JP2022553643A - 細胞傷害性ｔ細胞耐性腫瘍を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に記載の実施形態は、チェックポイント遮断に耐性のある腫瘍を、ＮＫ細胞を活性化させることによって治療するための、組成物および方法を対象とする。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０１９年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９１２，８２６号の優先権を主張し、その内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される実施形態の日付の当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、参照により本出願に組み込まれる。

本特許開示は、著作権保護の対象となる、材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許ファイルまたは記録に表れているように、特許文書または特許開示のいずれかによってファクシミリ複製に異議はないが、それ以外では、何であれすべての著作権を留保する。

政府の権益
本発明は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＣＡ１７３７５０、Ｔ３２ ＣＡ２０７０２１、およびＲ０１ ＣＡ２３８０３９に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

分野
本明細書に記載の実施形態は、チェックポイント遮断に耐性のある腫瘍を、ＮＫ細胞を活性化させることによって治療するための、組成物および方法を対象とする。

Ｔ細胞上のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）阻害性受容体を標的とする抗体によるチェックポイント遮断は、進行がんの患者においても永続的な抗腫瘍免疫を誘導することができる。しかしながら、多くの患者は、一次または二次耐性のためにこれらの療法の恩恵を受けることができない。細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）タンパク質に結合した腫瘍由来ペプチドを認識するその能力に基づいて、チェックポイント遮断の有効性において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によってこのようなＭＨＣ－Ｉ－ペプチド複合体が認識されると、Ｔ細胞がインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）を放出し、腫瘍細胞の増殖が阻害され、腫瘍細胞と樹状細胞の両方においてＭＨＣ－Ｉタンパク質の発現が増強される。したがって、チェックポイント遮断に対する耐性は、ＭＨＣ－Ｉ（Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および他の遺伝子）またはＩＦＮγ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２）経路における主要遺伝子の変異またはエピジェネティックなサイレンシングのいずれかによる、腫瘍細胞によるＭＨＣ－Ｉ発現の喪失によって、媒介される場合が多い。新生抗原の数が少ないかまたは失われていると、細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍免疫も低下する。現在、チェックポイント遮断および細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある固形腫瘍を有する患者に対する代替免疫療法はない。

本明細書に記載の態様は、対象におけるがんの症状を治療、予防、または軽減する方法を含む。実施形態では、がんを治療することは、腫瘍の成長および／または転移を停止または低減することによって示される。

実施形態では、がんは、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性がある。実施形態では、がんは、ＭＣＨクラスＩ欠損がんまたはＩＦＮガンマに耐性のあるがんである。実施形態では、がんは、免疫療法に耐性があり、例えば、抗ＰＤ１および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体に耐性のあるがんである。

本明細書に記載の実施形態によって治療することができるそのようながんの非限定的な例としては、メラノーマ、肺がん、腎がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、乳がん、胃がん、および膵がんが挙げられる。

一実施形態では、本方法は、１つ以上の活性化剤および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。例えば、活性化剤は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６受容体を介してＮＫ細胞を活性化させ、それにより、対象における１つ以上のがん細胞の溶解を引き起こし、がんは、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性がある。

実施形態では、活性化剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、サイトカイン、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、活性化剤は、モノクローナル抗体などの抗体を含む。例えば、抗体は、抗ＭＩＣＡ抗体、抗ＭＩＣＢ抗体、またはその両方を含む。実施形態では、抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのアルファ－３ドメインと結合する。実施形態では、抗体は、表１の１つ以上の配列を含む。

実施形態では、活性化剤は、腫瘍によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢのシェディングを阻害し、それにより、腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドの密度を増加させる。例えば、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体は、腫瘍によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢのシェディングを阻害する。

実施形態は、１つ以上の追加の治療薬または予防薬および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の第２の組成物を対象に投与するステップをさらに含むことができる。実施形態では、１つ以上の追加の治療薬または予防薬は、毒素、放射性標識、放射線療法、ｓｉＲＮＡ、小分子、ペプチド、抗体、遺伝子操作された細胞、放射線、またはサイトカインを含む。

例えば、１つ以上の追加の治療薬または予防薬は、パノビノスタットなどのＨＤＡＣ阻害剤を含む。

例えば、１つ以上の追加の治療薬または予防薬は、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１２、またはＩＬ１８などのサイトカインを含む。

例えば、１つ以上の追加の治療薬または予防薬は、小分子を含む。実施形態では、小分子はプロテアソーム阻害剤を含む。

例えば、１つ以上の追加の治療薬または予防薬は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの抗体を含む。

例えば、１つ以上の追加の治療薬または予防薬は、ＣＡＲ Ｔ細胞などの遺伝子操作された細胞を含む。

本明細書の実施形態は、Ｊａｋ１変異および／またはＢ２ｍ変異についてがんを試験するステップをさらに含むことができる。

本明細書に記載の態様はまた、ＮＫ細胞に対して対象のがん細胞を感作させる方法を対象とする。

実施形態では、本方法は、１つ以上の活性化剤および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法を含む。例えば、活性化剤は、ＮＫ細胞を活性化させ、それにより、対象における１つ以上のがん細胞の溶解を引き起こし、がんは、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性がある。

実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ受容体および／またはＣＤ１６受容体の活性化は、ＮＫ細胞を活性化させる。

実施形態では、活性化剤は、がん細胞によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢのシェディングを阻害し、それにより、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６受容体を活性化させる。したがって、がん細胞の表面上のＭＩＣＡ／Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６受容体、またはその両方を活性化させる。

本明細書に記載される実施形態の他の目的および利点は、以下の記載から容易に明らかになるであろう。

特許または出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を有するこの特許または特許出願刊行物のコピーは、申請および必要な料金の支払い後、特許庁によって提供される。

単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによるヒトメラノーマ転移に浸潤するＮＫ細胞の特徴を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによる血液およびメラノーマ転移（患者ＣＹ１５８）からのＮＫ細胞の単離。ＮＫ細胞は、ＣＤ４５およびＣＤ５６マーカーには陽性であるが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ１６３マーカーには陰性であるリンパ球サイズの単一生細胞として同定された。数字は、リンパ球集団全体（Ｔ細胞およびＢ細胞も含む）に占めるＮＫ細胞のパーセンテージを示している。（Ｂ）腫瘍中のＮＫ細胞は、血液中のＮＫ細胞とは異なる。ＣＹ１５８患者の血液および腫瘍浸潤ＮＫ細胞の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ＵＭＡＰプロットを使用して、血液および腫瘍浸潤ＮＫ細胞集団を視覚化し、各クラスターに占めるＮＫ細胞のパーセンテージは、血液および腫瘍ＮＫ細胞について示されている（左）。ＮＫ細胞クラスターは色分けされ、主要な差次的発現遺伝子がクラスターごとに示されている（右）。（Ｃ）３人の患者（ＣＹ１５５、ＣＹ１５８およびＣＹ１６０）からのデータを統合した、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによる転移および血液中のＮＫ細胞集団の比較。血液（左）および転移（右）中のＮＫ細胞クラスターを、ＵＭＡＰプロットを使用して視覚化した。各クラスターの主要な差次的発現遺伝子と、所与のクラスターに割り当てられたＮＫ細胞のパーセンテージが示されている。（Ｄ）血液（上）および腫瘍浸潤（下）ＮＫ細胞集団における選択された遺伝子のｍＲＮＡ転写物を、ＵＭＡＰプロットを使用して視覚化した。青色の強度は、個々の細胞において示された遺伝子の発現レベルを示している。 図１Ａの説明を参照されたい。 図１Ａの説明を参照されたい。 図１Ａの説明を参照されたい。 ＮＫ細胞集団の同定、ならびに細胞傷害性およびケモカインに関連する遺伝子の発現を示す。（Ａ～Ｄ）ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞集団の同定。扁桃腺から単離されたヒトの自然リンパ球からの公開された単一細胞データを使用して、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３の遺伝子発現シグネチャーを定義した。^３１ＵＭＡＰプロットおよびバイオリン図は、これらの遺伝子発現シグネチャーと配列決定された細胞の遺伝子発現パターンの類似性の程度を示している。血液および腫瘍由来の細胞を、ＮＫ細胞シグネチャー（Ａ、Ｂ）ならびにＩＬＣ３シグネチャー（Ｃ、Ｄ）を使用して調査した。（Ｅ）血液（上）およびメラノーマ転移（下）から単離されたＮＫ細胞の細胞傷害性遺伝子発現シグネチャー（ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＭ、ＰＲＦ１、ＧＮＬＹおよびＮＫＧ７）。ＵＭＡＰプロットおよびバイオリン図は、ＮＫ細胞クラスター全体にわたるこのシグネチャーのスコアを示すために示される。（Ｆ、Ｇ）ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２（ＸＣＬ１／２と略記）（Ｆ）ならびにＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ２およびＣＣＬ５（ＣＣＬ３／４／４Ｌ２／５と略記）（Ｇ）の、血液（上）および腫瘍浸潤ＮＫ細胞（下）による発現を示すＵＭＡＰプロット。 循環ＮＫ細胞と比較したメラノーマ転移におけるＮＫ細胞による阻害性受容体の差次的発現とフローサイトメトリーによるＮＫ細胞集団の同定を示す。（Ａ）血液およびメラノーマ転移から単離されたＮＫ細胞による阻害性受容体の発現。青色の強度は、個々の細胞において示された遺伝子の発現レベルを示している。（Ｂ）ＮＫ細胞集団（ＦＧＦＢＰ２およびＦＣＧＲ３Ａ）ならびにエフェクター分子（ＧＺＭＡおよびＧＺＭＫ）の同定に使用される遺伝子の発現。青色の強度は、個々の細胞において示された遺伝子の発現レベルを示している。（Ｃ）ＦＧＦＢＰ２およびＣＤ１６ａをマーカーとして使用するフローサイトメトリーによる血液試料中の、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって同定された３つのＮＫ細胞集団の検証。ＮＫ細胞は、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６３、および死細胞マーカーに対して陰性であるＣＤ４５およびＣＤ５６陽性細胞をゲーティングすることによって同定した。ＣＹ１６５患者についての代表的な分析が示されている。（Ｄ）ＦＧＦＢＰ２およびＣＤ１６ａマーカーに基づく血液および腫瘍試料中の３つのＮＫ細胞集団の定量。グランザイムＡおよびＫのラベルも、３つの母集団のそれぞれについて示されている。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。これらのグラフの各ドットは、個々の患者を表す。統計分析は、二元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｂ２Ｍの不活性化がヒトメラノーマ細胞をＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂに感作させることを示す。（Ａ）Ｂ２Ｍ遺伝子の不活化効率の検証。ヒトＡ３７５メラノーマ細胞を、対照またはＢ２Ｍ ｇＲＮＡ（それぞれ対照およびＢ２Ｍ－ＫＯと称する）で編集した。編集したＡ３７５細胞を、示された濃度のＩＦＮγで２４時間処理し、ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃの表面レベルをフローサイトメトリーによって定量した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（Ｂ～Ｃ）対照またはＢ２Ｍ ｇＲＮＡで編集したヒトＡ３７５メラノーマ細胞を、ＭＩＣＡ（７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）または示された濃度のアイソタイプ対照抗体とともに２４時間培養した。サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した、編集したメラノーマ細胞によって産生された可溶性ＭＩＣＡの定量（Ｂ）。以前に報告されたように、７Ｃ６抗体はＥＬＩＳＡによる可溶性ＭＩＣＡの検出を妨害しない。^２０対照およびＢ２Ｍで編集したメラノーマ細胞のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルは、ＰＥコンジュゲートＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ ６Ｄ４を使用したフローサイトメトリーによって定量した（Ｃ）。以前に報告されたように、このｍＡｂはＭＩＣＡ／Ｂ α１～α２ドメインに結合し、７Ｃ６抗体と競合しない。^２０（Ｄ）ＭＨＣ－Ｉ発現およびＭＩＣＡ ｍＡｂ処理に依存するＡ３７５メラノーマ細胞に対するヒトＮＫ細胞の効果。対照またはＢ２Ｍ ｇＲＮＡで編集したＧＦＰ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞を、ウェル当たり５×１０^３個の細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。メラノーマ細胞を７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間前処理した後、異なるエフェクター対標的比（０：１、０．５：１または１：１）で精製ヒトＮＫ細胞を添加した。ＩＬ－２（３００Ｕ／ｍｌ）をして、ＮＫ細胞の生存をサポートした。ＧＦＰ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞の数は、７２時間の期間にわたる複数の時点でＮｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｉｇｏ機器を使用したイメージングサイトメトリーによって定量した。３つの独立した実験の代表であるデータ（Ａ～Ｄ）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定（Ｄ）を使用した二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理が細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある転移に対する免疫を誘導することを示す。（Ａ）対照、Ｂ２ｍまたはＪａｋ１ ｇＲＮＡで編集したＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞をＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）または溶媒対照（ＰＢＳ）で２４時間処理し、Ｈ－２Ｋ^ｂの表面レベルをフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）ＭＩＣＡ ｍＡｂは、Ｂ２ｍまたはＪａｋ１遺伝子に不活性化変異を伴う確立された転移に対する免疫を誘導した。Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡメラノーマ細胞を対照、Ｂ２ｍまたはＪａｋ１ ｇＲＮＡで編集し、７×１０^５個の腫瘍細胞をＢ細胞欠損（Ｉｇｈｍ^－／－）マウスに静脈内注射した。７日目に、転移を定量するためにマウスのサブセットを安楽死させ、残りのマウスを７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたは対照ｍＡｂで処理した（７、８および１２日目に２００μｇを腹腔内投与）。１４日目に、実体顕微鏡下で肺表面転移を数えた。（Ｃ）Ｂ２ｍまたはＪａｋ１欠損メラノーマ転移を有するマウスの生存に対するＭＩＣＡ ｍＡｂ処理の影響。ＷＴマウスに、対照、Ｂ２ｍまたはＪａｋ１ ｇＲＮＡで編集した２×１０^５個のＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。マウスには１日目と２日目に７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを投与し、マウスの生存を記録した。（Ｄ）ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞によるＭＨＣ－Ｉの発現。ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞を対照またはＢ２ｍ ｇＲＮＡで編集し、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）または溶媒対照（ＰＢＳ）で２４時間刺激した。表面Ｈ－２Ｋ^ｂタンパク質レベルは、フローサイトメトリーによって定量した。（Ｅ）ＬＬＣ１肺がん細胞によって形成された肺転移のＭＩＣＡ ｍＡｂ処理。ＷＴＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、対照またはＢ２ｍ ｇＲＮＡで編集した１×１０^６（１Ｍ）または１．５×１０^６（１．５Ｍ）個のＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞を静脈内接種した。腫瘍細胞接種後２日目に、示されたｍＡｂでマウスを処理した（２００μｇを腹腔内投与）。追加の処理は、３日目に行い、その後週に１回行った。１４日目に肺転移を数えた。（Ｆ）同種または同系ＮＫ細胞で再構成したマウスにおけるＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移のＭＩＣＡ ｍＡｂ処理。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ダブルノックアウトマウスに、それぞれＬＬＣ１細胞と同種または同系のＣＢ６Ｆ１／ＪマウスまたはＣ５６ＢＬ／６マウス由来のＮＫ細胞（２×１０^５個の細胞）を注射した。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－マウスの第３群にはＮＫ細胞を投与しなかった。ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（７×１０^５）を静脈内注射した。ＮＫ細胞移入の２４時間後。腫瘍細胞接種後の２、３日目、およびその後は週に１回、示された抗体（２００μｇ）でマウスを処理した。１４日目に転移を数えた。３つの独立した実験の代表であるデータ（Ａ、Ｄ）、または３つ（Ｂ、Ｅ）もしくは２つ（Ｃ、Ｆ）の独立した実験からプールしたデータ。統計分析は、両側不対スチューデントｔ検定（Ｂ、Ｅ～Ｆ）、およびログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定（Ｃ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図５－１の説明を参照されたい。 ＭＩＣＡ／Ｂ抗体によるＢ２ｍおよびＪａｋ１欠損メラノーマ転移の治療にＮＫ細胞が不可欠であることを示す。（Ａ）野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照、Ｂ２ｍまたはＪａｋ１ ｇＲＮＡで編集した７×１０^５個のＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。１日後ならびに２日目および７日目に、７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ）でマウスを処理した。腫瘍細胞の接種と比較して、－１、０および７日目に１００μｇの抗アシアロＧＭ１（抗ａｓＧＭ１）を注射することによって、ＮＫ細胞の枯渇を実行した。対照マウスにはアイソタイプ対照抗体を投与した。肺表面転移は、腫瘍接種後１４日目に定量した。（Ｂ）肺組織へのＮＫ細胞浸潤の分析。腫瘍注射およびｍＡｂ処理は、フローサイトメトリーによる同定を可能にするＺｓＧｒｅｅｎを発現した腫瘍細胞を用いて、「Ａ」に記載されるように行った。以前に報告されたように、腫瘍細胞の接種後１２日目に、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４５．２抗体をマウスに静脈内注射して、血液および組織浸潤ＮＫ細胞を区別した。^２０肺浸潤ＮＫ細胞は、ＣＤ３ε－ＴＣＲβ－ＮＫ１．１＋ＣＤ４９ｂ＋ＥＯＭＥＳ＋生細胞として同定され、ＣＤ４５．２－ＡＰＣ（静脈内注射）については染色性が低く、ＣＤ４５．２－ＰＥ－ＣＹ７（細胞懸濁液に添加）については染色性が高かった。ＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞に対するＮＫ細胞の比率が示されている。（Ｃ、Ｄ）（Ｂ）に記載された実験の示された遺伝子型および処理群についてのＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞（Ｃ）および肺浸潤ＮＫ細胞（Ｄ）の数。ＥＯＭＥＳ標識を使用して、ＮＫ細胞をＩＬＣ１から区別した。２つの独立した実験からプールしたデータ（Ａ～Ｄ）。統計分析は、ボンフェローニの事後検定（Ａ）または両側不対スチューデントｔ検定（Ｂ～Ｄ）を使用した二元ＡＮＯＶＡを使用して実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ、０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットとＭＩＣＡ ｍＡｂとの組み合わせが、ヒトＮＫ細胞で再構成されたＮＳＧマウスにおけるＭＩＣＡ／Ｂの表面レベルを高め、転移の成長を阻害することを示す。（Ａ）パノビノスタットによる処理後のＮＫＧ２ＤリガンドｍＲＮＡレベルの増加。Ａ３７５メラノーマ細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）で２４時間処理し、バルクＲＮＡ－ｓｅｑのためにｍＲＮＡを抽出した。ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＭＨＣクラスＩ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、パノビノスタットおよびＰＢＳ群の比率（ｌｏｇ２倍率変化）として示されている。（Ｂ）パノビノスタット＋ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによる処理後のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルの増加。Ａ３７５メラノーマ細胞を、示されたｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）および増加濃度のパノビノスタットにより、２４時間インキュベートした。ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベル（左）およびＡ３７５細胞生存率（右）は、フローサイトメトリーによって定量した。シェディングＭＩＣＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した（中央）。（Ｃ）パノビノスタット＋ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの組み合わせによる短期ヒトメラノーマ細胞株の処理。示されたメラノーマ細胞株を、示されたｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）＋増加濃度のパノビノスタットにより、２４時間インビトロで処理した。ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルは、フローサイトメトリーによって定量した。（Ｄ）ヒトメラノーマ細胞によって形成された転移中のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルに対する、パノビノスタット＋ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理のインビボ相乗効果。ＮＳＧマウスに１×１０^６個のＺｓＧｒｅｅｎ＋Ａ３７５メラノーマ細胞を静脈内接種した。２週間後、マウスを、その後２日間、示されたｍＡｂ（２００μｇ）＋／－パノビノスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）により処理した。最後の処理から２４時間後、ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルを肺転移中の腫瘍細胞（大きく、生存可能なＺｓＧｒｅｅｎ＋、ＣＤ４５－細胞）で分析した。（Ｅ～Ｆ）ＮＳＧマウスを、インビトロで増殖させた精製ヒトＮＫ細胞（２×１０^６個を静脈内注射）で再構成した。ＮＫ細胞のインビボ生存を、腹腔内注射によるＩＬ－２（７．５×１０^４個の単位）の同時投与によってサポートした。１日目に、マウスに対照またはＢ２Ｍ編集Ａ３７５細胞（５×１０^５）を静脈内接種した。２日目および３日目に、マウスに、別の用量のＩＬ－２、示されたｍＡｂ（２００μｇ）＋／－１０ｍｇ／ｋｇパノビノスタットを投与した。１４日目に、肺表面転移の数を数えた。実験設計（Ｅ）および肺表面転移の定量（Ｆ）の例証。３つの独立した実験の代表であるデータ（ＢおよびＣ）、または２つの独立した実験（ＤおよびＦ）からプールしたデータ。統計分析は、両側不対スチューデントｔ検定（Ｄ）および二元ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの事後検定（Ｆ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図７－１の説明を参照されたい。 患者の血液および腫瘍試料からのＮＫ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ＮＫ細胞を、ＣＤ４５およびＣＤ５６を発現したが、ＣＤ３、ＣＤ１９（一部の試料）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ１６３を発現しなかったリンパ球サイズの生細胞として同定した。血液ＮＫ細胞（左）および腫瘍浸潤ＮＫ細胞（右）の全リンパ球集団（Ｔ細胞およびＢ細胞を含む）におけるＮＫ細胞のパーセンテージ。 ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによる個々の患者からの循環および腫瘍浸潤ＮＫ細胞集団の比較を示す。（Ａ～Ｂ）ＣＹ１５５（Ａ）とＣＹ１６０（Ｂ）の２人の患者からの試料についての、血液および腫瘍浸潤ＮＫ細胞の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析が示されている。ＵＭＡＰプロットを使用して、各患者からの血液および腫瘍浸潤ＮＫ細胞集団を視覚化した。また、各クラスターにおけるＮＫ細胞のパーセンテージは、血液および腫瘍のＮＫ細胞について示されている（左）。ＮＫ細胞クラスターは色分けされ、主要な差次的発現遺伝子がクラスターごとに示されている（右）。 ＩＬＣ１およびＩＬＣ２遺伝子発現シグネチャーおよびケモカイン発現の分析を示す。（Ａ～Ｂ）扁桃腺から単離されたヒトの自然リンパ球からの公開された単一細胞データを使用して、ＩＬＣ１細胞およびＩＬＣ２の遺伝子発現シグネチャーを定義した。^３１これらのシグネチャーを使用して、血液（Ａ）および腫瘍（Ｂ）ＮＫ細胞を調査した。（Ｃ）血液およびメラノーマ転移から単離されたＮＫ細胞によるケモカインの発現。青色の強度は、個々の細胞において示された遺伝子の発現レベルを示している。 表面受容体および遺伝子発現シグネチャーの分析を示す。（Ａ～Ｂ）ＮＫ細胞受容体（ＫＬＲＫ１、ＫＬＲＦ１、ＦＣＧＲ３Ａ、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２およびＮＣＲ３）ならびに阻害性ＮＫ細胞受容体（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＬＲＣ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＨＡＶＣＲ２、ＰＤＣＤ１、ＬＡＧ３）を活性化させるための遺伝子発現シグネチャーを使用して、血液（Ａ）ＮＫ細胞と腫瘍浸潤（Ｂ）ＮＫ細胞とを比較した。これらのシグネチャーは、ＵＭＡＰおよびバイオリン図を使用して視覚化した。（Ｃ）血液（上）および腫瘍（下）のＮＫ細胞による単細胞による活性化受容体および阻害性受容体の発現。青色の強度は、個々の細胞において示された遺伝子の発現レベルを示している。（Ｄ）フローサイトメトリーによって分析されたＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄの発現。例証のために、ＣＹ１５８患者のヒストグラムを示している。 図１１－１の説明を参照されたい。 メラノーマ転移からの腫瘍細胞上の表面ＨＬＡクラスＩおよびＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の分析を示す。メラノーマ転移を、患者から外科的に切除し、フローサイトメトリーによって分析した。腫瘍細胞は、ＣＤ４５陰性である生存可能で大きな単細胞として同定された。（Ａ、Ｂ）ＮＫ細胞もｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって分析された病変からのメラノーマ細胞による従来のＭＨＣ－Ｉ（ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ）（Ａ）およびＭＩＣＡ／Ｂ（Ｂ）タンパク質の発現。（Ｃ～Ｄ）追加の患者群からの転移中の腫瘍細胞による従来のＭＨＣ－Ｉタンパク質（Ｃ）およびＭＩＣＡ／Ｂ（Ｄ）の発現。（Ｅ）サンドイッチＥＬＩＳＡによる、示されたメラノーマ患者（ＣＹ１５６Ｐ～ＣＹ１６６）および健康なドナー（ＨＤ）からの血漿中のシェディングＭＩＣＡの定量。シェディングされたＭＩＣＢは、これらの試料では検出されなかった。 図１２－１の説明を参照されたい。 Ｂ２Ｍ欠損Ａ３７５メラノーマ細胞の特徴、およびＭＨＣ－Ｉの認識によるＮＫ細胞を介したメラノーマ細胞の殺傷の阻害を示す。（Ａ）Ａ３７５メラノーマ細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子不活化の効率の検証。細胞は、対照またはＢ２Ｍ ｇＲＮＡ（それぞれ対照およびＢ２Ｍ－ＫＯと称する）で編集した。細胞を、指示された濃度のＩＦＮγ（１ｎｇ／ｍｌ）またはＰＢＳで２４時間処理し、表面ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃタンパク質をフローサイトメトリーで定量した。（Ｂ）対照およびＢ２Ｍ編集Ａ３７５細胞のＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルの比較。細胞を、７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、ＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質をフローサイトメトリーで分析した。（Ｃ）健康なドナーから単離されたＮＫ細胞を１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で２４時間培養した。親のＡ３７５メラノーマ細胞を７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照抗体（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートした後、細胞傷害性アッセイで使用した。ＮＫ細胞を介したＡ３７５細胞の殺傷を、４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して分析した。示されたＫＩＲまたはアイソタイプ対照抗体を１０μｇ／ｍｌで共培養物に加えた。データは、３つの独立した実験の代表である（Ａ～Ｃ）。統計分析は、二元ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの事後検定（Ｃ）によって実行した。＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株の特性評価およびＭＩＣＡ ｍＡｂのインビボ活性を示す。（Ａ）対照、Ｂ２ｍまたはＪａｋ１ ｇＲＮＡで編集したＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を、示された濃度のＩＦＮγで２４時間処理し、Ｈ－２Ｋ^ｂ（左）およびＭＩＣＡ（右）の表面レベルをフローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。３つの独立した実験の代表であるデータ。（Ｂ）Ｂ細胞欠損（Ｉｇｈｍ^－／－）マウスに、対照、Ｂ２ｍ、またはＪａｋ１ ｇＲＮＡで編集した７×１０^５ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。転移が確立されたら（７日目）、マウスをＭＩＣＡまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（７、８、および１２日目に２００μｇ）で処理した。血漿試料中のシェディングＭＩＣＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量した。データは、２つの独立した実験からプールした。統計分析は、二元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定によって実行した。＊＊＊ｐ＜０．００１。 ヒト腫瘍細胞株のパネルに対するパノビノスタット処理の効果を示す。（Ａ～Ｂ）Ａ３７５メラノーマ細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）または溶媒対照（ＰＢＳ）で２４時間処理し、遺伝子発現をバルクＲＮＡ－ｓｅｑで調べた。パノビノスタットまたは溶媒対照で処理した細胞において差次的に発現される主要な遺伝子（Ａ）および対照で処理したＡ３７５細胞と比較してパノビノスタットで上方調節された主要な免疫学的経路（Ｂ）。ＦＤＲ：誤検出率；ｑ－ｖａｌ：ｑ値。（Ｃ～Ｈ）示されたヒト腫瘍細胞株を、示された抗体（２０μｇ／ｍｌ）および増加濃度のＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットにより、２４時間処理した。ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルは、ＰＥ標識６Ｄ４ ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーによって定量した（Ｃ－Ｈの左側のグラフ）。上清中のシェディングＭＩＣＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した（ＣおよびＤの右側のグラフ）。（Ｅ～Ｈ）ＥＬＩＳＡキットは、おそらく対立遺伝子バリアントの特異性またはＭＩＣＢのシェディングのために、これらの細胞株のシェディングＭＩＣＡを検出しなかった（ＥＬＩＳＡはＭＩＣＡに特異的であった）。アッセイ時のそのような抗体の利用可能性に応じて、異なるＦｃ領域を有する７Ｃ６抗体を使用した。以前に報告されたように、この抗体のＦｃ領域はＭＩＣＡ／Ｂシェディングの阻害に影響を与えない。^２０３つの独立した実験の代表であるデータ。 図１５－１の説明を参照されたい。 パノビノスタットがヒトＮＫ細胞によるＮＳＧマウスの再構成を阻害しなかったことを示す。ＮＳＧマウスに、健康なドナーからの２×１０^６個のインビトロで増殖させたヒトＮＫ細胞を静脈内注射した。ＮＫ細胞接種の直後に、マウスをＩＬ－２（７．５×１０^４個の単位）で処理して、ＮＫ細胞の生存をサポートした。また、マウスには、対照としてパノビノスタット（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを投与した。２４時間後、血液ＮＫ細胞をフローサイトメトリーで分析した。（Ａ）ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ３－生細胞として同定した循環ＮＫ細胞の数。（Ｂ、Ｃ）ＣＤ１６ａ（Ｂ）またはＮＫＧ２Ｄ（Ｃ）ｍＡｂで標識した血液ＮＫ細胞のパーセンテージ。２つの独立した実験からプールしたデータ（Ａ～Ｃ）。 調査したメラノーマ転移の概要を示す。ＳｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、上位３つのケース（赤で強調表示）について実行した。他の腫瘍試料を使用して、フローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩおよびＭＩＣＡ／Ｂタンパク質とＮＫ細胞の発現について腫瘍細胞集団を調べた。外科的に切除された転移の位置と以前の治療歴が列挙されている。 Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化が、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの存在下でＮＫ細胞を介したヒトメラノーマ細胞の殺傷を増強させることを示す。（Ａ）Ｂ２Ｍ遺伝子の不活化効率の検証。対照またはＢ２Ｍ－ＫＯヒトＡ３７５メラノーマ細胞を、示された濃度のＩＦＮγで２４時間処理し、ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃの表面レベルをフローサイトメトリーによって定量した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（Ｂ～Ｄ）対照またはＢ２Ｍ－ＫＯヒトＡ３７５メラノーマ細胞を、指定された濃度のＭＩＣＡ／Ｂ（７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）またはアイソタイプ対照抗体とともに２４時間培養した。サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した、メラノーマ細胞によって放出されたシェディングＭＩＣＡの定量（Ｂ）。以前に報告されたように（２３）、７Ｃ６抗体は、ＥＬＩＳＡによる可溶性ＭＩＣＡの検出を妨害しなかった。対照およびＢ２Ｍ－ＫＯメラノーマ細胞上のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルは、ＰＥコンジュゲートＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ ６Ｄ４を使用したフローサイトメトリーによって定量した（Ｃ）。以前に報告されたように（２３）、このｍＡｂは、ＭＩＣＡ／Ｂ α１～α２ドメインに結合し、７Ｃ６抗体と競合しない。「Ｃ」に示されている実験の代表であるヒストグラム（Ｄ）。（Ｅ）ＭＨＣ－Ｉ発現およびＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理に依存するＡ３７５メラノーマ細胞に対するヒトＮＫ細胞の効果。ＧＦＰ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞（対照またはＢ２Ｍ－ＫＯ）を、ウェル当たり５×１０^３細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。メラノーマ細胞を７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間前処理した後、異なるエフェクター対標的比（０：１、０．５：１または１：１）で精製ヒトＮＫ細胞を添加した。ＩＬ－２（３００Ｕ／ｍｌ）を追加して、ＮＫ細胞の生存をサポートした。ＧＦＰ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞の数は、７２時間の期間にわたる複数の時点でＮｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｉｇｏ機器を使用したイメージングサイトメトリーによって定量した。３つの独立した実験の代表であるデータ（Ａ～Ｅ）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定（Ｅ）を使用した二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理が、Ｂ２ｍおよびＪａｋ１遺伝子における不活性化変異を伴うメラノーマ転移に対する免疫を誘導することを示す。（Ａ）Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞（対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ）をＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）または溶媒対照（ＰＢＳ）で２４時間処理し、Ｈ－２Ｋ^ｂの表面レベルをフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）Ｂ２ｍまたはＪａｋ１遺伝子に不活性化変異を伴う確立された転移に対するＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理。Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡメラノーマ細胞（７×１０^５個の対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ腫瘍細胞）をＢ細胞欠損（Ｉｇｈｍ^－／－）マウスに静脈内注射した。７日目に、転移を定量するためにマウスのサブセットを安楽死させ、残りのマウスを７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたは対照ｍＡｂで処理した（７、８および１２日目に２００μｇを腹腔内投与）。１４日目に、実体顕微鏡下で肺表面転移を数えた。（Ｃ）Ｂ２ｍまたはＪａｋ１欠損メラノーマ転移を有するマウスの生存に対するＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理の影響。ＷＴマウス（Ｉｇｈｍ^＋／＋）に、２×１０^５個の対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。マウスには１日目と２日目に７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを投与し、マウスの生存を記録した。３つの独立した実験の代表であるデータ（Ａ）、または３つ（Ｂ）もしくは２つ（Ｃ）の独立した実験からプールしたデータ。統計分析は、両側不対スチューデントｔ検定（Ｂ）、およびログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定（Ｃ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 肺がん細胞によって発現される従来のＭＨＣ－Ｉ分子がＮＫ細胞を阻害し、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体処理の有効性を低下させることを示す。（Ａ）ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞によるＭＨＣ－Ｉの発現。対照またはＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞を、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）または溶媒対照（ＰＢＳ）で２４時間刺激した。表面Ｈ－２Ｋ^ｂタンパク質レベルは、フローサイトメトリーによって定量した。（Ｂ）ＬＬＣ１肺がん細胞によって形成された肺転移のＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理。ＷＴＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、１×１０^６個（１Ｍ）または１．５×１０^６個（１．５Ｍ）のＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（対照またはＢ２ｍ－ＫＯ）を静脈内接種した。腫瘍細胞接種後２日目に、示されたｍＡｂでマウスを処理した（２００μｇを腹腔内投与）。追加の処理は、３日目に行い、その後週に１回行った。１４日目に肺転移を数えた。（Ｃ）同種または同系ＮＫ細胞で再構成したマウスにおけるＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移のＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ダブルノックアウトマウスに、それぞれＬＬＣ１細胞と同種または同系のＣＢ６Ｆ１／ＪマウスまたはＣ５６ＢＬ／６マウス由来のＮＫ細胞（２×１０^５個の細胞）を注射した。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－マウスの第３群にはＮＫ細胞を投与しなかった。ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（７×１０^５）を静脈内注射した。ＮＫ細胞移入の２４時間後。腫瘍細胞接種後の２、３日目、およびその後は週に１回、示された抗体（２００μｇ）でマウスを処理した。１４日目に転移を数えた。３つの独立した実験の代表であるデータ（Ａ）、または３つ（Ｂ）もしくは２つ（Ｃ）の独立した実験からプールしたデータ。統計分析は、両側不対スチューデントｔ検定（Ｂ～Ｃ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＮＫ細胞がＢ２ｍおよびＪａｋ１欠損メラノーマ転移のＭＩＣＡ／Ｂ抗体による処理に不可欠であることを示す。（Ａ）野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７×１０^５個のＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞（対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ）を静脈内接種した。１日後ならびに２日目および７日目に、７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ）でマウスを処理した。ＣＤ８ Ｔ細胞の枯渇は１００μｇの抗ＣＤ８βを注射することによって実行したのに対し、ＮＫ細胞の枯渇は１００μｇの抗アシアロＧＭ１（抗ａｓＧＭ１）または抗ＮＫ１．１を注射することによって実行した。すべての枯渇抗体は、腫瘍細胞接種に対して－１日目、０日目、および７日目に投与した。対照マウスにはアイソタイプ対照抗体を投与した。肺表面転移は、腫瘍接種後１４日目に定量した。（Ｂ）肺組織へのＮＫ細胞浸潤の分析。腫瘍注射およびｍＡｂ処理は、フローサイトメトリーによる同定を可能にするためにＺｓＧｒｅｅｎを発現した腫瘍細胞を用いて、「Ａ」に記載されているように行った。腫瘍細胞接種後１２日目に、以前に報告されたように（２３）、マウスにＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４５．２抗体を静脈内注射して、血液および組織浸潤ＮＫ細胞を区別した。肺浸潤ＮＫ細胞は、ＣＤ３ε－ＴＣＲβ－ＮＫ１．１＋ＣＤ４９ｂ＋ＥＯＭＥＳ＋生細胞として同定され、ＣＤ４５．２－ＡＰＣ（静脈内注射）では染色が低く、ＣＤ４５．２－ＰＥ－ＣＹ７（細胞懸濁液に添加）では染色が高い。ＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞に対するＮＫ細胞の比率が示されている。（Ｃ、Ｄ）（Ｂ）に記載された実験の示された遺伝子型および処理群についてのＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞（Ｃ）および肺浸潤ＮＫ細胞（Ｄ）の数。ＥＯＭＥＳ標識を使用して、ＮＫ細胞をＩＬＣ１から区別した。２つの独立した実験からプールしたデータ（Ａ～Ｄ）。統計分析は、ボンフェローニの事後検定（Ａ）または両側不対スチューデントｔ検定（Ｂ～Ｄ）を使用した二元ＡＮＯＶＡを使用して実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ、０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせが、腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂの表面レベルを高めることを示す。（Ａ）パノビノスタットによる処理後のＮＫＧ２ＤリガンドｍＲＮＡレベルの増加。Ａ３７５メラノーマ細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）で２４時間処理し、バルクＲＮＡ－ｓｅｑのためにｍＲＮＡを抽出した。ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＭＨＣクラスＩ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、パノビノスタットおよびＰＢＳ群の比率（ｌｏｇ２倍率変化）として示されている。（Ｂ）Ａ３７５メラノーマ細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）または溶媒対照（ＰＢＳ）で２４時間処理し、示された遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲ（条件ごとに３回）で分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。統計分析は、ウェルチの補正による両側不対スチューデントｔ検定を使用して実行した。エラーバーは、３つの技術的複製の標準偏差を表す。（Ｃ）パノビノスタット＋ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによる処理後のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルの増加。Ａ３７５メラノーマ細胞を、示されたｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）および増加濃度のパノビノスタットにより、２４時間インキュベートした。ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベル（左）とＡ３７５細胞生存率（右）は、フローサイトメトリーによって定量した。シェディングＭＩＣＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した（中央）。（Ｄ）図２２Ｃに示されているデータの代表的なヒストグラム。（Ｅ）パノビノスタット＋ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせによる短期ヒトメラノーマ細胞株の処理。示されたメラノーマ細胞株を、示されたｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）＋増加濃度のパノビノスタットにより、２４時間インビトロで処理した。ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルは、フローサイトメトリーによって定量した。細胞株は、ＭＩＣＡ／Ｂの基礎レベルおよび誘導レベルが異なっていた。それらを、低～高のＭＩＣＡ／Ｂ発現の順に並べた。３つの独立した実験（Ｂ、Ｃ、およびＥ）の代表であるデータ。 ＨＤＡＣ－ＭＩＣＡ／Ｂ抗体併用療法が、ヒトＮＫ細胞で再構成されたＮＳＧマウスの転移の増殖を阻害することを示す。（Ａ）ヒトメラノーマ細胞によって形成された転移中のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルに対する、パノビノスタット＋ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理のインビボ相乗効果。ＮＳＧマウスに１×１０^６個のＺｓＧｒｅｅｎ＋Ａ３７５メラノーマ細胞を静脈内接種した。２週間後、マウスを、その後２日間、示されたｍＡｂ（２００μｇ）＋／－パノビノスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）により処理した。最後の処理から２４時間後、ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルを肺転移中の腫瘍細胞（大きく、生存可能なＺｓＧｒｅｅｎ＋、ＣＤ４５－細胞）で分析した。（Ｂ～Ｃ）ＮＳＧマウスを、インビトロで増殖させた精製ヒトＮＫ細胞（２×１０^６個を静脈内注射）で再構成した。ＮＫ細胞のインビボ生存を、腹腔内注射によるＩＬ－２（７．５×１０^４個の単位）の同時投与によってサポートした。１日目に、マウスに対照またはＢ２Ｍ－ＫＯ Ａ３７５細胞（５×１０^５）を静脈内接種した。２日目および３日目に、マウスに、別の用量のＩＬ－２、示されたｍＡｂ（２００μｇ）＋／－１０ｍｇ／ｋｇパノビノスタットを投与した。３日目に、追加用量のＮＫ細胞を投与した。１４日目に、肺表面転移の数を数えた。実験設計（Ｂ）および肺表面転移の定量（Ｃ）の例証。２つの独立した実験からプールしたデータ（ＡおよびＣ）。統計分析は、両側不対スチューデントｔ検定（Ａ）および二元ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの事後検定（Ｃ）によって実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｂ２Ｍ欠損Ａ３７５メラノーマ細胞の特徴と、ＭＨＣ－１の認識によるＮＫ細胞を介したメラノーマ細胞の殺傷の阻害を示す。（Ａ）Ａ３７５メラノーマ細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子不活化の効率の検証。対象およびＢ２Ｍ－ＫＯ細胞を、指示された濃度のＩＦＮγ（１ｎｇ／ｍｌ）またはＰＢＳで２４時間処理し、表面ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃタンパク質レベルをフローサイトメトリーで定量した。（Ｂ）対照およびＢ２Ｍ－ＫＯ Ａ３７５メラノーマ細胞を、ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、または用いずに２４時間処理した。ウエスタンブロット（レーン当たり２０μｇの総タンパク質）をＢ２Ｍおよびチューブリンに特異的な抗体でプローブした。（Ｃ）健康なドナーから単離されたＮＫ細胞を１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で２４時間培養した。親のＡ３７５メラノーマ細胞を７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照抗体（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートした後、細胞傷害性アッセイで使用した。ＮＫ細胞を介したＡ３７５細胞の殺傷を、４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して分析した。示されたＫＩＲまたはアイソタイプ対照抗体を１０μｇ／ｍｌで共培養物に加えた。データは、３つの独立した実験の代表である（Ａ～Ｃ）。統計分析は、二元ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの事後検定（Ｃ）によって実行した。＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株の特性評価およびＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂのインビボ活性を示す。対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を、示された濃度のＩＦＮγで２４時間処理した。（Ｂ）Ｈ２－Ｄ^ｂの表面レベルをフローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（Ｃ）対照、Ｂ２Ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、または用いずに２４時間処理した。ウエスタンブロット（レーン当たり２０μｇの総タンパク質）を、Ｂ２Ｍ、ＪＡＫ１、またはＧＡＰＤＨ（ローディング対照）に特異的な抗体でプローブした。３つの独立した実験の代表であるデータ。 Ｂ２ｍ－ＫＯおよびＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞がＣＤ８ Ｔ細胞を介した細胞傷害性に耐性があることを示す。対照、Ｂ２ｍ－ＫＯおよびＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞にＯｖａペプチド（１０ｎＭ）を一晩パルスし、洗浄して９６ウェルプレートに添加した（ウェル当たり５，０００個の細胞）。ナイーブＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を、異なるエフェクター対標的比（１：１、２：１、および５：１、０：１の条件にはＴ細胞が含まれていない）で追加した。細胞を４８時間共培養した（条件ごとに８～１０回繰り返した）。次に、ウェルを洗浄してＴ細胞および腫瘍死細胞を除去し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して付着した生きている腫瘍細胞を数えた。統計的有意性は、複数のｔ検定を使用して決定した。エラーバーは、標準偏差を表す。＊＊＊ｐ＜０．０００１。 対照およびＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞株の特性評価を示す。（Ａ）対照およびＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞株を、示された濃度のＩＦＮγで２４時間培養し、Ｈ２－Ｄ^ｂの表面発現をフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）対照またはＢ２Ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞をＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、または用いずに２４時間処理した。ウエスタンブロット（レーン当たり２０μｇの総タンパク質）を、Ｂ２Ｍまたはチューブリン（ローディング対照）に特異的な抗体でプローブした。 Ｂ１６Ｆ１０転移モデルにおける７Ｃ６抗体のインビボでの有効性を示す。（Ａ）Ｂ細胞欠損（Ｉｇｈｍ^－／－）マウスに、７×１０^５個の対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。転移が確立されたら（７日目）、マウスをＭＩＣＡ／Ｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（７、８、および１２日目に２００μｇ）で処理した。血漿試料中のシェディングＭＩＣＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量した。データは、２つの独立した実験からプールした。統計分析は、二元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定によって実行した。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＷＴマウスに対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種し、図２１ＡおよびＢに記載されるように、示された抗体で処理した。ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６受容体の表面発現を、フローサイトメトリーによって、肺浸潤ＮＫ細胞について分析した。データは、２つの独立した実験からプールした。＊ｐ＜０．０５。両側不対スチューデントｔ検定で計算。 Ａ３７５細胞による遺伝子発現に対するパノビノスタットの効果を示す。（Ａ～Ｂ）Ａ３７５細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）またはＰＢＳで２４時間処理し、図２２Ａに記載されるようにバルクＲＮＡ－ｓｅｑで分析した。パノビノスタットまたは溶媒対照で処理した細胞において差次的に発現された主要な遺伝子（Ａ）、および対照で処理したＡ３７５細胞と比較して、パノビノスタットについて上方調節した主要な免疫学的経路（Ｂ）。ＦＤＲ：誤検出率；ｑ－ｖａｌ：ｑ値。 メラノーマ細胞によるＭＩＣＡ／Ｂ発現に対するパノビノスタット処理の効果を示す。図２２Ｅに示す原発性メラノーマ細胞株についてのデータの代表的なヒストグラム。 腫瘍細胞株の多様なパネルによるＭＩＣＡ／Ｂ発現に対するパノビノスタットおよび７Ｃ６抗体の効果を示す。（Ａ～Ｆ）ヒト腫瘍細胞株を、示された抗体（２０μｇ／ｍｌ）および増加濃度のＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットにより、２４時間処理した。ＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルは、ＰＥ標識６Ｄ４ ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーによって定量した（Ａ、Ｂの左側のグラフおよびグラフＣ～Ｆ）。上清中のシェディングＭＩＣＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した（ＡおよびＢの右側のグラフ）。アッセイ時のそのような抗体の利用可能性に基づいて、異なるＦｃ領域を有する７Ｃ６抗体を使用した。以前に報告されたように、この抗体のＦｃ領域はＭＩＣＡ／Ｂシェディングの阻害に影響を与えない（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１５３７－１５４２（２０１８））。３つの独立した実験の代表であるデータ。 ＭＩＣＢと比較したＭＩＣＡのＥＬＩＳＡアッセイの特異性を示す。ヒトＭＩＣＡ（対立遺伝子００９）またはＭＩＣＢ（対立遺伝子００５）ｃＤＮＡで形質導入したＢ１６Ｆ１０細胞株の上清を、この研究全体で使用したＭＩＣＡ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ５９５６９）のＥＬＩＳＡを使用して分析した。これらのＢ１６Ｆ１０細胞株は以前に記載されている（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１５３７－１５４２（２０１８））。ＥＬＩＳＡにより、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株によってシェディングされた可溶性ＭＩＣＡが検出されたが、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＢ細胞によって放出されたシェディングＭＩＣＢは検出されなかった。 パノビノスタットがヒトＮＫ細胞によるＮＳＧマウスの再構成を阻害せず、７Ｃ６ ｍＡｂと相乗的に作用して、メラノーマ転移上での表面ＭＩＣＡ／Ｂ発現を増強したことを示す。ＮＳＧマウスに、健康なドナーからの２×１０^６個のインビトロで増殖させたヒトＮＫ細胞を静脈内注射した。ＮＫ細胞接種の直後に、マウスをＩＬ－２（７．５×１０^４個の単位）で処理して、ＮＫ細胞の生存をサポートした。また、マウスには、対照としてパノビノスタット（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを投与した。２４時間後、血液ＮＫ細胞をフローサイトメトリーで分析した。（Ａ）ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ３－生細胞として同定した循環ＮＫ細胞の数。（Ｂ、Ｃ）ＣＤ１６ａ（Ｂ）またはＮＫＧ２Ｄ（Ｃ）ｍＡｂで標識した血液ＮＫ細胞のパーセンテージ。２つの独立した実験からプールしたデータ（Ａ～Ｃ）。（Ｄ）図２３Ａに示されるデータの代表的なヒストグラム。 遺伝子ならびに対応する種および配列を示す。

