TW202120551A - 藉由adcc靶向cd39表現細胞促進及增強t細胞介導免疫反應之方法及組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於與習知療法(諸如靶向療法、化學療法及血管生成抑制劑等)組合之靶向檢查點分子之免疫療法，其已在治療實體或液體腫瘤中顯示具有前景。然而，非腫瘤細胞在腫瘤內微環境中之作用已指示此等細胞之消除(ablation)可為針對腫瘤產生有效免疫反應之關鍵，其包括免疫系統之細胞毒性T細胞及其他抗腫瘤細胞之腫瘤浸潤。本發明不聚焦於嘗試抑制CD39作為產生腺苷之酶之外核苷酸酶活性，而是利用CD39表現以由CD39依賴性ADCC實現腫瘤內細胞消除。

Description

藉由ADCC靶向CD39表現細胞促進及增強T細胞介導免疫反應之方法及組合物
對於患有晚期癌症之人，希望可為有價值但稀有之商品。近年來，稱為免疫檢查點抑制劑之藥物之新穎類別已顯示卓越之前景，可使腫瘤陷入困境並阻止其等生長，及容許接受治療之一些人基本痊癒。但此等開創性療法具有大量挑戰。儘管基於晚期癌症中針對程序性細胞死亡蛋白1 (PD1)、PD1配體1 (PDL1)及細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA4)療法之抑制抗體之免疫療法在晚期癌症中之成功，但相當大比例之病患仍對此等治療無反應。
隨著對免疫抑制腫瘤微環境作為抵抗之主要驅動物的關注日益增加，並根據免疫細胞浸潤之程度來表徵「熱」及「冷」腫瘤，研究員已發現基於缺乏對檢查點單一療法之有效反應之數種不同機制。免疫學上「熱」腫瘤含有高濃度之浸潤性T細胞及更多抗原，使得其等更易於被免疫系統識別，且更可能觸發強烈之免疫反應。免疫學上認為熱之癌症係膀胱癌、頭頸癌、腎癌、黑色素瘤及非小細胞肺癌。然而，即使在此等免疫學上「熱」癌症中，仍僅少數病患受益於免疫療法。相比之下，免疫學上「冷」腫瘤係出於各種原因而幾乎不含有浸潤性T細胞，似乎未經識別為外源者且不引起免疫系統強烈反應之癌症，使得此等癌症難以用當前之免疫療法治療。傳統上免疫學上「冷」癌症包括成膠質細胞瘤，及卵巢癌、前列腺癌、胰癌及大多數乳癌。
除癌胞外，腫瘤之微環境亦含有許多細胞類型，其等包括骨髓源性發炎細胞、淋巴細胞、血管、成纖維細胞及包含膠原蛋白及蛋白聚醣之胞外基質(ECM)。事實上，腫瘤藥物反應並非僅由腫瘤細胞之固有特徵決定，因為腫瘤相關基質細胞，包括成纖維細胞、間充質基質細胞(MSC)、免疫發炎細胞、血管內皮細胞及ECM組合以回應於抗癌治療。在許多情況下，該腫瘤是否具有T細胞浸潤或缺乏T細胞浸潤，對檢查點療法之抗性或無反應均為腫瘤中存在之其他細胞之抑制效應之結果，該等抑制效應之範圍從導致已存在於腫瘤中之細胞毒性T細胞之下調或抑制之腫瘤內傳訊至發展藉由降低彼等細胞自周圍血管滲入腫瘤內之能力完全排除細胞毒性T細胞之腫瘤微環境。
因此，此項技術中極需識別用於增強T細胞反應之取代機制。
靶向外核苷酸酶CD39以便降低在與該蛋白質相關聯之酶促活性之腫瘤內水平，並因此降低免疫抑制劑(腺苷)之腫瘤內含量。本發明至少部分基於下列另外之發現：CD39由腫瘤微環境中一定範圍之細胞(諸如基質細胞、II型NKT細胞及腫瘤相關巨噬細胞(TAM)表現，其等發揮作用以產生免疫抑制或免疫排斥環境，及使用某些抗體依賴性細胞毒性(ADCC)補體靶向彼等細胞用於在腫瘤中消除，可使用抗CD39抗體以增加細胞毒性T細胞之浸潤，及實際上將「冷」腫瘤轉化為免疫學上「熱」腫瘤。
例如，在一項態樣中，提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，其包含(i)至少一個抗原結合域，於一位點結合外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1) (CD39)，使得該抗CD39抗體形成穩定之免疫複合物，及(ii) FcγRIIIa結合部分，結合FcγRIIIa受體並向該抗CD39抗體賦予針對CD39+細胞之ADCC活性。
進一步提供許多實施例，其等可應用於本發明之任何態樣及/或與本文描述之任何其他實施例組合。例如，在一項實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段促進：(i)穩定之免疫複合物形成，當與HCC 1739BL細胞培育時，其特徵在於24小時後損失小於40%之免疫複合物，或24小時後小於35%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%或甚至小於10%，視需要其中該免疫複合物形成係藉由螢光強度使用螢光標記之二級抗體偵測(例如僅用於說明，以抗CD39抗體形成之免疫複合物之穩定性可藉由以HCC1739BL細胞培養抗CD39單株抗體(mAb) (諸如在2 µg/ml或更大)不同時間及然後藉由螢光結合之二級抗體偵測免疫複合物之存在)；(ii)針對CD39+細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性；(iii) CD45+免疫細胞上之CD39之抗體介導之靶胞吞；(iv)來自腫瘤中腫瘤血管內皮破壞或血管分布網路崩潰之CD39之抗體介導之靶胞吞；(v)結合至CD39胺基酸抗原決定基，其具有選自由圖33中列舉之CD39胺基酸抗原決定基序列組成之群之序列；及/或(vi)以與單株抗體純系A1非競爭性或僅部分競爭性結合至CD39之方式結合至CD39。
在另一實施例中，FcγRIIIa結合部分係選自由下列組成之群：Fc域、結合至FcγRIIIa之抗體或其片段，及FcγRIIIa結合肽。在又另一實施例中，該抗原結合域係選自由下列組成之群：Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv(scFv)、Fav、dsFv、sc(Fv)2、Fde、sdFv、單域抗體(dAb)，及雙功能抗體(diabodies)片段及/或其中該抗CD39抗體或抗原結合片段係單株。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段係結合至藥劑，視需要其中該藥劑係選自由下列組成之群：結合蛋白、酶、藥物、化學治療劑、生物劑、毒素、放射性核素、免疫調節劑、可偵測部分，及標籤。在另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段具有胺基酸序列可由在嚴格條件下與SEQ ID No. 1之核酸雜交之核酸序列或核酸編碼之VH域，及胺基酸序列可由在嚴格條件下與SEQ 1ID No. 3之核酸雜交(諸如在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)在45℃下雜交，並在0.2xSSC/0.1%SDS中在50至65℃下清洗)之核酸序列或核酸編碼之VL域。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含具有CDR與SEQ ID No. 2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54之CDR相同至少60% (諸如至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之重鏈，及具有與SEQ ID No. 4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56之CDR相同至少60% (諸如至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR之輕鏈。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID No. 2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54相同至少60% (諸如至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更大)之可變重(VH)鏈，及與SEQ ID No. 4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56相同至少60% (諸如至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之可變輕(VL)鏈。在另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段，包含：(i)具有與SEQ ID No. 29相同至少80% (諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR1胺基酸序列、與SEQ ID 30相同至少80% (諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR2胺基酸序列及與SEQ ID No. 31相同至少80% (諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR3胺基酸序列之重鏈；及(ii)具有與SEQ ID No. 32相同至少80% (諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR1胺基酸序列、與SEQ ID No. 33相同至少80% (諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR2胺基酸序列及與SEQ ID No. 34相同至少80% (諸如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)之CDR3胺基酸序列之輕鏈。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含具有CDR選自由SEQ ID No. 6、10、14、18、22、26、42、46、50及54之CDR組成之群之重鏈，及具有選自由SEQ ID No. 8、12、16、20、24、28、44、48、52或56之CDR組成之群之CDR之輕鏈，及人類框架序列以形成具有可特異性結合人類CD39之抗原結合位點之人類化重鏈及輕鏈。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含IgG1或IgG3同型之Fc域，視需要其中該Fc域係人類的。在另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段係低岩藻糖基化或無岩藻糖基化。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段係人類或人類化的。在又另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段係雙特異性的，包括至少一個另外之抗原結合位點用於腫瘤抗原、免疫檢查點或共刺激受體，其中若該另外之抗原結合位點用於免疫檢查點，則其用作檢查點抑制劑，及其中若該另外之抗原結合位點用於共刺激受體，則其用作共刺激激動劑。在另一實施例中，該另外之抗原結合位點結合至選自由下列組成之群之檢查點蛋白：PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT及Siglec-15。在又另一實施例中，該另外之抗原結合位點結合T細胞上經上調並與T細胞耗竭相關之檢查點蛋白。在又另一實施例中，該另外之抗原結合位點結合至選自由下列組成之群之免疫共刺激受體：MHCI分子、BTLA受體、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB(CD137)。在另一實施例中，該另外之抗原結合位點結合至CD47，SIRPα，CD24或Siglec-10。
在另一態樣中，提供包含治療有效量之至少一種本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段，及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑或溶液之醫藥製劑。例如，該醫藥製劑可用於改善抗腫瘤T細胞免疫性，及適用於投與患有腫瘤之個體，包含有效量之抗CD39抗體或其抗原結合片段，及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑或溶液，其中向該個體投與抗CD39抗體導致腫瘤內CD39高 細胞之數量減少，並增強T細胞浸潤至腫瘤內或減少腫瘤中T細胞耗竭或兩者。
在又另一項態樣中，提供經分離之核酸分子，其i)在嚴格條件下與編碼本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽之核酸之互補體雜交；ii)具有在全長上與編碼本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽之核酸具有至少約90%一致性之序列；或iii)編碼本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽。
在又另一態樣中，提供由本文描述之核酸編碼之經分離之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽。
在另一態樣中，提供包含本文描述之經分離之核酸之載體，視需要其中該載體係表現載體。
在又另一項態樣中，提供包含本文描述之經分離之核酸之宿主細胞，其：a)表現本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段；b)包含本文描述之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽；或c)包含本文描述之載體。
在又另一態樣中，提供包含至少一種本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之裝置或套組。該裝置或套組視需要包含標記以偵測至少一種抗CD39抗體或其抗原結合片段，或包含該抗CD39抗體或其抗原結合片段之複合物。
在另一態樣中，提供包含本文描述之醫藥組合物、經分離之核酸分子、經分離之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽、載體及/或宿主細胞之裝置或套組。
在又另一態樣中，產生至少一種如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括下列步驟：(i)在適合容許該抗CD39抗體或其抗原結合片段之表現之條件下，培養已經經包含編碼至少一種抗CD39抗體或其抗原結合片段之序列之核酸轉形之轉形宿主細胞；及(ii)回收表現之抗CD39抗體或其抗原結合片段。
在又另一態樣中，提供偵測CD39多肽之存在或濃度之方法，該方法包括獲得樣本，及藉由使用至少一種本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段偵測該樣本中之該多肽。例如，該至少一種抗CD39抗體或其抗原結合片段可與CD39多肽形成複合物，及該複合物可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學分析、西方墨點法、質譜分析、核磁共振分析之形式或使用胞內流分析偵測。
在另一態樣中，提供藉由消除腫瘤內CD39高 細胞以改善抗腫瘤T細胞免疫性之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致腫瘤內CD39高 細胞之數量減少並增強T細胞浸潤至腫瘤內或減少腫瘤中T細胞之耗竭或兩者。
在又另一態樣中，提供用於促進免疫細胞浸潤至腫瘤內之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致腫瘤中CD39+ CD45‐SCA‐1+基質細胞之消除及減少，並增加細胞毒性T細胞浸潤腫瘤。
在又另一態樣中，提供用於減少II型NKT細胞抑制腫瘤內免疫細胞功能之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致腫瘤中II型NKT細胞之消除及減少。
在另一態樣中，提供用於減少調節T細胞(Treg)抑制腫瘤內免疫細胞功能之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或抗原結合片段之投與導致腫瘤中CD39高 Treg之消除及減少。
在又另一態樣中，提供用於減少腫瘤相關巨噬細胞(TAM)抑制腫瘤內免疫細胞功能之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致腫瘤中CD39高 TAM之消除及減少。
在又另一態樣中，提供用於促進抗腫瘤免疫反應之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與足以導致該腫瘤中CD39表現細胞減少之量之本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段。
在又另一態樣中，提供用於促進個體之腫瘤中之T細胞介導免疫功能之方法，其包括：(i)識別癌症個體具有腫瘤浸潤之腫瘤反應性淋巴細胞之程度低於預定臨限值，以表徵為未浸潤或浸潤不足(under-infiltrated)之腫瘤表型；及(ii)以增加腫瘤反應性T細胞浸潤腫瘤之量向該個體投與本文描述之抗CD39抗體或其抗原結合片段。
如上文描述，進一步提供可應用於本發明之任何態樣及/或與本文描述之任何其他實施例組合之許多實施例。例如，在一項實施例中，腫瘤內CD39高 細胞係選自造血幹細胞或祖細胞(CD45-Sca-1+)、CD39+ NKT細胞、CD39+巨噬細胞、CD39+癌細胞、CD39+內皮細胞或其組合。在另一實施例中，該抗CD39抗體或其抗原結合片段降低一或多個造血隔室內出現之CD39高 細胞之濃度，視需要其中該等一或多個造血隔室係選自由血液、脾及肝組成之群。在又另一實施例中，投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為抗腫瘤療法之一部分。在又另一實施例中，投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為抗感染療法之一部分，視需要其中該抗感染療法係抗病毒療法(包括HIV及HBV感染及COVID-19感染之治療)、用於結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )之治療，及用於內臟萊什曼病之治療。在另一實施例中，投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為用於治療實體腫瘤之抗腫瘤療法之一部分，視需要其中該實體腫瘤係胰癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、前列腺癌、結腸癌、乳癌、淋巴瘤、膽囊癌、腎癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、子宮頸癌或神經膠質瘤。在又另一實施例中，投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為用於治療液體腫瘤之抗腫瘤療法之一部分，視需要其中該液體腫瘤係白血病。在又另一實施例中，投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為涉及一或多種化學治療劑、抗血管生成劑、免疫腫瘤劑及/或放射之療法之一部分。在另一實施例中，該療法包括投與一或多種檢查點分子之一或多種抑制劑(拮抗劑)，視需要其中該等一或多種檢查點分子係選自由下列組成之群：PD-1拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、LAG-3拮抗劑、TIM-3拮抗劑、TIGIT拮抗劑及Siglec-15拮抗劑。在又另一實施例中，該療法包括投與一或多種共刺激分子之一或多種活化劑(激動劑)，視需要其中該等一或多種共刺激分子係選自係選自由下列組成之群：GITR激動劑、CD27激動劑、4-1BB激動劑、OX40激動劑、CD137激動劑、ICOS激動劑及CD28激動劑。在又另一實施例中，該療法包括投與下列中之一或多者：VEGFR或VEGF拮抗劑、EGFR或EGF拮抗劑、IDO抑制劑、IDO1抑制劑、HDAC抑制劑、PI3Kδ抑制劑、IL-15激動劑、CXCR4拮抗劑、CXCL12拮抗劑、DNMT抑制劑、介白素21、抗KIR抗體、抗CSF-1R抗體、抗CCR4抗體、GMCSF、抗PS抗體、抗CD30抗體-澳瑞他汀(aurstatin) E結合物、抗CD19抗體、抗CEA IL-2抗體、抗NY-ESO-1抗體、抗NKG2A抗體、STING激動劑、TRL7/8激動劑、RIG-1激動劑及/或NRLP3抑制劑、抗CD73抗體(諸如MEDI9447)、P2X7拮抗劑或腺苷A2A受體拮抗劑。在另一實施例中，該治療包括投與一或多種先天免疫誘導劑，視需要其中該等一或多種先天免疫誘導劑係選自由下列組成之群：CD47-SIRPα軸之抑制劑(例如抗體或結合至CD47或SIRPα並抑制該等兩種分子之相互作用之其他結合部分)、CD24-Siglec-10軸之抑制劑(例如抗體或結合至CD24或Siglec-10並抑制該等兩種分子之相互作用之其他結合部分)、阻斷NK及CD8+細胞之HLA-E驅動抑制之NGK2A檢查點抑制劑、STING激動劑、TLR7/8激動劑及RIG-I激動劑。在又另一實施例中，投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為包括腫瘤疫苗、過繼(adoptive)細胞療法(包括CAR-T及ACTR療法)、抗腫瘤基因療法、抑制核酸療法(諸如siRNA、shRNA、反義、CRISPR及TALEN療法)及/或溶瘤病毒療法之療法之一部分。在又另一實施例中，個體係癌症之動物模型。在另一實施例中，該個體係哺乳動物，視需要其中該哺乳動物係人類或囓齒動物。
I.概述 已知胞外腺苷係免疫功能之抑制劑。儘管胞內腺苷參與能量代謝、核酸代謝及甲硫胺酸循環，但在腫瘤微環境中，胞外腺苷在抑制免疫傳訊中發揮重要作用。藉由腺苷A2A受體(A2AR)傳訊之免疫抑制腺苷3'5'-單磷酸(cAMP)介導途徑可抑制低氧、發炎及癌性微環境中之T淋巴細胞及自然殺手(NK)細胞(Ohta等人，(2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103:13132‐7)。臨床前證據連同最近及不斷發展之積極臨床試驗資料一起證實A2AR抑制劑之投與可為免疫療法之潛在新穎策略。另外，在實驗動物模型中，阻斷涉及CD39/CD73之腺苷產生途徑亦誘導乳癌、結腸直腸癌及黑色素瘤之消退。在抗CD39及抗CD73抗體療法之情況下，重點主要在於藉由結合至此等細胞表面產生腺苷之酶(「外核苷酸酶」)並抑制酶促活性或自細胞表面移除酶促活性而抑制或降低ATP及衍生核苷酸分解代謝(最終)成腺苷。
本發明至少部分基於下列發現：CD39之某些抗體可選擇性靶向及消除(諸如藉由抗體依賴性細胞之細胞毒性)腫瘤微環境中之CD39表現細胞(比先前技術中之抗CD39抗體更有效)，包括CD39+ CD45‐ SCA‐1+基質細胞(諸如造血祖細胞)、CD39+ NKT細胞、CD39+巨噬細胞及CD39+內皮細胞，及CD39+癌細胞。腫瘤內CD39高 細胞數量之減少可導致腫瘤之發炎表型之變化，諸如增強之T細胞浸潤至腫瘤內、腫瘤中減少之T細胞耗竭、腫瘤內免疫細胞功能之降低之II型NKT細胞抑制及/或腫瘤內免疫細胞功能之降低之調節T細胞(Treg)抑制及/或腫瘤內免疫細胞功能之降低之腫瘤相關巨噬細胞(TAM)抑制。
儘管不希望受任何特定理論之束縛，但由發明人產生之某些抗體可與CD39形成更穩定之免疫複合物以產生更有效之ADCC殺死效用。發明人已觀察到，無法與CD39形成如彼等本發明包含者一樣穩定之免疫複合物之抗體導致表面上之CD39減少，但藉由增加CD39脫落或細胞增加(內化)之機制及就可藉由抗體依賴性細胞之細胞毒性消除CD39表現細胞而言不具有相同效用。在某些實施例中，本發明包含之某些抗體已顯示結合至CD39上之抗原決定基，此等抗原決定基與單株抗體純系A1非競爭性或僅部分競爭性結合至CD39。
如例示性方法中更詳細描述及附圖中闡述，相比於(例如)由先前技術中之所有抗CD39治療抗體直接抑制CD39 NTPase活性(Perrot等人，2019, Cell Reports 27:2411‐2425；Li等人，2020, Cancer Discovery 9(12):CD‐19‐0541；及PCT Publ. WO 2017/089334)，吾人之抗CD39抗體係經特別設計以具有包含IgG1 Fc域之人類恆定區。此設計賦予本發明之抗CD39抗體FcγRIIIa受體依賴性細胞活性，例如針對CD39+細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)及/或腫瘤內CD39+細胞之抗體介導之靶胞吞。因此，此等細胞活性導致腫瘤中CD39高 細胞之消除及減少。
標的抗CD39單株抗體之例示性特徵係如下文匯總，該等特徵經教示遠離用於參考文獻中描述之治療抗CD39抗體。
標的抗體可藉由FcγRIIIa受體依賴性活性(例如ADCC)靶向腫瘤中之CD39+細胞。
作為實例，圖13及圖26顯示吾人主要純系Ig39-21(完全人類抗CD39單株抗體)之顯著降低之岩藻糖基化(低岩藻糖基化或無岩藻糖基化)，藉由使用岩藻糖基化抑制劑(Ig39-21 AF)或藉由最佳化產生方法(NP501-BK)，顯著增加其活體外針對CD39+細胞之ADCC活性。此與活體內此等無岩藻糖基化抗體之抗腫瘤活性之增強並行(圖15)，而完全糖基化形式(Ig39-21 WT)在相同腫瘤模型中未顯示抗腫瘤活性(未顯示資料)。
如圖13及26中NK細胞毒性分析預測，此等不同岩藻糖基化Ig39-21抗體之活體外最大有效劑量(MaxED)進一步說明其等活體內抗腫瘤活性之差異。例如，岩藻糖基化將Ig39-21 WT之MaxED自0.1 μg/ml增強高達至0.001 μg/ml。當轉譯為臨床時，此100倍增加將為高效用、有利之安全概況、良好之耐受性及低成本。
相比之下，本文使用之參考hCD39抗體(hCD39 Ref)與此項技術中之抗體共用抗原結合位點。然而，與當前實例中使用之Ref抗體相反，先前技術抗體係用經特定設計以具有經消除之ADCC功能之Fc部分產生(即，經教示已經特定產生以結合CD39並抑制NTPase活性而無需引起CD39依賴性ADCC細胞殺死)。
標的抗CD39抗體之ADCC活性係選擇性針對CD39高 細胞。
作為實例，圖3及圖4顯示Ig39-21之ADCC活性係選擇性針對CD39高 細胞(即，圖3中之Raji-hCD39hi細胞及圖4中之SK-MEL-28細胞)。
此等活體外資料與活體內腫瘤微環境之相關性：圖16證實hCD39在攜載MC38之hCD39 KI小鼠之腫瘤內部係高度上調，包括CD45+腫瘤浸潤淋巴細胞(即，CD3+CD11b-T細胞、CD3-CD11b+髓樣細胞及F4/80hiGr-1腫瘤相關巨噬細胞)及腫瘤相關血管內皮細胞(未顯示資料)。NP501-BK治療導致腫瘤中CD39高 細胞之消除及減少(未顯示圖16及資料)。
此功能特徵應賦予抗體腫瘤特異性，避免應導致更安全之抗CD39抗體之全身性副作用。
抗CD39抗體與靶細胞膜上之抗原形成穩定之免疫複合物賦予抗體高ADCC活性。
作為圖29中顯示之一實例，靶細胞表面上抗體:抗原免疫複合物之穩定性係使用選自下列三組之抗體檢查：高ADCC (亦即，NP501-BK、hCD39 Ref及人類/兔嵌合純系8C11、8D8、9C10及48F10)、低ADCC (人類/兔嵌合純系52G4)或ADCC陰性(人類/兔嵌合純系8E9、59B6及67C1)。此免疫複合物之穩定性與抗體之ADCC活性間之強及正相關係清晰可見的。抗體:抗原免疫複合物越穩定，則抗體之ADCC活性越高。
抗CD39抗體之不同抗原決定基係與抗體之ADCC活性直接相關。
作為一實例，藉由比較標的人類/兔嵌合抗hCD39抗體之抗原決定基與市售抗hCD39單株抗體純系A1之抗原決定基，圖18及21至23顯示以與純系A1非競爭或僅部分競爭性結合至CD39之方式結合至抗CD39之抗CD39抗體很可能含有高ADCC活性，即，除65H5外，六種高ADCC抗體中有五種(2G12、8C11、8D8、9B6及9C10)顯示此特徵(圖21)。相比之下，低ADCC (2A11、5F1、52G4及63B1)及ADCC陰性(8E9、59B6、60D9、62G12、62H10、65E10、67A8及67C1)組中之所有抗體均顯示與純系A1之抗原決定基完全重疊之抗原決定基(圖22及23)。
腫瘤中標的抗CD39抗體之多個CD39高 細胞標靶。
作為一實例，採用hCD39 KI小鼠中之CD39-MC38結腸直腸癌模型(圖15及16)。此模型中NP501-BK之抗腫瘤活性係其對CD39高 腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤相關血管內皮細胞之靶向效應之結果(未顯示資料)。
另一實例係使用植入CD39+人類SK-MEL-28黑色素瘤細胞之NU/J裸小鼠之異種移植腫瘤模型(圖17)。此等純合之無胸腺裸小鼠缺乏T細胞，在B細胞發育中亦具有部分缺陷，而其等NK細胞在功能上可勝任。因此，在此異種移植腫瘤模型中，NP501-BK介導ADCC殺死之靶細胞係CD39+ SK-MEL-28腫瘤細胞，其與該抗體針對SK-MEL-28細胞之活體外ADCC活性相符(圖4)。
II.定義 為促進瞭解本發明，下文定義許多術語及片語。 「CD39」，亦稱為「分化簇39」、「外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1」或(基因)「ENTPD1」及(蛋白質) 「NTPDase1」係細胞表面定位之外核苷酸酶，其具有催化三磷酸及二磷酸核苷之γ-及β-磷酸殘基水解為單磷酸核苷衍生物(酶條目：EC 3.6.1.5)，諸如水解P2受體配體，諸如ATP、ADP、UTP及UDP之胞外面向催化位點(Junger等人，(2011) Nat. Rev. Immunol. 11:201-212)。代表性人類NTPDase1蛋白序列係提供於UniProtKB條目「P49961 (ENTP1_HUMAN)」中，及酶之代表性人類編碼序列係提供於基因庫登錄號S73813中。細胞周圍腺苷可藉由結合各種腺苷受體調節免疫細胞中之促炎或促抑制信號(Ernst等人，(2010) J. Immunol. 185:1993-1998；Antonioli等人，(2013) Trends Mol. Med. 19:355-367；Parodi等人，(2013) Cancer Immunol. Immunother. 62:851-862；Boer等人，(2013) Eur. J. Immunol. 43:1925-1932；Xu等人，(2013) Neuro-Oncol. 15:1160-1172；美國專利2013/0123345)。例如，腺苷結合至由淋巴細胞表現之A2A受體，引起胞內cAMP之積聚，防止T細胞活化及NK細胞毒性(Zarek等人，(2008) Blood 111:251-259；Lokshin等人，(2006) Canc. Res. 66:7758-7765)。CD39最初係經識別為人類淋巴細胞上之活化標誌物，但隨後已經顯示為調節T細胞之標誌特徵(Kansas等人，(1991) J. Immunol. 146:2235-2244；Deaglio等人，(2007) J. Exp. Med. 204:1257-1265；Borsellino等人，(2007) Blood 110:1225-1232)。Treg中CD39之損失顯著削弱其抑制T細胞活化之能力，此表明CD39之近分泌活性發揮作用以負調節T細胞功能(Deaglio等人，(2007) J. Exp. Med. 204:1257-1265)。一般而言，CD8+ T細胞已經報導為CD39– (Kansas等人，(1991) J. Immunol. 146:2235-2244；Moncrieffe等人，(2010) J. Immunol. 185:134-143；Pulte等人，(2011) Clin. Lymph. Myeloma Leuk. 11:367-372；Boer等人，(2013) Eur. J. Immunol. 43:1925-1932)。然而，最近在腫瘤及慢性病毒感染(例如HCV及HIV及諸如SARS-COV2 (COVID-19)之冠狀病毒科)之情況中已注意在耗竭之T細胞上此標誌物之上調(Canale等人，(2017) Cancer Res. 78(1):115-28；Gupta等人，(2015) PLoS Pathog. 11(10):e1005177；Mathew等人，(2020) Science 10.1126/science.abc8511)。
CD39蛋白之結構-功能關係為此項技術中熟知(例如回顧Antonioli等人，(2013) Trends Mol. Med. 19:355-367；Wang及Guidotti (1996) J. Biol. Chem. 271:9898-9901；Kaczmarek等人，(1996) J. Biol. Chem. 271:33116-33122)。例如，人類CD39係約500個胺基酸蛋白，其具有約七個潛在N-連接之糖基化位點、十一個Cys殘基及兩個跨膜區(Maliszewski等人，(1994) J. Immunol. 153:3574-3583)，該兩個跨膜區之組織形式為兩個跨膜域、包含N端及C端片段之小細胞質域，及由五個高度保守域構成之大胞外疏水域，五個高度保守域稱為三磷酸腺苷雙磷酸酶保守區(ACR) 1至5，其等為酶之分解代謝活性所需(Heine等人，(2001) Eur. J. Biochem. 268:364-373)。ACR 1及ACR 5之胺基酸序列含有磷酸鹽結合基序(DXG)，其對磷酸鹽裂解期間穩定酶與其核苷酸受質間之相互作用而言係重要的。另外，酶活性亦需兩個ACR殘基，ACR 3中之Glu 174及ACR 4之Ser 218 (Heine等人，(2001) Eur. J. Biochem. 268:364-373；Smith等人，(1998) Biochim. Biophys. Acta 1386:65-78)。倘若細胞表面表現，則CD39變為催化活性(Smith等人，(1998) Biochim. Biophys. Acta 1386:65-78)。
代表性人類CD39 cDNA及蛋白序列為此項技術中熟知且可自美國國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得。例如，已知至少七個人類CD39轉錄本變體編碼六個不同人類CD39同功型。人類CD39同功型1可在登錄號NM_001776.5及NP_001767.3下獲得。轉錄本變體表示最長轉錄本及編碼同功型1。相較於轉錄本變體1，可在登錄號NM_001098175.1及NP_001091645.1下獲得之人類CD39同功型2使用替代之5'外顯子，其導致不同5'非轉譯區(UTR)並在替代之起始密碼子處引起轉譯起始，導致更長且不同之N端。相較於轉錄本變體1，可在登錄號NM_001164178.1及NP_001157650.1下獲得之人類CD39同功型3使用替代之5'外顯子，其導致不同5'UTR並在替代之起始密碼子處引起轉譯起始，導致更長且不同之N端。相較於導致更短同功型之轉錄本變體1，可在登錄號NM_001164179.1及NP_001157651.1下獲得之人類CD39同功型4使用替代之框內剪接位點。相對於導致更短同功型之轉錄本變體1，可在登錄號NM_001164181.1及NP_001157653.1下獲得之人類CD39同功型5在5’區中使用替代之外顯子，在下游起始密碼子處導致不同5’ UTR及轉譯起始。相對於導致更短同功型之轉錄本變體1，可在登錄號NM_001164182.1及NP_001157654.1獲得之人類CD39同功型6缺乏替代之外顯子，在下游起始密碼子處導致不同5’ UTR並引起轉譯起始。相對於導致更短同功型之轉錄本變體1，可在登錄號NM_001164183.1及NP_001157655.1下獲得之亦由另一轉錄本變體編碼之人類CD39同功型6缺乏兩個替代之內部外顯子，在下游起始密碼子處導致不同5’ UTR並引起轉譯起始。
除人類外之有機體中CD39異種同源物之核酸及多肽序列係熟知的且包括(例如)小鼠CD39 (NM_009848.3及NP_033978.1)、大鼠CD39 (NM_022587.1及NP_072109.1)、奶牛CD39 (NM_174536.2及NP_776961.1)、青蛙CD39 (NM_001006795.1及NP_001006796.1)及斑馬魚CD39 (NM_001003545.1及NP_001003545.1)。
CD39之廣泛糖基化係與其細胞表面表現及活性相關聯，使得糖基化殘基之刪除或不可糖基化殘基之突變導致顯著降低之CD39活性(參見，例如，大鼠CD39之N端之可糖基化殘基73、中間之殘基333，及/或殘基429及/或C端之殘基458或其異種同源物中之相應殘基之刪除或突變；Wu等人，(2005) Mol. Biol. Cell. 16:1661-1672)。同樣，ACR 1至5中之任何一者或多者之三磷酸腺苷雙磷酸酶保守區(ACR)中之保守殘基之突變引起CD39活性之降低(Schulte am Esch等人，(1999) Biochem. 38:2248-2258；Yang等人，(2001) Biochem. 40:3943-4940；Wang及Guidotti (1998) J. Biol. Chem. 273:11392-11399)。
CD39活性之調節(例如降低)可以許多方式量測(例如根據本文描述之量測，包括使用對照、比率、與基線之比較及類似物)。例如，相較於此外核苷酸酶在測試藥劑之存在下之水平，CD39活性調節劑可降低該外核苷酸酶之催化活性或整體CD39活性。在一項實施例中，CD39活性係藉由分析樣本中腺苷之濃度測定。該濃度可隨時間評估。在另一實施例中，在測試樣本中添加ATP並測定或評估剩餘之ATP、AMP或腺苷之濃度。在此內文中之調節(諸如降低)可意謂1%、5%、10%＞、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、120%、150%、200%、500%、1000%或更多之降低。在一實施例中，該增加係隨時間偵測。
「CD39抗體」 (或者「抗CD39抗體」)係指選擇性結合至NTPDase1蛋白之一或多個抗原決定基之抗體，及包括單互補位抗體、雙互補位抗體及其他多互補位形式抗體。
a.抗體及其他多肽 如本文使用之術語「抗體」係指通過至少一個抗原結合位點識別並特異性結合標靶(諸如蛋白質、多肽、肽、糖、多核苷酸、脂質或前述中之任何一者之組合)之免疫球蛋白分子，其中該抗原結合位點係通常於該免疫球蛋白分子之可變區內。如本文使用，該術語包含完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體(前提條件為彼等片段已經格式化以包括Fc或其他FcγRIII結合域)、多特異性抗體、雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原結合位點之融合蛋白(其經格式化以包括Fc或其他FcγRIII結合域)，及包含抗原結合位點之任何其他經修飾之免疫球蛋白分子，只要該等抗體顯示所需之生物活性。
在本發明之內文中，「抗體介導之靶胞吞」係指抗體介導自CD45+免疫細胞表面消除CD39，而CD45+免疫細胞之數量無實質性減少，即通過除誘導CD45+細胞死亡外之過程。
如本文使用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指保留特異性結合至抗原(例如人類CD39)之能力之抗體之一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段進行。術語抗體(例如本文描述之抗CD39抗體)之「抗原結合部分」內包含之結合片段之實例包括(i) Fab片段，由VL 、VH 、CL及CH1域構成之單價片段；(ii) F(ab')2 片段，包含在鉸鏈區由二硫鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH 及CH1域構成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL 及VH 域構成之Fv片段；(v)由VH 域構成之dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546)；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)或(vii)兩個或更多個經分離之CDR之組合，其可視需要由合成連接子連接。此等單鏈抗體亦意欲包含於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等及其他潛在構築體係描述於Chan及Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，並以與完整抗體相同之方式針對效用篩選片段。抗原結合部分可藉由重組DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解產生。
術語抗體之「可變區」係指單獨或組合之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。一般而言，重鏈及輕鏈之可變區各由四個框架區(FR)及三個互補決定區(CDR)(亦稱為「高變區」)構成。各鏈中之CDR係由框架區緊密結合在一起，及與來自另一鏈之CDR一起有助於形成該抗體之抗原結合位點。存在用於確定CDR之至少兩種技術：(1)基於跨物種序列可變性之方法(即，Kabat等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institutes of Health, Bethesda Md.)，及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al Lazikani等人，1997, J. Mol. Biol., 273:927-948)。另外，此等兩種方法之組合有時在此項技術中用於確定CDR。
儘管抗體可為免疫球蛋白之五種主要類別中之任何一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其子類(同型) (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，但基於其等重鏈恆定域之一致性分別稱為α、δ、ε、γ及μ，較佳之CD39抗體係IgG1及IgG3同型，以最有效參與FcγRIII (即，以10-7 或更小之Kd)。
