CN114127121A - 用于通过cd39表达细胞的adcc靶向促进和增强t细胞介导的免疫反应的方法和组合物 - Google Patents

用于通过cd39表达细胞的adcc靶向促进和增强t细胞介导的免疫反应的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

与常规疗法(例如靶向疗法、化学疗法和血管生成抑制剂等)组合，靶向检查点分子的免疫疗法已在治疗实体或液体肿瘤中显示具有前景。然而，非肿瘤细胞在肿瘤内微环境中的作用已指示这些细胞的消除可为针对肿瘤产生有效免疫反应的关键，所述有效免疫反应包括免疫系统的细胞毒性T细胞和其他抗肿瘤细胞的肿瘤浸润。本发明不聚焦于尝试抑制CD39作为产生腺苷的酶的外核苷酸酶活性，而是利用CD39表达以通过CD39依赖性ADCC实现肿瘤内细胞消除。

Description

用于通过CD39表达细胞的ADCC靶向促进和增强T细胞介导的 免疫反应的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月12日提交的美国临时申请序列号62/885,509的优先权权益；所述申请的全部内容以引用的方式整体并入本文。
发明背景
对于患有晚期癌症的人，希望可为有价值但稀有的商品。近年来，称为免疫检查点抑制剂的药物的新颖类别已显示卓越的前景，可使肿瘤陷入困境并阻止它们生长，并且允许接受治疗的一些人基本痊愈。但这些开创性疗法具有大量挑战。尽管基于晚期癌症中针对程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、PD1配体1(PDL1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)疗法的抑制性抗体的免疫疗法在晚期癌症中的成功，但相当大比例的患者仍对这些治疗无反应。
随着对免疫抑制肿瘤微环境作为抵抗的主要驱动物的关注日益增加，并根据免疫细胞浸润的程度来表征“热”和“冷”肿瘤，研究者已发现基于缺乏对检查点单一疗法的有效反应的数种不同机制。免疫学上“热”肿瘤含有高水平的浸润性T细胞和更多抗原，使得它们更易于被免疫系统识别，并且更可能触发强烈的免疫反应。免疫学上认为热的癌症为膀胱癌、头颈癌、肾癌、黑素瘤和非小细胞肺癌。然而，即使在这些免疫学上“热”癌症中，仍仅少数患者受益于免疫疗法。相比之下，免疫学上“冷”肿瘤为出于各种原因而几乎不含浸润性T细胞，似乎未被识别为外来者且不引起免疫系统强烈反应的癌症，使得这些癌症难以用当前的免疫疗法治疗。传统上免疫学上“冷”癌症包括成胶质细胞瘤，以及卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和大多数乳腺癌。
除癌细胞外，肿瘤的微环境还含有许多细胞类型，它们包括骨髓源性炎症性细胞、淋巴细胞、血管、成纤维细胞和包含胶原蛋白和蛋白聚糖的细胞外基质(ECM)。事实上，肿瘤药物反应并非仅由肿瘤细胞的固有特征决定，因为肿瘤相关基质细胞，包括成纤维细胞、间充质基质细胞(MSC)、免疫炎症性细胞、血管内皮细胞和ECM组合以响应于抗癌治疗。在许多情况下，肿瘤是否具有T细胞浸润或缺乏T细胞浸润，对检查点疗法的抗性或无反应均为肿瘤中存在的其他细胞的抑制效应的结果，所述抑制效应的范围从导致已存在于肿瘤中的细胞毒性T细胞的下调或抑制的肿瘤内信号传导至发展通过降低那些细胞自周围血管渗入肿瘤内的能力而完全排除细胞毒性T细胞的肿瘤微环境。
因此，本领域中极需鉴定用于增强T细胞反应的替代机制。
发明内容
已靶向外核苷酸酶CD39以便产生与所述蛋白质相关联的酶促活性的肿瘤内水平的降低，并且因此降低免疫抑制剂(腺苷)的肿瘤内水平。本发明至少部分地基于以下另外的发现：CD39由肿瘤微环境中一定范围的细胞(诸如基质细胞、II型NKT细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))表达，所述细胞发挥作用以产生免疫抑制或免疫排斥环境，并且使用某些抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性抗CD39抗体靶向那些细胞以用于在肿瘤中消除可用于增加细胞毒性T细胞的浸润，并且实际上将“冷”肿瘤转化为免疫学上“热”肿瘤。
例如，在一个方面中，提供抗CD39抗体或其抗原结合片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含(i)至少一个抗原结合结构域，所述至少一个抗原结合结构域在一个位点结合外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(ectonucleoside triphosphatediphosphohydrolase-1)(CD39)，使得所述抗CD39抗体形成稳定的免疫复合物；和(ii)FcγRIIIa结合部分，所述FcγRIIIa结合部分结合FcγRIIIa受体并赋予所述抗CD39抗体针对CD39+细胞的ADCC活性。
进一步提供了许多实施方案，所述实施方案可应用于本发明的任何方面和/或与本文描述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段促进：(i)当与HCC1739BL细胞孵育时的稳定免疫复合物形成，如通过在24小时后所述免疫复合物损失小于40％，或在24小时后所述免疫复合物损失小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％或甚至小于10％所表征，任选地其中所述免疫复合物形成通过荧光强度使用荧光标记的第二抗体来检测(例如仅用于说明，与抗CD39抗体形成的免疫复合物的稳定性可通过将抗CD39单克隆抗体(mAb)(诸如在2μg/ml或更大)与HCC1739BL细胞孵育不同时间且然后通过荧光缀合的第二抗体检测免疫复合物的存在来测定)；(ii)针对CD39+细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；(iii)CD45+免疫细胞上的CD39的抗体介导的靶胞吞；(iv)来自肿瘤中肿瘤血管内皮破坏或血管分布网络崩溃的CD39的抗体介导的靶胞吞；(v)结合至具有选自由图33中所列的CD39氨基酸表位序列组成的组的序列的CD39氨基酸表位；和/或(vi)以与单克隆抗体克隆A1非竞争性或仅部分竞争性结合至CD39的方式结合至CD39。
在另一实施方案中，FcγRIIIa结合部分选自由以下组成的组：Fc结构域、结合至FcγRIIIa的抗体或其片段和FcγRIIIa结合肽。在又另一实施方案中，所述抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)、Fav、dsFv、sc(Fv)2、Fde、sdFv、单结构域抗体(dAb)和双功能抗体(diabodies)片段，和/或其中所述抗CD39抗体或抗原结合片段为单克隆。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段缀合至剂，任选地其中所述剂选自由以下组成的组：结合蛋白、酶、药物、化学治疗剂、生物剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、可检测部分和标签。在另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段具有VH结构域，所述VH结构域具有可由在严格条件下与SEQ ID No.1的核酸杂交的核酸序列或核酸编码的氨基酸序列；和VL结构域，所述VL结构域具有可由在严格条件下与SEQ ID No.3的核酸杂交(诸如在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)在45℃下杂交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中在50℃至65℃下洗涤)的核酸序列或核酸编码的氨基酸序列。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID No.2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54的CDR至少60％同一(例如，至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR；和轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56的CDR至少60％同一(例如，至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含与SEQID No.2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54至少60％同一(例如，至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的可变重(VH)链，和与SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56至少60％同一(例如，至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的可变轻(VL)链。在另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，所述重链具有与SEQ ID No.29至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR1氨基酸序列、与SEQ ID No.30至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR2氨基酸序列和与SEQ ID No.31至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR3氨基酸序列；和(ii)轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.32至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR1氨基酸序列、与SEQ ID No.33至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR2氨基酸序列和与SEQ ID No.34至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR3氨基酸序列。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有选自由SEQ ID No.6、10、14、18、22、26、42、46、50和54的CDR组成的组的CDR；和轻链，所述轻链具有选自由SEQ ID No.8、12、16、20、24、28、44、48、52或56的CDR组成的组的CDR；以及人框架序列，以形成具有能够特异性地结合人CD39的抗原结合位点的人源化重链和轻链。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含IgG1或IgG3同种型的Fc结构域，任选地其中所述Fc结构域为人的。在另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段为低岩藻糖基化或无岩藻糖基化。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段为人或人源化的。在又另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段为双特异性的，包括至少一个另外的抗原结合位点用于肿瘤抗原、免疫检查点或共刺激受体，其中如果所述另外的抗原结合位点用于免疫检查点，则其用作检查点抑制剂，并且其中如果所述另外的抗原结合位点用于共刺激受体，则其用作共刺激激动剂。在另一实施方案中，所述另外的抗原结合位点结合至选自由以下组成的组的检查点蛋白：PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT和Siglec-15。在又另一实施方案中，所述另外的抗原结合位点结合T细胞上经上调并与T细胞耗竭相关的检查点蛋白。在又另一实施方案中，所述另外的抗原结合位点结合至选自由以下组成的组的免疫共刺激受体：MHCI分子、BTLA受体、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。在另一实施方案中，所述另外的抗原结合位点结合至CD47，SIRPα，CD24或Siglec-10。
在另一方面中，提供一种药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效量的至少一种本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲剂或溶液。例如，所述药物制剂可用于改善抗肿瘤T细胞免疫性并且适合于施用至患有肿瘤的受试者，包含有效量的抗CD39抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲剂或溶液，其中向所述受试者施用抗CD39抗体使得肿瘤内CD39高细胞的数量减少，并且增强T细胞浸润至肿瘤内或减少肿瘤中的T细胞耗竭或两者。
在又另一个方面中，提供一种经分离的核酸分子，所述经分离的核酸分子i)在严格条件下与编码本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸的补体杂交；ii)具有在全长上与编码本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸具有至少约90％同一性的序列；或iii)编码本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽。
在又另一方面中，提供一种由本文描述的核酸编码的经分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽。
在另一方面中，提供一种包含本文描述的经分离的核酸的载体，任选地其中所述载体为表达载体。
在又另一个方面中，提供一种包含本文描述的经分离的核酸的宿主细胞，所述宿主细胞：a)表达本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段；b)包含本文描述的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽；或c)包含本文描述的载体。
在又另一方面中，提供一种装置或药盒，所述装置或药盒包含至少一种本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段。所述装置或药盒任选地包含标记以检测至少一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的复合物。
在另一方面中，提供一种装置或药盒，所述装置或药盒包含本文描述的药物组合物、经分离的核酸分子、经分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽、载体和/或宿主细胞。
在又另一方面中，一种产生至少一种如权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在适合允许所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的表达的条件下，培养已经通过包含编码至少一种抗CD39抗体或其抗原结合片段的序列的核酸转化的经转化的宿主细胞；以及(ii)回收表达的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
在又另一方面中，提供一种检测CD39多肽的存在或水平的方法，所述方法包括获得样品，以及通过使用至少一种本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段检测所述样品中的所述多肽。例如，所述至少一种抗CD39抗体或其抗原结合片段可与CD39多肽形成复合物，并且所述复合物可以酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学测定、蛋白质印迹、质谱测定、核磁共振测定的形式或使用细胞内流测定检测。
在另一方面中，提供一种通过耗减肿瘤内CD39高细胞而改善抗肿瘤T细胞免疫性的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得肿瘤内CD39高细胞的数量减少并且增强T细胞浸润至肿瘤内或减少肿瘤中的T细胞耗竭或两者。
在又另一方面中，提供一种用于促进免疫细胞浸润至肿瘤内的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得肿瘤中的CD39+CD45-SCA-1+基质细胞消除和减少，并且细胞毒性T细胞对肿瘤的浸润增加。
在又另一方面中，提供一种用于减少II型NKT细胞对肿瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得肿瘤中的II型NKT细胞消除和减少。
在另一方面中，提供一种用于减少调控性T细胞(Treg)对肿瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得肿瘤中的CD39高Treg消除和减少。
在又另一方面中，提供一种用于减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得肿瘤中的CD39高TAM消除和减少。
在又另一方面中，提供一种用于促进抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用足以使得所述肿瘤中的CD39表达细胞减少的量的本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
在又另一方面中，提供一种用于促进受试者的肿瘤中的T细胞介导的免疫功能的方法，所述方法包括：(i)鉴定具有低于预定阈值的肿瘤浸润的肿瘤反应性淋巴细胞程度的癌症受试者，以表征为未浸润或浸润不足(under-infiltrated)的肿瘤表型；以及(ii)以增加肿瘤反应性T细胞浸润肿瘤的量向所述受试者施用本文描述的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
如上文描述，进一步提供可应用于本发明的任何方面和/或与本文描述的任何其他实施方案组合的许多实施方案。例如，在一个实施方案中，肿瘤内CD39高细胞选自造血干细胞或祖细胞(CD45-Sca-1+)、CD39+NKT细胞、CD39+巨噬细胞、CD39+癌细胞、CD39+内皮细胞或其组合。在另一实施方案中，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段降低一个或多个造血区室内出现的CD39高细胞的水平，任选地其中所述一个或多个造血区室选自由血液、脾和肝组成的组。在又另一实施方案中，施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为抗肿瘤疗法的一部分。在又另一实施方案中，施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为抗感染疗法的一部分，任选地其中所述抗感染疗法为抗病毒疗法(包括HIV和HBV感染以及COVID-19感染的治疗)、用于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的治疗和用于内脏利什曼病的治疗。在另一实施方案中，施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为用于治疗实体肿瘤的抗肿瘤疗法的一部分，任选地其中所述实体肿瘤为胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌或神经胶质瘤。在又另一实施方案中，施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为用于治疗液体肿瘤的抗肿瘤疗法的一部分，任选地其中所述液体肿瘤为白血病。在又另一实施方案中，施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为涉及一种或多种化学治疗剂、抗血管生成剂、免疫肿瘤学剂和/或放射的疗法的一部分。在另一实施方案中，所述疗法包括施用一种或多种检查点分子的一种或多种抑制剂(拮抗剂)，任选地其中所述一种或多种检查点分子选自由以下组成的组：PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、TIGIT拮抗剂和Siglec-15拮抗剂。在又另一实施方案中，所述疗法包括施用一种或多种共刺激分子的一种或多种活化剂(激动剂)，任选地其中所述一种或多种共刺激分子选自选自由以下组成的组：GITR激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD137激动剂、ICOS激动剂和CD28激动剂。在又另一实施方案中，所述疗法包括施用以下中的一者或多者：VEGFR或VEGF拮抗剂、EGFR或EGF拮抗剂、IDO抑制剂、IDO1抑制剂、HDAC抑制剂、PI3Kδ抑制剂、IL-15激动剂、CXCR4拮抗剂、CXCL12拮抗剂、DNMT抑制剂、白细胞介素-21、抗KIR抗体、抗CSF-1R抗体、抗CCR4抗体、GMCSF、抗PS抗体、抗CD30抗体-奥瑞斯他汀(aurstatin)E缀合物、抗CD19抗体、抗CEA IL-2抗体、抗NY-ESO-1抗体、抗NKG2A抗体、STING激动剂、TRL7/8激动剂、RIG-1激动剂和/或NRLP3抑制剂、抗CD73抗体(诸如MEDI9447)、P2X7拮抗剂或腺苷A2A受体拮抗剂。在另一实施方案中，所述治疗包括施用一种或多种先天免疫诱导剂，任选地其中所述一种或多种先天免疫诱导剂选自由以下组成的组：CD47-SIRPα轴的抑制剂(例如，抗体或结合至CD47或SIRPα并抑制所述两种分子的相互作用的其他结合部分)、CD24-Siglec-10轴的抑制剂(例如，抗体或结合至CD24或Siglec-10并抑制所述两种分子的相互作用的其他结合部分)、阻断NK和CD8+细胞的HLA-E驱动的抑制的NGK2A检查点抑制剂、STING激动剂、TLR7/8激动剂和RIG-I激动剂。在又另一实施方案中，施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为包括肿瘤疫苗、过继细胞疗法(包括CAR-T和ACTR疗法)、抗肿瘤基因疗法、抑制性核酸疗法(诸如siRNA、shRNA、反义、CRISPR和TALEN疗法)和/或溶瘤病毒疗法的疗法的一部分。在又另一实施方案中，受试者为癌症的动物模型。在另一实施方案中，所述受试者为哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物为人或啮齿动物。
附图说明
图1.通过流式细胞术使用人CD39hi人B类淋巴母细胞(HCC1739BL)细胞测量的Ig39-21的亲和力。通过瞬时转染产生的完全人抗CD39抗体克隆Ig39-21如指示连续稀释，并在4℃下与HCC1739BL细胞一起孵育30分钟，接着流式细胞术分析。Kd经计算为0.412nM。
图2.Ig39-21证实针对HCC1739BL细胞的ADCC活性：Luc-报告基因测定。使用HCC1739BL细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。在37℃在于5％CO2中将靶细胞与如所指示经连续稀释的Ig39-21一起预孵育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50经计算为0.014μg/mL。
图3.Ig39-21证实选择性地针对人CD39hi Raji细胞的ADCC活性：Luc-报告基因测定。使用具有不同人CD39表达水平的各种Raji细胞系(包括Raji细胞(Raji-hCD39neg))、高度表达人CD39的hCD39转染的Raji细胞(Raji-hCD39hi)或表达低水平的人CD39的hCD39转染的Raji细胞(Raji-hCD39lo)作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。在37℃下在5％CO2中将靶细胞与如所指示经连续稀释的Ig39-21一起预孵育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加(RLU)指示。RLU：相对发光单位。
图4.Ig39-21针对CD39低正常内皮细胞(HUVEC)不发挥ADCC活性。使用人黑素瘤细胞(SK-MEL-28)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。在37℃下在5％CO2中将靶细胞与如所指示经连续稀释的Ig39-21一起预孵育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加指示。RLU：相对发光单位。此数据指示Ig39-21的安全性，其避免潜在全身性副作用。
图5.CD39赋予靶Raji-hCD39hi细胞对NK细胞毒性的抗性。使用经CFSE标记的Raji-hCD39neg或Raji-hCD39hi细胞作为靶细胞，并且在37℃下在5％CO2中以不同比例(如所指示)与NK-92-CD16V/V效应细胞一起共培养6小时。然后通过碘化丙啶(P/I)摄取通过流式细胞术分析靶细胞死亡。结果表示为CFSE+P/I+细胞的％。
图6.Ig39-21增强针对Raji-hCD39hi细胞的NK细胞毒性。在37℃下在5％CO2中将CFSE标记的Raji-hCD39hi靶细胞与或不与Ig39-21抗体(10μg/mL)一起孵育30分钟，接着在37℃下以不同比例(如所指示)与NK-92-CD16 V/V效应细胞一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡，并且计算CFSE+P/I+细胞的％。
图7.Ig39-21加强针对hCD39hi人B类淋巴母细胞(HCC1739BL)细胞的NK细胞毒性。在37℃下在5％CO2中将CFSE标记的HCC1739BL靶细胞与或不与Ig39-21抗体(10μg/mL)一起孵育30分钟，接着在37℃下以不同比例(如所指示)与NK-92-CD16 V/V效应细胞一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡，并且计算CFSE+P/I+细胞的％。
图8.无岩藻糖基化增强针对HCC1739BL细胞的Ig39-21介导的ADCC：Luc-报告基因测定。将HCC1739BL靶细胞在不存在(Ig39-21 WT)或存在岩藻糖基化抑制剂(Ig39-21 AF)的情况下，在37℃下与通过瞬时转染产生的经连续稀释的Ig39-21一起预孵育30分钟，并且与Jurkat效应细胞(T:E＝1:6)进一步共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50经计算为0.02μg/mL(Ig39-21 WT)和0.0008μg/mL(Ig39-21 AF)
图9.无岩藻糖基化增强针对HCC1739BL细胞的Ig39-21介导的ADCC：NK细胞毒性测定。在37℃下在5％CO2中将CFSE标记的HCC1739BL靶细胞与如所指示经连续稀释的Ig39-21WT或Ig39-21 AF一起孵育30分钟。然后在37℃下将细胞与NK-92-CD16 V/V效应细胞(E:T＝1:8)一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡，并且计算CFSE+P/I+细胞的％(细胞毒性的％)。EC50经计算为0.04μg/mL(Ig39-21 WT)和0.0006μg/mL(Ig39-21 AF)。
图10.优化的Ig39-21(NP501-BK)、Ig39-21 WT和Ig39-21 AF使用人CD39阳性CHO细胞(CHO-hCD39)表现出类似的结合亲和力。将Ig39-21 WT、Ig39-21 AF或NP501-BK(通过使用经稳定转染的细胞产生，Ig39-21的优化型式)如所指示连续稀释并在4℃下与CHO-hCD39细胞一起孵育30分钟。然后，在4℃下将细胞用第二抗体(抗人IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0003354910840000131
488)染色30分钟并通过流式细胞术进行分析。并行使用人IgG1同种型对照抗体(KLH-hIgG1)。Kd经计算为0.48nM(NP501-BK)、0.52nM(Ig39-21 WT)和0.51nM(Ig39-21AF)。
图11.NP501-BK、Ig39-21 WT和Ig39-21 AF使用表达CD39的HCC1739BL细胞表现出类似的结合亲和力。将Ig39-21 WT、Ig39-21 AF或NP501-BK如所指示连续稀释并在4℃下与HCC1739BL细胞一起孵育30分钟。然后，在4℃下将细胞用第二抗体(抗人IgG(Fc特异性抗体)Alexa
Figure BDA0003354910840000132
488)染色30分钟并通过流式细胞术进行分析。并行使用人IgG1同种型对照抗体(KLH-hIgG1)。Kd经计算为0.16nM(NP501-BK)、0.29nM(Ig39-21 WT)和0.35nM(Ig39-21 AF)。
图12.优化的Ig39-21(NP501-BK)和无岩藻糖基化Ig39-21发挥类似的ADCC活性：使用HCC1739BL细胞的Luc-报告基因测定。在37℃下将HCC1739BL靶细胞与经连续稀释的人IgG1同种型对照抗体(KLH-hIgG1)或完全人抗CD39单克隆抗体(Ig39-21 AF或NP501-BK)一起预孵育30分钟并与Jurkat效应细胞(T:E＝1:6)进一步共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50经计算为0.0017μg/mL(NP501-BK)和0.00086μg/mL(Ig39-21 AF)。
图13.NP501-BK和Ig39-21 AF发挥比Ig39-21 WT远远更高的ADCC活性：针对HCC1739BL细胞的NK细胞毒性。在37℃下在5％CO2中将CFSE标记的HCC1739BL靶细胞与如所指示经连续稀释的人IgG1同种型对照抗体(KLH-hIgG1)或完全人抗CD39单克隆抗体(Ig39-21 WT、Ig39-21 AF或NP501-BK)一起孵育30分钟。然后在37℃下将细胞与NK-92-CD16 V/V效应细胞(E:T＝1:8)一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡并计算CFSE+P/I+细胞的％(细胞毒性的％)。EC50经计算为1.58E-04μg/mL(NP501-BK)、4.22E-03μg/mL(Ig39-21 WT)和4.75E-05μg/mL(Ig39-21 AF)。
图14.完全人抗CD39抗体针对Raji-hCD39hi细胞表现出类似的CDC活性。在37℃下将Raji-hCD39hi靶细胞与经连续稀释的人IgG1同种型对照(KLH-hIgG1)或完全人抗CD39单克隆抗体(Ig39-21WT、Ig39-21 AF或NP501-BK)一起预孵育30分钟并进一步暴露于10％正常人血清(NHS)持续2小时。通过流式细胞术分析靶细胞裂解并计算％P/I+细胞(细胞毒性的％)。EC50经计算为0.31μg/mL(NP501-BK)、0.38μg/mL(Ig39-21 WT)和0.25μg/mL(Ig39-21 AF)。
图15.NP501-BK和Ig39-21 AF在体内发挥类似的抗肿瘤功效。在肿瘤激发后第8、11、14和17天，将皮下植入MC38细胞的C57BL6人源化CD39小鼠(hCD39 KI)用5mg/kg人IgG1同种型对照抗体(KLH-hIgG1)或完全人抗CD39单克隆抗体(Ig39-21 AF或NP501-BK)治疗。每周两次使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)。肿瘤体积(mm3)被测定为L*W*W*0.52。每组n＝5。
图16.NP501-BK治疗使得CD39hi肿瘤浸润淋巴细胞上的hCD39表达减少。在肿瘤接种后第8、11和14天，将MC38荷瘤hCD39 KI小鼠用三个剂量的KLH-hIgG1(5mg/kg)或NP501-BK(5mg/kg)治疗。在第15天，脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞从这些小鼠纯化，用所指示的细胞表面标记物染色，并通过如材料和方法中描述的流式细胞术进行分析。每组n＝6至8。
图17.NP501-BK在CD39+SK-MEL-28异种移植物模型中发挥抗肿瘤活性。使用皮下植入SK-MEL-28异种移植物的NU/J裸小鼠以评估NP501-BK的体内功效。当肿瘤达到大约500mm3的平均体积时(视为治疗的第0天)，在第0天和第3天经由腹膜内用两个剂量的300μl盐水或10mg/kg NP501-BK治疗小鼠。每三天使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)。肿瘤体积(mm3)被测定为L*W*W*0.52。每组n＝6至7。
图18.18种人/兔嵌合抗人CD39单克隆抗体相对参考抗hCD39单克隆抗体克隆A1对HCC1739BL细胞的表位竞争测定。在4℃下将HCC1739BL细胞与一组18种抗hCD39单克隆抗体(人/兔嵌合克隆；未缀合，2μg/ml)培养30分钟。然后将细胞洗涤两次并在4℃下用与PE缀合的小鼠抗hCD39单克隆抗体克隆A1染色30分钟，接着流式细胞术分析。使用无嵌合抗体孵育的细胞作为对照。
图19.人/兔嵌合克隆9B6和Ig39-21发挥类似的ADCC活性：使用HCC1739BL细胞的Luc-报告基因测定。使用HCC1739BL细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。在37℃下将靶细胞与经连续稀释的Ig39-21 WT或人/兔嵌合克隆9B6(Hu/Ra 9B6；在所有嵌合克隆中，与具有最高ADCC活性的人IgG1 Fc嵌合的兔抗hCD39单克隆抗体)一起预孵育30分钟并且与Jurkat效应细胞(T:E＝1:6)进一步共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景(RLU)的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50经计算为0.014μg/mL(Ig39-21 WT)和0.022μg/mL(Hu/Ra 9B6)。
图20.18种人/兔嵌合抗体的ADCC活性：使用HCC1739BL细胞的Luc-报告基因测定。使用HCC1739BL细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。如上文描述，针对ADCC活性检查一组18种人/兔嵌合抗体。简言之，在37℃下将靶细胞与经连续稀释的抗体一起预孵育30分钟并且与Jurkat效应细胞(T:E＝1:6)进一步共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加(RLU)指示。RLU：相对发光单位。18种克隆中有10种显示阳性ADCC活性。
图21.具有高ADCC活性的人/兔嵌合抗体：使用HCC1739BL细胞的Luc-报告基因测定。Luc-报告基因ADCC测定如图20中上文描述进行。汇总具有高ADCC活性的六种克隆。六种克隆中有五种(除65H5外)不与克隆A1的表位竞争(参见图18)。
图22.具有低ADCC活性的人/兔嵌合克隆：使用HCC1739BL细胞的Luc-报告基因测定。Luc-报告基因ADCC测定如图20中上文描述进行。汇总具有低ADCC活性的四种克隆，它们均与克隆A1的表位竞争(参见图18)。9B6充当阳性对照。
图23.无ADCC活性的人/兔嵌合抗体：使用HCC1739BL细胞的Luc-报告基因测定。Luc-报告基因ADCC测定如图20中上文描述进行。汇总无ADCC活性的八种克隆，它们均与克隆A1的表位完全竞争(参见图18)。9B6充当阳性对照。
图24.选择人/兔嵌合抗体针对HCC1739BL细胞的NK细胞毒性。在37℃下在5％CO2中将CFSE标记的HCC1739BL靶细胞与如所指示经连续稀释的人/兔嵌合克隆一起孵育30分钟。然后，在37℃下将细胞与NK-92-CD16 V/V效应细胞(E:T＝1:8)一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡并计算CFSE+P/I+细胞的％(细胞毒性的％)。列举经计算的EC50。超过背景的最大细胞毒性的％被测定为：就各克隆而言，在1μg/mL下的最大细胞毒性的％-各克隆的背景细胞毒性的％(在10-4μg/mL下)。来自luc-报告基因高ADCC组的示例性嵌合克隆(8C11、8D8、9B6、9C10、48F10和65H5)表现出高NK杀死活性。相比之下，来自luc-报告基因ADCC阴性组的嵌合克隆(59B6、60D9、62G12和62H10)展示低NK杀死活性。
图25.参考抗人CD39单克隆抗体(hCD39 Ref)抑制CHO细胞膜上的hCD39 ATP酶活性。在37℃下将CHO-hCD39细胞与10μg/mL人IgG1同种型Ultra-LEAF抗体或抗hCD39 Ref抗体(hCD39 Ref)一起孵育30分钟，接着在室温下与ATP(250μM)一起孵育15分钟。然后收集上清液，并通过发光使用
Figure BDA0003354910840000171
检测ATP水平。还并行检测了无抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下的单独ATP以计算如材料和方法中描述的酶活性抑制的％。
图26.含有相同人IgG1 Fc部分的参考抗体(hCD39 Ref)和Ig39-21 WT发挥类似的ADCC活性：针对HCC1739BL细胞的NK细胞毒性。在37℃下在5％CO2中将CFSE标记的HCC1739BL靶细胞与如所指示经连续稀释的抗hCD39单克隆抗体(hCD39 Ref、NP501-BK、Ig39-21 WT或Ig39-21 AF)一起孵育30分钟。然后在37℃下将细胞与NK-92-CD16 V/V效应细胞(E:T＝1:8)一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡并计算CFSE+P/I+细胞的％(细胞毒性的％)。EC50经计算为2.62E-03μg/mL(hCD39 Ref)、5.14E-05μg/mL(NP501-BK)、1.98E-03μg/mL(Ig39-21 WT)和7.94E-06μg/mL(Ig39-21 AF)。
图27.在HCC1739BL细胞上表位竞争基质-I相对抗hCD39参考抗体(hCD39 Ref)。在4℃下将HCC1739BL细胞与10μg/ml未缀合的人IgG1同种型Ultra-LEAF抗体或hCD39 Ref抗体一起孵育30分钟。然后，在4℃下使细胞暴露于Alexa
Figure BDA0003354910840000172
647缀合的抗体(8C11、8D8、8E9、9B6和Ig39-21 WT)或PE缀合的克隆A1持续30分钟，接着两次洗涤和流式细胞术分析。计算AF647或PE MFI检测相对于同种型对照的倍数变化(无表位重叠＝1)。Ra：兔抗体；Hu/Ra：人/兔嵌合抗体。
图28.在HCC1739BL细胞上表位竞争基质-II相对抗hCD39参考抗体(hCD39 Ref)。在4℃下将HCC1739BL细胞与10μg/ml未缀合的人IgG1同种型Ultra-LEAF抗体或hCD39 Ref抗体一起孵育30分钟。然后在4℃下使细胞暴露于未缀合的兔或人/兔嵌合抗体(2A11、2G12、5F1、9C10、48F10、52G4、59B6、65H5和67C1)持续30分钟，洗涤两次并在4℃下用第二抗体(抗兔IgG(H+L)，Alexa
Figure BDA0003354910840000181
488)染色30分钟。最后，洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。计算AF488MFI检测相对于同种型对照的倍数变化(无表位重叠＝1)。
图29.抗体:抗原免疫复合物在HCC1739BL细胞上的稳定性。在37℃下在5％CO2中将抗人CD39抗体(2μg/ml)与HCC1739BL细胞一起孵育24小时或在4℃下孵育20分钟，接着在4℃下第二抗体染色(抗人IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0003354910840000182
488)30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。20分钟与24小时治疗之间的AF488MFI的差异表示细胞膜上人CD39的损失，其如材料和方法中描述计算。24小时后，来自luc-报告基因ADCC阴性组(8E9、59B6和67C1)和低ADCC组(52G4)的示例性嵌合克隆未在细胞膜上形成稳定的免疫复合物(例如CD39的损失大于40％)。Hu/Ra：人/兔嵌合抗体；hIgG1：人源化兔抗体，IgG1同种型；hIgG4：人源化兔抗体，IgG4同种型。
图30.通过流式细胞术使用HCC1739BL细胞测量的人源化兔抗体的亲和力。将人/兔嵌合克隆(Hu/Ra 8C11、8D8和9C10)和它们相应的人源化克隆(IgG1或IgG4同种型)如所指示连续稀释，并在4℃下与HCC1739BL细胞一起孵育30分钟。然后，在4℃下将细胞用第二抗体(抗人IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0003354910840000183
488)染色30分钟并通过流式细胞术进行分析。计算Kd并在图形旁边指示。
图31.人源化兔抗体针对HCC1739BL细胞的NK细胞毒性。将人/兔嵌合克隆(Hu/Ra8C11、8D8和9C10)和它们相应的人源化克隆(IgG1或IgG4同种型)如所指示连续稀释并在37℃下在5％CO2中与CFSE标记的HCC1739BL靶细胞一起孵育30分钟。然后在37℃下将细胞与NK-92-CD16 V/V效应细胞(E:T＝1:8)一起共培养6小时。通过流式细胞术分析靶细胞死亡并计算CFSE+P/I+细胞的％(细胞毒性的％)。列举经计算的EC50。
图32.人源化兔抗体针对Raji-hCD39hi细胞的CDC活性。将人/兔嵌合克隆(Hu/Ra8C11、8D8和9C10)和它们相应的人源化克隆(IgG1或IgG4同种型)如所指示连续稀释并在37℃下与Raji-hCD39hi靶细胞一起预孵育30分钟，接着与10％正常人血清(NHS)一起孵育2小时。通过流式细胞术分析靶细胞裂解并计算％P/I+细胞(细胞毒性的％)。列举经计算的EC50。
图33.构象表位作图。显示主要假定CD39表位候选者的列表。为参考CD39表位序列提供示例性、代表性CD39细胞外结构域序列，以及为数据可视化提供人CD39的二聚体的同源模型。
具体实施方式
I.概述
已知细胞外腺苷为免疫功能的抑制剂。尽管细胞内腺苷参与能量代谢、核酸代谢和甲硫氨酸循环，但在肿瘤微环境中，细胞外腺苷在抑制免疫信号传导中发挥重要作用。通过腺苷A2A受体(A2AR)信号传导的免疫抑制腺苷3'5'-单磷酸(cAMP)介导的途径可抑制低氧、炎症和癌性微环境中的T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞(Ohta等人(2006)Proc NatlAcad Sci USA,103:13132-7)。临床前证据连同最近和不断发展的积极临床试验数据一起证实A2AR抑制剂的施用可为免疫疗法的潜在新颖策略。另外，在实验动物模型中，阻断涉及CD39/CD73的腺苷产生途径还诱导乳腺癌、结肠直肠癌和黑素瘤的消退。在抗CD39和抗CD73抗体疗法的情况下，重点主要在于通过结合至这些细胞表面产生腺苷的酶(“外核苷酸酶”)并抑制酶促活性或从细胞表面去除酶促活性而抑制或降低ATP和衍生核苷酸分解代谢(最终)成腺苷。
本发明至少部分地基于以下发现：针对CD39的某些抗体能够选择性地靶向和消除(诸如通过抗体依赖性细胞毒性)肿瘤微环境中的CD39表达细胞(比先前技术中的抗CD39抗体更有效)，包括CD39+CD45-SCA-1+基质细胞(诸如造血祖细胞)、CD39+NKT细胞、CD39+巨噬细胞和CD39+内皮细胞以及CD39+癌细胞。所产生的肿瘤内CD39高细胞数量的减少可导致肿瘤的炎症表型的此类变化，诸如增强的T细胞浸润至肿瘤内、肿瘤中减少的T细胞耗竭、肿瘤内免疫细胞功能的降低的II型NKT细胞抑制和/或肿瘤内免疫细胞功能的降低的调控性T细胞(Treg)抑制和/或肿瘤内免疫细胞功能的降低的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)抑制。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但由发明人产生的某些抗体能够与CD39形成更稳定的免疫复合物以产生更有效的ADCC杀死功效。发明人已观察到，不能与CD39形成如本发明所涵盖的那些一样稳定的免疫复合物的抗体导致表面上的CD39减少，但通过增加CD39脱落或胞吞(内化)的机制，并且就能够通过抗体依赖性细胞毒性消除CD39表达细胞而言不具有相同功效。在某些实施方案中，本发明所涵盖的某些抗体已显示结合至CD39上的表位，所述表位与单克隆抗体克隆A1非竞争性或仅部分竞争性结合至CD39。
如示例性方法中更详细描述和附图中阐述，相比于(例如)由先前技术中的所有抗CD39治疗抗体直接抑制CD39 NTP酶活性(Perrot等人,2019,Cell Reports 27:2411-2425；Li等人,2020,Cancer Discovery 9(12):CD-19-0541；和PCT公布WO 2017/089334)，我们的抗CD39抗体经特别设计以具有包含IgG1 Fc结构域的人恒定区。这种设计赋予本发明的抗CD39抗体FcγRIIIa受体依赖性细胞活性，例如针对CD39+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或肿瘤内CD39+细胞的抗体介导的靶胞吞。因此，此类细胞活性导致肿瘤中CD39高细胞的消除和减少。
主题抗CD39单克隆抗体的示例性特征如下文汇总，所述特征经教示远离用于参考文献中描述的治疗性抗CD39抗体。
主题抗体通过FcγRIIIa受体依赖性活性(例如ADCC)靶向肿瘤中的CD39+细胞。
作为实例，图13和图26显示通过使用岩藻糖基化抑制剂(Ig39-21AF)或通过优化产生方法(NP501-BK)，主要克隆Ig39-21(完全人抗CD39单克隆抗体)的岩藻糖基化降低(又称为低岩藻糖基化或无岩藻糖基化)显著增强其体外针对CD39+细胞的ADCC活性。这与体内这些无岩藻糖基化抗体的抗肿瘤活性的增强并行(图15)，而完全糖基化形式(Ig39-21 WT)在相同肿瘤模型中未显示抗肿瘤活性(未显示数据)。
如图13和26中NK细胞毒性测定预测，这些不同岩藻糖基化Ig39-21抗体的体外最大有效剂量(MaxED)进一步说明它们的差异体内抗肿瘤活性。例如，无岩藻糖基化使Ig39-21 WT的MaxED从0.1μg/ml增强高达至0.001μg/ml。当转化为临床时，这种100倍增加将为高功效、有利的安全性概况、良好的耐受性和低成本。
相比之下，本文使用的参考hCD39抗体(hCD39 Ref)与本领域中的抗体共享抗原结合位点。然而，与当前实施例中使用的Ref抗体相反，先前技术抗体用经特定设计以具有消除的ADCC功能的Fc部分产生(即，经教示已经特定产生以结合CD39并抑制NTP酶活性而无需引起CD39依赖性ADCC细胞杀死)。
主题抗CD39抗体的ADCC活性为选择性地针对CD39高细胞。
作为实例，图3和图4显示Ig39-21的ADCC活性为选择性地针对CD39高细胞(即，图3中的Raji-hCD39hi细胞和图4中的SK-MEL-28细胞)。
这些体外数据与体内肿瘤微环境的相关性：图16证实hCD39在携带MC38的hCD39KI小鼠的肿瘤内部高度上调，包括CD45+肿瘤浸润淋巴细胞(即，CD3+CD11b-T细胞、CD3-CD11b+髓样细胞和F4/80hiGr-1肿瘤相关巨噬细胞)和肿瘤相关血管内皮细胞(数据未显示)。NP501-BK治疗导致肿瘤中CD39高细胞的消除和减少(图16和数据未显示)。
这种功能特征应赋予抗体肿瘤特异性，从而避免应导致更安全的抗CD39抗体的全身性副作用。
抗CD39抗体与靶细胞膜上的抗原形成稳定的免疫复合物赋予抗体高ADCC活性。
作为图29中显示的一个实例，靶细胞表面上抗体:抗原免疫复合物的稳定性使用选自以下三组的抗体检查：高ADCC(即，NP501-BK、hCD39 Ref和人/兔嵌合克隆8C11、8D8、9C10和48F10)、低ADCC(人/兔嵌合克隆52G4)或ADCC阴性(人/兔嵌合克隆8E9、59B6和67C1)。这种免疫复合物的稳定性与抗体的ADCC活性之间的强和正相关为清晰可见的。抗体:抗原免疫复合物越稳定，则抗体的ADCC活性越高。
抗CD39抗体的不同表位与抗体的ADCC活性直接相关。