詳細な説明
細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性は、多くの経路の変異から生じる可能性がある。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性は、とりわけ、Ｂ２ＭまたはＪＡＫ１遺伝子の変異など、腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現またはＩＦＮγシグナル伝達の喪失によって媒介されることがよくある。活性化されたＮＫ細胞はそのような耐性腫瘍を標的とすることができるが、好適なＮＫ細胞ベースの戦略はまだ開発されていない。本明細書に記載される実施形態の態様は、この欠点に対処する。具体的には、ヒトがんにおける頻繁な回避メカニズムであるＭＩＣＡ／Ｂシェディングを遮断したｍＡｂによる処理後に、Ｂ２ＭおよびＪＡＫ１欠損転移がＮＫ細胞の標的となったことが示されている。例示的なｍＡｂは、ＷＯ２０１８２１７６８８Ａ１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

さらに、チェックポイント遮断後に進行した患者を含む、ヒトメラノーマ転移におけるＮＫ細胞の単細胞分析により、腫瘍浸潤ＮＫ細胞と循環ＮＫ細胞との主要な転写の違いが特定された。ＮＫ細胞は、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによる療法に失敗した患者を含む、ほとんどのヒトメラノーマ転移に存在する。これらの細胞は、細胞傷害性などの重要な機能を反映する転写プログラム、および関連する受容体（ＸＣＲ１）を発現する樹状細胞を動員するＸＣＬ１およびＸＣＬ２などのＴ細胞を介した腫瘍免疫に必要である主要な免疫細胞集団を動員するケモカインの分泌を有する。

最後に、７つの腫瘍浸潤ＮＫ細胞クラスターの遺伝子発現プログラムは、細胞傷害性およびケモカイン分泌を含む重要な特殊化を示している。したがって、ＮＫ細胞ベースの免疫療法は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性を持たせる変異を有する腫瘍を標的とする機会を提供する。

略語および定義
１つ以上の実施形態の詳細な説明が本明細書に提供される。しかしながら、これらの実施形態は、様々な形態で具体化することができる。したがって、本明細書に開示された特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の根拠として、および当業者に本明細書に記載の実施形態を任意の適切な方法で用いるように教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。特許請求の範囲および／または明細書において「備える」という用語とともに使用されるときの「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つ以上」の意味とも一致する。

「例えば」、「など」、「含む」などの句のいずれかが本明細書で使用される場合は常に、他に明確に記載されない限り、「限定することなく」という句が付随することが理解される。同様に、「一例」、「例示的」などは、非限定的であると理解される。

「実質的に」という用語は、意図した目的に悪影響を与えない記述語からの逸脱を可能にする。記述用語は、「実質的に」という語が明確に列挙されていなくても、「実質的に」という用語によって修飾されることが理解される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（ならびに同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、用語の各々は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下（ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」を意味する非限定用語（ｏｐｅｎ ｔｅｒｍ）であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを除外しないとも解釈される。よって、例えば、「ステップａ、ｂ、およびｃを含むプロセス」は、プロセスが少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。「ａ」または「ａｎ」という用語が使用される場合は常に、そのような解釈が文脈において無意味でない限り、「１つ以上」と理解される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、本明細書では、おおよそ、大まかに、およそ、またはその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、それは、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、２０パーセント上または下の（高い、または低い）分散によって記載された値を上回る、および下回る数値を修飾するために使用される。

治療方法
本明細書に記載の実施形態の態様は、がんなどの細胞増殖性障害を治療する方法を対象とする。より具体的には、本明細書に記載の実施形態の態様は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるがんなどのチェックポイント遮断耐性がんを治療する方法を対象とする。

「がん」および「がん性」という用語は、通常、無秩序な細胞成長、ならびにいくつかの特徴的な構造的および／または分子的特徴のうちのいずれかによって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を指すか、または説明することができる。「がん性細胞」は、特定の構造特性を有し、分化を欠き、多くの場合、浸潤および転移が可能である細胞として理解される。ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６ｔｈ．Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照されたい）。がんという用語は、例えば、卵巣がん、子宮頸がんおよび子宮がんを含む女性生殖器官のがん；肺がん；乳がん；腎細胞がん種；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；例えば、腎がん、前立腺がん、膀胱がんおよび尿道がんを含む泌尿生殖器系のがん；頭頸部がん；肝がん；例えば、胃がん、食道がん、小腸がんまたは結腸がんを含む胃腸系のがん；胆道樹のがん；膵がん；例えば、精巣がんを含む男性生殖器系のがん；妊娠性絨毛性疾患；例えば、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、がん様腫瘍、インスリン腫およびＰＮＥＴ腫瘍を含む内分泌系のがん；例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫を含む肉腫；中皮腫；皮膚のがん；メラノーマ；中枢神経系のがん；小児がん：ならびに、例えば、あらゆる形態の白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫を含む造血系のがんなどを含む。がんはまた、膀胱がんなどの泌尿器がん；膀胱、乳房、頸部、胆管がん、結腸直腸、食道、胃、頭頸部、腎臓、肝臓、肺などのがん腫；^’鼻咽頭、卵巣、膵臓／胆嚢、前立腺がんおよび甲状腺がん腫；骨肉腫、滑膜肉腫および横紋筋肉腫などの筋骨格系がん；ＭＦＨ／線維肉腫、平滑筋肉腫およびカポジ肉腫などの軟部肉腫；多発性骨髄腫、リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの造血器悪性腫瘍；ならびに、膠芽腫、星状細胞腫、メラノーマ、中皮腫およびウィルムス腫瘍など他の新生物を含むことができる（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ２００３ ４（１２）：９１２－９２５。

「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指すことができる。

「腫瘍」という用語は、悪性であろうと良性であろうと、すべての腫瘍性細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指すことができる。

文脈によって別段の指示がない限り、本明細書で使用される「がん」という用語は、がん、細胞増殖性障害または腫瘍を指すことができる。同様に、「がん細胞」という用語は、文脈によって別段の指示がない限り、がん、細胞増殖性障害または腫瘍の細胞を指すことができる。

文脈によって別段の指示がない限り、「がん」、「細胞増殖性障害」または「腫瘍」という用語は交換可能に使用することができる。

「治療する」または「治療」という用語は、治療的処置および予防的もしくは防御的手段の両方を指し、その望ましい結果は、がんの進行などの望ましくない生理学的変化もしくは障害を予防するか、減速（軽減）するか、または逆転させることである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和、疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化しない）疾患の状態、疾患の進行の遅延または緩徐、病状の改善または緩和、寛解（部分的もしくは全体的）が挙げられ、検出可能か否かは問わない。「治療」とは、治療を受けていない場合に予想される生存率と比較して、生存期間を延長することを指す。治療を必要とする者としては、すでに状態もしくは障害に罹患している者、ならびに状態もしくは障害に罹患しやすい者、または状態もしくは障害を予防する必要がある者を挙げることができる。

例えば、がんの文脈において、「治療すること」という用語は、腫瘍細胞、がん細胞もしくは腫瘍の成長、増殖もしくは転移を防ぐこと、腫瘍細胞もしくはがん細胞の複製を防ぎ、全体的な腫瘍量を減らすか、あるいはがん性細胞数を減らし、疾患に関連する１つ以上の症状を改善すること、のうちのいずれかまたはすべてを含むことができる。

本明細書に記載の実施形態は、がん、または他の細胞増殖関連疾患もしくは障害のリスクがあるか、または感受性がある対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。例えば、方法は、がんの徴候を治療、予防、または軽減するために使用される。一実施形態では、方法は、固形腫瘍の徴候を治療、予防、または軽減するために使用される。本明細書の実施形態によって治療することができる他の腫瘍の非限定的な例としては、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、腎がん、乳がん、子宮頸がん、脳がん、皮膚がん、肝がん、膵がんまたは胃がんが挙げられる。加えて、本明細書に記載の実施形態の方法は、白血病およびホジキンリンパ腫などのリンパ腫などの血液がんを治療するために使用することができる。代替的に、方法を使用して、転移したがんの症状を治療、予防、または緩和することができる。

一実施形態では、本明細書に記載の実施形態は、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＴ細胞ベースの療法（チェックポイント遮断など）に耐性のあるがんに罹患している、がんのリスクがある、またはがんに感受性のある対象を治療する方法を提供する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）タンパク質に結合した腫瘍由来ペプチドを認識するその能力に基づいて、チェックポイント遮断の有効性において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によってこのようなＭＨＣ－Ｉ－ペプチド複合体が認識されると、Ｔ細胞がインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）を放出し、腫瘍細胞の増殖が阻害され、腫瘍細胞と樹状細胞の両方においてＭＨＣ－Ｉタンパク質の発現が増強される。したがって、チェックポイント遮断に対する耐性は、ＭＨＣ－Ｉ（Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および他の遺伝子）またはＩＦＮγ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２）経路における主要遺伝子の変異またはエピジェネティックなサイレンシングのいずれかによる、腫瘍細胞によるＭＨＣ－Ｉ発現の喪失によって、媒介される場合が多い。新生抗原の数が少ないかまたは失われていると、細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍免疫も低下する。

したがって、一態様では、本明細書に記載の実施形態は、抗腫瘍ＮＫ細胞応答を活性化させるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体（例えば、ｓｃＦｖ抗体または二重特異性抗体）を対象に投与することによって、対象の症候性がんまたは細胞増殖性疾患もしくは障害を予防、治療または軽減するための方法を提供する。活性化されたＮＫ細胞応答は、例えば、腫瘍生検の分析（治療前の生検と治療後の生検との比較など）によって決定することができる。このような分析としては、例えば、ＮＫｐ４６およびＣＤ５６などのＮＫ細胞マーカーとともに、グランザイムＡおよびパーフォリンの多色蛍光抗体法を挙げることができる。

一実施形態では、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体を対象に投与することができる。多くのヒトがんは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の亜集団上の活性化ＮＫ群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドとして機能するＭＨＣ－Ｉポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）およびＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）タンパク質を発現する。しかしながら、腫瘍は、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質のタンパク質分解によるシェディングにより、ＮＫＧ２Ｄ受容体を介した腫瘍免疫を回避することがよくある。ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインはシェディングに不可欠なドメインであり、このドメインに結合するモノクローナル抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのシェディングを阻害し、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を誘導することができる。腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の密度の増加は、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体を介した活性化を増強し、腫瘍コンジュゲート抗体のＦｃセグメントもＣＤ１６Ｆｃ受容体を介してＮＫ細胞を活性化させた。このようなＭＩＣＡ／Ｂ抗体による治療により、腫瘍浸潤ＮＫ細胞が、細胞傷害性の高い状態へと著しく変化した。

本明細書の実施形態において利用することができる抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体の非限定的な例には、抗ＭＩＣＡ／Ｂに特異的な任意の抗体が含まれる。一実施形態では、抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインに特異的である。例えば、ＷＯ２０１８２１７６８８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

したがって、本明細書に記載の実施形態は、タンパク質分解によるシェディング部位であるＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）および／またはＢ（ＭＩＣＢ）ａ３ドメインと特異的に結合し、望ましい機能特性を有するヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体などの抗体を含む。これらの特性としては、ヒトがん細胞によるＭＩＣＡ／Ｂシェディングの阻害、ＮＫ細胞認識のための細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂの安定化、およびＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６ Ｆｃ受容体の両方の活性化が挙げられる。これらの特性を有するＭＩＣＡ抗体は、細胞傷害性リンパ球を活性化させるストレス分子による免疫活性化を回復する。

いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、それぞれ表１に示すような配列番号１～３を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、それぞれ表１に示すような配列番号４～６を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖可変領域、配列番号１～３をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４～６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

本明細書に提供されるのは、ＭＩＣＡおよび／もしくはＭＩＣＢに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、重鎖可変領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に提供されるのは、ＭＩＣＡおよび／もしくはＭＩＣＢに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、軽鎖可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

例えば、抗体は、クローン７Ｃ６（例えば、７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）、６Ｆ１１、および／または１Ｃ２を含む。

関連する態様では、本明細書の実施形態は、抗ＭＩＣＡおよび／または抗ＭＩＣＢ抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、あるいはその抗原結合部分、核酸分子を含む発現ベクター、ならびに発現ベクターで変換された細胞を含むことができる。また、本明細書の実施形態は、細胞内で抗ＭＩＣＡおよび／または抗ＭＩＣＢ抗体を発現し、細胞から抗体を単離することを含む、抗ＭＩＣＡおよび／または抗ＭＩＣＢ抗体を調製する方法をさらに含むことができる。

抗ＭＩＣＡおよび／もしくは抗ＭＩＣＢ抗体、またはその抗原結合部分、ならびに担体を含む組成物も本明細書に提供される。薬剤に連結された、本明細書に記載の抗ＭＩＣＡおよび／または抗ＭＩＣＢ抗体を含むイムノコンジュゲートも本明細書に提供される。抗ＭＩＣＡおよび／もしくは抗ＭＩＣＢ抗体、またはその抗原結合部分を含むキット、ならびに使用説明書も本明細書に提供される。

実施形態では、抗体は、本明細書にさらに記載されるように、治療有効量で投与することができる。

「患者」または「対象」という用語は、交換可能に使用することができる。「患者」または「対象」の例としては、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥および家禽が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、患者は、ヒトである。

「がん患者」は、がんを有すると診断された個人を指すことができる。がんの例としては、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、メラノーマなどの固形腫瘍および他の組織器官の腫瘍、ならびにリンパ腫および白血病などの血液腫瘍（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、およびＢ細胞リンパ腫を含む）、脳および中枢神経系の腫瘍（例えば、髄膜、脳、脊髄、頭蓋神経およびＣＮＳの他の部分の腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫または髄質芽細胞腫）；頭部および／または頸部がん、乳がん、循環器系の腫瘍（例えば、心臓、縦隔および胸膜、および他の胸腔内臓器、血管腫瘍、ならびに腫瘍関連血管組織）；血液およびリンパ系の腫瘍（例えば、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、悪性免疫増殖性疾患、多発性骨髄腫、および悪性形質細胞新生物、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、単球性白血病、特定の細胞型の他の白血病、不特定の細胞型の白血病、リンパ様の不特定の悪性新生物、造血および関連組織（びまん性大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫または皮膚Ｔ細胞リンパ腫など）；排出系の腫瘍（例えば、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、および他の泌尿器）；消化管の腫瘍（例えば、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門、および肛門管）；肝臓および肝内胆管、胆嚢、および胆道の他の部分、膵臓、ならびに他の消化器を含む腫瘍；口腔の腫瘍（例えば、唇、舌、歯茎、口底、口蓋、耳下腺、唾液腺、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨子状窩、下咽頭、および口腔の他の部位）；生殖器系の腫瘍（例えば、外陰部、膣、子宮頸部、子宮、卵巣、および女性生殖器に関連する他の部位、胎盤、陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器に関連する他の部位）；気道の腫瘍（例えば、鼻腔、中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど））；骨格系の腫瘍（例えば、四肢の骨および関節軟骨、骨関節軟骨、ならびに他の部位）；皮膚の腫瘍（例えば、皮膚の悪性メラノーマ、非メラノーマ皮膚がん、皮膚の基底細胞がん、皮膚の扁平上皮がん、中皮腫、カポジ肉腫）；ならびに、末梢神経および自律神経系、結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜、眼、甲状腺、副腎、ならびに他の内分泌腺および関連構造を含む他の組織を含む腫瘍、リンパ節の二次および不特定の悪性新生物、呼吸器系および消化器系の二次悪性新生物、ならびに他の部位の二次悪性新生物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、上記がんは、メラノーマ、非小細胞肺がんなどの肺がん、前立腺がん、腎細胞がん、または結腸直腸がんである。

がんまたは細胞増殖関連疾患もしくは障害のリスクがあるか、あるいはそれに感受性がある対象としては、がんの家族歴を有する患者、またはがんを引き起こすことが知られているか、もしくは疑われる薬剤に曝露された対象を挙げることができる。予防剤の投与は、疾患が予防されるか、または代替的に、その進行が遅延されるようにがんの徴候の前に行うことができる。治療薬の投与は、対象ががんと診断された後に、疾患の進行が逆転、遅延または停止されるように行うことができる。

一態様では、本明細書に記載の実施形態は、抗腫瘍ＮＫ細胞応答を活性化させるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体（例えば、ｓｃＦｖ抗体または二重特異性抗体）を対象に投与することによって、対象の症候性がんまたは細胞増殖性疾患もしくは障害を予防、治療または軽減するための方法を提供する。本明細書に記載される場合、「治療すること」という用語は、腫瘍細胞、がん細胞もしくは腫瘍の成長、増殖もしくは転移を防ぐこと、腫瘍細胞もしくはがん細胞の複製を防ぎ、全体的な腫瘍量を減らすか、あるいはがん性細胞数を減らし（例えば、細胞溶解を誘導することによって）、疾患に関連する１つ以上の症状を改善すること、のうちのいずれかまたはすべてを含むことができる。

本明細書で使用される場合、「転移」は、悪性腫瘍がその起源の視界から遠くに広がることを指すことができる。がん細胞は、血流、リンパ系、体腔、またはそれらの任意の組み合わせを介して転移する可能性がある。

「細胞増殖」という用語は、例えば、細胞分裂によるか、または細胞死の阻害（例えば、壊死、アポトーシス）によるかどうかにかかわらず、細胞数の相対的な増加を指すことができる。不適切な細胞増殖は、例えば、不適切な細胞成長、過剰な細胞分裂、細胞分裂（すなわち、有糸分裂）、および／または不適切な細胞生存に起因する可能性がある。

「細胞溶解」という用語は、壁または膜の破壊による細胞の崩壊を指すことができる。例えば、細胞の破壊（すなわち、溶解）は、細胞の完全性を損なうウイルスメカニズム、化学メカニズム、酵素メカニズム、または浸透圧メカニズムによるものであり得る。

別の態様では、本明細書に記載の実施形態は、ナチュラルキラー細胞の抗がん効果に対してがんまたはがん細胞を感作させるための方法を提供する。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞、Ｋ細胞、および／またはキラー細胞としても知られている）は、腫瘍および事実上感染した細胞の宿主拒絶反応において役割を果たすリンパ球の一種である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞が必要とするものとは実質的に異なる分子メカニズムによって腫瘍細胞を認識する。腫瘍細胞のＮＫ細胞認識は、ＤＮＡ損傷および細胞ストレスなどの悪性形質転換に関連するリガンドによって媒介される。理論に拘束されることを望まないが、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法アプローチに応答することができる。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子との相互作用時に阻害性受容体によって提供される負のシグナルと、様々な活性化受容体によって促進される正のシグナルとのバランスによって決まる。ＮＫ細胞は、自然の細胞傷害性応答の促進に協力する広範な活性化受容体を発現する。これらの受容体としては、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー受容体メンバー２Ｂ４、Ｉｇ様受容体ＤＮＡＸアクセサリー分子－１（ＤＮＡＭ１）、およびレクチン様受容体ナチュラルキラー受容体群２、メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６ａ（ＩｇＧの受容体）が挙げられる。