在某些實施例中，抗體係「低岩藻糖基化」及可甚至為「無岩藻糖基化」。「低岩藻糖基化」抗體製劑係指其中小於50%之寡醣鏈含有α-1,6-岩藻糖之抗體製劑。通常，「低岩藻糖基化」抗體製劑中小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%或小於5%或小於1%之寡醣鏈含有α-1,6-岩藻糖。「無岩藻糖基化」抗體之結合至IgG重鏈之CH2域之糖中缺乏α-1,6-岩藻糖。
如本文使用，術語「單株抗體」係指針對針對特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和力之抗體或其中所有抗體針對特定抗原決定基均顯示單一結合特異性及親和力之抗體組合物。通常，此等單株抗體將源自於編碼該抗體之單一細胞或核酸，及將在不故意引入任何序列改變之情況下繁殖。因此，術語「人類單株抗體」係指具有源自於人類種系免疫球蛋白序列之可變及視需要之恆定區之單株抗體。在一項實施例中，人類單株抗體係由雜交瘤產生，例如，藉由將自轉基因或轉染色體非人類動物(例如具有包含人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因之基因體之轉基因小鼠)之B細胞融合至永生化細胞獲得。
如本文使用之術語「人類化抗體」係指非人類(例如鼠科)抗體之形式，該等抗體為特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段，其等含有最小非人類序列。通常，人類化抗體係人類免疫球蛋白，其中CDR之殘基係經來自具有所需特異性、親和力及/或結合力之非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR之殘基置換。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv框架區殘基係經來自非人類物種之抗體中之相應殘基置換。人類化抗體可藉由在Fv框架區中及/或於經置換之非人類殘基內取代另外殘基而經進一步修飾，以改善及最佳化抗體特異性、親和力及/或結合能力。人類化抗體可包含含有所有或大體上所有對應於非人類免疫球蛋白之CDR，而所有或大體上所有框架區為人類免疫球蛋白序列之彼等之可變域。在一些實施例中，該等可變域包含人類免疫球蛋白序列之框架區。在一些實施例中，該等可變域包含人類免疫球蛋白共有序列之框架區。該人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或域之至少一部分(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區或域(Fc)。通常認為人類化抗體不同於嵌合抗體。
如本文使用之術語「人類抗體」係指由人類產生之抗體或使用此項技術中已知的任何技術製得之具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列之抗體。
如本文使用之術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列係源自於兩個或更多個物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈之可變區對應於源自於哺乳動物之一種物種(例如小鼠、大鼠、兔子等)之具有所需之特異性、親和力及/或結合能力之抗體之可變區，而恆定區係與來源於另一物種(通常人類)之抗體中之序列同源，以避免在該物種中引起免疫反應。
「Fc受體」或「FcR」係結合至免疫球蛋白之Fc區之受體。結合至IgG抗體之FcR包含FcγR家族之受體，包括此等受體之對偶基因變體及交替剪接形式。該FcγR家族由三個活化(小鼠中之FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人類中之FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一種抑制劑(FcγRIIB)受體構成。
「FcγRIII結合部分」係當與抗CD39抗體之抗原結合位點結合時可結合至FcγRIII(CD16)並介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之肽、蛋白質、核酸或其他部分。含有IgG1及IgG3同型之CH2及CH3域之重鏈Fc片段係FcγRIII結合部分。
術語「抗原決定基」及「抗原決定位」在本文中可互換使用及係指可經識別並由特定抗體特異性結合之抗原之部分。當抗原為多肽時，抗原決定基可自連續胺基酸及由蛋白質之三級折疊並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之抗原決定基(亦稱為線性抗原決定基)通常在蛋白質變性時保留，而由三級折疊形成之抗原決定基(亦稱為構型抗原決定基)通常在蛋白質變性時失去。抗原決定基通常包括至少3個，及更通常至少5、6、7或8至10個呈不同空間構型之胺基酸。
如本文使用，術語「特異性結合至」或「對…具特異性」係指可量測及可再現之相互作用，諸如標靶與抗體間之結合，此在分子(包括生物分子)之異質群體之存在下確定標靶之存在。例如，特異性結合至標靶(其可為抗原決定基)之抗體係以比其結合至其他標靶更大之親和力、結合性、更容易及/或以更大之持續時間結合此標靶之抗體。在一項實施例中，如(例如)藉由放射免疫分析法(RIA)量測，抗體結合至無關標靶之程度係小於該抗體對標靶之結合之約10%。在某些實施例中，特異性結合至標靶之抗體具有小於或等於1 μM、100 nM、10 nM、1 nM或甚至0.1 nM之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗體特異性結合至蛋白質上抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之蛋白質中係保守的。在另一實施例中，特異性結合可包括但無需排他性結合。
術語「多肽」及「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用及係指任何長度之胺基酸之聚合物。該聚合物可為直鏈或分支鏈的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可由非胺基酸中斷。該術語亦包含已經天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合。該定義內亦包括(例如)含有胺基酸之一或多種類似物(包括(例如)非天然胺基酸)之多肽，及此項技術中已知的其他修飾。應瞭解因為本發明包含之多肽可基於抗體或免疫球蛋白超家族之其他成員，在某些實施例中，該等多肽可作為單鏈或作為相關鏈存在。
在兩種或更多種核酸或多肽之內文中，術語「相同」或百分率「一致性」係指當比較及比對(視需要，引入間隙)以達成最大對應，而不考慮將任何保守胺基酸取代作為序列一致性之一部分時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分率之相同核苷酸或相同胺基酸殘基。百分率一致性可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查量測。可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對之各種演算法及軟體為此項技術中熟知。此等包括(但不限於) BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其變體。在一些實施例中，本發明包含之兩個核酸或多肽係大體上相同的，意謂如使用序列比較演算法或藉由目視檢查量測，當針對最大對應比較及比對時，其等具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，及在一些實施方式中，至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或胺基酸殘基一致性。在一些實施例中，一致性存在於長度為在至少約10個殘基、至少約20個殘基、至少約40至60個殘基、至少約60至80個殘基或其間的任何整數值之胺基酸序列之區上。在一些實施例中，一致性存在於比60至80個殘基更長之區(諸如至少約80至100個殘基)上，及在一些實施例中，序列在比較中之序列之全長上係大體上相同的，諸如靶蛋白或抗體之編碼區。在一些實施例中，一致性存在於長度為至少約10個鹼基、至少約20個鹼基、至少約40至60個鹼基、至少約60至80個鹼基或其間的任何整數值之核苷酸序列之區上。在一些實施例中，一致性存在於比60至80個鹼基更長之區(諸如至少約80至1000個鹼基或更多)上，及在一些實施例中，該等序列在比較中之序列之全長上係大體上相同的，諸如編碼受關注之蛋白質之核苷酸序列。
「保守胺基酸取代」係其中一個胺基酸殘基係經具有類似側鏈之另一胺基酸殘基取代者。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族在此項技術中已經普遍定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。例如，以苯丙胺酸取代酪胺酸係保守取代。一般而言，本發明包含之多肽、可溶性蛋白及/或抗體之序列中之保守取代不消除含有該胺基酸序列之多肽、可溶性蛋白或抗體結合至靶向結合位點。識別不消除結合之胺基酸保守取代之方法為此項技術中熟知。
經「分離」之多肽、可溶性蛋白、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物係呈自然中未發現之形式之多肽、可溶性蛋白、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。經分離之多肽、可溶性蛋白、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括彼等已經純化至其等不再呈自然中發現之形式之程度。在一些實施例中，經分離之多肽、可溶性蛋白、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物為大體上純。
如本文使用之術語「大體上純」係指至少50%純(即，不含污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純或至少99%純之材料。
如本文使用之術語「融合蛋白」或「融合多肽」係指由包含至少兩個基因之核苷酸序列之核酸分子表現之雜合蛋白。
如本文使用之術語「連接子」或「連接子區」係指插入於第一多肽(例如抗CD39抗體)與第二多肽(例如Fc或其他FcγRIII結合部分；scFV、Vhh域或類似物，其結合不同蛋白質以產生維持針對CD39之二價之雙特異性抗體形式)間之連接子。在一些實施例中，該連接子為肽連接子。連接子不應不利影響該等多肽之表現、分泌或生物活性。較佳地，連接子不為抗原性的且不引起免疫反應。
b.核酸 術語「多核苷酸」及「核酸」及「核酸分子」在本文中可互換使用及係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其等類似物，或可由DNA或RNA聚合酶併入聚合物內之任何受質。
如本文使用，術語「核酸分子編碼」、「DNA序列編碼」及「DNA編碼」係指核苷酸沿脫氧核糖核酸脫氧核糖核苷酸股之順序或序列。此等脫氧核糖核苷酸之順序決定胺基酸沿多肽(蛋白質)鏈之順序。因此，核酸序列編碼該胺基酸序列。
當參考核苷酸序列使用時，如本文使用之術語「序列」，該術語語法及其他形式可包含DNA或RNA，且可為單股或雙股。核酸序列可經突變。
如本文使用之術語「載體」意謂構築體，其可在宿主細胞中遞送及通常表現受關註之一或多個基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏接質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體，及囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體。
如本文使用，術語「轉染」係指外源核酸進入真核細胞內。轉染可藉由此項技術中已知的各種方法達成，包括磷酸鈣-DNA共沈澱、DEAE-右旋糖酐介導轉染、聚乙烯介導轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、逆轉錄病毒感染及基因槍技術(基因槍)。
如本文使用之術語「載體」係包含經分離之核酸之經分離之核酸，其可用於將組合物遞送至細胞之內部。此項技術中已知許多載體，包括(但不限於)線性多核苷酸、與離子或兩親化合物締合之多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製之質體或病毒。該術語亦應解釋為包括促進核酸轉移至非質體及非病毒化合物(例如聚離胺酸化合物、脂質體及類似物)之細胞內。病毒載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體及類似物。
如本文使用，術語「表現載體」係指包含重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包含待表現之可操作地連接之控制序列及核苷酸序列。該表現載體包含足夠用於表現之順式作用之元件(順式作用元件)；用於表現之其他表現元件可由宿主細胞或活體外表現系統提供。表現載體包括此項技術中已知的所有載體，諸如黏接質體、質體(例如裸露或包含在脂質體中)及病毒(例如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文使用，術語「可操作地連接」係指將調節序列與異源核酸序列間之功能鍵聯連接至連接件導致後者之表現。例如，當第一核酸序列及第二核酸序列係功能關係時，該第一核酸序列與該第二核酸序列間係可操作地連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子係可操作地連接至編碼序列。通常，可操作地連接之DNA定序係連續的，且視需要，在相同閱讀框中加入兩個蛋白質編碼區。
如本文使用，術語「啟動子」係定義為多核苷酸序列之細胞特異性轉錄之合成機制所需之合成機制所識別或引入之啟動子DNA序列。
如本文使用之術語「組成性表現」係指全部在生理條件下經表現。
如本文使用之術語「誘導型表現」係指在某些病症下之表現，該等病症諸如當T細胞抗原結合時發生。如何熟習例行性「誘導表現」。
術語「電穿孔」係指使用跨膜電場脈衝在生物膜中誘導微觀途徑(孔)。其存在容許生物分子(諸如質體或其他寡核苷酸)自細胞膜之一側穿過至另一側。
c.檢查點抑制劑、共刺激激動劑、先天免疫誘導劑及化學治療劑 「檢查點分子」係指由組織及/或免疫細胞表現並以取決於檢查點分子之表現程度之方式降低免疫反應之效用的蛋白質。當此等蛋白質係經阻斷時，免疫系統之「剎車」係經釋放，及例如，T細胞可更有效殺死癌細胞。T細胞或癌細胞上發現之檢查點蛋白質之實例包括PD-1/PD-L1及CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT及Siglec-15。
「檢查點抑制劑」係指逆轉來自檢查點分子之免疫抑制傳訊之藥物實體。
「共刺激分子」係指免疫細胞諸如T細胞同源結合配偶體，其特異性結合至共刺激配體，藉此介導共刺激，諸如(但不限於)增殖。共刺激分子係除促進有效免疫反應之抗原受體或配體外之細胞表面分子。共刺激分子包括(但不限於) MHCI分子、BTLA受體及鐸配體，及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。共刺激分子之實例包括(但不限於)：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (觸覺)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 CD96 (CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB‐A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO‐3)、BLAME (SLAMF8)、SELLPG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP‐76、PAG/Cbp、CD19a及CD83配體。
「共刺激激動劑」係指活化(激動)共刺激分子(諸如共刺激配體將如此)並產生免疫刺激信號或以其他方式增加免疫反應之效能或效用之藥物實體。
「先天免疫誘導劑」係模擬先天免疫反應(包括巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞及類似物之發炎活性之活化及/或抗發炎活性之去活化)之藥劑。先天免疫誘導劑包括CD47-SIRPα軸之抑制劑，諸如結合至CD47或SIRPα並抑制兩種分子之相互作用以促進抗腫瘤巨噬細胞活性之抗體或其他結合部分。先天免疫誘導劑包括CD24‐Siglec‐10軸之抑制劑，諸如結合至CD24或Siglec-10並抑制兩種分子之相互作用以促進抗腫瘤巨噬細胞活性之抗體或其他結合部分。在其他實施例中，該先天免疫活化劑可為NGK2A檢查點抑制劑，其阻斷NK及CD8+細胞之HLA-E驅動抑制。先天免疫性之小分子誘導劑包括諸如STING激動劑、TLR7/8激動劑及RIG-I激動劑之藥劑。
「化學治療劑」係可適用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑之實例包括烷化劑，諸如噻替帕(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美多巴(meturedopa)及烏多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；產乙酸素(尤其泡番荔枝辛(bullatacin)及布來那酮(bullatacinone)；δ-9-四氫大麻酚(地那比諾(dronabinol)、MARINOL)；β-拉帕酮(β‐lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicines)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(包括合成類似物拓撲替康(HYCAMTIN)、CPT-11 (伊立替康(irinotecan)、CAMPTOSAR、乙醯基喜樹鹼、莨菪亭(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin)；培美曲塞(pemetrexed)；胼胝質抑素(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻黴素(cryptophycin) (尤其隱藻黴素1及隱藻黴素8)；朵拉司他汀(dolastatin)；杜卡黴素(duocarmycin) (包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；潘克拉汀(pancratistatin)；TLK-286；CDP323、經口α-4整合素抑制劑；肉質網囊素(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、鹽酸甲氧乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法崙(melphalan)、新恩比星(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及拉尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔類抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1 (參見，例如Nicolaou等人，Angew. Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183‐186 (1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A (dynemicin A)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；及新卡他汀髮色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔類抗生素髮色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、卡米黴素(carminomycin)、嗜碳菌素(carzinophilin)、染色體黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮雜-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin) (包括ADRIAMYCIN、嗎啉基-阿黴素、氰基嗎啉基-阿黴素、2-吡咯啉-阿黴素、阿黴素HCl脂質體注射液(DOXIL)及脫氧阿黴素(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、馬賽黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)，諸如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波菲黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎拉黴素(quelamycin)、羅丹黴素(rodorubicin)、鏈黴黑素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR)、替加氟(tegafur) (UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine) (XELODA)、埃博黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)及伊馬替尼(imatinib) (2-苯基胺基嘧啶衍生物)及其他c-Kit抑制劑；抗腎上腺素，諸如胺麩精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲酯(edatraxate)；脫氧胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；亞絲醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elfornithine)；乙酸降鈣素(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；香菇多醣(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；美登木素生物鹼，諸如美登素(maytansine)及安斯菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達莫(mopidanmol)；尼曲林(nitraerine)；噴托他汀(pentostatin)；菲納姆(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2‐乙基肼(2‐ethylhydrazide)；前卡巴嗪(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products Eugene Oreg.)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西咗喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鍵孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''‐三氯三乙胺(2,2',2''‐trichlorotriethylamine)；毛黴菌素(trichothecene) (尤其T-2毒素、維拉卡林A (verracurin A)、漆斑菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine) (ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；呱泊溴烷(pipobroman)；葛胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；噻替帕；類紫杉醇，例如紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇經白蛋白改造之奈米粒子調配物(ABRAXANE)及多西他賽(doxetaxel) (TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine) (VELBAN)；鉑；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine) (ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；亞葉酸(leucovovin)；長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE)；鹽酸米托蒽醌(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluorometlhylornithine) (DMFO)；維甲酸(retinoid)，諸如視黃酸；上文中任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；及上文中之兩者或更多者之組合諸如CHOP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼及潑尼松龍之組合療法之縮寫)及FOLFOX (使用奧沙利鉑(ELOXATIN)與5-FU及亞葉酸(leucovovin)之組合之治療方案之縮寫)。
此定義中亦包括抗激素藥，其發揮作用以調節、減少、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素之效應，及通常係以全身或全身治療之形式。其等本身可為激素。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen) (包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene) (FARESTON)；抗孕激素；雌激素受體下調劑(ERD)；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant) (FASLODEX)；發揮作用以抑制或關閉卵巢之藥劑，例如白胺酸釋放激素(LHRH)激動劑，諸如乙酸亮丙瑞林(LUPRON及ELIGARD)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布塞林(buserelin acetate)及雷公藤甲素(tripterelin)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制酶芳香化酶之芳香化酶抑制劑，其調節腎上腺中雌激素產生，諸如，例如，4(5)-咪唑、胺麩精、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE)，依西美坦(exemestane) (AROMASIN)、甲福司汀(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole) (RIVISOR)、來曲唑(letrozole) (FEMARA)及阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX)。另外，化學治療藥之此定義包括雙膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鹽(DIDROCAL)、NE‐58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(ZOMETA)、阿崙膦酸鹽(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(AREDIA)、替魯膦酸鹽(SKELID)或利塞膦酸鹽(ACTONEL)；及曲沙他濱(troxacitabine) (1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其彼等抑制涉及細胞增殖之傳訊途徑中之基因表現者，諸如，例如，PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因療法疫苗，諸如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN)；抗雌激素，諸如氟維司群；套組抑制劑，諸如伊馬替尼或EXEL-0862 (酪胺酸激酶抑制劑)；EGFR抑制劑，諸如埃羅替尼(erlotinib)或西妥昔單抗(cetuximab)；抗VEGF抑制劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab)；阿裡諾替康(arinotecan)；rmRH (例如ABARELIX)；拉帕替尼(lapatinib)及二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate) (ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；17AAG (熱休克蛋白(Hsp) 90毒物之格爾德黴素(geldanamycin)衍生物)及上文中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
如本文使用，術語「細胞介素」一般係指由一個細胞群釋放之蛋白質，其作為細胞間介體作用於另一細胞上或對產生該等蛋白質之細胞具有自分泌作用。此等細胞介素之實例包括淋巴因子、單核因子；介白素(「IL」)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL10 、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29 (諸如IL-23)、IL-31，包括PROLEUKIN rIL-2；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-α、TGF-β1-3；及其他多肽因子，包括白血病抑制因子(「LIF」)、睫狀神經營養蛋白(「CNTF」)、CNTF樣細胞介素(「CLC」)、心肌營養蛋白(「CT」)及套組配體(「KL」)。
如本文使用，術語「趨化介素」係指具有選擇性誘導白血球之趨化性及活化之能力之可溶性因子(諸如細胞介素)。其等亦觸發血管生成、發炎、傷口癒合及腫瘤發生之過程。趨化介素之實例包括IL-8，鼠科角質形成細胞趨化介素(KC)之人類同源物。
d.治療 在免疫功能障礙之內文中，術語「功能障礙」係指對抗原刺激之免疫反應降低之狀態。該術語包括其中可發生抗原識別之耗竭及/或無反應之常見元件，但接著發生免疫反應對控制感染或腫瘤生長無效。
如本文使用，「功能障礙」亦包括難治性或對抗原識別無反應，具體言之，將抗原識別轉化為下游T細胞效應功能，諸如增殖、細胞介素產生(例如IL-2)及/或靶細胞殺死之能力受損。
術語「無反應」係指由藉由T細胞受體遞送不完整或不足之信號(例如在缺乏ras活化之情況下，胞內Ca+2 之增加)產生之對抗原刺激無反應之狀態。在缺乏共刺激之情況下，抗原刺激亦導致T細胞無反應，導致即使在共刺激之情況下，細胞變得難以由抗原隨後活化。無反應狀態可通常由介白素‐2之存在推翻。無反應T細胞未經歷純系擴增及/或獲取效應功能。
術語「耗竭」係指T細胞耗竭，是由於在許多慢性感染及癌症期間發生之持續TCR傳訊引起之T細胞功能障礙之狀態。其與無反應之區別在於其非藉由不完整或不足之傳訊引起，而由持續之傳訊引起。將其定義為較差之效應功能、抑制受體之持續表現及不同於功能效應物或記憶T細胞之轉錄狀態。耗竭阻止感染及腫瘤之最佳化控制。
「增強T細胞功能」意謂誘導、引起或刺激T細胞以具有持續或放大之生物功能，或更新或再活化耗竭或非活性之T細胞。增強T細胞功能之實例包括：相對於干預前之此等程度，來自CD8+ T細胞之γ-干擾素之增加之分泌、增加之增殖、增加之抗原反應性(例如病毒、病原體或腫瘤清除率)。在一項實施例中，增強之程度係至少50%，或者60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%。量測此增強之方式係一般技術者已知。
「T細胞功能障礙失調症」係特徵在於對抗原刺激之反應性降低之T細胞之失調症或病症。在一特定實施例中，T細胞功能障礙失調症係與CD39之不適當增加之程度特別相關聯之失調症。在另一實施例中，T細胞功能障礙失調症係其中T細胞無反應或分泌細胞介素、增殖或執行溶細胞活性之能力降低之失調症。在一特定態樣中，降低之反應性導致表現免疫原之病原體或腫瘤之無效控制。特徵在於T細胞功能障礙之T細胞功能障礙失調症之實例包括未解決之急性感染、慢性感染及腫瘤免疫性。
「腫瘤免疫性」係指其中腫瘤逃避免疫識別及清除之過程。因此，作為一治療概念，當減弱此逃避時，腫瘤免疫性係經「治療」，及腫瘤係由免疫系統識別及攻擊。腫瘤識別之實例包括腫瘤結合、腫瘤縮小及腫瘤清除。
「持續反應」係指在停止治療後減少腫瘤生長之持續效應。例如，相較於投與階段起始時之尺寸，腫瘤尺寸可保持相同或更小。在一些實施例中，持續反應具有至少與治療持續時間相同之持續時間，治療持續時間之至少1.5x、2.0x、2.5x或3.0倍長度。
如本文使用之術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中之生理病症，其中細胞之群體之特徵在於失控之細胞生長。癌症之實例包括(但不限於)癌、母細胞瘤、肉瘤及血液系統癌症，諸如淋巴瘤及白血病。
如本文使用之術語「腫瘤」及「贅生物」係指由過度之細胞生長或增殖引起之組織之任何團塊，良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括癌前病變。腫瘤生長一般係失控及漸進的，不誘導或抑制正常細胞之增殖。腫瘤可影響各種細胞、組織或器官，包括(但不限於)選自膀胱、骨骼、大腦、乳房、軟骨、神經膠質細胞、食道、輸卵管、膽囊、心臟、腸、腎、肝、肺、淋巴結、神經組織、卵巢、胰、前列腺、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、氣管、尿道、輸尿管、尿道、子宮、陰道器官或組織或相應之細胞。腫瘤包括癌症，諸如肉瘤、癌、漿細胞瘤或(惡性漿細胞)。本發明包含之腫瘤可包括(但不限於)白血病(例如急性白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓樣白血病、急性髓樣白血病、急性早幼粒細胞性白血病、急性髓樣單核細胞白血病、急性單核細胞白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性髓樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多症)、淋巴瘤(霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金病)、原發性巨球蛋白血症、重鏈疾病及實體腫瘤，諸如肉瘤癌(例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管內皮內皮瘤肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumora)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、癌、支氣管癌、髓樣癌、腎細胞癌、肝癌、尼羅河導管癌(Nile duct carcinoma)、絨毛膜癌、精原細胞腫瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤(Wilms' tumor)、宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤)、食管癌、膽囊癌、腎癌、多大性骨髓瘤。較佳地，「腫瘤」包括(但不限於)：胰癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、前列腺癌、結腸癌、乳癌、淋巴瘤、膽囊癌、腎癌、白血病、多發性骨髓瘤、卵巢癌、宮頸癌及神經膠質瘤。
如本文使用之術語「轉移」係指癌症自身體之起源位點擴散或轉移至身體之其他區並在新位置發展類似癌性病變之過程。「轉移性」或「轉移」細胞係失去與相鄰細胞之黏附性接觸之細胞並經由血流或淋巴自疾病之原發位點遷移以侵入相鄰身體結構者。
術語「癌細胞」及「腫瘤細胞」係指源自於癌症或腫瘤或癌前病變之細胞之總群體，包括非致瘤細胞，其等包括大部分之癌細胞群體，及致瘤幹細胞(癌症幹細胞)。如本文使用，術語「癌細胞」或「腫瘤細胞」在僅係指缺乏更新及分化能力之彼等細胞時由術語「非致瘤」修飾以將彼等腫瘤細胞與癌症幹細胞區分開。
如本文使用之術語「有效量」係指提供治療或預防益處之量。
如本文使用，「完全反應」或「CR」係指所有標靶病變之消失；「部分反應」或「PR」係指標靶病變之最長直徑(SLD)之總和降低至少30%，以基線SLD為參考；及「穩定疾病」或「SD」既非指標靶病變足夠縮小至符合PR標準，亦非足夠增加至符合PD，以自治療起始之最小SLD為參考。
如本文使用，「漸進性疾病」或「PD」係指標靶病變之SLD增加至少20%，以自治療起始或存在一或多個新病變記錄之最小SLD為參考。
如本文使用，「無進展存活期」 (PFS)係指在治療期間及之後之時間長度，在此期間治療中之疾病(諸如癌症)未惡化。無進展存活期可包括病患已經歷完全反應或部分反應之時間量，及病患已經歷穩定疾病之時間量。
如本文使用，「整體反應率」(ORR)係指完全反應(CR)率及部分反應(PR)率之總和。
如本文使用，「整體存活率」係指在特定時間段後一組中可能存活之個體之百分率。
如本文使用之術語「治療」係指個體嘗試改變藉由細胞干預引起之臨床疾病之過程或治療，可為臨床病理之預防性干預過程。包括(但不限於)預防疾病之發生或複發、症狀之減輕、減少任何疾病之直接或間接病理學後果、預防轉移、減緩疾病進展之速率、疾病之改善或緩解或經改善之預後之治療。
術語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、囓齒動物及類似物，其係特定治療之受體。通常，關於人類個體，術語「個體」及「病患」在本文中可互換使用。
如本文使用之術語「激動劑」及「激動」係指或描述可直接或間接大體上誘導、活化、促進、增加或增強標靶及/或途徑之生物活性之治療部分。本文使用術語「激動劑」以包括部分或完全誘導、活化、促進、增加或增強蛋白質或受關注之其他標靶之活性之任何藥劑。
如本文使用之術語「拮抗劑」及「拮抗」係指或描述可直接或間接部分或完全阻斷、抑制、減少或中和標靶及/或途徑之生物活性之治療部分。本文使用術語「拮抗劑」以包括部分或完全阻斷、抑制、降低或中和蛋白質或受關注之其他標靶之活性之任何藥劑。
如本文使用之術語「調節」及「調整」係指生物活性之變化或改變。調節包括(但不限於)刺激活性或抑制活性。調節可為活性增加或活性降低、結合特徵之變化，或與蛋白質、途徑、系統或受關注之其他生物標靶之活性相關聯之生物、功能或免疫性質之任何其他變化。
如本文使用之術語「免疫反應」包括來自先天免疫系統及適應性免疫系統之反應。其包括細胞介導及/或體液免疫反應。其包括T細胞及B細胞反應，及來自免疫系統之其他細胞諸如自然殺手(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞等之反應。
術語「醫藥上可接受」係指由聯邦政府或州政府之監管機構批准或可批准或美國藥典或其他公認之藥典列舉用於動物(包括人類)中之物質。
術語「醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑」或「可接受之醫藥載劑」係指可連同至少一種本發明之藥劑一起向個體投與且不破壞其醫藥活性且當以足以遞送治療效應之量投與時為無毒之賦形劑、載劑或佐劑。一般而言，熟習此項技術者及美國FDA認為醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑係任何調配物之非活性成分。
術語「有效量」或「治療有效量」或「治療效應」係指有效「治療」個體(諸如哺乳動物)之疾病或失調症之抗CD39抗體之量。在癌症或腫瘤之情況下，治療有效量之抗CD39抗體具有治療效應，及因此可增強免疫反應、增強抗腫瘤反應、增加免疫細胞之溶細胞活性、增加由免疫細胞殺死腫瘤、減少腫瘤細胞之數量；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；減少癌症幹細胞之數量或頻率；減小腫瘤尺寸；減少癌細胞群體；抑制或阻止癌細胞浸潤至周圍器官內，包括，例如，癌症擴散至軟組織及骨內；抑制及阻止腫瘤或癌細胞轉移；抑制及阻止腫瘤或癌細胞生長；在一定程度上緩解與癌症相關聯之症狀中之一或多者；降低發病率及死亡率；改善生活品質；或此等效應之組合。
術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「以治療(to treat)」或「減輕(alleviating)」或「以減輕(alleviate)」均指(1)治癒、減緩、減少經診斷之病理病症或失調症及/或中止經診斷之病理病症或失調症之進展之治療措施，及(2)預防或減緩靶向病理病症或失調症之發展之預防或防止措施。因此，彼等需治療者包括彼等已患有該失調症者；彼等易患該失調症者；及彼等要預防疾病之人類。在癌症或腫瘤之情況下，若病患顯示下列中之一或多者，則該個體係根據本發明包含之方法成功「治療」：增加之免疫反應、增加之抗腫瘤反應、增加之免疫細胞之溶細胞活性、增加之由免疫細胞殺死腫瘤細胞、癌細胞之數量之減少或癌細胞之完全不存在、腫瘤尺寸之減小；癌細胞浸潤至周圍器官內之抑制或不存在，包括癌細胞擴散至軟組織及骨內；腫瘤或癌細胞轉移之抑制或不存在；癌症生長之抑制或不存在；與特定癌症相關聯之一或多種症狀之緩解；降低之發病率及死亡率；生活品質之改善；致瘤性之降低；癌症幹細胞之數量或頻率之減少；或效應之一些組合。