作为一个实例，通过比较主题人/兔嵌合抗hCD39抗体的表位与市售抗hCD39单克隆抗体克隆A1的表位，图18和21至23显示以与克隆A1非竞争或仅部分竞争性结合至CD39的方式结合至抗CD39的抗CD39抗体很可能含有高ADCC活性，即，除65H5外，六种高ADCC抗体中有五种(2G12、8C11、8D8、9B6和9C10)显示这种特征(图21)。相比之下，低ADCC(2A11、5F1、52G4和63B1)和ADCC阴性(8E9、59B6、60D9、62G12、62H10、65E10、67A8和67C1)组中的所有抗体均显示与克隆A1的表位完全重叠的表位(图22和23)。
肿瘤中主题抗CD39抗体的多个CD39高细胞靶标。
作为一个实例，采用hCD39 KI小鼠中的CD39-MC38结肠直肠癌模型(图15和16)。此模型中NP501-BK的抗肿瘤活性为其对CD39高肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤相关血管内皮细胞的靶向效应的结果(数据未显示)。
另一实例为使用植入CD39+人SK-MEL-28黑素瘤细胞的NU/J裸小鼠的异种移植物肿瘤模型(图17)。这些纯合的无胸腺裸小鼠缺乏T细胞，在B细胞发育中也具有部分缺陷，而它们的NK细胞在功能上可胜任。因此，在这种异种移植物肿瘤模型中，NP501-BK介导的ADCC杀死的靶细胞为CD39+SK-MEL-28肿瘤细胞，其与所述抗体针对SK-MEL-28细胞的体外ADCC活性相符(图4)。
II.定义
为促进了解本发明，下文定义许多术语和短语。
“CD39，”也称为“分化簇39”、“外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1”或(基因)“ENTPD1”和(蛋白质)“NTPD酶1”为细胞表面定位的外核苷酸酶，其具有催化三磷酸和二磷酸核苷的γ-和β-磷酸残基水解为单磷酸核苷衍生物(酶条目：EC 3.6.1.5)，诸如水解P2受体配体，诸如ATP、ADP、UTP和UDP的细胞外面向催化位点(Junger等人(2011)Nat.Rev.Immunol.11:201-212)。代表性人NTPD酶1蛋白序列提供于UniProtKB条目“P49961(ENTP1_人)中，”并且酶的代表性人编码序列系提供于GenBank登录号S73813中。细胞周围腺苷可通过结合各种腺苷受体调节免疫细胞中的促炎性或促抑制性信号(Ernst等人(2010)J.Immunol.185:1993-1998；Antonioli等人(2013)Trends Mol.Med.19:355-367；Parodi等人(2013)CancerImmunol.Immunother.62:851-862；Boer等人(2013)Eur.J.Immunol.43:1925-1932；Xu等人(2013)Neuro-Oncol.15:1160-1172；美国专利公布2013/0123345)。例如，腺苷结合至由淋巴细胞表达的A2A受体，引起细胞内cAMP的累积，从而防止T细胞活化和NK细胞毒性(Zarek等人(2008)Blood 111:251-259；Lokshin等人(2006)Canc.Res.66:7758-7765)。CD39最初被鉴定为人淋巴细胞上的活化标志物，但随后已经显示为调控性T细胞的标志特征(Kansas等人(1991)J.Immunol.146:2235-2244；Deaglio等人(2007)J.Exp.Med.204:1257-1265；Borsellino等人(2007)Blood 110:1225-1232)。Treg中CD39的损失显著削弱其抑制T细胞活化的能力，这表明CD39的近分泌活性发挥作用以负调控T细胞功能(Deaglio等人(2007)J.Exp.Med.204:1257-1265)。一般而言，CD8+T细胞已经报告为CD39–(Kansas等人(1991)J.Immunol.146:2235-2244；Moncrieffe等人(2010)J.Immunol.185:134-143；Pulte等人(2011)Clin.Lymph.Myeloma Leuk.11:367-372；Boer等人(2013)Eur.J.Immunol.43:1925-1932)。然而，最近在肿瘤和慢性病毒感染(例如HCV和HIV以及诸如SARS-COV2(COVID-19)的冠状病毒科)的情况中已注意到在耗竭的T细胞上这种标志物的上调(Canale等人(2017)Cancer Res.78(1):115-28；Gupta等人(2015)PLoS Pathog.11(10):e1005177；Mathew等人(2020)Science 10.1126/science.abc8511)。
CD39蛋白的结构-功能关系为本领域中熟知(例如由Antonioli等人(2013)TrendsMol.Med.19:355-367；Wang和Guidotti(1996)J.Biol.Chem.271:9898-9901；Kaczmarek等人(1996)J.Biol.Chem.271:33116-33122综述)。例如，人CD39为大约500个氨基酸的蛋白质，其具有大约七个潜在N-连接的糖基化位点、十一个Cys残基和两个跨膜区(Maliszewski等人(1994)J.Immunol.153:3574-3583)，所述两个跨膜区以两个跨膜结果域、包含N末端和C末端片段的小细胞质结构域和由五个高度保守结构域组成的大细胞外疏水型结构域的形式组构，所述五个高度保守结构域被称为三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)保守区(ACR)1至5，它们为酶的分解代谢活性所需(Heine等人(2001)Eur.J.Biochem.268:364-373)。ACR 1和ACR 5的氨基酸序列含有磷酸盐结合基序(DXG)，其对磷酸盐裂解期间稳定酶与其核苷酸底物之间的相互作用而言为重要的。另外，酶活性还需要两个ACR残基，ACR 3中的Glu 174和ACR 4的Ser 218(Heine等人(2001)Eur.J.Biochem.268:364-373；Smith等人(1998)Biochim.Biophys.Acta 1386:65-78)。在细胞表面表达后，CD39变为催化活性(Smith等人(1998)Biochim.Biophys.Acta 1386:65-78)。
代表性人CD39 cDNA和蛋白质序列为本领域中熟知且可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得。例如，已知至少七种人CD39转录物变体编码六种不同的人CD39同工型。人CD39同工型1可在登录号NM_001776.5和NP_001767.3下获得。转录物变体表示最长转录物并且编码同工型1。相较于转录物变体1，可在登录号NM_001098175.1和NP_001091645.1下获得的人CD39同工型2使用替代5'外显子，其导致不同5'非翻译区(UTR)并在替代起始密码子处引起翻译起始，导致更长且不同的N末端。相较于转录物变体1，可在登录号NM_001164178.1和NP_001157650.1下获得的人CD39同工型3使用替代的5'外显子，其导致不同5'UTR并在替代的起始密码子处引起翻译起始，导致更长且不同的N端。相对于产生更短同工型的转录物变体1，可在登录号NM_001164179.1和NP_001157651.1下获得的人CD39同工型4使用替代框内剪接位点。相对于产生更短同工型的转录物变体1，可在登录号NM_001164181.1和NP_001157653.1下获得的人CD39同工型5在5’区中使用替代外显子，在下游起始密码子处导致不同5’UTR和翻译起始。相对于产生更短同工型的转录物变体1，可在登录号NM_001164182.1和NP_001157654.1获得的人CD39同工型6缺乏替代外显子，在下游起始密码子处导致不同5’UTR并引起翻译起始。相对于导致更短同工型的转录物变体1，可在登录号NM_001164183.1和NP_001157655.1下获得的还由另一转录物变体编码的人CD39同工型6缺乏两个替代内部外显子，在下游起始密码子处导致不同5’UTR并引起翻译起始。
除人外的生物体中CD39直向同源物的核酸和多肽序列为熟知的且包括(例如)小鼠CD39(NM_009848.3和NP_033978.1)、大鼠CD39(NM_022587.1和NP_072109.1)、奶牛CD39(NM_174536.2和NP_776961.1)、青蛙CD39(NM_001006795.1和NP_001006796.1)和斑马鱼CD39(NM_001003545.1和NP_001003545.1)。
CD39的广泛糖基化与其细胞表面表达和活性相关联，使得糖基化残基的缺失或突变为不可糖基化残基导致显著降低的CD39活性(参见，例如，大鼠CD39的N末端的可糖基化残基73、中间的残基333，和/或残基429和/或C末端的残基458或其直向同源物中的相应残基的缺失或突变；Wu等人(2005)Mol.Biol.Cell.16:1661-1672)。类似地，ACR 1至5中的任一者或多者的三磷酸腺苷双磷酸酶保守区(ACR)中的保守残基的突变引起CD39活性的降低(Schulte am Esch等人(1999)Biochem.38:2248-2258；Yang等人(2001)Biochem.40:3943-4940；Wang和Guidotti(1998)J.Biol.Chem.273:11392-11399)。
CD39活性的调节(例如降低)可以许多方式测量(例如根据本文描述的测量，包括使用对照、比率、与基线的比较等)。例如，相较于这种外核苷酸酶在测试剂的存在下的水平，CD39活性调节剂可降低所述外核苷酸酶的催化活性或整体CD39活性。在一个实施方案中，CD39活性通过分析样品中腺苷的浓度来测定。所述浓度可随时间推移评估。在另一实施方案中，在所测试的样品中添加ATP并测定或评估剩余的ATP、AMP或腺苷的浓度。在此上下文中的调节(诸如降低)可意指1％、5％、10％>、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、200％、500％、1000％或更多的降低。在一个实施方案中，所述增加随时间推移检测。
“CD39抗体”(或者“抗CD39抗体”)是指选择性地结合至NTPD酶1蛋白的一个或多个表位的抗体，并且包括单互补位抗体，以及双互补位抗体和其他多互补位形式抗体。
a.抗体和其他多肽
如本文使用的术语“抗体”是指通过至少一个抗原结合位点识别并特异性地结合靶标(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述中的任一者的组合)的免疫球蛋白分子，其中所述抗原结合位点通常于所述免疫球蛋白分子的可变区内。如本文使用，所述术语涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体(前提条件为那些片段已经格式化以包含Fc或其他FcγRIII结合结构域)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白(其经格式化以包含Fc或其他FcγRIII结合结构域)，以及包含抗原结合位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体表现出所需的生物活性。
在本发明的上下文中，“抗体介导的靶胞吞”是指抗体介导从CD45+免疫细胞的表面耗减CD39，而CD45+免疫细胞的数量无实质性减少，即通过除诱导CD45+细胞死亡以外的过程。
如本文使用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保留特异性地结合至抗原(例如人CD39)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。术语抗体(例如本文描述的抗CD39抗体)的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546)；和(vi)经分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个经分离的CDR的组合，其可任选地由合成接头连接。此类单链抗体也意图包含于术语抗体的“抗原结合部分”内。这些和其他潜在构建体描述于Chan和Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10:301中。这些抗体片段为使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式针对效用筛选片段。抗原结合部分可通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生。
术语抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。一般而言，重链和轻链的可变区各自由四个框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)(也称为“高变区”)组成。每条链中的CDR通过框架区紧密结合在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成所述抗体的抗原结合位点。存在用于确定CDR的至少两种技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即，Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institutes of Health,Bethesda Md.)，和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。另外，这些两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
尽管抗体可为免疫球蛋白的五种主要类别中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其子类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，但基于它们的重链恒定结构域的同一性分别称为α、δ、ε、γ和μ，优选的CD39抗体为IgG1和IgG3同种型，以便最有效地接合FcγRIII(即，以10-7或更小的Kd)。
在某些实施方案中，抗体为“低岩藻糖基化”并且甚至可为“无岩藻糖基化”。“低岩藻糖基化”抗体制剂是指其中小于50％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖的抗体制剂。通常，“低岩藻糖基化”抗体制剂中小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于5％或小于1％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖。“无岩藻糖基化”抗体在附接至IgG重链的CH2结构域的碳水化合物中缺乏α-1,6-岩藻糖。
如本文使用，术语“单克隆抗体”是指针对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体或其中所有抗体针对特定表位均显示单一结合特异性和亲和力的抗体组合物。通常，此类单克隆抗体将源自编码所述抗体的单一细胞或核酸，并且将在不故意引入任何序列改变的情况下繁殖。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和任选的恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，例如，通过将从转基因或转染色体非人动物(例如具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)获得的B细胞融合至永生化细胞而获得。
如本文使用的术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠类)抗体的形式，所述抗体为特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段，它们含有最小非人序列。通常，人源化抗体为人免疫球蛋白，其中CDR的残基被来自具有所需特异性、亲和力和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的残基置换。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人物种的抗体中的相应残基置换。人源化抗体可通过在Fv框架区中和/或在经置换的非人残基内取代另外残基而进行进一步修饰，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或结合能力。人源化抗体可包含含有所有或大体上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR、而所有或大体上所有框架区为人免疫球蛋白序列的那些的可变结构域。在一些实施方案中，所述可变结构域包含人免疫球蛋白序列的框架区。在一些实施方案中，所述可变结构域包含人免疫球蛋白共有序列的框架区。所述人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区或结构域(Fc)。通常认为人源化抗体不同于嵌合抗体。
如本文使用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或使用本领域中已知的任何技术制得的具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。
如本文使用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区对应于源自哺乳动物的一种物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需的特异性、亲和力和/或结合能力的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一物种(通常人)的抗体中的序列同源，以避免在所述物种中引发免疫反应。
“Fc受体”或“FcR”为结合至免疫球蛋白的Fc区的受体。结合至IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。所述FcγR家族由三种活化(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性(FcγRIIB)受体组成。
“FcγRIII结合部分”为当与抗CD39抗体的抗原结合位点结合时可结合至FcγRIII(CD16)并介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的肽、蛋白质、核酸或其他部分。含有IgG1和IgG3同种型的CH2和CH3结构域的重链Fc片段为FcγRIII结合部分。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用并且是指可被识别并由特定抗体特异性地结合的抗原的部分。当抗原为多肽时，表位可由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在蛋白质变性时失去。表位通常包含至少3个，且更通常至少5、6、7或8至10个呈不同空间构象的氨基酸。
如本文使用，术语“特异性地结合至”或“对……具特异性”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶标与抗体间的结合，其在分子(包括生物分子)的异质群体的存在下确定靶标的存在。例如，特异性地结合至靶标(其可为表位)的抗体以比其结合至其他靶标更大的亲和力、结合性、更容易和/或以更大的持续时间结合此靶标的抗体。在一个实施方案中，如(例如)通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗体结合至不相关靶标的程度小于所述抗体与靶标的结合的约10％。在某些实施方案中，特异性地结合至靶标的抗体具有小于或等于1μM、100nM、10nM、1nM或甚至0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性地结合至蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质中为保守的。在另一实施方案中，特异性结合可包括但无需排他性结合。
术语“多肽”和“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸中断。所述术语还涵盖已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及本领域中已知的其他修饰。应了解因为本发明所涵盖的多肽可基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，在某些实施方案中，所述多肽可作为单链或作为相关链存在。
在两种或更多种核酸或多肽的上下文中，术语“同一”或“同一性”百分比是指当比较和比对(如果需要，引入空位)以实现最大对应，而不考虑将任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或相同氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件为本领域中熟知。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其变体。在一些实施方案中，本发明所涵盖的两种核酸或多肽为大体上相同的，意指如使用序列比较算法或通过目视检查测量，当针对最大对应比较和比对时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，且在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％、99％核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40至60个残基、至少约60至80个残基或其间的任何整数值的氨基酸序列的区上。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个残基更长的区(诸如至少约80-100个残基)上，并且在一些实施方案中，序列在所比较序列的全长上为大体上相同的，诸如靶蛋白或抗体的编码区。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、至少约40至60个碱基、至少约60-80个碱基或其间的任何整数值的核苷酸序列的区上。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个碱基更长的区(诸如至少约80-1000个碱基或更多)上，并且在一些实施方案中，所述序列在所比较序列的全长上为大体上相同的，诸如编码目标蛋白质的核苷酸序列。
“保守氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一氨基酸残基取代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经普遍定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，以苯丙氨酸取代酪氨酸为保守取代。一般而言，本发明所涵盖的多肽、可溶性蛋白和/或抗体的序列中的保守取代不消除含有所述氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白或抗体结合至靶结合位点。鉴定不消除结合的氨基酸保守取代的方法为本领域中熟知。
经“分离的”多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为呈自然中未发现的形式的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经纯化至它们不再呈自然中发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，经分离的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为大体上纯。
如本文使用的术语“大体上纯”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
如本文使用的术语“融合蛋白”或“融合多肽”是指由包含至少两种基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。
如本文使用的术语“接头”或“接头区”是指插入于第一多肽(例如抗CD39抗体)与第二多肽(例如Fc或其他FcγRIII结合部分；scFV、Vhh域或类似物，其结合不同蛋白质以产生维持针对CD39的二价的双特异性抗体形式)之间的接头。在一些实施方案中，所述接头为肽接头。接头不应不利地影响所述多肽的表达、分泌或生物活性。优选地，接头不为抗原性的并且不引发免疫反应。
b.核酸
术语“多核苷酸”和“核酸”以及“核酸分子”在本文中可互换使用并且是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们类似物，或可由DNA或RNA聚合酶并入聚合物内的任何底物。
如本文使用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指核苷酸沿脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸链段的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定氨基酸沿多肽(蛋白质)链的顺序。因此，核酸序列编码所述氨基酸序列。
当关于核苷酸序列使用时，如本文使用的术语“序列”，所述术语语法和其他形式可包含DNA或RNA，并且可为单链或双链。核酸序列可经突变。
如本文使用的术语“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送和通常表达一个或多个目标基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体，和囊封于脂质体中的DNA或RNA表达载体。
如本文使用，术语“转染”是指外源核酸进入真核细胞内。转染可通过本领域中已知的各种方法实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪技术(基因枪)。
如本文使用的术语“载体”为包含经分离的核酸的经分离的核酸，其可用于将组合物递送至细胞的内部。本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应解释为包括促进核酸转移至非质粒和非病毒化合物(例如聚赖氨酸化合物、脂质体和类似物)的细胞内。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和类似物。
如本文使用，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含待表达的可操作地连接的控制序列和核苷酸序列。所述表达载体包含足够用于表达的顺式作用元件(顺式作用元件)；用于表达的其他元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中已知的所有载体，诸如粘粒、质粒(例如裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文使用，术语“可操作地连接”是指将调控序列与异源核酸序列之间的功能键联连接至连接件导致后者的表达。例如，当第一核酸序列和第二核酸序列为功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列之间为可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA测序为连续的，且在需要的情况下，在相同阅读框中连接两个蛋白质编码区。
如本文使用，术语“启动子”被定义为多核苷酸序列的细胞特异性转录的合成机制所需的合成机制所识别或引入的启动子DNA序列。
如本文使用的术语“组成型表达”是指全部在生理条件下表达。
如本文使用的术语“诱导型表达”是指在某些疾患下的表达，所述疾患诸如在T细胞抗原结合时发生。如何熟习常规“诱导表达”。
术语“电穿孔”是指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔)；其存在允许生物分子(诸如质粒或其他寡核苷酸)从细胞膜的一侧穿过至另一侧。
c.检查点抑制剂、共刺激激动剂、先天免疫诱导剂和化学治疗剂
“检查点分子”是指由组织和/或免疫细胞表达并以取决于检查点分子的表达程度的方式降低免疫反应的功效的蛋白质。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统的“剎车”被释放，并且例如，T细胞能够更有效地杀死癌细胞。T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白质的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT和Siglec-15。
“检查点抑制剂”是指逆转来自检查点分子的免疫抑制信号传导的药物实体。
“共刺激分子”是指免疫细胞诸如T细胞同源结合配偶体，其特异性地结合至共刺激配体，由此介导共刺激，诸如但不限于增殖。共刺激分子为除促进有效免疫反应的抗原受体或配体外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHCI分子、BTLA受体和Toll配体，和OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)以及4-1BB(CD137)。共刺激分子的实例包括但不限于：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 CD96(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
“共刺激激动剂”是指活化(激动)共刺激分子(诸如共刺激配体将如此)并产生免疫刺激信号或以其他方式增加免疫反应的效能或功效的药物实体。
“先天免疫诱导剂”为模拟先天免疫反应(包括巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和类似物的炎症活性的活化和/或抗炎症活性的去活化)的剂。先天免疫诱导剂包括CD47-SIRPα轴的抑制剂，诸如结合至CD47或SIRPα并抑制两种分子的相互作用以促进抗肿瘤巨噬细胞活性的抗体或其他结合部分。先天免疫诱导剂包括CD24-Siglec-10轴的抑制剂，诸如结合至CD24或Siglec-10并抑制两种分子的相互作用以促进抗肿瘤巨噬细胞活性的抗体或其他结合部分。在其他实施方案中，所述先天免疫活化剂可为NGK2A检查点抑制剂，其阻断NK和CD8+细胞的HLA-E驱动的抑制。先天免疫性的小分子诱导剂包括诸如STING激动剂、TLR7/8激动剂和RIG-I激动剂的剂。
“化学治疗剂”为可适用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，诸如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕酮(β-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)、CAMPTOSAR、乙酰基喜树碱、莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；培美曲塞(pemetrexed)；海绵他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；TLK-286；CDP323、经口α-4整联蛋白抑制剂；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosurea)诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见，例如Nicolaou等人,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A(dynemicin A)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；和新制癌菌素生色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代基-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉并-阿霉素、阿霉素HCl脂质体注射液(DOXIL)和脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)，诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA)、埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和伊马替尼(imatinib)(2-苯基氨基嘧啶衍生物)和其他c-Kit抑制剂；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；德福法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products Eugene Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西咗喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)、白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(ABRAXANE)和多西他赛(doxetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)(VELBAN)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；盐酸米托蒽醌(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；类视黄醇(retinoid)，诸如视黄酸；上文中任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；和上文中的两者或更多者的组合诸如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写)和FOLFOX(使用奥沙利铂(ELOXATIN)与5-FU和亚叶酸(leucovovin)的组合的治疗方案的缩写)。
此定义中还包括抗激素药，其发挥作用以调控、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的效应，并且通常呈全身或全身治疗的形式。它们本身可为激素。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；抗孕激素；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(fulvestrant)(FASLODEX)；发挥作用以抑制或关闭卵巢的剂，例如亮氨酸释放激素(LHRH)激动剂，诸如乙酸亮丙瑞林(LUPRON和ELIGARD)、乙酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin)；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和和抑制调节肾上腺中雌激素产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)，依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RIVISOR)、来曲唑(letrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化学治疗剂的此定义包括双膦酸盐，诸如氯膦酸盐(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)或利塞膦酸盐(ACTONEL)；和曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是抑制涉及细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，诸如，例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，诸如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN)；抗雌激素，诸如氟维司群；Kit抑制剂，诸如伊马替尼或EXEL-0862(酪氨酸激酶抑制剂)；EGFR抑制剂，诸如埃罗替尼(erlotinib)或西妥昔单抗(cetuximab)；抗VEGF抑制剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)；阿里诺替康(arinotecan)；rmRH(例如ABARELIX)；拉帕替尼(lapatinib)和二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，还称为GW572016)；17AAG(热休克蛋白(Hsp)90毒物的格尔德霉素(geldanamycin)衍生物)和上文中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如本文使用，术语“细胞因子”一般是指由一个细胞群体释放的蛋白质，其作为细胞间介体作用于另一细胞上或对产生所述蛋白质的细胞具有自分泌作用。此类细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子；白细胞介素-(“IL”)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29(诸如IL-23)、IL-31，包括PROLEUKIN rIL-2；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β、TGF-β1-3；和其他多肽因子，包括白血病抑制因子(“LIF”)、(“睫状神经营养因子”CNTF)、CNTF样细胞因子(“CLC”)、心肌营养蛋白(“CT”)和Kit配体(“KL”)。
如本文使用，术语“趋化因子”是指具有选择性地诱导白细胞的趋化性和活化的能力的可溶性因子(诸如细胞因子)。它们还触发血管生成、炎症、伤口愈合和肿瘤发生的过程。趋化因子的实例包括IL-8，鼠类角质形成细胞趋化因子(KC)的人同源物。
d.治疗
在免疫功能障碍的上下文中，术语“功能障碍”是指对抗原刺激的免疫反应性降低的状态。所述术语包括其中可发生抗原识别的耗竭和/或无反应的常见元件，但接着发生免疫反应对控制感染或肿瘤生长无效。
如本文使用，“能障碍”功还包括难治性或对抗原识别无反应，具体地，将抗原识别转化为下游T细胞效应功能，诸如增殖、细胞因子产生(例如IL-2)和/或靶细胞杀死的能力受损。
术语“无变应性”是指由通过T细胞受体递送不完整或不足的信号(例如在缺乏ras活化的情况下，细胞内Ca+2的增加)产生的对抗原刺激无反应的状态。T细胞无变应性还可在不存在共刺激的情况下用抗原刺激时产生，导致即使在共刺激的情况下，细胞也对由抗原进行的后续活化变得难治。无反应状态可通常由白细胞介素-2的存在推翻。无变应性T细胞未经历克隆扩增和/或获得效应功能。
术语“耗竭”是指T细胞耗竭，是由于在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导引起的T细胞功能障碍的状态。其与无变应性的区别在于其并非通过不完整或不足的信号传导引起，而由持续的信号传导引起。将其定义为较差的效应功能、抑制受体的持续表达和不同于功能效应物或记忆T细胞的转录状态。耗竭阻止感染和肿瘤的优化控制。
“增强T细胞功能”意指诱导、引起或刺激T细胞以具有持续或放大的生物功能，或更新或再活化耗竭或非活性的T细胞。增强T细胞功能的实例包括：相对于干预前的此类水平，来自CD8+T细胞的γ-干扰素的分泌增加、增殖增加、抗原反应性增加(例如病毒、病原体或肿瘤清除率)。在一个实施方案中，增强的水平为至少50％，或者60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％。测量这种增强的方式为本领域普通技术人员已知。
“T细胞功能障碍病症”特征在于对抗原刺激的反应性降低的T细胞的病症或疾患。在一个特定实施方案中，T细胞功能障碍病症为与CD39的不适当增加的水平特别相关联的病症。在另一实施方案中，T细胞功能障碍病症为其中T细胞无变应性或分泌细胞因子、增殖或执行溶细胞活性的能力降低的病症。在一个特定方面中，降低的反应性导致表达免疫原的病原体或肿瘤的无效控制。特征在于T细胞功能障碍的T细胞功能障碍病症的实例包括未消退的急性感染、慢性感染和肿瘤免疫性。
“肿瘤免疫性”是指其中肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，当减弱这种逃避时，肿瘤免疫性被“治疗”，并且肿瘤由免疫系统识别和攻击。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤缩小和肿瘤清除。
“持续反应”是指在停止治疗后减少肿瘤生长的持续效应。例如，相较于施用阶段起始时的大小，肿瘤大小可保持相同或更小。在一些实施方案中，持续反应具有至少与治疗持续时间相同的持续时间，治疗持续时间的至少1.5x、2.0x、2.5x或3.0x长度。
如本文使用的术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理疾患，其中细胞群体的特征在于不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤和血液系统癌症，诸如淋巴瘤和白血病。
如本文使用的术语“肿瘤”和“赘生物”是指由过度的细胞生长或增殖引起的组织的任何团块，良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括癌前病变。肿瘤生长一般为不受调控的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞的增殖。肿瘤可影响各种细胞、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨骼、大脑、乳房、软骨、神经胶质细胞、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、阴道器官或组织或相应的细胞。肿瘤包括癌症，诸如肉瘤、癌、浆细胞瘤或(恶性浆细胞)。本发明所涵盖的肿瘤可包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓性单核细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症)、淋巴瘤(霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症、重链疾病和实体肿瘤，诸如肉瘤癌(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮内皮瘤肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumora)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌、尼罗河导管癌(Nileduct carcinoma)、绒毛膜癌、精原细胞肿瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。优选地，“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和神经胶质瘤。
如本文使用的术语“转移”是指癌症从身体的起源位点扩散或转移至身体的其他区并在新位置发展类似癌性病变的过程。“转移性”或“转移”细胞为失去与相邻细胞的粘附性接触的细胞并经由血流或淋巴从疾病的原发位点迁移以侵入相邻身体结构者。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指源自癌症或肿瘤或癌前病变的细胞的总群体，包括非致瘤细胞，它们包括大部分的癌细胞群体，和致瘤干细胞(癌症干细胞)。如本文使用，术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”在仅指缺乏更新和分化能力的那些细胞时由术语“非致瘤”修饰以将那些肿瘤细胞与癌症干细胞区分开。
如本文使用的术语“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
如本文使用，“完全反应”或“CR”是指所有靶病变的消失；“部分反应”或“PR”是指靶病变的最长直径(SLD)的总和降低至少30％，以基线SLD为参考；并且“稳定疾病”或“SD”既不是指靶病变足够缩小至符合PR标准，也不是足够增加至符合PD，以自治疗起始的最小SLD为参考。
如本文使用，“进行性疾病”或“PD”是指靶病变的SLD增加至少20％，以自治疗起始或存在一个或多个新病变记录的最小SLD为参考。
如本文使用，“无进展存活期”(PFS)是指在治疗期间和之后的时间长度，在此期间治疗中的疾病(诸如癌症)未恶化。无进展存活期可包括患者已经历完全反应或部分反应的时间量，和患者已经历稳定疾病的时间量。
如本文使用，“整体反应率”(ORR)是指完全反应(CR)率和部分反应(PR)率的总和。
如本文使用，“整体存活率”是指在特定时间段后一组中可能存活的受试者的百分比。
如本文使用的术语“治疗”是指受试者尝试改变通过细胞干预引起的临床疾病的过程或治疗，可为临床病理的预防性干预过程。包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的减轻、减少任何疾病的直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、疾病的改善或缓解或经改善的预后的治疗。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物和类似物，其为特定治疗的受体。通常，关于人受试者，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
如本文使用的术语“激动剂”和“激动”是指或描述可直接或间接大体上诱导、活化、促进、增加或增强靶标和/或途径的生物活性的治疗部分。本文使用术语“激动剂”以包括部分或完全诱导、活化、促进、增加或增强蛋白质或其他目标靶标的活性的任何剂。
如本文使用的术语“拮抗剂”和“拮抗”是指或描述可直接或间接部分或完全阻断、抑制、减少或中和靶标和/或途径的生物活性的治疗部分。本文使用术语“拮抗剂”以包括部分或完全阻断、抑制、降低或中和蛋白质或其他目标靶标的活性的任何剂。
如本文使用的术语“调节(modulation)”和“调节(modulate)”是指生物活性的变化或改变。调节包括但不限于刺激活性或抑制活性。调节可为活性增加或活性降低、结合特征的变化，或与蛋白质、途径、系统或其他目标生物靶标的活性相关联的生物、功能或免疫性质的任何其他变化。
如本文使用的术语“免疫反应”包括来自先天免疫系统和适应性免疫系统的反应。其包括细胞介导的和/或体液免疫反应。其包括T细胞和B细胞反应，和来自免疫系统的其他细胞诸如自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞等的反应。
术语“药学上可接受”是指由联邦政府或州政府的监管机构批准或可批准或美国药典或其他公认的药典列举用于动物(包括人)中的物质。