ＮＫＧ２Ｄは、すべてのＮＫ細胞上で構成的に発現する強力な活性化受容体であるが、不変のナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ならびにＣＤ８^＋αβ Ｔ細胞およびγδ Ｔ細胞などのＴ細胞のサブセット上にも存在する。ＮＫＧ２Ｄは、健康な細胞上での発現が不十分ないくつかのリガンドと結合することができるが、がんまたはウイルス感染の状況で刺激を与えると上方調節される。いくつかのインビボモデルは、異常細胞に対するＮＫ細胞応答におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の基本的な役割を示す。

ＮＫＧ２Ｄ受容体の最も顕著な特徴は、ストレス経路によって誘導される自己タンパク質の大きなレパートリーに結合し、したがって「誘導された自己」認識を媒介する能力にある。ヒトでは、これらのリガンドには、高度に多型性のＭＨＣクラスＩ関連タンパク質（ＭＩＣ）ＡおよびＭＩＣＢ、ならびにＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）の６つのメンバーが含まれる。ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）は、健康な組織の大部分の表面上には存在しないが、有糸分裂、ウイルス感染、およびがんなどのストレス条件下で、主に転写レベルおよび転写後レベルで作用するいくつかの経路によって上方調節される。

多くのヒトがんは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の亜集団上の活性化ＮＫ群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドとして機能するＭＨＣ－Ｉポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）およびＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）タンパク質を発現する。しかしながら、腫瘍は、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質のタンパク質分解によるシェディングにより、ＮＫＧ２Ｄ受容体を介した腫瘍免疫を回避することがよくある。ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインはシェディングに不可欠なドメインであり、このドメインに結合するモノクローナル抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのシェディングを阻害し、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を誘導することができる。腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の密度の増加により、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体を介した活性化が増強された。このようなＭＩＣＡ／Ｂ抗体による治療により、腫瘍浸潤ＮＫ細胞が、細胞傷害性の高い状態へと著しく変化した。

ＮＫＧ２Ｄに加えて、腫瘍コンジュゲート抗体のＦｃセグメントは、ＣＤ１６Ｆｃ受容体を介してＮＫ細胞も活性化させた。ＩｇＧが結合すると、ＣＤ１６はシグナル伝達カスケードを開始し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、脱顆粒、およびサイトカイン分泌など、多様な応答を生成する。ＣＤ１６は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球上に発現している。この文脈では、ＮＫ細胞上でのその発現は特に関連性がある。

実施例を参照すると、ＭＨＣクラスＩ欠損腫瘍細胞（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍）は、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６を介してＮＫ細胞を活性化させるＭＩＣＡ抗体などの活性化剤の存在下で効率的に殺傷される。したがって、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍は、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６を介したＮＫ細胞の活性化によって標的とすることができる。

本明細書に記載の実施形態の態様は、活性化剤および抗がんＮＫ細胞応答を活性化させるためのその使用を含む。「活性化剤」という用語は、ＮＫ細胞の活性化を可能にする任意の薬剤を指すことができる。例えば、活性化剤は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を介してＮＫ細胞を活性化させることができる。例えば、活性化剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、生物学的薬剤、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）、または小分子であり得る。ＮＫ細胞の活性化の分子マーカーは当技術分野で知られており、これには、細胞傷害性タンパク質（パーフォリン、グランザイムＡ）およびサイトカイン（ＩＦＮガンマなど）の高レベルの発現が含まれる。一実施形態では、活性化剤は、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体などの抗体またはその断片である。一実施形態では、活性化剤は、表１に記載されているような抗体またはその断片である。

本明細書に記載の実施形態の態様は、薬剤耐性がんの症状を予防、治療、または緩和するために有用である。本明細書で使用される場合、「薬剤耐性」または「難治性」がん、細胞増殖性障害または腫瘍は、細胞が同等の感受性細胞と比較して薬剤に対する細胞傷害性の低下を示す難治性がん、細胞増殖性障害または腫瘍を指すことができる。例えば、腫瘍および／またはがん細胞は、チェックポイント遮断療法によって誘導されるものなどの細胞傷害性Ｔ細胞に耐性を示す可能性がある。

例えば、本明細書に記載の実施形態の態様は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるがんおよびＴ細胞を活性化させる免疫療法に耐性のあるがんなどのチェックポイント遮断の症状を予防、治療、または緩和するのに有用である。例えば、がんは、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、および／または抗ＰＤＬ１抗体に耐性がある可能性がある。免疫チェックポイントは、免疫反応を遅くするか、または停止させ、免疫細胞の制御されていない活動による過度の組織損傷を予防する阻害性経路である。「チェックポイント遮断（ＣＰＢ）療法」は、阻害性経路を阻害し、より広範な免疫活性を可能にする療法を指す。そのような療法は、阻害性経路を阻害する任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、あるいはその断片による治療を含み得る。「チェックポイント遮断療法」は、既存の免疫応答の刺激を指すことができる。特定の実施形態では、ＣＰＢ療法は、プログラム死－１（ＰＤ－１）経路の阻害剤、例えば、ニボルマブなどであるがこれに限定されない抗ＰＤ１抗体による療法である。他の実施形態では、ＣＰＢ療法は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）抗体を用いた療法である。追加の実施形態では、ＣＰＢ療法は、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１またはＫＩＲなどのＣＤ２８ＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーを標的とする（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６５：２７（２０１４））。さらなる追加の実施形態では、ＣＰＢ療法は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７またはＴＥＶＩ－３などのＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを標的とする。場合によっては、チェックポイント阻害剤の標的化は、阻害抗体または同様の分子を使用して達成される。他の場合では、それは標的のアゴニストで達成される。このクラスの例としては、刺激標的ＯＸ４０およびＧＩＴＲが挙げられる。例えば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１抗体およびそれらの組み合わせから選択される抗体による療法を含むＣＰＢ療法である。

ＣＰＢ療法の性質は、本明細書に記載の実施形態にとって重要ではなく、好適な薬剤の例が本明細書に記載されている。実施形態では、ＣＰＢ療法は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１抗体およびそれらの組み合わせから選択される抗体による療法である。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブである。例示的な抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブである。ＣＰＢ療法を受けているかなりの数のがん患者は、最初の退行期間の後、ＣＰＢ療法に耐性になり、結果として腫瘍の進行をもたらす。ＣＰＢ療法への耐性は、とりわけＢ２ＭおよびＪａｋ１などの抗原処理経路またはその産物に関連する遺伝子の発現低下に関連している。本明細書に記載されるように、ヒトがんにおける頻繁な回避メカニズムであるＭＩＣＡ／Ｂシェディングを遮断したｍＡｂによる処理後に、Ｂ２ＭおよびＪＡＫ１欠損転移がＮＫ細胞の標的となった。

本明細書に記載の実施形態の態様は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるがんの症状を予防、治療、または緩和するために有用である。「Ｔ細胞」は、Ｔリンパ球を指し、γ：δ^＋Ｔ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むが、これらに限定されない。ＣＤ４＋Ｔ細胞としては、Ｔ_Ｈ０、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２細胞、ならびに制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）が挙げられる。制御性Ｔ細胞には少なくとも３つのタイプがある：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ_ｒｅｇ、ＣＤ２５^－Ｔ_Ｈ３ Ｔ_ｒｅｇ、およびＣＤ２５_－ＴＲ１ Ｔ_ｒｅｇ。「細胞傷害性Ｔ細胞」は、別の細胞を殺傷することができるＴ細胞を指す。細胞傷害性Ｔ細胞の大部分はＣＤ８＋ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞であるが、一部の細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ４＋である。

ほとんどのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＭＨＣ分子に結合したペプチド抗原（または抗原のペプチド断片）の複合体（ＭＨＣ：抗原複合体）を認識する。ＴＣＲは、各Ｔ細胞の抗原特異性、およびＭＨＣクラスＩ分子とＭＨＣクラスＩＩ分子によって表示される抗原の認識の制限に関与する。ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来するＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩＩに制限されている。つまり、ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来するＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって表示される抗原のみを認識する。ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩに制限されており、ＭＨＣクラスＩ分子によって表示される抗原のみを認識する。

理論に拘束されることを望まないが、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法アプローチに応答することができる。実際、腫瘍細胞（ＭＨＣクラスＩ欠損がんとも呼ばれる）によるＭＨＣ－Ｉ発現の喪失は、ＭＨＣ－Ｉタンパク質が阻害性ＮＫ細胞受容体のリガンドとして機能するため、ＮＫ細胞に対する感受性を高める。したがって、本明細書に記載の実施形態の態様はまた、ＭＨＣクラスＩ欠損がんの症状を治療、予防、または軽減するのに有用であると見なすことができる。

本明細書に記載の実施形態の態様はまた、Ｔ細胞によって放出されるＩＦＮガンマに耐性のあるがんの症状を治療、予防、または軽減するのに有用であると見なすことができる。例えば、本明細書に記載の実施形態の態様は、ガンマインターフェロン経路に１つ以上の喪失変異を有する腫瘍に対してＮＫ細胞を活性化させることを含むことができる。

本明細書に記載の実施形態の態様はまた、ＭＨＣクラスＩ欠損であり、またＩＦＮガンマに耐性のあるがんの症状を治療、予防、または軽減するのに有用であると見なすことができる。

さらに、本明細書に記載の実施形態の態様は、がん免疫療法に耐性のあるがんの症状を予防、治療、または緩和するために有用である。がん免疫療法は、腫瘍と戦うために患者自身の免疫系を誘導するように設計された治療戦略の多様なセットを指すことができる。

がんの治療には、いくつかのタイプの免疫療法が使用される。これらの治療は、免疫系ががんを直接攻撃するのを助けるか、あるいはより一般的な方法で免疫系を刺激することができる。

免疫系ががんに対して直接作用するのを助ける免疫療法のタイプとしては、免疫系が腫瘍に対してより強く応答するのを助ける薬物であるチェックポイント遮断剤が挙げられる。これらの薬物は、Ｔ細胞ががん細胞を殺傷しないようにする阻害剤経路を放出することによって作用する。これらの薬物は、腫瘍を直接標的としない。代わりに、これらの薬物は、免疫系の攻撃を回避するがん細胞の能力を妨害する。そのような免疫療法としては、例えば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１および／または抗ＰＤＬ１などのチェックポイント遮断阻害剤を挙げることができる。養子細胞移入は、対象のＴ細胞ががんと戦う自然な能力を高めようとする治療法である。この治療では、Ｔ細胞を対象の腫瘍から採取し、次にがんに対して最も活性のあるＴ細胞を実験室で大量に成長させてから、対象に投与して戻す。養子細胞移入には、特定のがんを標的とするために実験室で設計されたＴ細胞を使用するＣＡＲ Ｔ細胞療法と呼ばれる療法が含まれる場合がある。治療用抗体としても知られるモノクローナル抗体は、実験室で生産される免疫系タンパク質である。これらの抗体は、がん細胞に見られる特定の標的に付着するように設計されている。いくつかのモノクローナル抗体は、免疫系によってよりよく見られ、破壊されるようにがん細胞をマークする。これらは、免疫療法の一種である。がん治療に使用される他のモノクローナル抗体は、免疫系からの応答を引き起こさない。このようなモノクローナル抗体は、免疫療法ではなく、標的療法と見なされる。治療ワクチンは、がん細胞に対する免疫系の応答を高めることにより、がんに対して作用する。

がんと戦うために体の免疫応答を増強または刺激する他のタイプの免疫療法には、体の細胞によって作製されるタンパク質であるサイトカインが含まれる。それらは、体の正常な免疫応答、およびがんに応答する免疫系の能力において重要な役割を果たす。がんの治療に使用されるサイトカインの２つの主要なタイプは、インターフェロンおよびインターロイキンと呼ばれる。

本明細書に記載の実施形態の別の態様は、抗がん剤に対して細胞を感作させるための組成物および方法を対象とする。「感作させる」は、細胞または腫瘍などの指定された系の感受性を高める活性化剤の能力を指すことができる。この意味には、以前は感受性がなかった、または感受性が低かった抗がん化合物もしくはレジメンに対して細胞をより応答性にするように細胞を変更する（すなわち、感作させる）ことが含まれ得る。感作させることおよび「より感受性が高い」ことはまた、以前は殺傷しなかった物質への曝露によって細胞死をもたらすように、細胞または腫瘍の感受性を高めることを含み得る。

実施形態では、１つ以上の活性化剤は、がんの症状を治療、予防、または軽減するために対象に投与される。活性化剤は、組成物の患者への投与さを可能にする任意の形態であり得る薬学的に許容される組成物で提供され得る。例えば、組成物は、液体または固体の形態であり得る。典型的な投与経路としては、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣、眼、および腫瘍内が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技法が含まれる。一実施形態では、組成物は、ミニポンプ注入システムを使用した注入によって投与することができる。

一実施形態では、薬学的組成物は、抗体調製物として対象に投与することができる。抗体調製物、例えば、その標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものが、標的とのその結合に起因する効果をもたらすことができる。例えば、ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインはシェディングに不可欠なドメインであり、このドメインに結合するモノクローナル抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのシェディングを阻害し、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を誘導することができる。腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の密度の増加は、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体を介した活性化を増強し、腫瘍コンジュゲート抗体のＦｃセグメントもＣＤ１６Ｆｃ受容体を介してＮＫ細胞を活性化させた。このようなＭＩＣＡ／Ｂ抗体による治療により、腫瘍浸潤ＮＫ細胞が、細胞傷害性の高い状態へと著しく変化した。

本明細書に記載の実施形態の活性化剤、例えば、ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインと特異的に結合する抗体は、薬学的組成物の形態でがんの治療のために投与することができる。抗体を含む治療用の薬学的組成物の調製に関連する原理および注意事項、ならびに成分の選択に関するガイダンスは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０００、Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４、およびＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供される。

任意の特定の患者に対する特定の投与量および治療レジメンは、使用される具体的な抗体、そのバリアントまたは誘導体、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事、投与時間、排出率、薬物の併用、治療される具体的な疾患、ならびに治療される具体的な疾患の重症度など、様々な要因に依存する。医療従事者によるそのような要因の判断は、当業者の技量の範囲内である。その量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特性、治療される疾患、疾患の重症度、および所望の効果にも依存するであろう。使用される量は、当技術分野で周知の薬学的および薬物動態学的原理によって決定することができる。

「有効量」または「治療有効量」という用語は、哺乳動物のがん細胞を治療する（例えば、殺傷する）のに有効な薬物または治療薬（すなわち、活性化剤）の量を指すことができる。がんの場合、薬物の有効量はがん細胞数を減らす、腫瘍のサイズを縮小する、末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、および／もしくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、および／もしくは停止させる）、腫瘍成長をある程度阻害する、ならびに／またはがんに関連する症状の１つ以上をある程度緩和することができる。薬物は、既存のがん細胞の成長を防止する、および／またはそれを殺傷することができる程度に、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。がん治療の場合、有効性は、例えば、疾患の進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、および／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。

本明細書に記載の実施形態の治療有効量は、治療目的を達成するために必要な量とすることができる。上記のように、これは、特定の場合には標的の機能を妨害する、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用とすることができる。投与する必要のある量はさらに、その特異的な抗原についての抗体の結合親和性に依存し、また、投与された抗体が、それが投与される他の対象の自由体積から枯渇する速度にも依存する。別の例として、これは、ＮＫ細胞の抗がん活性などのＮＫ細胞の活性化である可能性がある。

対象（例えば、患者）に投与される活性化剤の投与量は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ患者体重、または１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。

抗体に関して言えば、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答のため、他の種由来の抗体よりもヒト体内での半減期が長い。したがって、より少ない投与量およびより少ない頻度でのヒト抗体の投与を使用することができる。さらに、抗体の投与量および投与頻度は、例えば、脂質化などの修飾によって抗体の取り込みおよび組織への（例えば脳への）浸透を増強することによって低減され得る。本明細書に記載の実施形態の抗体または抗体断片の治療上有効な投与のための一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回～１週間に１回の範囲であり得る。

実施形態では、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性抗体断片を使用することができる。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、かつ／または組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）を参照されたい）。製剤はまた、治療される適応症に必要な２つ以上の活性化合物、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するもの、を含有することができる。代替的に、または追加的に、組成物は、例えば、細胞傷害性剤、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ１２、ＩＬ１８）、化学療法剤、または成長阻害剤などの、その機能を増強する薬剤を含むことができる。そのような分子は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。

活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）における、またはマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入することができる。

インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。例えば、これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。

徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸およびγエチル－Ｌ－グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注射可能ミクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン－酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い時間にわたってタンパク質を放出する。

本明細書に詳細に記載されるように、１つ以上の活性化剤を含有するものなど、本明細書に記載される本明細書に記載の実施形態の組成物は、１つ以上の追加の治療薬または治療もしくは予防レジメンと組み合わせて投与することができる。例えば、１つ以上の追加の治療薬は、化学療法剤、サイトカイン（ＩＬ１５、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、放射線療法、または免疫療法剤であり得る。

追加の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、例えば、放射線療法などの他の治療または予防レジメンと組み合わせて投与することができる。

本明細書に記載の実施形態は、抗原の同じエピトープ、あるいは、抗原の２つ以上の異なるエピトープに結合する２つ以上の抗体を投与することによって、患者のがんを治療する方法を提供する。代替的に、がんは、第１の抗原に結合する第１の抗体および第１の抗原以外のタンパク質に結合する第２の抗体を投与することによって治療することができる。例えば、第１の抗体はＭＩＣＡ／Ｂに結合でき、第２の抗体はＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせに結合できる。

他の実施形態では、がんは、第１の抗原に結合し、また第１の抗原以外のタンパク質に結合する、二重特異性抗体を投与することによって治療することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態は、第１の抗体もしくは活性化剤を単独で、または第１の抗体によって認識されるもの以外の別のタンパク質を認識する第２の活性化剤もしくは抗体と組み合わせて、免疫応答を達成または増強することができる細胞とともに投与することを提供する。例えば、これらの細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、またはＰＢＭＣに見られる任意の細胞型、例えば、細胞毒性Ｔ細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。

さらに、本発明は、１つ以上の活性化剤および抗新生物剤、例えば、小分子、成長因子、サイトカインまたはペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ポリヌクレオチド、脂質由来メディエーター、低分子生体アミン、ホルモン、神経ペプチドおよびプロテアーゼなどの生体分子を含む他の治療剤の投与を提供する。小分子には、無機分子および小有機分子が含まれるが、これらに限定されない。好適な成長因子またはサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、およびＴＮＦ－アルファが含まれる。小分子ライブラリーは、当該技術分野で知られている。（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１２：１４５，１９９７を参照されたい。）

一実施形態はまた、（ａ）患者を評価して、患者が難治性もしくは薬剤耐性がん、または細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるがんを有するかどうかを決定することと、（ｂ）有効量の１つ以上の活性化剤を患者に投与することと、（ｃ）がんの状態を判断するために患者を監視することと、を含む。

例えば、対象由来の生物学的試料は、Ｊａｋ１もしくはＢ２Ｍ変異、またはＩＦＮガンマシグナル伝達経路（Ｓｔａｔ１変異など）もしくは腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩ抗原提示経路（Ｔａｐ１またはＴａｐ２変異など）の機能を無効にするその他の変異などの、細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性のマーカーについて評価できる。「生物学的試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および生体液を含み得る。したがって、「生物学的試料」という用語の使用には、血液、および血清、血漿、またはリンパ液を含む、血液の画分または成分が含まれる。すなわち、本明細書に記載の実施形態の検出方法を使用して、生体試料中の分析物であるｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、分析物ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技法には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が含まれる。分析物ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技法には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。

患者または患者のがんを評価および／または監視するステップは、試料中の細胞マーカーの存在を検出するためのプローブの使用を含むことができる。例えば、プローブは検出可能な標識を含有することができる。実施形態では、プローブは抗体であるが、ポリヌクレオチドまたは小分子であり得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。無傷抗体、またはそのフラグメント（例えば、Ｆ_ａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ_{（ａｂ）２}）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能物質をプローブまたは抗体に結合（すなわち、物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することができる。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することが含まれる。

イムノアッセイを実施するための手順は、例えば、”ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５、”Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６、および”Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技法は、対象に標識された抗分析物タンパク質抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的な画像化技法によって検出され得る放射性マーカーで標識され得る。

検出は、プローブまたは抗体を検出可能な物質にカップリング（例えば、物理的に連結する）ことによって促進できる。検出可能物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性材料の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３２Ｐまたは^３Ｈが挙げられる。

がんを治療するための組成物
本明細書に記載の実施形態の態様はまた、がんまたは細胞増殖性疾患の症状を予防、治療、または軽減するための組成物を対象とする。

さらに、本明細書に記載の実施形態の態様は、腫瘍細胞、がん細胞もしくは腫瘍の成長、増殖もしくは転移を防止する；腫瘍細胞もしくはがん細胞の複製を防止し、全体的な腫瘍量を減少させるか、またはがん細胞数を減少させ、病気に関連する１つ以上の症状を改善するための組成物を対象とする。

実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上の活性化剤を含む。例えば、組成物は、表１に記載されるような抗体またはその断片を含むことができる。例えば、組成物は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＮＦ－αなどのサイトカインを含むことができる。実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５である。

組成物は、獣医学的投与またはヒトへの投与に適している。本明細書に記載の実施形態の組成物は、ヒトまたは動物に組成物を投与することを可能にする任意の形態であり得る。例えば、組成物は、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であり得る。典型的な投与経路としては、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣、眼、および鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技法が含まれる。例えば、組成物は、非経口的に投与される。本明細書に記載の実施形態の薬学的組成物は、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体などの活性化剤が、組成物を動物に投与したときに生物学的に利用可能になるように製剤化することができる。組成物は、１つ以上の投与量単位の形態をとることができ、例えば、錠剤は単一の投与量単位であり得、エアロゾル形態の活性化剤の容器は、複数の投与量単位を保持し得る。

薬学的組成物を調製する際に使用される材料は、使用される量において無毒であり得る。活性化剤などの薬学的組成物中の有効成分の最適な投与量が、様々な要因に依存することは、当業者には明らかであろう。関連する要因には、動物のタイプ（例えば、ヒト）、活性化剤の具体的な形態、治療または予防される具体的な疾患、投与様式、および使用される組成物が含まれるが、これらに限定されない。

薬学的に許容される担体またはビヒクルは粒子状であり得るので、組成物は、例えば、錠剤または粉末の形態である。担体は液体であり得、組成物は、例えば、経口シロップまたは注射可能な液体である。さらに、担体は、例えば、吸入投与において有用なエアロゾル組成物を提供するように、気体であり得る。

経口投与を目的とする場合、組成物は固体または液体の形態であり得、半固体、半液体、懸濁液およびゲルの形態が、本明細書で固体または液体のいずれかと見なされる形態に含まれる。

経口投与用の固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、ピル、カプセル、チューインガム、ウエハーなどの形態に製剤化することができる。このような固体組成物は、通常、１つ以上の不活性希釈剤を含有する。さらに、以下のうちの１つ以上が存在し得る：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトースまたはデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの香料、および着色剤。

組成物は、カプセル、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、上記のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリンまたは脂肪油などの液体担体を含有することができる。

組成物は、液体、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液の形態であり得る。液体は、経口投与または注射による送達に有用であり得る。経口投与を目的とする場合、組成物は、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤、および調味料のうちの１つ以上を含むことができる。注射による投与用の組成物には、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤および等張剤のうちの１つ以上も含まれ得る。

本明細書に記載の実施形態の液体組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態であるかどうかにかかわらず、以下のうちの１つ以上を含むこともできる：注射用水などの滅菌希釈剤、生理食塩水などの生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水、溶媒もしくは懸濁媒体として機能し得る合成モノまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。非経口組成物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラス、プラスチックもしくは他の材料製の複数用量バイアルに封入することができる。生理食塩水は、アジュバントであり得る。注射可能な組成物は、無菌であり得る。

障害または状態の治療に有効な組成物の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技法によって決定することができる。さらに、インビトロまたはインビボアッセイを使用して、最適な投与量範囲を特定することができる。組成物に使用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重症度に依存し、開業医の判断および各患者の状況に応じて決定することができる。

組成物は、好適な投与量が得られるように、有効量の少なくとも１つの活性化剤を含むことができる。例えば、この量は、組成物の少なくとも約０．０１重量％である。経口投与を目的とする場合、この量は、組成物の約０．１重量％～約８０重量％の範囲に変動させることができる。経口組成物は、組成物の約４重量％～約５０重量％を構成することができる。本明細書に記載の実施形態の組成物は、非経口投与量単位が約０．０１重量％～約２重量％の活性化剤を含有するように調製することができる。

静脈内投与の場合、組成物は、動物の体重１ｋｇ当たり約１～約２５０ｍｇの活性化剤を含むことができる。例えば、投与量は、約４～約２５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化剤の範囲であるだろう。

実施形態では、動物に投与される活性化剤の投与量は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｋｇ動物体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ動物体重である。例えば、動物に投与される活性化剤の投与量は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２５０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。例えば、動物に投与される投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ動物体重であり、例えば、動物体重の約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。

組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができる。投与は、全身または局所であることができる。様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへのカプセル化が知られており、組成物を投与するために使用することができる。特定の実施形態では、２つ以上の活性化剤または組成物が動物に投与される。投与方法としては、経口投与および非経口投与；皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下を含むがこれらに限定されない非経口投与；鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、脳室内、髄腔内、膣内、経皮、直腸、吸入により、または耳、鼻、目もしくは皮膚への局所が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、投与様式は、開業医の裁量に任せることができ、病状の部位（例えば、がんの部位または腫瘍内）に部分的に依存するであろう。

一実施形態では、活性化剤または組成物は非経口的に投与される。

一実施形態では、活性化剤または組成物は、注入ポンプまたは点滴などによって静脈内投与される。

特定の実施形態では、１つ以上の活性化剤または組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することができる。これは、例えば、限定としてではなく、手術中の局所注入によって；局所適用、例えば、手術後の創傷被覆材と組み合わせて；注射によって；カテーテルによって；ポートによって；坐剤によって；またはインプラントによって達成することができ、インプラントは、多孔性、非多孔性もしくはゼラチン状の材料（シラスティック膜などの膜を含む）、または繊維製である。一実施形態では、投与は、がん、腫瘍、または腫瘍性もしくは前腫瘍性組織の部位（または以前の部位）への直接注射によるものであり得る。別の実施形態では、投与は、疾患の発現の部位（または以前の部位）への直接注射によるものであり得る。

肺投与はまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤を用いた製剤化により、あるいはフルオロカーボンまたは合成肺表面活性物質における灌流を介して使用することができる。特定の実施形態では、活性化剤または組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として製剤化することができる。

別の実施形態では、活性化剤は、リポソームなどの小胞で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ（同上），ｐｐ．３１７－３２７を参照されたい。同上を参照されたい）。

さらに別の実施形態では、活性化剤または組成物は、制御放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ（上記）、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照されたい）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたい。Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出システムは、活性化剤または組成物の標的に近接して配置することができ、したがって、全身用量のごく一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（上記），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒによるレビュー（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０））で議論されている他の制御放出システムを使用することができる。

「担体」という用語は、活性化剤とともに投与される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を指すことができる。そのような薬学的担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油などの液体であり得る。担体は、生理食塩水、アラビアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。一実施形態では、動物に投与される場合、活性化剤および薬学的に許容される担体は無菌である。活性化剤が静脈内投与される場合、水が担体となり得る。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、注射可能溶液などの液体担体として使用することができる。好適な薬学的担体としてはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も挙げられる。本組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。

本組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、乳濁液、エアロゾル、スプレー、懸濁液、または使用に適した他の任意の形態をとることができる。一実施形態では、薬学的に許容される担体はカプセルである（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照されたい）。好適な薬学的担体の他の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

一実施形態では、活性化剤は、ヒトなどの動物への静脈内投与に適合した薬学的組成物として、通常の手順に従って製剤化される。通常、静脈内投与用の担体またはビヒクルは、無菌の等張性水性緩衝液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤を含むこともできる。静脈内投与用の組成物は、注射部位の痛みを和らげるために、リグノカインなどの局所麻酔薬を任意に含むことができる。実施形態では、成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉容器内の乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。活性化剤が注入によって投与される場合、それは、例えば、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を収容する注入ボトルで分配することができる。活性化剤が注射によって投与される場合、注射用滅菌水のアンプルまたは生理食塩水を提供して、投与前に成分を混合することができるようにすることができる。

経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、トローチ、水性もしくは油性懸濁液、顆粒、粉末、乳濁液、カプセル、シロップ、またはエリキシル剤の形態であり得る。経口投与される組成物は、１つ以上の任意選択的な薬剤、例えば、薬学的に口当たりの良い調製物を提供するための、フルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、ウィンターグリーンのオイルまたはチェリーなどの香料、着色剤、および保存剤を含有することができる。さらに、錠剤またはピルの形態では、組成物を胃腸管内の崩壊および吸収を遅延させ、それにより、長期間にわたって持続的な作用を提供するために、コーティングすることができる。浸透圧的に活性な誘発（ｄｒｉｖｉｎｇ）化合物を取り囲む選択的に透過性の膜もまた、経口投与される化合物に適している。これらの後のプラットフォームでは、カプセルを取り巻く環境からの流体が誘発化合物によって吸収され、それが膨潤して、開口部を通して薬剤または薬剤組成物を移動させる。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤のスパイクプロファイルとは異なり、本質的にゼロオーダーの送達プロファイルを提供することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料も使用できる。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。そのような担体は、医薬品グレードのものであり得る。

組成物は、局所投与を目的とすることができ、その場合、担体は、溶液、乳濁液、軟膏またはゲルベースの形態であり得る。基剤は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定剤のうちの１つ以上を含むことができる。増粘剤は、局所投与用の組成物中に存在することができる。経皮投与を目的とする場合、組成物は、経皮パッチまたはイオントフォレーシスデバイスの形態であり得る。局所製剤は、約０．１％～約１０％ｗ／ｖ（組成物の単位体積当たりの重量）の濃度の活性化剤を含むことができる。

組成物は、例えば、直腸内で溶融して活性化剤を放出する坐剤の形態での直腸投与を目的とすることができる。直腸投与用の組成物は、好適な非刺激性賦形剤として油性塩基を含有することができる。そのような塩基としては、ラノリン、カカオバター、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。

組成物は、固体または液体の投与量単位の物理的形態を変更する様々な材料を含むことができる。例えば、組成物は、有効成分の周りにコーティングシェルを形成する材料を含むことができる。コーティングシェルを形成する材料は、通常、不活性であり、例えば、砂糖、シェラック、および他の腸溶コーティング剤から選択することができる。あるいは、有効成分をゼラチンカプセルで包むことができる。

組成物は、気体状の投与量単位からなることができ、例えば、エアロゾルの形態であり得る。エアロゾルという用語は、コロイド性質のものから加圧パッケージで構成されるシステムまで、様々なシステムを表すために使用される。送達は、液化もしくは圧縮ガスによって、または有効成分を分配する好適なポンプシステムによって行うことができる。活性化剤のエアロゾルは、活性化剤を送達するために、単相、二相、または三相系で送達することができる。エアロゾルの送達には、必要な容器、アクチベーター、弁、サブ容器、スペーサーなどが含まれ、これらが一緒になってキットを形成することができる。エアロゾルは、過度の実験をすることなく、当業者によって決定することができる。

固体、液体または気体の形態であるかどうかにかかわらず、本明細書に記載の実施形態の組成物は、がんまたは細胞増殖性疾患の症状の治療、予防、または緩和に使用される薬剤を含むことができる。

薬学的組成物は、薬学分野で周知である方法論を使用して調製することができる。例えば、注射によって投与されることを意図した組成物は、活性化剤を水と組み合わせて溶液を形成することによって調製することができる。均一な溶液または懸濁液の形成を促進するために界面活性剤を加えることができる。界面活性剤は、活性化剤と非共有結合的に相互作用して、水性送達系における活性化剤の溶解または均一な懸濁を促進する化合物である。

実施形態では、活性化剤は小分子である。「小分子」という用語は、実験室で合成された、または自然界で見られる非ペプチド性、非オリゴマー性の有機化合物を指すことができる。小分子は、「天然物様」である化合物を指すことができるが、「小分子」という用語は、「天然物様」化合物に限定されない。むしろ、小分子は、典型的には、いくつかの炭素－炭素結合を有すること、複数の立体中心を有すること、複数の官能基を有すること、少なくとも２つの異なるタイプの官能基を有すること、および重量が１５００未満である分子を有することを含む特徴のうちの１つ以上を有することを特徴とするが、この特性決定は、本明細書に記載の実施形態の目的を限定することを意図するものではない。

小分子足場という用語は、官能化のための少なくとも１つの部位を有する化合物を指すことができる。一実施形態では、小分子足場は、官能化のための多数の部位を有することができる。これらの官能化部位は、当技術分野の当業者によって理解され得るように、保護またはマスクすることができる。これらの部位は、基礎となる環構造または骨格上にも見出すことができる。

実施形態では、活性化剤はサイトカインである。「サイトカイン」という用語は、同じ細胞集団（自己分泌）または別の細胞集団（傍分泌）のための細胞内メディエーターとして作用するある細胞集団によって放出されるタンパク質などの分子を指すことができる。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。いくつかのサイトカインは、ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモンチロキシンインスリン；プロインスリン；リラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子－αおよびベータ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧ－αおよびＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えば、ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－アルファ、－ベータおよび－ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；および顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－１、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２；ＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ、幹細胞因子としても知られる）を含む他のポリペプチド因子である。実施形態では、活性化剤は生物学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）である。「生物学的」または「生物学的薬剤」は、治療薬としての使用を目的とした、生物および／またはそれらの生成物から作製された任意の薬学的に活性な薬剤を指すことができる。本明細書に記載の実施形態の一実施形態では、生物学的薬剤には、例えば、抗体、核酸分子（ポリヌクレオチド）、例えば、アンチセンス核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