e.雜項 應瞭解每當本文以語言「包含」描述實施例時，另外亦提供依據「由…組成」及/或「基本上由…組成」描述之類似實施例。亦應瞭解每當本文以語言「基本上由…組成」描述實施例時，另外亦提供根據「由……組成」描述之類似實施例。
如本文使用，提及「約」或「近似」值或參數包括(及描述)針對該值或參數之實施例。例如，提及「約X」之描述包括「X」之描述。
如諸如本文之「A及/或B」之片語中使用之術語「及/或」意欲包括A及B；A或B；A (單獨)；及B (單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中使用之術語「及/或」意欲包含下列實施例中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
III.抗 CD39 抗體 a.單株抗體 抗CD39抗體可為單株抗體。單株抗體可使用雜交瘤方法製備，諸如彼等由Kohler及Milstein, Nature, 256:495 (1975)描述者。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他適當之宿主動物係通常用免疫劑免疫，以引起產生或可產生將特異性結合至該免疫劑之抗體之淋巴細胞。或者，淋巴細胞可經活體外免疫。
免疫劑將通常包括CD39多肽或其融合蛋白。一般而言，若需人類起源之細胞，則使用外周血淋巴細胞(「PBL」)，或若需非人類哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然後該等淋巴細胞係使用合適之融合劑(諸如聚乙二醇)與永生化細胞融合，以形成雜交瘤細胞[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986)，第59至103頁]。永生化細胞系通常為經轉形之哺乳動物細胞，尤其囓齒動物、牛及人類起源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。可在合適之培養基中培養雜交瘤細胞，該培養基較佳含有抑制未融合、永生化細胞之生長或存活之一或多種物質。例如，若親代細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(「HAT培養基」)，該等物質阻止HGPRT缺陷細胞之生長。
較佳之永生化細胞系係彼等有效融合，由選擇之產生抗體之細胞支持抗體之穩定之高表現程度，及對培養基(諸如HAT培養基)敏感者。更佳之永生化細胞系係鼠科骨髓瘤系，其可(例如)自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.及American Type Culture Collection, Manassas, Va獲得。人類骨髓瘤及小鼠人類異源骨髓瘤細胞系亦已描述用於產生人類單株抗體[Kozbor, J. Immunol., 133:3001  (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)，第51至63頁]。
然後，可分析其中培養雜交瘤細胞之培養基中抗多肽之單株抗體之存在。較佳地，由雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定。此等技術及分析為此項技術中已知。該單株抗體之結合親和力可(例如)藉由Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)測定。
在識別所需雜交瘤細胞後，純系可藉由限制稀釋程序子選殖，並藉由標準方法生長[Goding，同上]。適用於此目的之培養基包括(例如)杜爾貝科改良伊格爾培養基及RPMI-1640培養基。或者，雜交瘤細胞可在哺乳動物中作為腹水活體內生長。
由子純系分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如，例如，蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析術、凝膠電泳、透析或親和層析術自培養基或腹水分離或純化。
單株抗體亦可藉由重組DNA方法製造，諸如彼等美國專利第4,816,567號中描述者。編碼本發明包含之單株抗體之DNA可使用習知程序容易分離及定序(例如藉由使用可特異性結合至編碼鼠科抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。本發明包含之雜交瘤細胞充當此DNA之較佳來源。一經分離，可將該DNA放置於表現載體中，然後轉染至宿主細胞諸如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另外產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞內，以獲得單株抗體於重組宿主細胞中之合成。DNA亦可(例如)藉由以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源鼠科序列[美國專利第4,816,567號；Morrison等人，同上]，或藉由共價結合至非免疫球蛋白多肽之編碼序列之所有或部分之免疫球蛋白編碼序列修飾。此非免疫球蛋白多肽可取代本發明包含之抗體之恆定域，或可取代本發明包含之抗體之一個抗原組合位點之可變域以產生嵌合二價抗體。
b.人類及人類化抗體 本發明包含之抗CD39抗體可進一步包含人類化抗體或人類抗體。非人類(諸如鼠科)抗體之人類化形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或抗體之其他抗原結合子序列)，其等含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之互補決定區(CDR)之殘基係經來自非人類物種(供體抗體)諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠或兔之CDR之殘基置換。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv框架殘基係經相應之非人類殘基置換。人類化抗體亦可包含在受體抗體或經輸入之CDR或框架序列中均未發現之殘基。一般而言，人類化抗體將包含至少一個，及通常兩個可變域中之大體上所有，其中該等CDR區中之所有或大體上所有對應於彼等非人類免疫球蛋白者，及該等FR區中之所有或大體上所有係彼等人類免疫球蛋白共有序列者。該人類化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之恆定區[Jones等人，Nature, 321:522‐525 (1986)；Riechmann等人，Nature, 332:323‐329 (1988)及Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593‐596 (1992)]。
用於人類化非人類抗體之方法為此項技術中熟知。一般而言，人類化抗體具有非人類來源之一或多個胺基酸殘基引入其中。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其等通常取自「輸入」可變域。人類化可大體上遵循Winter及同事之方法進行[Jones等人，Nature, 321:522‐525 (1986)；Riechmann等人，Nature, 332:323‐327 (1988)；Verhoeyen等人，Science, 239:1534‐1536 (1988)]，藉由以囓齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列。因此，此等「人類化」抗體係嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中大體上小於完整之人類可變域已由來自非人類物種之相應序列取代。在實務中，人類化抗體係通常其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基係由來自囓齒動物抗體中之類似位點之殘基取代之人類抗體。
人類抗體亦可使用此項技術中已知的各種技術產生，包括噬菌體展示庫[Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。Cole等人及Boerner等人之技術亦適用於製備人類單株抗體[(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J. Immunol., 147(1):86‐95 (1991)]。同樣，人類抗體可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉基因動物(例如其中內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活之小鼠)內製得。一經攻擊，即觀測到人類抗體產生，在所有態樣中均與人類中可見者十分相似，包括基因重排、組裝及抗體庫。此方法係描述(例如)於美國專利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016號，及於下列科學公開案：Marks等人，Bio/Technology 10, 779‐783 (1992)；Lonberg等人，Nature 368 856‐859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812‐13 (1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14, 845‐51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65‐93 (1995)中。
亦可使用如上文描述之已知選擇及/或誘變方法使抗體親和力成熟。較佳之親和力成熟之抗體具有比製備該成熟抗體之起始抗體(通常鼠科、人類化或人類)大五倍，更佳10倍，甚至更佳20或30倍之親和力。
c.雙特異性抗體 本文描述之抗CD39抗體包括雙特異性分子。可將抗CD39抗體或其抗原結合部分衍生或連接至另一功能分子，例如，另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體之配體)，以產生結合至至少兩個不同結合位點或靶分子之雙特異性分子。實際上，本文描述之抗體可經衍生或連接至超過一個其他功能分子，以產生結合至超過兩個不同結合位點及/或靶分子之多特異性分子；此等多特異性分子意欲涵蓋如本文使用之術語「雙特異性分子」。為產生本文描述之雙特異性分子，本文描述之抗體可功能性連接(例如由化學偶合、基因融合、非共價結合或其他方式)至一或多個其他結合分子諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，使得產生雙特異性分子。
因此，本文提供包含至少一個對CD39之第一結合特異性及對第二靶抗原決定基之第二結合特異性之雙特異性分子。在本文描述之其中雙特異性分子為多特異性之一實施例中，該分子可進一步包括第三結合特異性。
在某些實施例中，標的雙特異性(或視需要可為多特異性)包括免疫檢查點之一或多個結合域，例如，其等係檢查點抑制劑，諸如PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT及/或Siglec-15。在某些實施例中，該多特異性包括結合T細胞上之檢查點蛋白(尤其與T細胞耗竭相關聯之檢查點諸如LAG-3、TIM-3或TIGIT)之結合域。在某些實施例中，該多特異性結合至CD39及與檢查點相關聯之一或多個其他T細胞，及導致表現CD39及其結合之其他檢查點蛋白中之各者或兩者之細胞之抗體依賴性細胞毒性。
在某些實施例中，標的雙特異性(或視需要可為多特異性)包括免疫共刺激受體之一或多個結合域，例如，其等係共刺激激動劑(活化劑)，諸如MHCI分子、BTLA受體及鐸配體，及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB (CD137)之激動劑。多特異性中可包括之共刺激分子之實例包括(但不限於)：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺)、CEACAM1、1CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB‐A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELLPG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及CD83配體。
在某些實施例中，標的雙特異性(或視需要可為多特異性)包括充當先天免疫活化劑之一或多個結合域，諸如CD47、SIRPα、CD24、Siglec-10或NKG2A之結合部分。
在一項實施例中，本文描述之雙特異性分子包含至少一個抗體或其抗體片段(包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈(scFv)構築體。
雙特異性分子對其等特異性標靶之結合可使用本領域公認之方法諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點法分析確認。此等分析中之各者一般藉由採用對受關注之複合物具特異性之經標記之試劑(例如抗體)偵測特別受關注之蛋白質-抗體複合物之存在。
用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現，其中該等兩個重鏈具有不同特異性[Milstein及Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]。因為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分類，此等雜交瘤(四染色體瘤)產生十種不同抗體分子之可能混合物，其中僅一種具有正確之雙特異性結構。該正確分子之純化係通常藉由親和層析術步驟進行。類似程序係揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829及於Traunecker等人，EMBO J., 10:3655-3659 (1991)中。
具有所需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原組合位點)可融合至免疫球蛋白恆定域序列。融合較佳係與免疫球蛋白重鏈恆定域融合，該域包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分。較佳具有含有融合之至少一者中存在之輕鏈結合必需之位點之第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合之DNA及視需要免疫球蛋白輕鏈插入單獨之表現載體內，並共轉染至合適之宿主有機活體內。就產生雙特異性抗體之其他詳細說明而言，參見，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。
根據WO 96/27011中描述之另一方法，一對抗體分子之間之界面可經改造以最大化自重組細胞培養物回收之異二聚體之百分率。較佳之界面包含抗體恆定域之CH3區之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面之一或多個小胺基酸側鏈係經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換。與較大之側鏈相同或類似尺寸之補償「腔」係藉由以較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈，於二級抗體分子之界面上產生。此提供用於增加異二聚體之產率超過其他非所需最終產物(諸如同二聚體)之機制。
雙特異性抗體製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。用於自抗體片段產生雙特異性抗體之技術已描述於參考文獻中。例如，雙特異性抗體可使用化學鍵聯製備。Brennan等人，Science 229:81 (1985)描述其中將完整抗體蛋白水解裂解以產生F(ab')2 片段之程序。此等片段在二硫酚複合劑亞砷酸鈉之存在下還原以穩定鄰位二硫酚並防止分子間二硫鍵形成。然後將產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然後，Fab'-TNB衍生物中之一者係藉由以巰基乙胺還原再轉化為Fab'-硫醇，並與等莫耳量之其他Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。產生之雙特異性抗體可用作用於酶之選擇性固定之藥劑。
Fab'片段可自大腸桿菌直接回收並化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)描述完全人類化雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。各Fab'片段係分別自大腸桿菌分泌，並經活體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。因此形成之雙特異性抗體可結合至過表現ErbB2受體之細胞及正常之人類T細胞，及觸發人類細胞毒性淋巴細胞針對人類乳腫瘤標靶之裂解活性。
各種用於直接自重組細胞培養製備及分離雙特異性抗體片段之技術亦已經描述。例如，雙特異性抗體已使用白胺酸拉鏈產生(Kostelny等人，J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽係由基因融合連接至兩種不同抗體之Fab'部分。抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，及然後再氧化以形成抗體異二聚體。此方法亦可用於產生抗體同二聚體。由Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)描述之「雙功能抗體」技術已提供用於製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含重鏈可變域(VH )藉由一種太短而不容許在相同鏈上兩個域之間配對之連接子連接至輕鏈可變域(VL )。因此，迫使一個片段之VH 及VL 域與另一片段之互補VL 及VH 域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。藉由使用單鏈Fv (sFv)二聚體製造雙特異性抗體片段之另一策略亦已經報導。參見，Gruber等人，J. Immunol. 152:5368 (1994)。
具有超過二價之抗體係經考慮。作為一項非限制性實例，可製備三特異性抗體。參見例如Tutt等人，J. Immunol. 147:60 (1991)。
d.雜結合(Heteroconjugate)抗體 雜結合抗體亦於本發明之範圍內。雜結合抗體包含兩個共價連接之抗體。例如，已提出此等抗體將免疫系統細胞靶向非所需細胞[美國專利第4,676,980號]，及用於治療HIV感染[WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089]。經考慮該等抗體可在活體外使用合成蛋白化學中之已知方法，包括涉及交聯劑者製備。例如，免疫毒素可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵構築。適用於此目的之試劑之實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁醯亞胺酸酯，及該等揭示於例如美國專利第4,676,980號中者。
e.效應功能改造 可合需要修飾本發明所包含抗體之效應功能，以增強例如抗CD39抗體治療癌症之有效性。例如，可將半胱胺酸殘基引入Fc區內，藉此容許在此區中形成鏈間二硫鍵。因此產生之同二聚體抗體可具有經改善之內化能力及/或增強之補體介導細胞殺死及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)及Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)。在某些較佳實施例中，改造之效應功能係抗CD39抗體誘導自免疫細胞FcγRIII結合依賴性移除(諸如藉由抗CD39抗體介導之靶胞吞) CD39，即不藉由細胞殺死消除免疫細胞群體之能力。
具有增強之抗腫瘤活性之同二聚體抗體亦可使用如Wolff等人，Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)中描述之異雙功能交聯劑製備。或者，抗體可經改造以具有雙重Fc區，及可藉此具有增強之CD39胞啃(trogocytosis)能力。參見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)。
f.代表性抗CD39抗體序列 在某些實施例中，抗CD39抗體係完全人類抗體，諸如自人類抗體庫產生。一例示性完全人類抗CD39抗體係純系Ig39-21，重及輕可變域(VH及VL)序列如下提供：
   核酸序列 胺基酸序列
VH域 SEQ ID No. 1 (VH) SEQ ID No. 2 (VH)
VL域 SEQ ID No. 3 (VL) SEQ ID No. 4 (VL)
就Ig39-21純系而言，VH及VL域中之各者之CDR為：
   CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No. 29 SEQ ID No. 30 SEQ ID No. 31
VL SEQ ID No. 32 SEQ ID No. 33 SEQ ID No. 34
利用上文VH及VL域之例示性全長抗體及例示性單鏈抗體(scFV)之序列如下提供：
   核酸序列 胺基酸序列
全長重鏈 SEQ ID No. 35 SEQ ID No. 36
全長輕鏈 SEQ ID No. 37 SEQ ID No. 38
scFV SEQ ID No. 39 SEQ ID No. 40
在一些實施例中，抗CD39抗體或其抗原結合片段包含至少一個重鏈可變域，其與本文描述之VH域序列(諸如SEQ ID No. 2)相同至少60%，及與本文描述之VH域序列(諸如SEQ ID No. 2)甚至更佳相同至少65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%，且可特異性結合人類CD39。
在一些實施例中，抗CD39抗體或其抗原結合片段包含至少一個輕鏈可變域，其與本文描述之VL域序列(諸如SEQ ID No. 4)相同至少60%，及與本文描述之VL域序列(諸如SEQ ID No. 4)甚至更佳相同至少65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%，且可特異性結合人類CD39。
在某些實施例中，抗CD39抗體係包含具有與SEQ ID No. 29、30及31中顯示之VH域之CDR及SEQ ID No. 32、33及34中顯示之相應VL域之CDR相關聯之人類框架序列之VH域之人類化抗體。本文描述之抗CD39抗體之CDR係較佳與本文描述之CDR相同，但可在各CDR上變化1、2或3個胺基酸，只要所得抗體特異性結合人類CD39。
在某些實施例中，抗CD39抗體之重鏈及輕鏈具有可變域，其可由與本文描述之VH及VL域(相應地)編碼序列諸如彼等SEQ ID No. 1 (VH)及SEQ ID No. 3 (VL)中顯示者相同或在嚴格條件(諸如在45℃下6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，及在50至65℃下於0.2xSSC/0.1% SDS中清洗)下雜交之核酸編碼。
在一些實施例中，抗CD39抗體係在兔中產生，及此等抗體之重鏈及輕鏈之可變域係兔序列，而恆定域係人類序列。兔抗CD39抗體之VH及VL域之例示性序列為：
純系 核酸序列 胺基酸序列 CDR序列
9B6 SEQ ID No. 5 (VH) SEQ ID No. 7 (VL) SEQ ID No. 6 (VH) SEQ ID No. 8 (VL) SEQ ID No. 6 (VH) CDRs CDR1: GFSLSAYG CDR2: IYSSGRT CDR3: ARSRAGISSGDGFDS    SEQ ID No. 8 (VL) CDRs CDR1: QNIYSN CDR2: RAS CDR3: QQGFDSSNIDNT
8C11 SEQ ID No. 9 (VH) SEQ ID No. 11 (VL) SEQ ID No. 10 (VH) SEQ ID No. 12 (VL) SEQ ID No. 10 (VH) CDRs CDR1: GFSLSKSI CDR2: IGSSGST CDR3: ARGLLYSGNKS    SEQ ID No. 12 (VL) CDRs CDR1: QSVLLNNQ CDR2: DAS CDR3: LGGYSGNLYA
8D8 SEQ ID No. 13 (VH) SEQ ID No. 15 (VL) SEQ ID No. 14 (VH) SEQ ID No. 16 (VL) SEQ ID No. 14 (VH) CDRs CDR1: GFSLSSYA CDR2: INSYGTT CDR3: ARGDSYGSGVGLGL    SEQ ID No. 16 (VL) CDRs CDR1: QNIYSN CDR2: RAS CDR3: QQGFSSNNVDNT
9C10 SEQ ID No. 17 (VH) SEQ ID No. 19 (VL) SEQ ID No. 18 (VH) SEQ ID No. 20 (VL) SEQ ID No. 18 (VH) CDRs CDR1: GFSLSSYA CDR2: ISSSGST CDR3: ARDRVIYSIGPYYFNL    SEQ ID No. 20 (VL) CDRs CDR1: EIIYSN CDR2: GAS CDR3: QQSFSSNNVGNI
65H5 SEQ ID No. 21 (VH) SEQ ID No. 23 (VL) SEQ ID No. 22 (VH) SEQ ID No. 24 (VL) SEQ ID No. 22 (VH) CDRs CDR1: GFSLSTHA CDR2: TYASGRT CDR3: ARNGADETFYYFDL    SEQ ID No. 24 (VL) CDRs CDR1: QNINTW CDR2: RAS CDR3: QQYDASINIDNA
2G12 SEQ ID No. 25 (VH) SEQ ID No. 27 (VL) SEQ ID No. 26 (VH) SEQ ID No. 28 (VL) SEQ ID No. 26 (VH) CDRs CDR1: GIDLSSNA CDR2: IRNNDIT CDR3: ARGGGSYSIVFWNL    SEQ ID No. 28 (VL) CDRs CDR1: ERIYSN CDR2: YAS CDR3: QQGYSNNNVDNT
48F10 SEQ ID No. 41 (VH) SEQ ID No. 43 (VL) SEQ ID No. 42 (VH) SEQ ID No. 44 (VL) SEQ ID No. 42 (VH) CDRs CDR1: GIDLSNNACDR2: IRSSGSTCDR3: ARGGGSYSIVFWNL    SEQ ID No. 44 (VL) CDRs CDR1: ERIYSNCDR2: YTS CDR3: QQGYSSSNVDNT
在一些實施例中，抗CD39抗體在兔中產生，及然後藉由CDR移植人類化。人類化兔抗CD39抗體之VH及VL域之例示性序列為：
純系 核酸序列 胺基酸序列 CDR序列
人類化8D8 SEQ ID No. 45 (VH) SEQ ID No. 47 (VL) SEQ ID No. 46 (VH) SEQ ID No. 48 (VL) SEQ ID No. 46 (VH) CDRs CDR1: GFSLSSYA CDR2: INSYGTT CDR3: ARGDSYGSGVGLGL    SEQ ID No. 48 (VL) CDRs CDR1: QNIYSN CDR2: RAS CDR3: QQGFSSNNVDNT
人類化8C11 SEQ ID No. 49 (VH) SEQ ID No. 51 (VL) SEQ ID No. 50 (VH) SEQ ID No. 52 (VL) SEQ ID No. 50 (VH) CDRs CDR1: GFSLSKSI CDR2: IGSSGST CDR3: ARGLLYSGNKS SEQ ID No. 52 (VL) CDRs CDR1: QSVLLNNQ CDR2: DAS CDR3: LGGYSGNLYA
人類化9C10 SEQ ID No. 53 (VH) SEQ ID No. 55 (VL) SEQ ID No. 54 (VH) SEQ ID No. 56 (VL) SEQ ID No. 54 (VH) CDRs CDR1: GFSLSSYA CDR2: ISSSGST CDR3: ARDRVIYSIGPYYFNL    SEQ ID No. 56 (VL) CDRs CDR1: EIIYSN CDR2: GAS CDR3: QQSFSSNNVGNI
在一些實施例中，本文提供之抗抗CD39抗體促進：(i)穩定之免疫複合物形成，當與HCC1739BL細胞培育時，其特徵在於24小時後，該免疫複合物損失小於30%，視需要其中該免疫複合物形成係由螢光強度使用經螢光標記之二級抗體偵測；(ii)針對CD39+細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性；(iii) CD45+免疫細胞上之CD39之抗體介導之靶胞吞；(iv)來自腫瘤中腫瘤血管內皮破壞或血管分布網路崩潰之CD39之抗體介導之靶胞吞；(v) (視需要)結合至具有選自圖33中列舉之CD39胺基酸抗原決定基序列之群之序列之CD39抗原決定基(例如結合一或多個線性或構型CD39抗原決定基，諸如選自由以下組成之群：1) IYLTDCMERAR、2) LRMESEELADR、3) RVKGPGISKFV、4) DCMERAREVIPR、5) LTDCMERAREVIPR、6) SLSNYPFDFQGAR、7) CRVKGPGISKF、8) GAYGWITINYLLGKFSQK、9) ILRDPCFHPGYKK及其任何組合，諸如RVKGPGISKFV及DCMERAREVIPR、LTDCMERAREVIPR及SLSNYPFDFQGAR或CRVKGPGISKF、GAYGWITINYLLGKFSQK，及/或ILRDPCFHPGYKK)；及/或(vi) (視需要)以與單株抗體純系A1非競爭性或僅部分競爭性結合至CD39之方式結合至CD39。
根據序列識別編號之上文描述之代表性抗CD39抗體序列對應於下列： SEQ ID No. 1 (純系IG39-21 vH核酸序列)
Figure 02_image001
Figure 02_image003
SEQ ID No. 2 (純系IG39‐21 vH胺基酸序列)
Figure 02_image005
SEQ ID No. 3 (純系IG39‐21 vL域核酸序列)
Figure 02_image007
Figure 02_image009
SEQ ID No. 4 (純系IG39‐21 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image011
SEQ ID No. 5 (純系9B6 vH域核酸序列)
Figure 02_image013
Figure 02_image015
SEQ ID No. 6 (純系9B6 vH域胺基酸序列)
Figure 02_image017
Figure 02_image019
SEQ ID No. 7 (純系9B6 vL域核酸序列)
Figure 02_image021
SEQ ID No. 8 (純系9B6 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image023
Figure 02_image025
SEQ ID No. 9 (純系8C11 vH域核酸序列)
Figure 02_image027
SEQ ID No. 10 (純系8C11 vH域胺基酸序列)
Figure 02_image029
SEQ ID No. 11 (純系8C11 vL域核酸序列)
Figure 02_image031
Figure 02_image033
SEQ ID No. 12 (純系8C11 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image035
SEQ ID No. 13 (純系8D8 vH域核酸序列)
Figure 02_image037
Figure 02_image039
SEQ ID No. 14 (純系8D8 vH域胺基酸序列)
Figure 02_image041
Figure 02_image043
SEQ ID No. 15 (純系8D8 vL域核酸序列)
Figure 02_image045
SEQ ID No. 16 (純系8D8 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image047
Figure 02_image049
SEQ ID No. 17 (純系9C10 vH域核酸序列)
Figure 02_image051
SEQ ID No. 18 (純系9C10 vH域胺基酸序列)
Figure 02_image053
Figure 02_image055
SEQ ID No. 19 (純系9C10 vL域核酸序列)
Figure 02_image057
Figure 02_image059
SEQ ID No. 20 (純系9C10 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image061
SEQ ID No. 21 (純系65H5 vH域核酸序列)
Figure 02_image063
Figure 02_image065
SEQ ID No. 22 (純系65H5 vH域胺基酸序列)
Figure 02_image067
SEQ ID No. 23 (純系65H5 vL域核酸序列)
Figure 02_image069
Figure 02_image071
SEQ ID No. 24 (純系65H5 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image073
Figure 02_image075
SEQ ID No. 25 (純系2G12 vH域核酸序列)
Figure 02_image077
SEQ ID No. 26 (純系2G12 vH域胺基酸序列)
Figure 02_image079
Figure 02_image081
SEQ ID No. 27 (純系2G12 vL域核酸序列)
Figure 02_image083
SEQ ID No. 28 (純系2G12 vL域胺基酸序列)
Figure 02_image085
Figure 02_image087
SEQ ID No. 29 (純系IG39‐21 vH域CDR1胺基酸序列)
Figure 02_image089
SEQ ID No. 30 (純系IG39‐21 vH域CDR2胺基酸序列)
Figure 02_image091
SEQ ID No. 31 (純系IG39‐21 vH域CDR3胺基酸序列)
Figure 02_image093
SEQ ID No. 32 (純系IG39‐21 vL域CDR1胺基酸序列)
Figure 02_image095
SEQ ID No. 33 (純系IG39‐21 vL域CDR2胺基酸序列)
Figure 02_image097
SEQ ID No. 34 (純系IG39‐21 vL域CDR3胺基酸序列)
Figure 02_image099
SEQID No. 35(純系IG39-21全長vH鏈核酸序列)
Figure 02_image101
Figure 02_image103
Figure 02_image105
SEQ ID No. 36 (純系IG39‐21全長vH鏈胺基酸序列)
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
SEQ ID No. 37 (純系IG39‐21全長vL鏈核酸序列)
Figure 02_image113
Figure 02_image115
SEQ ID No. 38 (純系IG39‐21全長vL鏈胺基酸序列)
Figure 02_image117
Figure 02_image119
SEQ ID No. 39 (純系IG39‐21 scFv核酸序列)
Figure 02_image121
Figure 02_image123
SEQ ID No. 40 (純系IG39‐21 scFv胺基酸序列)
Figure 02_image125
Figure 02_image127
SEQ ID No. 41
Figure 02_image129
Figure 02_image131
SEQ ID No. 42
Figure 02_image133
SEQ ID No. 43
Figure 02_image135
Figure 02_image137
SEQ ID No. 44
Figure 02_image139
SEQ ID No. 45
Figure 02_image141
SEQ ID No. 46
Figure 02_image143
Figure 02_image145
SEQ ID No. 47
Figure 02_image147
SEQ ID No. 48
Figure 02_image149
Figure 02_image151
SEQ ID No. 49
Figure 02_image153
SEQ ID No. 50
Figure 02_image155
SEQ ID No. 51
Figure 02_image157
Figure 02_image159
SEQ ID No. 52
Figure 02_image161
SEQ ID No. 53
Figure 02_image163
Figure 02_image165
SEQ ID No. 54
Figure 02_image167
SEQ ID No. 55
Figure 02_image169
Figure 02_image171
SEQ ID No. 56
Figure 02_image173
為用於人類病患中，將需人類化此等抗體，以人類恆定區置換重鏈及輕鏈之恆定區，及以人類抗體框架區置換可變區之框架區。在一些實施例中，抗CD39抗體或其抗原結合片段係兔抗體之人類化形式。
在一些實施例中，抗CD39抗體或其抗原結合片段包含至少一個重鏈變量，其與SEQ ID No. 6、10、14、18、22、26、42、46、50或54相同至少60%，及甚至更佳與SEQ ID No. 6、10、14、18、22、26、42、46、50及54相同至少65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%，且可特異性結合人類CD39。
在一些實施例中，抗CD39抗體或其抗原結合片段包含至少一個輕鏈變量，其與SEQ ID No. 8、12、16、20、24、28、44、48、52或56相同至少60%，及甚至更佳與SEQ ID No. 8、12、16、20、24、28、44、48、52或56相同至少65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%，且可特異性結合人類CD39。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR，例如CDR (或其部分)係自非人類抗體衍生，及FR (或其部分)係自人類抗體序列衍生。人類化抗體視需要亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基係經來自非人類抗體(例如其中衍生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代，例如，以恢復或改善抗體特異性或親和力。
在某些實施例中，抗CD39抗體係人類化抗體，其包含具有與選自SEQ ID No. 6、10、14、18、22、26、42、46、50或54之VH域之CDR，及選自SEQ ID No. 8、12、16、20、24、28、44、48、52或56之相應VL域之CDR相關聯之人類框架序列之VH域。該等CDR係較佳相同的，但可在各CDR上變化1、2或3個胺基酸，只要所得抗體特異性結合人類CD39。
人類化抗體及製造其等之方法係回顧(例如)於Almagro及Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，並進一步描述(例如)於Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5, 821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36:25-34 (2005) (描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR混排」)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (描述FR混排之「定向選擇」方法)中。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(參見，例如，Sims等人，J. Immunol. 151:2296 (1993))；自特定子組之輕鏈或重鏈可變區之人類抗體之共有序列衍生之框架區(參見，例如，Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及Presta等人，J. Immunol., 151:2623 (1993))；人類成熟(經體細胞突變)框架區或人類生殖系框架區(參見，例如，Almagro及Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及自篩選FR庫衍生之框架區(參見，例如，Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，J Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
