CN113905747A - 用于增强免疫功能的细胞、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开总地涉及用于增强免疫功能，并且特别是T细胞(如CD8+T细胞)的免疫功能的多肽、细胞、组合物和方法。更特别地，本发明涉及修饰的DNAM‑1多肽、表达重组和/或修饰的DNAM‑1的T细胞以及在过继性T细胞转移中使用这些细胞的方法，如用于治疗癌症或感染。本公开还涉及用于制备具有增强的免疫功能的T细胞的方法；用于制备用于过继性细胞疗法的T细胞的方法；用于评估受试者或细胞群中的T细胞的免疫功能的方法；用于预测癌症受试者对癌症治疗的响应的方法；和用于预测癌症受试者的存活或存活时间的方法。

Description

用于增强免疫功能的细胞、组合物和方法
相关申请
本申请要求2019年2月27日提交的发明名称为“用于增强免疫功能的细胞、组合物和方法”的澳大利亚临时申请No.2019900621的优先权，将其内容按引用全部并入本文中。
发明领域
本公开总地涉及用于增强免疫功能，且特别是T细胞(如CD8+T细胞)的免疫功能的多肽、细胞、组合物和方法。更特别地，本发明涉及修饰的DNAM-1多肽、表达重组和/或修饰的DNAM-1的T细胞，以及在过继性T细胞转移中使用这些细胞的方法，如用于治疗癌症或感染。本公开还涉及制备具有增强的免疫功能的T细胞的方法；用于制备用于过继性细胞疗法的T细胞的方法；用于评估T细胞在受试者或细胞群中的免疫功能的方法；用于预测癌症受试者对癌症疗法的反应性的方法；和用于预测癌症受试者的存活或存活时间的方法。
发明背景
近几十年来，癌症疗法有了显著发展。不仅传统的手术治疗、放疗和化疗变得更加精确，而且更新的疗法还提供了广泛的靶向与癌症发展相关的特定分子、细胞和/或途径疗法，并且这些疗法可能对不同的癌症、癌症阶段和/或人群特别有效。因此，除了手术、放疗和传统的化疗(即涉及使用药物杀死快速分裂的细胞(如癌症)的非靶向化学疗法)，癌症疗法现在还包括例如激素疗法、靶向疗法和免疫疗法。
癌症免疫疗法通过利用或使用患者的免疫系统来实现治疗癌症的功能。这可以凭借多种机制并通过使用不同的策略来实现，包括通过刺激效应细胞和/或抑制调节细胞(例如通过施用细胞因子，如IL-2和IFN-γ，或药物，如沙利度胺
Figure BDA0003319880510000021
艾那度胺
Figure BDA0003319880510000022
泊马度胺
Figure BDA0003319880510000023
和咪喹莫特
Figure BDA0003319880510000024
)的免疫应答的非特异性刺激，主动免疫以刺激或增强特异性抗癌免疫应答(例如使用癌症疫苗，诸如用于预防宫颈癌的HPV疫苗
Figure BDA0003319880510000025
和
Figure BDA0003319880510000026
用于治疗前列腺癌的Sipuleucel-T
Figure BDA0003319880510000027
和用于治疗膀胱癌的Bacillus Calmette-Guérin(BCG)疫苗)，以及抗体的被动转移或激活的免疫细胞的被动转移(即过继性细胞疗法(ACT)，例如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法)。已开发为癌症免疫疗法的抗体包括，例如，免疫检查点抑制剂抗体(例如靶向CTLA-4、PD-1或PD-L1)和靶向癌细胞上的分子以诱导对癌细胞的免疫应答的抗体(例如抗CD52抗体)。
然而，尽管癌症免疫疗法已为癌症治疗提供了一个扩展的工具箱，并且对某些患者非常有效，但许多患者并没有从目前批准的癌症免疫疗法受益。除了原发性无反应外，许多患者对目前的免疫检查点阻断抗体产生抗药性。因此，仍然需要促进免疫功能和增强免疫疗法(如癌症免疫疗法和其他免疫疗法)的有效性的方法和组合物。
发明概述
本公开源于出乎预料的发现，即DNAX辅助分子-1(DNAM-1；CD226)是肿瘤中的T细胞功能必不可少的。发明人确定了DNAM-1信号传导诱导DNAM-1的下调并限制或降低T细胞的抗肿瘤活性。相反，维持或增加DNAM-1的表面表达增强T细胞的功能并提高抗肿瘤活性。维持或增加表面表达可以通过例如靶向(例如，突变或消除)人DNAM-1的322位的酪氨酸、靶向(例如，突变或消除)人DNAM-1的324-327位的AP2结合基序；靶向(例如，突变或消除)在对应于人DNAM-1的282-287位的位置的AP-2结合基序；靶向(例如，突变或消除)人DNAM-1的位320-323的Cbl-b结合基序；和/或靶向(例如，突变或消除)人DNAM-1的295位和/或333位的赖氨酸(相对于SEQ ID NO:1中列出的前体人DNAM-1进行编号)来实现。因此，以这种方式具有一处或更多靶向多肽的修饰的修饰的DNAM-1多肽可以在T细胞中表达时与在T细胞中表达的野生型DNAM-1(例如，T细胞中表达的内源性野生型DNAM-1多肽)相比呈现出增加的细胞表面保留或表达。这对于癌症疗法并且特别是癌症免疫疗法具有重要意义。具体地，并且如本文首次描述的，本公开的表达重组和/或修饰的DNAM-1多肽的T细胞(包括CAR T细胞)可以过继性转移至受试者来治疗受试者的癌症，作为独立治疗或结合其他癌症疗法。表达内源性DNAM-1(包括高水平的内源性DNAM-1)的T细胞也可以分离用于随后过继性转移至癌症受试者。还可以利用表达DNAM-1的T细胞增强的免疫功能，用于治疗受试者的感染。本公开的表达重组和/或修饰的DNAM-1多肽的T细胞可以过继性转移至受试者来治疗受试者的感染，作为独立治疗或结合其他疗法。表达内源性DNAM-1的T细胞可以分离用于随后过继性转移至感染的受试者，用于治疗感染。如本文证明的，DNAM-1也是T细胞免疫功能、癌症存活以及对癌症疗法的反应性的生物标志物。
因此，在一个方面中，本文提供了包含修饰的DNAM-1多肽的T细胞，其中修饰的DNAM-1多肽与野生型DNAM-1多肽相比，呈现出增加的在细胞表面上的保留，或增加的细胞表面表达；并且其中T细胞是人T细胞。
在一些实施方案中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置的酪氨酸修饰。修饰可以是例如氨基酸置换或缺失，如用苯丙氨酸置换酪氨酸。