术语“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”或“可接受的药物载体”是指可连同至少一种本发明的剂一起向受试者施用且不破坏其药物活性且当以足以递送治疗效应的量施用时为无毒的赋形剂、载体或佐剂。一般而言，本领域技术人员和美国FDA认为药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂为任何制剂的非活性成分。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效应”是指有效“治疗”受试者(诸如哺乳动物)的疾病或病症的抗CD39抗体的量。在癌症或肿瘤的情况下，治疗有效量的抗CD39抗体具有治疗效应，并且因此可增强免疫反应、增强抗肿瘤反应、增加免疫细胞的溶细胞活性、增加由免疫细胞杀死肿瘤、减少肿瘤细胞的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减少癌症干细胞的数量或频率；减小肿瘤大小；减少癌细胞群体；抑制或阻止癌细胞浸润至周围器官内，包括，例如，癌症扩散至软组织和骨内；抑制和阻止肿瘤或癌细胞转移；抑制和阻止肿瘤或癌细胞生长；在一定程度上缓解与癌症相关联的症状中的一者或多者；降低发病率和死亡率；改善生活质量；或这些效应的组合。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗(to treat)”或“减轻(alleviating)”或“以减轻(alleviate)”均指(1)治愈、减缓、减少经诊断的病理疾患或病症和/或中止经诊断的病理疾患或病症的进展的治疗措施，和(2)预防或减缓靶向病理疾患或病症的发展的预防或防止措施。因此，需治疗的那些包括已患有所述病症的那些；易患所述病症的那些；和要预防病症的那些。在癌症或肿瘤的情况下，如果患者显示以下中的一者或多者，则所述受试者为根据本发明所涵盖的方法成功地“治疗”：增加的免疫反应、增加的抗肿瘤反应、增加的免疫细胞的溶细胞活性、增加的由免疫细胞杀死肿瘤细胞、癌细胞的数量的减少或癌细胞的完全不存在、肿瘤大小的减小；癌细胞浸润至周围器官内的抑制或不存在，包括癌细胞扩散至软组织和骨内；肿瘤或癌细胞转移的抑制或不存在；癌症生长的抑制或不存在；与特定癌症相关联的一种或多种症状的缓解；降低的发病率和死亡率；生活质量的改善；致瘤性的降低；癌症干细胞的数量或频率的减少；或效应的一些组合。
e.杂项
应了解每当本文以语言“包含”描述实施方案时，另外还提供依据“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的类似实施方案。还应了解每当本文以语言“基本上由…组成”描述实施方案时，另外还提供根据“由……组成”描述的类似实施方案。
如本文使用，提及“约”或“大约”值或参数包括(和描述)针对所述值或参数的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如诸如本文的“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
III.抗CD39抗体
a.单克隆抗体
抗CD39抗体可为单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如由Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)描述的那些。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物通常用免疫剂免疫，以引发产生或能够产生将特异性地结合至所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可经体外免疫。
免疫剂通常包将括CD39多肽或其融合蛋白。一般而言，如果需要人起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)使所述淋巴细胞与永生化细胞融合，以形成杂交瘤细胞[Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)，第59至103页]。永生化细胞系通常为经转化的哺乳动物细胞，尤其啮齿动物、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有抑制未融合、永生化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的永生化细胞系为有效融合，由选择的产生抗体的细胞支持抗体的稳定的高表达程度，和对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些。更优选的永生化细胞系为鼠类骨髓瘤系，其可(例如)自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.和American Type Culture Collection,Manassas,Va获得。人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)，第51至63页]。
然后，可分析其中培养杂交瘤细胞的培养基中抗多肽的单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定(诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定。此类技术和测定为本领域中已知。所述单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Scatchard analysis of Munson andPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)测定。
在鉴定所需杂交瘤细胞后，克隆可通过限制稀释程序亚克隆，并通过标准方法生长[Goding，同上]。适用于此目的的培养基包括例如杜尔贝科氏改良的伊格尔氏培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水体内生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如，例如，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法自培养基或腹水分离或纯化。
单克隆抗体还可通过重组DNA方法制造，诸如美国专利号4,816,567中描述的那些。编码本发明所涵盖的单克隆抗体的DNA可使用常规程序容易分离和测序(例如通过使用能够特异性地结合至编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明所涵盖的杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一旦分离，可将所述DNA放置于表达载体中，然后转染至宿主细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞内，以获得单克隆抗体于重组宿主细胞中的合成。DNA还可例如通过以人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠类序列[美国专利号4,816,567；Morrison等人,同上]，或通过共价连接至非免疫球蛋白多肽的编码序列的所有或部分的免疫球蛋白编码序列修饰。这种非免疫球蛋白多肽可取代本发明所涵盖的抗体的恒定结构域，或者可取代本发明所涵盖的抗体的一个抗原组合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
b.人和人源化抗体
本发明所涵盖的抗CD39抗体还可包含人源化抗体或人抗体。非人(诸如鼠类)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，它们含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基置换。人源化抗体还可包含在受体抗体或经输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，并且通常两个可变结构域中的全部或大体上全部，其中所述CDR区中的全部或大体上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所述FR区中的全部或大体上全部为人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体最优还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
用于人源化非人抗体的方法为本领域中熟知。一般而言，人源化抗体具有引入其中的非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。人源化可大体上遵循Winter和同事的方法进行[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)]，通过以啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，这些“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中大体上小于完整的人可变结构域已由来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体为通常其中一些CDR残基和可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人抗体。
人抗体还可使用本领域中已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术还适用于制备人单克隆抗体[(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。同样，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的小鼠)内制得。一经激发，即观察到人抗体产生，在所有方面中均与人中可见的那些十分相似，包括基因重排、组装和抗体库。这种方法例如描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和以下科学出版物：Marks等人,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology 14,826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)中。
还可使用如上文描述的已知选择和/或诱变方法使抗体亲和力成熟。优选的亲和力成熟的抗体具有比制备所述成熟抗体的起始抗体(通常鼠类、人源化或人)大五倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍的亲和力。
c.双特异性抗体
本文描述的抗CD39抗体包括双特异性分子。可将抗CD39抗体或其抗原结合部分衍生或连接至另一功能分子，例如，另一肽或蛋白质(例如另一抗体或受体的配体)，以产生结合至至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。实际上，本文描述的抗体可经衍生或连接至超过一个其他功能分子，以产生结合至超过两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子还意图由如本文使用的术语“双特异性分子”涵盖。为产生本文描述的双特异性分子，本文描述的抗体可功能性连接(例如由化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，本文提供包含对CD39的至少一个第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本文描述的其中双特异性分子为多特异性的一个实施方案中，所述分子还可包括第三结合特异性。
在某些实施方案中，主题双特异性(或根据具体情况可为多特异性)包括免疫检查点的一个或多个结合结构域，例如，它们为检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT和/或Siglec-15。在某些实施方案中，所述多特异性包括结合T细胞上的检查点蛋白(尤其与T细胞耗竭相关联的检查点诸如LAG-3、TIM-3或TIGIT)的结合结构域。在某些实施方案中，所述多特异性结合至CD39和与检查点相关联的一个或多个其他T细胞，并且导致表达CD39和其所结合的其他检查点蛋白中的每一者或两者的细胞的抗体依赖性细胞毒性。
在某些实施方案中，主题双特异性(或根据具体情况可为多特异性)包括免疫共刺激受体的一个或多个结合结构域，例如，它们为共刺激激动剂(活化剂)，诸如MHCI分子、BTLA受体和铎配体，和OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)的激动剂。多特异性中可包括的共刺激分子的实例包括但不限于：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
在某些实施方案中，主题双特异性(或根据具体情况可为多特异性)包括充当先天免疫活化剂的一个或多个结合结构域，诸如CD47、SIRPα、CD24、Siglec-10或NKG2A的结合部分。
在一个实施方案中，本文描述的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。所述抗体还可为轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，诸如Fv或单链(scFv)构建体。
双特异性分子与它们的特异性靶标的结合可使用本领域公认的方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定确认。这些测定中的每一者一般通过采用对目标复合物具有特异性的经标记的试剂(例如抗体)检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域中已知。传统上，双特异性抗体的重组产生为基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中所述两个重链具有不同特异性[Milstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983)]。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生十种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。所述正确分子的纯化通常通过亲和色谱法步骤进行。类似程序公开于1993年5月13日公布的WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。
具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)可融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。融合优选为与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，所述结构域包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选具有含有融合的至少一者中存在的轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合的DNA和(如果需要)免疫球蛋白轻链插入单独的表达载体内，并共转染至合适的宿主生物体内。就产生双特异性抗体的其他详细说明而言，参见，例如，Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据WO 96/27011中描述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可经工程化以最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。与较大的侧链相同或类似大小的补偿“腔”通过以较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上产生。这提供用于增加异二聚体的产率超过其他非所需最终产物(诸如同二聚体)的机制。
双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术已描述于参考文献中。例如，双特异性抗体可使用化学键联制备。Brennan等人,Science229:81(1985)描述其中将完整抗体蛋白水解裂解以产生F(ab')2片段的程序。这些片段在二硫酚复合剂亚砷酸钠的存在下还原以稳定邻位二硫酚并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，Fab'-TNB衍生物中的一者通过用巯基乙胺还原再转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作用于酶的选择性固定的剂。
Fab'片段可从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的产生。各Fab'片段分别从大肠杆菌分泌，并经受体外定向化学偶联以形成双特异性抗体。因此形成的双特异性抗体可结合至过表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳肿瘤靶标的裂解活性。
用于直接从重组细胞培养制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已进行了描述。例如，双特异性抗体已使用亮氨酸拉链产生(Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接至两种不同抗体的Fab'部分。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法还可用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双功能抗体”技术已提供用于制造双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过太短而不允许在相同链上两个结构域之间配对的接头连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制造双特异性抗体片段的另一策略也已经报告。参见，Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)。
具有超过二价的抗体被考虑。作为一个非限制性实例，可制备三特异性抗体。参见例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
d.异缀合物(Heteroconjugate)抗体
异缀合物抗体也在本发明的范围内。异缀合无抗体包含两个共价连接的抗体。例如，已提出此类抗体使免疫系统细胞靶向非所需细胞[美国专利号4,676,980]，和用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089]。考虑所述抗体可在体外使用合成蛋白化学中的已知方法制备，所述方法包括涉及交联剂的那些。例如，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建。适用于此目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯，和公开于例如美国专利号4,676,980中的那些。
e.效应功能工程化
可能需要修饰本发明所涵盖抗体的效应功能，以增强例如抗CD39抗体治疗癌症的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区内，由此允许在此区中形成链间二硫键。因此产生的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀死和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,J.Exp Med.,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。在某些优选的实施方案中，工程化的效应功能为抗CD39抗体诱导从免疫细胞FcγRIII结合依赖性移除(诸如通过抗CD39抗体介导的靶胞吞)CD39，即不通过细胞杀死耗减免疫细胞群体的能力。
具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等人,CancerResearch,53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备。或者，抗体可经工程化以具有双重Fc区，并且可由此具有增强的CD39胞啃(trogocytosis)能力。参见Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design,3:219-230(1989)。
f.代表性抗CD39抗体序列
在某些实施方案中，抗CD39抗体为完全人抗体，诸如从人抗体文库产生。一种示例性完全人抗CD39抗体为克隆Ig39-21，重和轻可变结构域(VH和VL)序列如下提供：
核酸序列 氨基酸序列
VH结构域 SEQ ID No.1(VH) SEQ ID No.2(VH)
VL结构域 SEQ ID No.3(VL) SEQ ID No.4(VL)
就Ig39-21克隆而言，VH和VL结构域中的每一者的CDR为：
CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No.29 SEQ ID No.30 SEQ ID No.31
VL SEQ ID No.32 SEQ ID No.33 SEQ ID No.34
利用上文VH和VL结构域的示例性全长抗体和示例性单链抗体(scFV)的序列如下提供：
核酸序列 氨基酸序列
全长重链 SEQ ID No.35 SEQ ID No.36
全长轻链 SEQ ID No.37 SEQ ID No.38
scFV SEQ ID No.39 SEQ ID No.40
在一些实施方案中，抗CD39抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变结构域，其与本文描述的VH结构域序列(诸如SEQ ID No.2)至少60％同一，并且与本文描述的VH结构域序列(诸如SEQ ID No.2)甚至更优选至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一，且能够特异性地结合人CD39。
在一些实施方案中，抗CD39抗体或其抗原结合片段包含至少一个轻链可变结构域，其与本文描述的VL结构域序列(诸如SEQ ID No.4)至少60％同一，并且与本文描述的VL结构域序列(诸如SEQ ID No.4)甚至更优选至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一，且能够特异性地结合人CD39。
在某些实施方案中，抗CD39抗体为包含具有与SEQ ID No.29、30和31中所示的VH结构域的CDR和SEQ ID No.32、33和34中所示的相应VL结构域的CDR缔合的人框架序列的VH结构域的人源化抗体。本文描述的抗CD39抗体的CDR优选与本文描述的CDR相同，但可在各CDR上变化1、2或3个氨基酸，只要所得抗体特异性地结合人CD39。
在某些实施方案中，抗CD39抗体的重链和轻链具有可变结构域，所述可变结构域可由与本文描述的VH和VL结构域(相应地)编码序列诸如那些SEQ ID No.1(VH)和SEQ IDNo.3(VL)中所示的那些相同或在严格条件(诸如在45℃下6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，和在50℃至65℃下于0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤)下杂交的核酸编码。
在一些实施方案中，抗CD39抗体在兔中产生，并且这些抗体的重链和轻链的可变结构域为兔序列，而恒定结构域为人序列。兔抗CD39抗体的VH和VL结构域的示例性序列为：
Figure BDA0003354910840000571
Figure BDA0003354910840000581
Figure BDA0003354910840000591
在一些实施方案中，抗CD39抗体在兔中产生，然后通过CDR移植人源化。人源化兔抗CD39抗体的VH和VL结构域的示例性序列为：
Figure BDA0003354910840000592
在一些实施方案中，本文提供的抗抗CD39抗体促进：(i)当与HCC1739BL细胞孵育时的稳定免疫复合物形成，如通过在24小时后所述免疫复合物的损失小于30％所表征，任选地其中所述免疫复合物形成通过荧光强度使用荧光标记的第二抗体检测；(ii)针对CD39+细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；(iii)CD45+免疫细胞上的CD39的抗体介导的靶胞吞；(iv)来自肿瘤中肿瘤血管内皮破坏或血管分布网络崩溃的CD39的抗体介导的靶胞吞；(v)(任选地)结合至具有选自图33中所列的CD39氨基酸表位序列的组的序列的CD39表位(例如结合一个或多个线性或构象CD39表位，诸如选自由以下组成的组：1)IYLTDCMERAR、2)LRMESEELADR、3)RVKGPGISKFV、4)DCMERAREVIPR、5)LTDCMERAREVIPR、6)SLSNYPFDFQGAR、7)CRVKGPGISKF、8)GAYGWITINYLLGKFSQK、9)ILRDPCFHPGYKK及其任何组合，诸如RVKGPGISKFV和DCMERAREVIPR、LTDCMERAREVIPR和SLSNYPFDFQGAR或CRVKGPGISKF、GAYGWITINYLLGKFSQK，和/或ILRDPCFHPGYKK)；和/或(vi)(任选地)以与单克隆抗体克隆A1非竞争性或仅部分竞争性结合至CD39的方式结合至CD39。
根据序列鉴定编号的上文描述的代表性抗CD39抗体序列对应于以下：
SEQ ID No.1(克隆IG39-21 vH核酸序列)
Figure BDA0003354910840000601
Figure BDA0003354910840000611
SEQ ID No.2(克隆IG39-21 vH氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000621
SEQ ID No.3(克隆IG39-21 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000622
SEQ ID No.4(克隆IG39-21 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000631
SEQ ID No.5(克隆9B6 vH结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000632
SEQ ID No.6(克隆9B6 vH结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000641
SEQ ID No.7(克隆9B6 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000651
SEQ ID No.8(克隆9B6 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000652
SEQ ID No.9(克隆8C11 vH结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000661
SEQ ID No.10(克隆8C11 vH结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000662
Figure BDA0003354910840000671
SEQ ID No.11(克隆8C11 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000672
SEQ ID No.12(克隆8C11 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000681
SEQ ID No.13(克隆8D8 vH结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000682
Figure BDA0003354910840000691
SEQ ID No.14(克隆8D8 vH结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000692
SEQ ID No.15(克隆8D8 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000701
SEQ ID No.16(克隆8D8 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000702
SEQ ID No.17(克隆9C10 vH结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000711
SEQ ID No.18(克隆9C10 vH结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000721
SEQ ID No.19(克隆9C10 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000731
SEQ ID No.20(克隆9C10 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000732
Figure BDA0003354910840000741
SEQ ID No.21(克隆65H5 vH结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000742
SEQ ID No.22(克隆65H5 vH结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000743
Figure BDA0003354910840000751
SEQ ID No.23(克隆65H5 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000752
SEQ ID No.24(克隆65H5 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000753
Figure BDA0003354910840000761
SEQ ID No.25(克隆2G12 vH结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000762
SEQ ID No.26(克隆2G12 vH结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000771
SEQ ID No.27(克隆2G12 vL结构域核酸序列)
Figure BDA0003354910840000781
SEQ ID No.28(克隆2G12 vL结构域氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000782
SEQ ID No.29(克隆IG39-21 vH结构域CDR1氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000791
SEQ ID No.30(克隆IG39-21 vH结构域CDR2氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000792
SEQ ID No.31(克隆IG39-21 vH结构域CDR3氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000793
SEQ ID No.32(克隆IG39-21 vL结构域CDR1氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000794
SEQ ID No.33(克隆IG39-21 vL结构域CDR2氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000795
SEQ ID No.34(克隆IG39-21 vL结构域CDR3氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000796
SEQID No.35(克隆IG39-21全长vH链核酸序列)
Figure BDA0003354910840000801
Figure BDA0003354910840000811
Figure BDA0003354910840000821
SEQ ID No.36(克隆IG39-21全长vH链氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000822
Figure BDA0003354910840000831
Figure BDA0003354910840000841
SEQ ID No.37(克隆IG39-21全长vL链核酸序列)
Figure BDA0003354910840000842
SEQ ID No.38(克隆IG39-21全长vL链氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000851
SEQ ID No.39(克隆IG39-21 scFv核酸序列)
Figure BDA0003354910840000861
SEQ ID No.40(克隆IG39-21 scFv氨基酸序列)
Figure BDA0003354910840000871
Figure BDA0003354910840000881
SEQ ID No.41
Figure BDA0003354910840000882
SEQ ID No.42
Figure BDA0003354910840000883
Figure BDA0003354910840000891
SEQ ID No.43
Figure BDA0003354910840000892
SEQ ID No.44
Figure BDA0003354910840000901
SEQ ID No.45
Figure BDA0003354910840000902
Figure BDA0003354910840000911
SEQ ID No.46
Figure BDA0003354910840000912
SEQ ID No.47
Figure BDA0003354910840000913
Figure BDA0003354910840000921
SEQ ID No.48
Figure BDA0003354910840000922
SEQ ID No.49
Figure BDA0003354910840000923
Figure BDA0003354910840000931
SEQ ID No.50
Figure BDA0003354910840000932
SEQ ID No.51
Figure BDA0003354910840000941
SEQ ID No.52
Figure BDA0003354910840000942
SEQ ID No.53
Figure BDA0003354910840000951
SEQ ID No.54
Figure BDA0003354910840000952
Figure BDA0003354910840000961
SEQ ID No.55
Figure BDA0003354910840000962
SEQ ID No.56
Figure BDA0003354910840000963
Figure BDA0003354910840000971
为用于人患者中，将希望人源化这些抗体，用人恒定区置换重链和轻链的恒定区，以及用人抗体框架区置换可变区的框架区。在一些实施方案中，抗CD39抗体或其抗原结合片段为兔抗体的人源化形式。
在一些实施方案中，抗CD39抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变，其与SEQ ID No.6、10、14、18、22、26、42、46、50或54至少60％同一，并且甚至更优选与SEQ IDNo.6、10、14、18、22、26、42、46、50和54至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一，且能够特异性地结合人CD39。
在一些实施方案中，抗CD39抗体或其抗原结合片段包含至少一个轻链可变，其与SEQ ID No.8、12、16、20、24、28、44、48、52或56至少60％同一，并且甚至更优选与SEQ IDNo.8、12、16、20、24、28、44、48、52或56至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一，且能够特异性地结合人CD39。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如其中衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在某些实施方案中，抗CD39抗体为人源化抗体，其包含具有与选自SEQ ID No.6、10、14、18、22、26、42、46、50或54的VH结构域的CDR，和选自SEQ ID No.8、12、16、20、24、28、44、48、52或56的相应VL结构域的CDR缔合的人框架序列的VH结构域。所述CDR优选为相同的，但可在各CDR上变化1、2或3个氨基酸，只要所得抗体特异性地结合人CD39。
人源化抗体和制造它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“定向选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；源自特定子组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(经体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施方案中，本文提供的抗CD39抗体为人抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术产生。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
例如，人抗体可通过向转基因动物施用免疫原制备，所述转基因动物已经修饰以响应于抗原性激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座中的全部或一部分，它们置换内源性免疫球蛋白基因座，或它们存在于染色体外或随机整合至所述动物的染色体内。在此类转基因小鼠中，所述内源性免疫球蛋白基因座一般已经灭活。关于用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSE技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述HuMAB技术的美国专利号5,770,429；描述K-MMOUSE技术的美国专利号7,041,870，和描述VELOCIMOUSE技术的美国专利申请公布号US 2007/0061900)。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可例如通过与不同的人恒定区组合而经进一步修饰。
人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系已进行了描述。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51至63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA,103:3557-3562(2006)中。另外方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中的那些。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methodsand Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可通过分离选自人来源的噬菌体、酵母或细菌展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生。然后此类可变结构域序列可与所需的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
为阐述，本发明所涵盖的抗CD39抗体可通过针对具有所需活性的抗体筛选组合文库分离。例如，本领域中已知各种方法用于产生噬菌体或酵母展示文库并针对具有所需结合特征的抗体筛选这些文库。这些方法综述于例如Hoogenboom等人,Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,N.J.,2001)且进一步描述例如于McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
作为噬菌体展示方法的一个实例，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并随机重组于噬菌体文库中，然后它们可针对如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述的抗原结合噬菌体筛选。噬菌体通常展示抗体片段，呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，如由Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)描述，原始库可经克隆(例如自人)以提供针对广泛范围的非自身抗原以及还有自身抗原的单一来源抗体而无需任何免疫。最后，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述，原始文库还可通过从干细胞克隆未经重排的V基因片段和使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并进行体外重排合成制备。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中认为是人抗体或人抗体片段。
FcγRIII结合还可通过根据现有技术的方法增加，例如，通过修饰抗体的Fc部分的氨基酸序列或抗体的Fc部分的糖基化(参见，例如EP2235061)。在某些实施方案中，主题抗体由其中当糖基化时，所述抗体上小于50％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖的细胞产生。通常，在“低岩藻糖基化”抗体制备中，小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于5％或小于1％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖。在附接至IgG重链的CH2结构域的碳水化合物中，“无岩藻糖基化”抗体缺乏α-1,6-岩藻糖。Mori,K等人,Cytotechnology 55(2007)109和Satoh M等人,Expert Opin Biol Ther.6(2006)1161-1173涉及FUT8(α-1,6-岩藻糖基转移酶)基因敲除CHO系用于产生无岩藻糖基化抗体。
IV.表达载体
在某些实施方案中，使用重组表达载体以扩增和表达编码本文描述的抗CD39抗体的DNA。例如，重组表达载体可为可复制DNA构建体，其具有编码可操作地连接至源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录和/或翻译调控元件的抗CD39抗体的多肽链的合成或cDNA来源的DNA片段。转录单元一般包含以下的组装：(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)结构或编码序列，其被转录为mRNA并翻译为蛋白质，和(3)适当的转录和翻译起始和终止序列。调控元件可包括操作子序列以控制转录。在宿主中复制的能力通常由复制的起源赋予，并且可另外并入促进转化子的识别的选择基因。当DNA区在功能上彼此相关时，它们被“可操作地连接”。例如，如果信号肽的DNA表达为参与多肽的分泌的前体，则其(分泌前导序列)可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子控制序列的转录，则其可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被放置以便于允许翻译，则其可操作地连接至编码序列。在一些实施方案中，意图用于酵母表达系统中的结构元件包括使得可由宿主细胞细胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。在其他实施方案中，当在不存在前导序列或转运序列的情况下表达重组蛋白时，其可包括N末端甲硫氨酸残基。此残基随后可任选地从表达的重组蛋白裂解以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主细胞的选择。可采用各种表达宿主/载体组合。适用于真核宿主的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。适用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9和它们衍生物，和更广泛的宿主范围质粒，诸如M13和其他丝状单链DNA噬菌体。
适用于表达抗CD39抗体的多肽链的宿主细胞(或用作靶标的蛋白质)包括在适当的启动子的控制下的原核生物、酵母细胞、昆虫细胞或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括如下文描述的已建立的哺乳动物起源的细胞系。还可采用无细胞翻译系统。适合与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的克隆和表达载体为本领域技术人员熟知的。
使用各种哺乳动物细胞培养系统以表达重组多肽。重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达可为优选的，因为此类蛋白质一般被正确折叠、适当修饰且具有生物功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7(猴肾来源的)、L-929(鼠成纤维细胞来源的)、C127(鼠类乳腺肿瘤来源的)、3T3(鼠类成纤维细胞来源的)、CHO(中国仓鼠卵巢来源的)、HeLa(人宫颈癌来源的)、BHK(仓鼠肾成纤维细胞来源的)和HEK-293(人胚胎肾脏来源的)细胞系及其变体。哺乳动物表达载体可包含非转录元件，诸如复制起点、适用于连接至待表达的基因的启动子和增强子和其他5'或3'侧翼非转录序列和5'或3'非翻译序列，诸如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。
重组蛋白在昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中的表达也提供用于产生正确折叠和具有生物功能的蛋白质的可靠方法。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统为本领域技术人员熟知的。
在某些实施方案中，多核苷酸包含编码抗体轻链的多核苷酸，所述抗体轻链包含与SEQ ID No.1至少60％同一的可变区，并且甚至更优选与SEQ ID No.1至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一的可变区，且能够特异性地结合人CD39。
在某些实施方案中，多核苷酸包含编码抗体重链的多核苷酸，所述抗体重链包含与SEQ ID No.2至少60％同一的可变区，并且甚至更优选与SEQ ID No.2至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一的可变区，且能够特异性地结合人CD39。
V.用于体内递送的经编码的抗CD39抗体
用于在患者中递送待表达的抗CD39抗体的编码序列的治疗载体可为病毒、非病毒或物理的。参见，例如，Rosenberg等人,Science,242:1575-1578,1988，和Wolff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9011-9014(1989)。用于基因疗法中的方法和组合物的论述包括Eck等人,Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第九版，Hardman等人编,McGraw-Hill,New York,(1996)，第5章，第77至101页；Wilson,Clin.Exp.Immunol.107(增刊1):31-32,1997；Wivel等人,Hematology/Oncology Clinicsof North America,Gene Therapy,S.L.Eck编，12(3):483-501,1998；Romano等人,StemCells,18:19-39,2000，以及其中引用的参考文献中。美国专利号6,080,728也提供各种基因递送方法和组合物的论述。递送途径包括例如全身施用和原位施用。熟知的病毒递送技术包括使用腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、泡沫病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺相关病毒载体。