在某些實施例中，本文提供之抗CD39抗體係人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的各種技術產生。人類抗體係一般描述於van Dijk及van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)中。
例如，人類抗體可藉由向轉基因動物投與免疫原製備，該轉基因動物已經修飾以應抗原性攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座中之所有或一部分，其等置換內源性免疫球蛋白基因座，或其等存在於染色體外或隨機整合至該動物之染色活體內。在此等轉基因小鼠中，該等內源性免疫球蛋白基因座已一般經滅活。為回顧用於自轉基因動物獲得人類抗體之方法，參見Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見，例如，描述XENOMOUSE技術之美國專利第6,075,181及6,150,584號；描述HuMAB技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE技術之美國專利第7,041,870號，及描述VELOCIMOUSE技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號)。來自由此等類動物產生之完整抗體之人類可變區可(例如)藉由與不同之人類恆定區組合而經進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法製備。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠人類異源骨髓瘤細胞系已經描述。(參見，例如，Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51至63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人，J. Immunol., 147: 86 (1991))。經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體係亦描述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 103:3557-3562 (2006)中。另外方法包括彼等描述(例如)於美國專利第7,189,826號(描述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (描述人類人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤技術)係亦描述於Vollmers及Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)及Vollmers及Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體、酵母或細菌展示庫之Fv純系可變域序列產生。然後此等可變域序列可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體庫選擇人類抗體之技術。
為闡述，本發明包含之抗CD39抗體可藉由針對具有所需活性之抗體篩選組合庫分離。例如，此項技術中已知各種方法用於產生噬菌體或酵母展示庫並針對具有所需結合特徵之抗體篩選此等庫。此等方法係回顧(例如)於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編，Human Press, Totowa, N.J., 2001)及進一步描述(例如)於McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編，Human Press, Totowa, N.J., 2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)中。
作為噬菌體展示方法之一實例，VH及VL基因庫係藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖，並隨機重組於噬菌體庫中，然後其等可針對如Winter等人，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)中描述之抗原結合噬菌體篩選。噬菌體通常顯示抗體片段，呈單鏈Fv (scFv)片段形式或呈Fab片段形式。來自免疫來源之庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築雜交瘤。或者，如由Griffiths等人，EMBO J, 12: 725-734 (1993)描述，原始庫可經選殖(例如自人類)以提供針對廣泛範圍之非自身抗原及亦自身抗原之單一來源抗體而無需任何免疫。最後，如由Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)描述，原始庫亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因片段及使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變之CDR3區並進行活體外重排合成製備。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936及2009/0002360。
自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段在本文中認為係人類抗體或人類抗體片段。
FcγRIII結合亦可藉由根據技術之狀態之方法增加，例如，藉由修飾抗體之Fc部分之胺基酸序列或抗體之Fc部分之糖基化(參見，例如EP2235061)。在某些實施例中，標的抗體係由其中當糖基化時，該抗體上小於50%之寡醣鏈含有α-1,6-岩藻糖之細胞產生。通常，在「低岩藻糖基化」抗體製備中，小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%或小於5%或小於1%之寡醣鏈含有α-1,6-岩藻糖。在結合至IgG重鏈之CH2域之糖中，「無岩藻糖基化」抗體缺乏α-1,6-岩藻糖。Mori, K等人，Cytotechnology 55 (2007)109及Satoh M等人，Expert Opin Biol Ther. 6 (2006) 1161-1173係關於FUT8 (α-1,6-岩藻糖基轉移酶)基因敲除CHO系用於產生無岩藻糖基化抗體。
IV.表現載體 在某些實施例中，使用重組表現載體以擴增及表現編碼本文描述之抗CD39抗體之DNA。例如，重組表現載體可為可複製DNA構築體，其具有編碼可操作地連接至自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因衍生之合適之轉錄及/或轉譯調節元件之抗CD39抗體之多肽鏈之合成或cDNA衍生之DNA片段。轉錄單元一般包含以下之總成：(1)在基因表現中具有調節作用之一或多個遺傳元件，例如轉錄啟動子或強化子，(2)結構或編碼序列，其係經轉錄為mRNA並轉譯為蛋白質，及(3)適當之轉錄及轉譯起始及終止序列。調節元件可包括操作子序列以控制轉錄。在宿主中複製之能力通常由複製之起源賦予，及可另外併入促進轉形子之識別之選擇基因。當DNA區在功能上彼此相關時，其等係經「可操作地連接」。例如，若信號肽之DNA表現為參與多肽之分泌之前體，則其(分泌前導序列)係可操作地連接至多肽之DNA；若啟動子控制序列之轉錄，則其可操作地連接至編碼序列；或若核糖體結合位點係經放置以便於允許轉譯，則其可操作地連接至編碼序列。在一些實施例中，意欲用於酵母表現系統中之結構元件包括使得可由宿主細胞胞外分泌經轉譯之蛋白質之前導序列。在其他實施例中，當在不存在前導序列或運輸序列之情況下表現重組蛋白時，其可包括N端甲硫胺酸殘基。接著，此殘基可視需要自經表現之重組蛋白裂解以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇取決於宿主細胞之選擇。可採用各種表現宿主/載體組合。適用於真核宿主之表現載體包括(例如)包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列之載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知的細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR1、pBR322、pMB9及其等衍生物，及更廣泛之宿主範圍質體，諸如M13及其他絲狀單鏈DNA噬菌體。
適用於表現抗CD39抗體之多肽鏈之宿主細胞(或用作標靶之蛋白質)包括在適當之啟動子之控制下之原核生物、酵母細胞、昆蟲細胞或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細胞包括如下文描述之已建立之哺乳動物起源之細胞系。亦可採用無細胞轉譯系統。適合與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之選殖及表現載體係為熟習此項技術者熟知的。
使用各種哺乳動物細胞培養系統以表現重組多肽。重組蛋白在哺乳動物細胞中之表現可為較佳的，因為此等蛋白質一般係經正確折疊、適當修飾及具有生物功能。合適之哺乳動物宿主細胞系之實例包括COS-7 (猴腎衍生)、L-929 (鼠成纖維細胞衍生)、C127 (鼠科乳腫瘤衍生)、3T3 (鼠科成纖維細胞衍生)、CHO (中國倉鼠卵巢衍生)、HeLa (人類宮頸癌衍生)、BHK (倉鼠腎成纖維細胞衍生)及HEK-293 (人類胚胎腎臟衍生)細胞系及其變體。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，諸如複製之起源、適用於連接至待表現之基因之啟動子及強化子及其他5'或3'側翼非轉錄序列及5'或3'非轉譯序列，諸如必需之核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點及轉錄終止序列。
重組蛋白在昆蟲細胞培養系統(例如桿狀病毒)中之表現亦提供用於產生正確折疊及具有生物功能之蛋白質之可靠方法。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白之桿狀病毒系統係為熟習此項技術者熟知的。
在某些實施例中，多核苷酸包含編碼抗體輕鏈之多核苷酸，該抗體輕鏈包含與SEQ ID No. 1相同至少60%之可變區，及甚至更佳與SEQ ID No. 1相同至少65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%之可變區，且可特異性結合人類CD39。
在某些實施例中，多核苷酸包含編碼抗體重鏈之多核苷酸，該抗體重鏈包含與SEQ ID No. 2相同至少60%之可變區，及甚至更佳與SEQ ID No. 2相同至少65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%之可變區，且可特異性結合人類CD39。
V.用於活體內遞送之經編碼之抗 CD39 抗體 用於在病患中遞送待表現之抗CD39抗體之編碼序列之治療載體可為病毒、非病毒或物理的。參見，例如，Rosenberg等人，Science, 242:1575-1578, 1988，及Wolff等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)。用於基因療法中之方法及組合物之討論包括Eck等人，Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第九版，Hardman等人編，McGraw-Hill, New York, (1996)，第5章，第77至101頁；Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (增刊1):31-32, 1997；Wivel等人，Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck編，12(3):483-501, 1998；Romano等人，Stem Cells, 18:19-39, 2000，及其中引用之參考文獻中。美國專利第6,080,728號亦提供各種基因遞送方法及組合物之討論。遞送途徑包括(例如)全身投與及原位投與。熟知的病毒遞送技術包括使用腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、泡沫病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒及腺相關病毒載體。
a.病毒載體 較佳之病毒載體係基於非細胞病性真核病毒，其中非必需基因已經攜載編碼抗原決定基及靶向受關注之序列之核酸序列之核酸構築體置換。本發明包含之某些實施例之較佳病毒係腺病毒及腺相關病毒(AAV)，其等為已經批准在基因療法中用於人類用途之雙股DNA病毒。另外，用於耐受之較佳載體不包括免疫刺激序列。
腺病毒載體 用於活體內遞送一或多種核酸序列之一種說明性方法涉及使用腺病毒表現載體。「腺病毒表現載體」意謂包括彼等含有足以(a)支持包裝該構築體及(b)在有義或反義方向上表現其中已經選殖之多核苷酸之腺病毒序列之構築體。當然，在反義構築體之內文中，表現無需合成之基因產物。在一具體實施例中，該遞送載體涉及細胞色素b5還原酶3 (CYB5R3)之市售ORF，腺病毒載體pAd中之轉錄變體1，具有C端Flag及His標籤，(Vigene Biosciences產品編碼AH889428)。WIPO專利申請案WO/2015/050364亦教示具有包括Cyb5r3基因之表現構築體之載體。
腺病毒載體係高度免疫原性的，且因此並不較佳藉由呈遞抗原或在自體免疫疾病之情況下投與以誘導耐受性。然而，此等載體可用於誘導免疫性，例如用於治療傳染病及類似物，包括(例如)流感、HBV、HCV及HIV。
腺相關病毒載體(AAV) AAV由於其安全性而係遞送運載工具之良好選擇，即，經基因改造(重組)不整合至宿主基因體內。同樣，AAV不為致病的，且非與任何疾病相關聯。病毒編碼序列之移除將免疫反應最小化至病毒基因表現，及因此，rAAV不引起發炎反應。根據一具體實施例，含有含有本文描述之核酸構築體之抗原決定基序列之AAV載體係適用於轉導APC。
通常，含有含有核酸構築體之抗原決定基之病毒載體係自編碼所需抗原決定基之多核苷酸、合適之調節元件及介導細胞轉導之抗原決定基表現必需之元件組裝。在一項實施例中，採用腺相關病毒(AAV)載體。在一更具體之實施例中，該AAV載體係AAV1、AAV6或AAV8。
具有由AAV ITR結合之受關注之DNA分子之AAV表現載體可藉由將選擇之序列直接插入其中已切除主要之AAV開放閱讀框(「ORF」)之AAV基因體內構築。本發明之AAV中可包括之組成性啟動子之實例包括(但不限於)例示性CMV立即早期強化子/雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
就真核細胞而言，表現控制序列通常包括啟動子、強化子、諸如自免疫球蛋白基因、SV40、巨細胞病毒等衍生者，及可包括剪接供體及受體位點之聚腺苷酸化序列。該聚腺苷酸化序列一般在轉基因序列之後及3' ITR序列之前插入。在一項實施例中，可使用牛生長激素polyA。
此等及其他常見載體及調節元件之選擇係習知的，及許多此等序列係可獲得的。參見，例如，Sambrook等人，及其中引用之參考文獻，例如，於第3.18至3.26及16.17至16.27頁及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989)。當然，非所有載體及表現控制序列均將同樣好地發揮作用以表現本發明之所有轉基因。然而，熟習此項技術者可在此等表現控制序列中作出選擇而不背離本發明之範圍。合適之啟動子/強化子序列可由熟習此項技術者使用由本申請案提供之指導選擇。此選擇係例行事件，且非分子或構築體之限制。
逆轉錄病毒載體 在某些實施例中，病毒載體可為逆轉錄病毒載體。「逆轉錄病毒」係具有RNA基因體之病毒。在特定實施例中，逆轉錄病毒載體含有包裝及整合病毒基因體必需之所有順式作用序列，即，(a)載體兩端之長末端重複(LTR)或其部分；(b)用於負股及正股DNA合成之引子結合位點；及(c)將基因體RNA併入病毒體內必需之包裝信號。關於逆轉錄病毒載體之更多細節可參見Boesen等人，1994, Biotherapy 6:291-302；Clowes等人，1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kiem等人，1994, Blood 83: 1467-1473；Salmons及Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141；Miller等人，1993, Meth. Enzymol. 217:581- 599；及Grossman及Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-1 14。
「γ逆轉錄病毒」係指逆轉錄病毒科家族之屬。例示性γ逆轉錄病毒包括小鼠幹細胞病毒、鼠科白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒及禽網狀內皮病病毒。
廣泛使用之逆轉錄病毒載體包括彼等基於鼠科白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)及其組合者(參見，例如，Buchscher等人，J. Virol. 66:2731-2739, 1992；Johann等人，J. Virol. 66: 1635-1640, 1992；Sommerfelt等人，Virol. 176:58-59, 1990；Wilson等人，J. Virol. 63:2374-2378, 1989；Miller等人，J. Virol. 65:2220-2224, 1991；及PCT/US94/05700)。
慢病毒載體係指可感染分裂細胞及非分裂細胞並通常產生高病毒滴度之逆轉錄病毒之屬。慢病毒之數個實例包括HIV (人類免疫缺陷病毒：包括1型HIV及2型HIV)；馬傳染性貧血病毒；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在特定實施例中，可使用其他逆轉錄病毒載體。此等包括(例如)基於人類泡沫病毒(HFV)或泡沫病毒屬中其他病毒之載體。泡沫病毒(FVes)係當今已知的最大逆轉錄病毒，且廣泛分佈於不同之哺乳動物中，包括所有非人類靈長類動物物種，然而不存在於人類中。此完全無病原性使FV載體成為人類基因療法之理想基因轉移運載工具，並清楚地將FV載體作為基因遞送系統與HIV衍生及亦γ逆轉錄病毒衍生之載體加以區分。
非細胞病性病毒包括逆轉錄病毒(例如慢病毒)，其生命週期涉及將基因體病毒RNA逆轉錄成DNA，及接著將前病毒整合至宿主細胞DNA內。逆轉錄病毒已經批准用於人類基因療法試驗。最有用為彼等複製缺陷(即，可定向合成所需蛋白質，但無法製造感染性粒子)之逆轉錄病毒。此等經基因改變之逆轉錄病毒表現載體針對活體內基因之高效轉導具有一般效用。用於產生複製缺陷型逆轉錄病毒之標準方案(包括將外源性基因材料併入質體內，轉染內襯質體之包裝細胞，由包裝細胞系產生重組逆轉錄病毒，自組織培養基收集病毒粒子，及用病毒粒子感染靶細胞之步驟)係為熟習此項技術者已知。
逆轉錄病毒基因體含有分別編碼衣殼蛋白、聚合酶及包膜組分之三種基因gag、pol及env。自gag基因上游發現之序列含有用於將基因體包裝至病毒體內之信號。逆轉錄病毒載體係基因轉移質體，其中異源核酸殘基位於兩個逆轉錄病毒LTR之間。逆轉錄病毒載體通常含有適當之包裝信號，其等使得逆轉錄病毒載體或使用逆轉錄病毒載體作為模板轉錄之RNA包裝至適當包裝細胞系中之病毒病毒體內(參見，例如，美國專利第4,650,764號)。此等兩個長末端重複(LTR)序列係存在於病毒基因體之5'及3'端。此等含有強啟動子及強化子序列，及亦需整合至宿主細胞基因體中(Coffin, 1990)。為構築逆轉錄病毒載體，將編碼一或多個受關注之寡核苷酸或多核苷酸序列之核酸插入病毒基因體內來取代某些病毒序列，以產生複製缺陷之病毒。亦包括基於慢病毒(例如逆轉錄病毒之一類型)之逆轉錄病毒載體之游離型或非整合型形式。
當需穩定表現時，慢病毒載體係有用的，但慢病毒載體可為免疫原性的，且可能具有其他非所需效應。因此，儘管慢病毒載體便於研究，但當針對人類投與使用其等時，尤其在需誘導耐受性而非免疫性之情況下應加以注意。儘管mRNA電穿孔更為安全，但慢病毒係適用於針對癌症療法離體改造T細胞或樹突狀細胞或其他抗原呈遞細胞。然而，兩項最近進展已使慢病毒之使用更安全且更臨床上可轉譯。首先，自殺基因連同抗原一起之共表現，當投與藥物時，該等抗原之產物變得發揮作用。一典型實例係單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)。表現此等基因之細胞可將藥物更昔洛韋(ganciclovir)代謝為誘導細胞死亡之細胞毒性產物。因此，在一些經轉導之細胞變為惡性之情況下，其等可經根除。存在約一打此等系統(Duarte等人，Cancer Letters, 324:160-170, 2012)。其次，現正研發非整合型慢病毒載體，因此其等為非致癌的(Nightingale等人，2006, Mol. Ther., 13:1121-1132)。根據熟習此項技術者之判斷，此等方法可與本發明一起使用。
適用於本文中之逆轉錄病毒載體係描述(例如)於美國專利第5,399,346及5,252,479號中；及於WIPO公開案WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266及WO 92/14829中，其等提供使用此等逆轉錄病毒載體將核酸有效引入人類細胞內之方法之描述。其他逆轉錄病毒載體包括(例如)小鼠乳腫瘤病毒載體(例如Shackleford等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659, 1998)、慢病毒及類似物。一例示性病毒載體係plentilox-IRES-GFP。
可容易適應於遞送編碼抗CD39抗體藥劑之轉基因之另外逆轉錄病毒遞送系統包括(僅為闡述)已公開之PCT申請案WO/2010/045002、WO/2010/148203、WO/2011/126864、WO/2012/058673、WO/2014/066700、WO/2015/021077、WO/2015/148683、WO/2017/040815，其等中之各者之說明書及圖式均以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，逆轉錄病毒係包含以下之具有重組複製能力之逆轉錄病毒：編碼逆轉錄病毒GAG蛋白之核酸序列；編碼逆轉錄病毒POL蛋白之核酸序列；編碼逆轉錄病毒包膜之核酸序列；及於腫瘤逆轉錄病毒(oncoretroviral)多核苷酸序列之5'及3'端包含長末端重複(LTR)序列之腫瘤逆轉錄病毒多核苷酸序列；包含可操作地連接至抗CD39抗體藥劑之編碼序列之內部核糖體進入位點(IRES)之匣，其中該匣位於3'LTR之U3區之5'及編碼逆轉錄病毒包膜之序列之3'處；及用於在靶細胞中逆轉錄、包裝並整合之順式作用序列。
在某些實施例中，逆轉錄病毒係包含以下之具有重組複製能力之逆轉錄病毒：逆轉錄病毒GAG蛋白；逆轉錄病毒POL蛋白；逆轉錄病毒包膜；包含於逆轉錄病毒多核苷酸序列之3'端之長末端重複(LTR)序列、於逆轉錄病毒多核苷酸5'端之啟動子序列(該啟動子適用於在哺乳動物細胞中表現)、gag核酸域、pol核酸域及env核酸域之逆轉錄病毒多核苷酸；包含可操作地連接至異源多核苷酸之抗CD39抗體藥劑編碼序列之匣，其中該匣位於5'至3' LTR處並經可操作地連接，及3'至編碼逆轉錄病毒包膜之env核酸域；及在靶細胞中逆轉錄、包裝及整合必需之順式作用之序列。
在具有重組複製能力之逆轉錄病毒之某些較佳實施例中，包膜係選自兩性、多性、異種、10A1、GALV、狒狒內源性病毒、RD114、彈狀病毒、α病毒、麻疹或流感病毒包膜中之一者。
在具有重組複製能力之逆轉錄病毒之某些較佳實施例中，逆轉錄病毒多核苷酸序列係自選自由以下組成之群之病毒改造：鼠科白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠科白血病病毒(MoMLV)、貓白血病病毒(FeLV)、狒狒內源性逆轉錄病毒(BEV)、豬內源性病毒(PERV)、貓源性逆轉錄病毒RD114、松鼠猴逆轉錄病毒、異種鼠科白血病病毒相關病毒(XMRV)、禽網狀內皮內皮病病毒(REV)或長臂猿白血病病毒(GALV)。
在具有重組複製能力之逆轉錄病毒之某些較佳實施例中，逆轉錄病毒係γ逆轉錄病毒。
在具有重組複製能力之逆轉錄病毒之某些較佳實施例中，存在第二匣，其包含第二治療蛋白之編碼序列，諸如另一檢查點抑制劑多肽、共刺激多肽及/或免疫刺激細胞介素(僅作為實例)，例如在該匣之下游。在某些實例中，該第二匣可包括內部核糖體進入位點(IRES)或可操作地連接至第二治療蛋白之編碼序列之微型啟動子或polIII啟動子。
在具有重組複製能力之逆轉錄病毒之某些較佳實施例中，其係非溶解性、兩性逆轉錄病毒複製載體，較佳地，其在腫瘤微環境之細胞中選擇性感染並複製。
作為表現構築體之其他病毒載體 其他病毒載體可用作本發明中用於向宿主細胞遞送寡核苷酸或多核苷酸序列之表現構築體。可採用自病毒諸如牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒及皰疹病毒衍生之載體。其等為各種哺乳動物細胞提供數種吸引人之特徵。亦包括B型肝炎病毒。
b.非病毒載體 質體載體 其他載體包括質體載體。質體載體已廣泛描述於此項技術中且為熟習此項技術者熟知。參見，例如，上文引用之Sambrook等人，1989。在過去數年間，質體載體已用作DNA疫苗，用於向細胞活體內遞送抗原編碼基因。其等對此尤為有利，因為其等沒有與病毒載體中之許多相同之安全性問題。然而，具有可與宿主細胞相容之啟動子之此等質體可表現質體內由核酸編碼之肽抗原決定基。其他質體為一般技術者熟知。另外，質體可使用限制酶及連接反應進行定制設計，以移除及添加DNA之特定片段。質體可藉由各種非經腸、黏膜及局部途徑遞送。例如，DNA質體可藉由肌內、皮內、皮下或其他途徑注射。其亦可藉由鼻內噴霧劑或滴劑、直腸栓劑及口服投與。其亦可使用基因槍投與至表皮或黏膜表面內。該等質體可給定於水溶液中，於金粒子上乾燥，或與另一DNA遞送系統(包括(但不限於)脂質體、樹狀聚合物、耳蝸及微囊化)結合。
因此，在一項態樣中，提供質體用於表現含有抗原決定基之核酸構築體，該核酸構築體包括表現匣；亦稱為轉錄單元。當將質體放置於適用於抗原決定基表現之環境中時，該轉錄單元將表現多核苷酸，該多核苷酸包括編碼抗原決定基之序列、ETS及MHCII啟動子序列或編碼抗原決定基及分泌信號序列之序列，及在該構築體中經編碼之任何其他序列。轉錄單元包括轉錄控制序列，其係與細胞免疫反應元件編碼序列轉錄連接。轉錄控制序列可包括啟動子/強化子序列，諸如巨細胞病毒(CMV)啟動子/強化子序列。然而，熟習此項技術者將知曉適用於在真核細胞中表現之各種其他啟動子序列係已知的且可同樣用於本文揭示之構築體中。核酸產物之表現程度將取決於相關聯之啟動子及相關聯之強化子元件之存在及活化。
在某些實施例中，可將編碼所需抗原決定基及靶向序列之序列選殖至表現質體內，該表現質體含有用於轉錄、轉譯、RNA穩定性及複製之調節元件(即，包括轉錄控制序列)。此等表現質體為此項技術中熟知且一般技術者將可用包括編碼細胞免疫反應元件或其片段之序列之多核苷酸以該細胞免疫反應元件可表現之方式設計適當之表現構築體。存在合適之表現質體之許多實例，其中包括序列之多核苷酸可經選殖，諸如pCI-neo、pUMVC或pcDNA3。
大量攜載用於表現細胞免疫反應元件或其片段之質體之細菌宿主可經發酵及該質體可經純化以後續使用。使用質體之當前人類臨床試驗利用此方法。重組DNA諮詢委員會資料管理報告，Human Gene Therapy 6: 535-548, 1994。此項技術中已知的當前DNA分離方法包括移除脂多醣(內毒素)，其等係來自用於增殖該等質體之細菌之污染物。此步驟最佳用於使用致耐受性之DNA疫苗，因為內毒素充當強佐劑且可產生非所需之免疫刺激。
質體之目的係將核酸序列有效遞送至細胞或組織並在細胞或組織中表現治療抗原決定基。特定言之，該質體之目的可為達成高拷貝數、避免質體不穩定性之潛在原因並提供質體選擇之方式。至於表現，核酸匣含有用於在該匣內表現核酸之必需元件。表現包括用質體有效轉錄插入之基因、核酸序列或核酸匣。表現產物可為蛋白質、多肽或RNA。核酸匣中可含有核酸序列。核酸之表現可為連續的或經調節的。
微環 本文描述之核酸構築體之實施例可以微環DNA之形式處理。微環DNA屬於小型(2至4 kb)環形質體衍生物，其等已自所有原核載體部分釋放。由於微環DNA載體不含有細菌DNA序列，因此不太可能將其等視為外源的及經破壞的。(典型之轉基因遞送方法涉及含有外源DNA之質體)。因此，相較於習知質體(數天至數週)，此等載體可表現更長之時間週期(按數週或數月之順序)。較小尺寸之微環亦擴展其等選殖能力並促進其等遞送至細胞內。用於產生微環DNA之套組為此項技術中已知且為市售的(System Biosciences, Inc., Palo Alto, Calif.)。關於微環DNA之資訊係提供於Dietz等人，Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy (2013); 21 8, 1526-1535及Hou等人，Molecular Therapy-Methods & Clinical Development，文章編號：14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62中。關於微環之更多資訊係提供於Chen Z Y、He C Y、Ehrhardt A、Kay M A. Mol Ther. 2003年9月；8(3):495-500中及微環DNA載體達成由活性染色質及轉錄程度反映之持續表現。Gracey Maniar L E、Maniar J M、Chen Z Y、Lu J、Fire A Z、Kay M A. Mol Ther. 2013年1月；21(1):131-8。
作為最終獲得由核酸編碼之產物之表現之方法中之初始步驟，係實現由細胞攝取核酸。由細胞攝取核酸取決於許多因素，其等中之一者係核酸接近細胞表面之時間長度。例如，在肌內(i.m.)投與於緩衝劑中之質體DNA後，若按摩該肌肉，則觀測到基因表現之顯著降低，可能由於DNA直接或經由淋巴血管自該肌肉漏出(Human Gene Therapy 4:151-159; 1993)。因此，可需以延遲核酸擴散之速率或被帶離需要細胞攝取核酸之位點之化合物調配核酸。此外，此等化合物可適用於藉由諸如注射之方式向有機體投與，同時維持或恢復增加細胞攝取核酸必需之物理特徵。
為實現寡核苷酸或多核苷酸序列之表現，必須將表現構築體遞送至細胞內。在本發明包含之某些實施例中，包含一或多個寡核苷酸或多核苷酸序列之表現構築體可僅由裸重組DNA或質體構成。
為誘發免疫性，較佳將任何類型之DNA疫苗載體改造為富含CpG (以刺激免疫細胞上之TLR9)或相反經改造以移除CpG，及在可能之情況下，用GpG基序置換CpG基序(Ho等人，J. Immunol. 71(9):4920-6, 2003；Ho等人，J. Immunol. 175(9):6226-34, 2005)。DNA疫苗可經改造以含有抗原/抗原決定基，亦可含有與抗原共表現以充當佐劑或免疫調節劑(多種啟動子載體)之另外基因。已發現此等DNA疫苗係臨床上安全的，例如在T1D病患中(Roep等人，Sci. Transl. Med. 5(191):191ra82, 2013)。
機械遞送系統 另外之非病毒遞送方法包括(但不限於)可活體外使用之機械遞送系統，諸如Woffendin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581, 1994中描述之方法；沈積光聚合水凝膠材料或使用電離輻射(參見，例如，美國專利第5,206,152及WO 92/11033號)；使用掌上型基因轉移粒子槍(參見，例如，美國專利第5,149,655號)；及使用電離輻射活化經轉移之基因(參見，例如，美國專利第5,206,152及WO 92/11033號)。遞送裝置亦可為生物相容的，亦可為生物可降解的。調配物較佳提供相對恆定水平之活性組分釋放。另一方面，一經投與即可需更快速率之立即釋放。使用已知技術，此等組合物之調配完全於一般技術者之水平內。
增強遞送之物理方法包括電穿孔(其中高壓之短脈衝攜載核酸跨越膜)、基因槍(其中將DNA裝載至金粒子上並迫使DNA滲透至細胞內)、聲波穿孔、磁轉染、流體動力遞送及類似物，其等中之所有均為熟習此項技術者已知。亦可將DNA囊封於脂質體中，較佳陽離子脂質體，或可與細胞膜相互作用並融合或經歷內吞作用以實現將DNA轉移至細胞內之多聚體(合成脂質體)。DNA亦可與聚合物(多聚體)或與可直接將負載釋放至細胞之細胞質內之樹狀聚合物形成複合物。
適用於此方面中之說明性載劑包括以下之微粒：聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、膠乳、澱粉、纖維素、右旋糖酐及類似物。其他說明性緩釋載劑包括超分子生物載體，其等包含非液體親水性核(例如交聯多醣或寡醣)及視需要包含兩親化合物(諸如磷脂)之外層(參見，例如，美國專利第5,151,254號及PCT申請案WO 94/20078、WO/94/23701及WO 96/06638)。緩釋調配物內含有之活性劑之量取決於植入之位點、釋放之速率及預期持續時間及待治療或預防之病症之性質。
可生物降解之微球(例如聚乳酸聚乙醇酸酯)可用作組合物之載劑。合適之可生物降解之微球係揭示(例如)於美國專利第4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609及5,942,252號中。諸如描述於WO/99 40934及其中引用之參考文獻中之經修飾之B型肝炎核蛋白載劑系統將亦適用於許多應用。另一說明性載劑/遞送系統採用包含微粒-蛋白質複合物之載劑，諸如彼等描述於美國專利第5,928,647號中者，當腫瘤內使用以遞送抗CD39抗體藥劑之編碼序列時，其等可具有另外益處，抗CD39抗體藥劑可誘導靶向病患之腫瘤組織之MHC I限制之細胞毒性T淋巴細胞反應。
可生物降解之聚合物奈米粒子促進非病毒核酸轉移至細胞。小(約200 nm)、帶正電(約10 mV)粒子係藉由陽離子、可水解降解之聚(β-胺基酯)及質體DNA之自組裝形成。
多核苷酸亦可藉由直接顯微注射、臨時細胞透化(例如抑制物及/或活化劑與細胞透化劑之共投與)、融合至膜移位肽及類似物向細胞投與。
在本發明之某些特定實施例中，基因構築體係經由電穿孔引入靶細胞內。電穿孔涉及將細胞(或組織)及DNA (或DNA複合物)曝露於高壓放電。活體內電穿孔係已成功用於將質體DNA有效遞送至許多不同組織之基因遞送技術。研究已報導投與活體內電穿孔以將質體DNA遞送至B16黑色素瘤及其他腫瘤組織。由質體編碼之基因或cDNA之全身及局部表現可以投與活體內電穿孔獲得。使用活體內電穿孔增強腫瘤組織中之質體DNA攝取，導致於腫瘤內之表現，並將質體遞送至肌肉組織，導致分泌蛋白諸如細胞介素之全身表現(參見，例如，US8026223)。用於將抗CD39抗體藥劑轉基因活體內電穿孔至細胞內之例示性技術、載體及裝置包括PCT公開案WO/2017/106795、WO/2016/161201、WO/2016/154473、WO/2016/112359及WO/2014/066655。
美國專利第7,245,963號描述模塊化電極系統及其等用於促進將將生物分子引入身體或植物中選擇之組織之細胞內之用途。模塊化電極系統包含複數個針電極；皮下注射針；提供可編程恆流脈衝控制器至複數個針電極之導電連接之電連接器；及電源。操作者可抓住安裝在支撐結構上之複數個針電極並將其等穩固插入身體或植物中選擇之組織內。然後，生物分子係經由皮下注射針遞送至選擇之組織內。將可編程恆流脈衝控制器活化，並將恆流電脈衝施加至複數個針電極。施加之恆流電脈衝促進將生物分子引入複數個電極間之細胞內。美國專利第7,245,963號之全部內容係以引用之方式併入本文中。
美國專利公開案2005/0052630描述可用於有效促進將生物分子引入身體或植物中選擇之組織之細胞內之電穿孔裝置。該電穿孔裝置包含電動裝置(「EKD裝置」)，其操作係由軟體或韌體規定。該EKD裝置基於使用者控制及脈衝參數之輸入在陣列中於電極間產生一系列之可編程之恆流脈衝模式，且容許電流波形資料之儲存及獲取。電穿孔裝置亦包含具有針電極之陣列之可置換電極盤、用於注射針之中央注射通道及可移除之引導盤(參見，例如，美國專利公開案2005/0052630)，其係以引用之方式併入本文中。
美國專利第7,245,963號及美國專利公開案第2005/0052630號中描述之電極陣列及方法適用於不僅深度滲透至諸如肌肉之組織內，但亦深度滲透至其他組織或器官內。因為電極陣列之配置，亦將注射針(以遞送選擇之生物分子)完全插入標靶器官內，及該注射係垂直於標靶組織投與在由電極預先描繪之區中。
通常，活體內細胞電穿孔所需之電場之量級係一般類似於活體外細胞所需之電場。在一項實施例中，該電場之量級係自約10 V/cm至約1500 V/cm，較佳自約300 V/cm至1500 V/cm，及較佳自約1000 V/cm至1500 V/cm之範圍內。或者，較低之場強(自約10 V/cm至100 V/cm，及更佳自約25 V/cm至75 V/cm)之脈衝長度較長。例如，當標稱電場係約25至75 V/cm時，脈衝長度較佳係約10 msec。
脈衝長度可為約10 s至約100 ms。可存在任何所需數量之脈衝，通常每秒1至100個脈衝。脈衝間之延遲可為任何所需時間，諸如一秒。波形、電場強度及脈衝持續時間亦可取決於細胞之類型及經由電穿孔進入該等細胞內之分子之類型。
亦包含併入電化學阻抗光譜學(「EIS」)之電穿孔裝置。此等裝置提供關於活體內(特定言之，腫瘤內電穿孔效率)之即時資訊，容許最佳化條件。併入EIS之電穿孔裝置之實例可參見(例如)WO2016/161201，其係以引用之方式併入本文中。
本發明包含之非病毒遞送載體之攝取亦可藉由血漿電穿孔(亦稱為雪崩轉染)增強。簡而言之，微秒放電在電極表面產生空蝕微氣泡。相較於與習知電穿孔相關聯之擴散介導之運輸，藉由破裂之微泡產生之機械力與磁場之組合發揮作用以增加跨細胞膜之運輸效率。電漿電穿孔之技術係描述於美國專利第7,923,251及8,283,171號中。此技術亦可活體內用於細胞之轉形。Chaiberg等人，(2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090；Chaiberg等人，2012年1月24日發證之美國專利第8, 101 169號。
其他替代之電穿孔技術亦經考慮。活體內質體遞送亦可使用冷電漿進行。電漿係物質之四種基本狀態中之一者，其他狀態為固體、液體及氣體。電漿係未結合之正粒子及負粒子之電中性介質(即，電漿之總電荷大致為零)。電漿可藉由加熱氣體或使其經受強電磁場(以鐳射或微波發生器施加)產生。此減少或增加電子之數量、產生稱為離子之帶正電或帶負電之粒子(Luo等人，(1998) Phys. Plasma 5:2868-2870)，且若存在，則伴隨分子鍵之解離。
冷電漿(即，非熱電漿)係藉由將經脈衝之高壓信號遞送至合適之電極產生。冷電漿裝置可採取氣體噴射裝置或電介質阻擋放電(DBD)裝置之形式。低溫電漿藉由其等在相對較低之氣體溫度下提供電漿已吸引極大之熱情及關注。在此等溫度下提供電漿受各種應用關注，包括傷口癒合、抗菌方法及各種其他醫學療法及滅菌。如先前指示，冷電漿(即，非熱電漿)係藉由將經脈衝之高壓信號遞送至合適之電極產生。冷電漿裝置可採取氣體噴射裝置、電介質阻擋放電(DBD)裝置或多頻富諧波電源之形式。
電介質阻擋放電裝置依賴於不同方法以產生冷電漿。電介質阻擋放電(DBD)裝置含有至少一個由電介質層覆蓋之導電電極。電迴路係由接地形成，該接地可由經歷冷電漿處理之標靶受質提供或由為電極提供內置接地提供。電介質阻擋放電裝置之能量可由諸如上文提及者之高壓電源提供。更一般而言，能量係以經脈衝之DC電壓之形式輸入至電介質阻擋放電裝置內以形成電漿放電。藉由電介質層，放電係自導電電極分離並減少電極蝕刻及氣體加熱。經脈衝之DC電壓可在幅度及頻率上變化以達成變化之操作方案。併入冷電漿產生之原理之任何裝置(例如DBD電極裝置)均落於本發明包含之各種實施例之範圍內。
冷電漿已用於用外源核酸轉染細胞。特定言之，腫瘤細胞之轉染(參見，例如，Connolly等人，(2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733；及Connolly等人，(2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21)。
在某些說明性實施例中，編碼本發明包含之抗CD39抗體藥劑之轉基因構築體係使用包含以下之電穿孔裝置遞送：施加器；及自施加器延伸之複數個電極，該等電極係與覆蓋區相關聯；與電極電連通之電源，該電源經組態以於覆蓋區內產生對細胞之一或多個電穿孔信號；及耦合至該等電極之引導構件，其中，該引導構件係經組態以調節該等電極之覆蓋面積。電極之至少一部分可以錐形佈置放置於該施加器內。一或多個電穿孔信號可各與電場相關聯。該裝置可進一步包含耦合至電源及電極之電位計。該電位計可經組態以將電場大體上維持於預定範圍內。
一或多個電穿孔信號可各與電場相關聯。該裝置可進一步包含耦合至電源及電極之電位計。該電位計可經組態以將電場維持於預定範圍內，以便於大體上防止覆蓋區內之細胞之永久損壞及/或大體上最小化疼痛。例如，電位計可經組態以將電場維持至約1300 V/cm。
電源可向第一電極提供第一電信號並向第二電極提供第二電信號。該等第一電信號及第二電信號可組合以產生具有拍頻之電波。該等第一電信號及第二電信號可各具有單極性波形及雙極性波形中之至少一者。該第一電信號可具有第一頻率及第一幅度。該第二電信號可具有第二頻率及第二幅度。該第一頻率可與該第二頻率不同或相同。該第一幅度可與該第二幅度不同或相同。
在某些實施例中，本發明提供用於治療患有腫瘤之個體之方法，該方法包括：向該腫瘤注射有效劑量之編碼抗CD39抗體藥劑之質體；及向該腫瘤投與電穿孔療法。在某些實施例中，該電穿孔療法進一步包括在約100微秒至約20毫秒之脈衝寬度上投與至少一個約200 V/cm至約1500 V/cm之電壓脈衝。