実施形態では、活性化剤はポリヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」は、単一の「ポリヌクレオチド」ならびに複数の「ポリヌクレオチド」を包含することができる。「ポリヌクレオチド」は、核酸、核酸配列、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはそれらの任意の断片であり得るヌクレオチドの鎖を指すことができる。それは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖もしくは一本鎖であり、炭水化物、脂質、タンパク質もしくは他の材料と組み合わせて、活性などを実行するか、または有用な組成物を形成することができる。

実施形態では、活性化剤はポリペプチドである。本明細書で使用される「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することができ、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、本明細書では「ポリペプチド」を指すことができ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾などの、ポリペプチドの発現後修飾産物を指すこともできる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生されることができ、必ずしも特定の核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸または小さなパーセンテージのアミノ酸を改変、付加、欠失、または置換する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加が、本明細書では集合的に「保存的に修飾されたバリアント」と呼ばれることを容易に認識するであろう。いくつかの実施形態では、改変は、アミノ酸の化学的に類似したアミノ酸での置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。

例えば、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野では、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）として定義されている。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることができる。別の実施形態では、アミノ酸鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似する鎖で置換することができる。

一実施形態では、活性化剤は、抗体、抗体断片、またはその誘導体である。本明細書で使用される「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指すことができる。抗体は、全抗体および任意の抗原結合断片、またはその一本鎖であることができる。例えば、「抗体」は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む、任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含むことができる。非限定的な例としては、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖の可変領域、重鎖または軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子の免疫学的に活性な部分を指すことができる。「特異的に結合する」または「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原性決定部分と反応して、他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。

本明細書で使用される「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの、抗体の一部を指す。抗体断片は、構造に関係なく、完全な抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語には、アプタマー（シュピーゲルマーなど）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を包含させることができる。「抗体断片」という用語にはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質を包含させることができる。本明細書に記載の抗体、抗原結合ポリペプチド、バリアント、または誘導体には、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、ミニボディ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体などが包含される。

「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合的に連結されたＶＨ：ＶＬヘテロ二量体であり、これは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現され得る。（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９－５８８３を参照されたい）。いくつかの態様では、領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。リンカーは、柔軟性のためにグリシン、ならびに溶解性のためにセリンまたはスレオニンをリッチにすることができ、その際、Ｖ_ＨのＮ末端とＶ_ＬのＣ末端とを連結させることも、またはその逆とすることもできる。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。抗体Ｖ領域からの自然に凝集されるが、化学的に分離された、軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるであろう、ｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための多くの方法が記載されている。例えば、それぞれを参照によりその全体を組み込む米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，８９２，０１９号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照されたい。

非常に大きなナイーブヒトｓｃＦｖライブラリーは、多数の標的分子に対して再配置された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するために作製されており、作製することができる。疾患特異的抗体を単離するために、感染性疾患を有する個体からより小さなライブラリーを構築することができる。（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３３９－４３（１９９２）、Ｚｅｂｅｄｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３ １７５－７９（１９９２）を参照されたい）。

ヒトから得られる抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なる、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤの５つのクラスのイムノグロブリンに分類される。当業者であれば、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中にもいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４）があることを理解するであろう。特定のクラスは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、およびＩｇＧ_４、ならびに他のものなどの、サブクラスも有する。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_５などは、十分に特徴付けられており、機能的な特異性を与えることが知られている。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には「Ｙ」字型にジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は「Ｙ」の口から始まり、可変領域を通って続く重鎖を囲む。本明細書に記載の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。

軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖のクラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、２つの重鎖の「尾」（ｔａｉｌ）部は、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型に分岐した末端のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端まで伸びている。

軽鎖と重鎖のいずれも、構造的および機能的な相同性領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語が、機能的な意味で使用される。軽鎖部分および重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）が、抗原の認識および特異性を決定する。逆に、軽鎖および重鎖の定常ドメイン（ＣＬ、ならびにＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指すことができる。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なる区間は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接区間の間に挿入される。よって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間、およびそれに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。

各抗原結合ドメインに存在する６つのＣＤＲは、アミノ酸の短い非連続配列であり、抗体が水性環境でその三次元構成をとるときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される。抗原結合ドメインの残りのアミノ酸であるＦＲ領域は、少ない分子間変動を示す。フレームワーク領域は、主にβシートのコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、ループを形成して連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的な相互作用によって、ＣＤＲを正しい方向に配置するための足場を形成するよう機能する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応における抗原上のエピトープに相補的な表面を提供し、同族のエピトープへの抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが以前に同定されているため（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照）、当業者によって、重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る。

当技術分野で使用および／または許容される用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、特に反対の意味で明示的に述べられない限り、そのようなすべての意味を包含することを意図する。一例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語を使用して、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位を説明することである。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）により記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、いずれの定義を適用して抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すことも、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることが意図されている。特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、ＣＤＲの配列とサイズによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列さえわかれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかをルーチン的に決定することができる。

Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変ドメイン配列の付番システムを定義した。当業者は、配列自体の他の実験データに依存することなく、この「カバット付番」システムを、任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「カバット付番」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載される付番システムを指す。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定因子を含むことができる。可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。例えば、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わされて、三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常、特異的な三次元構造特徴、および特異的な電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドに対して産生され得る。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖の各上の３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）によって定義される。

本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を指すことができる。免疫学的結合相互作用の強度、または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_Ｄ）として表すことができ、より小さな（Ｋ_Ｄ）は、より大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、両方の「オン速度定数」（Ｋ_ｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋ_ｏｆｆ）は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）を参照されたい）。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比は、親和性に関係のないすべてのパラメータをキャンセルでき、解離定数Ｋ_Ｄに等しい。（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照されたい）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイなどの速度論的アッセイ、またはＢＩＡｃｏｒｅなどの当業者に公知の同様のアッセイによって測定されるような平衡結合定数（ＫＤ）が≦１０μＭ、≦１０ｎＭ、≦１０ｐＭ、または≦１００ｐＭ～約１ｐＭであるときに、ＰＤ－１エピトープに特異的に結合することができる。「特異的に結合する」または「～に特異性を有する」とは、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する抗体、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を伴うことを指すことができる。例えば、抗体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介して、そのエピトープに結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。

当該技術分野内で知られる様々な手順は、本明細書に記載の実施形態のタンパク質に対して、またはそれらの誘導体、断片、アナログ、ホモログ、もしくはオルソログに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生に使用することができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい）。

抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の技法によって精製することができ、これらは主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する。その後、または代替的に、求められる免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープをカラムに固定化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製することができる。免疫グロブリンの精製については、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（Ａｐｒｉｌ １７，２０００），ｐｐ．２５－２８）によって議論される。

本明細書で使用される、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる１つの抗体分子の分子種のみを含有する抗体分子の集団を指すことができる。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子で同一である。ＭＡｂは、それに対する特有の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。

モノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含めることができ、残りの鎖は、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列、ならびに所望の生物学的活性を示すそのような抗体の断片と同一または相同である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５を参照されたい）。例えば、キメラ抗体は、マウス抗体からの可変領域およびヒト抗体からの定常領域から誘導することができる。

非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体を指すことができる。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの変更は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、超可変ループのうちのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９、ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６を参照されたい。

モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものなどの、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫剤で免疫化して、免疫剤に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘導する。代替的に、リンパ球は、インビトロで免疫化することができる。

免疫剤は、タンパク質抗原、その断片、またはその融合タンパク質を含むことができる。例えば、ヒト起源の細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球が使用され、または、非ヒト哺乳動物の供給源が望まれる場合は脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９－１０３を参照）。不死化細胞株は、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞とすることができる。例えば、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、非融合の、不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培地において培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。

有用な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を維持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手できるマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１－６３）を参照されたい）。

次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。例えば、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。そのような技法およびアッセイは、当該技術分野で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療用途では、標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を特定することが重要である。

所望のハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９－１０３を参照されたい）。この目的に適した培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地およびＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。代替的に、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水としてインビボで成長させることができる。

サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または腹水液から単離または精製することができる。

モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。本明細書に記載の実施形態のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。本明細書に記載の実施形態のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として役立つことができる。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、これは次いでサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２－１３（１９９４）を参照されたい）または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合することによって、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書に記載の実施形態の抗体の定常ドメインの代わりに使用することができるか、または本明細書に記載の実施形態の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに使用して、キメラ二価抗体を作製することができる。

完全ヒト抗体は、例えば、ＣＤＲを含む、軽鎖および重鎖の両方の配列全体がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。そのような抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。「ヒト化抗体」は、非ヒト種由来の抗体とすることができるが、その軽鎖および重鎖タンパク質配列は、ヒトで産生される抗体バリアントとの類似性を高めるよう改変されている。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域と、を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換され、それにより、抗原結合が変化し、例えば改善される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって特定され、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定し、また配列を比較して特定の位置にある異常なフレームワーク残基を特定することによって行われる。（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５８５，０８９、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照）。例えば、抗体の非ヒト部分（軽鎖および／または重鎖のＣＤＲなど）は、標的抗原に結合することができる。ヒト化モノクローナル抗体はまた、本明細書では「ヒトモノクローナル抗体」と呼ばれることもある。

抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００、ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリングまたはリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９－９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号、参照によりその全体が組み込まれる）などの、当技術分野で公知の様々な技術を使用してヒト化することができる。「ヒト化」（リシェイプまたはＣＤＲグラフトとも呼ばれる）は、異種源（通常はげっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低下させ、ヒト免疫系の活性化を改善するための、当業者に周知の確立された技術である（例えば、Ｈｏｕ Ｓ，Ｌｉ Ｂ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｑｉａｎ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｄ，Ｈｏｎｇ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｇｕｏ Ｙ（Ｊｕｌｙ ２００８）”Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ”Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４４（１）：１１５－２０）を参照）。

完全ヒトおよびヒト化抗体などのヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ，１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照）、ヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ，１９８５ Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照）を使用して調製することができる。ヒトモノクローナル抗体を利用することができ、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅ，ｅｔ ａｌ，１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６－２０３０を参照されたい）またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）産生することができる。

加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの他の技術を使用して産生することもできる。（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１）を参照されたい）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジ後、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再配置、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む、すべての態様においてヒトに見られるものと非常によく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２－１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５－５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５－９３（１９９５）に記載されている。

ヒト抗体は、加えて、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように修飾されるトランスジェニック非ヒト動物を使用して産生することができる。（ＰＣＴ国際公開第９４／０２６０２号および米国特許第６，６７３，９８６号を参照）。非ヒト宿主における重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は無力化されており、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性遺伝子座は、宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を使用して、組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物は、改変の完全な相補体よりも少ない相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得られる。そのような非ヒト動物の非限定的な例はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として、目的の免疫原での免疫化後、直接動物から、または代替的に、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどの、動物に由来する不死化Ｂ細胞から得ることができる。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、回収および発現されて、抗体を直接得ることができるか、またはさらに修飾されて、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子などの抗体のアナログを得ることができる。したがって、そのような技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７３：６５－９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第９８／２４８９３号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）などの企業は、上記と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供するために業務を提供できる。

内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く、マウスとして例示される、非ヒト宿主を産生する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。これは、遺伝子座の再配置を防止し、再配置された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止するために、胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失することであって、欠失が、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有する標的化ベクターによって行われる、欠失することと、胚性幹細胞からトランスジェニックマウスを産生することであって、その体細胞および生殖細胞が、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有する、産生することと、を含む、方法によって得ることができる。

ヒト抗体などの、目的の抗体を産生するための１つの方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを培養中の１つの哺乳動物宿主細胞へ導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞へ導入し、２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成することを含む。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含有する抗体を発現する。

この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを特定するための方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選抜するための対応する方法は、ＰＣＴ国際公開第９９／５３０４９号に開示されている。

目的の抗体はまた、上記の一本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターによって発現させることができる。例えば、ベクターは、限定されないが、国際公開第９３／６４７０１号に記載されるような、標的化部分（例えば細胞の表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えばポリリシン）を含む化学コンジュゲート、ウイルスベクター（例えばＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、例えばＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載される融合タンパク質、すなわち標的化部分（例えば標的細胞に特異的な抗体）と核酸結合部分（例えばプロタミン）を含む融合タンパク質、プラスミド、ファージ、ウイルスベクターなどが挙げられる。ベクターは、染色体、非染色体、または合成物であり得る。レトロウイルスベクターも使用でき、モロニーマウス白血病ウイルスが挙げられる。ＤＮＡウイルスベクターも使用されてよく、オルソポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクターが含まれる（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）、Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ，ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）、Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）、Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１１４９（１９９０），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）を参照されたい、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ ３：２１９（１９９３）、Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）ａｎｄ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｓｅｅ Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照されたい。

ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を神経細胞に導入するために使用できる。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）よりも短期間の発現（約２ヶ月）をもたらし、ひいてはＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞および治療される状態に依存するであろう。導入は、標準的な技法、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入、または形質転換によることができる。遺伝子導入のモードの例には、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰ０_４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが含まれる。

ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的化するために使用することができる。例えば、定位的注入を使用して、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に誘導することができる。加えて、粒子は、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍなどのミニポンプ注入システムを使用した脳室内（ｉｃｖ）注入によって送達することができる。対流と呼ばれるバルク流に基づく方法は、脳の拡張領域に大きな分子を送達するのに効果的であることも証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用であり得る。（Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６－２０８０（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２－３０５（１９９４）を参照されたい）。使用することができる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内、および皮下注射、ならびに経口または他の既知の投与経路が含まれる。

これらのベクターを使用して、様々な方法で使用できる大量の抗体を発現させて、例えば、腫瘍細胞に結合してＭＩＣＡ／Ｂの脱落を阻止しようとすることができる。

技法は、本明細書に記載の実施形態の抗原性タンパク質に特異的な一本鎖抗体の産生に適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。加えて、方法は、Ｆ_ａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１を参照されたい）の構築に適合させて、タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログについて所望の特異性を有するモノクローナルＦ_ａｂフラグメントの迅速かつ効果的な特定を可能にすることができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、当該技術分野で知られている技法によって産生することができ、これらに限定されないが、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ_{（ａｂ’）２}フラグメント、（ｉｉ）Ｆ_{（ａｂ’）２}フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦ_ａｂフラグメント、（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理によって生成されたＦ_ａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆ_ｖフラグメントを含む。

ヘテロコンジュゲート抗体も本明細書に記載の実施形態の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞への免疫系細胞の標的化を可能にし（米国特許第４，６７６，９８０号を参照）、ＨＩＶ感染の治療を可能にする（ＰＣＴ国際公開第９１／００３６０号、同第９２／２０３７３号を参照）。抗体は、架橋剤を用いるものなど、タンパク質合成化学分野における既知の方法を使用してインビトロで調製できることが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル－４－メルカプトブチリミデート、ならびに、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが含まれる。

本明細書に記載の実施形態の抗体は、例えば、がんの治療における抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して改変することができる。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入することができ、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺滅および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有することができる。（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１ １９１－１ １９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照されたい）。代替的に、二重Ｆｃ領域を有し、それによって強化された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を操作することができる。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９－２３０（１９８９）を参照されたい）。

特定の実施形態では、本明細書に記載の実施形態の抗体は、抗体の抗原非依存性エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を改変するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含むことができる。そのような抗体は、これらの置換を欠く抗体と比較される場合、ＦｃＲｎへの増加または減少した結合のいずれかを示し、したがって、それぞれ、増加または減少した血清中の半減期を有する。ＦｃＲｎについての改善された親和性を有するＦｃバリアントは、より長い血清半減期を有すると予想され、そのような分子は、例えば、慢性疾患または障害を治療するために、投与された抗体の長い半減期が望まれる哺乳動物を治療する方法において有用な用途を有する。対照的に、低下したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃバリアントは、より短い半減期を有することができ、そのような分子はまた、例えば、短縮された循環時間が有利であり得る哺乳動物に投与するために、例えば、インビボ診断画像化のために、または出発抗体が、長期間にわたって循環中に存在する場合、毒性の副作用を有する状況において、有用である。低下したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃバリアントは、胎盤を横切る可能性も低く、よって妊婦における疾患または障害の治療においても有用である。加えて、低減したＦｃＲｎ結合親和性が望ましい場合がある他の用途には、脳、腎臓、および／または肝臓への局在化が望ましい用途が含まれる。一実施形態では、Ｆｃバリアント含有抗体は、血管系から腎糸球体の上皮を横切る輸送の低下を示すことができる。別の実施形態では、Ｆｃバリアント含有抗体は、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を横切り血管空間への輸送の低下を示すことができる。一実施形態では、改変されたＦｃＲｎ結合を有する抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０～２９９（ＥＵ付番による）で構成される。ＦｃＲｎ結合活性を改変する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第０５／０４７３２７号に開示されている。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載の実施形態の抗体、またはその断片は、以下の置換：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、およびＳ３０４Ｄ（ＥＵ付番）のうちの１つ以上を有するＦｃドメインを含む。

いくつかの実施形態では、変異は、ｍＡｂの抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性が改変されるように、ｍＡｂの定常領域に導入される。例えば、変異は、ＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異である。一実施形態では、抗体（例えば、ヒトｍＡｂ、または二重特異性Ａｂ）は、ＡＤＣＣ活性を低下させるヘテロ二量体ｍＡｂの１つのｓｃＦｖユニット上に変異を含む。別の実施形態では、ｍＡｂは、ＡＤＣＣ活性を完全に除去する、ヘテロ二量体ｍＡｂの両方の鎖上に変異を含む。例えば、ｍＡｂの一方または両方のｓｃＦｖユニットに導入された変異は、ＣＨ２ドメインのＬＡＬＡ変異である。可変ＡＤＣＣ活性を有するこれらのｍＡｂは、ｍＡｂがｍＡｂによって認識される１つの抗原を発現する細胞に向かって最大の選択的殺滅を示すが、ｍＡｂによって認識される第２の抗原に向かって最小の殺滅を示すように、最適化することができる。

他の実施形態では、本明細書に記載の診断および治療方法での使用のための、本明細書に記載の実施形態の抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖定常領域などの定常領域を有し、それはグリコシル化を低減または排除するように改変される。例えば、本明細書に記載の実施形態の抗体はまた、抗体のグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含み得る。例えば、Ｆｃバリアントでは、グリコシル化（例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化）を低減させることができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃバリアントは、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）に通常見られるＮ結合型グリカンのグリコシル化が低減されている。別の実施形態では、抗体は、グリコシル化モチーフ、例えばアミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合型グリコシル化モチーフ、の付近または内部にアミノ酸置換を有する。具体的な実施形態では、抗体は、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を有するＦｃバリアントを含む。より具体的なの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵ付番）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含む。

グリコシル化を低減または変更する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第０５／０１８５７２号に開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態の抗体またはその断片は、グリコシル化を排除するように修飾される。そのような抗体、またはそのフラグメントは、「アグリ（ａｇｌｙ）」抗体、またはそのフラグメント（例えば、「アグリ」抗体）と呼ばれ得る。理論に拘束されないが、「アグリ」抗体、またはその断片は、インビボで改善された安全性および安定性プロファイルを有することができる。例示的なアグリ抗体、またはその断片は、Ｆｃエフェクター機能を欠き、それによりＰＤ－１を発現する正常な生組織および細胞に対するＦｃ媒介性毒性の可能性を排除する、ＩｇＧ_４抗体の脱グリコシル化Ｆｃ領域を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の実施形態の抗体、またはその断片は、改変されたグリカンを含む。例えば、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７におけるＮ－グリカン上に低減した数のフコース残基を有することができ、すなわち、脱フコシル化される。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７におけるＮ－グリカン上に改変された数のシアル酸残基を有することができる。

本発明はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）などの細胞傷害性剤、または放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート）にコンジュゲートされた抗体を含むイムノコンジュゲートを対象とする。

使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。ラジオコンジュゲートされた抗体の産生には、様々な放射性核種が利用可能である。非限定的な例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、および^１８６Ｒｅが挙げられる。

抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタレルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）など）、ジイソシアネート（トリエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。（ＰＣＴ国際公開第９４／１１０２６号および米国特許第５，７３６，１３７号を参照）。

当業者であれば、多種多様な可能な部分が、得られる抗体または本明細書に記載の実施形態の他の分子にカップリングされ得ることを認識する。（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、”Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照されたい）。

結合は、抗体および他の部分がそれらのそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合するであろう任意の化学反応によって達成することができる。この結合は、多くの化学メカニズム、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成を含むことができる。一実施形態では、結合は、共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合によって、または外部架橋分子の組み込みによって達成することができる。多くの二価または多価連結剤は、本明細書に記載の実施形態の抗体などのタンパク質分子を他の分子にカップリングするのに有用である。例えば、代表的な結合剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を含むことができる。このリストは、当該技術分野で知られている様々なクラスの結合剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的な結合剤の例示である。（Ｋｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５－２５４９（１９８４）、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５－２１６（１９８２）、およびＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）を参照されたい。）リンカーの非限定的な例は、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用について記載するＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）を参照されたい）。オリゴペプチドリンカーによって抗体に結合したハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載する、米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。本明細書に記載の実施形態の抗体とともに使用できる有用なリンカーの非限定的な例としては、以下が含まれる：（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノ－プロピル）カルボジイミド塩酸塩、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－プリジル－ジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）、２１５５８Ｇ）、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）、（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５－Ｇ）、および（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートされたスルホ－ＮＨＳ（－ヒドロキシスルホ－スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）が挙げられる。

本明細書に記載されるリンカーは、異なる属性を有する成分を含有し、よって異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、カルボン酸アルキルのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボン酸塩のスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ－エステル含有リンカーは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を含有し、向上した安定性を有するコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合は、一般に、他の結合よりも安定性が低く、これはジスルフィド結合がインビトロで切断され、利用可能なコンジュゲートが少なくなるためである。例えば、スルホ－ＮＨＳは、カルボディミドカップリングの安定性を高めることができる。カルボジミド結合（ＥＤＣなど）は、スルホ－ＮＨＳと組み合わせて使用されると、カルボジミド結合反応単独よりも加水分解に対してより耐性のあるエステルを形成する。

本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されるような当該技術分野で知られる方法によって調製される。拡張された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

非限定的に例示される有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、定義された孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生成する。本明細書に記載の実施形態の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるリポソームにコンジュゲートすることができる。

本明細書に記載の実施形態の態様は、ＭＩＣＡ／Ｂに対して特異的なものなどの単離されたモノクローナル抗体を含む。細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、高分子の天然の供給源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された状態の分子のことを指す。「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合には、細胞性物質、ウイルス性物質もしくは培地を、または化学的に合成される場合には、化学前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない、核酸またはペプチドを指すこともある。例えば、「単離された核酸」は、断片としては天然には存在せず、天然の状態では見られない核酸断片を含むことができる。「単離された」はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すこともある。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドのいずれも包含することができる。

「単離された分子」（例えば、抗体）は、その自然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、分子の診断または治療用途を妨げる可能性のある物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、分子は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される場合に分子の９５重量％を超えるまで、または９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度まで、あるいは（３）クマシーブルーもしくは銀染色を使用した還元または非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製されるであろう。「単離された分子」（例えば、抗体）は、分子の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチュでの分子を含む。しかしながら、通常、単離された分子は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。

本明細書で記載されるように、本発明の抗体または薬剤（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、断片、アナログ、およびホモログは、投与に適した薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、抗体または薬剤と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で記載される場合、「薬学的に許容される担体」という言語は、薬学的投与と適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含むよう意図されている。好適な担体は、当該分野の標準的な参照テキストであり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である限りを除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。

本明細書に記載の実施形態の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。

注射可能な使用に適した薬学的組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含むことができる。静脈内投与について、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。実施形態では、組成物は、無菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性である。製造および貯蔵の条件下で安定であり得、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって達成することができる。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、活性化合物を必要な量で本明細書に記載の成分のうちの１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製され得る。例えば、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒および本明細書に記載のもの由来の必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分およびその以前に無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。

経口組成物は、不活性な希釈剤または可食性の担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、洗口剤としての使用のための流体担体を使用して調製することができ、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で回され、吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または同様の性質の化合物のいずれかを含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカンスガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロートなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味などの着香剤。

吸入による投与について、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガス、またはネブライザーを含有する加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与について、浸透させる障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与について、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当該技術分野で知られる軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。

化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを有する）または直腸送達のための停留浣腸の形態で調製することができる。

一実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的とするリポソームを含む）はまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

投与の簡便性および投与量の均一性のために、投与量単位形態で経口または非経口組成物を製剤化することができる。本明細書で使用される投与量単位形態は、治療される対象のための単一投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本明細書に記載の実施形態の単位剤形の仕様は、活性化合物の特有の特性、達成される治療効果、および個体の治療のためのかかる活性化合物を化合する当該技術分野に固有の制限によって決定され、かつそれらに直接依存する。

薬学的組成物は、投与の指示とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。

１つ以上の活性化剤を含有するものなど、本明細書に記載の組成物は、１つ以上の追加の予防薬もしくは治療薬、または１つ以上の追加の治療もしくは予防レジメンと組み合わせて投与することができる。したがって、「併用療法」という用語は、少なくとも１つの活性化剤および少なくとも１つ以上の追加の予防もしくは治療薬またはレジメンを含む治療レジメンを指すことができる。

一実施形態では、追加の化学療法剤などの追加の薬剤は、がんの治療が難治性であることが見出されていない薬剤である。別の実施形態では、追加の薬剤は、がんの治療が難治性であることが見出された薬剤である。この組成物は、がんの治療としても手術を受けた患者に投与することができる。一実施形態では、追加の治療方法は放射線療法である。

特定の実施形態では、活性化剤は、化学療法剤などの追加の薬剤と同時に、または放射線療法と同時に投与される。別の特定の実施形態では、追加の薬剤または放射線療法は、組成物の投与の前または後に、一態様では少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週、１ヶ月、さらなる態様では組成物の投与の前または後に数ヶ月（例えば、最大３ヶ月）投与される。

実施形態では、追加の治療薬および／または予防薬は、放射線治療薬／放射線療法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、抗体、遺伝子操作された細胞、放射線、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

例えば、「放射線治療薬」という句は、新生物の治療における電磁放射線または粒子放射線の使用を指すことができる。放射線治療薬の例は、放射線療法で提供され、これに限定されないが、当技術分野で知られている（Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ，ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｉｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２４８－７５（Ｄｅｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，４ ｅｄｉｔ．，ｖｏｌｕｍｅ １，１９９３）。

例えば、追加の薬剤は小分子を含むことができる。実施形態では、小分子は、パノビノスタットなどのＨＤＡＣ阻害剤を含む。パノビノスタットは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と呼ばれる薬剤の一種である。パノビノスタットは、複数の経路を介して悪性細胞のアポトーシスを引き起こす複数のヒストンデアセチラーゼ酵素を阻害する非選択的ＨＤＡＣ阻害剤である。当業者は、ＦＤＡ承認または臨床試験にあるものを含む、いくつかのＨＤＡＣ阻害剤のうちのいずれか１つが、本明細書に記載の実施形態で利用できることを認識するであろう。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤であるボリノスタット、ロミデプシン、およびベリノスタットは、一部のＴ細胞リンパ腫に対して承認されており、パノビノスタットは多発性骨髄腫に対して承認されている。例えば、Ｅｃｋｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｔｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．”Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ．”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８．７（２０１７）：１４１４を参照されたい。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸、短鎖脂肪酸、ベンズアミド、環状テトラペプチド、またはサーチュイン阻害剤であり得る。

他の実施形態では、小分子はプロテアソーム阻害剤を含むことができる。プロテアソームは、内因性タンパク質の分解に関与するプロテアーゼ複合体である。破壊されるタンパク質は、標的タンパク質に結合したユビキチンが存在するため、プロテアソームによって認識される。ユビキチン－プロテアソーム経路は、特定のタンパク質の細胞内濃度を調節する上で不可欠な役割を果たし、それにより、細胞内の恒常性を維持する。プロテアソーム阻害剤は、細胞内の複数のシグナル伝達カスケードに影響を与える可能性のある、この標的化されたタンパク質の分解を防ぐ。例えば、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ（ベルケイド）、カルフィルゾミブ（キプロリス）、またはイキサゾミブ（ニンラロ）である可能性がある。

実施形態では、追加の薬剤は、抗体などのポリペプチドであり得る。実施形態では、抗体は、ＰＤ１（抗ＰＤ１抗体）、ＰＤＬ１（抗ＰＤＬ１抗体）またはＣＴＬＡ４（抗ＣＴＬＡ４抗体）に特異的な抗体であり得る。他の実施形態では、追加の治療薬は、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ１６１抗体などの、ＮＫ細胞上の阻害性受容体に結合する抗体である。他の実施形態では、抗体は、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、またはＴＩＭ－３に対するものであり得る。図１３を参照すると、抗体は抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３／４抗体であり得る。

実施形態では、追加の薬剤は、化学療法剤であり得る。「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化合物を指すことができる。本明細書に記載の組成物とともに投与することができる化学療法剤としては、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル、５－ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インターフェロンアルファ－２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６－チオグアニン）；細胞傷害性剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン、コランブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げられるが、これらに限定されない。

化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファンおよびトレオスルファンなどのアルキルスルホネート；ダカルバジン；ベンゾドーパ、カルボコン、メチュレドーパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチイレンチオホスホルアミドおよびトリメチルオロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン；ＴＬＫ ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡ（商標））；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８など）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミドまたはウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチンなどのニトロソウレア；クロドロネートなどのビスホスホネート；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，１９９４，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３－１８６を参照されたい）およびアントラサイクリン、例えば、アントラサイクリン、ＡＤ３２、アルカルビシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ＤＸ－５２－１、エピルビシン、ＧＰＸ－１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）、エスペラミシン、ネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２およびペプロマイシン）、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルフォリノ－ドキソルビシン、シアノモルフォリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、ＥＩＣＡＲ、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなどの抗副腎薬（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）；フォリン酸（ロイコボリン）などの葉酸補充剤；アセグラトン；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）、ＬＹ２３１５１４ペメトレキセドなどの抗葉酸抗腫瘍薬、メトトレキセートおよびトリメトレキセートなどのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）およびＵＦＴ、Ｓ－１およびカペシタビンなどのそのプロドラッグなどの抗代謝剤、およびチミジル酸シンターゼ阻害剤およびラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸＲＭ、ＴＤＸ）などのグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤；エニルウラシルなどのジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの阻害剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；デフェロキサミン；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンおよびアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’‘－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；シトシンアラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイドおよびタキサン、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモフォアフリー、アルブミン工学によるパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金；白金類似体もしくはシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金ベースの類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、テポテカン、９－アミノカンプトテシン、カンプトテシン、およびクリスナトールなどのエピポドフィリン；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン、ビンカアルカロイド、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））などのビンカアルカロイド；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルヒロニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体；ならびに、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニソロンの併用療法の省略形であるＣＨＯＰ、および５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））による治療レジメンの省略形であるＦＯＬＦＯＸなど、上記のうちの２つ以上の組み合わせも挙げられる。

組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＮＦ－αが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、他の免疫療法剤と組み合わせて投与することができる。免疫療法剤の非限定的な例としては、シムツズマブ、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクトモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマクソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ヅリゴツマブ、ヅシジツマブ、デツモマブ、デセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマクソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィジツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イマガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、および３Ｆ８が挙げられる。

実施形態では、追加の薬剤は、一連のセッションにわたって投与することができる。本明細書に記載されている追加の薬剤のいずれか１つまたは組み合わせを投与することができる。放射線に関しては、治療するがんのタイプに応じて、任意の放射線治療プロトコルを使用することができる。例えば、限定ではないが、Ｘ線を照射することができる。例えば、深部腫瘍には高エネルギーメガボルテージ（１ＭｅＶを超えるエネルギーの放射線）を使用でき、皮膚がんには電子ビームおよびオルソボルテージＸ線放射線を使用することができる。ラジウム、コバルト、および他の元素の放射性同位元素などのガンマ線放出放射性同位元素も投与することができる。

さらに、本明細書に記載のがんの組成物および治療方法は、治療を受けている患者にとって、毒性が高すぎることが証明された、または証明される可能性がある、例えば、許容できないまたは耐えられない副作用をもたらす化学療法または放射線療法などの標準的な抗がん療法の代替として提供される。治療を受けている患者は、任意選択で、どの治療が許容可能もしくは耐えられるかによって、手術、放射線療法、または化学療法などの別のがん治療で治療することができる。

活性化剤はまた、白血病およびリンパ腫を含むがこれらに限定されない特定のがんの治療、例えば自家幹細胞移入を含む治療などのために、インビトロまたはエクスビボの様式で使用することができる。

薬剤耐性がんまたは細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるがんを治療するための方法は、それを必要とする患者に、有効量の少なくとも１つの活性化剤および任意選択で抗がん剤である別の治療薬を投与することを含む。好適な抗がん剤には、本明細書に記載のものが含まれ、メトトレキサート、タキソール、Ｌ－アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ダカルバジン、プロカルビジン、トポテカン、ナイトロジェンマスタード、サイトキサン、エトポシド、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、およびラチトレキサート、ＢＣＮＵ、イリノテカン、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ならびにドセタキセルを含むが、これらに限定されない。

また、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、メゲストロール、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェンなどの、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、酢酸リュープロリド、ゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに、トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどの遺伝子治療ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ＥＢ１０８９、ＣＤ１０９３、ＫＨ１０６０などのビタミンＤＡ類似体；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。

追加の実施形態では、追加の治療薬は、ベルトポルフィン（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（２ＢＡ－２－ＤＭＨＡ）などの光線力学剤；インターフェロン－α、インターフェロン－γまたは腫瘍壊死因子などのサイトカイン；ゲムシタビン、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）（ボルテゾミブ）、Ｒｅｖｌａｍｉｄ（商標）（レナリドマイド）またはタラミド；ロバスタチン；１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン；スタウロスポリン；アクチノマイシンＤまたはダクチノマイシンなどのアクチノマイシン；ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、およびムトキサントロンなどのアントラサイクリン；ベラパミルなどのＭＤＲ阻害剤およびタプシガルギンなどのＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤；ならびに、上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体であり得る。