a.病毒载体
优选的病毒载体为基于非细胞病性真核病毒，其中非必需基因已被携带编码表位和靶向目标序列的核酸序列的核酸构建体置换。本发明所涵盖的某些实施方案的优选病毒为腺病毒和腺相关病毒(AAV)，它们为已经批准在基因疗法中用于人用途的双链DNA病毒。另外，用于耐受的优选载体不包含免疫刺激序列。
腺病毒载体
用于体内递送一种或多种核酸序列的一种说明性方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意指包括含有足以(a)支持包装构建体和(b)在有义或反义方向上表达其中已经克隆的多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。当然，在反义构建体的上下文中，表达不需要基因产物为合成的。在一个具体实施方案中，所述递送载体涉及细胞色素b5还原酶3(CYB5R3)的市售ORF，腺病毒载体pAd中的转录变体1，具有C末端Flag和His标签，(Vigene Biosciences产品编码AH889428)。WIPO专利申请WO/2015/050364还教示具有包括Cyb5r3基因的表达构建体的载体。
腺病毒载体为高度免疫原性的，且因此并不优选通过呈递抗原或在自身免疫疾病的情况下施用以诱导耐受性。然而，这些载体可用于诱导免疫性，例如用于治疗感染性疾病等，包括例如流感、HBV、HCV和HIV。
腺相关病毒载体(AAV)
AAV由于其安全性而为递送媒介物的良好选择，即，经遗传工程化(重组)不整合至宿主基因组内。同样，AAV不为致病的，且不与任何疾病相关联。病毒编码序列的移除将免疫反应最小化至病毒基因表达，并且因此，rAAV不引起炎症反应。根据一个具体实施方案，包含含有本文描述的核酸构建体的表位序列的AAV载体适用于转导APC。
通常，包含含有核酸构建体的表位的病毒载体从编码所需表位的多核苷酸、合适的调控元件和介导细胞转导的表位表达必需的元件组装。在一个实施方案中，采用腺相关病毒(AAV)载体。在一个更具体的实施方案中，所述AAV载体为AAV1、AAV6或AAV8。
具有由AAV ITR结合的目标DNA分子的AAV表达载体可通过将选择的序列直接插入其中已切除主要的AAV开放阅读框(“ORF”)的AAV基因组内构建。本发明的AAV中可包含的组成型启动子的实例包括但不限于示例性CMV立即早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
就真核细胞而言，表达控制序列通常包括启动子、增强子、诸如源自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒的那些，以及可包含剪接供体和受体位点的聚腺苷酸化序列。所述聚腺苷酸化序列一般在转基因序列之后和3'ITR序列之前插入。在一个实施方案中，可使用牛生长激素polyA。
这些和其他常见载体和调控元件的选择为常规的，并且许多这些序列为可获得的。参见，例如，Sambrook等人以及其中引用的参考文献，例如，于第3.18-3.26和16.17-16.27页和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989)。当然，并非所有载体和表达控制序列均将同样好地发挥作用以表达本发明的所有转基因。然而，本领域技术人员可在这些表达控制序列中作出选择而不背离本发明的范围。合适的启动子/增强子序列可由本领域技术人员使用由本申请提供的指导选择。这种选择为常规问题，并且不是对分子或构建体的限制。
逆转录病毒载体
在某些实施方案中，病毒载体可为逆转录病毒载体。“逆转录病毒”为具有RNA基因组的病毒。在特定实施方案中，逆转录病毒载体含有包装和整合病毒基因组必需的所有顺式作用序列，即，(a)位于载体每一端的长末端重复(LTR)或其部分；(b)用于负链和正链DNA合成的引物结合位点；和(c)将基因组RNA并入病毒体内必需的包装信号。关于逆转录病毒载体的更多细节可参见Boesen等人,1994,Biotherapy 6:291-302；Clowes等人,1994,J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem等人,1994,Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141；Miller等人,1993,Meth.Enzymol.217:581-599；和Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.in Genetics andDevel.3:110-1 14。
“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科家族的属。示例性γ逆转录病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠类白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮病病毒。
广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合的那些(参见，例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739,1992；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640,1992；Sommerfelt等人,Virol.176:58-59,1990；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378,1989；Miller等人,J.Virol.65:2220-2224,1991；和PCT/US94/05700)。
慢病毒载体是指可感染分裂细胞和非分裂细胞并通常产生高病毒滴度的逆转录病毒的属。慢病毒的若干实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括1型HIV和2型HIV)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在特定实施方案中，可使用其他逆转录病毒载体。这些包括例如基于人泡沫病毒(HFV)或泡沫病毒属中的其他病毒的载体。泡沫病毒(FVes)为当今已知的最大逆转录病毒，且广泛分布于不同的哺乳动物中，包括所有非人灵长类动物物种，然而不存在于人中。这种完全无病原性使FV载体成为人基因疗法的理想基因转移媒介物，并清楚地将FV载体作为基因递送系统与HIV来源以及还有γ逆转录病毒来源的载体加以区分。
非细胞病性病毒包括逆转录病毒(例如慢病毒)，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录成DNA，和随后将前病毒整合至宿主细胞DNA内。逆转录病毒已经批准用于人基因疗法试验。最有用为复制缺陷(即，能够定向合成所需蛋白质，但不能制造感染性颗粒)的那些逆转录病毒。此类经遗传改变的逆转录病毒表达载体针对体内基因的高效转导具有一般效用。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括将外源性遗传物质并入质粒内，转染内衬质粒的包装细胞，由包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组织培养基收集病毒颗粒，和用病毒颗粒感染靶细胞的步骤)为本领域技术人员已知。
逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的三种基因gag、pol和env。从gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装至病毒体内的信号。逆转录病毒载体为基因转移质粒，其中异源核酸残基位于两个逆转录病毒LTR之间。逆转录病毒载体通常含有适当的包装信号，它们使得逆转录病毒载体或使用逆转录病毒载体作为模板转录的RNA包装至适当包装细胞系中的病毒病毒体内(参见，例如，美国专利号4,650,764)。这两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5'和3'端。这些含有强启动子和增强子序列，并且还需整合至宿主细胞基因组中(Coffin,1990)。为构建逆转录病毒载体，将编码一个或多个目标寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸插入病毒基因组内来取代某些病毒序列，以产生复制缺陷的病毒。还包括基于慢病毒(例如逆转录病毒的一种类型)的逆转录病毒载体的游离型或非整合型形式。
当需要稳定表达时，慢病毒载体为有用的，但慢病毒载体可为免疫原性的，且可能具有其他非所需效应。因此，尽管慢病毒载体便于研究，但当针对人施用使用它们时，尤其在需诱导耐受性而非免疫性的情况下应加以注意。尽管mRNA电穿孔更为安全，但慢病毒适用于针对癌症疗法离体工程化T细胞或树突状细胞或其他抗原呈递细胞。然而，两项最近进展已使慢病毒的使用更安全且更临床上可转化。首先，自杀基因连同抗原一起的共表达，当施用药物时，所述抗原的产物变得发挥作用。一个典型实例为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)。表达这些基因的细胞可将药物更昔洛韦(ganciclovir)代谢为诱导细胞死亡的细胞毒性产物。因此，在一些经转导的细胞变为恶性的情况下，它们可被根除。存在约一打此类系统(Duarte等人,Cancer Letters,324:160-170,2012)。其次，现正研发非整合型慢病毒载体，因此它们为非致癌的(Nightingale等人,2006,Mol.Ther.,13:1121-1132)。根据本领域技术人员的判断，这些方法可与本发明一起使用。
适用于本文中的逆转录病毒载体描述于例如美国专利号5,399,346和5,252,479中；和WIPO公布WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266和WO 92/14829中，它们提供使用这些逆转录病毒载体将核酸有效引入人细胞内的方法的描述。其他逆转录病毒载体包括例如小鼠乳腺肿瘤病毒载体(例如Shackleford等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:9655-9659,1998)、慢病毒等。一种示例性病毒载体为plentilox-IRES-GFP。
可容易适应于递送编码抗CD39抗体剂的转基因的另外逆转录病毒递送系统包括(仅为阐述)已公布的PCT申请WO/2010/045002、WO/2010/148203、WO/2011/126864、WO/2012/058673、WO/2014/066700、WO/2015/021077、WO/2015/148683、WO/2017/040815，它们中的每一者的说明书和图均以引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，逆转录病毒为包含以下的具有重组复制能力的逆转录病毒：编码逆转录病毒GAG蛋白的核酸序列；编码逆转录病毒POL蛋白的核酸序列；编码逆转录病毒包膜的核酸序列；和在肿瘤逆转录病毒(oncoretroviral)多核苷酸序列的5'和3'端包含长末端重复(LTR)序列的肿瘤逆转录病毒多核苷酸序列；包含可操作地连接至抗CD39抗体剂的编码序列的内部核糖体进入位点(IRES)的盒，其中所述盒位于3'LTR的U3区的5'和编码逆转录病毒包膜的序列的3'处；以及用于在靶细胞中逆转录、包装和整合的顺式作用序列。
在某些实施方案中，逆转录病毒为包含以下的具有重组复制能力的逆转录病毒：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；包含于逆转录病毒多核苷酸序列的3'端的长末端重复(LTR)序列、于逆转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列(所述启动子适用于在哺乳动物细胞中表达)、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域的逆转录病毒多核苷酸；包含可操作地连接至异源多核苷酸的抗CD39抗体剂编码序列的盒，其中所述盒位于5'至3'LTR处并经可操作地连接，和3'至编码逆转录病毒包膜的env核酸结构域；以及在靶细胞中逆转录、包装和整合必需的顺式作用的序列。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的某些优选实施方案中，包膜选自两性、多性、异种、10A1、GALV、狒狒内源性病毒、RD114、弹状病毒、α病毒、麻疹或流感病毒包膜中的一者。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的某些优选实施方案中，逆转录病毒多核苷酸序列从选自由以下组成的组的病毒工程化：鼠类白血病病毒(MLV)、莫罗尼鼠类白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(BEV)、猪内源性病毒(PERV)、猫源性逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒、异种鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)、禽网状内皮内皮病病毒(REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的某些优选实施方案中，逆转录病毒为γ逆转录病毒。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的某些优选实施方案中，存在第二盒，所述第二盒包含第二治疗蛋白的编码序列，诸如另一检查点抑制剂多肽、共刺激多肽和/或免疫刺激细胞因子(仅作为实例)，例如在所述盒的下游。在某些实例中，所述第二盒可包含内部核糖体进入位点(IRES)或可操作地连接至第二治疗蛋白的编码序列的微型启动子或polIII启动子。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的某些优选实施方案中，其为非溶解性、两性逆转录病毒复制载体，优选地，其在肿瘤微环境的细胞中选择性感染并复制。
作为表达构建体的其他病毒载体
其他病毒载体可用作本发明中用于向宿主细胞递送寡核苷酸或多核苷酸序列的表达构建体。可采用源自诸如牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒的病毒的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供数种吸引人的特征。还包括B型肝炎病毒。
b.非病毒载体
质粒载体
其他载体包括质粒载体。质粒载体已广泛描述于本领域中且为本领域技术人员熟知。参见，例如，上文引用的Sambrook等人,1989。在过去数年间，质粒载体已用作DNA疫苗，用于向细胞体内递送抗原编码基因。它们对这一点尤为有利，因为它们没有与病毒载体中的许多相同的安全性问题。然而，具有可与宿主细胞相容的启动子的这些质粒可表达质粒内由核酸编码的肽表位。其他质粒为本领域普通技术人员熟知。另外，质粒可使用限制酶和连接反应进行定制设计，以移除和添加DNA的特定片段。质粒可通过各种胃肠外、粘膜和局部途径递送。例如，DNA质粒可通过肌内、皮内、皮下或其他途径注射。其还可通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和口服施用。其还可使用基因枪施用至表皮或粘膜表面内。所述质粒可在水溶液中给予，在金颗粒上干燥，或与另一DNA递送系统(包括但不限于脂质体、树状聚合物、耳蜗和微囊化)结合。
因此，在一个方面中，提供质粒用于表达含有表位的核酸构建体，所述核酸构建体包括表达盒；也称为转录单元。当将质粒放置于适用于表位表达的环境中时，所述转录单元将表达多核苷酸，所述多核苷酸包括编码表位的序列、ETS和MHCII启动子序列或编码表位和分泌信号序列的序列，以及在所述构建体中经编码的任何其他序列。转录单元包括转录控制序列，其与细胞免疫反应元件编码序列转录连接。转录控制序列可包括启动子/增强子序列，诸如巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子序列。然而，本领域技术人员将知晓适用于在真核细胞中表达的各种其他启动子序列系已知的且可同样用于本文公开的构建体中。核酸产物的表达水平将取决于相关联的启动子和相关联的增强子元件的存在和活化。
在某些实施方案中，可将编码所需表位和靶向序列的序列克隆至表达质粒内，所述表达质粒含有用于转录、翻译、RNA稳定性和复制的调控元件(即，包括转录控制序列)。此类表达质粒为本领域中熟知且本领域普通技术人员将能够用包含编码细胞免疫反应元件或其片段的序列的多核苷酸以所述细胞免疫反应元件可表达的方式设计适当的表达构建体。存在合适的表达质粒的许多实例，其中包括序列的多核苷酸可经克隆，诸如pCI-neo、pUMVC或pcDNA3。
大量携带用于表达细胞免疫反应元件或其片段的质粒的细菌宿主可经发酵和所述质粒可经纯化以后续使用。使用质粒的当前人临床试验利用这种方法。重组DNA咨询委员会数据管理报告，Human Gene Therapy 6:535-548,1994。本领域中已知的当前DNA分离方法包括移除脂多糖(内毒素)，它们为来自用于增殖所述质粒的细菌的污染物。这一步骤最优选用于使用致耐受性的DNA疫苗，因为内毒素充当强佐剂且可产生非所需的免疫刺激。
质粒的目的为将核酸序列有效递送至细胞或组织并在细胞或组织中表达治疗表位。特别地，所述质粒的目的可为实现高拷贝数、避免质粒不稳定性的潜在原因并提供质粒选择的方式。至于表达，核酸盒含有用于在所述盒内表达核酸的必需元件。表达包括用质粒有效转录插入的基因、核酸序列或核酸盒。表达产物可为蛋白质、多肽或RNA。核酸盒中可含有核酸序列。核酸的表达可为连续的或经调控的。
微环
本文描述的核酸构建体的实施方案可以微环DNA的形式加工。微环DNA属于小型(2至4kb)环形质粒衍生物，它们已从所有原核载体部分释放。由于微环DNA载体不含有细菌DNA序列，因此不太可能将它们视为外来的和经破坏的。(典型的转基因递送方法涉及含有外源DNA的质粒)。因此，相较于常规质粒(数天至数周)，这些载体可表达更长的时间周期(按数周或数月的顺序)。较小尺寸的微环还扩展它们克隆能力并促进它们递送至细胞内。用于产生微环DNA的试剂盒为本领域中已知且为市售的(System Biosciences,Inc.,PaloAlto,Calif.)。关于微环DNA的信息提供于Dietz等人,Vector Engineering and DeliveryMolecular Therapy(2013)；21 8,1526-1535和Hou等人,Molecular Therapy-Methods&Clinical Development，文章编号：14062(2015)doi:10.1038/mtm.2014.62中。关于微环的更多信息系提供于Chen Z Y、He C Y、Ehrhardt A、Kay M A.Mol Ther.2003年9月；8(3):495-500中，并且微环DNA载体实现由活性染色质和转录水平反映的持续表达。GraceyManiar L E、Maniar J M、Chen Z Y、Lu J、Fire A Z、Kay M A.Mol Ther.2013年1月；21(1):131-8。
作为最终获得由核酸编码的产物的表达的方法中的初始步骤，为实现由细胞摄取核酸。由细胞摄取核酸取决于许多因素，它们中的一者为核酸接近细胞表面的时间长度。例如，在肌内(i.m.)施用于缓冲剂中的质粒DNA后，如果按摩所述肌肉，则观察到基因表达的显著降低，可能是由于DNA直接或经由淋巴血管从所述肌肉漏出(Human Gene Therapy 4:151-159；1993)。因此，可能需要以延迟核酸扩散的速率或被带离需要细胞摄取核酸的位点的化合物配制核酸。此外，这些化合物可适用于通过诸如注射的方式向生物体施用，同时维持或恢复增加细胞摄取核酸必需的物理特征。
为实现寡核苷酸或多核苷酸序列的表达，必须将表达构建体递送至细胞内。在本发明所涵盖的某些实施方案中，包含一个或多个寡核苷酸或多核苷酸序列的表达构建体可仅由裸重组DNA或质粒组成。
为诱发免疫性，优选地将任何类型的DNA疫苗载体工程化为富含CpG(以刺激免疫细胞上的TLR9)或相反经工程化以移除CpG，并且在可能的情况下，用GpG基序置换CpG基序(Ho等人,J.Immunol.71(9):4920-6,2003；Ho等人,J.Immunol.175(9):6226-34,2005)。DNA疫苗可经工程化以含有抗原/表位，并且还可含有与抗原共表达以充当佐剂或免疫调节剂(多种启动子载体)的另外基因。已发现这些DNA疫苗为临床上安全的，例如在T1D患者中(Roep等人,Sci.Transl.Med.5(191):191ra82,2013)。
机械递送系统
另外的非病毒递送方法包括但不限于可体外使用的机械递送系统，诸如Woffendin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(24):11581,1994中描述的方法；沉积光聚合水凝胶材料或使用电离辐射(参见，例如，美国专利号5,206,152和WO 92/11033号)；使用手持式基因转移颗粒枪(参见，例如，美国专利号5,149,655)；和使用电离辐射来活化经转移的基因(参见，例如，美国专利号5,206,152和WO 92/11033)。递送装置还可为生物相容的，并且还可为生物可降解的。制剂优选提供相对恒定水平的活性组分释放。另一方面，可能需要在施用后更快速率的立即释放。使用已知技术，此类组合物的配制完全在本领域普通技术人员的水平内。
增强递送的物理方法包括电穿孔(其中高压的短脉冲携带核酸跨越膜)、基因枪(其中将DNA负载至金颗粒上并迫使DNA渗透至细胞内)、声致穿孔、磁转染、流体动力学递送等，它们中的全部均为本领域技术人员所已知。还可将DNA囊封于脂质体中，优选阳离子脂质体，或可与细胞膜相互作用并融合或经历内吞作用以实现将DNA转移至细胞内的多聚体(合成脂质体)。DNA还可与聚合物(聚合复合物)或与可直接将负载释放至细胞的细胞质内的树状聚合物形成复合物。
适用于此方面的说明性载体包括以下的微粒：聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖和类似物。其他说明性延迟释放载体包括超分子生物载体，它们包含非液体亲水性核(例如交联多糖或寡糖)且任选地包含两亲性化合物(诸如磷脂)的外层(参见，例如，美国专利号5,151,254和PCT申请WO 94/20078、WO/94/23701和WO 96/06638)。持续释放制剂内含有的活性剂的量取决于植入的部位、释放的速率和预期持续时间以及待治疗或预防的疾患的性质。
可生物降解的微球(例如聚乳酸聚乙醇酸酯)可用作组合物的载体。合适的可生物降解的微球公开于例如美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中。诸如描述于WO/99 40934以及其中引用的参考文献中的经修饰的B型肝炎核蛋白载体系统还将适用于许多应用。另一说明性载体/递送系统采用包含微粒-蛋白质复合物的载体，诸如描述于美国专利号5,928,647号中的那些，当肿瘤内使用以递送抗CD39抗体剂的编码序列时，它们可具有另外益处，抗CD39抗体剂能够诱导靶向患者的肿瘤组织的MHC I限制性细胞毒性T淋巴细胞反应。
可生物降解的聚合物纳米颗粒促进非病毒核酸转移至细胞。小(大约200nm)、带正电(大约10mV)颗粒通过阳离子、可水解降解的聚(β-氨基酯)和质粒DNA的自组装形成。
多核苷酸还可通过直接显微注射、临时细胞透化(例如阻抑物和/或活化剂与细胞透化剂的共施用)、融合至膜易位肽等向细胞施用。
在本发明的某些特定实施方案中，基因构建体经由电穿孔引入靶细胞内。电穿孔涉及将细胞(或组织)和DNA(或DNA复合物)暴露于高压放电。体内电穿孔已成功用于将质粒DNA有效递送至许多不同组织的基因递送技术。研究已报告施用体内电穿孔以将质粒DNA递送至B16黑素瘤和其他肿瘤组织。由质粒编码的基因或cDNA的全身和局部表达可以施用体内电穿孔获得。使用体内电穿孔增强肿瘤组织中的质粒DNA摄取，导致于肿瘤内的表达，并将质粒递送至肌肉组织，导致分泌蛋白诸如细胞因子的全身表达(参见，例如，US8026223)。用于将抗CD39抗体剂转基因体内电穿孔至细胞内的示例性技术、载体和装置包括PCT公布WO/2017/106795、WO/2016/161201、WO/2016/154473、WO/2016/112359和WO/2014/066655。
美国专利号7,245,963描述模块化电极系统和它们用于促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞内的用途。模块化电极系统包含多个针电极；皮下注射针；提供可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可抓住安装在支撑结构上的多个针电极并将它们稳固插入身体或植物中的选定组织内。然后，生物分子经由皮下注射针递送至选定组织内。将可编程恒流脉冲控制器活化，并将恒流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒流电脉冲促进将生物分子引入多个电极之间的细胞内。美国专利号7,245,963的全部内容特此以引用的方式并入。
美国专利公布2005/0052630描述可用于有效促进将生物分子引入身体或植物中的选定组织的细胞内的电穿孔装置。所述电穿孔装置包含电动力学装置(“EKD装置”)，其操作由软件或固件规定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列的可编程的恒流脉冲模式，并且允许电流波形数据的储存和获取。电穿孔装置还包括具有针电极的阵列的可置换电极盘、用于注射针的中央注射通道和可移除的引导盘(参见，例如，美国专利公布2005/0052630)，其特此以引用的方式并入。
美国专利号7,245,963和美国专利公布号2005/0052630中描述的电极阵列和方法适用于不仅深度渗透至诸如肌肉的组织内，而且深度渗透至其他组织或器官内。因为电极阵列的配置，还将注射针(以递送选择的生物分子)完全插入靶器官内，并且所述注射垂直于靶组织施用在由电极预先描绘的区域中。
通常，体内细胞电穿孔所需的电场的量级一般类似于体外细胞所需的电场。在一个实施方案中，所述电场的量级在约10V/cm至约1500V/cm，优选约300V/cm至1500V/cm，且优选约1000V/cm至1500V/cm的范围内。或者，较低的场强(约10V/cm至100V/cm，且更优选约25V/cm至75V/cm)的脉冲长度较长。例如，当标称电场为约25至75V/cm时，脉冲长度优选为约10msec。
脉冲长度可为约10s至约100ms。可存在任何所需数量的脉冲，通常每秒1至100个脉冲。脉冲间的延迟可为任何所需时间，诸如一秒。波形、电场强度和脉冲持续时间还可取决于细胞的类型和经由电穿孔进入所述细胞内的分子的类型。
还涵盖并入电化学阻抗光谱学(“EIS”)的电穿孔装置。这些装置提供关于体内(特别地，肿瘤内电穿孔效率)的实时信息，从而允许优化条件。并入EIS的电穿孔装置的实例可参见例如WO2016/161201，其特此以引用的方式并入。
本发明所涵盖的非病毒递送载体的摄取还可通过等离子体电穿孔(还称为雪崩转染)增强。简言之，微秒放电在电极表面产生空蚀微气泡。相较于与常规电穿孔相关联的扩散介导的运输，通过破裂的微泡产生的机械力与磁场的组合发挥作用以增加跨细胞膜的转运效率。等离子体电穿孔的技术描述于美国专利号7,923,251和8,283,171中。此技术还可体内用于细胞的转化。Chaiberg等人(2006)Investigative Ophthalmology&VisualScience 47:4083-4090；Chaiberg等人,2012年1月24日发布的美国专利号8,101 169。
还考虑其他替代电穿孔技术。体内质粒递送还可使用冷等离子体进行。等离子体为物质的四种基本状态中的一者，其他状态为固体、液体和气体。等离子体为未结合的正颗粒和负颗粒的电中性介质(即，等离子体的总电荷大致为零)。等离子体可通过加热气体或使其经受强电磁场(以激光或微波发生器施加)产生。这减少或增加电子的数量、产生称为离子的带正电或带负电的颗粒(Luo等人(1998)Phys.Plasma 5:2868-2870)，并且如果存在，则伴随分子键的解离。
冷等离子体(即，非热等离子体)通过将经脉冲的高压信号递送至合适的电极产生。冷等离子体装置可采取气体喷射装置或电介质阻挡放电(DBD)装置的形式。低温等离子体通过它们在相对较低的气体温度下提供等离子体已吸引极大的热情和关注。在这种温度下提供等离子体受各种应用关注，包括伤口愈合、抗菌方法、各种其他医学疗法和灭菌。如先前指示，冷等离子体(即，非热等离子体)通过将经脉冲的高压信号递送至合适的电极产生。冷等离子体装置可采取气体喷射装置、电介质阻挡放电(DBD)装置或多频富谐波电源的形式。
电介质阻挡放电装置依赖于不同方法以产生冷等离子体。电介质阻挡放电(DBD)装置含有至少一个由电介质层覆盖的导电电极。电回路由接地形成，所述接地可由经历冷等离子体处理的靶底物提供或通过为电极提供内置接地而提供。电介质阻挡放电装置的能量可由诸如上文提及的那些的高压电源提供。更一般而言，能量以经脉冲的DC电压的形式输入至电介质阻挡放电装置内以形成等离子体放电。通过电介质层，放电从导电电极分离并减少电极蚀刻和气体加热。经脉冲的DC电压可在幅度和频率上变化以实现变化的操作方案。并入冷等离子体产生的这种原理的任何装置(例如DBD电极装置)均落于本发明涵盖的各种实施方案的范围内。
冷等离子体已用于用外来核酸转染细胞。特别地，肿瘤细胞的转染(参见，例如，Connolly等人(2012)Human Vaccines&Immune-therapeutics 8:1729-1733；和Connolly等人(2015)Bioelectrochemistry 103:15-21)。
在某些说明性实施方案中，编码本发明所涵盖的抗CD39抗体剂的转基因构建体使用包含以下的电穿孔装置递送：施加器；从施加器延伸的多个电极，所述电极与覆盖区相关联；与电极电连通的电源，所述电源经配置以在覆盖区内产生对细胞的一个或多个电穿孔信号；和耦合至所述电极的引导构件，其中，所述引导构件被配置以调节所述电极的覆盖面积。电极的至少一部分可以锥形布置放置于所述施加器内。一个或多个电穿孔信号可各自与电场相关联。所述装置还可包括耦合至电源和电极的电位计。所述电位计可经配置以将电场大体上维持于预定范围内。
一个或多个电穿孔信号可各自与电场相关联。所述装置还可包含耦合至电源和电极的电位计。所述电位计可经配置以将电场维持于预定范围内，以便于大体上防止覆盖区内的细胞的永久损坏和/或大体上最小化疼痛。例如，电位计可经配置以将电场维持至约1300V/cm。
电源可向第一电极提供第一电信号并向第二电极提供第二电信号。所述第一电信号和第二电信号可组合以产生具有拍频的电波。所述第一电信号和第二电信号可各自具有单极性波形和双极性波形中的至少一者。所述第一电信号可具有第一频率和第一幅度。所述第二电信号可具有第二频率和第二幅度。所述第一频率可与所述第二频率不同或相同。所述第一幅度可与所述第二幅度不同或相同。
在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括：向所述肿瘤注射有效剂量的编码抗CD39抗体剂的质粒；以及向所述肿瘤施用电穿孔疗法。在某些实施方案中，所述电穿孔疗法还包括在约100微秒至约20毫秒的脉冲宽度上施用至少一个约200V/cm至约1500V/cm的电压脉冲。
在某些实施方案中，质粒(或第二电穿孔质粒)进一步编码至少一种免疫刺激性细胞因子，诸如选自编码IL-12、IL-15以及IL-12和IL-15的组合的组。
用于递送编码抗CD39抗体的核构建体的脂质和聚阳离子分子
脂质介导的核酸递送和外来核酸(包括mRNA)于体外和体内的表达均已非常成功。基于脂质的非病毒制剂为腺病毒基因疗法提供替代方案。当前体内脂质递送方法使用皮下、皮内、肿瘤内或颅内注射。脂质制剂的进展改善体内基因转移的效率(参见PCT申请WO98/07408)。例如，包含等摩尔比率的l,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)和胆固醇的脂质制剂可显著增强全身体内基因转移。DOTAP:胆固醇脂质制剂形成独特结构，称为“三明治脂质体”。这种制剂被报告为在内陷双层或“花瓶”结构间的“三明治”DNA。这些脂质结构的有益特征包括正p、胆固醇的胶体稳定化、二维核酸包装和增加的血清稳定性。
阳离子脂质体技术为基于具有带正电的头基和疏水性脂质尾的两亲性脂质结合至带负电的DNA或RNA和形成一般通过内吞作用进入细胞内的颗粒的能力。一些阳离子脂质体还含有中性共脂质，认为其增强哺乳动物细胞的脂质体摄取。同样，其他聚阳离子诸如聚-l-赖氨酸和聚乙烯-亚胺经由电荷相互作用与核酸复合，并且有助于将DNA或RNA缩合成纳米颗粒，然后它们为核内体介导的摄取的底物。[8]这些阳离子-核酸复合技术中的数种已发展为潜在临床产品，包括与质粒DNA(pDNA)、寡聚脱氧核苷酸和各种形式的合成RNA的复合物。
本文公开的核酸构建体可与发挥作用以增强摄取至细胞内的聚阳离子分子缔合。所述核酸构建体与聚阳离子分子的复合还有助于包装所述构建体，使得它们尺寸减小，这据信帮助细胞摄取。一旦进入核内体内，则复合物由于较低pH而解离，并且聚阳离子分子可破坏所述核内体的膜以促进DNA逃逸至细胞质内，然后其可降解。初步数据显示当与聚阳离子分子聚赖氨酸或聚乙烯亚胺复合时，相较于DC，核酸构建体实施方案已增强至SC内的摄取。
适用于与核酸构建体复合的聚阳离子分子的一个实例包括细胞渗透肽(CPP)，实例包括聚赖氨酸(上文描述)、聚精氨酸和Tat肽。细胞渗透肽(CPP)为小肽，其可结合至DNA，且一旦释放，就渗透细胞膜，以促进DNA从核内体逃逸至细胞质。CPP的另一实例涉及27个残基的嵌合肽，称为MPG，前段时间已经显示可以稳定方式结合ss和ds寡核苷酸，从而产生非共价复合物，其保护核酸免受DNA酶降解并将寡核苷酸体外有效递送至细胞(Mahapatro A等人,JNanobiotechnol,2011,9:55)。当检查不同肽:DNA比率以及10:1和5:1比率(分别150nm和1um)时，复合物形成大约150nm至1um的小颗粒。另一CPP涉及经修饰的四肽[含有胍基羰基吡咯(GCP)基团(TL-GCP)的四赖氨酸]，其据报告以高亲和力结合至6.2kb质粒DNA，从而产生700至900nm带正电的聚集体，Li等人,Agnew Chem Int Ed Enl 2015；54(10):2941-4)。RNA还可由此类聚阳离子分子复合用于体内递送。
可与本文描述的核酸构建体复合的聚阳离子分子的其他实例包括可作为
Figure BDA0003354910840001201
和In Vivo JET(Polypus-transfection,S.A.,Illkirch,France)商购的聚阳离子聚合物。
VI.使用方法和药物组合物
本发明所涵盖的抗CD39抗体适用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如针对癌症的免疫疗法。在某些实施方案中，本文描述的抗CD39抗体适用于活化、促进、增加和/或增强免疫反应、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、诱导肿瘤消退、增加肿瘤细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。在某些实施方案中，本发明所涵盖的抗CD39抗体还适用于针对病原体(诸如病毒)的免疫疗法。在某些实施方案中，本文描述的抗CD39抗体适用于抑制病毒感染、减少病毒感染、增加病毒感染的细胞凋亡和/或增加病毒感染的细胞的杀死。使用方法可为体外、离体或体内方法。
本发明提供使用本文描述的抗CD39抗体活化受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，本发明提供使用本文描述的抗CD39抗体促进受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，本发明提供使用本文描述的抗CD39抗体增加受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于使用本文描述的抗CD39抗体增强受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加细胞介导的免疫性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加Th1型反应。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加CD4+T细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加CD8+T细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加CTL活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加CU活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括抑制或降低Treg细胞的抑制活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括抑制或降低MDSC的抑制活性。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加记忆T细胞的百分比的数量。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加长期免疫记忆功能。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强包括增加长期记忆。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强不包括实质性副作用和/或基于免疫的毒性的证据。在一些实施方案中，免疫反应的活化、促进、增加和/或增强不包括细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的证据。在一些实施方案中，免疫反应为抗原刺激的结果。在一些实施方案中，所述抗原刺激为肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述抗原刺激为癌症。在一些实施方案中，所述抗原刺激为病原体。在一些实施方案中，所述抗原刺激为病毒感染的细胞。
用于确定抗CD39抗体是否调节、活化或抑制免疫反应的体内和体外测定为本领域中已知或正在研发中。
在本文描述的方法的某些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生的持久或长期免疫性的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗CD39抗体。
在一些实施方案中，肿瘤为实体肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤：结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠道肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤和头颈肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为结肠直肠肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为卵巢肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为肺肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为胰腺或胰岛肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为膀胱或尿路上皮肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤为液体肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为白血病，诸如骨髓性或粒细胞性白血病、淋巴性、淋巴细胞性或成淋巴细胞性白血病和真性红细胞增多症或红细胞增多症。
在一些实施方案中，肿瘤表达或过表达由抗CD39抗体(诸如包含特异性地结合所述肿瘤抗原的抗原结合位点的双特异性剂)靶向的肿瘤抗原。
本发明进一步提供用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文描述的抗CD39抗体。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体抑制或减少癌症的生长。
本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者(例如需要治疗的受试者)施用治疗有效量的本文描述的抗CD39抗体。在某些实施方案中，所述受试者为人。在某些实施方案中，所述受试者患有癌性肿瘤。在某些实施方案中，所述受试者已移除肿瘤。
在某些实施方案中，癌症为选自由以下组成的组的癌症：结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠道癌、黑素瘤、宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、脑癌、胶质母细胞瘤和头颈癌。在某些实施方案中，所述癌症为胰腺癌。在某些实施方案中，所述癌症为卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症为结肠直肠癌。在某些实施方案中，所述癌症为乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症为前列腺癌。在某些实施方案中，所述癌症为肺癌。在某些实施方案中，所述癌症为黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症为膀胱癌。
本发明提供包含本文描述的抗CD39抗体的组合物。本发明还提供包含本文描述的抗CD39抗体和药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物适用于免疫疗法中。在一些实施方案中，所述药物组合物适用于免疫肿瘤学中。在一些实施方案中，所述组合物适用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，所述药物组合物适用于抑制受试者(例如人患者)的肿瘤生长。在一些实施方案中，所述组合物适用于治疗癌症中。在一些实施方案中，所述药物组合物适用于治疗受试者(例如人患者)的癌症。
通过将本发明所涵盖的纯化剂与药学上可接受的媒介物(例如载体或赋形剂)组合制备制剂用于储存和使用。本领域技术人员一般将药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂视为制剂或药物组合物的非活性成分。
在一些实施方案中，抗CD39抗体被冻干和/或以冻干形式储存。在一些实施方案中，包含本文描述的抗CD39抗体的制剂被冻干。
合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)、氯化苯甲烷铵(benzalkoniumchloride)、氯化苄乙氧铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，诸如单糖、双糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物，诸如Zn-蛋白质络合物；以及非离子表面活性剂，诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22增补版，2012,Pharmaceutical Press,London.)。
本发明所涵盖的药物组合物可以许多方式施用用于局部或全身治疗。施用可为局部的，通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末；经肺，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器，气管内和鼻内；经口；或胃肠外，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或脑室内)。
治疗性制剂可呈单位剂型。此类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、在水或非水介质中的溶液或悬浮液或栓剂。在诸如片剂的固体组合物中，将主要活性成分与药物载体混合。常规制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和稀释剂(例如，水)。这些可用于形成固体预配制组合物，其含有本发明所涵盖的化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均质混合物。然后将所述固体预配制组合物细分为上文描述的类型的单位剂型。制剂或组合物的片剂、丸剂等可经包衣或以其他方式混配以提供剂型，所述剂型提供延长的作用的优点。例如，所述片剂或丸剂可包含由外部组分覆盖的内部组合物。此外，所述两种组分可由肠溶层隔开，所述肠溶层发挥作用以抵抗崩解且允许内部组分完整通过胃或延迟释放。各种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的此类材料的混合物。
抗CD39抗体还可包埋于微胶囊中。此类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊分别于胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或于如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第22增补版，2012,Pharmaceutical Press,London中描述的粗乳状液中。
在某些实施方案中，药物制剂包含与脂质体复合的抗CD39抗体。用于产生脂质体的方法为本领域技术人员已知。例如，一些脂质体可通过逆相蒸发用包含卵磷脂、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体可通过确定孔径的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方案中，可产生包含抗CD39抗体的持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有抗CD39抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，其中所述基质呈成形物品的形式(例如，薄膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOT(包含乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林的可注射微球))、乙酸异丁酸蔗糖和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
在某些实施方案中，除施用抗CD39抗体外，方法或治疗还包括施用至少一种另外的免疫反应刺激剂。在一些实施方案中，所述另外的免疫反应刺激剂包括但不限于集落刺激因子(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF))、白细胞介素(例如，IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、检查点抑制剂、阻断免疫抑制功能的抗体(例如，抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体)、toll样受体(例如，TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族的成员(例如，CD80、CD86)。另外的免疫反应刺激剂可在施用抗CD39抗体之前、同时和/或之后施用。还提供包含抗CD39抗体和免疫反应刺激剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述免疫反应刺激剂包含1、2、3种或更多种免疫反应刺激剂。
在某些实施方案中，除施用抗CD39抗体外，方法或治疗还包括施用至少一种另外治疗剂。另外治疗剂可在施用抗CD39抗体之前、同时和/或之后施用。还提供包含抗CD39抗体和另外治疗剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种另外治疗剂包含1、2、3种或更多种另外治疗剂。