在某些實施例中，質體(或第二電穿孔質體)進一步編碼至少一種免疫刺激細胞介素，諸如選自編碼IL-12、IL-15及IL-12及IL-15之組合之群。
用於遞送編碼抗CD39抗體之核構築體之脂質及聚陽離子分子
脂質介導之核酸遞送及外源核酸(包括mRNA)於活體外及活體內之表現均已非常成功。基於脂質之非病毒調配物為腺病毒基因療法提供替代方案。當前活體內脂質遞送方法使用皮下、皮內、腫瘤內或顱內注射。脂質調配物之進展改善活體內基因轉移之效率(參見PCT申請案WO 98/07408)。例如，包含等莫耳比率之l,2-雙(油醯氧基)-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)及膽固醇之脂質調配物可顯著增強全身活體內基因轉移。DOTAP:膽固醇脂質調配物形成獨特結構，稱為「三明治脂質體」。此調配物係經報導為在內陷雙層或「花瓶」結構間之「三明治」 DNA。此等脂質結構之有益特徵包括正p、膽固醇之膠體穩定化、二維核酸包裝及增加之血清穩定性。
陽離子脂質體技術係基於具有帶正電之頭基及疏水性脂質尾之兩親性脂質結合至帶負電之DNA或RNA及形成一般藉由內吞作用進入細胞內之粒子之能力。一些陽離子脂質體亦含有中性共脂質，認為其增強哺乳動物細胞之脂質體攝取。同樣，其他聚陽離子諸如聚-l-離胺酸及聚乙烯-亞胺經由電荷相互作用與核酸複合，及有助於將DNA或RNA縮合成奈米粒子，然後其等為核內體介導攝取之受質。[8]此等陽離子-核酸複合技術中之數種已發展為潛在臨床產品，包括與質體DNA (pDNA)、寡聚脫氧核苷酸及合成RNA之各種形式複合之複合物。
本文揭示之核酸構築體可與發揮作用以增強攝取至細胞內之聚陽離子分子締合。該核酸構築體與聚陽離子分子之複合亦有助於包裝該構築體，使得其等尺寸減小，此據信幫助細胞攝取。倘若進入核內體內，則複合物由於較低pH解離，及聚陽離子分子可破壞該核內體之膜以促進DNA逃逸至細胞質內，然後其可降解。初步資料顯示當與聚陽離子分子聚離胺酸或聚乙烯亞胺複合時，相較於DC，核酸構築體實施例已增強至SC內之攝取。
適用於與核酸構築體複合之聚陽離子分子之一項實例包括細胞滲透肽(CPP)，實例包括聚離胺酸(上文描述)、聚精胺酸及Tat肽。細胞滲透肽(CPP)係小肽，其可結合至DNA，且一經釋放，即滲透細胞膜，以促進DNA自核內體逃逸至細胞質。CPP之另一實例涉及27個殘基嵌合肽，稱為MPG，前段時間已經顯示可以穩定方式結合ss及ds寡核苷酸，導致非共價複合物，其保護核酸免受DNase降解並將寡核苷酸活體外有效遞送至細胞(Mahapatro A等人，J Nanobiotechnol, 2011, 9:55)。當檢查不同肽:DNA比率，及10:1及5:1比率(分別150 nm及1 um)時，複合物形成約150 nm至1 um之小粒子。另一CPP涉及經修飾之四肽[含有胍基羰基吡咯(GCP)基團(TL-GCP)之四離胺酸]，其據報導以高親和力結合至6.2 kb質體DNA，導致700至900 nm帶正電之聚集體，Li等人，Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4)。RNA亦可由此等聚陽離子分子複合用於活體內遞送。
可與本文描述之核酸構築體複合之聚陽離子分子之其他實例包括可作為JETPRIME® 及In Vivo JET (Polypus-transfection, S.A., Illkirch, France)購買獲得之聚陽離子聚合物。
VI.使用方法及醫藥組合物 本發明包含之抗CD39抗體適用於各種應用，包括(但不限於)治療性治療方法，諸如針對癌症之免疫療法。在某些實施例中，本文描述之抗CD39抗體適用於免疫反應之活化、促進、增加及/或增強、抑制腫瘤生長、減小腫瘤體積、誘導腫瘤消退、增加腫瘤細胞凋亡及/或降低腫瘤之致瘤性。在某些實施例中，本發明包含之抗CD39抗體亦適用於針對病原體(諸如病毒)之免疫療法。在某些實施例中，本文描述之抗CD39抗體適用於抑制病毒感染、減少病毒感染、增加病毒感染之細胞凋亡及/或增加病毒感染之細胞之殺死。使用方法可為活體外、離體或活體內方法。
本發明提供使用本文描述之抗CD39抗體活化個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文描述之抗CD39抗體促進個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文描述之抗CD39抗體增加個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供用於使用本文描述之抗CD39抗體增強個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加細胞介導免疫性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加Th1型反應。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加T細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加CD4+ T細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加CD8+ T細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加CTL活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加T細胞活性及增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加CU活性及增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括抑制或降低Treg細胞之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括抑制或降低MDSC之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加記憶T細胞之百分率之數量。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加長期免疫記憶功能。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包括增加長期記憶。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強不包括實質性副作用及/或基於免疫之毒性之證據。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強不包括細胞介素釋放症候群(CRS)或細胞介素風暴之證據。在一些實施例中，免疫反應係抗原刺激之結果。在一些實施例中，該抗原刺激係腫瘤細胞。在一些實施例中，該抗原刺激係癌症。在一些實施例中，該抗原刺激係病原體。在一些實施例中，該抗原刺激係病毒感染之細胞。
用於確定抗CD39抗體是否調節、活化或抑制免疫反應之活體內及活體外分析為此項技術中已知或正在研發中。
在本文描述之方法之某些實施例中，誘導抑制腫瘤復發或腫瘤再生之持久或長期免疫性之方法包括向個體投與治療有效量之抗CD39抗體。
在一些實施例中，腫瘤係實體腫瘤。在某些實施例中，該腫瘤係選自由以下組成之群之腫瘤：結腸直腸腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、神經內分泌腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、膠質母細胞瘤、淋巴瘤及頭頸腫瘤。在某些實施例中，該腫瘤係結腸直腸腫瘤。在某些實施例中，該腫瘤係卵巢腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係肺腫瘤。在某些實施例中，該腫瘤係胰或胰島腫瘤。在某些實施例中，該腫瘤係黑色素瘤腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係膀胱或尿路上皮腫瘤。
在一些實施例中，腫瘤係液體腫瘤。在某些實施例中，該腫瘤係白血病，諸如骨髓性或粒細胞性白血病、淋巴性、淋巴細胞性或淋巴細胞白血病及真性紅細胞增多症或紅細胞增多症。
在一些實施例中，腫瘤表現或過表現被抗CD39抗體(諸如包含特異性結合該腫瘤抗原之抗原結合位點之雙特異性藥劑)靶向之腫瘤抗原。
本發明進一步提供用於治療個體之癌症之方法，其包括向該個體投與治療有效量之本文描述之抗CD39抗體。在一些實施例中，該抗CD39抗體抑制或減少癌症之生長。
本發明提供治療癌症之方法，該方法包括向個體(例如需治療之個體)投與治療有效量之本文描述之抗CD39抗體。在某些實施例中，該個體為人類。在某些實施例中，該個體患有癌性腫瘤。在某些實施例中，該個體已移除腫瘤。
在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群之癌症：結腸直腸癌、胰癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、宮頸癌、神經內分泌癌、膀胱癌、腦癌、膠質母細胞瘤及頭頸癌。在某些實施例中，該癌症係胰癌。在某些實施例中，該癌症係卵巢癌。在某些實施例中，該癌症係結腸直腸癌。在某些實施例中，該癌症係乳癌。在某些實施例中，該癌症係前列腺癌。在某些實施例中，該癌症係肺癌。在某些實施例中，該癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，該癌症係膀胱癌。
本發明提供包含本文描述之抗CD39抗體之組合物。本發明亦提供包含本文描述之抗CD39抗體及醫藥上可接受之媒劑之醫藥組合物。在一些實施例中，該等醫藥組合物發現用於免疫療法中。在一些實施例中，該等醫藥組合物發現用於免疫腫瘤學中。在一些實施例中，該等組合物發現用於抑制腫瘤生長。在一些實施例中，該等醫藥組合物發現用於抑制個體(例如人類病患)之腫瘤生長。在一些實施例中，該等組合物發現用於治療癌症中。在一些實施例中，該等醫藥組合物發現用於治療個體(例如人類病患)之癌症。
藉由將本發明包含之純化劑與醫藥上可接受之媒劑(例如載劑或賦形劑)組合製備調配物用於儲存及使用。熟習此項技術者一般將醫藥上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑視為調配物或醫藥組合物之非活性成分。
在一些實施例中，抗CD39抗體係經凍乾及/或以凍乾形式儲存。在一些實施例中，包含本文描述之抗CD39抗體之調配物係經凍乾。
合適之醫藥上可接受之媒劑包括(但不限於)無毒緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、六甲基氯化銨(hexamethonium chloride)、氯化苄烷胺(benzalkonium chloride)、氯化苯索寧(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如小於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；醣類，諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物，諸如Zn-蛋白質複合物；及非離子表面活性劑，諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第22.sup.版，2012, Pharmaceutical Press, London.)。
本發明包含之醫藥組合物可以許多方法投與用於局部或全身治療。投與可為局部的，藉由表皮或透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末；經肺，藉由吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括藉由霧化器，氣管內及鼻內；經口；或非經腸，包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌內(例如注射或輸注)或顱內(例如鞘內或腦室內)。
治療調配物可為單位劑型。此等調配物包括錠劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、在水或非水介質中之溶液或懸浮液或栓劑。在諸如錠劑之固體組合物中，將主要活性成分與醫藥載劑混合。習知製錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠及稀釋劑(例如，水)。此等可用於形成固體預調配組合物，其含有本發明包含之化合物或其無毒之醫藥上可接受之鹽之均質混合物。然後將該固體預調配組合物細分為上文描述之類型之單位劑型。調配物或組合物之錠劑、丸劑等可經包覆或以其他方式複合以提供劑型，該劑型提供延長之作用之優勢。例如，該錠劑或丸劑可包含由外部組分覆蓋之內部組合物。此外，該等兩種組分可由腸溶層隔開，該腸溶層發揮作用以抵抗崩解及容許內部組分完整通過胃或延遲釋放。各種材料可用於此等腸溶層或包衣，此等材料包括許多聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及乙酸纖維素之此等材料之混合物。
抗CD39抗體亦可包埋於微囊劑中。此等微囊劑係(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備，例如，羥甲基纖維素或明膠微囊劑及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊劑分別於膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於如Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第22.sup.版，2012, Pharmaceutical Press, London中描述之大乳液中。
在某些實施例中，醫藥調配物包括與脂質體複合之抗CD39抗體。產生脂質體之方法為熟習此項技術者已知。例如，一些脂質體可藉由逆相蒸發以包含卵磷脂、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體可通過確定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。
在某些實施例中，可產生包含抗CD39抗體之緩釋製劑。緩釋製劑之合適之實例包括含有抗CD39抗體之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，其中該等基質係以成形物品之形式(例如，薄膜或微囊劑)。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、非可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT (包含乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林之可注射微球))、乙酸異丁酸蔗糖及聚D-(-)-3-羥基丁酸。
在某些實施例中，除投與抗CD39抗體外，方法或治療進一步包括投與至少一種另外之免疫反應刺激劑。在一些實施例中，該另外之免疫反應刺激劑包括(但不限於)集落刺激因子(例如，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、幹細胞介素(SCF))、介白素(例如，IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、檢查點抑制劑、阻斷免疫抑制功能之抗體(例如，抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗CD3抗體)、鐸樣受體(例如，TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族之成員(例如，CD80、CD86)。另外之免疫反應刺激劑可在投與抗CD39抗體之前、並行及/或之後投與。亦提供包含抗CD39抗體及免疫反應刺激劑之醫藥組合物。在一些實施例中，該免疫反應刺激劑包含1、2、3或更多種免疫反應刺激劑。
在某些實施例中，除投與抗CD39抗體外，方法或治療進一步包括投與至少一種另外治療劑。另外治療劑可在投與抗CD39抗體之前、並行及/或之後投與。亦提供包含抗CD39抗體及另外治療劑之醫藥組合物。在一些實施例中，該至少一種另外治療劑包含1、2、3或更多種另外治療劑。
儘管此非必需，但使用兩種或更多種治療劑之組合療法通常使用藉由不同作用機制發揮作用之藥劑。使用具有不同作用機制之藥劑之組合療法可導致累加或協同效應。相較於單一療法中使用之各藥劑之劑量，組合療法可容許各藥劑之更低劑量，藉此減少毒性副作用及/或增加抗CD39抗體之治療指數。組合療法可降低耐藥性癌細胞發展之可能性。在一些實施例中，組合療法包含影響免疫反應(例如，增強或活化該反應)之治療劑及影響(例如，抑制或殺死)腫瘤/癌細胞之治療劑。
在本文描述之方法之一些實施例中，抗CD39抗體及至少一種另外治療劑之組合導致累加或協同結果。在一些實施例中，組合療法導致抗CD39抗體之治療指數增加。在一些實施例中，該組合療法導致另外治療劑之治療指數增加。在一些實施例中，該組合療法導致抗CD39抗體之毒性及/或副作用降低。在一些實施例中，該組合療法導致另外治療劑之毒性及/或副作用降低。
治療劑之有用類別包括(例如)抗微管蛋白劑、澳瑞他汀(auristatin)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如，鉑錯合物，諸如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)及三核鉑錯合物及卡鉑)、蒽環類、抗生素、抗葉酸、抗代謝物、化學療法敏化劑、杜卡黴素、依託泊苷、氟化嘧啶、離子載體(ionophore)、促排卵素(lexitropsin)、亞硝基脲、鉑醇(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素、放射敏化劑、類固醇、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼或類似物。在某些實施例中，第二治療劑係烷化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。
可與本文描述之抗CD39抗體組合投與之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施例中，方法或治療涉及投與抗CD39抗體與化學治療劑之組合或與化學治療劑之混合物之組合。使用抗CD39抗體之治療可在投與化學治療之前、並行或之後發生。組合投與可包括共投與，以單一醫藥調配物或使用不同調配物，或以任何順序但一般於一定時間內之連續投與，使得所有活性劑可同時發揮其等生物活性。此等化學治療劑之製備及給藥時間表可根據製造商之說明書或如由熟習從業者憑經驗確定使用。此化學療法之製備及給藥時間表係亦描述於The Chemotherapy Source Book，第4.sup.th版，2008, M. C. Perry編，Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa中。
適用於本發明之化學治療劑包括(但不限於)烷化劑，諸如噻替帕及環磷醯胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，諸如白消安、英丙舒凡及哌泊舒凡；氮丙啶，諸如苯并多巴、卡波醌、美多巴及烏多巴；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙撐磷醯胺、三乙撐硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、甲基二(氯乙基)胺、鹽酸甲氧乙胺、美法崙、新恩比星、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷醯胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲諸如卡莫司汀、氯脲黴素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、拉尼莫司汀；抗生素，諸如阿克拉黴素、放線菌素、安麯黴素、偶氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素C、卡奇黴素、卡拉比星、卡米黴素(caminomycin)、嗜碳菌素、染色體黴素、放線菌素D、道諾黴素、地托比星、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素、表柔比星、依索比星、伊達比星、馬賽黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、波菲黴素、嘌呤黴素、奎拉黴素、羅丹黴素、鏈黴黑素、鏈脲黴素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他汀、佐柔比星；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸、甲胺蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱、阿紮胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸曲他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺麩精、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶；阿莫司汀；比生群；依達曲酯；脫氧胺；地美可辛；亞絲醌；依氟鳥胺酸；乙酸降鈣素；依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；洛尼達寧；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidamol)；硝曲克林(nitracrine)；噴托他汀；菲納姆；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；前卡巴嗪；PSK；雷佐生；西呋喃(sizofuran)；螺旋鍺；細交鍵孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷；葛胞嘧啶；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇，例如紫杉醇(TAXOL)及多西他賽(docetaxel) (TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春花鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；鹽酸米托蒽醌；替尼泊苷；道諾黴素；胺基蝶呤；伊班膦酸鹽；CPT11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素；卡培他濱 (XELODA)；及上文中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括抗激素藥，其等發揮作用以調節或抑制對腫瘤之激素作用，諸如抗雌激素，包括(例如)他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶之4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、克昔芬、LY117018、奧那司酮及托瑞米芬 (FARESTON)；及抗雄激素，諸如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上文中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，該另外治療劑係順鉑。在某些實施例中，該另外治療劑係卡鉑。
在本文描述之方法之某些實施例中，化學治療劑係拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑係干擾拓撲異構酶(例如，拓撲異構酶I或II)之作用之化學治療劑。拓撲異構酶抑制劑包括(但不限於)鹽酸阿黴素、檸檬酸道諾黴素、鹽酸米托蒽醌、放線菌素D、依託泊苷、鹽酸拓撲替康、替尼泊苷(VM-26)及伊立替康，及此等中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
在某些實施例中，化學治療劑係抗代謝物。抗代謝物係結構與正常生化反應所需之代謝物類似，但足夠不同以干擾細胞之一或多種正常功能(諸如細胞分裂)之化學物質。抗代謝物包括(但不限於)吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲胺蝶呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴托他汀、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)及克拉屈濱(cladribine)，及此等中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
在本文描述之方法之某些實施例中，化學治療劑係抗有絲分裂劑，包括(但不限於)結合微管蛋白之藥劑。在一些實施例中，該藥劑係紫杉烷。在某些實施例中，該藥劑係紫杉醇或多西他賽，或紫杉醇或多西他賽之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，該藥劑係紫杉醇(TAXOL)、多西他賽(TAXOTERE)、白蛋白結合之紫杉醇(nab-紫杉醇；ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代實施例中，抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼、長春花鹼、長春瑞濱或長春地辛，或其醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，該抗有絲分裂劑係驅動蛋白Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶諸如Aurora A或Plk1之抑制劑。
在本文描述之方法之某些實施例中，經考慮標的抗CD39抗體將與在腫瘤中誘導ATP之釋放及/或引起腫瘤內CD39或CD73之上調之彼等化學治療劑一起具有更大之組合效應(或許甚至係協同效應)。存在廣泛範圍之化學治療劑，其等引起ATP釋放至胞外空間內，因為其等誘導腫瘤細胞死亡，諸如(但不限於)蒽環類(諸如阿黴素、道諾黴素、表柔比星及伊達比星)、基於鉑之藥物(諸如順鉑、卡鉑及奧沙利鉑)及蛋白酶體抑制劑(諸如硼替佐米(bortezomib))。放射療法及光動力療法(PDT)亦可導致ATP釋放及/或CD39及/或CD73之腫瘤內濃度之上調。
在本文描述之方法之一些實施例中，另外治療劑包含諸如小分子之藥劑。例如，治療可涉及組合投與抗CD39抗體與充當抗腫瘤相關抗原(包括(但不限於) EGFR、HER2 (ErbB2)及/或VEGF)之抑制劑之小分子。在一些實施例中，抗CD39抗體係與選自由以下組成之群之蛋白激酶抑制劑組合投與：吉非替尼(gefitinib) (IRESSA)、埃羅替尼 (TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib) (RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib) (NEXAVAR)及帕唑帕尼(pazopanib) (GW786034B)。在一些實施例中，另外治療劑包含mTOR抑制劑。
在本文描述之方法之某些實施例中，另外治療劑係抑制癌症幹細胞途徑之小分子。在一些實施例中，該另外治療劑係Notch途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係Wnt途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係BMP途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係Hippo途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係mTOR/AKR途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係RSPO/LGR途徑之抑制劑。
在本文描述之方法之一些實施例中，另外治療劑包含生物分子，諸如抗體。例如，治療可涉及組合投與抗CD39抗體與抗腫瘤相關抗原之抗體，該等抗體包括(但不限於)結合EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF之抗體。在某些實施例中，該另外治療劑係對癌症幹細胞標誌物具特異性之抗體。在一些實施例中，該另外治療劑係結合Notch途徑之組分之抗體。在一些實施例中，該另外治療劑係結合Wnt途徑之組分之抗體。在某些實施例中，該另外治療劑係抑制癌症幹細胞途徑之抗體。在一些實施例中，該另外治療劑係Notch途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係Wnt途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係BMP途徑之抑制劑。在一些實施例中，該另外治療劑係抑制β-連環蛋白傳訊之抗體。在某些實施例中，該另外治療劑係為血管生成抑制劑之抗體(例如，抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施例中，該另外治療劑係貝伐單抗 (AVASTIN)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN)、帕妥珠單抗(pertuzumab) (OMNITARG)、帕尼單抗(panitumumab) (VECTIBIX)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)，紮魯木單抗(zalutumumab)或西妥昔單抗 (ERBITUX)。
I/O組合-代表性檢查點抑制劑及共刺激激動劑 在本文描述之方法之一些實施例中，另外治療劑係調節免疫反應之抗體。在一些實施例中，該另外治療劑係抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM-3抗體、抗TIGIT抗體及/或抗Siglec-15抗體。
例如，治療可進一步包括投與免疫檢查點分子之抑制劑或共刺激分子之活化劑，或其組合。免疫檢查點之例示性抑制劑包括以下中之一或多者之抑制劑：PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、NLRP1、NRLP3、STING、TGFRβ或Siglec-15。共刺激分子之例示性活化劑包括以下中之一或多者之激動劑：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配體。免疫檢查點之例示性抑制劑及共刺激分子之例示性活化劑可參見PCT公開案WO 2016/054555，該PCT公開案係以引用之方式併入本文中。
PD-1拮抗劑 PD-1基因係55 kDa I型跨膜蛋白，其為Ig基因超家族之一部分(Agata等人，(1996) Int Immunol 8:765-72)。PD-1含有膜近端免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)及基於膜遠端酪胺酸之開關基序(ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181 :1953-6；Vivier, E及Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91)。PD-1之兩種配體已經識別，PD-L1及PD-L2，其等已顯示一經結合至PD-1即下調T細胞活化(Freeman等人，(2000) J Exp Med 192: 1027-34；Latchman等人，(2001) Nat Immunol 2:261-8；Carter等人，(2002) Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1及PD-L2兩者均為結合至PD-1但不結合至其他CD28家族成員之B7同源物。PD-L1在各種人類癌症中係充足的(Dong等人，(2002) Nat. Med. 8:787-9)。PD-1與PD-L1間之相互作用導致腫瘤浸潤淋巴細胞之減少、T細胞受體介導增殖之減少及癌細胞之免疫逃避(Dong等人，(2003) J. Mol. Med. 81:281-7；Blank等人，(2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307- 314；Konishi等人，(2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100)。免疫抑制可藉由抑制PD-1與PD-L1間之局部相互作用逆轉，且當PD-1與PD-L2間之相互作用亦經阻斷時，該效應為累加的(Iwai等人，(2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7；Brown等人，(2003) J. Immunol. 170: 1257-66)。
如本文使用，術語「程序性死亡1」、「程序性細胞死亡1」、「蛋白質PD-1」、「PD-1」、PD1、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-1」可互換使用，及包括人類PD-1之變體、同功型、物種同源物及與人類PD-1具有至少一個共同抗原決定基之類似物。完整之人類PD-1序列可在基因庫登錄號第U64863號下找到。
如本文使用，術語「程序性細胞死亡1配體1」、「PD-L1」、「PDL1」、「PDCD1L1」、「PDCD1LG1」、「CD274」、「B7同源物1」、「B7-H1」、「B7-H」及「B7H1」可互換使用，及包括人類PDL-1之變體、同功型、物種同源物，及與人類PDL-1具有至少一個共同抗原決定基之類似物。完整之人類PD-L1胺基酸序列-同功型a前體-可在基因庫登錄號第NP_054862.1號下找到。完整之人類PD-L1胺基酸序列-同功型b前體-可在基因庫登錄號第NP_001254635.1號下找到。
術語「PD-1軸結合拮抗劑」係抑制PD-1軸結合配偶體與其結合配偶體中之一或多者之相互作用，以便於移除由PD-1傳訊軸上之傳訊引起之T細胞功能障礙，從而恢復或增強T細胞功能(例如，增殖、細胞介素產生、靶細胞殺死)之分子。如本文使用，PD-1軸結合拮抗劑包括PD-1結合拮抗劑、PD-L1結合拮抗劑及PD-L2結合拮抗劑。
術語「PD-1結合拮抗劑」係減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與其結合配偶體中之一或多者(諸如PD-L1、PD-L2)之相互作用引起之信號轉導之分子。在一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑係抑制PD-1結合至其結合配偶體之分子。在一特定態樣中，該PD-1結合拮抗劑抑制PD-1結合至PD-L1及/或PD-L2。例如，PD-1結合拮抗劑包括抗PD-1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與PD-L1及/或PD-L2之相互作用引起之信號轉導之其他分子。在一項實施例中，PD-1結合拮抗劑減少由或通過表現於T淋巴細胞上之通過PD-1傳訊介導之細胞表面蛋白介導之負共刺激信號，以便使得功能障礙之T細胞更少功能障礙(例如，增強對抗原識別之效應物反應)。在一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑係抗PD-1抗體。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑係本文描述之MDX-1106。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑係本文描述之Merck 3745。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑係本文描述之CT-011。
術語「PD-L1結合拮抗劑」係減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合配偶體中之一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互作用引起之信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1結合至其結合配偶體之分子。在一特定態樣中，該PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1結合至PD-1及/或B7-1。在一些實施例中，該PD-L1結合拮抗劑包括抗PD-L1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合配偶體中之一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互作用引起之信號轉導之其他分子。在一項實施例中，PD-L1結合拮抗劑減少由或通過表現於T淋巴細胞上之通過PD-L1傳訊介導之細胞表面蛋白介導之負共刺激信號，以便使得功能障礙之T細胞更少功能障礙(例如，增強對抗原識別之效應物反應)。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抗PD-L1抗體。在一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文描述之YW243.55.S70。在另一特定態樣，抗PD-L1抗體係本文描述之MDX-1105。在又另一特定態樣中，抗PD-L1抗體係本文描述之MPDL3280A。
術語「PD-L2結合拮抗劑」係減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合配偶體中之一或多者(諸如PD-1)之相互作用引起之信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑係抑制PD-L2結合至其結合配偶體之分子。在一特定態樣中，該PD-L2結合拮抗劑抑制PD-L2結合至PD-1。在一些實施例中，該PD-L2拮抗劑包括抗PD-L2抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合配偶體中之一或多者(諸如PD-1)之相互作用引起之信號轉導之其他分子。在一項實施例中，PD-L2結合拮抗劑減少由或通過表現於T淋巴細胞上之通過PD-L2傳訊介導之細胞表面蛋白介導之負共刺激信號，以便使得功能障礙之T細胞更少功能障礙(例如，增強對抗原識別之效應物反應)。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑係免疫黏附素。
PD-1途徑：PD-1途徑之成員為與PD-1傳訊相關聯之所有蛋白質。一方面，此等可為誘導PD-1上游之PD-1傳訊之蛋白質，諸如，例如，PD-1 PD-L1及PD-L2之配體及信號轉導受體PD-1。另一方面，此等可為PD-1受體下游之信號轉導蛋白。在本發明包含之內文中，尤其較佳為PD-1途徑之成員係PD-1、PD-L1及PD-L2。
PD-1途徑抑制劑：在本發明包含之內文中，PD-1途徑抑制劑在本文中較佳定義為可損害PD-1途徑傳訊，較佳由PD-1受體介導之傳訊之化合物。因此，該PD-1途徑抑制劑可為針對可拮抗PD-1途徑傳訊之PD-1途徑之任何成員之任何抑制劑。在此內文中，該抑制劑可為如本文定義之拮抗抗體，靶向PD-1途徑之任何成員，較佳針對PD-1受體PD-L1或PD-L2。此拮抗抗體亦可由核酸編碼。此等經編碼之抗體亦稱為如本文定義之「胞內抗體」。同樣，該PD-1途徑抑制劑可為PD-1受體之片段或阻斷PD1配體之活性之PD1-受體。B7-1或其片段亦可充當PD1抑制配體。此外，該PD-1途徑抑制劑可為針對PD-1途徑成員(較佳PD-1、PD-L1或PD-L2)之siRNA (小干擾RNA)或反義RNA。另外，PD-1途徑抑制劑可為蛋白質，該蛋白質包含可結合至PD-1但阻止PD-1傳訊，例如，藉由抑制PD-1及B7-H1或B7-DL相互作用之胺基酸序列之蛋白質(或針對可結合至PD-1但阻止PD-1傳訊，例如，藉由抑制PD-1及B7-H1或B7-DL相互作用之胺基酸序列編碼之核酸)。另外，PD-1途徑抑制劑可為可抑制PD-1途徑傳訊之小分子抑制劑，例如，PD-1結合肽或小有機分子。
在某些實施例中，本發明包含之PD-1拮抗劑包括結合至PD-1配體並干擾、減少或抑制一或多個配體對PD-1受體之結合，或直接結合至該PD-1受體而不參與通過PD-1受體之信號轉導之藥劑。在一項實施例中，該PD-1拮抗劑直接結合至PD-1並阻斷PD-1抑制信號轉導。在另一實施例中，該PD-1拮抗劑結合至PD-1之一或多個配體(例如，PD-L1及PD-L2)，並減少或抑制配體通過PD-1觸發抑制信號轉導。在一項實施例中，該PD-1拮抗劑直接結合至PD-L1，抑制或阻止PD-L1結合至PD-1，藉此阻斷PD-1抑制信號轉導。
本發明包含之方法及組合物中使用之PD-1拮抗劑包括PD-1結合支架蛋白，及包括(但不限於) PD-配體、抗體及多價藥劑。在一特定實施例中，該拮抗劑係融合蛋白，諸如AMP-224。在另一實施例中，該拮抗劑係抗PD-1抗體(「PD-1抗體」)。適用於本發明中之抗人類PD-1抗體(或自其中衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗PD-1抗體。例如，可使用抗體MK-3475或CT-011。另外，可使用WO 2006/121168中描述之單株抗體5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3及5F4，其等之教示係以引用之方式併入本文中。亦可使用與此等公認之抗體中之任何一者競爭性結合至PD-1之抗體。