在更多实施方案中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325-328位的位置的AP-2结合基序YXXF的修饰，其中该修饰消除了AP-2结合基序YXXF。例如，修饰的DNAM-1多肽可以包含在对应于SEQ ID NO:1的325位的位置的酪氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO:1的328位的位置的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ IDNO:1的325、326或327位的任一个位置后的氨基酸插入；和/或在对应于326和327位的位置的一个或多个残基的缺失。
在其他实施方案中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282-287位的位置的AP-2结合基序EXXXLF的修饰，其中该修饰消除了AP-2结合基序EXXXLF。例如，修饰的DNAM-1多肽可以包含在对应于SEQ ID NO:1的282位的位置的谷氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO的286位的位置的亮氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO:1的287位的位置的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO:1的282-286的位置的任一个或多个残基后的氨基酸插入；和/或在对应于SEQ ID NO:1的283、284和285位的位置的一个或多个残基的缺失。
在再一个实施方案中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320-322位的位置的Cbl-b结合基序((D/N)XpY)的修饰，其中该修饰消除了Cbl-B结合基序。在一些实例中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320位的位置的天冬氨酸的氨基酸缺失或置换；和/或在对应于SEQ ID NO:1的320和/或321位的位置后的氨基酸插入。
在其他实施方案中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于295位的位置的赖氨酸的氨基酸置换或缺失；和/或在对应于SEQ ID NO:1的333位的位置的赖氨酸的氨基酸置换或缺失。
在再一个方面中，本公开提供了包含重组DNAM-1多肽的T细胞，其中DNAM-1多肽没有融合到、或不包含异源胞内信号结构域；并且T细胞包含内源性T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置的酪氨酸的修饰。在其他方面中，提供了包含重组DNAM-1多肽的T细胞，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置的酪氨酸的修饰，其中T细胞是人T细胞。这些方面中的在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置的酪氨酸的修饰可以是氨基酸置换或缺失，例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸。
在每个上述涉及T细胞的方面的一些实施方案中，DNAM-1多肽缺乏全部或部分胞质结构域。在其他实施方案中，DNAM-1多肽包含全部或部分胞外结构域；IgG1结构域；和/或IgG2结构域。
在特定的实例中，DNAM-1多肽包含SEQ ID NO:5-9或21-30的任一个中列出的氨基酸序列，或与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中DNAM-1多肽不包含与野生型DNAM-1多肽相同的序列(即，与野生型多肽，诸如野生型人DNAM-1多肽(例如，SEQ ID NO:1或2中列出的序列)具有小于100％序列同一性)。
在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其他实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。T细胞可以是αβT细胞或γδT细胞。在特定的实例中，T细胞源自从人受试者分离的原代人PBMC。
在一些实施方案中，T细胞包含重组TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)，例如，T细胞可以是CAR-T细胞。在一些实例中，CAR结合选自TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖酰单唾液酸神经节苷酯、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MART-1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1的肿瘤抗原。
还提供了包含本公开的T细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以进一步包含化疗剂(例如，免疫检查点抑制剂，如CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂)或抗感染剂(例如，抗生素、抗阿米巴剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗疟疾剂、抗结核剂或抗病毒剂)。
本公开的再一个方面涉及用于制备用于过继性细胞疗法的T细胞群的方法，包括：从受试者获得T细胞样品；从样品选择DNAM+T细胞；和扩增DNAM+T细胞以产生用于过继性细胞疗法的T细胞群。在一些实施方案中，该方法包括选择DNAM+CD8+T细胞和/或DNAM+CD4+T细胞。在特定实例中，该方法进一步包括将DNAM+T细胞工程化来表达CAR或转基因TCR。因此还提供了由该方法产生的T细胞群。
在另一个方面中，提供了提高受试者的免疫功能的方法，包括将本公开的T细胞(例如，表达如本文所述的重组和/或修饰的DNAM-1多肽的T细胞)、本公开的药物组合物或本公开的T细胞群给药于受试者。