尽管这并非必需，但使用两种或更多种治疗剂的组合疗法通常使用通过不同作用机制发挥作用的剂。使用具有不同作用机制的剂的组合疗法可产生累加或协同效应。相较于单一疗法中使用的各剂的剂量，组合疗法可允许各剂的更低剂量，由此减少毒性副作用和/或增加抗CD39抗体的治疗指数。组合疗法可降低耐药性癌细胞发展的可能性。在一些实施方案中，组合疗法包含影响免疫反应(例如，增强或活化所述反应)的治疗剂和影响(例如，抑制或杀死)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在本文描述的方法的一些实施方案中，抗CD39抗体和至少一种另外治疗剂的组合产生累加或协同结果。在一些实施方案中，组合疗法使得抗CD39抗体的治疗指数增加。在一些实施方案中，所述组合疗法使得另外治疗剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，所述组合疗法使得抗CD39抗体的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，所述组合疗法使得另外治疗剂的毒性和/或副作用降低。
治疗剂的有用类别包括例如抗微管蛋白剂、奥瑞斯他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸、抗代谢物、化学疗法增敏剂、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体(ionophore)、拉克左素(lexitropsin)、亚硝基脲、顺铂(platinol)、嘌呤抗代谢剂、嘌呤霉素、放射增敏剂、类固醇、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在某些实施方案中，第二治疗剂为烷化剂、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可与本文描述的抗CD39抗体组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方案中，方法或治疗涉及施用抗CD39抗体与化学治疗剂的组合或与化学治疗剂的混合物的组合。使用抗CD39抗体的治疗可在施用化学治疗之前、同时或之后发生。组合施用可包括共施用，以单一药物制剂或使用不同制剂，或以任何顺序但一般于一定时间段内的连续施用，使得所有活性剂可同时发挥它们生物活性。此类化学治疗剂的制备和给药时间表可根据制造商的说明书或如由熟练从业者凭经验确定使用。这种化学疗法的制备和给药时间表还描述于The Chemotherapy Source Book，第4增补版，2008,M.C.Perry编，Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa中。
适用于本发明的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，诸如苯佐多巴、卡波醌、米特多巴和尤利多巴；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代基-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸曲他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；德福法明；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西咗喃(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(docetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；盐酸米托蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯佩拉霉素；卡培他滨(XELODA)；和上文中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括抗激素药，它们发挥作用以调节或抑制对肿瘤的激素作用，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、克昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上文中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，所述另外治疗剂为顺铂。在某些实施方案中，所述另外治疗剂为卡铂。
在本文描述的方法的某些实施方案中，化学治疗剂为拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂为干扰拓扑异构酶(例如，拓扑异构酶I或II)的作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸阿霉素、柠檬酸道诺霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康，和这些中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方案中，化学治疗剂为抗代谢剂。抗代谢剂为结构与正常生化反应所需的代谢物类似，但足够不同以干扰细胞的一种或多种正常功能(诸如细胞分裂)的化学物质。抗代谢剂包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟、胞嘧啶阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)和克拉屈滨(cladribine)，以及这些中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在本文描述的方法的某些实施方案中，化学治疗剂为抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的剂。在一些实施方案中，所述剂为紫杉烷。在某些实施方案中，所述剂为紫杉醇或多西他赛，或紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，所述剂为紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合的紫杉醇(nab-紫杉醇；ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，诸如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂为驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶诸如Aurora A或Plk1的抑制剂。
在本文描述的方法的某些实施方案中，预期主题抗CD39抗体将与在肿瘤中诱导ATP的释放和/或引起肿瘤内CD39或CD73的上调的那些化学治疗剂一起具有更大的组合效应(或许甚至协同效应)。存在广泛范围的化学治疗剂，它们引起ATP释放至细胞外空间内，因为它们诱导肿瘤细胞死亡，诸如但不限于蒽环类(诸如阿霉素、道诺霉素、表柔比星和伊达比星)、基于铂的药物(诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂)和蛋白酶体抑制剂(诸如硼替佐米(bortezomib))。放射疗法和光动力疗法(PDT)还可导致ATP释放和/或CD39和/或CD73的肿瘤内水平的上调。
在本文描述的方法的一些实施方案中，另外治疗剂包含诸如小分子的剂。例如，治疗可涉及组合施用抗CD39抗体与充当针对肿瘤相关抗原(包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF)的抑制剂的小分子。在一些实施方案中，抗CD39抗体与选自由以下组成的组的蛋白激酶抑制剂组合施用：吉非替尼(gefitinib)(IRESSA)、埃罗替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib)(RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)和帕唑帕尼(pazopanib)(GW786034B)。在一些实施方案中，另外治疗剂包含mTOR抑制剂。
在本文描述的方法的某些实施方案中，另外治疗剂为抑制癌症干细胞途径的小分子。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为Notch途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为Wnt途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为BMP途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为Hippo途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为mTOR/AKR途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为RSPO/LGR途径的抑制剂。
在本文描述的方法的一些实施方案中，另外治疗剂包含生物分子，诸如抗体。例如，治疗可涉及组合施用抗CD39抗体与针对肿瘤相关抗原的抗体，所述抗体包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体。在某些实施方案中，所述另外治疗剂为对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为结合Notch途径的组分的抗体。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为结合Wnt途径的组分的抗体。在某些实施方案中，所述另外治疗剂为抑制癌症干细胞途径的抗体。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为Notch途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为Wnt途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为BMP途径的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为抑制β-连环蛋白信号传导的抗体。在某些实施方案中，所述另外治疗剂为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方案中，所述另外治疗剂为贝伐单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARG)、帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
I/O组合-代表性检查点抑制剂和共刺激激动剂
在本文描述的方法的一些实施方案中，另外治疗剂为调节免疫反应的抗体。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体和/或抗Siglec-15抗体。
例如，治疗还可包括施用免疫检查点分子的抑制剂或共刺激分子的活化剂，或其组合。免疫检查点的示例性抑制剂包括以下中的一者或多者的抑制剂：PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、NLRP1、NRLP3、STING、TGFRβ或Siglec-15。共刺激分子的示例性活化剂包括以下中的一者或多者的激动剂：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体。免疫检查点的示例性抑制剂和共刺激分子的示例性活化剂可参见PCT公布WO 2016/054555，所述PCT公布以引用的方式并入本文中。
PD-1拮抗剂
PD-1基因为55kDa I型跨膜蛋白，其为Ig基因超家族的一部分(Agata等人(1996)Int Immunol 8:765-72)。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和基于膜远程酪氨酸的开关基序(ITSM)(Thomas,M.L.(1995)J Exp Med 181:1953-6；Vivier,E和Daeron,M(1997)Immunol Today 18:286-91)。PD-1的两种配体已经鉴定，PD-L1和PD-L2，它们已显示在结合至PD-1后下调T细胞活化(Freeman等人(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter等人(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1和PD-L2两者均为结合至PD-1但不结合至其他CD28家族成员的B7同源物。PD-Ll在各种人癌症中为丰富的(Dong等人(2002)Nat.Med.8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞的免疫逃避(Dong等人(2003)J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1之间的局部相互作用逆转，并且当PD-1与PD-L2之间的相互作用也被阻断时，所述效应为累加的(Iwai等人(2002)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
如本文使用，术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、PD1、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-l”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同工型、物种同源物以及与人PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的人PD-1序列可在GenBank登录号U64863下找到。
如本文使用，术语“程序性细胞死亡1配体1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCD1L1”、“PDCD1LG1”、“CD274”、“B7同源物1”、“B7-H1”、“B7-H”和“B7H1”可互换使用，并且包括人PDL-1的变体、同工型、物种同源物，以及与人PDL-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的人PD-L1氨基酸序列-同工型a前体-可在GenBank登录号NP_054862.1下找到。完整的人PD-L1氨基酸序列-同工型b前体-可在GenBank登录号NP_001254635.1下找到。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”为抑制PD-1轴结合配偶体与其结合配偶体中的一者或多者的相互作用，以便于移除由PD-1信号传导轴上的信号传导引起的T细胞功能障碍，从而恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀死)的分子。如本文使用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”为减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-L1、PD-L2)的相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面中，所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂减少由或通过表达于T淋巴细胞上的通过PD-1信号传导介导的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，以便使得功能障碍的T细胞更少功能障碍(例如，增强对抗原识别的效应物反应)。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。在一个特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文描述的MDX-1106。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文描述的Merck3745。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文描述的CT-011。
术语“PD-L1结合拮抗剂”为减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-1、B7-1)的相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面中，所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中，所述PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-1、B7-1)的相互作用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂减少由或通过表达于T淋巴细胞上的通过PD-L1信号传导介导的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，以便使得功能障碍的T细胞更少功能障碍(例如，增强对抗原识别的效应物反应)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。在一个特定方面中，抗PD-L1抗体为本文描述的YW243.55.S70。在另一特定方面，抗PD-L1抗体为本文描述的MDX-1105。在又另一特定方面中，抗PD-L1抗体为本文描述的MPDL3280A。
术语“PD-L2结合拮抗剂”为减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-1)的相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂为抑制PD-L2与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面中，所述PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方案中，所述PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-1)的相互作用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂减少由或通过表达于T淋巴细胞上的通过PD-L2信号传导介导的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，以便使得功能障碍的T细胞更少功能障碍(例如，增强对抗原识别的效应物反应)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂为免疫粘附素。
PD-1途径：PD-1途径的成员为与PD-1信号传导相关联的所有蛋白质。一方面，这些可为诱导PD-1上游的PD-1信号传导的蛋白质，诸如，例如，PD-1PD-L1和PD-L2的配体和信号转导受体PD-1。另一方面，这些可为PD-1受体下游的信号转导蛋白。在本发明所涵盖的上下文中，尤其优选为PD-1途径的成员为PD-1、PD-L1和PD-L2。
PD-1途径抑制剂：在本发明所涵盖的上下文中，PD-1途径抑制剂在本文中优选定义为能够损害PD-1途径信号传导，优选由PD-1受体介导的信号传导的化合物。因此，所述PD-1途径抑制剂可为针对能够拮抗PD-1途径信号传导的PD-1途径的任何成员的任何抑制剂。在此上下文中，所述抑制剂可为如本文定义的拮抗性抗体，靶向PD-1途径的任何成员，优选针对PD-1受体PD-L1或PD-L2。这种拮抗性抗体还可由核酸编码。此类经编码的抗体还称为如本文定义的“细胞内抗体”。此外，所述PD-1途径抑制剂可为PD-1受体的片段或阻断PD1配体的活性的PD1-受体。B7-1或其片段也可充当PD1抑制配体。此外，所述PD-1途径抑制剂可为针对PD-1途径的成员(优选PD-1、PD-L1或PD-L2)的siRNA(小干扰RNA)或反义RNA。另外，PD-1途径抑制剂可为蛋白质，所述蛋白质包含能够结合至PD-1但阻止PD-1信号传导，例如，通过抑制PD-1和B7-H1或B7-DL相互作用的氨基酸序列的蛋白质(或编码能够结合至PD-1但阻止PD-1信号传导，例如，通过抑制PD-1和B7-H1或B7-DL相互作用的氨基酸序列的核酸)。另外，PD-1途径抑制剂可为能够抑制PD-1途径信号传导的小分子抑制剂，例如，PD-1结合肽或小有机分子。
在某些实施方案中，本发明所涵盖的PD-1拮抗剂包括结合至PD-1配体并干扰、减少或抑制一个或多个配体与PD-1受体的结合，或直接结合至所述PD-1受体而不参与通过PD-1受体的信号转导的剂。在一个实施方案中，所述PD-1拮抗剂直接结合至PD-1并阻断PD-1抑制性信号转导。在另一实施方案中，所述PD-1拮抗剂结合至PD-1的一个或多个配体(例如，PD-L1和PD-L2)，并减少或抑制配体通过PD-1触发抑制信号转导。在一个实施方案中，所述PD-1拮抗剂直接结合至PD-L1，抑制或阻止PD-L1结合至PD-1，由此阻断PD-1抑制性信号转导。
本发明所涵盖的方法和组合物中使用的PD-1拮抗剂包括PD-1结合支架蛋白，并且包括但不限于PD-配体、抗体和多价剂。在一个特定实施方案中，所述拮抗剂系融合蛋白，诸如AMP-224。在另一实施方案中，所述拮抗剂为抗PD-1抗体(“PD-1”抗体)。适用于本发明中的抗人PD-1抗体(或源自其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中熟知的方法产生。或者，可使用公认的抗PD-1抗体。例如，可使用抗体MK-3475或CT-011。另外，可使用WO 2006/121168中描述的单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4，它们的教示以引用的方式并入本文中。还可使用与这些公认的抗体中的任一者竞争性结合至PD-1的抗体。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂为抗PD-L1抗体。适用于本发明中的抗人PD-L1抗体(或源自其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中熟知的方法产生。或者，可使用公认的抗PD-L1抗体。例如，可使用MEDI4736(还称为抗B7-Hl)或MPDL3280A(还称为RG7446)。另外，可使用WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中描述的单克隆抗体12A4、3G10、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4，它们的教示以引用的方式并入本文中。还可使用与这些公认的抗体中的任一者竞争性结合至PD-L1的抗体。
示例性抗PD-L1抗体为WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中描述的12A4。在一个实施方案中，所述抗体包含12A4的重链和轻链CDR或VR。在另一实施方案中，所述抗体与如上文提及的抗体竞争性结合至PD-L1上的相同表位和/或结合至PD-L1上的相同表位。在另一实施方案中，所述抗体与上文提及的抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性。
抗PD-1或抗PD-L1抗体可分别以10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M或更小的KD结合至PD-1或PD-L1。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂选自纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)或匹地利珠单抗(Pidilizumab)的抗PD-1抗体。优选的PD-1抑制剂为纳武单抗。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体为纳武单抗。纳武单抗的替代名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体为纳武单抗(CAS注册号：946414-94-4)。纳武单抗为特异性地阻断PDl的完全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和特异性地结合至PDl的其他人单克隆抗体公开于US 8,008,449(以引用的方式并入)和WO 2006/121168(以引用的方式并入)中。在其他实施方案中，所述抗PD-1抗体为派姆单抗。派姆单抗(商品名
Figure BDA0003354910840001371
原名兰布罗利珠单抗(Lambrolizumab)，还称为Merck 3745、MK-3475或SCH-900475)为结合至PD1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗公开于例如Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44、WO 2009/114335(以引用的方式并入)和US 8,354,509(以引用的方式并入)中。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体为匹地利珠单抗。匹地利珠单抗(CT-011；CureTech)为结合至PD1的人源化IgGlk单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO2009/101611中。其他抗PDl抗体公开于US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中。其他抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为免疫粘附素{例如，包含融合至恒定区{例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，所述PD-1抑制剂为AMP-224。在一些实施方案中，所述PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抑制剂为YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为MDX-1105。MDX-1105(还称为BMS-936559)为WO2007/005874中描述的抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，所述PD-L1抑制剂为YW243.55.S70。所述YW243.55.S70抗体为WO 2010/077634(以引用的方式并入)中描述的抗PD-L1(在WO 2010/077634中，在分别SEQ ID No.20和21中所示的重链和轻链可变区序列)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为MDPL3280A(Genentech/Roche)。MDPL3280A为结合至PD-L1的人Fc优化的IgGl单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体公开于美国专利号7,943,743(以引用的方式并入)和美国公布号2012/0039906(以引用的方式并入)中。在其他实施方案中，所述PD-L2抑制剂为AMP-224。AMP-224为阻断PD1与B7-H1之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于WO 2010/027827(以引用的方式并入)和WO 2011/066342(以引用的方式并入)中)。
在某些实施方案中，PD-1途径抑制剂为PD-1途径信号传导的小分子拮抗剂。此类小分子拮抗剂包括结合至PD-1、PD-1L和/或PD-1L2中的一者或多者并抑制PD-1与PD-1L1和/或PD-1L2的相互作用的那些剂。
PD-1途径信号传导的示例性小分子拮抗剂可尤其在以下中找到：公布的美国申请2014/0294898和2014/0199334，和公布的PCT申请WO 2013/132317和WO 2012/168944，它们中的每一者以引用的方式并入本文中。
仅为阐述，主题组合疗法可以选自由以下组成的组的小分子拮抗剂实践：
Figure BDA0003354910840001391
在其他实施方案中，小分子拮抗剂以以下通式表示：
Figure BDA0003354910840001392
其中，
R1为Ser的游离C末端或酰胺化C末端；
L为选自-NH(CH2)nNH-或-NH(CH2CH2O)nNH-的接头；
R4选自氢、氨基(C1-C20)烷基、-NHCOCH3或-NHCONH2；
或其逆向类似物或药学上可接受的立体异构体或药学上可接受的盐。
在又其他实施方案中，小分子拮抗剂以以下通式表示：
Figure BDA0003354910840001401
其中，
R1为Ser的N末端；或被Ser的羟基或氨基取代的(C1-C20)酰基；
L为选自-NH(CH2)nNH-、-NH(CH2)nCH(NH2)CO-、-OOC(CH2)mCOO-、-NH(CH2)nCO-、-NH(CH2CH2O)nNH-、-NH(CH2CH2O)nCO-或-CO(CH2CH2O)nCO-的接头；
R2为Am2的游离C末端、酰胺化C末端或N末端；或Y-R5；
Y为选自-OOC(CH2)mCOO-、-CO(CH2)nNH-、-CO(CH2CH2O)nNH-或-COCH2(OCH2CH2)nNH-的任选接头；
R5为白蛋白结合部分，诸如马来酰亚胺基丙酸；
R3为OH或NH2；
R4为Phe的苯基上的取代基，并且选自氢、氨基(C1-C20)烷基、-NHCOCH3或-NHCONH2；
n为具有选自2至10的值的整数，包括2和10；
m为具有选自0至8的值的整数，包括0和8；并且
Ser-Asn、Asn-Thr或Thr-Ser的肽键(-CONH-)中的一者可被
Figure BDA0003354910840001412
的经修饰的肽键置换，
其中Q为氢、-CO(C1-C20)烷基或-COO(C1-C20)烷基；其中一个或多个或所有氨基酸可呈D-构型；
或其逆向类似物或药学上可接受的立体异构体或药学上可接受的盐。
例如，小分子拮抗剂可选自由以下组成的组：
Figure BDA0003354910840001411
Figure BDA0003354910840001421
Figure BDA0003354910840001431
Figure BDA0003354910840001441
Figure BDA0003354910840001451
Figure BDA0003354910840001461
Figure BDA0003354910840001471
CTLA-4拮抗剂
在某些实施方案中，本文描述的组合还包括CTLA-4抑制剂。示例性抗CTLA-4抗体包括曲美木单抗(Tremelimumab)(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，原名替奇木单抗(ticilimumab)，CP-675,206)；和伊匹单抗(Ipilimumab)(CTLA-4抗体，还称为MDX-010，CAS号477202-00-9)。
用于本文提供的方法中的关于曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可参见US6,682,736(以引用的方式并入)(其中将其称为11.2.1)，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文中。曲美木单抗(还称为CP-675,206、CP-675、CP-675206和替奇木单抗)为对CTLA-4具有高度选择性并阻断CTLA-4与CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的结合的人IgG2单克隆抗体。已显示导致体外免疫活化，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已显示肿瘤消退。
用于本文提供的方法中的曲美木单抗包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面中，用于本文提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含含有本文上文显示的氨基酸序列的轻链可变区和含有本文上文显示的氨基酸序列的重链可变区。在一个特定方面中，用于本文提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含本文上文显示的Kabat定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述轻链可变区包含本文上文显示的Kabat定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域普通技术人员将能够容易地坚定Chothia定义、Abm定义或本领域普通技术人员已知的其他CDR定义。在一个特定方面中，用于本文提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含如US6,682,736中公开的抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，所述专利以引用的方式整体并入本文中。
本发明还考虑利用CTLA-4的小分子抑制剂，诸如由Huxley等人,2004CellChemical Biology 11:1651-1658描述，其包括下式化合物：
Figure BDA0003354910840001491
Figure BDA0003354910840001492
其他小分子CTLA-4拮抗剂包括
Figure BDA0003354910840001493
在一个实施方案中，组合包括免疫-DASH抑制剂、抗PD-1抗体分子(例如，如本文描述)和抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)。可使用的示例性剂量包括约1至10mg/kg(例如，3mg/kg)的抗PD-1抗体分子的剂量，和约3mg/kg的抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)的剂量。
其他示例性抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利号5,811,097中。
在本文描述的方法的一些实施方案中，另外治疗剂为调节免疫反应的抗体。在一些实施方案中，所述另外治疗剂为抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体或抗-Siglec-15抗体。
在一些实施方案中，LAG3抗体为IMP701、IMP731、BMS-986016、LAG525和GSK2831781。在一些实施方案中，所述LAG3拮抗剂包括可溶性LAG3受体，例如，IMP321。
在一些实施方案中，免疫反应刺激剂选自由以下组成的组：CD28激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD27激动剂、CD80激动剂、CD86激动剂、CD40激动剂和GITR激动剂。在一些实施方案中，所述OX40激动剂包括OX40配体或其OX40结合部分。例如，所述OX40激动剂可为MEDI6383。在一些实施方案中，所述OX40激动剂为特异性地结合OX40的抗体。在一些实施方案中，结合OX40的抗体为MEDI6469、MEDI0562或MOXR0916(RG7888)。在一些实施方案中，所述OX40激动剂为能够表达OX40配体的载体(例如，表达载体或病毒，诸如腺病毒)。在一些实施方案中，表达OX40的载体为δ-24-RGDOX或DNX2401。
在一些实施方案中，4-1BB(CD137)激动剂为结合分子，诸如抗运载蛋白(anticalin)。在一些实施方案中，所述抗运载蛋白为PRS-343。在一些实施方案中，所述4-1BB激动剂为特异性地结合4-1BB的抗体。在一些实施方案中，结合4-1BB的抗体为PF-2566(PF-05082566)或乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)。
在一些实施方案中，CD27激动剂为特异性地结合CD27的抗体。在一些实施方案中，结合CD27的抗体为伐立鲁单抗(varlilumab)(CDX-1127)。
在一些实施方案中，GITR激动剂包含GITR配体或其GITR结合部分。在一些实施方案中，所述GITR激动剂为特异性地结合GITR的抗体。在一些实施方案中，结合GITR的抗体为TRX518、MK-4166或INBRX-110。
在某些实施方案中，抗CD39抗体与STING激动剂组合，优选作为药物组合物的一部分。环二核苷酸(CDN)环二AMP(由单核细胞增多性李斯特氏菌和其他细菌产生)及其类似物环二GMP，并且环GMP-AMP由宿主细胞识别为病原体相关分子模式(PAMP)，它们结合至称为干扰素基因刺激物(STING)的病原体识别受体(PRR)。STING为宿主哺乳动物细胞的细胞质中的衔接蛋白，其活化TANK结合激酶(TBK1)-IRF3和NF-κB信号传导轴，从而导致IFN-β和强烈活化先天免疫性的其他基因产物的诱导。现在认识到STING为宿主胞质监视途径的组分(Vance等人,2009)，其以细胞内病原体感测感染并在反应中诱导IFN-β的产生，导致适应性保护性病原体特异性免疫反应的发展，其由抗原特异性CD4+和CD8+T细胞和病原体特异性抗体组成。美国专利号7,709,458和7,592,326；PCT公布号WO2007/054279、WO2014/093936、WO2014/179335、WO2014/189805、WO2015/185565、WO2016/096174、WO2016/145102、WO2017/027645、WO2017/027646和WO2017/075477；以及Yan等人,Bioorg.Med.Chem Lett.18:5631-4,2008。
示例性组合
在一个优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与抗肿瘤铂配位络合物的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、脑癌和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于顺铂、奥沙利铂、卡铂、四硝酸三铂(BBR3464)、沙铂、四铂、奥米铂、异丙铂、奈达铂和洛铂。特别优选为抗CD39抗体与顺铂、奥沙利铂、卡铂、四硝酸三铂、沙铂、四铂、奥米铂、异丙铂、奈达铂和洛铂的组合，并且甚至更优选为与顺铂和奥沙利铂的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与抗代谢药的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、脑癌、肛门癌、白血病和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨(decitabine)、氟尿苷、氟达拉滨、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞(raltitrexed)、克拉屈滨、氯法拉滨(clofarabine)、巯基嘌呤、喷司他丁和硫鸟嘌呤。特别优选为抗CD39抗体与5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁和硫鸟嘌呤的组合，并且甚至更优选为与5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷和甲氨蝶呤的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与有丝分裂抑制剂的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于紫杉醇、多西他赛、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。特别优选为抗CD39抗体与紫杉醇、多西他赛、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨的组合，并且甚至更优选为与紫杉醇、多西他赛、长春新碱和长春瑞滨的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与抗癌抗生素的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗以下癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、神经母细胞瘤、脑癌、肛门癌、睾丸癌、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于道诺霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹杉琼(pixantrone)、戊柔比星(valrubicin)、丝裂霉素C、博来霉素、放线菌素A和光神霉素。特别优选为抗CD39抗体与道诺霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹杉琼(pixantrone)、戊柔比星、丝裂霉素C、博来霉素、放线菌素D和光神霉素的组合，并且甚至更优选为与道诺霉素、阿霉素、丝裂霉素C和放线菌素D的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与拓扑异构酶I和/或II抑制剂的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、神经母细胞瘤、脑癌、宫颈癌、睾丸癌、白血病和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于拓扑替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、鲁比替康、依托泊苷、安吖啶和替尼泊苷。特别优选为PM00104或其药学上可接受的盐与拓扑替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、鲁比替康、依托泊苷、安吖啶和替尼泊苷的组合，且甚至更优选为与拓扑替康、伊立替康和依托泊苷的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与蛋白酶体抑制剂的组合以治疗癌症，并且更特别地治疗肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、脑癌、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于硼替佐米、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)和盐孢酰胺A(salinosporamide A)。特别优选系抗CD39抗体与硼替佐米、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯和盐孢菌酰胺A的组合，且甚至更优选为与硼替佐米的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌和脑癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、脑癌和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于罗米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、伏立诺他(vorinostat)、莫西司他(mocetinostat)、贝利司他(belinostat)、恩替司他(entinostat)、瑞米司他(resminostat)、PCI-24781、AR-42、CUDC-101和丙戊酸。特别优选为抗CD39抗体与罗米地辛、帕比司他、伏立诺他、莫西司他、贝利司他、恩替司他、瑞米司他、PCI-24781、AR-42、CUDC-101和丙戊酸的组合，且甚至更优选为与伏立诺他的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与氮芥烷化剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、肉瘤、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于美法仑、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀和苯达莫司汀(bendamustine)。特别优选为抗CD39抗体与美法仑、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀和苯达莫司汀的组合，且甚至更优选为与环磷酰胺的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、肉瘤、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌和肾癌。在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与亚硝基脲烷化剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于洛莫司汀、司莫司汀(semustine)、卡莫司汀、福莫司汀和链脲霉素(streptozotocin)。特别优选为抗CD39抗体与洛莫司汀、司莫司汀、卡莫司汀、福莫司汀和链脲霉素的组合，且甚至更优选为与卡莫司汀的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、卵巢癌和乳腺癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与非典型烷化剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。此化学治疗剂组包括但不限于丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺(temozolomide)和六甲蜜胺。特别优选为抗CD39抗体与丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺和六甲蜜胺的组合，且甚至更优选为与达卡巴嗪和替莫唑胺的组合以治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与雌激素拮抗剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗乳腺癌。此化学治疗剂组包括但不限于托瑞米芬、氟维司群、他莫昔芬和萘福昔定(nafoxidine)。特别优选为抗CD39抗体与托瑞米芬、氟维司群、他莫昔芬和萘福昔定的组合，且甚至更优选为与他莫昔芬的组合以治疗乳腺癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与雄激素拮抗剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗前列腺癌。此化学治疗剂组包括但不限于比卡鲁胺、氟他胺、MDV3100和尼鲁米特。特别优选为抗CD39抗体与比卡鲁胺、氟他胺、MDV3100和尼鲁米特的组合，且甚至更优选为与氟他胺的组合以治疗前列腺癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与mTOR抑制剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。此化学治疗剂组包括但不限于西罗莫司(sirolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、KU-0063794和WYE-354。特别优选为抗CD39抗体与西罗莫司、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司、KU-0063794和WYE-354的组合，且甚至更优选为与替西罗莫司的组合以治疗肺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌和脑癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及抗CD39抗体与酪氨酸激酶抑制剂的组合以治疗癌症，且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。此化学治疗剂组包括但不限于埃罗替尼、索拉非尼、阿昔替尼(axitinib)、博舒替尼(bosutinib)、西地尼布、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、吉非替尼、伊马替尼、卡奈替尼(canertinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、司马沙尼(semaxanib)、舒尼替尼、瓦他拉尼(vatalanib)和凡德他尼。特别优选为抗CD39抗体与埃罗替尼、索拉非尼、阿昔替尼、博舒替尼、西地尼布、克唑替尼、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、卡奈替尼、拉帕替尼、来他替尼、来那替尼、尼罗替尼、司马沙尼、舒尼替尼、瓦他拉尼和凡德他尼的组合，且甚至更优选为与埃罗替尼的组合以治疗癌症，且更特别地治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和脑癌。