在另一實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-L1抗體。適用於本發明中之抗人類PD-L1抗體(或自其中衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用公認之抗PD-L1抗體。例如，可使用MEDI4736 (亦稱為抗B7-Hl)或MPDL3280A (亦稱為RG7446)。另外，可使用WO 2007/005874及美國專利第7,943,743號中描述之單株抗體12A4、3G10、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4，其等之教示係以引用之方式併入本文中。亦可使用與此等公認之抗體中之任何一者競爭性結合至PD-L1之抗體。
例示性抗PD-L1抗體係WO 2007/005874及美國專利第7,943,743號中描述之12A4。在一項實施例中，該抗體包含12A4之重鏈及輕鏈CDR或VR。在另一實施例中，該抗體與如上文提及之抗體競爭性結合至PD-L1上之相同抗原決定基及/或結合至PD-L1上之相同抗原決定基。在另一實施例中，該抗體與上文提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性。
抗PD-1或抗PD-L1抗體可分別以10-7 M、5 x 10-8 M、10-8 M、5 x 10-9 M、10-9 M、5 x 10-10 M、10-10 M或更小之KD結合至PD-1或PD-L1。
在一項實施例中，PD-1抑制劑係選自納武單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)或匹地珠單抗(Pidilizumab)之抗PD-1抗體。較佳之PD-1抑制劑係納武單抗。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係納武單抗。納武單抗之替代名稱包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些實施例中，該抗PD-1抗體係納武單抗(CAS註冊號：946414-94-4)。納武單抗係特異性阻斷PD1之完全人類IgG4單株抗體。納武單抗(純系5C4)及特異性結合至PD1之其他人類單株抗體係揭示於US 8,008,449 (以引用之方式併入本文中)及WO 2006/121168 (以引用之方式併入本文中)中。在其他實施例中，該抗PD-1抗體係派姆單抗。派姆單抗(商品名KEYTRUDA® ，原名蘭博利單抗(Lambrolizumab)，亦稱為Merck 3745、MK-3475或SCH-900475)係結合至PD1之人類化IgG4單株抗體。派姆單抗係揭示(例如)於Hamid, O.等人，(2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44、WO 2009/114335 (以引用之方式併入本文中)及US 8,354,509 (以引用之方式併入本文中)中。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係匹地珠單抗。匹地珠單抗(CT‐011；Cure Tech)係結合至PD1之人類化IgGlk單株抗體。匹地珠單抗及其他人類化抗PD-1單株抗體係揭示於WO2009/101611中。其他抗PD1抗體係揭示於US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中。其他抗PD1抗體包括AMP 514 (Amplimmune)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑係免疫黏附素{例如，包含融合至恆定區{例如，免疫球蛋白序列之Fc區)之PD-L1或PD-L2之胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素。在一些實施例中，該PD-1抑制劑係AMP-224。在一些實施例中，該PD-L1抑制劑係抗PD-L1抗體。在一些實施例中，該抗PD-L1抑制劑係YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。
在一項實施例中，PD-L1抑制劑係MDX-1105。MDX-1105(亦稱為BMS-936559)係WO 2007/005874中描述之抗PD-L1抗體。在一項實施例中，該PD-L1抑制劑係YW243.55.S70。該YW243.55.S70抗體係WO 2010/077634 (以引用之方式併入本文中)中描述之抗PD-L1 (在WO 2010/077634中，SEQ ID No. 20及21中分別顯示之重鏈及輕鏈可變區序列)。
在一項實施例中，PD-L1抑制劑係MDPL3280A (Genentech/Roche)。MDPL3280A係結合至PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及對PD-L1之其他人類單株抗體係揭示於美國專利第7,943,743號(以引用之方式併入本文中)及美國公開案第2012/0039906號(以引用之方式併入本文中)中。在其他實施例中，該PD-L2抑制劑係AMP-224。AMP-224係阻斷PD1與B7-H1間之相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體(B7-DCIg；Amplimmune；例如，揭示於WO 2010/027827 (以引用之方式併入本文中)及WO 2011/066342 (以引用之方式併入本文中)中)。
在某些實施例中，PD-1途徑抑制劑係PD-1途徑傳訊之小分子拮抗劑。此等小分子拮抗劑包括彼等結合至PD-1、PD-L1及/或PD-L2中之一或多者並抑制PD-1與PD-1L1及/或PD-1L2之相互作用之藥劑。
PD-1途徑傳訊之例示性小分子拮抗劑可尤其在下列中找到：經公開之美國申請案2014/0294898及2014/0199334，及經公開之PCT申請案WO 2013/132317及WO 2012/168944，其等中之各者係以引用之方式併入本文中。
僅為闡述，標的組合療法可以選自由以下組成之群之小分子拮抗劑實踐：
Figure 02_image175
在其他實施例中，小分子拮抗劑係以以下通式表示：
Figure 02_image177
其中： R1 係Ser之游離C端或醯胺化C端； L係選自-NH(CH2 )n NH-或-NH(CH2 CH2 O)n NH-之連接子； R4 係選自氫、胺基(C1 -C20 )烷基、-NHCOCH3 或-NHCONH2 ； 或其逆向類似物或醫藥上可接受之立體異構體或醫藥上可接受之鹽。
在又其他實施例中，小分子拮抗劑係以以下通式表示：
Figure 02_image179
其中： R1 係Ser之N端；或經Ser之羥基或胺基取代之(C1 -C20 )醯基； L係選自-NH(CH2 )n NH-、-NH(CH2 )n CH(NH2 )CO-、-OOC(CH2 )m COO-、-NH(CH2 )n CO-、-NH(CH2 CH2 O)n NH-、-NH(CH2 CH2 O)n CO-或-CO(CH2 CH2 O)n CO-之連接子； R2 係Am2 之游離C端、醯胺化C端或N端；或Y-R5 ； Y係選自-OOC(CH2 )m COO-、-CO(CH2 )n NH-、-CO(CH2 CH2 O)n NH-或-COCH2 (OCH2 CH2 )n NH-之可選連接子； R5 係白蛋白結合部分，諸如馬來醯亞胺基丙酸； R3 係OH或NH2 ； R4 係Phe之苯基上之取代基及係選自氫、胺基(C1 -C20 )烷基、-NHCOCH3 或-NHCONH2 ； n係具有選自2至10之值之整數，包括2及10； m係具有選自0至8之值之整數，包括0及8；及 Ser-Asn、Asn-Thr或Thr-Ser之肽鍵(-CONH-)中之一者可經
Figure 02_image181
之經修飾之肽鍵置換， 其中Q係氫、-CO(C1 -C20 )烷基或-COO(C1 -C20 )烷基；其中一或多個或所有胺基酸可為呈D-構型； 或其逆向類似物或醫藥上可接受之立體異構體或醫藥上可接受之鹽。
例如，小分子拮抗劑可選自由以下組成之群：
Figure 02_image183
Figure 02_image185
Figure 02_image187
Figure 02_image189
Figure 02_image191
Figure 02_image193
Figure 02_image195
CTLA-4拮抗劑 在某些實施例中，本文描述之組合亦包括CTLA-4抑制劑。例示性抗CTLA-4抗體包括曲美木單抗(Tremelimumab) (可自Pfizer獲得之IgG2單株抗體，原名托珠單抗(ticilimumab)，CP-675,206)；及伊匹單抗(Ipilimumab) (CTLA-4抗體，亦稱為MDX-010，CAS號477202-00-9)。
用於本文提供之方法中之關於曲美木單抗(或其抗原結合片段)之資訊可參見US 6,682,736(以引用之方式併入) (其中將其稱為11.2.1)，該案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。曲美木單抗(亦稱為CP-675,206、CP-675、CP-675206及托珠單抗)係對CTLA-4具有高度選擇性並阻斷CTLA-4結合至CD80 (B7.1)及CD86 (B7.2)之人類IgG2單株抗體。已顯示導致活體外免疫活化及經曲美木單抗治療之一些病患已顯示腫瘤消退。
用於本文提供之方法中之曲美木單抗包含重鏈及輕鏈或重鏈可變區及輕鏈可變區。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之曲美木單抗或其抗原結合片段包括包含本文上文顯示之胺基酸序列之輕鏈可變區及包含本文上文顯示之胺基酸序列之重鏈可變區。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之曲美木單抗或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含本文上文顯示之Kabat定義之CDR1、CDR2及CDR3序列，及其中該輕鏈可變區包含本文上文顯示之Kabat定義之CDR1、CDR2及CDR3序列。一般技術者將可容易識別Chothia定義、Abm定義或彼等一般技術者已知的其他CDR定義。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之曲美木單抗或其抗原結合片段包含如US 6,682,736中揭示之抗體之可變重鏈及可變輕鏈CDR序列，該案係以全文引用之方式併入本文中。
本發明亦考慮利用CTLA-4之小分子抑制劑，諸如由Huxley等人，2004 Cell Chemical Biology 11:1651-1658描述，其包括下式化合物：
Figure 02_image197
其他小分子CTLA-4拮抗劑包括
Figure 02_image199
在一項實施例中，組合包括免疫-DASH抑制劑、抗PD-1抗體分子(例如，如本文描述)及抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗)。可使用之例示性劑量包括約1至10 mg/kg (例如，3 mg/kg)之抗PD-1抗體分子之劑量，及約3 mg/kg之抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗)之劑量。
其他例示性抗CTLA-4抗體係揭示(例如)於美國專利第5,811,097號中。
在本文描述之方法之一些實施例中，另外治療劑係調節免疫反應之抗體。在一些實施例中，該另外治療劑係抗PD-1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體、抗TIGIT抗體或抗-Siglec-15抗體。
在一些實施例中，LAG3抗體係IMP701、IMP731、BMS-986016、LAG525及GSK2831781。在一些實施例中，該LAG3拮抗劑包括可溶性LAG3受體，例如，IMP321。
在一些實施例中，免疫反應刺激劑係選自由以下組成之群：CD28激動劑、4-1BB激動劑、OX40激動劑、CD27激動劑、CD80激動劑、CD86激動劑、CD40激動劑及GITR激動劑。在一些實施例中，該OX40激動劑包括OX40配體或其OX40結合部分。例如，該OX40激動劑可為MEDI6383。在一些實施例中，該OX40激動劑係特異性結合OX40之抗體。在一些實施例中，結合OX40之抗體係MEDI6469、MEDI0562或MOXR0916 (RG7888)。在一些實施例中，該OX40激動劑係可表現OX40配體之載體(例如，表現載體或病毒，諸如腺病毒)。在一些實施例中，表現OX40之載體係δ-24-RGDOX或DNX2401。
在一些實施例中，4-1BB (CD137)激動劑係結合分子，諸如抗運載蛋白(anticalin)。在一些實施例中，該抗運載蛋白係PRS-343。在一些實施例中，該4-1BB激動劑係特異性結合4-1BB之抗體。在一些實施例中，結合4-1BB之抗體係PF-2566 (PF-05082566)或烏魯單抗(urelumab) (BMS-663513)。
在一些實施例中，CD27激動劑係特異性結合CD27之抗體。在一些實施例中，結合CD27之抗體係瓦利魯瑪單抗(varlilumab) (CDX-1127)。
在一些實施例中，GITR激動劑包含GITR配體或其GITR結合部分。在一些實施例中，該GITR激動劑係特異性結合GITR之抗體。在一些實施例中，結合GITR之抗體係TRX518、MK-4166或INBRX-110。
在某些實施例中，抗CD39抗體係與STING激動劑組合，較佳作為醫藥組合物之一部分。環二核苷酸(CDN)環二AMP(由單核球增多性李氏菌及其他細菌產生)及其類似物環二GMP及環GMP-AMP係由宿主細胞識別為病原體相關分子模式(PAMP)，其等結合至稱為干擾素基因刺激物(STING)之病原體識別受體(PRR)。STING係宿主哺乳動物細胞之細胞質中之轉接蛋白，其活化TANK結合激酶(TBK1)-IRF3及NF-κB傳訊軸，導致IFN-β及強烈活化先天免疫性之其他基因產物之誘導。現知曉STING係宿主胞質監視途徑之組分(Vance等人，2009)，其以胞內病原體感知感染並在反應中誘導IFN-β之產生，導致適應性保護性病原體特異性免疫反應之發展，其由抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞，及病原體特異性抗體構成。美國專利第7,709,458號及第7,592,326號；PCT公開案第WO2007/054279、WO2014/093936、WO2014/179335、WO2014/189805、WO2015/185565、WO2016/096174、WO2016/145102、WO2017/027645、WO2017/027646及WO2017/075477號；及Yan等人，Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008。
例示性組合 在一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與抗腫瘤鉑配位錯合物之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、腦癌及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)順鉑、奧沙利鉑、卡鉑、三硝酸四鉑(BBR3464)、沙鉑、四鉑、奧米鉑、異丙鉑、奈達鉑及洛鉑。特別較佳為抗CD39抗體與順鉑、奧沙利鉑、卡鉑、三硝酸四鉑、沙鉑、四鉑、奧米鉑、異丙鉑、奈達鉑及洛鉑之組合，及甚至更佳為與順鉑及奧沙利鉑之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與抗代謝物之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、食道癌、腦癌、肛門癌、白血病及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於) 5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿糖胞苷、卡培他濱、地西他濱(decitabine)、氟尿苷、氟達拉濱、胺基蝶呤、甲胺蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞(raltitrexed)、克拉屈濱、氯法拉濱(clofarabine)、巰基嘌呤、噴托他汀及硫鳥嘌呤。特別較佳係抗CD39抗體與5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿糖胞苷、卡培他濱、地西他濱、氟尿苷、氟達拉濱、胺基蝶呤、甲胺蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、克拉屈濱、氯法拉濱、巰基嘌呤、噴托他汀及硫鳥嘌呤之組合，及甚至更佳係與5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿糖胞苷及甲胺蝶呤之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、腦癌、白血病及淋巴瘤。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與有絲分裂抑制劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、腦癌、白血病及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)紫杉醇、多西他賽、長春花鹼、長春新鹼、長春地辛及長春瑞濱。特別較佳係抗CD39抗體與紫杉醇、多西他賽、長春花鹼、長春新鹼、長春地辛及長春瑞濱之組合，及甚至更佳係與紫杉醇、多西他賽、長春新鹼及長春瑞濱之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與抗癌抗生素之組合以治療癌症，及更特定言之治療以下之癌症：肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰癌、甲狀腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、神經母細胞瘤、腦癌、肛門癌、睾丸癌、白血病、多發性骨髓瘤及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)道諾黴素、阿黴素、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌、匹沙酮(pixantrone)、戊柔比星(valrubicin)、絲裂黴素C、博來黴素、放線菌素A及光神黴素。特別較佳係抗CD39抗體與道諾黴素、阿黴素、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌、匹沙酮(pixantrone)、戊柔比星、絲裂黴素C、博來黴素，放線菌素D及光神黴素之組合，及甚至更佳係與道諾黴素、阿黴素、絲裂黴素C及放線菌素D之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、腦癌、白血病及淋巴瘤。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與拓撲異構酶I及/或II抑制劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、神經母細胞瘤、腦癌、宮頸癌、睾丸癌、白血病及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)拓撲替康、SN-38、伊立替康、喜樹鹼、魯貝替康、依託泊苷、安吖啶及替尼泊苷。特別較佳係PM00104或其醫藥上可接受之鹽與拓撲替康、SN-38、伊立替康、喜樹鹼、魯貝替康、依託泊苷、安吖啶及替尼泊苷之組合，及甚至更佳係與拓撲替康、伊立替康及依託泊苷之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與蛋白體抑制劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、前列腺癌、胰癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、腦癌、多發性骨髓瘤及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)硼替佐米、雙硫崙、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate)及鹽孢醯胺A (salinosporamide A)。特別較佳係抗CD39抗體與硼替佐米、雙硫崙、表沒食子兒茶素沒食子酸酯及鹽孢醯胺A之組合，及甚至更佳係與硼替佐米之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、前列腺癌、胰癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌及腦癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與組蛋白脫乙醯酶抑制劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、腦癌及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)羅米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、伏立諾他(vorinostat)、莫西司他(mocetinostat)、貝利司他(belinostat)、恩替司他(entinostat)、雷米司他(resminostat)、PCI-24781、AR-42、CUDC-101及丙戊酸。特別較佳係抗CD39抗體與羅米地辛、帕比司他、伏立諾他、莫西司他、貝利司他、恩替司他、雷米司他、PCI-24781、AR-42、CUDC-101及丙戊酸之組合，及甚至更佳係與伏立諾他之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與氮芥烷化劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、白血病、多發性骨髓瘤及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)美法崙、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、環磷醯胺、甲基二(氯乙基)胺、烏拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀及苯達莫司汀(bendamustine)。特別較佳係抗CD39抗體與美法崙、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、環磷醯胺、甲基二(氯乙基)胺、烏拉莫司汀、雌莫司汀及苯達莫司汀之組合，及甚至更佳係與環磷醯胺之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌及腎癌。在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與亞硝基脲烷化劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、多發性骨髓瘤及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)洛莫司汀、司莫司汀(semustine)、卡莫司汀、福莫司汀及鏈佐黴素(streptozotocin)。特別較佳係抗CD39抗體與洛莫司汀、司莫司汀、卡莫司汀、福莫司汀及鏈佐黴素之組合，及甚至更佳係與卡莫司汀之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、卵巢癌及乳癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與非典型烷化劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、胰癌、胃癌、卵巢癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、腦癌、白血病及淋巴瘤。此化學治療劑組包括(但不限於)前卡巴嗪、達卡巴嗪、替莫唑胺(temozolomide)及六甲蜜胺。特別較佳係抗CD39抗體與前卡巴嗪、達卡巴嗪、替莫唑胺及六甲蜜胺之組合，及甚至更佳係與達卡巴嗪及替莫唑胺之組合以治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與雌激素拮抗劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療乳癌。此化學治療劑組包括(但不限於)托瑞米芬、氟維司群、他莫昔芬及萘福昔定(nafoxidine)。特別較佳係抗CD39抗體與托瑞米芬、氟維司群、他莫昔芬及萘福昔定之組合，及甚至更佳係與他莫昔芬之組合以治療乳癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與雄激素拮抗劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療前列腺癌。此化學治療劑組包括(但不限於)比卡魯胺、氟他胺、MDV3100及尼魯米特。特別較佳係抗CD39抗體與比卡魯胺、氟他胺、MDV3100及尼魯米特之組合，及甚至更佳係與氟他胺之組合以治療前列腺癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與mTOR抑制劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。此化學治療劑組包括(但不限於)西羅莫司(sirolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、KU-0063794及WYE-354。特別較佳係抗CD39抗體與西羅莫司、替西羅莫司、依維莫司、地磷莫司、KU-0063794及WYE-354之組合，及甚至更佳係與替西羅莫司之組合以治療肺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、乳癌、結腸直腸癌及腦癌。
在另一較佳實施例中，本發明係關於抗CD39抗體與酪胺酸激酶抑制劑之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。此化學治療劑組包括(但不限於)埃羅替尼、索拉非尼、阿昔替尼(axitinib)、博舒替尼(bosutinib)、西地尼布、克唑替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、吉非替尼、伊馬替尼、卡奈替尼(canertinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來他替尼(lestaurtinib)、來那替尼(neratinib)、尼羅替尼(nilotinib)、司馬沙尼(semaxanib)、舒尼替尼、瓦他拉尼(vatalanib)及凡德他尼。特別較佳係抗CD39抗體與埃羅替尼、索拉非尼、阿昔替尼、博舒替尼、西地尼布、克唑替尼、達沙替尼、吉非替尼、伊馬替尼、卡奈替尼、拉帕替尼、來他替尼、來那替尼、尼羅替尼、司馬沙尼、舒尼替尼、瓦他拉尼及凡德他尼之組合，及甚至更佳係與埃羅替尼之組合以治療癌症，及更特定言之治療選自以下之癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌及腦癌。
本發明包含之另一態樣中係關於上述方法中之任何一者，其進一步包括向病患投與MAP激酶途徑抑制劑或WNT途徑抑制劑。
在一些實施例中，MAP激酶途徑抑制劑係選自由以下組成之群：BRAF抑制劑、MEK抑制劑、PI3K抑制劑及c-KIT抑制劑。
在一些實施例中，BRAF抑制劑係選自由以下組成之群：GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、達拉非尼(dabrafenib)及LGX818。
在一些實施例中，MEK抑制劑係選自由以下組成之群：GSK1120212、司美替尼(selumetinib)及MEK162。
在一些實施例中，WNT途徑抑制劑係β-連環蛋白抑制劑或捲曲蛋白抑制劑(frizzled inhibitor)。
在一些實施例中，β-連環蛋白抑制劑係選自由以下組成之群：氯硝柳胺(niclosamide)、XAV-939、FH 535及ICG 001。
本發明包含之另一態樣係關於上述方法中之任何一者，其進一步包括向病患投與癌症疫苗。在一些實施例中，該癌症疫苗係樹突狀細胞疫苗。
本發明包含之另一態樣係關於上述方法中之任何一者，其進一步包括向病患投與過繼細胞轉移。
在一些實施例中，過繼細胞轉移係CAR-T細胞療法。
本發明包含之另一態樣係關於上述方法中之任何一者，其進一步包括向病患投與抗體療法。
本發明包含之另一態樣係關於上述方法中之任何一者，其中抗CD39抗體之投與增強抗體療法之抗體依賴性細胞介導細胞毒性。
在一些實施例中，抗體療法係選自由以下組成之群：曲妥珠單抗(trastuzamab)、西妥昔單抗、貝伐單抗及利妥昔單抗(rituximab)。
此外，使用抗CD39抗體之治療可包括使用其他生物分子諸如一或多種細胞介素(例如，淋巴因子、介白素、腫瘤壞死因子及/或生長因子)之組合治療或可伴隨腫瘤之手術移除、癌細胞之移除或治療醫師認為必要之任何其他療法。在一些實施例中，另外治療劑係免疫反應刺激劑。
在本文描述之方法之一些實施例中，抗CD39抗體可與選自由以下組成之群之生長因子組合：腎上腺髓素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促紅血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遷移刺激因子、肌生長抑制素(GDF-8)、NGF、神經營養蛋白、PDGF、促血小板生成素、TGF-β、TGF-β、TNF-α、VEGF、P1GF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15及IL-18。
在本文描述之方法之一些實施例中，另外治療劑係免疫反應刺激劑。在一些實施例中，該免疫反應刺激劑係選自由以下組成之群：粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、介白素3 (IL-3)、介白素12 (IL-12)、介白素1 (IL-1)或介白素2 (IL-2)。
投與時間表 在本文描述之方法之某些實施例中，治療涉及投與抗CD39抗體與放射療法之組合。使用抗CD39抗體之治療可在放射療法之前、並行或之後發生。此放射療法之給藥時間表可由熟習醫學從業者確定。
在本文描述之方法之某些實施例中，治療涉及投與抗CD39抗體與抗病毒療法之組合。使用抗CD39抗體之治療可在抗病毒療法之前、並行或之後發生。組合療法中使用之抗病毒藥物將取決於個體感染之病毒。
組合投與可包括共投與，以單一醫藥調配物或使用不同之調配物，或以任何順序但一般於一定時間內之連續投與，使得所有活性劑可同時發揮其等生物活性。
應知曉抗CD39抗體及至少一種另外治療劑之組合可以任何順序或並行投與。在一些實施例中，該抗CD39抗體將向先前已經歷使用第二治療劑之治療之病患投與。在某些其他實施例中，該抗CD39抗體及第二治療劑將大體上同時或並行投與。例如，個體可經給定抗CD39抗體，同時經歷使用第二治療劑(例如，化學療法)之治療過程。在某些實施例中，抗CD39抗體將於使用第二治療劑之治療之1年內投與。在某些替代實施例中，抗CD39抗體將於使用第二治療劑之任何治療之10、8、6、4或2個月內投與。在某些其他實施例中，抗CD39抗體將於使用第二治療劑之任何治療之4、3、2或1週內投與。在一些實施例中，抗CD39抗體將於使用第二治療劑之任何治療之5、4、3、2或1天內投與。應進一步知曉兩種(或更多種)藥劑或治療可於數小時或數分鐘內(即，大體上同時)向個體投與。
就疾病之治療而言，抗CD39抗體之適當劑量取決於待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、疾病之反應性，無論是否出於治療或預防目的投與抗CD39抗體、先前療法、病患之臨床病史等等均在治療醫師之自由裁量權下。該抗CD39抗體可投與一次或經一系列治療持續數天至數月，或直至實現治癒或達成疾病狀態之減輕(例如，腫瘤尺寸之減小)。最佳給藥時間表可自病患體內之藥物積聚之量測值計算且將取決於個別藥劑之相對效能而變化。投與醫師可確定最佳劑量、給藥方法及重複率。在某些實施例中，劑量係0.01 μg至100 mg/kg體重、0.1 μg至100 mg/kg體重、1 μg至100 mg/kg體重、1 mg至100 mg/kg體重、1 mg至80 mg/kg體重、10 mg至100 mg/kg體重、10 mg至75 mg/kg體重或10 mg至50 mg/kg體重。在某些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約0.1 mg至約20 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約0.1 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約0.25 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約0.5 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約1 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約1.5 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約2 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約2.5 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約5 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約7.5 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約10 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約12.5 mg/kg體重。在一些實施例中，該抗CD39抗體之劑量係約15 mg/kg體重。在某些實施例中，該劑量可每天、每週、每月或每年一次或更多次給定。在某些實施例中，該抗CD39抗體係每週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次給定。
在一些實施例中，抗CD39抗體可以初始較高之「負載」劑量，接著一或多個較低劑量投與。在一些實施例中，投與之頻率亦可改變。在一些實施例中，給藥方案可包括投與初始劑量，接著每週一次、每兩週一次、每三週一次或每月一次投與另外劑量(或「維持」劑量)。例如，給藥方案可包括投與初始負載劑量，接著每週投與維持劑量(例如，該初始劑量之一半)。或給藥方案可包括投與初始負載劑量，接著每隔一週投與維持劑量(例如，該初始劑量之一半)。或給藥方案可包括投與三個初始劑量歷時3週，接著每隔一週投與維持劑量(例如，相同量)。
如熟習此項技術者已知，任何治療劑之投與均可導致副作用及/或毒性。在一些實例中，該等副作用及/或毒性係如此嚴重而無法排除在治療有效劑量下投與特定藥劑。在一些實例中，必須停止藥物療法，且可嘗試其他藥劑。然而，相同治療類別中之許多藥劑通常顯示類似副作用及/或毒性，意謂病患不得不停止療法，或若可能，則罹患與該治療劑相關聯之令人不快之副作用。
在一些實施例中，給藥時間表可限於特定數量之投與或「週期」。在一些實施例中，抗CD39抗體係投與3、4、5、6、7、8或更多個週期。例如，該抗CD39抗體係每2週投與6個週期，該抗CD39抗體係每3週投與6個週期，該抗CD39抗體係每2週投與4個週期，該抗CD39抗體係每3週投與4個週期等。給藥時間表可由熟習此項技術者決定及接著修改。
因此，本發明提供向個體投與本文描述之抗CD39抗體之方法，其等包括使用間歇給藥策略來投與一或多種藥劑，此可減少與投與抗CD39抗體、化學治療劑等相關聯之副作用及/或毒性。在一些實施例中，用於治療人類個體之癌症之方法包括向該個體投與治療有效劑量之抗CD39抗體與治療有效劑量之化學治療劑之組合，其中該等藥劑中之一或兩者係根據間歇給藥策略投與。在一些實施例中，該間歇給藥策略包括向個體投與初始劑量之抗CD39抗體，並約每2週一次投與後續劑量之該抗CD39抗體。在一些實施例中，該間歇給藥策略包括向個體投與初始劑量之抗CD39抗體，及約每3週一次投與後續劑量之該抗CD39抗體。在一些實施例中，該間歇給藥策略包括向個體投與初始劑量之抗CD39抗體，及約每4週一次投與後續劑量之該抗CD39抗體。在一些實施例中，該抗CD39抗體係使用間歇給藥策略投與及該化學治療劑係每週投與。
抗感染治療組合 在一實施例中，本發明提供使用抗CD39抗體治療個體之方法，其中該個體罹患病毒感染。在一項實施例中，該病毒感染係經選自由以下組成之群之病毒感染：人類免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、愛潑斯坦巴爾病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、迴聲病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或蟲媒病毒性腦炎病毒。
在一實施例中，本發明提供使用抗CD39抗體治療個體之方法，其中該個體罹患細菌感染。在一項實施例中，該細菌感染係經選自由以下組成之群之細菌感染：衣原體(Chlamydia)、立克次氏菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、黏質沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌(Legionella)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙門氏菌桿菌(Salmonella)、芽孢桿菌(bacilli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、瀰漫型麻風分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)及博氏桿菌(Borriella)。
在一實施例中，本發明提供使用抗CD39抗體治療個體之方法，其中該個體罹患真菌感染。在一項實施例中，該真菌感染係經選自由以下組成之群之真菌感染：念珠菌(Candida) (白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus) (薰煙色麴菌(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴菌屬(Genus Mucorales) (毛黴屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizopus))、申克孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮膚芽孢桿菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。
在一實施例中，本發明提供使用抗CD39抗體治療個體之方法，其中該個體罹患寄生蟲感染。在一項實施例中，該寄生蟲感染係經選自由以下組成之群之寄生蟲感染：溶組織性變形蟲(Entamoeba histolytica)、結腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴蟲(Acanthamoeba)、賈第鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、小巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓形蟲(Toxoplasma gondii)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
VII.抗CD39抗體結合物 本文揭示之抗CD39抗體亦可結合至化學部分。該化學部分可為(尤其)聚合物、放射性核素或細胞毒性因子。
例如，本發明提供結合至治療部分(即，藥物)之抗CD39抗體。該治療部分可為(例如)細胞毒素、化學治療劑、細胞介素、免疫抑制劑、免疫刺激劑、裂解肽或放射性同位素。此等結合物在本文中係稱為「抗體-藥物結合物」或「ADC」。因此，在一項態樣中，根據任何上文描述之態樣或實施例之抗CD39抗體係結合至治療部分。例示性治療部分包括細胞毒性部分、放射性同位素、細胞介素及裂解肽。