他の実施形態
本明細書に記載の実施形態は、その詳細な説明とともに記載されたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本明細書に記載の実施形態の範囲を例示すことを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書に記載の実施形態は、特許請求の範囲に記載された本明細書に記載の実施形態の範囲を限定しない以下の例にさらに記載される。

実施例は、本明細書に記載の実施形態のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の実施例は、本明細書に記載の実施形態を作製および実施する例示的な様式を例示している。しかしながら、本明細書に記載の実施形態の範囲は、これらの実施例に開示されている特定の実施形態に限定されず、代わりの方法を使用して同様の結果を得ることができるため、例示のみを目的としている。

実施例１－ＭＨＣクラスＩ発現の喪失によるチェックポイント遮断に耐性のあるがんの治療
Ｔ細胞上の阻害性受容体を標的とする抗体によるチェックポイント遮断は、がんの治療に広く使用されている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とする抗体は、メラノーマ、肺がん、腎がん、膀胱がん、およびホジキンリンパ腫などの非限定的な例を含む様々ながんの治療に承認されている。チェックポイント遮断には、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合した腫瘍由来ペプチドの認識後に腫瘍細胞を殺傷する、免疫応答のエフェクター細胞としての細胞傷害性Ｔ細胞が必要である。遺伝子変異またはエピジェネティックなメカニズムの不活性化に起因してＭＨＣクラスＩの発現を喪失している腫瘍は、チェックポイント遮断に耐性がある。しかしながら、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＮＫ細胞上の阻害性ＫＩＲ受容体のリガンドとして機能する。しかしながら、ＮＫ細胞の活性化シグナルが存在しないか、または弱いため、この阻害シグナル伝達の喪失は、腫瘍免疫の誘導には十分ではない。

ＭＨＣクラスＩ欠損腫瘍細胞が、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の２つの主要な受容体を介してＮＫ細胞を活性化させるＭＩＣＡ抗体の存在下で効率的に殺傷されることを示した。重要なのは、ＭＩＣＡ抗体がインビボで治療に耐性のあるがん細胞に対して単剤活性を有することを実証することである。理論に拘束されることを望まないが、ＭＨＣクラスＩ欠損腫瘍細胞は、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６などの主要な活性化受容体を介してＮＫ細胞の活性化を誘導するモノクローナル抗体で標的化することができる。例えば、そのようなモノクローナル抗体は、ＮＫ細胞を活性化させるＭＩＣＡ抗体または他の腫瘍標的化抗体であり得る。

現在、ＭＨＣクラスＩの発現を喪失したがんに対する免疫療法はない。このようながんは、エフェクターメカニズムとして細胞傷害性Ｔ細胞を必要とするすべての免疫療法に耐性がある。この分野での臨床的ニーズは高い。本発明者らのアプローチでは、ＮＫ細胞は２つの主要なＮＫ細胞受容体（ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６）を介したシグナル伝達により活性化されるが、ＭＨＣクラスＩタンパク質と結合するＫＩＲ受容体からの阻害シグナルはこれに対抗しない。

本明細書に記載の実施形態の態様は、チェックポイント遮断を伴う単剤療法に耐性のある患者における、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４チェックポイント遮断を伴う併用療法の使用を含む。ほとんどの応答性がんでは、患者の２０％のみがＰＤ－１遮断に応答するので、改善の余地は多い。

実施例２－細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍の治療のためのナチュラルキラー細胞の利用
要約
細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性は、Ｂ２ＭまたはＪＡＫ１遺伝子の変異など、腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現またはＩＦＮγシグナル伝達の喪失によって媒介されることがよくある。ＮＫ細胞はそのような耐性腫瘍を標的とすることができるが、好適なＮＫ細胞ベースの戦略はまだ開発されていない。本明細書に記載される実施形態の態様は、この欠点に対処する。ヒトがんにおける頻繁な回避メカニズムであるＭＩＣＡ／Ｂシェディングを遮断したｍＡｂによる処理後に、Ｂ２ＭおよびＪＡＫ１欠損転移がＮＫ細胞の標的となったことが示されている。また、チェックポイント遮断後に進行した患者を含む、ヒトメラノーマ転移におけるＮＫ細胞の単細胞分析を実施した。腫瘍浸潤と循環ＮＫ細胞との主要な転写の違いを識別した。また、７つの腫瘍浸潤ＮＫ細胞クラスターの遺伝子発現プログラムは、細胞傷害性およびケモカイン分泌などの重要な特殊化を示している。したがって、ＮＫ細胞ベースの免疫療法は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性を持たせる変異を有する腫瘍を標的とする機会を提供する。

序章
Ｔ細胞上のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）阻害性受容体を標的とする抗体によるチェックポイント遮断は、進行がんの患者においても永続的な抗腫瘍免疫を誘導することができる。しかしながら、多くの患者は一次または二次耐性のためにこれらの療法の恩恵を受けることができない。^１細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）タンパク質に結合した腫瘍由来ペプチドを認識するその能力に基づいて、チェックポイント遮断の有効性において中心的な役割を果たす。^２Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によってこのようなＭＨＣ－Ｉ－ペプチド複合体が認識されると、Ｔ細胞がインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）を放出し、腫瘍細胞の増殖が阻害され、腫瘍細胞と樹状細胞の両方においてＭＨＣ－Ｉタンパク質の発現が増強される。^３したがって、チェックポイント遮断に対する耐性は、ＭＨＣ－Ｉ（Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および他の遺伝子）またはＩＦＮγ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２）経路における主要遺伝子の変異またはエピジェネティックなサイレンシングのいずれかによる、腫瘍細胞によるＭＨＣ－Ｉ発現の喪失によって、媒介される場合が多い。^{４、５、６}新生抗原の数が少ないか、または失われていると、細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍免疫も低下する。^{７、８、９、１０}現在、チェックポイント遮断および細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある固形腫瘍を有する患者に対する代替免疫療法はない。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞が必要とするものとは実質的に異なる分子メカニズムによって腫瘍細胞を認識する。腫瘍細胞のＮＫ細胞認識は、ＤＮＡ損傷および細胞ストレスなどの悪性形質転換に関連するリガンドによって媒介される。^１２理論に拘束されることを望まないが、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法アプローチに応答することができる。実際、腫瘍細胞によるＭＨＣ－Ｉ発現の喪失は、ＭＨＣ－Ｉタンパク質が阻害性ＮＫ細胞受容体のリガンドとして機能するため、ＮＫ細胞に対する感受性を高める。^１２しかしながら、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫の誘導には、ＮＫ細胞を介した腫瘍細胞の攻撃を妨げる免疫回避メカニズムの効果的な標的化も必要になる可能性がある。例えば、多くのヒトがんは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の亜集団上の活性化ＮＫ群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドとして機能するＭＨＣ－Ｉポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）およびＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）タンパク質を発現する。^{１３、１４}しかしながら、腫瘍は、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質のタンパク質分解によるシェディングにより、ＮＫＧ２Ｄ受容体を介した腫瘍免疫を回避することがよくある。^{１５、１６、１７、１８、１９}最近、シェディングに不可欠なドメインであるＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を開発した。例えば、表１、およびＷＯ２０１８２１７６８８Ａ１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらのｍＡｂは、ＭＩＣＡ／Ｂのシェディングを阻害し、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を誘導した。腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の密度の増加は、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体を介した活性化を増強し、腫瘍コンジュゲート抗体のＦｃセグメントもＣＤ１６Ｆｃ受容体を介してＮＫ細胞を活性化させた。このようなＭＩＣＡ／Ｂ抗体による治療により、腫瘍浸潤ＮＫ細胞が、細胞傷害性の高い状態へと著しく変化した。^２０

したがって、理論に拘束されることを望まないが、ＮＫ細胞ベースの療法は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある転移性病変を治療することができる。しかしながら、固形腫瘍に浸潤するヒトＮＫ細胞についてはほとんど知られていない。チェックポイント遮断後に腫瘍が進行した患者からの転移を含む、ヒトメラノーマ転移に浸潤するＮＫ細胞の単細胞分析を実施した。これらのデータは、新しいＮＫ細胞の亜集団を特定し、腫瘍浸潤ＮＫ細胞集団と循環ＮＫ細胞集団との顕著な違いを浮き彫りにした。ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメインｍＡｂによる処理により、ＭＨＣ－ＩまたはＩＦＮγシグナル伝達経路における不活性化変異（それぞれＢ２ｍおよびＪａｋ１変異）を伴う腫瘍に対するＮＫ細胞を介した免疫が可能となった。これらの結果は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるヒトがんに対するＮＫ細胞ベースの免疫療法の開発およびその検証を導くのに役立つであろう。

結果
ヒトメラノーマ転移に浸潤するＮＫ細胞の単一細胞特性評価
証拠の増加は、腫瘍免疫においてＮＫ細胞が果たす重要な役割を実証する。^{２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８}しかしながら、ヒト固形腫瘍に浸潤しているＮＫ細胞集団についてはほとんど知られていない。したがって、外科的切除を必要とするヒトメラノーマ転移に浸潤するＮＫ細胞の単一細胞研究を実行した。これらの患者の大多数では、チェックポイント遮断による治療後に腫瘍が進行していた（図１７）。ＮＫ細胞は、ＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ４^－ＣＤ８ａ^－ＣＤ１４^－ＣＤ１５^－ＣＤ１６３^－リンパ球サイズの生細胞としてフローサイトメトリーによって腫瘍および一致する血液試料から選別した。これらのマーカーで同定されたＮＫ細胞は、血液試料と比較して腫瘍内により低頻度で存在していた。全リンパ球集団におけるＮＫ細胞頻度は、血液では２．４７％～４６．１０％、腫瘍では０．４６％～６．４８％の範囲で変動した（図８）。例えば、ＮＫ細胞は、患者ＣＹ１５８の腫瘍中の総ＣＤ４５^＋リンパ球の４．１２％、およびその血液中の総ＣＤ４５^＋リンパ球の２７．７％であった（図１）。

３人の患者（ＣＹ１５５、ＣＹ１５８、およびＣＹ１６０）からのメラノーマ転移および一致する血液試料から単離されたＮＫ細胞のトランスクリプトームを、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを使用して、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）によって調べた。非線形次元削減技法である一様多様体近似および射影（ＵＭＡＰ）を使用して、ＮＫ細胞クラスターを視覚化した。各患者からの腫瘍対血液ＮＫ細胞の統合分析は、クラスター全体にわたるＮＫ細胞の分布に大きな違いがあることを実証し、これは、腫瘍浸潤ＮＫ細胞と循環ＮＫ細胞のトランスクリプトームに実質的な違いがあったことを示している。同様の遺伝子発現プロファイルを持つＮＫ細胞クラスターが３人の患者すべてにおいて同定された。唯一の例外は、患者ＣＹ１５８の腫瘍にのみ存在する、インターフェロン誘導性遺伝子（ＩＳＧ１５、ＩＦＩ６）の差次的発現を特徴とするＮＫ細胞集団であった（図１、図９）。

３人の患者すべてからの血液ＮＫ細胞の分析により、４つの血液ＮＫ細胞クラスター（ｂＮＫ．０～ｂＮＫ．３）が同定された。３人の患者すべてからの腫瘍浸潤細胞の同様の分析により、ＮＫ細胞の８つのクラスター（ｔＮＫ．０～ｔＮＫ．７）が同定された（図１）。腫瘍内で同定された２つのＮＫ細胞クラスターは、血液ＮＫ細胞と転写機能を共有していたが、これらの場所では著しく異なる頻度で存在していた。腫瘍内の優勢なＮＫ細胞クラスター（ｔＮＫ．０、４１．１％）は、血液中のマイナーなＮＫ細胞集団（ｂＮＫ．２、３．３％）（ＳＥＬＬ、ＩＬ７Ｒ、ＸＣＬ１およびＸＣＬ２）と転写シグネチャーを共有していた。血液中の優勢なＮＫ細胞クラスター（ｂＮＫ．０）は、腫瘍内のクラスターｔＮＫ．３（ＦＧＦＢＰ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢを含む）と多くの主要遺伝子の発現を共有していたが、腫瘍浸潤ＮＫ細胞の割合ははるかに低かった（血中の８２．９％と比較して、１０．９％）。また、小さな増殖ＮＫ細胞クラスターが血液（ｂＮＫ．３、０．９％）および腫瘍（ｔＮＫ．７、１．５％）の両方に存在し、これらの細胞は細胞周期遺伝子（ＰＣＮＡおよびＭＫＩ６７を含む）の発現を共有していた。メラノーマ転移中で同定された他の５つのＮＫ細胞クラスター（ｔＮＫ．１、ｔＮＫ．２、ｔＮＫ．４、ｔＮＫ．５およびｔＮＫ．６）は、血液ＮＫ細胞クラスターとは転写プログラムがまったく異なっていた（図１）。

ＮＫ細胞の単離に使用されるマーカー（図１）は、ＩＬＣ１、ＩＬＣ２およびＩＬＣ３亜集団を含む自然リンパ球（ＩＬＣ）によっても発現される。^２９ＩＬＣは組織に存在する細胞であることが知られており、したがってＩＬＣは血液試料に存在しなかった可能性がある。^３０しかしながら、メラノーマ転移中で同定されたＮＫ細胞クラスターの一部がＩＬＣであり得るかどうかを評価することは重要であった。以前のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ研究では、ＮＫ細胞、ＩＬＣ１、ＩＬＣ２およびＩＬＣ３によって差次的に発現された遺伝子が特定され、これらの遺伝子を使用して、これらの自然リンパ球集団それぞれの転写シグネチャーを組み立てた。^３１血液中のすべてのＮＫ細胞クラスターは、強いＮＫ細胞遺伝子発現シグネチャーを持っていたが、３つすべてのＩＬＣシグネチャーのスコアは低かった（図２および図１０）。さらに、腫瘍内で同定された８つのＮＫ細胞クラスターのうち７つも、ＮＫ細胞遺伝子発現シグネチャーのスコアが高かった（図２）。例外はｔＮＫ．５クラスター（金色）で、ＩＬＣ３遺伝子発現シグネチャーのスコアは高かったが、ＮＫ細胞、ＩＬＣ１またはＩＬＣ２シグネチャーのスコアは低かった（図２および図１０）。最後に、腫瘍ＮＫ細胞集団または血液ＮＫ細胞集団はいずれも、強いＩＬＣ１またはＩＬＣ２遺伝子発現シグネチャーを持っていなかった（図１０）。したがって、ＮＫ細胞（８クラスター中７クラスター、合計９３．２％細胞）およびＩＬＣ３様細胞（１クラスター、細胞の６．８％）がヒトメラノーマ転移中で同定された。

主要なＮＫ細胞機能に関連する遺伝子発現プログラム
腫瘍免疫におけるＮＫ細胞の調査は、主に細胞傷害性機能に焦点を当てているが、最近の研究では、Ｔ細胞を介した腫瘍免疫の誘導に重要な樹状細胞の動員におけるＮＫ細胞の重要な役割が強調されている。^{２４、２６}細胞傷害性遺伝子発現シグネチャー（ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＭ、ＰＲＦ１、ＧＮＬＹおよびＮＫＧ７）を組み立てるために、主要な細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子のパネルを使用した。この細胞傷害性シグネチャーは、ほとんどの血液ＮＫ細胞、特にクラスターｂＮＫ．０、ｂＮＫ．１、ｂＮＫ．３で高かった。腫瘍ＮＫ細胞では、この細胞傷害性シグネチャーの勾配が観察された。これは、ｔＮＫ．３およびｔＮＫ．４クラスターで最も高く、他の５つのクラスターでは中間レベルであった。これらの細胞をＩＬＣ３として指定したことと一致して、ｔＮＫ．５クラスターのみがこの細胞傷害性シグネチャーに対して陰性であった（図２）。また、ＮＫ細胞クラスター全体にわたってグランザイム遺伝子の発現パターンが異なることも観察された。ＧＺＭＡの発現はほとんどの血液ＮＫ細胞で高かったが、腫瘍ＮＫ細胞における細胞傷害性シグネチャーと同様の勾配を示した。興味深いことに、ＧＺＭＫの発現は明確なパターンを示した。ほとんどの血液ＮＫ細胞では低かったが、腫瘍ＮＫ細胞クラスターの多くでは高かった（図３）。

また、腫瘍ＮＫ細胞および血液ＮＫ細胞間でケモカイン遺伝子の発現に著しい違いが見られた。ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２（ＸＣＲ１ケモカイン受容体に結合する）は、交差提示ＤＣ（ｃＤＣ１）を腫瘍に動員する上で重要な役割を果たすことが最近示された。^２６これら２つのケモカイン遺伝子の発現は、血液ＮＫ細胞と比較して腫瘍ＮＫ細胞（クラスターｔＮＫ．０、ｔＮＫ．１、ｔＮＫ．２、ｔＮＫ．６）で実質的に高かった（図２および図１０）。また、多くの腫瘍ＮＫ細胞（クラスターｔＮＫ．３、ｔＮＫ．４およびｔＮＫ．１）でのケモカイン遺伝子の別のセット（ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ２およびＣＣＬ５）の高発現が観察されたが、ほとんどの血液ＮＫ細胞での発現は低かった（図２および図１０）。これらのケモカインはＣＣＲ５および他のケモカイン受容体に結合し、Ｔ細胞および他の免疫細胞の動員に重要な役割を果たす。ＣＣＬ５は、交差提示ＤＣの動員に貢献することも知られている。^{２６、３２}したがって、腫瘍に存在するＮＫ細胞は、ＤＣ、Ｔ細胞および他の免疫細胞集団の動員に重要な多くのケモカイン遺伝子を発現する。血液ＮＫ細胞と比較して腫瘍浸潤ＮＫ細胞が、ＡＰ－１転写因子のサブユニットをコードする実質的により高いレベルのＦＯＳおよびＪＵＮを発現したことに留意する（図１）。単一細胞データはまた、ケモカイン遺伝子発現に関して腫瘍ＮＫ細胞集団間の機能的特殊化を明確に示した：腫瘍ＮＫ細胞の４つのクラスターはＸＣＬ１／ＸＣＬ２の高発現を示したが、腫瘍ＮＫ細胞クラスターの別個のセットはＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ２およびＣＣＬ５の高発現を示した。したがって、これらの腫瘍ＮＫ細胞集団は、別個の微小環境を作り出すことができる。

ＮＫ細胞は、一連の活性化および阻害性受容体を介して細胞外環境からのシグナルを統合する（図１１）。活性化受容体をコードする遺伝子の中で、血液ＮＫ細胞および腫瘍ＮＫ細胞の大部分でＫＬＲＦ１（ＮＫｐ８０タンパク質）に対して強いシグナルが観察された（図１１）。ＮＫｐ８０のリガンドをコードするＡＩＣＬ遺伝子は、血液悪性腫瘍と固形腫瘍の両方で発現する可能性がある。^３３他の確立された活性化ＮＫ細胞受容体のシグナルは低かった（ＮＣＲ１、ＮＣＲ３、ＣＤ２２６およびＮＫＧ２Ｄ）が、ｍＲＮＡとタンパク質の両方が関連する細胞集団内で非常に豊富であっても、一部のｍＲＮＡはｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによってかなり弱いシグナルを生成する傾向があることに留意することが重要である。例えば、ＫＬＲＫ１ ｍＲＮＡは血液ＮＫ細胞を含むすべてのＮＫ細胞集団ではて低かったが（ＫＬＲＫ１はＮＫＧ２Ｄタンパク質をコードしている）、ＨＣＳＴ ｍＲＮＡは高かった（ＨＣＳＴ ｍＲＮＡはＮＫＧ２Ｄのアダプター分子であるＤＡＰ１０をコードしている）。したがって、理論に拘束されることを望まないが、ＫＬＲＫ１ ｍＲＮＡをｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで検出することは困難であったが、ＨＣＳＴは検出された。一方、公開された報告は、ＮＫＧ２Ｄタンパク質がメラノーマ患者からのヒト血液ＮＫ細胞上で検出できるが、健康ドナーと比較して低いレベルであることを実証している。^{３４、３５}ＮＫＧ２Ｄの発現は、血液ＮＫ細胞と比較して腫瘍浸潤で低かった（図１１）。これはおそらく、リガンド誘導性の下方調節およびＴＧＦβ誘導性の遺伝子発現の変化によるものである。^３６

また、ＮＫ細胞内で阻害機能が確立された受容体の興味深い発現パターンを観察した。腫瘍浸潤ＮＫ細胞は血液ＮＫ細胞よりも高レベルのＫＬＲＣ１遺伝子（ＮＫＧ２Ａタンパク質）を発現し、ＫＬＲＤ１遺伝子（ＣＤ９４タンパク質）はほとんどの腫瘍ＮＫ細胞および血液ＮＫ細胞によって高度に発現されていた。これは、メラノーマ浸潤ＮＫ細胞の大部分が、ＨＬＡ－Ｅを認識する阻害性ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４受容体を発現していることを示している。また、腫瘍ＮＫ細胞と血液ＮＫ細胞の両方でＫＬＲＢ１遺伝子（ＣＤ１６１タンパク質）の強いシグナルが観察され、ＣＤ１６１は腫瘍細胞およびＡＰＣ上のＣＬＥＣ２Ｄに結合した後のＮＫ細胞の細胞傷害性を阻害することが知られている。^３７他のほとんどの阻害性受容体のシグナルは弱かったが、興味深いことに異なる発現パターンが出現した。ＣＤ９６はＮＫ細胞クラスター全体にわたって発現したが、他の受容体の発現はＮＫ細胞クラスターのうちの１つまたは小さなサブセット（ＣＤ１６０およびＫＩＲ２ＤＬ３など）に限定されていた。また、ＫＩＲ２ＤＬ３およびＫＩＲ２ＤＬ４は、阻害性受容体遺伝子の同じファミリーに属していても、ＮＫ細胞クラスター全体にわたって異なる発現パターンを示した（図３および図１１）。

フローサイトメトリーによるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの検証
フローサイトメトリーを使用して、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータからの主要な所見を検証し、分析をメラノーマ患者のより大きな集団に拡張した。確立されたマーカー（ＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ４^－ＣＤ８ａ^－ＣＤ１４^－ＣＤ１５^－ＣＤ１６３^－ＣＤ１９^－リンパ球サイズの生細胞）を使用してＮＫ細胞を同定し、次いでｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づいてＣＤ１６ａおよびＦＧＦＰＢ２マーカーを使用して主要なＮＫ細胞亜集団を同定した。重要なのは、ＣＤ１６ａタンパク質がＦＣＧＲ３Ａ遺伝子によってコードされていることである。この分析により、３つの細胞集団が同定された：１）主要な細胞傷害性遺伝子（ＰＲＦ１およびＧＺＭＢ）を発現していたｂＮＫ．０（血液中で最も豊富な集団）およびｔＮＫ．３に対応したＦＧＦＢＰ２^＋ＣＤ１６ａ^＋ＮＫ細胞；２）マーカーとしてＦＧＦＰＢ２を使用してＣＤ１６ａ^＋集団から分離できるＦＧＦＢＰ２^－ＣＤ１６ａ^＋ＮＫ細胞（これらの細胞は、ｂＮＫ．１、ならびにＦＣＧＲ３Ａを発現したがＦＧＦＢＰ２を発現しなかったｔＮＫ．４およびｔＮＫ．１に対応していた）；３）ｂＮＫ．２（小さな血液サブセット）およびＦＧＦＢＰ２とＦＣＧＲ３Ａを発現しなかった豊富な腫瘍ＮＫ細胞集団（排他的ではないが、主にｔＮＫ．０およびｔＮＫ．２）に対応していたＦＧＦＢＰ２^－ＣＤ１６ａ^－ＮＫ細胞（図１および図３）。

ＦＧＦＢＰ２およびＣＤ１６ａマーカーを使用して、メラノーマにおけるこれら３つのＮＫ細胞集団を調べ、合計７人の患者の血液試料を照合した。血液試料中の優勢なＮＫ細胞集団はＦＧＦＢＰ２とＣＤ１６ａの両方について陽性であったが、腫瘍浸潤ＮＫ細胞の大部分はＦＧＦＢＰ２とＣＤ１６ａの両方について陰性であった（図３）。これはｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータ（図３）と一致している。さらに、これらのＮＫ細胞集団におけるグランザイムＡおよびＫの発現を調べた。グランザイムＡおよびＫの発現は、腫瘍ＮＫ細胞と比較して血液中で高かった。また、グランザイムＡレベルは、ＦＧＦＢＰ２^－ＣＤ１６ａ^－血液ＮＫ細胞と比較してＦＧＦＢＰ２陽性および陰性ＣＤ１６ａ^＋血液ＮＫ細胞で高かった（図３）。これはｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータ（図３）と一致している。

ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃタンパク質は、８人の患者のメラノーマ細胞の表面上で検出されたが、３人の患者の腫瘍細胞では低いか、または検出できなかった（図１２）。特に、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（ＣＹ１５５）で研究された腫瘍のうちの１つは、検出できない表面ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃタンパク質を有し、この患者はＰＤ－１ｍＡｂによる治療後に進行していた。表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質は、比較的低レベルではあるが、ほとんどの場合、メラノーマ細胞の表面上で検出された。９つの血清試料のうち７つで、シェディングＭＩＣＡが検出された。これは、シェディングによる腫瘍細胞からの表面ＭＩＣＡの喪失と一致している（図１２）。健康な対象の血清では、シェディングＭＩＣＡは検出されなかった。

ＭＩＣＡ抗体は、ＮＫ細胞を介したヒトＢ２Ｍ欠損メラノーマ細胞の殺傷を増強した
単一細胞データは、ＮＫ細胞がチェックポイント遮断に耐性のある病変を含むヒトメラノーマ転移に浸潤することを実証している（図１７）。したがって、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的抗体が、Ｂ２Ｍ欠損腫瘍細胞に対するＮＫ細胞を介した免疫を増強することができるかどうかを調べた。^２０ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子は、ヒト６番染色体上のＭＨＣ遺伝子座の一部であり、コードされたタンパク質は、ＭＨＣタンパク質と有意な構造的類似性を共有している。Ｂ２Ｍ欠損症は、Ｔ細胞性免疫およびＴ細胞チェックポイント遮断に対する応答性を無効にするが、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質はβ２ミクログロブリンまたはペプチドとは会合していない。^{５、３８、３９}ヒトＡ３７５メラノーマ細胞中のＢ２Ｍ遺伝子を不活性化させた結果、ＩＦＮγで刺激した後でもＭＨＣ－Ｉ表面タンパク質は完全に喪失していた（図４および図１３）。Ｂ２Ｍ欠損症はＭＩＣＡ／Ｂ経路を妨害しなかったが、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的ｍＡｂ（７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）による治療は、ＭＩＣＡのシェディングを阻害し、対照およびＢ２Ｍ編集Ａ３７５細胞と同程度にＭＩＣＡ／Ｂの表面レベルを増加させた（図４および図１３）。

ＮＫ細胞はＭＨＣ－Ｉ分子に対する阻害性受容体を有しており^１２、理論に拘束されることを望まないが、Ｂ２Ｍ欠損腫瘍細胞はＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理に対してより感受性が高い可能性がある。複数の時点で９６ウェルプレート内の蛍光腫瘍細胞のカウントを可能にする画像化ベースのシステムを使用して、ＮＫ細胞を介したヒトＡ３７５メラノーマ細胞の殺傷の動態を研究した。この技法の主な利点は、腫瘍の微小環境により関連性の高い、エフェクター対標的比が低い場合のＮＫ細胞と腫瘍細胞との相互作用の調査が可能になることである。^４０この実験は、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理（７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）が、対照のＡ３７５メラノーマ細胞と比較して、Ｂ２Ｍ－ＫＯに対して実質的により効果的であることを実証した。エフェクター対標的比が低い（１：１）場合でも、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの存在下では遅い時点（４８～７２時間）で少数の蛍光Ｂ２Ｍ－ＫＯメラノーマ細胞しか残っていなかった（図４）。ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３およびＫＩＲ２ＤＬ４は、ヒトＮＫ細胞上のＭＨＣ－Ｉ分子に対する最もよく特性評価された阻害性受容体の一部である。^１２抗体を介したこれらの受容体の遮断により、ＮＫ細胞を介した７Ｃ６－ｈＩｇＧ１処理Ａ３７５メラノーマ細胞の殺傷が増加した（図１３）。これらの実験により、ＭＨＣクラスＩ表面発現の喪失により、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの存在下でヒト腫瘍細胞がＮＫ細胞に対してより脆弱になることが実証された。

ＭＩＣＡ／Ｂ抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある転移に対するＮＫ細胞誘発免疫を誘導した
２匹のマウスモデルを使用して、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理がＭＨＣ－ＩおよびＩＦＮγ経路における不活性化変異（それぞれＢ２ｍおよびＪａｋ１変異）を伴う腫瘍に対するＮＫ細胞誘発免疫を誘導できるかどうかを調査した。ＩＦＮγはＴ細胞とＮＫ細胞の両方から分泌されるため、Ｊａｋ１変異は特に興味深いものであった。腫瘍細胞におけるＩＦＮγシグナル伝達は、ＭＨＣクラスＩ経路の多くの遺伝子の発現を増強するだけでなく、腫瘍細胞の増殖も阻害する。^３したがって、Ｊａｋ１変異は、ＮＫ細胞が腫瘍細胞の成長を制御する能力に悪影響を与えるか、またはＮＫ細胞上の阻害性受容体に関与するＭＨＣクラスＩタンパク質の喪失を通じてＮＫ細胞の活性化を増強する可能性がある。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマおよびＬＬＣ１肺がん細胞株にレンチウイルスベクターを形質導入して、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することが知られているヒトＭＩＣＡの発現を誘導した。^２０これらのマウスモデルは、ＭＨＣクラスＩ発現のパターンに重要な違いがあった。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞は、Ｈ－２Ｋ^ｂタンパク質の基礎表面レベルが非常に低かったが、ＩＦＮγへの曝露によりＨ－２Ｋ^ｂ表面タンパク質が著しく増加した（図５および図１４）。対照的に、ＬＬＣ１肺腫瘍細胞は、ＩＦＮγ処理によってＨ－２Ｋ^ｂの基礎レベルが検出可能なレベルに増加した（図５）。

Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡメラノーマ細胞におけるＢ２ｍまたはＪａｋ１遺伝子を不活性化させ（図５および図１４）、肺転移モデルでＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理の有効性を試験した。編集した腫瘍細胞を静脈内注射し、確立された表面肺転移が検出された７日目に処理を開始した（「処理前群」と表示されたマウスのサブセットの病理学的分析によって決定）（図５）。以前に報告されたように、ヒトＭＩＣＡに対する内因性抗体の発生を防ぐために、Ｂ細胞欠損Ｉｇｈｍ^－／－マウスを宿主として使用した。^２０ＭＩＣＡ ｍＡｂ（７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａ）による処理は、対照、Ｂ２ｍ－ＫＯおよびＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞による肺転移の増殖を阻害した（図５）。また、ＭＩＣＡ ｍＡｂ処理により、シェディングＭＩＣＡの血漿レベルが低下した（図１４）。Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ接種と比較して、１日目および２日目に投与されたＭＩＣＡ ｍＡｂは、アイソタイプ対照ｍＡｂ処理と比較して、対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯメラノーマ転移を有する野生型（ＷＴ）マウスの生存を有意に増加させた（図５）。驚いたことに、Ｂ２Ｍ－ＫＯマウスと比較した場合、ＪＡＫ１－ＫＯマウスではより大きな生存利益があった。ＪＡＫ１－ＫＯマウスが応答するかどうかがわからなかったため（ＮＫ細胞もガンマインターフェロンを分泌するため）、この発見は驚くべきものであった。本明細書に示されるように、ＮＫ細胞は、ガンマインターフェロン経路に喪失変異を有する腫瘍に対して依然として活性である。また、ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍モデルにおけるＭＩＣＡ／Ｂ抗体処理の有効性を検討した。注目すべきことに、対照ＬＬＣ１細胞はベースラインでＭＨＣ－Ｉを発現し、ＩＦＮγで処理するとＭＨＣ－Ｉ表面タンパク質レベルが増加するが、Ｂ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１細胞はＩＦＮγで処理してもＭＨＣ－Ｉを発現しない（図５）。腫瘍細胞をＷＴマウスに静脈内注射し、２日目にｍＡｂ処理を開始した。ＭＩＣＡ ｍＡｂ処理すると、対照ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞によって形成される肺転移の数が減少した。Ｂ２ｍ遺伝子の不活性化により、対照のＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞と比較して、肺転移の数がほとんど検出できないレベルまで減少した。したがって、接種した腫瘍細胞の数を５０％増加させた結果、Ｂ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞による肺転移が形成された。これらの実験条件下で、アイソタイプ対照ｍＡｂと比較して、７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａでの処理後のＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移の数が有意に減少したことが観察された（図５）。さらに、養子移入モデルを使用して、ＮＫ細胞およびＭＨＣ－Ｉタンパク質の阻害性受容体の役割を調査した。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ＫＯマウスを、同系（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来）または同種（ＣＢ６Ｆ１マウス由来）のＮＫ細胞で再構成した。同系および同種のＮＫ細胞は、マウスをＭＩＣＡ／Ｂとアイソタイプ対照ｍＡｂで処理した場合に、ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞によって形成される肺転移の数を大幅に減少させた。また、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体処理は、同種ＮＫ細胞を移植した場合に、より効果的であった（図５）。以前に報告されたように、同種ＮＫ細胞は、腫瘍細胞（ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞など）上のＭＨＣクラスＩタンパク質によっては阻害されない。^４１理論に拘束されることを望まないが、データは、ＮＫ細胞上の阻害性受容体によるＭＨＣ－Ｉタンパク質の関与により、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによって誘導される抗腫瘍免疫の有効性が低下することを検証している。