本发明所涵盖的另一方面涉及上述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用MAP激酶途径抑制剂或WNT途径抑制剂。
在一些实施方案中，MAP激酶途径抑制剂选自由以下组成的组：BRAF抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂和c-KIT抑制剂。
在一些实施方案中，BRAF抑制剂选自由以下组成的组：GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、达拉非尼(dabrafenib)和LGX818。
在一些实施方案中，MEK抑制剂选自由以下组成的组：GSK1120212、司美替尼(selumetinib)和MEK162。
在一些实施方案中，WNT途径抑制剂为β-连环蛋白抑制剂或卷曲蛋白抑制剂(frizzled inhibitor)。
在一些实施方案中，β-连环蛋白抑制剂选自由以下组成的组：氯硝柳胺(niclosamide)、XAV-939、FH 535和ICG 001。
本发明所涵盖的另一方面涉及上述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用癌症疫苗。在一些实施方案中，所述癌症疫苗为树突状细胞疫苗。
本发明所涵盖的另一方面涉及上述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用过继细胞转移。
在一些实施方案中，过继细胞转移为CAR-T细胞疗法。
本发明所涵盖的另一方面涉及上述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用抗体疗法。
本发明所涵盖的另一方面涉及上述方法中的任一者，其中抗CD39抗体的施用增强抗体疗法的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
在一些实施方案中，抗体疗法选自由以下组成的组：曲妥珠单抗(trastuzamab)、西妥昔单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗(rituximab)。
此外，使用抗CD39抗体的治疗可包括使用其他生物分子诸如一种或多种细胞因子(例如，淋巴因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)的组合治疗或者可伴随肿瘤的手术移除、癌细胞的移除或治疗医师认为必要的任何其他疗法。在一些实施方案中，另外治疗剂为免疫反应刺激剂。
在本文描述的方法的一些实施方案中，抗CD39抗体可与选自由以下组成的组的生长因子组合：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、促血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、P1GF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在本文描述的方法的一些实施方案中，另外治疗剂为免疫反应刺激剂。在一些实施方案中，所述免疫反应刺激剂选自由以下组成的组：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-1(IL-1)或白细胞介素-2(IL-2)。
施用时间表
在本文描述的方法的某些实施方案中，治疗涉及施用抗CD39抗体与放射疗法的组合。使用抗CD39抗体的治疗可在放射疗法之前、同时或之后发生。这种放射疗法的给药时间表可由熟练的医学从业者确定。
在本文描述的方法的某些实施方案中，治疗涉及施用抗CD39抗体与抗病毒疗法的组合。使用抗CD39抗体的治疗可在抗病毒疗法之前、同时或之后发生。组合疗法中使用的抗病毒药物将取决于受试者所感染的病毒。
组合施用可包括共施用，以单一药物制剂或使用不同的制剂，或以任何顺序但一般于一定时间内的连续施用，使得所有活性剂可同时发挥它们生物活性。
应了解抗CD39抗体和至少一种另外治疗剂的组合可以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体将向先前已经历使用第二治疗剂的治疗的患者施用。在某些其他实施方案中，所述抗CD39抗体和第二治疗剂将大体上同时或并行施用。例如，受试者可被给予抗CD39抗体，同时经历使用第二治疗剂(例如，化学疗法)的治疗过程。在某些实施方案中，抗CD39抗体将于使用第二治疗剂的治疗的1年内施用。在某些替代实施方案中，抗CD39抗体将于使用第二治疗剂的任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在某些其他实施方案中，抗CD39抗体将于使用第二治疗剂的任何治疗的4、3、2或1周内施用。在一些实施方案中，抗CD39抗体将于使用第二治疗剂的任何治疗的5、4、3、2或1天内施用。应进一步了解两种(或更多种)剂或治疗可于数小时或数分钟内(即，大体上同时)向受试者施用。
就疾病的治疗而言，抗CD39抗体的适当剂量取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性，无论是出于治疗还是预防目的施用抗CD39抗体、先前疗法、患者的临床病史等等均由主治医生来酌情权衡。所述抗CD39抗体可施用一次或经一系列治疗持续数天至数月，或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻(例如，肿瘤大小的减小)。最佳给药时间表可从患者体内的药物积聚的测量值计算且将取决于个别剂的相对效能而变化。施用医师可确定最佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，剂量为0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重或10mg至50mg/kg体重。在某些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约0.1mg至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约0.1mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约0.25mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约0.5mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约1mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约1.5mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约2mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约2.5mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约5mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约7.5mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约10mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约12.5mg/kg体重。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体的剂量为约15mg/kg体重。在某些实施方案中，所述剂量可每天、每周、每月或每年一次或更多次给予。在某些实施方案中，所述抗CD39抗体每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给予。
在一些实施方案中，抗CD39抗体可以初始较高的“负载”剂量，接着一个或多个较低剂量施用。在一些实施方案中，施用的频率也可改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，接着每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用另外剂量(或“维持剂量”)。例如，给药方案可包括施用初始负载剂量，接着每周施用维持剂量(例如，所述初始剂量的一半)。或给药方案可包括施用初始负载剂量，接着每隔一周施用维持剂量(例如，所述初始剂量的一半)。或给药方案可包括施用三个初始剂量持续3周，接着每隔一周施用维持剂量(例如，相同量)。
如本领域技术人员已知，任何治疗剂的施用均可导致副作用和/或毒性。在一些实例中，所述副作用和/或毒性如此严重而无法排除在治疗有效剂量下施用特定剂。在一些实例中，必须停止药物疗法，且可尝试其他剂。然而，相同治疗类别中的许多剂通常显示类似副作用和/或毒性，意指患者不得不停止疗法，或者如果可能，则罹患与所述治疗剂相关联的令人不快的副作用。
在一些实施方案中，给药时间表可限于特定数量的施用或“周期”。在一些实施方案中，抗CD39抗体施用3、4、5、6、7、8个或更多个周期。例如，所述抗CD39抗体每2周施用6个周期，所述抗CD39抗体每3周施用6个周期，所述抗CD39抗体每2周施用4个周期，所述抗CD39抗体每3周施用4个周期等。给药时间表可由本领域技术人员决定且随后修改。
因此，本发明提供向受试者施用本文描述的抗CD39抗体的方法，所述方法包括使用间歇给药策略来施用一种或多种剂，这可减少与施用抗CD39抗体、化学治疗剂等相关联的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗人受试者的癌症的方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗CD39抗体与治疗有效剂量的化学治疗剂的组合，其中所述剂中的一者或两者根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的抗CD39抗体，并约每2周一次施用后续剂量的所述抗CD39抗体。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的抗CD39抗体，并约每3周一次施用后续剂量的所述抗CD39抗体。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的抗CD39抗体，并约每4周一次施用后续剂量的所述抗CD39抗体。在一些实施方案中，所述抗CD39抗体使用间歇给药策略施用，并且所述化学治疗剂每周施用。
抗感染治疗组合
在一个实施方案中，本发明提供使用抗CD39抗体治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患病毒感染。在一个实施方案中，所述病毒感染为被选自由以下组成的组的病毒感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒。
在一个实施方案中，本发明提供使用抗CD39抗体治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患细菌感染。在一个实施方案中，所述细菌感染为被选自由以下组成的组的细菌感染：衣原体(Chlamydia)、立克次氏菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(Legionella)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌(Salmonella)、芽孢杆菌(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacteriumlepromatosis)和博氏杆菌(Borriella)。
在一实施方案中，本发明提供使用抗CD39抗体治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患真菌感染。在一个实施方案中，所述真菌感染为被选自由以下组成的组的真菌感染：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲菌属(Aspergillus)(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属(Genus Mucorales)(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrixschenkii)、皮肤芽孢杆菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)。
在一实施方案中，本发明提供使用抗CD39抗体治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患寄生虫感染。在一个实施方案中，所述寄生虫感染为被选自由以下组成的组的寄生虫感染：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴虫(Acanthamoeba)、贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
VII.抗CD39抗体缀合物
本文公开的抗CD39抗体还可缀合至化学部分。所述化学部分可尤其为聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。
例如，本发明提供缀合至治疗部分(即，药物)的抗CD39抗体。所述治疗部分可为例如细胞毒素、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。此类缀合物在本文中称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。因此，在一个方面中，根据任何上文描述的方面或实施方案的抗CD39抗体缀合至治疗部分。示例性治疗部分包括细胞毒性部分、放射性同位素、细胞因子和裂解肽。
在某些实施方案中，抗CD39抗体能够通过内化缀合至细胞毒性部分或与细胞毒性部分缔合的抗体而在CD39表达细胞中诱导细胞毒性。细胞毒性部分可例如选自由以下组成的组：紫杉醇；细胞松弛素B；短杆菌肽D；溴化乙锭；依米丁(emetine)；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷(tenoposide)；长春新碱；长春花碱；秋水仙碱；阿霉素；道诺霉素；二羟基蒽醌二酮；微管蛋白抑制剂，诸如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂，诸如单甲基奥瑞斯他汀E或F或其类似物或衍生物；尾海兔素10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光神霉素；放线菌素D；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷化剂，诸如氮芥、噻硫磷、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C；铂衍生物，诸如顺铂或卡铂；倍癌霉素A、倍癌霉素SA、拉奇霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，诸如放线菌素D、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、蒽霉素(AMC))；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(PDB)；白喉毒素和相关分子，诸如白喉A链及其活性片段和杂交分子，蓖麻毒素，诸如蓖麻毒素A或脱糖基化蓖麻毒素A链毒素、霍乱毒素、志贺样毒素，诸如SLT I、SLT II、SLT IIV、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆鲍曼-比尔克(Bowman-Birk)蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、阿罗林(alorin)、皂苷(saporin)、蒴莲根毒素(modeccin)、白素毒素(gelanin)、相思豆毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌(α-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、香石竹蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆蛋白(Phytolacca americana protein)诸如PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、皂苷抑制剂(sapaonariaofficinalis inhibitor)、白树毒素(gelonin)、线菌毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和依诺霉素(enomycin)毒素；核糖核酸酶(RNA酶)；DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A；商陆抗病毒蛋白；白喉菌素毒素；以及假单胞菌内毒素。
在一个实施方案中，抗CD39抗体缀合至奥瑞斯他汀或其肽类似物、衍生物或前药。奥瑞斯他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌活性(US5663149)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents and Chemother.42:2961-2965。例如，奥瑞斯他汀E可与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，分别产生AEB和AEVB。其他典型的奥瑞斯他汀衍生物包括AFP、MMAF(单甲基奥瑞斯他汀F)和MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E)。合适的奥瑞斯他汀和奥瑞斯他汀类似物、衍生物和前药以及适用于将奥瑞斯他汀缀合至Ab的接头描述于例如美国专利号5,635,483、5,780,588和6,214,345和国际专利申请公布WO02088172、WO2004010957、WO2005081711、WO2005084390、WO2006132670、WO03026577、WO200700860、WO207011968和WO205082023中。
在另一实施方案中，抗CD39抗体缀合至吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(PDB)或其类似物、衍生物或前药。合适的PDB和PDB衍生物和相关技术描述于例如Hartley J.A.等人,Cancer Res 2010；70(17):6849-6858；Antonow D.等人,Cancer J 2008；14(3):154-169；Howard P.W.等人,Bioorg Med Chem Lett 2009；19:6463-6466和Sagnou等人,BioorgMed Chem Lett 2000；10(18):2083-2086中。
在另一实施方案中，抗CD39抗体缀合至选自由以下组成的组的细胞毒性部分：蒽环霉素、美登素、卡奇霉素、倍癌霉素、拉奇霉素(CC-1065)、尾海兔素10、尾海兔素15、伊立替康、单甲基奥瑞斯他汀E、单甲基奥瑞斯他汀F、PDB或任何其类似物、衍生物或前药。
在一特定实施方案中，抗CD39抗体缀合至蒽环霉素或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至美登素或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至卡奇霉素或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至倍癌霉素或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至拉奇霉素(CC-1065)或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至尾海兔素10或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至尾海兔素15或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至单甲基奥瑞斯他汀E或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至单甲基奥瑞斯他汀F或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓或其类似物、衍生物或前药。在另一特定实施方案中，抗体缀合至伊立替康或其类似物、衍生物或前药。
在一个实施方案中，本发明所涵盖的抗CD39抗体缀合至核酸或核酸相关分子。在一个这样的实施方案中，缀合的核酸为细胞毒性核糖核酸酶(RNA酶)或脱氧核糖核酸酶(例如，DNA酶I)、反义核酸、抑制性RNA分子(例如，siRNA分子)或免疫刺激性核酸(例如，含有免疫刺激CpG基序的DNA分子)。在另一实施方案中，本发明所涵盖的CD39特异性抗体缀合至适体或核酶。
在一个实施方案中，本发明所涵盖的抗CD39抗体例如作为融合蛋白缀合至裂解肽(诸如CLIP、蛙皮素2(Magainin 2)、蜂毒肽(mellitin)、天蚕素(Cecropin)和P18)。
在一个实施方案中，抗CD39抗体缀合至细胞因子，诸如，例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子、安塞司亭(ancestim)和TNFα。
在某些实施方案中，化学部分为增加抗体或片段在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括但不限于亲水性聚合物，它们包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如，分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开PEG缀合的单链抗体。Wen等人(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开使抗体与附接至放射性金属螯合剂(二亚乙基三氨基五乙酸(DTPA))的PEG缀合。
抗CD39抗体还可与诸如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe的标记缀合。
抗CD39抗体还可与荧光或化学发光标记缀合，所述荧光或化学发光标记包括荧光团诸如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、异硫氰酸盐、红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰(dansyl)、伞形酮、荧光素、鲁米诺(luminal)标记、异鲁米诺(isoluminal)标记、芳族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/亲和素、自旋标记和稳定自由基。
可采用用于将本发明所涵盖的抗体及其抗原结合片段缀合至各种部分的本领域中已知的任何方法，所述方法包括由Hunter等人(1962)Nature 144:945；David等人(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等人(1981)J.Immunol.Meth.40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407的那些方法。用于缀合抗体和片段的方法为常规的且在本领域中非常熟知。
VIII.药物组合物
本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体可配制成组合物，尤其药物组合物。此类组合物包含治疗或预防有效量的本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体，与合适的载体(例如，药学上可接受的剂)混合。通常，本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体在配制成药物组合物之前被充分纯化以向动物施用。
用于本发明药物组合物中的药学上可接受的剂包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填料、增积剂、缓冲液、递送媒介物、张力剂、助溶剂、润湿剂、复合剂、缓冲剂、抗菌剂和表面活性剂。
中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水为示例性适当的载体。药物组合物可包括抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。同样举例说明，合适的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸和类似物。过氧化氢也可用作防腐剂。合适的助溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的复合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或湿润剂包括去水山梨醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯80、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)等。缓冲剂可为常规缓冲剂，诸如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲剂可为约pH 4至5.5，并且Tris缓冲剂可为约pH 7至8.5。另外药物剂阐述于Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编，Mack出版公司，1990中。
组合物可呈液体形式或呈冻干或冷冻干燥形式并且可包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或增积剂(参见，例如，美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。在一个实施方案中，包括冻干保护剂，其为非还原性糖，诸如蔗糖、乳糖或海藻糖。一般包括的冻干保护剂的量应使得在重构后，所得制剂将为等渗的，尽管高渗或轻度低渗的制剂也可为合适的。另外，冻干保护剂的量应足以防止冻干时不可接受的量的蛋白质的降解和/或积聚。预冻干制剂中糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM。在另一实施方案中，包括表面活性剂，诸如非离子表面活性剂和离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯基醚(例如Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉荳蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉荳蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉荳蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、椰油酰胺基丙基-、苯乙酰胺基丙基-、肉荳蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(例如，月桂酰胺基丙基)；肉荳蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰牛磺酸钠或甲基牛磺酸二牛磺酸钠；和MONAQUATTM.系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics、PF68等)。预冻干制剂中可能存在的表面活性剂的示例性量为约0.001％至0.5％。高分子量结构添加剂(例如，填料、粘合剂)可包括例如阿拉伯树胶、白蛋白、海藻酸、磷酸钙(二元酸)、纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂(dextrate)、蔗糖、侵填体(tylose)、预胶凝淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔豆胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、海藻酸钠、黄蓍胶微晶纤维素、淀粉和玉米蛋白。高分子量结构添加剂的示例性浓度为0.1重量％至10重量％。在其他实施方案中，可包括增积剂(例如，甘露醇、甘氨酸)。
组合物可适用于胃肠外施用。示例性组合物适用于通过熟练的技术人员可获得的任何途径注射或输注至动物内，诸如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或病变内途径。胃肠外制剂通常将为无菌、无热原的等渗水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。
非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油，诸如橄榄油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏右旋糖者的那些和类似物。还可存在防腐剂和其他添加剂，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和类似物。一般，参见Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack编，1980，其以引用的方式并入本文中。
本文描述的药物组合物可被配制用于以在特定局部环境中提供产品的局部浓度(例如，推注，长效效应)和/或增加的稳定性或半衰期的方式受控或持续递送。所述组合物可包含本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体与聚合化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的颗粒制剂，以及诸如可生物降解基质、可注射微球、微胶囊颗粒、微胶囊、可生物蚀解的颗粒珠、脂质体和可植入递送装置的剂的制剂，它们提供活性剂的受控释放或持续释放，然后可作为长效注射剂递送。用于配制这种持续释放或受控释放递送方式的技术为已知的且各种聚合物已经研发并将用于药物的受控释放和递送。此类聚合物通常为可生物降解且可生物相容的。聚合物水凝胶(包括通过对映体聚合物或多肽片段的复合形成的那些)和具有温度或pH敏感性质的水凝胶可因为捕获生物活性蛋白剂(例如，抗体)涉及的温和和水性条件而适用于提供药物长效效应。参见，例如，PCT申请公布WO 93/15722中用于递送药物组合物的受控释放多孔聚合微粒的描述。
适用于此目的的材料包括聚丙交酯(参见，例如，美国专利3,773,919)、聚(α-羟基羧酸)的聚合物，诸如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988A)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(～)～3-羟基丁酸。其他可生物降解的聚合物包括聚(内酯)、聚(缩醛)、聚(原酸酯)和聚(原碳酸酯)。持续释放组合物还可包括脂质体，它们可通过本领域中已知的数种方法中的任一者制备(参见，例如，Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-92(1985))。载体本身或其降解产物在靶组织中应为无毒的且不应进一步加剧疾患。这可通过在靶病症的动物模型中或如果无法获得这些模型则在正常动物中进行常规筛选确定。[00196]用于持续释放的重组蛋白的微囊化已用人生长激素(rhGH)、干扰素(rhIFN--)、白细胞介素-2和MNrgpl20成功进行。Johnson等人,Nat.Med.,2:795-799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993)；Hora等人,Bio/Technologv.8:755-758(1990)；Cleland,“Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”，inVaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach,Powell和Newman编，(PlenumPress:New York,1995),第439至462页；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399；和美国专利号5,654,010。这些蛋白质的持续释放制剂由于其生物相容性和广泛的可生物降解性质而使用聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物进行研发。PLGA的降解产物(乳酸和乙醇酸)可于人体内快速清除。此外，此聚合物的可降解性可取决于其分子量和组成。Lewis,“Controlledrelease of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”，于:M.Chasin和R.Langer(编)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),第1至41页中。持续释放组合物的另外实例包括例如EP 58,48IA、美国专利号3,887,699、EP158,277A、加拿大专利号1176565、U.Sidman等人,Biopolymers 22,547[1983]；R.Langer等人,Chem.Tech.12,98[1982]；Sinha等人,J.Control.Release 90,261[2003]；Zhu等人,Nat.Biotechnol.18,24[2000]和Dai等人,Colloids Surf BBiointerfaces 41,117[2005]。
生物粘附性聚合物也考虑用于本发明所涵盖的组合物中或与本发明所涵盖的组合物一起使用。生物粘附剂为合成和天然存在的材料，它们能够长时间粘附至生物底物。例如，卡波姆(Carbopol)和聚卡波非(Polycarbophil)均为聚(丙烯酸)的合成交联衍生物。基于天然生成的物质的生物粘附性递送系统包括例如透明质酸，也称为玻尿酸。透明质酸为天然存在的粘多糖，其由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成。透明质酸发现于脊椎动物的细胞外组织基质中，包括在结缔组织，以及在滑膜液以及在眼的玻璃体和房水中。透明质酸的酯化衍生物已用于产生用于可生物相容和可生物降解的递送中的微球(参见，例如，Cortivo等人,Biomaterials(1991)12:727-730；欧洲公布号517,565；国际公布号WO96/29998；Ilium等人,J.Controlled ReI.(1994)29:133-141)。本发明所涵盖的示例性含透明质酸的组合物以大约0.1％至约40％(w/w)结合至透明质酸聚合物的IL-1/3结合抗体或片段的量包含透明质酸酯聚合物。[00198]可生物降解和不可生物降解的聚合物基质均可用于递送本发明所涵盖的组合物，并且此类聚合基质可包含天然或合成聚合物。可生物降解的基质为优选的。发生释放的时间周期为基于聚合物的选择。通常，在数小时至三至十二个月的范围内的周期内的释放为最理想的。可用于形成可生物降解的递送系统的示例性合成聚合物包括：乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚烷基二醇、聚环氧烷、聚亚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚酸酐、聚氨基甲酸酯及其共聚物、聚(丁酸)、聚(戊酸)、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。示例性天然聚合物包括海藻酸盐和其他多糖，包括右旋糖肝和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物(化学基团的取代、添加，例如，烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规作出的其他修饰)、白蛋白和其他亲水性蛋白质、玉米蛋白和其他醇溶谷蛋白和疏水性蛋白质、共聚物及其混合物。一般而言，这些材料通过酶促水解或体内暴露于水、通过表面或大块侵蚀降解。所述聚合物任选地呈水凝胶的形式(参见，例如，WO 04/009664、WO 05/087201，Sawhney等人,Macromolecules,1993,26,581-587)，在水中可吸收其重量的多达约90％，并且此外，任选地与多价离子或其他聚合物交联。
递送系统还包括非聚合物系统，它们为脂质，包括固醇(诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸)或中性脂肪(诸如单酸-、二酸-和三酸甘油酯)；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物；和类似物。特定实例包括但不限于：(a)其中以于基质内的形式包含产品的侵蚀系统，诸如美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中描述的那些，和(b)其中产品以受控速率从聚合物弥漫的扩散系统，诸如美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686中描述。含有脂质体的产品可通过已知方法制备，诸如，例如，(DE 3,218,121；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；和EP 102,324)。
或者或另外，组合物可经由植入于其中已吸收或囊封本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体的膜、海绵或其他适当的材料的受影响区内而经局部施用。在使用植入装置的情况下，所述装置可植入任何合适的组织或器官内，并且本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体的递送可通过所述装置经由推注直接施用，或经由连续施用，或经由导管使用连续输注施用。
包含本发明包含的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体的药物组合物可经配制以供吸入，诸如，例如，配制成干粉。吸入溶液还可配制于液化推进剂中用于气雾剂递送。在又另一制剂中，溶液可经雾化。用于肺部施用的另外药物组合物包括描述于例如PCT申请公布WO 94/20069中的那些，其公开经化学修饰的蛋白质的肺部递送。就肺部递送而言，粒度应适用于递送至远程肺。例如，粒度可为1μm至5μm；然而，例如，如果各颗粒均相当多孔，则可使用较大的颗粒。
含有本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体的某些制剂可经口施用。以此方式施用的制剂可与或不与通常用于混配固体剂型(诸如片剂和胶囊)的那些载体一起配制。例如，胶囊可经设计以在生物利用度最大化且全身前降解最小化时在胃肠道的某个点释放所述制剂的活性部分。可包含另外剂以促进选择性结合剂的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一制剂可涉及有效量的本发明所涵盖的抗CD39抗体、抗体片段、核酸或载体与适用于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解于无菌水或另一适当的媒介物中，溶液可以单位剂型制备。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或结合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
IX.示例性方法
材料和方法
试剂
除非另有规定，否则所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，细胞培养基购自Life Technologies(Carlsbad,CA)，细胞培养耗材购自
Figure BDA0003354910840001741
Scientific Products(Shirley,MA)，并且商业抗体购自Biolegend(San Diego,CA)。包括Alexa
Figure BDA0003354910840001742
488缀合的AffiniPure驴抗人IgG(Fc特异性)(#709-545-098)和Alexa
Figure BDA0003354910840001743
488缀合的抗兔IgG(H+L)(#711-545-152)的第二抗体获自JacksonImmunoResearch(West Grove,PA)，
Figure BDA0003354910840001744
(#G7571)，并且Bio-GloTM(#G7941)获自Promega(Madison,WI)。2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖购自BIOSYNTH Carbosynth(#MD06089)，并且正常人血清(#A113)购自Quidel公司(San Diego,CA)。抗人CD39参考抗体(hCD39 Ref)通过瞬时转染使用ExpiCHOTM表达系统试剂盒(#A29133；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)产生，并且抗体序列如所公开获得(Perrot等人,Cell Reports 27:2411-2425(2019))。hCD39 Ref抗体和完全人抗CD39单克隆抗体(Ig39-21)均含有相同的人IgG1 Fc部分。
hCD39 Ref抗体与本领域中的抗体共享抗原结合位点。然而，不同于当前实施例中使用的Ref抗体，先前技术的抗体被产生具有经特别设计以具有经消除的ADCC功能的Fc部分(即，经教示特异性地产生以结合CD39并抑制NTP酶活性而无需调用CD39依赖性ADCC细胞杀死)。
细胞培养
将经人CD39稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-hCD39)维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素的F12K中。将经人B类淋巴母细胞(HCC1739BL，ATCC#CRL-2334)、Raji细胞(Raji-hCD39neg)和人CD39稳定转染的Raji细胞(Raji-hCD39hi)培养于补充有10％FBS、1％青霉素-链霉素的RPMI 1640中。使人黑素瘤细胞(SK-MEL-28，ATCC#HTB-72)在EMEM加10％FBS、1％青霉素-链霉素中生长。在具有IL-2(10ng/ml)的MEM-α培养基中培养人自然杀伤细胞(NK-92-CD16 V/V)(ATCC#PTA-6967)。使人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，单供体，EGMTM-2(Lonza#C2517A,Basel,Switzerland)在EGMTM内皮细胞生长培养基套装(Lonza#CC-3124)中生长。将所有细胞系在37℃下在5％CO2气氛中在100％湿度下维持在培养瓶中，除Jurkat细胞/NFAT-luc+FcγRIIIA(Promega Cat#:G7011)在用于实验前在水浴中在37℃下解冻。
完全人抗CD39抗体的产生和无岩藻糖基化
在不存在(Ig39-21 WT)或存在岩藻糖基化抑制剂2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖(Ig39-21 AF)的情况下，完全人抗CD39抗体Ig39-21通过使用FreeStyleTM 293-F细胞(ThermoFisher Scientific#R79007)瞬时转染产生。优化的Ig39-21(鉴定为克隆NP501-BK)由经稳定转染的CHO细胞产生。
对表达人CD39的细胞系的单克隆抗体亲和力
将CHO-hCD39细胞或HCC1739BL细胞(内源性表达高水平的hCD39)(1X105个细胞)与连续稀释的单克隆抗体一起在4℃下孵育30分钟。在用细胞染色缓冲液洗涤两次后，将细胞与抗人IgG(Fc特异性)Alexa
Figure BDA0003354910840001761
488(1:5000)一起在4℃下孵育30分钟。然后将细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次并通过CytekTM Aurora流式细胞术(Cytek Biosciences,Fremont,CA)进行分析。检测Alexa
Figure BDA0003354910840001762
488中值荧光强度(MFI)并通过FCS Express 7软件(De Novo Software，Los Angeles,CA)分析数据。
人CD39酶活性对完整细胞的抑制
用胰蛋白酶消化CHO-hCD39细胞(8X104个细胞/孔)，计数并涂铺于96孔板U底部内，接着用改良的林格缓冲液(RB)(120mM NaCl、5mM KCl、2.5mM CaCl2、1.2mM MgSO4、25mMNaHCO3、10mM葡萄糖、80mM Tris-HCl，pH 7.4)洗涤两次并与单克隆抗体一起在37℃下孵育30分钟。然后在室温下使CHO-hCD39细胞暴露于ATP(250μM)，持续15分钟。最后将上清液收集至96孔不透明壁多孔板(BRAND板#781968)并通过发光使用
Figure BDA0003354910840001763
检测ATP水平。发光值在SynergyTM Neo2多模式读数器(BioTeK Instruments Inc.,Winooski,VT)上读数，它们与ATP水平直接相关。无抗体的细胞(细胞+ATP)或ATP单独在不存在细胞的情况下充当对照。结果表示为由以下计算的酶活性抑制的％：[(细胞+ATP+Ab)-(细胞+ATP)/(ATP)-(细胞+ATP)]X 100。所有步骤均以RB进行。
NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(NK细胞毒性测定)
将靶细胞(表达hCD39)用CFSE(0.025μM)在37℃下在水浴中预先标记5分钟。在用1X PBS洗涤两次后，将细胞在含有4％超低IgG FBS(Thermo Fisher Scientific#A3381901)的MEM-α培养基(Thermo Fisher Scientific#32561037)中在有或无单克隆抗体的情况下在5％CO2中孵育30分钟。然后，将靶细胞与NK-92-CD16 V/V效应细胞以不同比例在37℃下在5％CO2中共培养6小时。孵育后，在室温下用碘化丙啶(P/I)(200ng/mL)将细胞染色10分钟并通过CytekTM Aurora流式细胞术(Cytek Biosciences)分析靶细胞死亡。结果表示为CFSE+P/I+细胞的％或细胞毒性的％。
NFAT荧光素酶报告基因Jurkat系统(ADCC测定)