在某些實施例中，抗CD39抗體可藉由內化結合至細胞毒性部分或與細胞毒性部分締合之抗體而在CD39表現細胞中誘導細胞毒性。細胞毒性部分可(例如)選自由以下組成之群：紫杉醇；細胞鬆弛素B；短桿菌肽D；溴化乙錠；依米丁(emetine)；絲裂黴素；依託泊苷；腱糖苷(tenoposide)；長春新鹼；長春花鹼；秋水仙鹼；阿黴素；道諾黴素；二羥基蒽醌二酮；微管蛋白抑制劑，諸如美登素或其類似物或衍生物；抗有絲分裂劑，諸如單甲基澳瑞他汀E或F或其類似物或衍生物；朵拉司他汀10或15或其類似物；伊立替康或其類似物；米托蒽醌；光神黴素；放線菌素D；1-脫氫睾酮；糖皮質激素；普魯卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛爾；嘌呤黴素；卡奇黴素或其類似物或衍生物；抗代謝物、諸如甲胺蝶呤、6巰基嘌呤、6硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine)、羥基脲、天冬醯胺酶、吉西他濱或克拉屈濱；烷化劑，諸如甲基二(氯乙基)胺、噻硫磷、苯丁酸氮芥、美法崙、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐黴素、達卡巴嗪(DTIC)、前卡巴嗪、絲裂黴素C；鉑衍生物，諸如順鉑或卡鉑；杜卡黴素A、杜卡黴素SA、雷切黴素(CC-1065)或其類似物或衍生物；抗生素，諸如放線菌素D、博來黴素、道諾黴素、阿黴素、伊達比星、光神黴素、絲裂黴素、米托蒽醌、普卡黴素、蒽黴素(AMC))；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯二氮卓(PDB)；白喉毒素及相關分子，諸如白喉A鏈及其活性片段及雜交分子，蓖麻毒素，諸如蓖麻毒素A或脫糖基化蓖麻毒素A鏈毒素、霍亂毒素、志賀樣毒素，諸如SLT I、SLT II、SLT IIV、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆鮑曼-比爾克(Bowman-Birk)蛋白酶抑制劑、假單胞菌外毒素、阿羅林(alorin)、皂苷(saporin)、蒴蓮根毒素(modeccin)、白素毒素(gelanin)、相思豆毒素A鏈(abrin A chain)、蒴蓮根毒素A鏈(modeccin A chain)、α-八疊球菌(α-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、香石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陸蛋白(Phytolacca americana protein)諸如PAPI、PAPII及PAP-S、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、皂甙抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、白樹毒素(gelonin)、線菌毒素(mitogellin)、局限曲黴素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)及依諾黴素(enomycin)毒素；核糖核酸酶(RNase)；DNase I、葡萄球菌腸毒素A；商陸抗病毒蛋白；白喉菌素毒素；及假單胞菌內毒素。
在一項實施例中，抗CD39抗體係結合至澳瑞他汀或其肽類似物、衍生物或前藥。澳瑞他汀已顯示干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人，(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)及具有抗癌活性(US5663149)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965。例如，澳瑞他汀E可與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應，分別產生AEB及AEVB。其他典型之澳瑞他汀衍生物包括AFP、MMAF (單甲基澳瑞他汀F)及MMAE (單甲基澳瑞他汀E)。合適之澳瑞他汀及澳瑞他汀類似物、衍生物及前藥，及適用於將澳瑞他汀結合至Ab之連接子係描述(例如)於美國專利第5,635,483、5,780,588及6,214,345號及於國際專利申請公開案WO02088172、WO2004010957、WO2005081711、WO2005084390、WO2006132670、WO03026577、WO200700860、WO207011968及WO205082023中。
在另一實施例中，抗CD39抗體係結合至吡咯并[2,1-c][1,4]-苯二氮卓(PDB)或其類似物、衍生物或前藥。合適之PDB及PDB衍生物及相關技術係描述於(例如) Hartley J. A.等人，Cancer Res 2010; 70(17): 6849-6858；Antonow D.等人，Cancer J 2008; 14(3):154-169； Howard P. W.等人，Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466及Sagnou等人，Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18): 2083-2086中。
在另一實施例中，抗CD39抗體係結合至選自由以下組成之群之細胞毒性部分：蒽環黴素、美登素、卡奇黴素、杜卡黴素、雷切黴素(CC-1065)、朵拉司他汀10、朵拉司他汀15、伊立替康、單甲基澳瑞他汀E、單甲基澳瑞他汀F、PDB或任何其類似物、衍生物或前藥。
在一特定實施例中，抗CD39抗體係結合至蒽環黴素或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至美登素或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至卡奇黴素或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至杜卡黴素或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至雷切黴素(CC-1065)或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至朵拉司他汀10或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至朵拉司他汀15或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至單甲基澳瑞他汀E或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至單甲基澳瑞他汀F或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至吡咯并[2,1-c][1,4]-苯二氮卓或其類似物、衍生物或前藥。在另一特定實施例中，抗體係結合至伊立替康或其類似物、衍生物或前藥。
在一項實施例中，本發明包含之抗CD39抗體係結合至核酸或核酸相關分子。在一項此實施例中，結合之核酸係細胞毒性核糖核酸酶(RNase)或脫氧核糖核酸酶(例如，DNase I)、反義核酸、抑制RNA分子(例如，siRNA分子)或免疫刺激核酸(例如，含有免疫刺激CpG基序之DNA分子)。在另一實施例中，本發明包含之CD39特異性抗體係結合至適體或核酶。
在一項實施例中，本發明包含之抗CD39抗體係(例如)作為融合蛋白結合至裂解肽(諸如CLIP、蛙皮素2 (Magainin 2)、蜂毒肽(mellitin)、天蠶素(Cecropin)及P18)。
在一項實施例中，抗CD39抗體係結合至細胞介素，諸如，例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、CD40L、Flt3配體、幹細胞因子、安塞斯汀(ancestim)及TNFα。
在某些實施例中，化學部分係增加抗體或片段在個體體內之半衰期之聚合物。合適之聚合物包括(但不限於)親水性聚合物，其等包括(但不限於)聚乙二醇(PEG) (例如，分子量為2 kDa、5 kDa、10 kDa、12 kDa、20 kDa、30 kDa或40 kDa之PEG)、右旋糖酐及單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人，(1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981)揭示PEG結合之單鏈抗體。Wen等人，(2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553)揭示使抗體與結合至放射性金屬螯合劑(二伸乙基三胺基五乙酸(DTPA))之PEG結合。
抗CD39抗體亦可與諸如99 Tc、90 Y、111 In、32 P、14 C、125 I、3 H、131 I、11 C、15 O、13 N、18 F、35 S、51 Cr、57 To、226 Ra、60 Co、59 Fe、57 Se、152 Eu、67 CU、217 Ci、211 At、212 Pb、47 Sc、109 Pd、234 Th、40 K、157 Gd、55 Mn、52 Tr及56 Fe之標記結合。
抗CD39抗體亦可與螢光或化學發光標記結合，該等螢光或化學發光標記包括螢光團諸如稀土螯合物、螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、異硫氰酸鹽、藻紅素、藻藍素、異藻藍素、鄰苯二甲醛、螢光胺、152 Eu、丹磺醯(dansyl)、傘形酮、螢光素、官腔標記(luminal label)、異腔標記(isoluminal label)、芳族吖啶酯標記、咪唑標記、吖啶鹽標記、草酸酯標記、水母發光蛋白標記、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/親和素、自旋標記及穩定自由基。
可採用用於將本發明包含之抗體及其抗原結合片段結合至各種部分之此項技術中已知的任何方法，包括彼等由Hunter等人，(1962) Nature 144:945；David等人，(1974) Biochemistry 13:1014；Pain等人，(1981) J. Immunol. Meth. 40:219；及Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407之方法。用於結合抗體及片段之方法係習知的且在此項技術中非常熟知。
VIII.醫藥組合物 本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體可調配成組合物，尤其醫藥組合物。此等組合物包含治療或預防有效量之本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體，與合適之載劑(例如，醫藥上可接受之藥劑)混合。通常，本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體在調配成醫藥組合物之前係經充分純化以向動物投與。
用於本發明醫藥組合物中之醫藥上可接受之藥劑包括載劑、賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調味劑及稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填料、增積劑、緩衝液、遞送運載工具、張力劑、助溶劑、潤濕劑、複合劑、緩衝劑、抗菌劑及表面活性劑。
中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合之鹽水係例示性適當之載劑。醫藥組合物可包括抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子表面活性劑，諸如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。同樣以實例說明之，合適之張力增強劑包括鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨醇及類似物。合適之防腐劑包括氯化苄烷胺、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸及類似物。過氧化氫亦可用作防腐劑。合適之助溶劑包括甘油、丙二醇及PEG。合適之複合劑包括咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精。合適之表面活性劑或濕潤劑包括去水山梨醇、聚山梨醇酯諸如聚山梨醇酯80、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、四丁酚醛(tyloxapal)及類似物。緩衝劑可為習知緩衝劑，諸如乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或Tris-HCl。乙酸鹽緩衝劑可為約pH 4至5.5，及Tris緩衝劑可為約pH 7至8.5。另外醫藥藥劑係闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A. R. Gennaro編，Mack出版公司，1990中。
組合物可呈液體形式或呈凍乾或冷凍乾燥形式且可包括一或多種凍乾保護劑、賦形劑、表面活性劑、高分子量結構添加劑及/或增積劑(參見，例如，美國專利6,685,940、6,566,329及6,372,716)。在一項實施例中，包括凍乾保護劑，其係非還原性糖，諸如蔗糖、乳糖或海藻糖。一般包括之凍乾保護劑之量應使得一經復水，所得調配物即為等滲的，儘管高滲或輕度低滲之調配物可亦為合適的。另外，凍乾保護劑之量應足以防止凍乾時不可接受之量之蛋白質之降解及/或積聚。預凍乾調配物中糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)之例示性凍乾保護劑濃度係約10 mM至約400 mM。在另一實施例中，包括表面活性劑，諸如非離子表面活性劑及離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯基醚(例如，Triton)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉荳蔻基-、亞油基-或硬脂基-磺基甜菜鹼；月桂基-、肉荳蔻基-、亞油基-或硬脂基-肌胺酸；亞油基-、肉荳蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基-、椰油醯胺基丙基-、苯乙醯胺基丙基-、肉荳蔻醯胺基丙基-、棕櫚醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如，月桂醯胺基丙基)；肉荳蔻醯胺丙基-、棕櫚醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基-二甲胺；甲基椰油醯牛磺酸鈉或甲基牛磺酸二牛磺酸鈉；及MONAQUAT™.系列(Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇，及乙二醇及丙二醇之共聚物(例如，Pluronics、PF68等)。預凍乾調配物中可能存在之表面活性劑之例示性量係約0.001至0.5%。高分子量結構添加劑(例如，填料、黏合劑)可包括(例如)阿拉伯樹膠、白蛋白、岩藻酸、磷酸鈣(二元酸)、纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、右旋糖酐、糊精、葡萄糖結合劑(dextrate)、蔗糖、填充體(tylose)、預糊化澱粉、硫酸鈣、直鏈澱粉、甘胺酸、膨潤土、麥芽糖、山梨醇、乙基纖維素、磷酸氫二鈉、磷酸二鈉、焦亞硫酸二鈉、聚乙烯醇、明膠、葡萄糖、瓜爾豆膠、液體葡萄糖、可壓縮糖、矽酸鋁鎂、麥芽糖糊精、聚環氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚維酮、岩藻酸鈉、黃蓍膠微晶纖維素、澱粉及玉米蛋白。高分子量結構添加劑之例示性濃度係0.1重量%至10重量%。在其他實施例中，可包括增積劑(例如，甘露醇、甘胺酸)。
組合物可適用於非經腸投與。例示性組合物係適用於藉由技術工可獲得之任何途徑注射或輸注至動物內，諸如關節內、皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內或病變內途徑。非經腸調配物通常將為無菌、無熱原之等滲水溶液，視需要含有醫藥上可接受之防腐劑。
非水溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油，諸如橄欖油及可注射之有機酯，諸如油酸乙酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括液體及營養補充劑、電解質補充劑，諸如彼等基於林格氏右旋糖者及類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及類似物。一般，參見Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack編，1980，其係以引用之方式併入本文中。
本文描述之醫藥組合物可經調配用於以在特定局部環境中提供產品之局部濃度(例如，推注，長效效應)及/或增加之穩定性或半衰期之方式受控或持續遞送。該等組合物可包括本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體與聚合化合物(諸如聚乳酸、聚乙醇酸等)之顆粒製劑，及諸如可生物降解基質、可注射微球、微囊劑顆粒、微囊劑、可生物蝕解之顆粒珠、脂質體及可植入遞送裝置之藥劑之調配物，其等提供活性劑之控釋或緩釋，然後可作為長效注射劑遞送。用於調配此緩釋或控釋遞送方式之技術係已知的且各種聚合物已經研發並將用於藥物之控釋及遞送。此等聚合物通常為可生物降解且可生物相容的。聚合物水凝膠(包括彼等藉由對映體聚合物或多肽片段之錯合形成者)及具有溫度或pH敏感性質之水凝膠可因為捕獲生物活性蛋白藥劑(例如，抗體)涉及之溫和及水性條件而適用於提供藥物長效效應。參見，例如，PCT申請公開案WO 93/15722中用於遞送醫藥組合物之控釋多孔聚合微粒之描述。
適用於此目的之材料包括聚丙交酯(參見，例如，美國專利3,773,919)、聚(α-羥基羧酸)之聚合物，諸如聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988A)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人，Biopolymers, 22: 547-556 (1983))、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯) (Langer等人，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982))、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(~)~3-羥基丁酸。其他可生物降解之聚合物包括聚(內酯)、聚(縮醛)、聚(原酸酯)及聚(原碳酸酯)。緩釋組合物亦可包括脂質體，其等可藉由此項技術中已知的數種方法中之任何一者製備(參見，例如，Eppstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985))。載劑本身或其降解產物在靶組織中應為無毒的且不應進一步加劇病症。此可藉由在標靶失調症之動物模型中或若無法獲得此等模型則在正常動物中進行例行性篩選確定。[00196]用於緩釋之重組蛋白之微囊化已用人類生長激素(rhGH)、干擾素(rhIFN--)、介白素-2及MNrgpl20成功進行。Johnson等人，Nat. Med., 2:795-799 (1996)；Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993)；Hora等人，Bio/Technologv. 8:755-758 (1990)；Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」，in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell及Newman編，(Plenum Press: New York, 1995)，第439至462頁；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399；及美國專利第5,654,010號。此等蛋白質之緩釋調配物由於其生物相容性及廣泛之可生物降解性質而使用聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物進行研發。PLGA之降解產物(乳酸及乙醇酸)可於人體內快速清除。此外，此聚合物之可降解性可取決於其分子量及組成。Lewis，「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」，於：M. Chasin及R. Langer (編)， Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990)，第1至41頁中。緩釋組合物之另外實例包括(例如) EP 58,48 IA、美國專利第3,887,699號、EP 158,277A、加拿大專利第1176565號、U. Sidman等人，Biopolymers 22, 547 [1983]、R. Langer等人，Chem. Tech. 12, 98 [1982]、Sinha等人，J. Control. Release 90, 261 [2003]、Zhu等人，Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000]及Dai等人，Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005]。
生物黏附性聚合物亦經考慮用於本發明包含之組合物中或與本發明包含之組合物一起使用。生物黏附劑係合成及天然生成之材料，其等可長時間黏附至生物受質。例如，Carbopol及聚卡波非(Polycarbophil)均為聚(丙烯酸)之合成交聯衍生物。基於天然生成之物質之生物黏附性遞送系統包括(例如)透明質酸，亦稱為玻尿酸。透明質酸係天然生成之黏多醣，其由D-葡萄醣醛酸及N-乙醯基-D-葡萄糖胺構成。透明質酸係發現於脊椎動物之胞外組織基質中，包括於結締組織，及於滑膜液及於眼之玻璃體及房水中。透明質酸之酯化衍生物已用於產生用於可生物相容及可生物降解之遞送中之微球(參見，例如，Cortivo等人，Biomaterials (1991) 12:727-730；歐洲公開案第517,565號；國際公開案第WO 96/29998號；Ilium等人，J. Controlled ReI. (1994) 29:133-141)。本發明包含之例示性含有透明質酸之組合物以約0.1%至約40% (w/w)結合至透明質酸聚合物之IL-1/3結合抗體或片段之量包含透明質酸酯聚合物。[00198]可生物降解及不可生物降解之聚合物基質均可用於遞送本發明包含之組合物，及此等聚合基質可包含天然或合成聚合物。可生物降解之基質係較佳的。發生釋放之時間週期係基於聚合物之選擇。通常，在數小時至三至十二個月之範圍內之週期內的釋放係最理想的。可用於形成可生物降解之遞送系統之例示性合成聚合物包括：乳酸及乙醇酸之聚合物、聚醯胺、聚碳酸酯、聚伸烷基、聚烷基二醇、聚環氧烷、聚伸烷基對苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙交酯、聚矽氧烷、聚酸酐、聚胺基甲酸酯及其共聚物、聚(丁酸)、聚(戊酸)、烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸及甲基丙烯酸酯之聚合物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥基-丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、羧乙基纖維素、三乙酸纖維素、硫酸纖維素鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚環氧乙烷、聚對苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯及聚乙烯吡咯啶酮。例示性天然聚合物包括岩藻酸鹽及其他多醣，包括右旋糖肝及纖維素、膠原蛋白、其化學衍生物(化學基團之取代、添加，例如，烷基、伸烷基、羥基化、氧化及熟習此項技術者例行作出之其他修飾)、白蛋白及其他親水性蛋白質、玉米蛋白及其他醇溶麩蛋白及疏水性蛋白質、共聚物及其混合物。一般而言，此等材料藉由酶促水解或活體內曝露於水、藉由表面或大塊侵蝕降解。該聚合物視需要係呈水凝膠之形式(參見，例如，WO 04/009664、WO 05/087201，Sawhney等人，Macromolecules, 1993, 26, 581-587)，在水中可吸收其重量之多達約90%，及此外，視需要與多價離子或其他聚合物交聯。
遞送系統亦包括非聚合物系統，其等為脂質，包括固醇(諸如膽固醇、膽固醇酯及脂肪酸)或中性脂肪(諸如單酸-、二酸-及三酸甘油酯)；水凝膠釋放系統；矽橡膠系統；基於肽之系統；蠟塗層；使用習知黏合劑及賦形劑之壓製錠劑；部分融合之植入物；及類似物。特定實例包括(但不限於)：(a)其中以於基質內之形式包含產品之侵蝕系統，諸如彼等美國專利第4,452,775、 4,675,189及5,736,152號中描述者，及(b)其中產品以受控速率自聚合物瀰漫之擴散系統，諸如美國專利第3,854,480、5,133,974及5,407,686號中描述。含有脂質體之產品可藉由已知方法製備，諸如，例如，(DE 3,218,121；Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985)；Hwang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；美國專利申請案83-118008；美國專利第4,485,045及4,544,545號；及EP 102,324)。
或者或另外，組合物可經由植入於其中已吸收或囊封本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體之膜、海綿或其他適當之材料之受影響區內而經局部投與。在使用植入裝置之情況下，該裝置可植入任何合適之組織或器官內，及本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體之遞送可通過該裝置經由推注直接投與，或經由連續投與，或經由使用連續輸注之導管投與。
包含本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體之醫藥組合物可經調配以供吸入，諸如，例如，調配成乾粉。吸入溶液亦可調配於液化推進劑中用於氣霧劑遞送。在又另一調配物中，溶液可經霧化。用於肺部投與之另外醫藥組合物包括彼等描述(例如)於PCT申請公開案WO 94/20069中，其揭示經化學修飾之蛋白質之肺部遞送。就肺部遞送而言，粒度應適用於遞送至遠端肺。例如，粒度可為1 μm至5 μm；然而，例如，若各顆粒均相當多孔，則可使用較大之顆粒。
含有本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體之某些調配物可經口投與。以此方式投與之調配物可與或不與彼等通常用於混合固體劑型(諸如錠劑及膠囊)之載劑一起調配。例如，膠囊可經設計以在生物利用度最大化且全身前降解最小化時在胃腸道之某個點釋放該調配物之活性部分。可包括另外藥劑以促進選擇性結合劑之吸收。亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
另一製劑可涉及有效量之本發明包含之抗CD39抗體、抗體片段、核酸或載體與適用於製造錠劑之無毒賦形劑之混合物。藉由將錠劑溶解於無菌水或另一適當之媒劑中，溶液可以單位劑型製備。合適之賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯樹膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
IX.例示性方法 材料及方法 試劑 除非另有規定，否則所有化學試劑均購買自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)，細胞培養基購買自Life Technologies (Carlsbad, CA)，細胞培養耗材購買自CELLTREAT® Scientific Products (Shirley, MA)，及商業抗體購買自Biolegend (San Diego, CA)。包括Alexa Fluor® 488結合之AffiniPure驢抗人類IgG (Fc特異性) (#709-545-098)及Alexa Fluor® 488結合之抗兔IgG (H+L) (#711-545-152)之二級抗體係獲得自Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA)，CellTiter-Glo® (#G7571)及Bio-Glo™ (#G7941)獲得自Promega (Madison, WI)。2-脫氧-2-氟-L-岩藻糖係購買自BIOSYNTH Carbosynth (#MD06089)及正常人類血清(#A113)購買自Quidel公司(San Diego, CA)。抗人類CD39參考抗體(hCD39 Ref)係由瞬時轉染使用ExpiCHO™表現系統套組(#A29133; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)產生及抗體序列係如公開獲得(Perrot等人，Cell Reports 27:2411-2425 (2019))。hCD39 Ref抗體及吾人完全人類抗CD39單株抗體(Ig39-21)均含有相同之人類IgG1 Fc部分。
hCD39 Ref抗體與此項技術中之抗體共用抗原結合位點。然而，不同於當前實例中使用之Ref抗體，先前技術之抗體係經產生具有經特別設計以具有經消除之ADCC功能之Fc部分(即，經教示特別產生以結合CD39並抑制NTPase活性而無需調用CD39依賴性ADCC細胞殺死)。
細胞培養 將經人類CD39穩定轉染之中國倉鼠卵巢細胞(CHO-hCD39)維持在以10%胎牛血清(FBS)、1%青黴素-鏈黴素補充之F12K中。將經人類B類淋巴母細胞(HCC1739BL，ATCC＃CRL-2334)、Raji細胞(Raji-hCD39neg)及人類CD39穩定轉染之Raji細胞(Raji-hCD39hi)培養於以10% FBS、1%青黴素-鏈黴素補充之RPMI 1640中。使人類黑色素瘤細胞(SK-MEL-28，ATCC＃HTB-72)在EMEM加10% FBS、1%青黴素-鏈黴素中生長。在具有IL-2 (10 ng/ml)之MEM-α培養基中培養人類自然殺死細胞(NK-92-CD16 V/V) (ATCC #PTA-6967)。使人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，單供體，EGM™-2 (Lonza #C2517A, Basel, Switzerland)在EGM™內皮細胞生長培養基套裝(Lonza #CC-3124)中生長。將所有細胞系維持在培養瓶中在37℃下在5% CO2 氣氛中在100%濕度下，除Jurkat細胞/NFAT-luc+FcγRIIIA (Promega Cat#: G7011)在用於實驗前在水浴中在37℃下解凍。
完全人類抗CD39抗體之產生及無岩藻糖基化 在缺乏(Ig39-21 WT)或存在岩藻糖基化抑制劑2-脫氧-2-氟-L-岩藻糖(Ig39-21 AF)之情況下，完全人類抗CD39抗體Ig39-21係藉由使用FreeStyle™ 293-F細胞(Thermo Fisher Scientific＃R79007)瞬時轉染產生。最佳化Ig39-21 (識別為純系NP501-BK)係由經穩定轉染之CHO細胞產生。
對表現人類CD39之細胞系之單株抗體親和力 將CHO-hCD39細胞或HCC1739BL細胞(內源性表現高程度之hCD39) (1X105 個細胞)以經連續稀釋之單株抗體在4℃下培養30分鐘。在用細胞染色緩衝劑清洗兩次後，細胞以抗人類IgG (Fc特異性) Alexa Fluor® 488 (1:5000)在4℃下培養30分鐘。然後細胞用細胞染色緩衝劑清洗兩次並藉由Cytek™ Aurora流式細胞分析技術(Cytek Biosciences, Fremont, CA)分析。偵測Alexa Fluor® 488中值螢光強度(MFI)並藉由FCS Express 7軟體(De Novo Software，Los Angeles, CA)分析資料。
人類CD39酶活性對完整細胞之抑制 用胰蛋白酶消化CHO-hCD39細胞(8X104 個細胞/孔)，計數並接種於96孔盤U底部內，接著用經改良之林格緩衝劑(RB) (120 mM NaCl、5 mM KCl、 2.5 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、25 mM NaHCO3、10 mM葡萄糖、80 mM Tris-HCl，pH 7.4)清洗兩次並以單株抗體在37℃下培養30分鐘。然後在室溫下將CHO-hCD39細胞曝露於ATP (250 µM)，歷時15分鐘。最後將上清液收集至96孔不透明壁多孔盤(BRAND盤＃781968)並藉由發光使用CellTiter-Glo®偵測ATP濃度。發光值係在Synergy™ Neo2多模式讀數器(BioTeK Instruments Inc., Winooski, VT)上讀數，其等係與ATP濃度直接相關。無抗體之細胞(細胞+ ATP)或ATP單獨在缺乏細胞之情況下充當對照。結果表示為由以下計算之酶活性抑制之%：[(細胞+ ATP + Ab) - (細胞+ ATP)/(ATP) - (細胞+ ATP)] X 100。所有步驟均以RB進行。
NK細胞介導抗體依賴性細胞毒性(NK細胞毒性分析) 靶細胞(表現hCD39)用CFSE (0.025 µM)在37℃下在水浴中預先標記5分鐘。在用1X PBS清洗兩次後，將細胞在含有4%超低IgG FBS (Thermo Fisher Scientific #A3381901)之MEM-α培養基(Thermo Fisher Scientific＃32561037)中在有或無單株抗體之情況下在5% CO2 中培養30分鐘。然後，靶細胞用NK-92-CD16 V/V效應細胞以不同比例在37℃下在5% CO2 中共培養6小時。培養後，在室溫下用碘化丙啶(P/I) (200 ng/mL)將細胞染色10分鐘及藉由Cytek™ Aurora流式細胞分析技術(Cytek Biosciences)分析靶細胞死亡。結果表示為CFSE+ P/I+ 細胞之%或細胞毒性之%。
NFAT螢光素酶報導Jurkat系統(ADCC分析) 將結合之靶細胞(內源性表現中間濃度之hCD39之SK-MEL-28黑色素瘤細胞或內源性表現低濃度之hCD39之HUVEC細胞)接種於96孔盤(8X103 個細胞/100 µl/孔)中(BRAND盤＃781965)並生長24小時，同時剛好在實驗前(5X105 個細胞/ml)接種懸浮靶細胞(HCC1739BL)。然後，細胞用ADCC分析緩衝劑(以4%超低IgG血清補充之DMEM或RPMI 1640培養基)清洗兩次，並在37℃下用經連續稀釋之單株抗體培養30分鐘。然後，將效應細胞(Jurkat細胞/NFAT-luc+FcγRIIIA) (3X106 個細胞/ml)添加至孔並在37℃下將混合物(E:T=1:6)培養6小時。最後將Bio-Glo™添加至孔內並使用Synergy™ Neo2多模式讀數器(BioTeK Instruments Inc.)讀取在5、15及30分鐘時的發光值。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加指示。
補體依賴性細胞毒性(CDC)分析 過表現人類CD39細胞之標靶Raji細胞(Raji-CD39hi)用無血清RPMI 1640培養基清洗兩次，在2X106 /ml之最終濃度下重懸浮於CDC分析緩衝劑(具有4%超低IgG FBS之RPMI 1640培養基)中及在冰上靜置2至3小時。然後，細胞用經連續稀釋之單株抗體在37°C下在5% CO2 中培養30分鐘。然後，將正常之人類血清(NHS 10%)添加至細胞並在37°C下在5% CO2 中培養2小時。培養後，在室溫下用碘化丙啶(P/I)(200 ng/mL)將細胞染色10分鐘及藉由Cytek™ Aurora流式細胞分析技術(Cytek Biosciences)分析標靶細胞死亡。結果表示為細胞毒性之% (P/I+ 細胞)。
抗原決定基競爭分析 抗原決定基競爭基質-I (圖27)：使用抗體標記套組根據製造商之說明書(Thermo Fisher Scientific #A20186)使抗人類CD39單株抗體(純系8C11、8D8、8E9、9B6和Ig39-21 WT)與Alexa Fluor® 647結合。小鼠抗人類CD39純系A1-PE係購買自Biolegend (#328208)。在4°C下用HCC1739BL細胞(1X105 個細胞)將未結合之人類IgG1同型Ultra-LEAF抗體(Biolegend #403502)或抗人類CD39單株抗體(10 µg/mL)培養30分鐘。接著，將結合Alexa Fluor® 647(1 µg/mL)或結合PE (0.25 μg/ mL)之抗人類CD39單株抗體添加至各孔並在4°C下培養30分鐘。然後，細胞用細胞染色緩衝劑清洗兩次並藉由Cytek™ Aurora流式細胞分析技術分析。偵測Alexa Fluor® 647 (AF647)或PE中值螢光強度(MFI)並藉由FCS Express 7軟體(De Novo Software)分析資料。計算AF647或PE MFI偵測相對於同型對照之倍數變化(無抗原決定基重疊= 1)。
抗原決定基競爭基質-II (圖28)：在4℃下用HCC1739BL細胞(1X105 個細胞)將未結合之人類IgG1同型對照或hCD39 Ref單株抗體(10 µg/mL)培養30分鐘。接著，將兔或人類/兔嵌合純系(1 µg/mL)添加至各孔並在4℃下培養30分鐘。然後，細胞用細胞染色緩衝劑清洗兩次並用結合Alexa Fluor® 488之抗兔IgG (H+L) (1:5000)在4°C下染色30分鐘。細胞用細胞染色緩衝劑再次清洗兩次並藉由Cytek™ Aurora流式細胞分析技術分析。偵測Alexa Fluor® 488 (AF488) MFI，並藉由FCS Express 7軟體(De Novo Software)分析資料。計算AF488 MFI偵測相對於同型對照之倍數變化(無抗原決定基重疊= 1)。
構型抗原決定基圖譜分析 此係使用Pepscan之專有CLIPS技術(Lelystad, The Netherlands)進行。抗原決定基圖譜分析之結果係使用由史威史模型(Swiss-model)使用模板PDB條目3ZX3.pdb建立之同源模型可視化。
穩定之免疫複合物分析 用抗人類CD39抗體(2 µg/ml)培養HCC1739BL細胞(5X105 個細胞/mL)或在37℃下在5% CO2 中保持未經處理24小時。第二天，使未經處理之細胞曝露於相同組之單株抗體(2 µg/ml)，但在4℃下20分鐘，以獲得基礎程度之CD39表現。然後，細胞用細胞染色緩衝劑清洗兩次並用抗人類IgG (Fc特異性) Alexa Fluor® 488 (1:2000)在4℃下染色30分鐘，接著兩次另外之清洗，並在室溫下用低聚甲醛(PFA，2%)固定10分鐘。最後，將細胞清洗兩次並藉由Cytek™ Aurora流式細胞分析技術(Cytek Biosciences)分析。偵測Alexa Fluor® 488 (AF488) MFI，並藉由FCS Express 7軟體(De Novo Software)分析資料。在24小時後，細胞膜上人類CD39損失之百分率計算為：[(20 min MFI - 24 h MFI/20 min MFI)] X100。
自腫瘤及脾純化淋巴細胞 在研究終止時切除來自荷瘤小鼠之脾及腫瘤。來自脾之單細胞懸浮液係藉由通過70 µM細胞過濾器機械嚙合脾，接著紅細胞裂解(#555899; BD Biosciences, San Jose, CA)獲得。腫瘤浸潤淋巴細胞係藉由使用小鼠腫瘤分離套組(#130-096-730)在gentleMACSTM 分離器(#130-096-427)上遵循製造商之說明書(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)消化腫瘤獲得。免疫分型係使用Cytek™ Aurora流式細胞分析技術進行。偵測抗體列舉於表1中。
動物研究 免疫活性同基因小鼠模型：其中小鼠CD39之胞外域係經人類對應物置換之C57BL6 hCD39 KI小鼠已自Beth Israel Deaconess醫學中心獲得許可。使用六至八週齡雌性小鼠進行腫瘤接種。將同基因鼠科MC38結腸直腸癌細胞維持在以10% FBS、青黴素(100單位/mL)及鏈黴素(100 μg/mL)補充之RPMI 1640培養基中。1X105 個MC38細胞係藉由胰蛋白酶消化收穫，並用以10% FBS補充之150 μl RPMI 1640重懸浮用於注射。將MC38細胞皮下注射至小鼠之右側面內。然後將小鼠隨機分為三組(每組n = 5)。在第8、11、14及17天，荷瘤小鼠經由i.p.接受5 mg/kg人類IgG1同型對照抗體(KLH-hIgG1)或完全人類抗CD39單株抗體(Ig39-21 AF或NP501-BK)。
異種移植腫瘤模型：純合之無胸腺裸小鼠(#002019; NU/J)係購買自The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)。使用五週齡雌性小鼠進行腫瘤接種。SK-MEL-28異種移植物係藉由將懸浮於與BD Matrigel基質高濃度(BD Biosciences #354262) 1:1混合之200 μl EMEM中之4X106 個SK-MEL-28細胞s.c.注射至小鼠之右側面內製備。當腫瘤達到約500 mm3 之平均體積(視為治療之第0天)，將小鼠隨機分為兩組(每組n = 6至7)，並在第0及第3天經由i.p.用兩個劑量之300 μl鹽水或10 mg/kg NP501-BK處理。
腫瘤長度(L)及寬度(W)係使用數位卡尺每週兩次量測。腫瘤體積(mm3 )測定為L*W*W*0.52。
統計分析 統計分析係使用GraphPad Prism 8 (GraphPad Software，San Diego, CA)進行。 表1：偵測抗體
名稱 供應商/Cat# 濃度/稀釋
AffiniPure驢抗人類IgG (Fc特異性) Alexa Fluor® 488 Jackson ImmunoResearch #709-545-098 1:2000至1:5000
AffiniPure驢抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor® 488 Jackson ImmunoResearch #711-545-152 1:5000