次に、ＷＴマウスに接種したＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株を用いて機構実験を実行した。ＮＫ細胞が枯渇すると、対照およびＢ２ｍ－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞の両方に対するＭＩＣＡ ｍＡｂの有効性が完全に喪失し、一方でＮＫ細胞が枯渇することによって、Ｊａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞に対するＭＩＣＡ ｍＡｂの有効性が大幅に低下した（図６）。以前に報告されたように、安楽死の前にＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４５．２抗体を静脈内注射することによって肺浸潤細胞と血液ＮＫ細胞とを区別した。^２０ＭＩＣＡ ｍＡｂ処理により、対照またはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍へのＮＫ細胞浸潤の程度が増加した（図６）。この分析では、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞の数がＭＩＣＡ ｍＡｂ処理マウスにおいて実質的に減少したため、ＮＫ細胞浸潤は腫瘍量に対して正規化した（図６）。これらのデータは、ＭＩＣＡ ｍＡｂ処理が、腫瘍細胞がＢ２ｍまたはＪａｋ１遺伝子に不活性化変異を有する場合でも、ＮＫ細胞依存的にメラノーマ転移の増殖を阻害することを実証している。

ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとＨＤＡＣ阻害剤との組み合わせで処理したヒト腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルの向上
上記の腫瘍モデルでは、ＭＩＣＡ転写は、以前に示したように、比較的高レベルのＭＩＣＡを誘導する異種プロモーターによって制御されていた。^２０しかしながら、ヒトがんでは、ＭＩＣＡ／Ｂの発現はＤＮＡ損傷および細胞ストレスに応答して誘導される。^１３調査したヒトメラノーマ転移では、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質は、低レベルではあるが、ほとんどの場合、腫瘍細胞の表面上で検出可能であり、９人中７人の患者の血清にＭＩＣＡが存在した（図１２）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子の転写が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）によってエピジェネティックに調節され、ＨＤＡＣ阻害剤がこれらの遺伝子の転写を増強することは周知である。^４２汎ＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットは、多発性骨髄腫の治療薬として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。^４３複数のがんマウスモデルでの以前の研究により、パノビノスタットの治療活性には機能的に正常な（ｉｎｔａｃｔ）免疫系が必要であることが確立された。^４４したがって、パノビノスタットと７Ｃ６－ｈＩｇＧ１ ｍＡｂとの組み合わせが、転写の増加（パノビノスタット）と表面タンパク質の安定化（ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ）によってＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを向上させることができるかどうかを調べた。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、Ａ３７５メラノーマ細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）で２４時間処理すると、ＭＩＣＡ、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１ＬなどのＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする複数の遺伝子のｍＲＮＡレベルが増加することを実証した。しかしながら、パノビノスタットは、従来のまたは非従来のＭＨＣ－Ｉ分子をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させなかった（図７）。パノビノスタットはまた、Ａ３７５メラノーマ細胞における他の多くの遺伝子の転写に影響を及ぼし、その一部は免疫関連経路であった（図１５）。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせにより、表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルが大幅に増加し、細胞生存率を低下させることなく、シェディングＭＩＣＡの濃度が低下した（図７）。これらの結論は、ヒト腫瘍細胞株の多様なパネルの分析によってさらに裏付けられた（図１５）。また、転移性病変から確立された短期ヒトメラノーマ細胞株のパネルによってＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを調べた。^{２０、４５}パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂでの処理は、個々の化合物での処理と比較して、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の表面密度を大幅に増加させた（図７）。これらのデータは、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写を増加させ、合成タンパク質を安定化させる組み合わせアプローチにより、ヒトがん細胞上の表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質が大幅に増加することを実証している。

ＭＩＣＡ ｍＡｂとパノビノスタットとを組み合わせると、ヒトＮＫ細胞で再構成したマウスのメラノーマ転移が減少する
次に、ヒトメラノーマ細胞の表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルに対するパノビノスタットのインビボ活性を調査した。パノビノスタットの選択された用量（１０ｍｇ／ｋｇ）が、免疫不全ＮＳＧマウスに移入したヒトＮＫ細胞に悪影響を及ぼさないことを最初に確立した（総循環ＮＫ細胞、ならびにＣＤ１６ａまたはＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の数に基づく、図１６）。次に、ＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞をＮＳＧマウスに静脈内注射し、転移が確立するまで２週間待った。次に、マウスをパノビノスタット（もしくはＰＢＳ）、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ（もしくはアイソタイプ対照ｍＡｂ）、またはパノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ（またはパノビノスタットとアイソタイプ対照ｍＡｂ）との組み合わせで２４時間間隔で２回処理した。１日後、ＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルを、フローサイトメトリーによって解離した肺組織からのＺｓＧｒｅｅｎ^＋腫瘍細胞上で定量した。選択された用量のパノビノスタットは、メラノーマ細胞のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを有意に増加させなかったが、パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせにより、肺転移におけるＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞のＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルが高くなった（図７）。

以前の経験に基づくと、移入したヒトＮＫ細胞の生存はＮＳＧマウスでは制限されており、比較的少数のヒトＮＫ細胞のみが肺組織に浸潤していた。したがって、本発明者らは、Ａ３７５メラノーマ細胞接種の１日後に処理を開始した（図７）。治療の早期開始により、肺組織にまだ深く浸潤していない腫瘍細胞のＮＫ細胞認識が可能になった可能性があった。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせのみが、対照（Ｂ２Ｍ野生型）Ａ３７５メラノーマ細胞によって形成される肺転移の数を減少させるが、パノビノスタットまたはＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂのいずれかによる単剤療法は効果がないことが分かった。対照的に、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによる単剤療法では、Ｂ２Ｍ－ＫＯ Ａ３７５メラノーマ細胞によって形成される肺転移の数が有意に減少した（図７）。ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとパノビノスタットとの組み合わせによっては、Ｂ２Ｍ－ＫＯ転移に対するこの効果は増強されなかった。これは、このモデルではＮＫ細胞の再構成が制限されていたためと考えられる。これらの結果は、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理が、このヒト化マウスモデルにおけるＭＨＣ－Ｉ欠損ヒトメラノーマ転移に対してより効果的であるのに対し、ＭＨＣ－Ｉタンパク質を発現するメラノーマ転移に対しては併用療法のみが効果的であることを実証している。

考察
チェックポイント遮断に対する一次および二次耐性は、腫瘍学における主要な問題である。チェックポイント遮断に対する耐性の多くのメカニズムは、腫瘍細胞におけるＭＨＣ－ＩおよびＩＦＮγシグナル伝達経路に関連している。これらには、ＭＨＣ－Ｉ抗原提示経路におけるＢ２Ｍまたは他の遺伝子の変異、新生抗原またはＭＨＣ－Ｉ発現の転写およびエピジェネティックなサイレンシング、ならびにＩＦＮγシグナル伝達経路における不活性化変異が含まれる。^{４、５、６}ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質はＭＨＣ－Ｉタンパク質と同様の構造を有するが、β２－ミクログロブリンとは集合しない。^３８また、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写は、ＩＦＮγではなくＤＮＡ損傷と細胞ストレスによって調節されている。^１３したがって、ＭＨＣ－ＩおよびＩＦＮγ経路の不活性化変異は、ＭＩＣＡ／Ｂ発現に悪影響を及ぼさない。

ＭＨＣ－Ｉ発現の喪失により、ＮＫ細胞の重要な阻害シグナルが除去されることは周知であるが、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫の誘導には十分な活性化シグナルも必要である。^１２ＭＨＣ－Ｉ（Ｂ２Ｍ変異）またはＩＦＮγシグナル伝達（ＪＡＫ１変異）経路に不活性化変異がある転移は、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的抗体で治療できることを示している。この抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのタンパク質分解によるシェディングを阻害する。これは、ヒトがんにおけるＮＫＧ２Ｄ受容体を介した免疫からの一般的な回避メカニズムである。このｍＡｂによる処理は、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ（ＭＩＣＡ／Ｂリガンドの密度の増加）とＣＤ１６ａ（ｍＡｂのＦｃ領域）受容体の両方の活性化を誘導することを以前に示した。^２０理論に拘束されることを望まないが、そのようなｍＡｂでＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を誘発するために２つのアプローチを試験することができる。まず、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的ｍＡｂを使用して、ＭＨＣ－ＩまたはＩＦＮγシグナル伝達経路における変異を不活性化させることによるチェックポイント遮断に耐性のある腫瘍を処理することができる。第二に、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとＰＤ－１ｍＡｂの同時投与は、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞を介した免疫を同時に誘発し、それにより、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍クローンの増殖を防ぐことができる。このようなアプローチは、広範な不均一性を伴う進行したヒト腫瘍にとって特に興味深い可能性がある。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞、γδＴ細胞およびＩＬＣによっても発現されることに留意することが重要である。^{１４、４６、４７}理論に拘束されることを望まないが、したがって、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理は、Ｔ細胞を介した腫瘍免疫を増強することができる。

腫瘍学で使用される多くの治療アプローチは、腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の発現を増強する。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＦＤＡ承認薬であるパノビノスタットなどのＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写を増強することは周知である。^４３しかしながら、腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂタンパク質のタンパク質分解によるシェディングは、ＮＫＧ２Ｄ受容体の活性化に対するそのような薬物の効果を制限する。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン抗体との組み合わせにより、メラノーマ転移のヒト化マウスモデルにおいてＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルが大幅に増加し、ＮＫ細胞を介した免疫が増強されることを示している。このヒト化モデルには重大な制限があり、特に恒常性サイトカインシグナル伝達の欠如により、移入されたヒトＮＫ細胞の生存が制限されていることを認識している。同様のアプローチを使用して、他のＦＤＡ承認薬との併用療法を開発することができる。ＨＤＡＣ阻害剤は健康な組織でＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を誘導することもできるが、マウスにはＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子がないため、この態様を本研究で評価することはできない。放射線療法によって誘発されるＤＮＡ損傷応答がＭＩＣＡ／Ｂ転写を強力に増強することも知られている。^４８局所放射線療法とＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによる全身免疫療法との組み合わせは、２つの全身免疫療法剤（ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４ ｍＡｂなど）を含む組み合わせで観察された免疫関連の有害事象を制限するのに魅力的である。また、免疫療法と放射線療法（ＣＴＬＡ－４遮断）を組み合わせると、非照射病変に対する全身性腫瘍免疫を誘発することができるという臨床的証拠がすでにある（アブスコパル効果）。^４９

単一細胞データは、ＮＫ細胞がＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによる処理後に進行した患者を含むヒトメラノーマ転移に実際に存在することを実証している。同じ患者からの腫瘍および血液ＮＫ細胞集団は、顕著な転写の違いを実証した。血液試料中のほとんどのＮＫ細胞（８２．９％、ｂＮＫ０クラスター）は、従来の細胞傷害性シグネチャー（ＧＺＭＢおよびＰＲＦ１を含む）を発現した。ただし、メラノーマ転移から単離されたＮＫ細胞は、遺伝子発現プログラムがより多様であった。腫瘍では７つのＮＫ細胞クラスター（および１つのＩＬＣ３クラスター）が検出され、血液では１つの優勢なＮＫ細胞クラスターと３つの小さなＮＫ細胞クラスターが検出された。腫瘍内のほとんどのＮＫ細胞は細胞傷害性シグネチャーに対して陽性であったが、クラスター間で勾配があった（ｔＮＫ．３およびｔＮＫ．４クラスターで最も高く、ｔＮＫ．０、ｔＮＫ．１およびｔＮＫ．２クラスターでより低い）。例えば、このシグネチャーはサイトカイン機能のグローバルな評価であり、グランザイムＡまたはパーフォリンなどの単一のマーカーよりも有益である。ケモカイン遺伝子の発現に関連する腫瘍浸潤ＮＫ細胞と血液ＮＫ細胞との最も顕著な違い。最近の２つの出版物は、ＮＫ細胞がＸＣＲ１受容体に結合するケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２を分泌することにより、腫瘍への交差提示ＤＣ（ｃＤＣ１）の動員に重要な役割を果たすことを示した。^{２４、２６}また、ＮＫ細胞とｃＤＣ１は頻繁に相互作用することがわかり、これは、ＮＫ細胞がＴ細胞を介した腫瘍免疫に重要なＤＣの動員に重要な役割を果たしていることを示している。^２４興味深いことに、血液ＮＫ細胞に対してはるかに多くの腫瘍浸潤ＮＫ細胞がＸＣＬ１およびＸＣＬ２を発現することが分かった。さらに、ケモカイン遺伝子発現の観点から腫瘍ＮＫ細胞クラスター間の機能的特殊化を観察した：細胞傷害性シグネチャーがより低いＮＫ細胞（クラスターｔＮＫ．０、ｔＮＫ．１、ｔＮＫ．２、ｔＮＫ．６）は、より高い細胞傷害性シグネチャー（ｔＮＫ．３およびｔＮＫ．４）を持つクラスターよりも高いレベルのＸＣＬ１およびＸＣＬ２を発現した。より高い細胞傷害性シグネチャーを有する腫瘍浸潤ＮＫ細胞は、実際には、別個のケモカイン遺伝子のセット（ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ２、ＣＣＬ５）を発現していた。コードされたケモカインはＣＣＲ５ケモカイン受容体に結合し、Ｔ細胞ならびに他の免疫細胞集団を動員する。^３２したがって、これらのデータは、腫瘍浸潤ＮＫ細胞集団間の重要な機能的特殊化を示している。細胞傷害性シグネチャーが低いＮＫ細胞は、ｃＤＣ１を動員する高レベルのＸＣＲ１結合ケモカインを発現する傾向があるが、より高い細胞毒性シグネチャーを有するＮＫ細胞は、Ｔ細胞および他の免疫細胞を動員するＣＣＲ５結合ケモカインを、より高レベルに発現する。これらのデータおよび最近の出版物は、腫瘍免疫におけるＮＫ細胞の役割をより広い文脈で再考する必要があることを示している。ＮＫ細胞は腫瘍細胞を殺傷するだけでなく、保護腫瘍免疫に必要な主要な免疫細胞集団を動員することによって好ましい微小環境を作り出すことができる。

最近のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ研究では、ヒトＮＫ細胞のトランスクリプトームを分析し、血液中の２つのＮＫ細胞集団と、脾臓試料中の４つの集団を同定した。血液と脾臓とのＮＫ細胞集団を、別個の転写機能によって特性評価した。^５０理論に拘束されることを望まないが、この研究と我々のデータは、ＮＫの転写状態が組織の微小環境によって動的に調節されていることを検証している。理論に拘束されることを望まないが、腫瘍において同定された異なるＮＫ細胞集団は、異なる微小環境に局在する。腫瘍内のＮＫ細胞集団の明らかな機能的特殊化は、細胞傷害性活性の増強または交差提示ＤＣを動員するケモカインの分泌などのＮＫ細胞機能の別個の側面を増強する機会も提供する。

要約すると、細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性を引き起こす変異を伴う転移は、ＭＩＣＡ／ＢシェディングがｍＡｂで阻害されると、ＮＫ細胞の標的となる可能性があることを示している。転移性病変に対するＮＫ細胞の活性をさらに増強するために、いくつかの組み合わせ戦略を試験することができる：１．腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂタンパク質発現を増強するアプローチ（パノビノスタット、局所放射線療法など）^４８、２．腫瘍内のＮＫ細胞機能を増強し、ＴＧＦβを介したＮＫＧ２Ｄの下方調節を低減するサイトカイン（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体など）^５１、３．ＮＫ細胞上の阻害性受容体を標的とする抗体^５２。転移浸潤ヒトＮＫ細胞に関する単一細胞データは、別個のＮＫ細胞集団の遺伝子発現プログラムに関する豊富な情報も提供する。これらの単一細胞データは、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍に対するＮＫ細胞免疫を増強するための戦略の将来の開発に情報を与えることができる。

方法
細胞株
Ｂ１６Ｆ１０、ＬＬＣ１、Ａ３７５、ＨＣＴ－１１６、Ａ５４９およびＵ９３７細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＲＰＭＩ－８２２６およびＵ２６６細胞株は寛大に寄付され（Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＮＣＩ－Ｈ１３９－Ｓｑｃ細胞株は寛大に寄付された。ＣＹ０２９－Ｓ１、ＣＹ０４８－Ｓ、ＣＹ ２１Ａ－Ｓ１、ＣＹ．１１９－１Ａ Ｓ、およびＣＹ３６－Ｓ１短期メラノーマ細胞株は以前に記載されている。^{２０、４５}Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－１０１２Ｋ）またはＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＬＴ０７－３１８）を使用して、すべての細胞株がマイコプラズマに対して陰性であることを試験した。すべての細胞株は、供給業者または共同研究者から入手した後、少数の継代で使用した。Ａ３７５、ＨＣＴ－１１６、Ａ５４９、Ｕ９３７、ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６、およびＮＣＩ－Ｈ１３９－Ｓｑｃ細胞株はＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、Ｂ１６Ｆ１０、ＬＬＣ１、ＣＹ０２９－Ｓ１、ＣＹ０４８－Ｓ、ＣＹ ２１Ａ－Ｓ１、ＣＹ．１１９－１Ａ Ｓ、およびＣＹ３６－Ｓ１はＤＭＥＭ培地で培養した。ＲＰＭＩ－１６４０およびＤＭＥＭ培地には、１０％ＦＢＳ、１×グルタマックス、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。すべての組織培養試薬はＧｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。細胞を３７℃で５％ＣＯ_２で培養した。

対照およびＢ２Ｍ－ＫＯＡ３７５細胞は、親Ａ３７５細胞にｌｅｎｔｉＣａｓ９－ｂｌａｓｔベクターを形質導入した後、ブラストサイジンで選択することにより生成した。続いて、ＢｓｍＢ１部位の間に挿入したヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含むｐＬＫＯ３Ｇ－ｇＲＮＡ－ＰＧＫ－ＥＧＦＰベクターを細胞に形質導入した。対照細胞株には、ベクターのバックボーンを形質導入した。形質導入後、細胞を組換えヒトＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間培養して、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の上方調節を誘導し、ＡＰＣコンジュゲートＷ６／３２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１１４１０）で染色した。ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ陰性Ｂ２Ｍ－ＫＯ細胞とＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ陽性対照細胞をフローサイトメトリーで選別した。親Ａ３７５細胞にもｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターを形質導入して、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＺｓＧｒｅｅｎの発現を可能にした。ＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５細胞をフローサイトメトリーで選別し、それを使用してインビボでのＭＩＣＡ／Ｂ発現を調べた。

Ｂ１６Ｆ１０対照およびＢ２ｍ－ＫＯ細胞株の生成は以前に報告された。^５３ＭＩＣＡ発現は、前述のように、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＭＩＣＡ＊００９－ＩＲＥＳ－ルシフェラーゼ発現カセットを搭載するｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターを対照およびＢ２ｍ－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０細胞に形質導入することによって達成された。^２０細胞をＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した後、ＡＰＣコンジュゲートＨ－２Ｄ^ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１１５１３）およびＰＥコンジュゲートＭＩＣＡ ６Ｄ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２０９０６）で標識した。次に、ＭＩＣＡ^＋Ｈ－２Ｄ^ｂ－Ｂ２Ｍ－ＫＯおよびＭＩＣＡ^＋Ｈ－２Ｄ^ｂ＋対照Ｂ１６Ｆ１０を、フローサイトメトリーで選別した。

Ｃａｓ９タンパク質とＪａｋ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡとを用いて対照Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株をエレクトロポレーションすることによって、Ｊａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を生成した。エレクトロポレーションは、Ａｍａｘａ（商標）ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＳＣ－２０９６）を４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）において使用して実行した。次に、細胞を組換えマウスＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間培養し、ＭＩＣＡ^＋Ｈ－２Ｄ^ｂ－細胞をフローサイトメトリーで単離した。

ＬＬＣ１細胞には、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＭＩＣＡ＊００９ｃＤＮＡ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ発現カセットを搭載したｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターを最初に形質導入した。得られたＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞にＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションし、Ｂ２ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと結合させた。対照細胞はＣａｓ９タンパク質のみでエレクトロポレーションした。対照およびＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞をＩＦＮγで２４時間処理し、Ｈ－２Ｋ^ｂの発現に基づいてフローサイトメトリーで選別した。対照ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞はＨ－２Ｋ^ｂ＋であったが、Ｂ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１細胞はＨ－２Ｋ^ｂ－であった。

ＭＩＣＡ／Ｂシェディングアッセイ
５×１０^４個の腫瘍細胞を、９６ウェルプレート（接着細胞の場合は平底、浮遊細胞の場合はＵ底）において、様々な濃度の抗体、ＩＦＮγ、および／またはパノビノスタット（ＡｐｅｘＢｉｏ、カタログ番号Ａ８１７８）の存在下で、各図に示されているように２４時間培養した。２４時間の培養期間の後、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離し、Ｈｕｍａｎ ＭＩＣＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５９５６９）を使用してシェディングＭＩＣＡの分析のために上清を収集した。以前、このＥＬＩＳＡキットを使用して、７Ｃ６ ｍＡｂがシェディングＭＩＣＡの検出を妨害しないことを実証した。^２０

接着細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０４０－０６６）で剥離し、細胞表面上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の完全性を維持した。Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）を使用してＦｃ受容体を遮断し、細胞をＰＥまたはＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＭＩＣＡ／Ｂクローン６Ｄ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２０９０６または３２０９０８）で染色した。重要なことには、６Ｄ４抗体はＭＩＣＡ／Ｂのα１－α２ドメインに結合するため、前述のように、ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインを標的とする７Ｃ６抗体と競合しない。^２０細胞は、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）、カタログ番号５５９９２５）、Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶ、ＹｅｌｌｏｗまたはＮｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、それぞれ、カタログ番号４２３１０８、４２３１０４および４２３１０６）のいずれかの死細胞マーカーでも染色した。データはＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０またはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸを使用して取得し、分析はＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して実行した。

ヒトおよびマウスのＮＫ細胞の単離
健康な個人（白血球減少カラー）からのヒトＮＫ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５５）を使用した陰性選択によって単離し、その結果、ＮＫ細胞の純度は少なくとも９０％になった。白血球減少カラーは、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）によって匿名で提供された。ＮＫ細胞は、１０％ＦＢＳ、５％ヒトＡＢ血清、１，０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を使用して、Ｇ－Ｒｅｘ ６－ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０２４０Ｍ）においてインビトロで増殖させた。ＮＫ細胞が実験に使用されるまで、培地は週に１回補充した。

マウスＮＫ細胞は、７０μｍセルストレーナーを使用して脾臓組織をメッシュ化し、続いて赤血球溶解（ＡＣＫバッファー）し、ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ４９ｂ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８９０８）およびＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ３ε ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３１２）で染色することにより単離した。ＮＫ細胞をフローサイトメトリーで選別し、典型的な純度は約９９％であった。これらの細胞を、同種または同系のＮＫ細胞を含む実験のために、Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ＫＯマウスに直ちに注射した。

ＮＫ細胞を介した殺傷アッセイ
長期ＮＫ細胞媒介殺傷アッセイでは、ＧＦＰ^＋対照およびＢ２Ｍ－ＫＯＡ３７５細胞を、組織培養培地中のＭＩＣＡ／Ｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間前処理した。続いて、腫瘍細胞をＶｅｒｓｅｎｅで剥離し、ＰＢＳで洗浄し、黒壁９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、カタログ番号３６０３）にウェル当たり５×１０^３個の細胞密度で播種した。図に示すように、ヒトＮＫ細胞を１～２時間後に異なるエフェクター対標的比で添加し、ＩＬ－２（３００Ｕ／ｍｌ）を添加して、ＮＫ細胞の生存をサポートした。以前に報告されたように、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の数を経時的に追跡した。^４０

短期間のＮＫ細胞殺傷アッセイでは、前述のように、Ａ３７５メラノーマ細胞を組織培養培地においてＭＩＣＡ／Ｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間前処理し、４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて標的細胞として使用した。^２０白血球アフェレーシス減少カラーから陰性選択によりＮＫ細胞を単離し、アッセイにおいて使用する前に、９６ウェルＵ底プレートにおいて１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２とともに２４時間培養した。いくつかの実験では、アイソタイプ対照ｍＡｂまたは抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３＋抗ＫＩＲ２ＤＬ４ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１２６０２および３４７００３）を追加することにより、^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＮＫ細胞上のＫＩＲ受容体を遮断した。

ヒトＡ３７５メラノーマ細胞のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ分析
親のＡ３７５細胞を５０ｎＭパノビノスタットまたは対応する量のＰＢＳで２４時間培養した。次に細胞をＶｅｒｓｅｎｅで剥離し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＫｉｔおよびＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＤＮａｓｅ Ｓｅｔでそれぞれ単離した（両方ともＱｉａｇｅｎのキット、それぞれ、カタログ番号７４１３４および７９２５４）。ｃＤＮＡの生成、配列決定および分析は、以前に報告されたように行った。^２０

マウス
野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、Ｉｇｈｍ^－／－Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、ＣＢ６Ｆ１／Ｊ、およびＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した（それぞれ、カタログ番号０００６６４、００２２８８、１００００７、および００５５５７）。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ノックアウトマウスはＴａｃｏｎｉｃから購入した（カタログ番号４１１１）。マウスは雄（雌のＮＳＧマウスを除く）で、６～８週齢であった。以前に報告されたように、すべてのマウスはＤａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの飼育場に収容された。^２０動物使用のための組織委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｕｓｅ）は、この研究で使用された手順を承認した（動物プロトコル番号０８－０４９）。

免疫応答性マウスの転移モデル
Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ）を尾静脈からＣ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴまたはＩｇｈｍ^－／－）に静脈内接種した（図の凡例で説明されているように、実験に応じて１００μｌのＰＢＳ中１～７×１０^５個の細胞）。マウスがアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００８５）または７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（注射あたり２００μｇ、７、８日目、その後は週に１回）の腹腔内注射によって転移を確立したとき（腫瘍接種後７日目）、Ｉｇｈｍ^－／－マウスにおいて処理を開始した。別のプロトコルでは、ＷＴマウスに、１、２日目に抗体を注射し、その後週に１回注射した。ＣＤ８ Ｔ細胞（１００μｇ抗ＣＤ８β、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログＢＥ０２２３）またはＮＫ細胞（１：１０希釈抗アシアロＧＭ１、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ９８６－１００１）の枯渇を誘導した抗体を、腫瘍細胞の接種に対して、－１、０日目に注射し、その後は週に１回注射した。対照ＩｇＧ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログＢＥ００８３）としてマウスＩｇＧ１を使用した。肺転移は、組織のホルマリン固定後、実体顕微鏡下で１４日目に定量した。あるいは、マウスの生存を記録した。

ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移モデルの場合、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１．０～１．５×１０^６個の腫瘍細胞（図の凡例に示されているように）を尾静脈から静脈内接種した。７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ）を、腫瘍細胞の接種に対して、２、３日目に投与し、その後は週に１回投与した。ＮＫ細胞の養子移入を含む実験では、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６（同系）またはＣＢ６Ｆ１／Ｊ（同種）マウスから単離された２×１０^５個のＮＫ細胞をＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ノックアウトマウスに静脈内注射した。これらのＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ３ε^－ＣＤ４９ｂ^＋細胞として単離した。ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（７×１０^５個の細胞）を、ＮＫ細胞移入の１日後に静脈内注射した。７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ／注射）を２、３日目に腹腔内投与し、その後は週に１回投与した。１４日目に、マウス（ＷＴまたはＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ノックアウト）をＣＯ_２吸入により安楽死させ、前述のように、肺転移のカウントを可能にするために墨汁（３０％）を気管に注入した。^２８肺組織はＦｅｋｅｔｅの固定液を使用して処理し、実体顕微鏡を使用して表面転移を数えた。

Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ転移モデルにおけるマウスＮＫ細胞の特性評価
ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ遺伝子型を持つ７×１０^５個のＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。腫瘍細胞接種後１日目および３日目に、マウスを７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ／注射）で処理した。１２日目に、マウスに５０μｌのＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０９８１４）を静脈内注射して、血管内免疫細胞を標識し、安楽死させた。肺組織を細かく切断し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型、０．１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ、２０Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅを添加したＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ機器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して処理した。次に、細胞懸濁液を、マウスＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１３２０）、ならびにＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０９８３０）、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ３ε（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１００３１２）、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＴＣＲβ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０９２１２）、ＢＶ７８５コンジュゲート抗マウスＮＫ１．１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７４０８５３）、ＰＥ－ＣＦ５９４コンジュゲート抗マウスＣＤ４９ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６２４５３）、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＥＯＭＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５３－４８７５－８２）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＧＺＭＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２－５８３１－８２）、ＢＶ４２１コンジュゲート抗マウスＮＫＧ２Ｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６２８００）、ＰＥＲＣＰ－ＣＹ５．５コンジュゲート抗マウスＣＤ１６／３２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０１３２４）、ＢＶ５１０コンジュゲート抗マウスＬｙ４９Ｃ／Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７４４０２８）およびＺｏｍｂｉｅ ＵＶなどの複数の抗体とともにインキュベートした。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０を使用してデータを処理した。

ヒト化マウスモデル
ＮＳＧマウスは、上記のようにインビトロで増殖させたヒトＮＫ細胞（１～２×１０^６個の細胞）で静脈内に再構成した。以前に報告されたように、ＩＬ－２を腹腔内注射して（７．５×１０^４個の単位）、ＮＫ細胞のインビボ生存をサポートした。^２０Ａ３７５メラノーマ細胞（５×１０^５個の細胞、対照またはＢ２Ｍ－ＫＯ）を１日後（０日目）に注射した。腫瘍細胞接種の１日後、マウスには、別の用量のＩＬ－２に加えて、アイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログＢＥ００９６）または７Ｃ６－ｈＩｇＧ１ ｍＡｂ（２００μｇ）、ならびにＰＢＳまたは１０ｍｇ／ｋｇパノビノスタット（ＡｐｅｘＢｉｏ、カタログ番号Ａ８１７８）を投与した。２日目に、マウスを同じドナーからのヒトＮＫ細胞で再び再構成し、ＩＬ－２、抗体、ならびにＰＢＳまたはパノビノスタットの注射も投与した。転移は、ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移モデル（気管への墨汁の注入、Ｆｅｋｅｔｅの固定液による肺組織の処理）について、上記したように、最後の処理の２週間後に定量した。

ＮＳＧマウスに１×１０^６個のＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞を接種して、肺転移におけるＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルに対するＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂおよびパノビノスタット処理の効果を研究した。これらのマウスにはヒトＮＫ細胞を投与しなかった。転移が確立されたら（２週間後）、２日後に７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ）、ならびに溶媒対照としてパノビノスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳでマウスを処理した。最後の処理の翌日、マウスをＣＯ_２吸入により安楽死させ、肺組織を機械的に分離して、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の完全性を維持した。腫瘍細胞は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性であるが、マウスＣＤ４５抗原に対して陰性である、大きな生細胞として同定された。ＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質を６Ｄ４－ＰＥｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３２０９０６）で標識し、フローサイトメトリーで定量した。

腫瘍のないＮＳＧマウスにおけるヒトＮＫ細胞の特性評価
腫瘍のないＮＳＧマウスに２×１０^６個のヒトＮＫ細胞を静脈内接種し、上記のようにインビトロで増殖させた。同時に、マウスには、ＩＬ－２（７．５×１０^４個）、ならびに溶媒対照としてパノビノスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの腹腔内注射を投与した。１日後、眼の出血により採血し、フローサイトメトリーによりヒトＮＫ細胞を分析した。

メラノーマ転移に浸潤するヒトＮＫ細胞の特性評価
メラノーマ組織試料は、Ｂｒｉｇｈａｍ＆Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌで無反応病変の治療のために手術を必要とした患者から得た。手術時に血液試料も採取した。新たに切除された腫瘍組織は、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ１３０－０９５－９２９）を使用して分離した。血液試料中の赤血球は、ＡＣＫバッファーを使用して溶解した。ＮＫ細胞は、ＢＤ Ａｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、メラノーマ病変および対応する血液試料から、ＣＤ４５^＋、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３ε^－，ＣＤ４^－、ＣＤ８ａ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１５^－およびＣＤ１６３^－であるリンパ球サイズの単一生細胞として単離した。これらの選別したＮＫ細胞を、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析に使用した。

フォローアップ実験では、腫瘍および血液ＮＫ細胞も抗ＦＧＦＰＢ２、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＫ、ＣＤ６２Ｌ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ１６ａ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。すべての蛍光色素標識抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。細胞内染色では、ＮＫ細胞を固定し、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ（商標）転写因子バッファーセット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２４４０１）を製造元の推奨に従って透過処理した。Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して試料を分析した。

単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ
ＮＫ細胞（試料当たり約１３，０００個のＮＫ細胞）を選別した直後に、細胞懸濁液をＰＢＳ中の０．０５％ＲＮａｓｅフリーＢＳＡで洗浄した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの構築には、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３’Ｖ２単一細胞アッセイ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用した。逆転写、ｃＤＮＡ増幅、ライブラリー調製はすべてメーカーの指示に従って実行した。ライブラリーは、ラピッドランモードでイルミナＨｉＳｅｑ ２５００を使用して配列決定され、細胞当たり２５，０００を超えるリードが得られた。

単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータの計算分析
逆多重化、アラインメント、フィルタリング、バーコードカウント、および固有の分子識別子（ＵＭＩ）カウントのステップには、１０ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒソフトウェアを使用した。分析は、Ｓｅｕｒａｔ ３．０パッケージを使用して実行した。^５４まず個々のデータセットを個別に処理してから、複数の試料からのデータを組み合わせた。データセットごとに、１，５００個の最も可変的な遺伝子を選択した。続いて、主成分分析（ＰＣＡ）を実行し、最初の１５個の主成分（ＰＣ）を使用して、Ｌｏｕｖａｉｎクラスタリングおよび一様多様体近似および射影（ＵＭＡＰ）埋め込みを実行した。^{５５、５６}各クラスターの最も重要なマーカー遺伝子をチェックして、Ｔ細胞（ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３ＥおよびＣＤ３Ｇ）、Ｂ細胞（ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＪＣＨＡＩＮ）、マクロファージ（ＬＹＺ）、メラノーマ細胞（ＭＬＡＮＡ）などの潜在的な汚染細胞集団を特定した。これらの細胞は、その後の分析の前に除去した。