将附接的靶细胞(内源性表达中间水平的hCD39的SK-MEL-28黑素瘤细胞或内源性表达低水平的hCD39的HUVEC细胞)接种于96孔板(8X103个细胞/100μl/孔)中(BRAND板#781965)并生长24小时，同时刚好在实验前(5X105个细胞/ml)接种悬浮靶细胞(HCC1739BL)。然后，将细胞用ADCC测定缓冲液(补充有4％超低IgG血清的DMEM或RPMI 1640培养基)洗涤两次，并在37℃下与经连续稀释的单克隆抗体一起孵育30分钟。然后，将效应细胞(Jurkat细胞/NFAT-luc+FcγRIIIA)(3X106个细胞/ml)添加至孔并在37℃下将混合物(E:T＝1:6)孵育6小时。最后将Bio-GloTM添加至孔内并使用SynergyTM Neo2多模式读数器(BioTeK Instruments Inc.)读取在5、15和30分钟时的发光值。ADCC活性由荧光素酶活性超过背景的增加指示。
补体依赖性细胞毒性(CDC)测定
将过表达人CD39细胞的靶Raji细胞(Raji-CD39hi)用无血清RPMI 1640培养基洗涤两次，以2X106/ml的最终浓度重悬浮于CDC测定缓冲液(具有4％超低IgG FBS的RPMI1640培养基)中并在冰上静置2-3小时。然后将细胞与经连续稀释的单克隆抗体一起在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。然后将正常人血清(NHS 10％)添加至细胞并在37℃下在5％CO2中孵育2小时。孵育后，在室温下将细胞用碘化丙啶(P/I)(200ng/mL)染色10分钟并通过CytekTM Aurora流式细胞术(Cytek Biosciences)分析靶细胞死亡。结果表示为细胞毒性的％(P/I+细胞)。
表位竞争测定
表位竞争基质-I(图27)：使用抗体标记药盒根据制造商的说明书(Thermo FisherScientific#A20186)使抗人CD39单克隆抗体(克隆8C11、8D8、8E9、9B6和Ig39-21 WT)与Alexa
Figure BDA0003354910840001781
647缀合。小鼠抗人CD39克隆A1-PE购自Biolegend(#328208)。在4℃下将未缀合的人IgG1同种型Ultra-LEAF抗体(Biolegend#403502)或抗人CD39单克隆抗体(10μg/mL)与HCC1739BL细胞(1X105个细胞)一起孵育30分钟。接着，将Alexa
Figure BDA0003354910840001782
647缀合的(1μg/mL)或PE缀合的(0.25μg/mL)抗人CD39单克隆抗体添加至各孔并在4℃下孵育30分钟。然后将细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次并通过CytekTM Aurora流式细胞术进行分析。检测Alexa
Figure BDA0003354910840001783
647(AF647)或PE中值荧光强度(MFI)并通过FCS Express 7软件(De NovoSoftware)分析数据。计算AF647或PE MFI检测相对于同种型对照的倍数变化(无表位重叠＝1)。
表位竞争基质-II(图28)：在4℃下将未缀合的人IgG1同种型对照或hCD39 Ref单克隆抗体(10μg/mL)与HCC1739BL细胞(1X105个细胞)一起孵育30分钟。接着，将兔或人/兔嵌合克隆(1μg/mL)添加至各孔并在4℃下孵育30分钟。然后将细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次并在4℃下用Alexa
Figure BDA0003354910840001784
488缀合的抗兔IgG(H+L)(1:5000)染色30分钟。将细胞用细胞染色缓冲液再次洗涤两次并通过CytekTM Aurora流式细胞术进行分析。检测Alexa
Figure BDA0003354910840001785
488(AF488)MFI，并通过FCS Express 7软件(De Novo Software)分析数据。计算AF488MFI检测相对于同种型对照的倍数变化(无表位重叠＝1)。
构象表位作图
这使用Pepscan的专有CLIPS技术(Lelystad,The Netherlands)进行。表位作图的结果使用由史威史模型(Swiss-model)使用模板PDB条目3ZX3.pdb建立的同源模型可视化。
稳定的免疫复合物测定
在37℃下在5％CO2中将HCC1739BL细胞(5X105个细胞/mL)与抗人CD39抗体(2μg/ml)一起孵育或保持未经处理24小时。第二天，使未经处理的细胞暴露于相同组的单克隆抗体(2μg/ml)，但在4℃下20分钟，以获得基础水平的CD39表达。然后将细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次并在4℃下用抗人IgG(Fc特异性)Alexa
Figure BDA0003354910840001791
488(1:2000)染色30分钟，接着两次另外的洗涤，并在室温下用多聚甲醛(PFA，2％)固定10分钟。最后，将细胞洗涤两次并通过CytekTM Aurora流式细胞术(Cytek Biosciences)进行分析。检测Alexa
Figure BDA0003354910840001792
488(AF488)MFI，并通过FCS Express 7软件(De Novo Software)分析数据。在24小时时，细胞膜上人CD39损失的百分比计算为：[(20min MFI-24h MFI/20min MFI)]X100。
从肿瘤和脾纯化淋巴细胞
在研究终止时切除来自荷瘤小鼠的脾和肿瘤。来自脾的单细胞悬浮液通过70μM细胞过滤器通过机械啮合脾，接着红细胞裂解(#555899；BD Biosciences,San Jose,CA)获得。肿瘤浸润淋巴细胞通过使用小鼠肿瘤分离试剂盒(#130-096-730)在gentleMACSTM分离器(#130-096-427)上遵循制造商的说明书(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)消化肿瘤获得。免疫分型使用CytekTM Aurora流式细胞术进行。检测抗体列于表1中。
动物研究
免疫活性同基因小鼠模型：其中小鼠CD39的细胞外结构域被人对应物置换的C57BL6 hCD39 KI小鼠已自Beth Israel Deaconess医学中心获得许可。使用六至八周龄雌性小鼠进行肿瘤接种。将同基因鼠类MC38结肠直肠癌细胞维持在补充有10％FBS、青霉素(100单位/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基中。通过胰蛋白酶消化收获1X105个MC38细胞，并用补充有10％FBS的150μl RPMI1640重悬浮用于注射。将MC38细胞皮下注射至小鼠的右侧腹内。然后将小鼠随机分为三组(每组n＝5)。在第8、11、14和17天，荷瘤小鼠经由腹膜内接受5mg/kg人IgG1同种型对照抗体(KLH-hIgG1)或完全人抗CD39单克隆抗体(Ig39-21 AF或NP501-BK)。
异种移植物肿瘤模型：纯合的无胸腺裸小鼠(#002019；NU/J)购自The JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME)。使用五周龄雌性小鼠进行肿瘤接种。SK-MEL-28异种移植物通过将悬浮于与BD Matrigel基质高浓度(BD Biosciences#354262)1:1混合的200μl EMEM中的4X106个SK-MEL-28细胞皮下注射至小鼠的右侧腹内制备。当肿瘤达到大约500mm3的平均体积(视为治疗的第0天)，将小鼠随机分为两组(每组n＝6至7)，并在第0天和第3天经由腹膜内用两个剂量的300μl盐水或10mg/kg NP501-BK处理。
肿瘤长度(L)和宽度(W)使用数字卡尺每周两次测量。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
统计分析
统计分析使用GraphPad Prism 8(GraphPad Software，San Diego,CA)进行。
表1.检测抗体
Figure BDA0003354910840001801
Figure BDA0003354910840001811
以引用的方式并入
本文提及的所有公布、专利和专利申请均特此以引用的方式整体并入，所述并入程度就如同各个别公布、专利或专利申请均指示以引用的方式明确且个别地并入一样。在冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。
还以引用的方式整体并入本文中的是以与公共数据库中的条目相关的登录号为参考的任何多核苷酸和多肽序列，诸如由基因组研究所(TIGR)于万维网和/或美国国家生物技术信息中心(NCBI)于万维网维护的那些。
等效物和范围
本发明所涵盖的一个或多个实施方案的细节阐述于上文描述中。尽管上文已描述优选的材料和方法，但与本文描述的那些类似或等效的任何材料和方法可用于本发明所涵盖的实施方案的实践或测试中。与本发明相关的其他特征、目标和优点从描述为显而易见的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的本领域普通技术人员通常了解的含义相同的含义。在冲突的情况下，将以上文提供的本发明描述为准。
本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确定本文描述的本发明所涵盖的具体实施方案的许多等效物。本发明所涵盖的范围不意图限于本文提供的描述且此类等效物意图由随附权利要求书涵盖。
除非指示相反或另外从上下文明显看出，否则如本文使用的冠词“一个/种(a/an)”是指冠词的语法目标中的一者或多于一者(即，指至少一者)。作为举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。除非指示相反或另外从上下文明显看出，否则如果组成员中的一者、多于一者或所有存在于、采用于给定产品或方法中或另外与其相关，则将组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述视为满足。本发明包括其中所述组中恰好一个成员存在于、采用于给定产品或方法中或另外与其相关的实施方案。本发明还包括其中多于一个或整个组成员均存在于、采用于给定产品或方法中或另外与其相关的实施方案。
还应注意术语“包含”意图为开放的并且允许但不要求包括另外的元件或步骤。当本文使用术语“包含”时，因此还涵盖和公开了术语“由...组成”。
在给定范围的情况下，包括端点。此外，应了解除非另有指示或另外从上下文和本领域中的普通技术人员的了解明显看出，否则表示为范围的值可假定于本发明所涵盖的不同实施方案中的陈述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确指示，否则确定至所述范围的下限单位的十分之一。
另外，应了解落于现有技术中的本发明所涵盖的任何特定实施方案可从权利要求中的任一者或多者明确排除。由于认为此类实施方案为本领域普通技术人员已知，因此即使本文中未明确阐述排除也可将它们排除。无论是否与现有技术的存在相关，本发明所涵盖的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何产生方法；任何使用方法；等等)可出于任何原因而从任何一项或多项权利要求排除。
应了解已使用的词语为描述性而非限制性词语，并且可在随附权利要求的范围内作出改变，而不背离本发明在其更广泛方面中涵盖的真实范围和精神。
尽管关于数个本文描述的实施方案已在一定长度和以一定特征描述本发明，但不意图将其限制于任何此类细节或实施方案或任何特定实施方案，而应参考随附权利要求解释，以便于鉴于现有技术，提供此类权利要求的最广泛的可能解释，并且因此有效涵盖本发明所涵盖的预期范围。
序列表
<110> Purinomia公司(Purinomia, Inc)
吴燕(Wu, Yan)
<120> 用于通过CD39表达细胞的ADCC靶向促进和增强T细胞介导的免疫反应的方法和组合物
<130> Purinomia
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人可变链文库
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 1
gag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta agg cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tca tat gat gta agc aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tct tac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg 336
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tca 357
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人可变链文库
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 3
gat gtt gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agg tac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gtc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag cca 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt agg tca cct cgg 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 5
cag tca gtg aag gag gcc ggg ggt cgc ctg gta acg cct gga gga tcc 48
Gln Ser Val Lys Glu Ala Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt gcg tat gga 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Gly
20 25 30
ata agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag gga ctg gaa tgg atc gga 144
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
atc att tat agt agt ggt agg act tac tac gcg aac tgg gcg aaa ggc 192
Ile Ile Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg 240
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
acc agt ctg aca acc gag gac acg gcc gcc tat ttc tgt gcc aga tca 288
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys Ala Arg Ser
85 90 95
cgg gct ggt att agt agt ggt gat ggt ttt gat tcc tgg ggc cca ggc 336
Arg Ala Gly Ile Ser Ser Gly Asp Gly Phe Asp Ser Trp Gly Pro Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Ser Val Lys Glu Ala Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys Ala Arg Ser
85 90 95
Arg Ala Gly Ile Ser Ser Gly Asp Gly Phe Asp Ser Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 7
gcc aga tgt gcc ctt gtg atg acc cag act cca tcc tcc gtg tct gca 48
Ala Arg Cys Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aat tgc cag gcc agt cag aac att 96
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile
20 25 30
tac agc aat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc cag 144
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Gln
35 40 45
ctc ctg atc tac agg gca tcc act ctg gca tct ggg gtc cca tcg cgg 192
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
ttc aaa ggc agt gca tct ggg aca gaa tac act ctc acc atc agc ggt 240
Phe Lys Gly Ser Ala Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
gtg cag tgt gac gat gct gcc act tac tat tgt caa cag ggt ttt gat 288
Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Asp
85 90 95
agt agt aac att gat aat act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc 336
Ser Ser Asn Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
aca 339
Thr
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Ala Arg Cys Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile
20 25 30
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Gln
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Ser Ala Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Asp
85 90 95
Ser Ser Asn Ile Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Thr
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 9
cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca cac 48
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr His
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt aag agt ata 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser Ile
20 25 30
ata agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tac atc gga 144
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
atc att ggt agt agt ggt agc aca tac tac gcg aac tgg gcg aaa ggc 192
Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aga atg 240
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Met
65 70 75 80
acc agt ctg aca ccc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga gga 288
Thr Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
ctt ctt tat tct ggt aat aaa tcg tgg ggc ccg ggc acc ctg gtc acc 336
Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Ser Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
gtc tcc tca 345
Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser Ile
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Ser Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 11
gcc aca ttt gcc att gat atg acc cag act cca tcc tcc gtg tct gca 48
Ala Thr Phe Ala Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aac tgc cag tcc agt cag agt gtt 96
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val
20 25 30
tta ctg aac aac caa tta tcc tgg ttt cag cag aaa cca ggg cag cct 144
Leu Leu Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
ccc aag ctc ctg atc tat gat gca tcc act ctg gaa tct ggg gtc cca 192
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
tct cgg ttc aca ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act ctc acc atc 240
Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
agc gac ctg gag tgt gac gat gct gcc act tac tat tgt tta ggc ggt 288
Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly
85 90 95
tat agt ggg aac ctt tat gct ttc ggc gga ggg acc gag gtg cta gtc 336
Tyr Ser Gly Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Leu Val
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ala Thr Phe Ala Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val
20 25 30
Leu Leu Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro
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85 90 95
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100 105 110
Lys
<210> 13
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(351)
<400> 13
cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt agc tat gca 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
ata agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctc gaa tat atc gcg 144
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Ala
35 40 45
atc att aat agt tat ggt acc aca tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc 192
Ile Ile Asn Ser Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cga gtc acc atc tcc aaa acc tcg agc acg gtg gat ctg aaa atc tcc 240
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga ggc gat 288
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp
85 90 95
agt tat ggt agt ggt gtt ggt ttg ggc ttg tgg ggc cca ggc acc ctg 336
Ser Tyr Gly Ser Gly Val Gly Leu Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
gtc acc gtc tcc tca 351
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Ala
35 40 45
Ile Ile Asn Ser Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp
85 90 95
Ser Tyr Gly Ser Gly Val Gly Leu Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 15
gcc aga tgt gcc tat gat atg acc cag act cca gcc tct gtg gag gta 48
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val
1 5 10 15
gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aag tgc cag gcc agt cag aac att 96
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile
20 25 30
tac agc aat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aag 144
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys
35 40 45
ctc ctg atc tac agg gca tcc agt ctg gca tct ggg gtc ccg tcg cgg 192
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gag ttc act ctc acc atc agc ggt 240
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
gtg cag tgt gac gat gct gcc act tac tac tgt caa cag ggt ttt agt 288
Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser
85 90 95
agt aat aat gtt gat aat act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc 336
Ser Asn Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile
20 25 30
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser
85 90 95
Ser Asn Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 17
cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc acc gtc tcc gga ttc tcc ctc agt agc tat gca 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tac atc gga 144
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
atc att agt agt agt ggt agc aca tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc 192
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg acc acg gtg gat ctg aaa atc tcc 240
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga gat cgt 288
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg
85 90 95
gtt att tat agt att ggt ccg tat tat ttt aat ttg tgg ggc cca ggc 336
Val Ile Tyr Ser Ile Gly Pro Tyr Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg
85 90 95
Val Ile Tyr Ser Ile Gly Pro Tyr Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 19
gcc aga tgt gcc tat gat atg acc cag act cca tcc tcc gtg tct gca 48
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
act gtg gga ggc aca gtc acc atc aat tgc cag gcc agt gag atc att 96
Thr Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile
20 25 30
tat agc aat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cct ccc aag 144
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
35 40 45
ctc ctg atc tat ggc gca tcc act ctg gca tct ggg gtc cca tcg cgg 192
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
ttc aaa ggc agt gga tct ggg aca gag tac act ctc acc atc agc gac 240
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp
65 70 75 80
ctg cag tgt gac gat gct gcc act tac tac tgt caa cag agt ttt agt 288
Leu Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser
85 90 95
agt aat aat gtt ggg aat att ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc 336
Ser Asn Asn Val Gly Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
Thr Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile
20 25 30
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp
65 70 75 80
Leu Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser
85 90 95
Ser Asn Asn Val Gly Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys
<210> 21
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(351)
<400> 21
cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc aca gcc tct gga ttc tcc ctc agt acc cat gca 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His Ala
20 25 30
ata aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tgg atc ggg 144
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
atc act tat gct agt ggt agg aca tat tac gcg agc tgg gcg aaa ggc 192
Ile Thr Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg acc acg gtg gat ctg aaa atc acc 240
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga aat ggg 288
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Gly
85 90 95
gct gat gaa aca ttt tac tac ttt gac ttg tgg ggc cca ggc acc ctg 336
Ala Asp Glu Thr Phe Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
gtc acc gtc tcc tca 351
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Thr Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Gly
85 90 95
Ala Asp Glu Thr Phe Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 23
gcc aga tgt gcc tat gat atg acc cag act cca gcc tcc gtg gag gca 48
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala
1 5 10 15
gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aag tgc cag gcc agt cag aat att 96
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile
20 25 30
aat act tgg tta tcc tgg tat cag cag aag gca ggg cag cct ccc aag 144
Asn Thr Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro Lys
35 40 45
ctc ctg atc tac agg gca tcc act ctg gca tct ggg gtc tca tcg cgg 192
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg
50 55 60
ttc aaa ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act ctc acc atc agc ggc 240
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
gtg gag tgt gcc gat gct gcc act tac tac tgt caa caa tat gat gct 288
Val Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ala
85 90 95
agt att aat att gat aat gct ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc 336
Ser Ile Asn Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile
20 25 30
Asn Thr Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Val Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys
<210> 25
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(351)
<400> 25
cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga atc gac ctc agt agc aat gca 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tat atc gga 144
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
att att agg aat aat gat atc aca tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc 192
Ile Ile Arg Asn Asn Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg acc acg gtg gat ctg ata atc acc 240
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ile Ile Thr
65 70 75 80
agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga ggg ggt 288
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
ggt tct tac agt att gtc ttc tgg aac tta tgg ggc cca ggc acc ctg 336
Gly Ser Tyr Ser Ile Val Phe Trp Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
gtc acc gtc tcc tca 351
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Arg Asn Asn Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ile Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ser Ile Val Phe Trp Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自兔单克隆
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 27
gcc aga tgt gcc tat gat atg acc cag act cca gcc tct gtg gag gta 48
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val
1 5 10 15
gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aat tgc cag gcc agt gag agg att 96
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile
20 25 30
tat agc aat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aaa 144
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys
35 40 45
ctc ctg atc tat tat gca tcc act ctg gca tct ggg gtc tca tcg cgg 192
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg
50 55 60
ttc aaa ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act ctc acc atc agc ggc 240
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
gtg cag tgt gcc gat gct gcc act tac tac tgt cag cag ggt tat agt 288
Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser
85 90 95
aat aat aat gtt gac aat act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc 336
Asn Asn Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
aga 339
Arg
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile
20 25 30
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser
85 90 95
Asn Asn Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Arg
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人VH结构域
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人VH结构域
<400> 30
Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人VH结构域
<400> 31
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人VL结构域
<400> 32
Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
1 5
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人VL结构域
<400> 33
Asp Ala Ser
1
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人VL结构域
<400> 34
Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 35
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人可变结构域和人Ig结构域
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1350)
<400> 35
gag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta agg cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tca tat gat gta agc aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tct tac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg 336
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc act aag ggc cca tcc gtg ttc 384
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
cca ctg gca ccc tct agt aag agc aca tct ggg ggt act gcc gct ctg 432
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
gga tgt ctg gtg aag gat tac ttc cca gag cca gtc acc gtg tcc tgg 480
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
aac agc ggg gcc ctg act tcc ggt gtc cat acc ttt cca gct gtg ctg 528
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
cag tca tcc ggc ctg tac agc ctg agc tct gtg gtc acc gtc ccc agt 576
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
tca tcc ctg gga aca cag act tat atc tgc aac gtg aat cac aag cca 624
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
tcc aat aca aaa gtc gac aag aaa gtg gaa ccc aag agc tgt gat aaa 672
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
acc cat aca tgc ccc cct tgt cct gct cca gag ctg ctg gga gga cca 720
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
tcc gtg ttc ctg ttt cca ccc aag cct aaa gac act ctg atg att tct 768