小鼠抗人類CD39純系A1-PE Biolegend #328208 0.25 µg/mL
Zombie NIR Biolegend #423106 1:20,000
CD11b-AF700 Biolegend #101222 1:400
CD45-BV510 Biolegend #103138 1:400
F4/80-PE Cy7 Biolegend #123114 1:400
CD3-PE Cy5 BD Biosciences #555276 1:200
Gr-1-BV480 BD Biosciences #746614 1:800
兔抗人類CD39純系8C11 Alexa Fluor® 647 Purinomia Biotech Inc. 1至2 µg/mL
人類/兔抗人類CD39純系8D8 Alexa Fluor® 647 Purinomia Biotech Inc. 1 µg/mL
兔抗人類CD39純系8E9 Alexa Fluor® 647 Purinomia Biotech Inc. 1 µg/mL
人類/兔抗人類CD39純系9B6 Alexa Fluor® 647 Purinomia Biotech Inc. 1 µg/mL
人類抗人類CD39純系Ig39-21 Alexa Fluor® 647 Purinomia Biotech Inc. 1 µg/mL
參考併入 本文提及之所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中，該併入程度就如同各個別公開案、專利或專利申請案均經指示以參考之方式明確且個別地併入一樣。在衝突之情況下，以本申請案(包括本文之任何定義)為準。
亦以全文引用之方式併入本文中的是以與公共資料庫中之條目相關之登錄號為參考之任何多核苷酸及多肽序列，諸如彼等由基因研究所(TIGR)於萬維網及/或美國國家生物技術資訊中心(NCBI)於萬維網維護者。
等同物及範圍 本發明包含之一或多個實施例之細節係闡述於上文描述中。儘管上文已描述較佳材料及方法，但與彼等本文描述者類似或等同之任何材料及方法可用於本發明包含之實施例之實務或測試中。與本發明相關之其他特徵、目標及優勢自描述係顯而易見的。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域中之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。在衝突之情況下，將以上文提供之實施方式為準。
熟習此項技術者將知曉或可確定使用不超過例行實驗，本文描述之本發明包含之特定實施例之許多等同物。本發明包含之範圍無意限於本文提供之描述且此等等同物係意欲涵蓋所隨附之申請專利範圍。
除非經指示相反或另外自內文明顯看出，否則本文使用之冠詞「一」及「一個」係指該冠詞之語法目標中之一或多於一者(即，指至少一者)。以實例說明之，「一個元件」意謂一個元件或多於一個元件。除非經指示相反或另外自內文明顯看出，否則若組成員中之一者、多於一者或所有係存在於、採用於給定產品或方法中或另外與其相關，則將組之一或多個成員間包括「或」之申請專利範圍或實施方式視為滿足。本發明包括其中該組中恰好一個成員存在於、採用於給定產品或方法中或另外與其相關之實施例。本發明亦包括其中多於一個或整個組成員均存在於、採用於給定產品或方法中或另外與其相關之實施例。
亦應注意術語「包含」意欲為開放的及允許但不要求包括另外之元件或步驟。當本文使用術語「包含」時，因此亦包含及揭示術語「由...構成」。
在給定範圍之情況下，包括端點。此外，應瞭解除非另有指示或另外自內文及此項技術中之一般技術者之瞭解明顯看出，否則表示為範圍之值可假定於本發明包含之不同實施例中之規定範圍內之任何特定值或子範圍，除非內文另有明確指示，否則確定至該範圍之下限單位之十分之一。
另外，應瞭解落於先前技術中之本發明包含之任何特定實施例可自申請專利範圍中之任何一者或多者明確排除。由於認為此等實施例為一般技術者已知，因此即使本文中未明確闡述排除亦可將其等排除。無論是否與先前技術之存在相關，本發明包含之組合物之任何特定實施例(例如，任何抗生素、治療或活性成分；任何產生方法；任何使用方法；等等)可出於任何原因而自任何一項或多項申請專利範圍排除。
應瞭解已使用之詞語係描述性而非限制性詞語，且可於隨附申請專利範圍之範圍內作出改變，而不背離本發明在其更廣泛態樣中包含之真實範圍及精神。
儘管關於數個本文描述之實施例已在一定長度及以一定特徵描述本發明，但無意將其限制於任何此等細節或實施例或任何特定實施例，而應參考隨附申請專利範圍解釋，以便於鑑於先前技術，提供此等申請專利範圍之最廣泛之可能解釋，及因此有效包含本發明包含之預期範圍。
圖1：藉由流式細胞分析技術使用人類CD39hi人類B類淋巴母細胞(HCC1739BL)細胞量測之Ig39-21之親和力。藉由瞬時轉染產生之吾人完全人類抗CD39抗體純系Ig39-21係如指示連續稀釋，並在4℃下用HCC1739BL細胞培養30分鐘，接著流式細胞分析技術分析。Kd經計算為0.412 nM。
圖2：Ig39-21證實針對HCC1739BL細胞之ADCC活性：Luc-報導子分析。使用HCC1739BL細胞作為靶細胞。使用穩定表現螢光素酶及hCD16a-158V之Jurkat細胞作為效應細胞。在37℃下於5% CO2 中用如指示經連續稀釋之Ig39-21將靶細胞預培養30分鐘，接著用效應細胞(T:E=1:6)共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加指示。RLU：相對發光單位。EC50經計算為0.014 µg/mL。
圖3：Ig39-21證實針對人類CD39hi Raji細胞之ADCC活性選擇性：Luc-報導子分析。使用具有不同人類CD39表現程度之各種Raji細胞系(包括Raji細胞(Raji-hCD39neg))、高度表現人類CD39之經hCD39轉染之Raji細胞(Raji-hCD39hi)或表現低程度之人類CD39之經hCD39轉染之Raji細胞(Raji-hCD39lo)作為靶細胞。使用穩定表現螢光素酶及hCD16a-158V之Jurkat細胞作為效應細胞。在37℃下在5% CO2 中用如指示經連續稀釋之Ig39-21將靶細胞預培養30分鐘，接著用效應細胞(T:E=1:6)共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加(RLU)指示。RLU：相對發光單位。
圖4：Ig39-21針對CD39低正常內皮細胞(HUVEC)不發揮ADCC活性。使用人類黑色素瘤細胞(SK-MEL-28)及人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)作為靶細胞。使用穩定表現螢光素酶及hCD16a-158V之Jurkat細胞作為效應細胞。在37℃下在5% CO2 中用如指示經連續稀釋之Ig39-21將靶細胞預培養30分鐘，接著用效應細胞(T:E=1:6)共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加指示。RLU：相對發光單位。此資料指示Ig39-21之安全性，其避免潛在全身性副作用。
圖5：CD39賦予標靶Raji-hCD39hi細胞對NK細胞毒性之抗性。使用經CFSE標記之Raji-hCD39neg或Raji-hCD39hi細胞作為靶細胞，並在37℃下在5% CO2 中以不同比例(如指示)用NK-92-CD16 V/V效應細胞共培養6小時。然後由碘化丙啶(P/I)攝取藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡。結果表示為CFSE+ P/I+ 細胞之%。
圖6：Ig39-21增強針對Raji-hCD39hi細胞之NK細胞毒性。在37℃下在5% CO2 中用或不用Ig39-21抗體(10 µg/mL)將經CFSE標記之Raji-hCD39hi靶細胞培養30分鐘，接著在37℃下以不同比例(如指示)用NK-92-CD16 V/V效應細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡，及計算CFSE+ P/I+ 細胞之%。
圖7：Ig39-21加強針對hCD39hi人類B類淋巴母細胞(HCC1739BL)細胞之NK細胞毒性。在37℃下在5% CO2 中用或不用Ig39-21抗體(10 µg/mL)將經CFSE標記之HCC1739BL靶細胞培養30分鐘，接著在37℃下以不同比例(如指示)用NK-92-CD16 V/V效應細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡，及計算CFSE+ P/I+ 細胞之%。
圖8：無岩藻糖基化增強針對HCC1739BL細胞之Ig39-21介導ADCC：Luc-報導子分析。在缺乏(Ig39-21 WT)或存在岩藻糖基化抑制劑(Ig39-21 AF)之情況下，在37℃下用藉由瞬時轉染產生之經連續稀釋之Ig39-21將HCC1739BL靶細胞預培養30分鐘，及用Jurkat效應細胞(T:E=1:6)進一步共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加指示。RLU：相對發光單位。EC50經計算為0.02 µg/mL (Ig39-21 WT)及0.0008 µg/mL(Ig39-21 AF)
圖9：無岩藻糖基化增強針對HCC1739BL細胞之Ig39-21介導ADCC：NK細胞毒性分析。在37℃下在5% CO2 中用如指示經連續稀釋之Ig39-21 WT或Ig39-21 AF將經CFSE標記之HCC1739BL靶細胞培養30分鐘。然後在37℃下用NK-92-CD16 V/V效應細胞(E:T =1:8)將細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡，及計算CFSE+ P/I+ 細胞之% (細胞毒性之%)。EC50經計算為0.04 µg/mL (Ig39-21 WT)及0.0006 µg/mL(Ig39-21 AF)。
圖10：最佳化Ig39-21 (NP501-BK)、Ig39-21 WT及Ig39-21 AF使用人類CD39陽性CHO細胞(CHO-hCD39)顯示類似結合親和力。Ig39-21 WT、Ig39-21 AF或NP501-BK (藉由使用經穩定轉染之細胞產生，Ig39-21之最佳化版本)係如指示連續稀釋並在4℃下用CHO-hCD39細胞培養30分鐘。然後，在4℃下用二級抗體(抗人類IgG (Fc特異性)，Alexa Fluor® 488)將細胞染色30分鐘並藉由流式細胞分析技術分析。平行使用人類IgG1同型對照抗體(KLH-hIgG1)。Kd經計算為0.48 nM (NP501-BK)、0.52 nM (Ig39-21 WT)及0.51 nM (Ig39-21AF)。
圖11：NP501-BK、Ig39-21 WT及Ig39-21 AF使用表現CD39之HCC1739BL細胞顯示類似結合親和力。Ig39-21 WT、Ig39-21 AF或NP501-BK係如指示連續稀釋並在4℃下用HCC1739BL細胞培養30分鐘。然後，在4℃下用二級抗體(抗人類IgG (Fc特異性抗體) Alexa Fluor® 488)將細胞染色30分鐘並藉由流式細胞分析技術分析。平行使用人類IgG1同型對照抗體(KLH-hIgG1)。Kd經計算為0.16 nM (NP501-BK)、0.29 nM (Ig39-21 WT)及0.35 nM (Ig39-21 AF)。
圖12：最佳化Ig39-21 (NP501-BK)及無岩藻糖基化Ig39-21發揮類似ADCC活性：使用HCC1739BL細胞之Luc-報導子分析。在37℃下用經連續稀釋之人類IgG1同型對照抗體(KLH-hIgG1)或完全人類抗CD39單株抗體(Ig39-21 AF或NP501-BK)將HCC1739BL靶細胞預培養30分鐘並用Jurkat效應細胞(T:E=1:6)進一步共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加指示。RLU：相對發光單位。EC50經計算為0.0017 µg/mL (NP501-BK)及0.00086 µg/mL (Ig39-21 AF)。
圖13：NP501-BK及Ig39-21 AF發揮比Ig39-21 WT遠遠更高之ADCC活性：針對HCC1739BL細胞之NK細胞毒性。在37℃下在5% CO2 中用如指示經連續稀釋之人類IgG1同型對照抗體(KLH-hIgG1)或完全人類抗CD39單株抗體(Ig39-21 WT、 Ig39-21 AF或NP501-BK)將經CFSE標記之HCC1739BL靶細胞培養30分鐘。然後在37℃下用NK-92-CD16 V/V效應細胞(E:T =1:8)將細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡並計算CFSE+ P/I+ 細胞之% (細胞毒性之%)。EC50經計算為1.58E-04 µg/mL (NP501-BK)、4.22E-03 µg/mL (Ig39-21 WT)及4.75E-05 µg/mL (Ig39-21 AF)。
圖14：完全人類抗CD39抗體針對Raji-hCD39hi細胞顯示類似CDC活性。在37℃下用經連續稀釋之人類IgG1同型對照(KLH-hIgG1)或完全人類抗CD39單株抗體(Ig39-21 WT、Ig39-21 AF或NP501-BK)將Raji-hCD39hi靶細胞預培養30分鐘並進一步曝露於10%正常人類血清(NHS)歷時2小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞裂解並計算% P/I+ 細胞(細胞毒性之%)。EC50經計算為0.31 µg/mL (NP501-BK)、0.38 µg/mL (Ig39-21 WT)及0.25 µg/mL (Ig39-21 AF)。
圖15：NP501-BK及Ig39-21 AF活體內發揮類似抗腫瘤效用。在腫瘤攻擊後第8、11、14及17天，皮下植入MC38細胞之C57BL6人類化CD39小鼠(hCD39 KI)係用5 mg/kg人類IgG1同型對照抗體(KLH-hIgG1)或完全人類抗CD39單株抗體(Ig39-21 AF或NP501-BK)治療。每週兩次使用數位卡尺量測腫瘤長度(L)及寬度(W)。腫瘤體積(mm3 )係測定為L*W*W*0.52。每組n = 5。
圖16：NP501-BK治療導致CD39hi腫瘤浸潤淋巴細胞上hCD39表現之減少。在腫瘤接種後第8、11及14天，MC38荷瘤hCD39 KI小鼠係以三個劑量之KLH-hIgG1 (5 mg/kg)或NP501-BK (5 mg/kg)治療。在第15天，脾細胞及腫瘤浸潤淋巴細胞係自此等小鼠純化，用指示之細胞表面標誌物染色，並藉由如材料及方法中描述之流式細胞分析技術分析。每組n = 6至8。
圖17：NP501-BK在CD39+ SK-MEL-28異種移植模型中發揮抗腫瘤活性。使用皮下植入SK-MEL-28異種移植物之NU/J裸小鼠以評估NP501-BK之活體內效用。當腫瘤達到約500 mm3 之平均體積時(視為治療之第0天)，在第0天及第3天經由i.p.用兩個劑量之300 μl鹽水或10 mg/kg NP501-BK治療小鼠。每三天使用數位卡尺量測腫瘤長度(L)及寬度(W)。腫瘤體積(mm3 )係測定為L*W*W*0.52。每組n = 6至7。
圖18： 18種人類/兔嵌合抗人類CD39單株抗體相對參考抗hCD39單株抗體純系A1對HCC1739BL細胞之抗原決定基競爭分析。在4℃下用一組18種抗hCD39單株抗體(人類/兔嵌合純系；未結合，2 µg/ml)將HCC1739BL細胞培養30分鐘。然後將細胞清洗兩次並在4℃下用與PE結合之小鼠抗hCD39單株抗體純系A1染色30分鐘，接著流式細胞分析技術分析。使用無嵌合抗體培養之細胞作為對照。
圖19：人類/兔嵌合純系9B6及Ig39-21發揮類似ADCC活性：使用HCC1739BL細胞之Luc-報導子分析。使用HCC1739BL細胞作為靶細胞。使用穩定表現螢光素酶及hCD16a-158V之Jurkat細胞作為效應細胞。在37℃下用經連續稀釋之Ig39-21 WT或人類/兔嵌合純系9B6 (Hu/Ra 9B6；在所有嵌合純系中，以具有最高ADCC活性之人類IgG1 Fc嵌合之兔抗hCD39單株抗體)將靶細胞預培養30分鐘及用Jurkat效應細胞(T:E=1:6)進一步共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景(RLU)之增加指示。RLU：相對發光單位。EC50經計算為0.014 µg/mL (Ig39-21 WT)及0.022 µg/mL (Hu/Ra 9B6)。
圖20：18種人類/兔嵌合抗體之ADCC活性：使用HCC1739BL細胞之Luc-報導子分析。使用HCC1739BL細胞作為靶細胞。使用穩定表現螢光素酶及hCD16a-158V之Jurkat細胞作為效應細胞。如上文描述，針對ADCC活性檢查一組18種人類/兔嵌合抗體。簡而言之，在37℃下用經連續稀釋之抗體將靶細胞預培養30分鐘及用Jurkat效應細胞(T:E=1:6)進一步共培養6小時。ADCC活性係由螢光素酶活性超過背景之增加(RLU)指示。RLU：相對發光單位。18種純系中有10種顯示陽性ADCC活性。
圖21：具有高ADCC活性之人類/兔嵌合抗體：使用HCC1739BL細胞之Luc-報導子分析。Luc-報導子ADCC分析係如圖20中上文描述進行。匯總具有高ADCC活性之六種純系。六種純系中有五種(除65H5外)不與純系A1之抗原決定基競爭(參見圖18)。
圖22：具有低ADCC活性之人類/兔嵌合純系：使用HCC1739BL細胞之Luc-報導子分析。Luc-報導子ADCC分析係如圖20中上文描述進行。匯總具有低ADCC活性之四種純系，其等均與純系A1之抗原決定基競爭(參見圖18)。9B6充當陽性對照。
圖23：無ADCC活性之人類/兔嵌合抗體：使用HCC1739BL細胞之Luc-報導子分析。Luc-報導子ADCC分析係如圖20中上文描述進行。匯總無ADCC活性之八種純系，其等均與純系A1之抗原決定基完全競爭(見圖18)。9B6充當陽性對照。
圖24：選擇人類/兔嵌合抗體針對HCC1739BL細胞之NK細胞毒性。在37℃下在5% CO2 中用如指示經連續稀釋之人類/兔嵌合純系將經CFSE標記之HCC1739BL靶細胞培養30分鐘。然後，在37℃用NK-92-CD16 V/V效應細胞(E:T =1:8)將細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡並計算CFSE+ P/I+ 細胞之% (細胞毒性之%)。列舉經計算之EC50。超過背景之最大細胞毒性之%係經測定為：就各純系而言，在1 µg/mL下之最大細胞毒性之%-各純系之背景細胞毒性之% (在10-4 µg/mL下)。來自luc-報導子高ADCC組之例示性嵌合純系(8C11、8D8、9B6、9C10、48F10及65H5)顯示高NK殺死活性。相反，來自luc-報導子ADCC陰性組之嵌合純系(59B6、60D9、62G12及62H10)顯示低NK殺死活性。
圖25：參考抗人類CD39單株抗體(hCD39 Ref)抑制CHO細胞膜上之hCD39 ATPase活性。在37℃下用10 µg/mL人類IgG1同型Ultra-LEAF抗體或抗hCD39 Ref抗體(hCD39 Ref)將CHO-hCD39細胞培養30分鐘，接著在室溫下用ATP (250 µM)培養15分鐘。然後收集上清液，並藉由發光使用CellTiter-Glo®偵測ATP濃度。亦平行偵測無抗體之細胞(細胞+ ATP)或ATP單獨在缺乏細胞之情況下以計算如材料及方法中描述之酶活性抑制之%。
圖26：含有相同人類IgG1 Fc部分之參考抗體(hCD39 Ref)及Ig39-21 WT發揮類似ADCC活性：針對HCC1739BL細胞之NK細胞毒性。在37℃下在5% CO2 中用如指示經連續稀釋之抗hCD39單株抗體(hCD39 Ref、NP501-BK、Ig39-21 WT或Ig39-21 AF)將經CFSE標記之HCC1739BL靶細胞培養30分鐘。然後，在37℃下用NK-92-CD16 V/V效應細胞(E:T =1:8)將細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡並計算CFSE+ P/I+ 細胞之% (細胞毒性之%)。EC50經計算為2.62E-03 µg/mL (hCD39 Ref)、5.14E-05 µg/mL (NP501-BK)、1.98E-03 µg/mL (Ig39-21 WT)及7.94E-06 µg/mL (Ig39-21 AF)。
圖27：於HCC1739BL細胞上抗原決定基競爭基質-I相對抗hCD39參考抗體(hCD39 Ref)。在4℃下用10 µg/ml未結合之人類IgG1同型Ultra-LEAF抗體或hCD39 Ref抗體將HCC1739BL細胞培養30分鐘。然後，在4℃下使細胞曝露於結合Alexa Fluor® 647之抗體(8C11、8D8、8E9、9B6及Ig39-21 WT)或結合PE之純系A1歷時30分鐘，接著兩次清洗及流式細胞分析技術分析。計算AF647或PE MFI偵測相對於同型對照之倍數變化(無抗原決定基重疊= 1)。Ra：兔抗體；Hu/Ra：人類/兔嵌合抗體。
圖28：於HCC1739BL細胞上抗原決定基競爭基質-II相對抗hCD39參考抗體(hCD39 Ref)。在4℃下用10 µg/ml未結合之人類IgG1同型Ultra-LEAF抗體或hCD39 Ref抗體將HCC1739BL細胞培養30分鐘。然後在4℃下使細胞曝露於未結合之兔或人類/兔嵌合抗體(2A11、2G12、5F1、9C10、48F10、52G4、59B6、65H5及67C1)歷時30分鐘，清洗兩次並在4℃下用二級抗體(抗兔IgG (H+L), Alexa Fluor® 488)染色30分鐘。最後，清洗細胞並藉由流式細胞分析技術分析。計算AF488 MFI偵測相對於同型對照之倍數變化(無抗原決定基重疊= 1)。
圖29：抗體:抗原免疫複合物於HCC1739BL細胞上之穩定性。在37℃下在5% CO2 中用HCC1739BL細胞將抗人類CD39抗體(2 µg/ml)培養24小時或在4℃下培養20 min，接著在4℃下二級抗體染色(抗人類IgG (Fc特異性)，Alexa Fluor® 488)30分鐘。然後清洗細胞並藉由流式細胞分析技術分析。20分鐘至24小時治療間之AF488 MFI之差異表示細胞膜上人類CD39之損失，其係如材料及方法中描述計算。24小時後，來自luc-報導子ADCC陰性組(8E9、59B6及67C1)及低ADCC組(52G4)之例示性嵌合純系未在細胞膜上形成穩定之免疫複合物(例如CD39之損失大於40%)。Hu/Ra：人類/兔嵌合抗體；hIgG1：人類化兔抗體，IgG1同型；hIgG4：人類化兔抗體，IgG4同型。
圖30：藉由流式細胞分析技術使用HCC1739BL細胞量測之人類化兔抗體之親和力。人類/兔嵌合純系(Hu/Ra 8C11、8D8及9C10)及其等個別人類化純系(IgG1或IgG4同型)係如指示連續稀釋，並在4℃下用HCC1739BL細胞培養30分鐘。然後，在4℃下用二級抗體(抗人類IgG (Fc特異性)，Alexa Fluor® 488)將細胞染色30分鐘並藉由流式細胞分析技術分析。計算Kd並在圖形旁邊指示。
圖31：人類化兔抗體針對HCC1739BL細胞之NK細胞毒性。人類/兔嵌合純系(Hu/Ra 8C11、8D8及9C10)及其等個別人類化純系(IgG1或IgG4同型)係如指示連續稀釋並在37℃下在5% CO2 中用經CFSE標記之HCC1739BL靶細胞培養30分鐘。然後在37℃下用NK-92-CD16 V/V效應細胞(E:T =1:8)將細胞共培養6小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞死亡並計算CFSE+ P/I+ 細胞之% (細胞毒性之%)。列舉經計算之EC50。
圖32：人類化兔抗體針對Raji-hCD39hi細胞之CDC活性。人類/兔嵌合純系(Hu/Ra 8C11、8D8及9C10)及其等個別人類化純系(IgG1或IgG4同型)係如指示連續稀釋及在37℃下用Raji-hCD39hi靶細胞預培養30分鐘，接著用10%正常人類血清(NHS)培養2小時。藉由流式細胞分析技術分析靶細胞裂解並計算% P/I+ 細胞(細胞毒性之%)。列舉經計算之EC50。
圖33：構型抗原決定基圖譜分析。顯示主要假定之CD39抗原決定基候選者之列表。為參考CD39抗原決定基序列提供例示性、代表性CD39胞外域序列，及為資料可視化提供人類CD39之二聚體之同源模型。
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Claims (50)

  1. 一種抗CD39抗體或其抗原結合片段，其包含： (i)至少一個抗原結合域，該抗原結合域於一位點結合外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1) (CD39)，使得該抗CD39抗體形成穩定之免疫複合物，及 (ii) FcγRIIIa結合部分，該FcγRIIIa結合部分結合FcγRIIIa受體並賦予該抗CD39抗體針對CD39+細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。
  2. 如請求項1之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段促進： (i)穩定之免疫複合物形成，當與HCC1739BL細胞培育時，其特徵在於24小時後損失小於30%之免疫複合物，視需要其中該免疫複合物形成係藉由螢光強度使用螢光標記之二級抗體偵測； (ii)針對CD39+細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性； (iii) CD45+免疫細胞上CD39之抗體介導之靶胞吞(cytosis)； (iv)來自腫瘤中腫瘤血管內皮破壞或血管分布網路崩潰之CD39之抗體介導之靶胞吞； (v) (視需要)結合至具有選自圖33中列舉之CD39胺基酸抗原決定基序列之群之序列之CD39抗原決定基；及/或 (vi) (視需要)以與單株抗體純系A1非競爭性或僅部分競爭性結合至CD39之方式結合至CD39。
  3. 如請求項1或2之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該FcγRIIIa結合部分係選自由下列組成之群：Fc域、結合至FcγRIIIa之抗體或其片段，及FcγRIIIa結合肽。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合域係選自由下列組成之群：Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv (scFv)、Fav、dsFv、sc(Fv)2、Fde、sdFv、單域抗體(dAb)，及雙功能抗體(diabodies)片段，及/或其中該抗CD39抗體或抗原結合片段係單株。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段係結合至藥劑，視需要其中該藥劑係選自由下列組成之群：結合蛋白、酶、藥物、化學治療劑、生物劑、毒素、放射性核素、免疫調節劑、可偵測部分，及標籤。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段具有VH域，其具有胺基酸序列係由在嚴格條件下與SEQ ID No. 1之核酸雜交之核酸所編碼；及VL域，其具有胺基酸序列係由在嚴格條件下與SEQ ID No. 3之核酸雜交之核酸所編碼。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含具有CDR與SEQ ID No. 2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54之CDR相同至少60%之重鏈，及具有CDR與SEQ ID No. 4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56之CDR相同至少60%之輕鏈。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID No. 2、6、10、14、18、22、26、42、46、50或54相同至少60%之可變重(VH)鏈，及與SEQ ID No. 4、8、12、16、20、24、28、44、48、52或56相同至少有60%之可變輕(VL)鏈。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含： (i)具有與SEQ ID No. 29相同至少80%之CDR1胺基酸序列、與SEQ ID No. 30相同至少80%之CDR2胺基酸序列及與SEQ ID No. 31相同至少80%之CDR3胺基酸序列之重鏈；及 (ii)具有與SEQ ID No. 32相同至少80%之CDR1胺基酸序列、與SEQ ID No. 33相同至少80%之CDR2胺基酸序列及與SEQ ID No. 34相同至少80%之CDR3胺基酸序列之輕鏈。
  10. 如請求項1至8中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含具有選自由SEQ ID No. 6、10、14、18、22、26、42、46、50及54之CDR組成之群之CDR之重鏈，及具有選自由SEQ ID No. 8、12、16、20、24、28、44、48、52及56之CDR組成之群之CDR之輕鏈，及人類框架序列以形成具有可特異性結合人類CD39之抗原結合位點之人類化重鏈及輕鏈。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段包含IgG1或IgG3同型之Fc域，視需要其中該Fc域係人類的。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段係低岩藻糖基化或無岩藻糖基化。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段係人類或係人類化的。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段係雙特異性的，包括至少一個另外之抗原結合位點用於腫瘤抗原、免疫檢查點或共刺激受體，其中若該另外之抗原結合位點用於免疫檢查點，則其用作檢查點抑制劑，及其中若該另外之抗原結合位點用於共刺激受體，則其用作共刺激激動劑。
  15. 如請求項14之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該另外之抗原結合位點結合至選自由下列組成之群之檢查點蛋白：PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT及Siglec-15。
  16. 如請求項14或15之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該另外之抗原結合位點結合T細胞上經上調並與T細胞耗竭相關之檢查點蛋白。
  17. 如請求項14之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該另外之抗原結合位點結合至選自由下列組成之群之免疫共刺激受體：MHCI分子、BTLA受體、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/ CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。
  18. 如請求項14之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中該另外之抗原結合位點結合至CD47，SIRPα、CD24或Siglec-10。
  19. 一種醫藥製劑，其包含治療有效量之至少一種如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑或溶液。
  20. 如請求項19之醫藥製劑，其用於改善抗腫瘤T細胞免疫性及適用於投與患有腫瘤之個體，包含有效量之該抗CD39抗體或其抗原結合片段，及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑或溶液，其中向該個體投與該抗CD39抗體導致腫瘤內CD39高 細胞之數量減少，並增強T細胞浸潤至該腫瘤內或減少該腫瘤中T細胞耗竭或兩者。
  21. 一種經分離之核酸分子，其 i)在嚴格條件下與編碼如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽之核酸之互補體雜交； ii)具有在全長上與編碼如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽之核酸具有至少約90%一致性之序列；或 iii)編碼如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽。
  22. 一種經分離之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽，其由如請求項21之核酸編碼。
  23. 一種載體，其包含如請求項21之經分離之核酸，視需要其中該載體係表現載體。
  24. 一種宿主細胞，其包含如請求項21之經分離之核酸，其： a)表現如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段； b)包含如請求項22之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽； 及/或 c)包含如請求項23之載體。
  25. 一種裝置或套組，其包含至少一種如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段，該裝置或套組視需要包含標記以偵測至少一種抗CD39抗體或其抗原結合片段，或包含該抗CD39抗體或其抗原結合片段之複合物。
  26. 一種裝置或套組，其包含如請求項19至24中任一項之醫藥組合物、經分離之核酸分子、經分離之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽、載體及/或宿主細胞。
  27. 一種產生至少一種如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括下列步驟：(i)在適合容許該抗CD39抗體或其抗原結合片段表現之條件下，培養已經經包含編碼至少一種該抗CD39抗體或其抗原結合片段之序列之核酸轉形的經轉形宿主細胞；及(ii)回收該表現之抗CD39抗體或其抗原結合片段。
  28. 一種偵測CD39多肽之存在或濃度之方法，其包括獲得樣本，及藉由使用至少一種如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段偵測該樣本中之該多肽。
  29. 如請求項28之方法，其中至少一種抗CD39抗體或其抗原結合片段與該CD39多肽形成複合物，及該複合物係以酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學分析、西方墨點法、質譜分析、核磁共振分析或使用胞內流分析之形式偵測。
  30. 一種藉由消除(depleting)腫瘤內CD39高 細胞以改善抗腫瘤T細胞免疫性之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致腫瘤內CD39高 細胞之數量減少，並增強T細胞浸潤至該腫瘤內或減少該腫瘤中T細胞之耗竭或兩者。
  31. 一種用於促進免疫細胞浸潤至腫瘤內之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致該腫瘤中CD39+ CD45‐ SCA-1+基質細胞之消除(ablation)及減少，並增加細胞毒性T細胞浸潤腫瘤。
  32. 一種用於減少II型NKT細胞抑制腫瘤內免疫細胞功能之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物， 其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致該腫瘤中II型NKT細胞之消除及減少。
  33. 一種用於減少調節T細胞(Treg)抑制腫瘤內免疫細胞功能之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物， 其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致該腫瘤中CD39高 Treg之消除及減少。
  34. 一種用於減少腫瘤相關巨噬細胞(TAM)抑制腫瘤內免疫細胞功能之方法，其包括向患有腫瘤之個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段之投與導致該腫瘤中CD39高 巨噬細胞之消除及減少。
  35. 一種用於促進抗腫瘤免疫反應之方法，包括向患有腫瘤之個體投與足以導致該腫瘤中CD39表現細胞減少之量之如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段。
  36. 一種用於促進個體之腫瘤中T細胞介導免疫功能之方法，包括： (i)識別癌症個體具有腫瘤浸潤之腫瘤反應性淋巴細胞之程度低於預定臨限值，以表徵為未浸潤或浸潤不足(under-infiltrated)之腫瘤表型；及 (ii)以增加腫瘤反應性T細胞浸潤腫瘤之量向該個體投與如請求項1至18中任一項之抗CD39抗體或其抗原結合片段。
  37. 如請求項30、31或34之方法，其中該等腫瘤內CD39高 細胞係選自造血幹細胞或祖細胞(CD45‐Sca‐1+)、CD39+ NKT細胞、CD39+巨噬細胞、CD39+癌細胞、CD39+內皮細胞或其組合。
  38. 如請求項30、31或34之方法，其中該抗CD39抗體或其抗原結合片段降低一或多個造血隔室內出現之CD39高 細胞之濃度，視需要其中該等一或多個造血隔室係選自由血液、脾及肝組成之群。
  39. 如請求項30至38中任一項之方法，其中投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為抗腫瘤療法之一部分。
  40. 如請求項30至39中任一項之方法，其中投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為抗感染療法之一部分，視需要其中該抗感染療法係抗病毒療法(包括HIV及HBV感染及COVID-19感染之治療)、用於結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )之治療，及用於內臟萊什曼病之治療。
  41. 如請求項30至40中任一項之方法，其中投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為用於治療實體腫瘤之抗腫瘤療法之一部分，視需要其中該實體腫瘤係胰癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、前列腺癌、結腸癌、乳癌、淋巴瘤、膽囊癌、腎癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、子宮頸癌或神經膠質瘤。
  42. 如請求項30至41中任一項之方法，其中投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為用於治療液體腫瘤之抗腫瘤療法之一部分，視需要其中該液體腫瘤係白血病。
  43. 如請求項30至42中任一項之方法，其中投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為涉及一或多種化學治療劑、抗血管生成劑、免疫腫瘤劑及/或放射之療法之一部分。
  44. 如請求項30至43中任一項之方法，其中該療法包括投與一或多種檢查點分子之一或多種抑制劑(拮抗劑)，視需要其中該等一或多種檢查點分子係選自由下列組成之群：PD-1拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、LAG-3拮抗劑、TIM-3拮抗劑、TIGIT拮抗劑及Siglec-15拮抗劑。
  45. 如請求項30至44中任一項之方法，其中該療法包括投與一或多種共刺激分子之一或多種活化劑(激動劑)，視需要其中該等一或多種共刺激分子係選自由下列組成之群：GITR激動劑、CD27激動劑、4-1BB激動劑、OX40激動劑、CD137激動劑、ICOS激動劑及CD28激動劑。
  46. 如請求項30至45中任一項之方法，其中該療法包括投與下列中之一或多者：VEGFR或VEGF拮抗劑、EGFR或EGF拮抗劑、IDO抑制劑、IDO1抑制劑、HDAC抑制劑、PI3Kδ抑制劑、IL-15激動劑、CXCR4拮抗劑、CXCL12拮抗劑、DNMT抑制劑、介白素21、抗KIR抗體、抗CSF-1R抗體、抗CCR4抗體、GMCSF、抗PS抗體、抗CD30抗體-澳瑞他汀(aurstatin) E結合物、抗CD19抗體、抗CEA IL-2抗體、抗NY-ESO-1抗體、抗NKG2A抗體、STING激動劑、TRL7/8激動劑、RIG-1激動劑及/或NRLP3抑制劑、抗CD73抗體(諸如MEDI9447)、P2X7拮抗劑或腺苷A2A受體拮抗劑。
  47. 如請求項30至46中任一項之方法，其中該療法包括投與一或多種先天免疫誘導劑，視需要其中該等一或多種先天免疫誘導劑係選自由下列組成之群：CD47-SIRPα軸之抑制劑、CD24-Siglec-10軸之抑制劑、阻斷NK及CD8+細胞之HLA-E驅動抑制之NGK2A檢查點抑制劑、STING激動劑、TLR7/8激動劑及RIG-I激動劑。
  48. 如請求項30至46中任一項之方法，其中投與該抗CD39抗體或其抗原結合片段作為包括腫瘤疫苗、過繼(adoptive)細胞療法、抗腫瘤基因療法、抑制核酸療法及/或溶瘤病毒療法之療法之一部分。
  49. 如請求項20或30至48中任一項之醫藥組合物或方法，其中該個體係癌症之動物模型。
  50. 如請求項20或30至49中任一項之醫藥組合物或方法，其中該個體係哺乳動物，視需要其中該哺乳動物係人類或囓齒動物。
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