次に、Ｓｅｕｒａｔの統合アルゴリズムを使用して、各患者の血液ＮＫ細胞とメラノーマ浸潤ＮＫ細胞のペア集団を比較し、さらに３つのメラノーマ浸潤ＮＫ細胞試料と３つの血液ＮＫ細胞試料を別々に統合した。各試料からの３，０００個の最も可変的な遺伝子と最初の１５個のＰＣを使用して、統合のために１，０００個のアンカー遺伝子を選択した。その後、統合データセットにＰＣＡ、クラスタリング（解像度＝０．３）、ＵＭＡＰ埋め込みを繰り返した。最後に、統合データセットについて差分試験を実行して、他のすべての細胞と比較して各クラスター内で有意に上方調節された遺伝子（調整済みＰ＜０．０５）、ならびに各主要クラスター内の血液ＮＫ細胞とメラノーマ浸潤ＮＫ細胞との間で差次的に発現する遺伝子を同定した。

特定の細胞機能または経路を表す遺伝子セットについては、細胞集団全体での遺伝子セットの活性の変動を評価するために、各細胞のＡＵＣｅｌｌスコアも計算した。^５７データの分析に基づいて、細胞傷害性とケモカイン活性の遺伝子セットを厳選した。ＮＫ細胞、ＩＬＣ１、ＩＣＬ２、およびＩＬＣ３の同一性については、他の３つの集団と比較して、これらの自然細胞型のうちの１つにおいて有意に上方調節された遺伝子を使用した以前の研究により定義された遺伝子シグネチャーを参照した（調整済みＰ＜１ｅ－３）；特にＩＬＣアイデンティティの場合、同じ遺伝子はＮＫ細胞において有意に上方調節されなかった（調整済みＰ＞１ｅ－２）。^３１

統計分析
すべての統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して実行し、関連する統計試験は各図の凡例に示されている。

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２４．Ｂａｒｒｙ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｘｉｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１（２０１８）．
２５．Ｃｕｒｓｏｎｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ，３７５２５３（２０１８）．
２６．Ｂｏｔｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃＤＣ１ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ １７２，１０２２－１０３７．ｅ１０１４（２０１８）．
２７．Ｓｏｕｚａ－Ｆｏｎｓｅｃａ－Ｇｕｉｍａｒａｅｓ，Ｆ．，Ｃｕｒｓｏｎｓ，Ｊ．＆Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，Ｎ．Ｄ．Ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｔａｒｇｅｔ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１９）．
２８．Ｆｅｒｒａｒｉ ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＢＲＡＦ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ＢＲＡＦＶ６００Ｅ－ｍｕｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４，７２９８－７３０８（２０１４）．
２９．Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ５６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｒｋｓ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｕｐ ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ Ｓｈａｒｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｒｏｕｐ ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｐａｔｈｗａｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４９，４６４－４７６．ｅ４６４（２０１８）．
３０．Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｇ．，Ｆａｎ，Ｘ．，Ｄｉｋｉｙ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ａｎｄ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０，９８１－９８５（２０１５）．
３１．Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Å．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ１２７＋ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７，４５１（２０１６）．
３２．Ｃｈｏｗ，Ｍ．Ｔ．＆Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２，１１２５－１１３１（２０１４）．
３３．Ａｋａｔｓｕｋａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ，ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ１．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２，７８３－７９０（２０１０）．
３４．ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｉ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ Ｔｉｍ－３ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２，４１０－４２２（２０１４）．
３５．Ｆｒｅｇｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ７６９２８（２０１３）．
３６．Ｌｅｅ，Ｊ．－Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｋ．－Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｄ．－Ｗ．＆Ｈｅｏ，Ｄ．Ｓ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ＴＧＦ－β１ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｗｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ＮＫ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７２，７３３５－７３４０（２００４）．
３７．Ｍａｒｒｕｆｏ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＬＬＴ１（ＣＬＥＣ２Ｄ，ＯＣＩＬ）－ＮＫＲＰ１Ａ（ＣＤ１６１）ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，１０５０（２０１８）．
３８．Ｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ＭＩＣＡ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２，４４３－４５１（２００１）．
３９．Ｂａｈｒａｍ，Ｓ．，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ，Ｍ．，Ｇｅｒａｇｈｔｙ，Ｄ．Ｅ．＆Ｓｐｉｅｓ，Ｔ．Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９１，６２５９－６２６３（１９９４）．
４０．Ｃｈａｎ，Ｌ．Ｌ．－Ｙ．，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．＆Ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ，Ｌ．Ｆ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｖｅｒ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｉｍｅ ｐｅｒｉｏｄｓ ｂｙ ｉｍａｇｅ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１９）．
４１．Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，２０９７－２１００（２００２）．
４２．Ｓｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｃｏｍｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｕｅ ｔｏ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，１１１３６－１１１４５（２００５）．
４３．Ｌａｕｂａｃｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｓａｎ－Ｍｉｇｕｅｌ，Ｊ．Ｆ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｃｌｉｎｃａｎｒｅｓ．０５３０．２０１５（２０１５）．
４４．Ｗｅｓｔ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎｔａｃｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）．
４５．Ｉｚａｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｅｌｌ＆ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，６５６－６６８（２０１６）．
４６．Ｇｒｏｈ，Ｖ．，Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ａ．，Ｂａｕｅｒ，Ｓ．＆Ｓｐｉｅｓ，Ｔ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ γδ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９，１７３７－１７４０（１９９８）．
４７．Ｃｈｉｏｓｓｏｎｅ，Ｌ．，Ｄｕｍａｓ，Ｐ．－Ｙ．，Ｖｉｅｎｎｅ，Ｍ．＆Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１（２０１８）．
４８．Ｄｈａｒ，Ｐ．＆Ｗｕ，Ｊ．Ｄ．ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５１，５５－６１（２０１８）．
４９．Ｆｏｒｍｅｎｔｉ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｏ ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４，１８４５（２０１８）．
５０．Ｃｒｉｎｉｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｏｒｇａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４９，９７１－９８６．ｅ９７５（２０１８）．
５１．Ｒｏｍｅｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ ｐｈａｓｅ １ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ－１５ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ＡＬＴ－８０３ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｒｅｌａｐｓｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ，ｂｌｏｏｄ－２０１７－２０１２－８２３７５７（２０１８）．
５２．Ａｎｄｒｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ａ ｍＡｂ ｉｓ ａ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｕｎｌｅａｓｈｉｎｇ ｂｏｔｈ Ｔ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １７５，１７３１－１７４３．ｅ１７１３（２０１８）．
５３．Ｐａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｍａｊｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，７７０－７７５（２０１８）．
５４．Ｓｔｕａｒｔ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｄａｔａ．ＢｉｏＲｘｉｖ，４６０１４７（２０１８）．
５５．Ｗａｌｔｍａｎ，Ｌ．＆Ｖａｎ Ｅｃｋ，Ｎ．Ｊ．Ａ ｓｍａｒｔ ｌｏｃａｌ ｍｏｖｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｍｏｄｕｌａｒｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂ ８６，４７１（２０１３）．
５６．ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｌ．，Ｈｅａｌｙ，Ｊ．＆Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｊ．Ｕｍａｐ：Ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．ａｒＸｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ ａｒＸｉｖ：１８０２．０３４２６（２０１８）．
５７．Ａｉｂａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＳＣＥＮＩＣ：ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １４，１０８３（２０１７）．

実施例３－ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢシェディングの阻害は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍に対するＮＫ細胞を介した免疫を誘発する
要約
細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性は、Ｂ２ＭまたはＪＡＫ１遺伝子の変異など、腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現またはＩＦＮγシグナル伝達の喪失によって媒介され得る。理論に拘束されることを望まないが、ＮＫ細胞は耐性腫瘍を標的にすることができるが、ＮＫ細胞ベースの戦略はまだ開発されていない。理論に拘束されることを望まないが、活性化シグナルが提供されれば、腫瘍はＮＫ細胞の標的となる可能性がある。ヒト腫瘍は、活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体のＭＩＣＡおよびＭＩＣＢリガンドを発現するが、ＭＩＣＡ／Ｂのタンパク質分解によるシェディングは、多くのヒトがんにおける免疫回避メカニズムである。Ｂ２ＭおよびＪＡＫ１欠損転移は、ＭＩＣＡ／Ｂのシェディングを遮断するｍＡｂで処理した後のＮＫ細胞の標的となることを示している。さらに、ＦＤＡ承認のＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ抗体とが相乗的に作用して、腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルを増強することを実証している。ＨＤＡＣ阻害剤はＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子発現を増強し、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体は細胞表面上の合成タンパク質を安定化させる。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ抗体との組み合わせにより、ヒトＮＫ細胞で再構成されたＮＳＧマウスのヒトメラノーマ細胞株によって形成される肺転移の数が減少する。したがって、ＭＩＣＡ／Ｂに特異的なｍＡｂによって誘導されるＮＫ細胞を介した免疫は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性を持たせる変異を有する腫瘍を標的とする機会を提供する。

序章
Ｔ細胞上のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）阻害性受容体を標的とする抗体によるチェックポイント遮断は、進行がんの患者においても永続的な抗腫瘍免疫を誘導することができる。しかしながら、多くの患者は、一次または二次耐性のためにこれらの療法の恩恵を受けることができない（１）。細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）タンパク質に結合した腫瘍由来ペプチドを認識するその能力に基づいて、チェックポイント遮断の有効性において役割を果たす（２）。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によるこのようなＭＨＣ－Ｉ－ペプチド複合体の認識は、パーフォリンおよびグランザイムを含む細胞傷害性顆粒の放出を介して、Ｔ細胞を介した殺傷を引き起こす。また、Ｔ細胞によるインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）の分泌は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞と樹状細胞の両方でＭＨＣ－Ｉタンパク質の発現を増強する（３）。したがって、チェックポイント遮断に対する耐性は、ＭＨＣ－Ｉ（Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および他の遺伝子）またはＩＦＮγ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２）経路における主要遺伝子の変異またはエピジェネティックなサイレンシングのいずれかによる、腫瘍細胞によるＭＨＣ－Ｉ発現の喪失によって、媒介される（４～６）。新生抗原の数が少ないかまたは失われていると、細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍免疫も低下する（７～１０）。現在、チェックポイント遮断に耐性のある固形腫瘍を有する患者に対する代替免疫療法はない。理論に拘束されることを望まないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、ＭＨＣ－Ｉタンパク質を欠く腫瘍細胞を標的にすることができるが、これまでのところ、ＣＡＲ Ｔ細胞は固形腫瘍に対して限られた有効性を示している（１１）。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞が必要とするものとは異なる分子メカニズムによって腫瘍細胞を認識する。腫瘍細胞のＮＫ細胞認識は、ＤＮＡ損傷および細胞ストレスなどの悪性形質転換に関連する細胞プロセスによって腫瘍細胞上で上方調節されたリガンドに結合する生殖細胞系列にコードされた活性化受容体によって媒介される（１２）。対照的に、Ｔ細胞は、共有腫瘍抗原または体細胞変異によって作製された新生抗原に由来するＭＨＣ提示ペプチドを認識する（２）。したがって、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法アプローチに応答することができる。実際、腫瘍細胞による発現の喪失は、ＭＨＣ－Ｉタンパク質が阻害性ＮＫ細胞受容体のリガンドとして機能するため、ＮＫ細胞に対する感受性を高める（１２）。しかしながら、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫の誘導には、ＮＫ細胞を介した腫瘍細胞の攻撃を妨げる免疫回避メカニズムの効果的な標的化も必要になる場合がある。例えば、多くのヒトがんは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の亜集団上の活性化ＮＫ群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドとして機能するＭＨＣ－Ｉ鎖関連ポリペプチドＡ（ＭＩＣＡ）およびＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）タンパク質を発現する（１３、１４）。腫瘍は、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質のタンパク質分解によるシェディングにより、ＮＫＧ２Ｄ受容体を介した腫瘍免疫を回避する（１５～２２）。シェディングに必須のドメインであるＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を開発した。これらのｍＡｂは、ＭＩＣＡ／Ｂのシェディングを阻害し、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を誘導した。腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の密度の増加は、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体を介した活性化を増強し、腫瘍コンジュゲート抗体のＦｃセグメントもＣＤ１６Ｆｃ受容体を介してＮＫ細胞を活性化させた。このようなＭＩＣＡ／Ｂ抗体による治療により、腫瘍浸潤ＮＫ細胞が、細胞傷害性の高い状態へと著しく変化した（２３）。

ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子は、ヒト６番染色体上のＭＨＣ遺伝子座の一部であり、コードされたタンパク質は、ＭＨＣタンパク質と有意な構造的類似性を共有している。Ｂ２Ｍ欠損症は、Ｔ細胞を介した免疫およびＴ細胞チェックポイント遮断に対する応答性を無効にするが、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質はβ２ミクログロブリンまたはペプチドと会合しない（５、２４～２６）。理論に拘束されることを望まないが、ＭＩＣＡ／Ｂシェディングの阻害は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある転移性病変に対するＮＫ細胞を介した免疫を誘導する。実際、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメインに特異的なｍＡｂによる処理により、ＭＨＣ－ＩまたはＩＦＮγシグナル伝達経路に不活性化変異（それぞれＢ２ｍおよびＪａｋ１変異）を伴う腫瘍に対するＮＫ細胞を介した免疫が可能になった。また、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子は、腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂ発現を阻害するヒストンデアセチラーゼによってエピジェネティックに調節されている（２７～３０）。ＨＤＡＣ阻害剤はインビボでＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂと相乗的に作用し、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写の増強（ＨＤＡＣ阻害剤）とＭＩＣＡ／Ｂシェディングの阻害（ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ）を通じて腫瘍細胞の表面上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを増強することを発見した。この併用療法は、ヒト化マウスモデルにおいてメラノーマ転移に対するＮＫ細胞媒介免疫を付与した。したがって、活性化受容体を誘発するＮＫ細胞ベースの免疫療法は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のあるがんを治療するために使用することができる。

材料および方法
細胞株
Ｂ１６Ｆ１０、ＬＬＣ１、Ａ３７５、ＨＣＴ－１１６、Ａ５４９およびＵ９３７細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＲＰＭＩ－８２２６およびＵ２６６細胞株が寄贈され（Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＮＣＩ－Ｈ１３９－Ｓｑｃ細胞株が惜しみなく寄贈された。ＣＹ０２９－Ｓ１、ＣＹ０４８－Ｓ、ＣＹ２１Ａ－Ｓ１、ＣＹ．１１９－１Ａ Ｓ、およびＣＹ３６－Ｓ１の短期メラノーマ細胞株は以前に報告されている（２３、３１）。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－１０１２Ｋ）またはＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＬＴ０７－３１８）を使用した実験で使用する前に、すべての細胞株がマイコプラズマに対して陰性であることを試験した。すべての細胞株は、供給業者または共同研究者から入手した後、少数の継代（約１０継代未満）で使用した。Ａ３７５、ＨＣＴ－１１６、Ａ５４９、Ｕ９３７、ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６、およびＮＣＩ－Ｈ１３９－Ｓｑｃ細胞株はＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、Ｂ１６Ｆ１０、ＬＬＣ１、ＣＹ０２９－Ｓ１、ＣＹ０４８－Ｓ、ＣＹ ２１Ａ－Ｓ１、ＣＹ．１１９－１Ａ Ｓ、およびＣＹ３６－Ｓ１はＤＭＥＭ培地で培養した。ＲＰＭＩ－１６４０およびＤＭＥＭ培地には、１０％ＦＢＳ、１×グルタマックス、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。すべての組織培養試薬はＧｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。細胞を３７℃で５％ＣＯ_２で培養した。

対照およびＢ２Ｍ－ＫＯＡ３７５細胞は、親Ａ３７５細胞にｌｅｎｔｉＣａｓ９－ブラストベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６２）続いて、ブラストサイジン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ｒ２１００１）で選択することにより生成した。続いて、ＢｓｍＢ１部位の間に挿入したヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、以前に報告された（３２）ｐＬＫＯ３Ｇ－ｇＲＮＡ－ＰＧＫ－ＥＧＦＰベクターを細胞に形質導入した。対照細胞株には、ベクターのバックボーンを形質導入した。形質導入後、細胞を組換えヒトＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で２４時間培養し、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の上方調節を誘導した。細胞をＡＰＣ結合Ｗ６／３２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１１４１０）で染色し、ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ陰性Ｂ２Ｍ－ＫＯ細胞とＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ陽性対照細胞をフローサイトメトリーで選別した。親Ａ３７５細胞にもｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターを形質導入して、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＺｓＧｒｅｅｎの発現を可能にした。このベクターは、親ベクターからＩＲＥＳおよびＺｓＧｒｅｅｎ配列を除去したＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の間にＺｓＧｒｅｅｎ配列を挿入することによって生成した。ＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５細胞をフローサイトメトリーで選別し、それを使用してインビボでのＭＩＣＡ／Ｂ発現を調べた。

Ｂ１６Ｆ１０対照およびＢ２ｍ－ＫＯ細胞株は以前に報告されている（３２）。ＭＩＣＡ発現は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＭＩＣＡ＊００９－ＩＲＥＳ－ルシフェラーゼ発現カセットを搭載したｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターを対照およびＢ２ｍ－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０細胞に形質導入することによって達成された。このプラスミドは、以前に報告されている（２３）。Ｂ１６Ｆ１０対照およびＢ２ｍ－ＫＯ細胞株をＰＥコンジュゲート抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３２０９０６）で標識し、ＭＩＣＡ^＋細胞をフローサイトメトリーで選別した。Ｃａｓ９タンパク質とＪａｋ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡとを用いて対照Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株をエレクトロポレーションすることによって、Ｊａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を生成した（図３４）。エレクトロポレーションは、Ａｍａｘａ（商標）ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＳＣ－２０９６）を４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）において使用して実行した。細胞をＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２４時間処理した。続いて、細胞を、ＰＥ結合ＭＩＣＡ ６Ｄ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２０９０６）およびＡＰＣコンジュゲート抗ＭＨＣ－Ｉ抗体のカクテル（抗Ｈ－２Ｋ^ｂおよび抗Ｈ－２Ｄ^ｂ、それぞれ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号１１６５１８および１１１５１３）で標識した。次に、ＭＩＣＡ^＋ＭＨＣ－Ｉ^－Ｂ２Ｍ－ＫＯおよびＭＩＣＡ^＋ＭＨＣ－Ｉ^＋対照Ｂ１６Ｆ１０をフローサイトメトリーで分類した。

ＬＬＣ１細胞には、ＥＦ１αプロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１４００７）の制御下でＭＩＣＡ＊００９ｃＤＮＡ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ発現カセットを搭載したｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターを最初に形質導入した。得られたＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞にＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションし、Ｂ２ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと結合させた。対照細胞はＣａｓ９タンパク質のみでエレクトロポレーションした。対照およびＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞をＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２４時間処理し、Ｈ－２Ｋ^ｂ（クローンＡＦ６－８８．５ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の発現に基づいてフローサイトメトリーで選別した。対照ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞はＨ－２Ｋ^ｂ陽性であったが、Ｂ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１細胞はＨ－２Ｋ^ｂ陰性であった。

ウエスタンブロッティング
Ｂ１６Ｆ１０、ＬＬＣ１、およびＡ３７５細胞株を、５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、または用いずに１６時間処理した。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解した。溶解産物を１４，０００ｒｐｍ、４^ｏＣで１０分間遠心分離した。総タンパク質をビシンコニン酸アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、ゲルローディングの前に正規化した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続いて、試料を、ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに転写し、０．１％Ｔｗｅｅｎを添加したトリス緩衝生理食塩水中の５％ミルクで遮断し、次のように適切な一次抗体とともに一晩インキュベートした：抗マウスＢ２Ｍ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒトＢ２Ｍ、ＪＡＫ１、ＧＡＰＤＨ、およびチューブリン（すべてＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体（Ｃｅｌｌ ＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とのインキュベーション後、Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した化学発光（Ｗｅｓｔｅｒｎ ＬｉｇｈｔｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）によってタンパク質を可視化した。

ＭＩＣＡ／Ｂシェディングアッセイ
５×１０^４個の腫瘍細胞を、９６ウェルプレート（接着細胞の場合は平底、浮遊細胞の場合はＵ底）において、様々な濃度の抗体、ＩＦＮγ、および／またはパノビノスタット（ＡｐｅｘＢｉｏ、カタログ番号Ａ８１７８）の存在下で、各図に示されているように２４時間培養した。２４時間の培養期間の後、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離し、Ｈｕｍａｎ ＭＩＣＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５９５６９）を使用してシェディングＭＩＣＡの分析のために上清を収集した。重要なことに、以前、７Ｃ６ ｍＡｂがこのＥＬＩＳＡを使用してシェディングＭＩＣＡの検出を妨害しないことを実証した（２３）。

接着細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０４０－０６６）で剥離し、細胞表面上のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の完全性を維持した。Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）を使用してＦｃ受容体を遮断し、細胞をＰＥまたはＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＭＩＣＡ／Ｂクローン６Ｄ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２０９０６または３２０９０８）で染色した。６Ｄ４抗体はＭＩＣＡ／Ｂのα１－α２ドメインに結合するため、以前に示したように（２３）、ＭＩＣＡ／Ｂのα３ドメインを標的とする７Ｃ６抗体と競合しない。細胞を、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）、カタログ番号５５９９２５）、Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶ、Ｙｅｌｌｏｗ、またはＮｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、それぞれ、カタログ番号４２３１０８、４２３１０４、および４２３１０６）のいずれかの死細胞マーカーでも染色した。データはＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０またはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸを使用して取得し、分析はＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して実行した。

ヒトおよびマウスのＮＫ細胞の単離
健康な個人（白血球減少カラー）からのヒトＮＫ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５５）を使用した陰性選択によって単離し、その結果、ＮＫ細胞の純度は少なくとも９０％になった。白血球減少カラーは、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）によって匿名で提供された。ＮＫ細胞は、１０％ＦＢＳ、５％ヒトＡＢ血清、１，０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（サイトカインはいずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を使用して、Ｇ－Ｒｅｘ ６－ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０２４０Ｍ）においてインビトロで増殖させた。ＮＫ細胞が実験に使用されるまで、培地は週に１回補充した。

マウスＮＫ細胞は、７０μｍセルストレーナーを使用して脾臓組織をメッシュ化し、続いて赤血球溶解（ＡＣＫバッファー）し、ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ４９ｂ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８９０８）およびＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ３ε ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３１２）で染色することにより単離した。ＮＫ細胞をフローサイトメトリーで選別し、典型的な純度は約９９％であった。これらの細胞を、同種または同系のＮＫ細胞を含む実験のために、Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ＫＯマウスに直ちに注射した。

ＮＫ細胞を介した殺傷アッセイ
長期ＮＫ細胞媒介殺傷アッセイでは、ＧＦＰ^＋対照およびＢ２Ｍ－ＫＯＡ３７５細胞を、組織培養培地中のＭＩＣＡ／Ｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間前処理した。続いて、腫瘍細胞をＶｅｒｓｅｎｅで剥離し、ＰＢＳで洗浄し、黒壁９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、カタログ番号３６０３）にウェル当たり５×１０^３個の細胞密度で播種した。図に示すように、ヒトＮＫ細胞を１～２時間後に異なるエフェクター対標的比で添加し、ＩＬ－２（３００Ｕ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して、ＮＫ細胞の生存をサポートした。以前に報告されたように（３３）、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の数を経時的に追跡した。

短期間のＮＫ細胞殺傷アッセイでは、前述のように（２３）、Ａ３７５メラノーマ細胞を組織培養培地中のＭＩＣＡ／Ｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間前処理し、４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイで標的細胞として使用した。ＮＫ細胞を、白血球アフェレーシス減少カラーからの陰性選択によって分離し、９６ウェルＵ底プレートで１，０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに２４時間培養してから、アッセイで使用した。アイソタイプ対照ｍＡｂまたは抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３＋抗ＫＩＲ２ＤＬ４ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１２６０２および３４７００３）を追加することにより、^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＮＫ細胞上のＫＩＲ受容体を遮断した。

ＣＤ８Ｔ細胞傷害性アッセイ
Ｊａｋ１－ＫＯおよびＢ２ｍ－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株のＣＤ８Ｔ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性を確認するために、Ｃｅｌｉｇｏベースの画像サイトメトリーアッセイを実行した（３３）。簡単に説明すると、腫瘍細胞に１０ｎＭ Ｏｖａペプチドを一晩パルスし、ＰＢＳで洗浄し、９６ウェルプレートに添加した（ウェル当たり５，０００個の腫瘍細胞）。腫瘍細胞は、エフェクター対標的比が異なるナイーブＯＴ－Ｉ ＣＤ８ Ｔ細胞と共培養した（１：０Ｔ細胞なし、１：１、２：１および５：１、群ごとに８～１０回の複製）。４８時間後、上清を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄して、死んだ腫瘍細胞とＣＤ８Ｔ細胞を除去した。次に、生きている腫瘍細胞の定量のために、Ｃｅｌｉｇｏ機器を使用してプレートを分析した。

ヒトＡ３７５メラノーマ細胞のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ分析
親のＡ３７５細胞を、パノビノスタット（５０ｎＭ）または対応する量のＰＢＳで２４時間処理した。次に細胞をＶｅｒｓｅｎｅで剥離し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＫｉｔおよびＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＤＮａｓｅ Ｓｅｔでそれぞれ単離した（両方ともＱｉａｇｅｎのキット、それぞれ、カタログ番号７４１３４および７９２５４）。ｃＤＮＡの生成、配列決定、および分析は、以前に報告されたように行った（２３）。

リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
Ａ３７５細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）で２４時間処理した。続いて、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ペレット化し、ＲＮｅａｓｙミニキット（＃７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用してトータルＲＮＡを抽出するために使用した。抽出されたＲＮＡの１マイクログラムを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１１７５６０５０）を使用してｃＤＮＡを合成した。希釈したｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３６９０１６）、ＴａｑＭａｎプローブ（ＭＩＣＡ－Ｈｓ００７４１２８６＿ｍ１、ＭＩＣＢ－Ｈｓ００７９２９５２＿ｍ１、ＧＡＰＤＨ－Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１、ＵＬＢＰ２－Ｈｓ００６０７６０９＿ｍＨ、およびＲＡＥＴ１Ｌ－Ｈｓ０４１９４６７１＿ｓ１）、ならびにＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用するｑＰＣＲのために使用した。群間の遺伝子発現の変化を調べるために、ΔΔＣＴ値を、各群の試料ごとに３つの技術的複製の平均ＣＴ値から求めた。遺伝子発現の倍数変化は、各試料のＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）と比較して表した。

マウス
野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、Ｉｇｈｍ^－／－Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、ＣＢ６Ｆ１／Ｊ、およびＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した（それぞれ、カタログ番号０００６６４、００２２８８、１００００７、および００５５５７）。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ノックアウトマウスはＴａｃｏｎｉｃから購入した（カタログ番号４１１１）。マウスは雄（雌のＮＳＧマウスを除く）で、６～８週齢であった。マウスは、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＩｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉの飼育場に収容された。動物使用のための組織委員会は、この研究で使用された手順を承認した。

免疫応答性マウスの転移モデル
Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ）を尾静脈からＣ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴまたはＩｇｈｍ^－／－）に静脈内接種した（図の凡例で説明されているように、実験に応じて１００μｌのＰＢＳ中１～７×１０^５個の細胞）。マウスがアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００８５）または７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（注射あたり２００μｇ、７、８日目、その後は週に１回）の腹腔内注射によって転移を確立したとき（腫瘍接種後７日目）、Ｉｇｈｍ^－／－マウスにおいて処理を開始した。別のプロトコルでは、ＷＴマウス（Ｉｇｈｍ^＋／＋）には１、２日目に抗体を注射し、その後週に１回注射した。ＣＤ８ Ｔ細胞（１００μｇ抗ＣＤ８β、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログＢＥ０２２３）またはＮＫ細胞（１：１０希釈抗アシアロＧＭ１、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ９８６－１００１、および１００μｇ抗ＮＫ１．１、クローンＰＫ１３６、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）の枯渇を誘導した抗体を、腫瘍細胞の接種に対して、－１、０日目に注射し、その後は週に１回注射した。対照ＩｇＧ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログＢＥ００８３）としてマウスＩｇＧ１を使用した。肺転移は、組織のホルマリン固定後、実体顕微鏡下で１４日目に定量した。あるいは、マウスの生存を記録した。

ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移モデルの場合、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１．０～１．５×１０^６個の腫瘍細胞（図の凡例に示されているように）を尾静脈から静脈内接種した。７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ）を、腫瘍細胞の接種に対して、２、３日目に投与し、その後は週に１回投与した。ＮＫ細胞の養子移入を含む実験では、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６（同系）またはＣＢ６Ｆ１／Ｊ（同種）マウスから単離された２×１０^５個のＮＫ細胞をＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ノックアウトマウスに静脈内注射した。これらのＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ３ε^－ＣＤ４９ｂ^＋細胞として単離した。ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞（７×１０^５個の細胞）を、ＮＫ細胞移入の１日後に静脈内注射した。７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ／注射）を２、３日目に腹腔内投与し、その後は週に１回投与した。１４日目に、マウス（ＷＴまたはＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ノックアウト）をＣＯ_２吸入により安楽死させ、前述のように（３４）、肺転移のカウントを可能にするために墨汁（３０％）を気管に注入した。肺組織をＦｅｋｅｔｅの固定液を使用して処理し、実体顕微鏡を使用して表面転移を数えた。

Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ転移モデルにおけるマウスＮＫ細胞の特性評価
ＷＴＣ５７ＢＬ／６マウスに、対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯ遺伝子型のいずれかを持つ７×１０^５個のＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞を静脈内接種した。腫瘍細胞接種後１日目および３日目に、マウスを７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ／注射）で処理した。１２日目に、マウスに５０μｌのＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０９８１４）を静脈内注射して、血管内免疫細胞を標識し、安楽死させた。肺組織を細かく切断し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型、０．１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ、２０Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅを添加したＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ機器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して処理した。次に、細胞懸濁液を、マウスＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１３２０）、ならびにＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０９８３０）、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ３ε（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１００３１２）、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＴＣＲβ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０９２１２）、ＢＶ７８５コンジュゲート抗マウスＮＫ１．１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７４０８５３）、ＰＥ－ＣＦ５９４コンジュゲート抗マウスＣＤ４９ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６２４５３）、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＥＯＭＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５３－４８７５－８２）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＧＺＭＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２－５８３１－８２）、ＢＶ４２１コンジュゲート抗マウスＮＫＧ２Ｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６２８００）、ＰＥＲＣＰ－ＣＹ５．５コンジュゲート抗マウスＣＤ１６／３２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０１３２４）、ＢＶ５１０コンジュゲート抗マウスＬｙ４９Ｃ／Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７４４０２８）およびＺｏｍｂｉｅ ＵＶなどの複数の抗体とともにインキュベートした。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０を使用してデータを処理した。

ヒト化マウスモデル
ＮＳＧマウスを、上記のようにインビトロで増殖させたヒトＮＫ細胞（１～２×１０^６個の細胞）で静脈内に再構成した。以前に報告されたように（２３）、ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）を腹腔内注射（７．５×１０^４個の単位）して、ＮＫ細胞のインビボ生存をサポートした。Ａ３７５メラノーマ細胞（５×１０^５個の細胞、対照またはＢ２Ｍ－ＫＯ）を１日後（０日目）に注射した。腫瘍細胞接種の１日後、マウスには、別の用量のＩＬ－２に加えて、アイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログＢＥ００９６）または７Ｃ６－ｈＩｇＧ１ ｍＡｂ（２００μｇ）、ならびにＰＢＳまたは１０ｍｇ／ｋｇパノビノスタット（ＡｐｅｘＢｉｏ、カタログ番号Ａ８１７８）を投与した。２日目に、マウスを同じドナーからのヒトＮＫ細胞で再び再構成し、ＩＬ－２、抗体、ならびにＰＢＳまたはパノビノスタットの注射も投与した。転移は、ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移モデル（気管への墨汁の注入、Ｆｅｋｅｔｅの固定液による肺組織の処理）について、上記したように、最後の処理の２週間後に定量した。

ＮＳＧマウスに１×１０^６個のＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞を接種して、肺転移におけるＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルに対するＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂおよびパノビノスタット処理の効果を研究した。これらのマウスにはヒトＮＫ細胞を投与しなかった。転移が確立されたら（２週間後）、２日後に７Ｃ６－ｈＩｇＧ１またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２００μｇ）、ならびに溶媒対照としてパノビノスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳでマウスを処理した。最後の処理の翌日、マウスをＣＯ_２吸入により安楽死させ、肺組織を機械的に分離して、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の完全性を維持した。腫瘍細胞は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性であるが、マウスＣＤ４５抗原に対して陰性である、大きな生細胞として同定された。ＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質を６Ｄ４－ＰＥｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３２０９０６）で標識し、フローサイトメトリーで定量した。

腫瘍のないＮＳＧマウスにおけるヒトＮＫ細胞の特性評価
腫瘍のないＮＳＧマウスに２×１０^６個のヒトＮＫ細胞を静脈内接種し、上記のようにインビトロで増殖させた。同時に、マウスには、ＩＬ－２（７．５×１０^４個、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ならびに溶媒対照としてパノビノスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの腹腔内注射を投与した。１日後、眼の出血により採血し、フローサイトメトリーによりヒトＮＫ細胞を分析した。