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
cga acc ccc gaa gtc aca tgc gtg gtc gtg gac gtg tcc cac gag gat 816
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
cct gaa gtc aag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtc gag gtg cat aat 864
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
gcc aag aca aaa cca cga gag gaa cag tac aac agt acc tat cgt gtc 912
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
gtg tca gtc ctg aca gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggg aag gaa 960
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
tat aag tgc aaa gtg agc aat aag gca ctg ccc gcc cct atc gag aaa 1008
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
aca att tct aag gct aaa gga cag cct agg gaa cca cag gtg tac act 1056
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
ctg cct cca tca cgg gac gag ctg aca aag aac cag gtc agt ctg act 1104
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
tgt ctg gtg aaa ggg ttc tat cct tct gat atc gcc gtg gag tgg gaa 1152
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
agt aat ggt cag cca gag aac aat tac aag acc aca ccc cct gtc ctg 1200
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
gac tct gat ggg agt ttc ttt ctg tat tcc aag ctg acc gtg gat aaa 1248
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
agc cgg tgg cag cag ggt aat gtc ttt agt tgt tca gtg atg cac gag 1296
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
gca ctg cac aat cac tac acc cag aaa tca ctg tca ctg tca cca ggt 1344
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
aaa tga 1350
Lys
<210> 36
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 37
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人可变结构域和人Ig结构域
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(645)
<400> 37
gat gtt gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agg tac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gtc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag cca 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt agg tca cct cgg 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa cga act gtg gct gca 336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 432
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 480
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 576
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 624
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
ttc aac agg gga gag tgt tag 645
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 39
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自人可变结构域
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(732)
<400> 39
gat gtt gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agg tac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gtc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag cca 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt agg tca cct cgg 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa ggc gga tcc tct agg 336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg
100 105 110
tca agt tcc agc ggc ggc ggt ggc agc gga ggc ggc ggt gag gtg caa 384
Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
115 120 125
ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta agg cct ggg ggg tcc ctg aga 432
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat gct atg cac 480
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His
145 150 155 160
tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata 528
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
165 170 175
tca tat gat gta agc aat aaa tac tac gca gac tcc gtg aag ggc cga 576
Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat ctg caa atg 624
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg aga tct 672
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
210 215 220
tac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc 720
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
acc gtc tcc tca 732
Thr Val Ser Ser
<210> 40
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
165 170 175
Ser Tyr Asp Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 41
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(351)
<400> 41
cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga atc gac ctc agt aac aat gca 96
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Asn Ala
20 25 30
atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tat atc gga 144
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
atc att agg agt agt ggt agt aca tat tac gcg aac tgg gca aaa ggc 192
Ile Ile Arg Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
cgg ttc acc atc tcc aaa acc tcg acc acg gtg gat ctg ata atc acc 240
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ile Ile Thr
65 70 75 80
agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga ggg ggt 288
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
ggt tct tac agt att gtc ttc tgg aac ttg tgg ggc cca ggc acc ctg 336
Gly Ser Tyr Ser Ile Val Phe Trp Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
gtc acc gtc tcc tca 351
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Asn Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Arg Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ile Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ser Ile Val Phe Trp Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<400> 43
gcc aga tgt gcc tat gat atg acc cag act cca gcc tct gtg gag gta 48
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val
1 5 10 15
gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aat tgc cag gcc agt gag agg att 96
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile
20 25 30
tat agc aat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aag 144
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys
35 40 45
ctc ctg atc tat tat aca tcc act ctg gca tct ggg gtc tca tcg cgg 192
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg
50 55 60
ttc aaa ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act ctc acc atc agc ggc 240
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
gtg gag tgt gcc gat gct gcc act tac tac tgt caa cag ggt tat agt 288
Val Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser
85 90 95
agt agt aat gtt gac aat act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc 336
Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
aaa ggt 342
Lys Gly
<210> 44
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile
20 25 30
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg
50 55 60
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Val Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser
85 90 95
Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys Gly
<210> 45
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<400> 45
ggc gag cag cag ctg gtg gag agc ggc gga ggc ctg gtg cag cct gga 48
Gly Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
gga agc ctg agg ctg agc tgc gcc gtg tcc ggc ttc agc ctg agc agc 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
20 25 30
tac gcc atc agc tgg gtg agg cag gcc ccc gga aag ggc ctg gag tac 144
Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
35 40 45
atc gcc atc atc aac agc tac ggc acc acc tac tac gcc agc tgg gcc 192
Ile Ala Ile Ile Asn Ser Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
aag ggc aga gtg acc atc tcc aag gat tcc tcc aag aac acc gtg tac 240
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg ggc tcc ctg aga gcc gag gat atg gcc gtg tac ttt tgc 288
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcc aga ggc gat tcc tac ggc tcc ggc gtg ggc ctg ggc ctg tgg gga 336
Ala Arg Gly Asp Ser Tyr Gly Ser Gly Val Gly Leu Gly Leu Trp Gly
100 105 110
cct gga acc ctg gtg aca gtg tcc tcc 363
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Gly Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
35 40 45
Ile Ala Ile Ile Asn Ser Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ser Tyr Gly Ser Gly Val Gly Leu Gly Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<400> 47
gga gac tac cag atg aca cag tcc cct agc acc ctg tcc gcc tcc gtg 48
Gly Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
ggc gac aga gtg aca atc acc tgt cag gcc tcc cag aat atc tac agc 96
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser
20 25 30
aat ctg gcc tgg tac cag cag aag cct ggc aag agg ccc aag ctg ctg 144
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Arg Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc tac aga gcc agc tcc ctg gcc tcc ggc gtg cca tct aga ttt tcc 192
Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
ggc tcc ggc agc ggc aca gag ttt acc ctg aca atc agc agc ctg cag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
ccc gat gat ttc gcc acc tac tac tgt cag cag ggc ttc agc agc aat 288
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Asn
85 90 95
aat gtg gac aat aca ttt ggc ggc ggc aca aag gtg gag atc aag 333
Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gly Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Arg Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Asn
85 90 95
Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 49
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 49
ggc gag cag cag ctg gtg gag agc ggc gga ggc ctg gtg cag cct gga 48
Gly Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
gga agc ctg agg ctg agc tgc gcc gtg tcc ggc ttt tcc ctg agc aag 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys
20 25 30
agc atc atc agc tgg gtg agg cag gcc cct ggc aag ggc ctg gag tac 144
Ser Ile Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
35 40 45
atc ggc atc atc ggc agc agc ggc tcc acc tac tac gcc aac tgg gcc 192
Ile Gly Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
aag ggc aga ttc aca atc tcc aag gac tcc tcc aag aat acc gtg tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg ggc tcc ctg agg gcc gag gat atg gcc gtg tac ttt tgt 288
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcc aga ggc ctg ctg tac tcc ggc aat aag tcc tgg ggc ccc ggc aca 336
Ala Arg Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Ser Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
ctg gtg acc gtg agc tcc 354
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Gly Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys
20 25 30
Ser Ile Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
35 40 45
Ile Gly Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Ser Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<400> 51
ggc gac atc gtg atg acc cag tcc ccc gat tcc ctg gcc gtg tcc ctg 48
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
ggc gag aga gcc aca atc aat tgt cag tcc tcc cag agc gtg ctg ctg 96
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu
20 25 30
aac aat cag ctg tcc tgg ttc cag cag aag cct ggc cag cct ccc aag 144
Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
35 40 45
ctg ctg atc tac gac gcc tcc aca ctg gag tcc ggc gtg ccc gat agg 192
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
ttc agc ggc tcc ggc agc ggc acc gac ttt acc ctg acc atc tcc agc 240
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
ctg cag gcc gag gat gtg gcc gtg tac tac tgc ctg ggc ggc tac agc 288
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser
85 90 95
ggc aac ctg tac gcc ttt ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 333
Gly Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu
20 25 30
Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser
85 90 95
Gly Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<400> 53
ggc gag cag cag ctg gtg gag tcc ggc gga ggc ctg gtg cag cca gga 48
Gly Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
gga agc ctg agg ctg tcc tgt gcc gtg agc ggc ttc tcc ctg agc tcc 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
20 25 30
tac gcc atg agc tgg gtg agg cag gcc ccc gga aag ggc ctg gag tac 144
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
35 40 45
atc ggc atc atc agc agc agc ggc agc aca tac tac gcc agc tgg gcc 192
Ile Gly Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
aag ggc agg ttc aca atc agc aag gat tcc tcc aag aat aca gtg tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg ggc tcc ctg agg gcc gag gac atg gcc gtg tac ttc tgt 288
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcc aga gac agg gtc atc tat tcc atc ggc cct tac tac ttc aac ctg 336
Ala Arg Asp Arg Val Ile Tyr Ser Ile Gly Pro Tyr Tyr Phe Asn Leu
100 105 110
tgg ggc ccc ggc aca ctg gtg aca gtg tcc agc 369
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gly Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
35 40 45
Ile Gly Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Val Ile Tyr Ser Ile Gly Pro Tyr Tyr Phe Asn Leu
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<400> 55
ggc gat tac cag atg aca cag tcc ccc tcc tcc ctg agc gcc tcc gtg 48
Gly Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
gga gat agg gtg acc atc aca tgc cag gcc agc gag atc atc tac agc 96
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
aat ctg gcc tgg tac cag cag aag ccc ggc aag ccc ccc aag ctg ctg 144
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc tac ggc gcc tcc aca ctg gcc agc ggc gtg cct agc aga ttc agc 192
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agc ggc tcc ggc acc gat tac acc ctg aca atc tcc agc ctg cag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
cct gag gat ttt gcc aca tac tac tgt cag cag tcc ttc agc tcc aat 288
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Ser Asn
85 90 95
aac gtg ggc aac atc ttc ggc ggc ggc aca aag gtg gag atc aag 333
Asn Val Gly Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gly Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Ser Asn
85 90 95
Asn Val Gly Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (50)

1.一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含：
(i)至少一个抗原结合结构域，所述抗原结合结构域在一个位点结合外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(CD39)，使得所述抗CD39抗体形成稳定的免疫复合物，以及
(ii)FcγRIIIa结合部分，所述FcγRIIIa结合部分结合FcγRIIIa受体并赋予所述抗CD39抗体针对CD39+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
2.如权利要求1所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段促进：
(i)当与HCC1739BL细胞孵育时的稳定免疫复合物形成，如通过在24小时后所述免疫复合物损失小于30％所表征，任选地其中所述免疫复合物形成系通过荧光强度使用荧光标记的第二抗体检测；
(ii)针对CD39+细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；
(iii)CD45+免疫细胞上CD39的抗体介导的靶胞吞；
(iv)来自肿瘤中肿瘤血管内皮破坏或血管分布网络崩溃的CD39的抗体介导的靶胞吞；
(v)(任选地)结合至具有选自图33中所列的CD39氨基酸表位序列的组的序列的CD39表位；和/或
(vi)(任选地)以与单克隆抗体克隆A1非竞争性或仅部分竞争性结合至CD39的方式结合至CD39。
3.如权利要求1或2所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述FcγRIIIa结合部分选自由以下组成的组：Fc结构域、结合至FcγRIIIa的抗体或其片段和FcγRIIIa结合肽。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)、Fav、dsFv、sc(Fv)2、Fde、sdFv、单结构域抗体(dAb)和双功能抗体片段，和/或其中所述抗CD39抗体或抗原结合片段为单克隆。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段缀合至剂，任选地其中所述剂选自由以下组成的组：结合蛋白、酶、药物、化学治疗剂、生物剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、可检测部分和标签。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段具有VH结构域，所述VH结构域具有能够由在严格条件下与SEQ IDNo.1的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列；和VL结构域，所述VL结构域具有能够由在严格条件下与SEQ ID No.3的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID No.2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54的CDR至少60％同一的CDR；和轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56的CDR至少60％同一的CDR。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID No.2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54至少60％同一的可变重(VH)链，和与SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56至少60％同一的可变轻(VL)链。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链，所述重链具有与SEQ ID No.29至少80％同一的CDR1氨基酸序列、与SEQ IDNo.30至少80％同一的CDR2氨基酸序列和与SEQ ID No.31至少80％同一的CDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.32至少80％同一的CDR1氨基酸序列、与SEQ IDNo.33至少80％同一的CDR2氨基酸序列和与SEQ ID No.34至少80％同一的CDR3氨基酸序列。
10.如权利要求1至8中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID No.6、10、14、18、22、26、42、46、50和54的CDR组成的组的CDR的重链和具有选自由SEQ ID No.8、12、16、20、24、28、44、48、52和56的CDR组成的组的CDR的轻链以及人框架序列，以形成具有能够特异性地结合人CD39的抗原结合位点的人源化重链和轻链。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段包含IgG1或IgG3同种型的Fc结构域，任选地其中所述Fc结构域为人的。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段为低岩藻糖基化或无岩藻糖基化。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段为人或为人源化的。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段为双特异性的，包含至少一个另外的抗原结合位点用于肿瘤抗原、免疫检查点或共刺激受体，其中如果所述另外的抗原结合位点用于免疫检查点，则其用作检查点抑制剂，并且其中如果所述另外的抗原结合位点用于共刺激受体，则其用作共刺激激动剂。
15.如权利要求14所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述另外的抗原结合位点结合至选自由以下组成的组的检查点蛋白：PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT和Siglec-15。
16.如权利要求14或15所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述另外的抗原结合位点结合T细胞上经上调并与T细胞耗竭相关的检查点蛋白。
17.如权利要求14所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述另外的抗原结合位点结合至选自由以下组成的组的免疫共刺激受体：MHCI分子、BTLA受体、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
18.如权利要求14所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述另外的抗原结合位点结合至CD47，SIRPα、CD24或Siglec-10。
19.一种药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效量的至少一种权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲剂或溶液。
20.如权利要求19所述的药物制剂，所述药物制剂用于改善抗肿瘤T细胞免疫性并且适合于施用至患有肿瘤的受试者，所述药物制剂包含有效量的所述抗CD39抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲剂或溶液，其中向所述受试者施用所述抗CD39抗体使得肿瘤内CD39高细胞的数量减少，并且增强T细胞浸润至所述肿瘤内或减少所述肿瘤中的T细胞耗竭或两者。
21.一种经分离的核酸分子，所述经分离的核酸分子
i)在严格条件下与编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸的补体杂交；
ii)具有在全长上与编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸具有至少约90％同一性的序列；或
iii)编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽。
22.一种经分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽，所述经分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽由权利要求21所述的核酸编码。
23.一种载体，所述载体包含权利要求21所述的经分离的核酸，任选地其中所述载体为表达载体。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求21所述的经分离的核酸，所述宿主细胞：
a)表达权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段；
b)包含权利要求22所述的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽；和/或
c)包含权利要求23所述的载体。
25.一种装置或药盒，所述装置或药盒包含至少一种权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，所述装置或药盒任选地包含标记以检测至少一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的复合物。
26.一种装置或药盒，所述装置或药盒包含权利要求19至24中任一项所述的药物组合物、经分离的核酸分子、经分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽、载体和/或宿主细胞。
27.一种产生至少一种权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在适合允许所述抗CD39抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养已经由包含编码至少一种抗CD39抗体或其抗原结合片段的序列的核酸转化的经转化宿主细胞；以及(ii)回收所述表达的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
28.一种检测CD39多肽的存在或浓度的方法，所述方法包括获得样品，以及通过使用至少一种权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段检测所述样品中的所述多肽。
29.如权利要求28的方法，其中至少一种抗CD39抗体或其抗原结合片段与所述CD39多肽形成复合物，并且所述复合物以酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学测定、蛋白质印迹、质谱测定、核磁共振测定或使用细胞内流测定的形式检测。
30.一种用于通过耗减肿瘤内CD39高细胞而改善抗肿瘤T细胞免疫性的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得肿瘤内CD39高细胞的数量减少，并且增强T细胞浸润至所述肿瘤内或减少所述肿瘤中的T细胞耗竭或两者。
31.一种用于促进免疫细胞浸润至肿瘤内的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得所述肿瘤中的CD39+CD45-SCA-1+基质细胞消除和减少，以及细胞毒性T细胞对所述肿瘤的浸润增加。
32.一种用于减少II型NKT细胞对肿瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，
其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得所述肿瘤中的II型NKT细胞消除和减少。
33.一种用于减少调控性T细胞(Treg)对肿瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，
其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得所述肿瘤中的CD39高Treg消除和减少。
34.一种用于减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的施用使得所述肿瘤中的CD39高巨噬细胞消除和减少。
35.一种用于促进抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用足以使得所述肿瘤中的CD39表达细胞减少的量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
36.一种用于促进受试者的肿瘤中T细胞介导的免疫功能的方法，所述方法包括：
(i)鉴定具有低于预定阈值的肿瘤浸润的肿瘤反应性淋巴细胞程度的癌症受试者，以表征为未浸润或浸润不足的肿瘤表型；以及
(ii)以增加肿瘤反应性T细胞浸润肿瘤的量向所述受试者施用权利要求1至18中任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
37.如权利要求30、31或34所述的方法，其中所述肿瘤内CD39高细胞选自造血干细胞或祖细胞(CD45-Sca-1+)、CD39+NKT细胞、CD39+巨噬细胞、CD39+癌细胞、CD39+内皮细胞或其组合。
38.如权利要求30、31或34所述的方法，其中所述抗CD39抗体或其抗原结合片段降低一个或多个造血区室内出现的CD39高细胞的水平，任选地其中所述一个或多个造血区室选自由血液、脾和肝组成的组。
39.如权利要求30至38中任一项所述的方法，其中施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为抗肿瘤疗法的一部分。
40.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为抗感染疗法的一部分，任选地其中所述抗感染疗法为抗病毒疗法(包括HIV和HBV感染以及COVID-19感染的治疗)、用于结核分枝杆菌的治疗和用于内脏利什曼病的治疗。
41.如权利要求30至40中任一项所述的方法，其中施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为用于治疗实体肿瘤的抗肿瘤疗法的一部分，任选地其中所述实体肿瘤为胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌或神经胶质瘤。
42.如权利要求30至41中任一项所述的方法，其中施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为用于治疗液体肿瘤的抗肿瘤疗法的一部分，任选地其中所述液体肿瘤为白血病。
43.如权利要求30至42中任一项所述的方法，其中施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为涉及一种或多种化学治疗剂、抗血管生成剂、免疫肿瘤学剂和/或放射的疗法的一部分。
44.如权利要求30至43中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用一种或多种检查点分子的一种或多种抑制剂(拮抗剂)，任选地其中所述一种或多种检查点分子选自由以下组成的组：PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、TIGIT拮抗剂和Siglec-15拮抗剂。
45.如权利要求30至44中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用一种或多种共刺激分子的一种或多种活化剂(激动剂)，任选地其中所述一种或多种共刺激分子选自由以下组成的组：GITR激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD137激动剂、ICOS激动剂和CD28激动剂。
46.如权利要求30至45中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用以下中的一者或多者：VEGFR或VEGF拮抗剂、EGFR或EGF拮抗剂、IDO抑制剂、IDO1抑制剂、HDAC抑制剂、PI3Kδ抑制剂、IL-15激动剂、CXCR4拮抗剂、CXCL12拮抗剂、DNMT抑制剂、白细胞介素-21、抗KIR抗体、抗CSF-1R抗体、抗CCR4抗体、GMCSF、抗PS抗体、抗CD30抗体-奥瑞斯他汀E缀合物、抗CD19抗体、抗CEA IL-2抗体、抗NY-ESO-1抗体、抗NKG2A抗体、STING激动剂、TRL7/8激动剂、RIG-1激动剂和/或NRLP3抑制剂、抗CD73抗体(诸如MEDI9447)、P2X7拮抗剂或腺苷A2A受体拮抗剂。
47.如权利要求30至46中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用一种或多种先天免疫诱导剂，任选地其中所述一种或多种先天免疫诱导剂选自由以下组成的组：CD47-SIRPα轴的抑制剂、CD24-Siglec-10轴的抑制剂、阻断NK和CD8+细胞的HLA-E驱动的抑制的NGK2A检查点抑制剂、STING激动剂、TLR7/8激动剂和RIG-I激动剂。
48.如权利要求30至46中任一项所述的方法，其中施用所述抗CD39抗体或其抗原结合片段作为包括肿瘤疫苗、过继细胞疗法、抗肿瘤基因疗法、抑制性核酸疗法和/或溶瘤病毒疗法的疗法的一部分。
49.如权利要求20或30至48中任一项所述的药物组合物或方法，其中所述受试者为癌症的动物模型。
50.如权利要求20或30至49中任一项所述的药物组合物或方法，其中所述受试者为哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物为人或啮齿动物。
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