統計分析
すべての統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して実行し、関連する統計試験は各図の凡例に示されている。

結果
ＮＫ細胞を介したヒトＢ２Ｍ欠損メラノーマ細胞の殺傷はＭＩＣＡ ｍＡｂによって増強される
ヒトＢ２Ｍ欠損腫瘍細胞に対するＮＫ細胞を介した免疫に対するＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的抗体の効果を調べた。ヒトＡ３７５メラノーマ細胞のＢ２Ｍ遺伝子を不活性化させた結果、ＩＦＮγで刺激した後でもＭＨＣ－Ｉ表面タンパク質が完全に失われた（図１８Ａ、図２４Ａ～Ｂ）。Ｂ２Ｍ欠損症は、ＭＩＣＡ／Ｂ発現を無効にしなかったが、細胞表面レベルが約５０％減少したことに気付いた。Ｂ２Ｍ－ＫＯと対照Ａ３７５メラノーマ細胞株の両方がＭＩＣＡを上清にシェディングした（図１８Ｂ～Ｄ）。ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的ｍＡｂ（７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）で処理すると、ＭＩＣＡのシェディングが阻害され、対照細胞とＢ２Ｍ欠損Ａ３７５細胞の両方でＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の表面レベルが上昇した（図１８Ｂ～Ｄ）。

ＮＫ細胞はＭＨＣ－Ｉ分子に対する阻害性受容体を有しており（１２）、理論に拘束されることを望まないが、Ｂ２Ｍ欠損腫瘍細胞はＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理に対してより感受性が高い可能性がある。複数の時点で９６ウェルプレート内の蛍光腫瘍細胞のカウントを可能にする画像化ベースのシステムを使用して、ＮＫ細胞を介したヒトＡ３７５メラノーマ細胞の殺傷の動態を研究した。この技法により、腫瘍微小環境に関連する低エフェクター対標的比でのＮＫ細胞と腫瘍細胞の相互作用の調査が可能になる（３３）。これらの実験には、健康なドナーの血液から陰性選択を介して単離された初代ＮＫ細胞を使用した。この実験では、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理（７Ｃ６－ｈＩｇＧ１）が対照Ａ３７５メラノーマ細胞と比較してＢ２Ｍ－ＫＯに対してより効果的であることが実証された。エフェクター対標的比が低い（１：１）場合でも、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの存在下では遅い時点（４８～７２時間）で少数の蛍光Ｂ２Ｍ－ＫＯメラノーマ細胞しか残っていなかった（図１８Ｅ）。以前、７Ｃ６ ｍＡｂがヒトＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ｄ受容体とＣＤ１６ａ受容体の二重の関与を誘導し、両方の受容体がＮＫ細胞を介した標的細胞の殺傷に寄与することを確立した（２３）。ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、およびＫＩＲ２ＤＬ４は、ヒトＮＫ細胞上のＭＨＣ－Ｉ分子の最も特徴的な阻害性受容体の一部である（１２）。健康なドナーからのＮＫ細胞はＭＨＣミスマッチのためにＡ３７５細胞にアロ反応性であるが、これらの受容体の抗体を介した遮断により、７Ｃ６－ｈＩｇＧ１処理Ａ３７５メラノーマ細胞のＮＫ細胞を介した死滅が増加した（補足図１８Ｃ）。したがって、ＮＫ細胞阻害性受容体は、Ａ３７５細胞上のＭＨＣ－Ｉタンパク質を認識した。まとめると、これらの実験は、ＭＨＣクラスＩ表面発現の喪失により、ヒト腫瘍細胞がＮＫ細胞に対してより脆弱になり、これはＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの存在によってさらに増強されることを実証した。

ＭＩＣＡ／Ｂ抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある転移に対する免疫を誘導した
２匹のマウスモデルを使用して、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理がＭＨＣ－ＩおよびＩＦＮγ経路における不活性化変異（それぞれＢ２ｍおよびＪａｋ１変異）を伴う腫瘍に対する免疫を誘導できるかどうかを検証した。ＩＦＮγはＴ細胞とＮＫ細胞の両方から分泌されるため、Ｊａｋ１変異は興味深いものであった。腫瘍細胞におけるＩＦＮγシグナル伝達は、ＭＨＣクラスＩ経路の多くの遺伝子の発現を増強するだけでなく、腫瘍細胞の増殖も阻害する（３）。したがって、Ｊａｋ１変異は、ＮＫ細胞が腫瘍細胞の増殖を制御する能力に悪影響を与えるか、ＮＫ細胞の阻害性受容体に関与するＭＨＣクラスＩタンパク質の喪失を通じてＮＫ細胞の活性化を増強する可能性がある。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマおよびＬＬＣ１肺がん細胞株にレンチウイルスベクターを形質導入して、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することが知られている（２３）ヒトＭＩＣＡの発現を誘導した。これらのマウスモデルでは、ＭＨＣクラスＩ発現のパターンに違いがあった。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞は、Ｈ－２Ｋ^ｂおよびＨ－２Ｄ^ｂタンパク質の基礎表面レベルが非常に低かったが、ＩＦＮγへの曝露によりＨ－２Ｋ^ｂおよびＨ－２Ｄ^ｂ表面タンパク質が著しく増加した（図１９Ａ、図。２５Ａ～Ｂ）。対照的に、ＬＬＣ１肺腫瘍細胞は、Ｈ－２Ｋ^ｂの検出可能な基礎レベルを有していたが、Ｈ－^２Ｄｂについては有していなかった。Ｈ－２Ｋ^ｂの表面発現はＩＦＮγ処理によって増加した（図２０Ａ、図２７４Ａ）。

Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡメラノーマ細胞（図１９Ａ、図２５Ａ～Ｃ）においてＢ２ｍまたはＪａｋ１遺伝子を不活性化させて、ＣＤ８ Ｔ細胞を介した殺傷に対する耐性を引き起こし（図２６）、肺転移モデルにおいてＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理の有効性を試験した。編集した腫瘍細胞を静脈内注射し、確立された表面肺転移が検出された７日目に処理を開始した（「処理前」と表示されたマウスのサブセットの病理学的分析によって決定）（図１９Ｂ）。以前に報告されたように（２３）、Ｂ細胞欠損Ｉｇｈｍ^－／－マウスを宿主として使用して、ヒトＭＩＣＡに対する内因性抗体の発生を防止した。ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ（７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａ）による治療により、対照、Ｂ２ｍ－ＫＯおよびＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞による肺転移の増殖が阻害された（図１９Ｂ）。ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理は、シェディングＭＩＣＡの血漿レベルも低下させた（図２８Ａ）。別の一連の実験では、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株を接種し、ＭＩＣＡ／Ｂまたは対照ｍＡｂで処理した野生型（Ｉｇｈｍ^＋／＋）マウスの生存も分析した。これらの実験では、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ接種に対して１日目と２日目に抗体を投与した。これは、マウス免疫系による内因性ＭＩＣＡ抗体の生成よりも早い時期であった。アイソタイプ対照抗体治療と比較して、７Ｃ６は、対照、Ｂ２ｍ－ＫＯまたはＪａｋ１－ＫＯメラノーマ転移を有するＷＴマウスの生存を有意に増加させた（図１９Ｃ）。

また、ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍モデルにおけるＭＩＣＡ／Ｂ抗体処理の有効性を検討した。この細胞株のＢ２ｍ遺伝子をノックアウトした（図２７Ｂ）。対照ＬＬＣ１細胞はベースラインでＨ－２Ｋ^ｂを発現し、ＩＦＮγで処理するとＭＨＣ－Ｉ表面タンパク質レベルが増加したが、Ｂ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１細胞ではＩＦＮγで処理した後でもＭＨＣ－Ｉ発現しなかった（図２０Ａ）。腫瘍細胞をＷＴマウスに静脈内注射し、２日目にｍＡｂ処理を開始した。ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理すると、対照ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞によって形成される肺転移の数が減少した。Ｂ２ｍ遺伝子の不活性化により、対照のＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞と比較して、肺転移の数がほとんど検出できないレベルまで減少した。したがって、接種した腫瘍細胞の数を５０％増加させた結果、Ｂ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ細胞による肺転移が形成された。これらの実験条件下で、アイソタイプ対照ｍＡｂと比較して、７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａでの処理後のＢ２ｍ－ＫＯ ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ転移の数が有意に減少したことが観察された（図２０Ｂ）。

ＭＨＣ－ＩのＮＫ細胞阻害性受容体は多形性遺伝子によってコードされており、標的細胞上で自己ＭＨＣ－Ｉを認識すると阻害されるＮＫ細胞の集団である自己寛容性ＮＫ細胞の生成に役割を果たす。これらの阻害性受容体は、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の多型変異体にも特異性を有する（３５）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢａｌｂｃマウスは、ＭＨＣ－Ｉ多型変異体が異なり、その結果、これら２つのマウス系統間の交配からのＦ１マウス（ＣＢ６Ｆ１と呼ばれる）は、Ｃ５７ＢＬ／６株からのＭＨＣ－Ｉバリアントに耐性のないＮＫ細胞の集団を有する（３６）。このようなアロ反応性ＮＫ細胞は、白血病に対する同種幹細胞移入の治療効果の鍵となる（３７）。このマウス系統を利用して、養子移入モデルを使用して、ＮＫ細胞とＭＨＣ－Ｉタンパク質の阻害性受容体の役割をさらに確認した。注目すべきことに、ＬＬＣ１細胞株はＣ５７ＢＬ／６マウスと同系である。Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ＫＯマウスを、同系ＮＫ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来）または同種ＮＫ細胞（ＣＢ６Ｆ１マウス由来）のいずれかで再構成した。同系および同種のＮＫ細胞は、マウスをＭＩＣＡ／Ｂとアイソタイプ対照ｍＡｂで処理した場合に、ＬＬＣ１－ＭＩＣＡ腫瘍細胞によって形成される肺転移の数を減少させた。また、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体処理は、同種ＮＫ細胞を移植した場合に、より効果的であった（図２０Ｃ）。このモデルの利点の１つは、Ｑａ－１（非従来型ＭＨＣ－Ｉ分子）の表面発現にもＢ２Ｍとの結合が必要なため、非従来型ＭＨＣ－Ｉ分子のＮＫＧ２Ａ認識に影響を与えないことである。したがって、Ｂ２Ｍ欠損腫瘍は、従来型および非従来型ＭＨＣ－Ｉ分子の両方のＮＫ細胞阻害性受容体によっては認識されない（１２、３８）。ＮＫ細胞上の阻害性受容体によるＭＨＣ－Ｉタンパク質の関与により、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによって誘導される抗腫瘍免疫の有効性を低下させる。

ＭＩＣＡ／Ｂ抗体の有効性に対するＮＫ細胞の重要な役割
次に、ＷＴマウスに接種したＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞株を用いて機構実験を実行した。ＣＤ８ Ｔ細胞ではなくＮＫ細胞が枯渇すると、対照およびＢ２ｍ－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞の両方に対するＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂの有効性が完全に喪失し、一方でＮＫ細胞が枯渇することによって、Ｊａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞に対するＭＩＣＡ ｍＡｂの有効性が大幅に低下した（図２１Ａ）。また、以前に報告されたように（２３）、安楽死の前にＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４５．２抗体の静脈内注射によって血液ＮＫ細胞と区別された肺浸潤ＮＫ細胞をフローサイトメトリーによって調べた。ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理は、対照またはＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍へのＮＫ細胞浸潤の程度を増加させた（図２１Ｂ）。この分析では、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞の数がＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理マウスで大幅に減少したため、ＮＫ細胞浸潤は腫瘍量に対して正規化された（図２１Ｃ～Ｄ）。７Ｃ６－ｍＩｇＧ２ａ ｍＡｂによる処理後のＪａｋ１－ＫＯ Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ肺転移モデルにおけるＮＫ細胞のＣＤ１６レベルの増加を除いて、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡメラノーマ細胞の遺伝子型に応じて組織浸潤ＮＫ細胞によるＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６発現の有意差は観察されなかった（図２８Ｂ）。これらのデータは、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理が、腫瘍細胞がＢ２ｍまたはＪａｋ１遺伝子に不活性化変異を有する場合でも、ＮＫ細胞依存的にメラノーマ転移の増殖を阻害することを実証している。

ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとＨＤＡＣ阻害剤との組み合わせで処理したヒト腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルの向上
本明細書に記載の腫瘍モデルにおいて、ＭＩＣＡ転写は、以前に示されたように（２３）、高レベルのＭＩＣＡを誘導する異種プロモーターによって制御された。しかしながら、ヒトがんでは、ＭＩＣＡ／Ｂの発現はＤＮＡ損傷と細胞ストレスに応答して誘導される（１３）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子の転写は、ＨＤＡＣによってエピジェネティックに調節されており、ＨＤＡＣ阻害剤はこれらの遺伝子の転写を増強する（２７、２８）。汎ＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットは、多発性骨髄腫の治療のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された（３９）。がんの複数のマウスモデルでの以前の研究により、パノビノスタットの治療活性には機能的に正常な免疫系が必要であることが確立された（４０）。したがって、パノビノスタットと７Ｃ６－ｈＩｇＧ１ ｍＡｂとの組み合わせが、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写の増加（パノビノスタット）および細胞表面上のコードされたタンパク質の安定化（ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ）によってＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを高めることができるかどうかを調べた。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、Ａ３７５メラノーマ細胞をパノビノスタット（５０ｎＭ）で２４時間処理すると、ＭＩＣＡ、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１ＬなどのＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする複数の遺伝子のｍＲＮＡレベルが増加することを実証した。しかしながら、パノビノスタットは、従来のまたは非従来のＭＨＣ－Ｉ分子をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させなかった（図２２Ａ）。また、リアルタイムｑＰＣＲにより、パノビノスタットがＭＩＣＡおよびＲＡＥＴ１Ｌの発現を増加させることを確認した。このアッセイでは、ＭＩＣＢとＵＬＢＰ２の増加も検出された（図２２Ｂ）。パノビノスタットはまた、Ａ３７５メラノーマ細胞における他の多くの遺伝子の転写に影響を及ぼし、その一部は免疫関連経路であった（図２９Ａ～Ｂ）。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせにより、表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルが大幅に増加し、細胞生存率を低下させることなく、シェディングＭＩＣＡの濃度が低下した（図５Ｃ～Ｄ）。また、転移性病変から樹立された短期ヒトメラノーマ細胞株のパネルによってＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを調べた（２３、３１）。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂでの処理は、個々の化合物での処理と比較して、ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の表面密度を大幅に増加させた（図２２Ｅ、図３０）。これらの結論は、ヒト腫瘍細胞株のパネルの分析によってさらに裏付けられた（図３１Ａ～Ｆ）。注目すべきことに、ＥＬＩＳＡはＭＩＣＡに特異的であったため、シェディングされたＭＩＣＢは分析されなかった（図３２）。これらのデータは、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写を増加させ、合成タンパク質を安定化させる組み合わせアプローチにより、ヒトがん細胞上の表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質が大幅に増加することを実証している。

ヒト化マウスモデルにおけるＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとパノビノスタット併用療法の有効性
次に、ヒトメラノーマ細胞の表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルに対するパノビノスタットのインビボ活性を調査した。マウスモデルの多発性骨髄腫治療に対するパノビノスタットの有効性を確立した以前の研究記事に基づいて、パノビノスタットの用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を選択した（４１）。パノビノスタットの選択された用量が、免疫不全ＮＳＧマウスに移入したヒトＮＫ細胞に悪影響を及ぼさないことを最初に確立した（総循環ＮＫ細胞、ならびにＣＤ１６ａまたはＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞のパーセンテージに基づく、図３３Ａ～Ｃ）。次に、ＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞をＮＳＧマウスに静脈内注射し、転移が確立するまで２週間待った。次に、マウスをパノビノスタット（もしくはＰＢＳ）、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ（もしくはアイソタイプ対照ｍＡｂ）、またはパノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ（またはパノビノスタットとアイソタイプ対照ｍＡｂ）との組み合わせで２４時間間隔で２回処理した。１日後、ＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルを、フローサイトメトリーによって解離した肺組織からのＺｓＧｒｅｅｎ^＋腫瘍細胞上で定量した。選択された用量のパノビノスタットは、単剤療法としてメラノーマ細胞のＭＩＣＡ／Ｂタンパク質レベルを有意に増加させなかったが、パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせにより、肺転移におけるＺｓＧｒｅｅｎ^＋Ａ３７５メラノーマ細胞のＭＩＣＡ／Ｂ表面レベルが高くなった（図２３Ａ、図３３Ｄ）。

以前の経験に基づくと、移入したヒトＮＫ細胞の生存はＮＳＧマウスでは制限されており、比較的少数のヒトＮＫ細胞のみが肺組織に浸潤していた。したがって、本発明者らは、ヒトＡ３７５メラノーマ細胞接種の１日後に処理を開始した（図２３Ｂ）。治療の早期開始により、肺組織にまだ深く浸潤していない腫瘍細胞のＮＫ細胞認識が可能になった。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとの組み合わせのみが、対照（Ｂ２Ｍ－ＷＴ）Ａ３７５メラノーマ細胞によって形成される肺転移の数を減少させるが、パノビノスタットまたはＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂのいずれかによる単剤療法は効果がないことが分かった。対照的に、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによる単剤療法では、Ｂ２Ｍ－ＫＯ Ａ３７５メラノーマ細胞によって形成される肺転移の数が有意に減少した（図２３Ｃ）。理論に拘束されることを望まないが、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとパノビノスタットとの組み合わせは、ＮＫ細胞の再構成がこのモデルで制限されていたため、Ｂ２Ｍ－ＫＯ転移に対するこの効果を増強しなかった。これらの結果は、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理が、このヒト化マウスモデルにおけるＭＨＣ－Ｉ欠損ヒトメラノーマ転移に対してより効果的であるのに対し、ＭＨＣ－Ｉタンパク質を発現するメラノーマ転移に対しては併用療法が効果的であることを実証している。

考察
チェックポイント遮断に対する一次および二次耐性は、腫瘍学における問題である。チェックポイント遮断に対する耐性の多くのメカニズムは、腫瘍細胞におけるＭＨＣ－ＩおよびＩＦＮγシグナル伝達経路に関連している。これらには、ＭＨＣ－Ｉ抗原提示経路におけるＢ２Ｍまたは他の遺伝子の変異、新生抗原またはＭＨＣ－Ｉ発現の転写およびエピジェネティックなサイレンシング、ならびにＩＦＮγシグナル伝達経路における不活性化変異が含まれる（４～６）。ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質はＭＨＣ－Ｉタンパク質と同様の全体的な構造を有するが、β２－ミクログロブリンとは集合しない（２４）。また、ＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写は、ＩＦＮγではなくＤＮＡ損傷と細胞ストレスによって誘導される（１３）。したがって、ＭＨＣ－ＩおよびＩＦＮγ経路の不活性化変異はＭＩＣＡ／Ｂ発現を無効にしない。

ＭＨＣ－Ｉ発現が失われると、ＮＫ細胞の阻害シグナルが除去されるが、ＮＫ細胞を介した腫瘍免疫の誘導には十分な活性化シグナルも必要である（１２）。ＭＨＣ－Ｉ（Ｂ２Ｍ変異）またはＩＦＮγシグナル伝達（ＪＡＫ１変異）経路に不活性化変異を有する転移は、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的抗体で治療できることを示している。この抗体は、ＭＩＣＡ／Ｂのタンパク質分解によるシェディングを阻害する。これは、ヒトがんにおけるＮＫＧ２Ｄ受容体を介した免疫からの一般的な回避メカニズムである。このｍＡｂによる処理が、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ（ＭＩＣＡ／Ｂリガンドの密度の増加）とＣＤ１６ａ（ｍＡｂのＦｃ領域）受容体の両方の活性化を誘導し、このｍＡｂによって誘発される腫瘍免疫がＮＫ細胞に依存することを以前に示した（２３）。理論に拘束されることを望まないが、２つのアプローチがそのようなｍＡｂによりＮＫ細胞を介した腫瘍免疫を引き出すことができる。まず、ＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン特異的ｍＡｂを使用して、ＭＨＣ－ＩまたはＩＦＮγシグナル伝達経路における変異を不活性化させることによるチェックポイント遮断に耐性のある腫瘍を処理することができた。第二に、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂとＰＤ－１ｍＡｂの同時投与は、ＮＫ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の両方を活性化させ、それにより、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性のある腫瘍クローンの増殖を防ぐことができる。このようなアプローチは、広範な不均一性を伴う進行したヒト腫瘍にとって興味深い可能性がある。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＩＬＣによっても発現される（１４、４２、４３、４４）。したがって、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂ処理は、理論に拘束されることを望まないが、ＣＤ８Ｔ細胞によって発現されるＮＫＧ２Ｄ受容体を介してＴ細胞を介した腫瘍免疫を増強することができる。ＮＫＧ２Ｄリガンドのシェディングは、必ずしも免疫逃避のメカニズムではない。例えば、マウスＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＵＬＴ－１のシェディングは、ＮＫ細胞を介した免疫を促進する（４５）。

腫瘍学で使用される多くの治療アプローチは、腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂタンパク質の発現を増強する。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＦＤＡ承認薬であるパノビノスタットなどのＭＩＣＡ／Ｂ遺伝子の転写を促進する（２７、２８、３９）。しかしながら、腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂタンパク質のタンパク質分解によるシェディングは、ＮＫＧ２Ｄ受容体の活性化に対するそのような薬物の効果を制限する。パノビノスタットとＭＩＣＡ／Ｂα３ドメイン抗体の組み合わせにより、インビボで腫瘍細胞のＭＩＣＡ／Ｂ表面タンパク質レベルが大幅に増加し、メラノーマ転移に対するＮＫ細胞を介した免疫が増強されることを示している。理論に拘束されることを望まないが、ＨＤＡＣ阻害剤は健康な組織でＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を誘導することもできる。同様のアプローチを使用して、他のＦＤＡ承認薬との併用療法を開発することができる。放射線療法によって誘発されるＤＮＡ損傷応答は、ＭＩＣＡ／Ｂ転写を強力に増強する（４６）。局所放射線療法とＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂによる全身免疫療法の組み合わせは、２つの全身免疫療法剤（ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４ ｍＡｂなど）を含む組み合わせで観察された免疫関連の有害事象を制限することができる。また、チェックポイント遮断（ＣＴＬＡ－４遮断）と放射線療法を組み合わせると、非照射病変に対する全身性腫瘍免疫を誘発することができるという臨床的証拠がある（アブスコパル効果）（４７）。

要約すると、細胞傷害性Ｔ細胞に対する耐性を引き起こす変異を伴う転移は、ＭＩＣＡ／ＢシェディングがｍＡｂで阻害されると、ＮＫ細胞の標的となる可能性があることを示している。いくつかの組み合わせ戦略は、転移性病変に対するＮＫ細胞の活性をさらに増強することができる。
１．腫瘍細胞によるＭＩＣＡ／Ｂタンパク質発現を増強するアプローチ（パノビノスタット、局所放射線療法など）（４６）、
２．腫瘍内のＮＫ細胞機能を増強し、ＴＧＦβを介したＮＫＧ２Ｄの下方調節を低減するサイトカイン（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体など）（４８）、
３．ＮＫ細胞の阻害性受容体を標的とする抗体（４９）。
したがって、ＮＫ細胞を介した免疫の誘導は、Ｔ細胞を介した細胞傷害性からの逃避変異を伴う腫瘍を治療するための戦略を提供することができる。

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１１．Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｒ．Ｓ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｏ．Ｕ．Ｋａｗａｌｅｋａｒ，Ｓ．Ｇｈａｓｓｅｍｉ，Ｍ．Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ，ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１３６１－１３６５（２０１８）．
１２．Ｅ．Ｏ．Ｌｏｎｇ，Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｌｉｕ，Ｍ．Ｅ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１，２２７－２５８（２０１３）．
１３．Ｄ．Ｈ．Ｒａｕｌｅｔ，Ｓ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｇｏｗｅｎ，Ｗ．Ｄｅｎｇ，Ｈ．Ｊｕｎｇ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１，４１３－４４１（２０１３）．
１４．Ｓ．Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ，ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩＣＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，７２７－７２９（１９９９）．
１５．Ｈ．Ｒ．Ｓａｌｉｈ，Ｈ．Ｇ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣＡ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｈｅｄｄｉｎｇ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，４０９８－４１０２（２００２）．
１６．Ｂ．Ｋ．Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ－ｅｎａｂｌｅｄ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４７，４８２－４８６（２００７）。
１７．Ｍ．Ｊｉｎｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｈａｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，１２８５－１２９０（２００８）．
１８．Ｆ．Ｑ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２（ＭＭＰ２）ｍｅｄｉａｔｅｓ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ（ＭＩＣＡ）ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｃｔａｓ Ｕｒｏｌ Ｅｓｐ ３８，１７２－１７８（２０１４）．
１９．Ｐ．Ｂｏｕｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＡＤＡＭ１７／ＴＮＦ－ａｌｐｈａ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ｂ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２，４９－５３（２００９）．
２０．Ｖ．Ｇｒｏｈ，Ｊ．Ｗｕ，Ｃ．Ｙｅｅ，Ｔ．Ｓｐｉｅｓ，Ｔｕｍｏｕｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ＭＩＣ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｍｐａｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４１９，７３４－７３８（２００２）。
２１．Ｉ．Ｗａｌｄｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＩＣＡ ｉｓ ｓｈｅｄ ｂｙ ＡＤＡＭ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８，６３６８－６３７６（２００８）．
２２．Ｈ．Ｒ．Ｓａｌｉｈ，Ｄ．Ｇｏｅｈｌｓｄｏｒｆ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＭＩＣＢ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ＭＩＣＢ ｉｎ ｓｅｒａ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７，１８８－１９５（２００６）．
２３．Ｌ．Ｆ．ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣＡ ａｎｄ ＭＩＣＢ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＮＫ ｃｅｌｌ－ｄｒｉｖｅｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１５３７－１５４２（２０１８）．
２４．Ｐ．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ＭＩＣＡ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，４４３－４５１（２００１）．
２５．Ｓ．Ｂａｈｒａｍ，Ｍ．Ｂｒｅｓｎａｈａｎ，Ｄ．Ｅ．Ｇｅｒａｇｈｔｙ，Ｔ．Ｓｐｉｅｓ，Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９１，６２５９－６２６３（１９９４）．
２６．Ｖ．Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，１２４４５－１２４５０（１９９６）．
２７．Ｓ．Ａｒｍｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｏｄｉｕｍ ｖａｌｐｒｏａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５，６３２１－６３２９（２００５）．
２８．Ｓ．Ｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｃｏｍｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｕｅ ｔｏ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５，１１１３６－１１１４５（２００５）．
２９．Ｃ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｔｉａｎ，Ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄ ＭＩＣＡ／Ｂ ｉｎ ＨｅＬａ ａｎｄ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅｉｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＮＫ ｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５８，１２７５－１２８５（２００９）．
３０．Ｓ．Ｄｉｅｒｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＡＭＬ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＨＤＡＣ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ＫＩＲ－ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ １１１，１４２８－１４３６（２００８）．
３１．Ｂ．Ｉｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ＆Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，６５６－６６８（２０１６）．
３２．Ｄ．Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍａｊｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，７７０－７７５（２０１８）．
３３．Ｌ．Ｌ．Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｌ．Ｆ．ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｖｅｒ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｉｍｅ ｐｅｒｉｏｄｓ ｂｙ ｉｍａｇｅ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４６９，４７－５１（２０１９）．
３４．Ｌ．Ｆｅｒｒａｒｉ ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＢＲＡＦ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ＢＲＡＦＶ６００Ｅ－ｍｕｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４，７２９８－７３０８（２０１４）．
３５．Ｓ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｏｓｔ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３６，７０９－７１３（２００５）。
３６．Ｙ．Ｙ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｙ４９Ａ ａｎｄ ５Ｅ６（Ｌｙ４９Ｃ）ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｒｉｎｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｂｌａｓｔｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４，６７－７６（１９９６）．
３７．Ｌ．Ｒｕｇｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，２０９７－２１００（２００２）．
３８．Ｘ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｅｄ Ｑａ－１ ｍｉｍｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｅｌｉｆｅ ７，ｅ３８６６７（２０１８）．
３９．Ｊ．Ｐ．Ｌａｕｂａｃｈ，Ｐ．Ｍｏｒｅａｕ，Ｊ．Ｆ．Ｓａｎ－Ｍｉｇｕｅｌ，Ｐ．Ｇ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１，４７６７－４７７３（２０１５）．
４０．Ａ．Ｃ．Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ｉｎｔａｃｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３，７２６５－７２７６（２０１３）．
４１．Ｊ．Ｄ．Ｇｒｏｗｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１０，１５１０－１５１０（２００７）．
４２．Ｖ．Ｇｒｏｈ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ｓ．Ｂａｕｅｒ，Ｔ．Ｓｐｉｅｓ，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇａｍｍａｄｅｌｔａ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９，１７３７－１７４０（１９９８）．
４３．Ｌ．Ｃｈｉｏｓｓｏｎｅ，Ｐ．－Ｙ．Ｄｕｍａｓ，Ｍ．Ｖｉｅｎｎｅ，Ｅ．Ｖｉｖｉｅｒ，Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８，６７１－６８８（２０１８）．
４４．Ｃ．Ｓ．Ｎ．Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ＩＬＣｓ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｔｏ ａｌｌ ｈｅｌｐｅｒ－ｌｉｋｅ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｃｅｌｌ １５７，３４０－３５６（２０１４）。
４５．Ｗ．Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｈｅｄ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１３６－１３９（２０１５）．
４６．Ｐ．Ｄｈａｒ，Ｊ．Ｄ．Ｗｕ，ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５１，５５－６１（２０１８）．
４７．Ｓ．Ｃ．Ｆｏｒｍｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｏ ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４，１８４５－１８５１（２０１８）．
４８．Ｒ．Ｒｏｍｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ ｐｈａｓｅ １ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ－１５ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ＡＬＴ－８０３ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｒｅｌａｐｓｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １３１，２５１５－２５２７（２０１８）．
４９．Ｐ．Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ａ ｍＡｂ ｉｓ ａ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｕｎｌｅａｓｈｉｎｇ ｂｏｔｈ Ｔ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １７５，１７３１－１７４３（２０１８）。

同等物
当業者であれば、ルーチンの実験以上のものを使用せずに、本明細書に具体的に記載された特定の物質および手順に対する多数の同等物を認識するであろう、または確認できるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の請求項によってカバーされる。

Claims (27)

1. 対象におけるがんを治療する方法であって、
   １つ以上の活性化剤および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の組成物を前記対象に投与すること
   を含み、前記活性化剤が、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６受容体を介してＮＫ細胞を活性化させ、それにより、前記対象における１つ以上のがん細胞の溶解を引き起こし、前記がんが、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性がある、前記方法。
2. 前記活性化剤が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記活性化剤が、抗ＭＩＣＡ抗体、抗ＭＩＣＢ抗体、またはその両方を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗体が、ＭＩＣＡ／Ｂのアルファ－３ドメインと結合する、請求項３に記載の方法。
6. 前記抗体が、表１の１つ以上の配列を含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記活性化剤が、腫瘍によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢのシェディングを阻害し、それにより、腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドの密度を増加させる、請求項１に記載の方法。
8. １つ以上の治療薬および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の第２の組成物を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記１つ以上の治療薬が、小分子、毒素、放射性標識、放射線療法、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、抗体、遺伝子操作された細胞、放射線、またはサイトカインを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記１つ以上の治療薬が、ＨＤＡＣ阻害剤を含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、パノビノスタットである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１２、またはＩＬ１８を含む、請求項９に記載の方法。
13. 前記小分子が、プロテアソーム阻害剤を含む、請求項９に記載の方法。
14. 前記抗体が、抗ＰＤ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む、請求項９に記載の方法。
15. 前記遺伝子操作された細胞が、ＣＡＲ Ｔ細胞である、請求項９に記載の方法。
16. 前記がんが、ＭＣＨクラスＩ欠損がんまたはＩＦＮガンマに耐性のあるがんである、請求項１に記載の方法。
17. 前記がんが、免疫療法に耐性がある、請求項１に記載の方法。
18. 前記がんが、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体に耐性がある、請求項１に記載の方法。
19. 前記がんが、メラノーマ、肺がん、腎がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、乳がん、胃がん、および膵がんを含む、請求項１に記載の方法。
20. がんを治療することが、腫瘍の成長および／または転移を停止または低減することによって示される、請求項１に記載の方法。
21. Ｊａｋ１変異および／またはＢ２ｍ変異について前記がんを試験するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
22. ＮＫ細胞に対して対象のがん細胞を感作させる方法であって、
    １つ以上の活性化剤および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の組成物を前記対象に投与すること
    を含み、前記活性化剤が、ＮＫ細胞を活性化させ、それにより、前記対象における１つ以上のがん細胞の溶解を引き起こし、前記がんが、細胞傷害性Ｔ細胞に耐性がある、前記方法。
23. 前記ＮＫＧ２Ｄ受容体および／またはＣＤ１６受容体の活性化が、ＮＫ細胞を活性化させる、請求項２２に記載の方法。
24. 前記活性化剤が、前記がん細胞によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢのシェディングを阻害し、それにより前記ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６受容体を活性化させる、請求項２２に記載の方法。
25. 前記がん細胞の表面上のＭＩＣＡ／Ｂが、前記ＮＫＧ２Ｄ受容体、前記ＣＤ１６受容体、またはその両方を活性化させる、請求項２２に記載の方法。
26. 前記がんが、ＭＣＨクラスＩ欠損がんまたはＩＦＮガンマに耐性のあるがんである、請求項２２に記載の方法。
27. Ｊａｋ１変異および／またはＢ２ｍ変異について前記がん細胞を試験するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

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