在再一个方面中，提供了用于治疗受试者癌症的方法，包括将本公开的T细胞(例如，表达如本文所述的重组和/或修饰的DNAM-1多肽的T细胞)、本公开的药物组合物或本公开的T细胞群给药于受试者。在一些实例中，该方法进一步包括将化疗剂(例如，免疫检查点抑制剂，如CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂)给药于受试者。在一些实例中，其中癌症是皮肤癌(例如，黑素瘤)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、肾癌、食道癌、前列腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、神经母细胞瘤或肝细胞癌。在更多实例中，癌症在给药T细胞或药物组合物前对一种或多种免疫检查点抑制剂是耐药性的。在特定的实施方案中，T细胞是自体的。在其他实施方案中，T细胞是同种异体的。
在另一个方面中，提供了用于治疗受试者感染的方法，包括将本公开的T细胞(例如，表达如本文所述的重组和/或修饰的DNAM-1多肽的T细胞)、本公开的药物组合物或本公开的T细胞群给药于受试者。在一些实施方案中，感染是病毒和/或细菌感染。感染可以是急性感染或慢性感染。在一些实施方案中，该方法进一步包括将抗感染剂给药于受试者(例如，抗生素、抗阿米巴剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗疟疾剂、抗结核剂或抗病毒剂)。在特定的实施方案中，T细胞是自体的。在其他实施方案中，T细胞是同种异体的。
还提供了本公开的T细胞(例如，表达如本文所述的重组和/或修饰的DNAM-1多肽的T细胞)、本公开的药物组合物或本公开的T细胞群用于制备用于治疗受试者癌症、治疗受试者感染和/或增强受试者免疫功能的药物的用途。
本公开的再一个方面涉及用于评估T细胞或T细胞群在受试者中的免疫功能的方法，包括评估来自受试者的样品中的T细胞群中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平，并将来自受试者的样品中的T细胞群中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平与对照样品中的一个T细胞或一群T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平进行比较。在一些实例中，评估样品中一群T细胞中的T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平包括检测样品中DNAM1+T细胞的数量或百分比。在一个实施方案中，对照样品包含具有正常或有效免疫功能的T细胞，并且与对照样品中T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平相比，来自受试者的样品中的一群T细胞中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平降低指示受试者中的T细胞或T细胞群的免疫功能受损或无效。在其他实施方案中，该方法包括从受试者获得样品，其中该样品包含一个T细胞或T细胞群；将样品与结合T细胞表面上的DNAM-1的结合剂(抗DNAM-1抗体)接触；并在结合剂结合T细胞群中的一个或多个T细胞时对其检测，由此评估来自受试者的样品中的T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平，或DNAM+T细胞的百分比。在一些实例中，受试者患有癌症或患有感染。在一些实施方案中，进一步给予受试者治疗，如化疗剂或抗感染剂。
本公开的另一个方面涉及用于预测癌症受试者将响应免疫检查点抑制剂治疗的可能性的方法，包括检测来自受试者的样品(例如，肿瘤样品，使得T细胞是肿瘤浸润T细胞)中的DNAM-1+CD8+T细胞的数量或百分比，并将来自受试者的样品中的DNAM-1+CD8+T细胞的数量或百分比与参照水平或含量进行比较。在特定实施方案中，检测了作为样品中总CD8+T细胞的一定百分比的DNAM-1CD8+T细胞。在一些实施方案中，在预测受试者响应治疗的情况中，进一步给予受试者免疫检查点抑制剂治疗。在一些实施方案中，在预测受试者不响应治疗的情况中，给予受试者治疗以提高反应性，例如，施用本公开的T细胞。
还提供了修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的325-328位的位置的AP-2结合基序的修饰，其中该修饰消除了AP-2结合基序YXXF。在一些实例中，DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325位的位置的酪氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ IDNO:1的328位的位置的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO:1的325、326或327位的任一个位置后的氨基酸插入；和/或在对应于326和327位的位置的一个或多个残基的缺失。
在另一个方面中，提供了修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的282-287位的位置的AP-2结合基序EXXXLF的修饰。在一些实例中，修饰的DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282位的位置的谷氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO的286位的位置的亮氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO:1的287位的位置的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；在对应于SEQ ID NO:1的282-286的位置的任一个或多个残基后的氨基酸插入；和/或在对应于SEQ ID NO:1的283、284和285位的位置的一个或多个残基的缺失。
在再一个方面中，提供了修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的320-322位的位置的Cbl-b结合基序((D/N)XpY)的修饰，其中该修饰消除了Cbl-B结合基序。在一个实例中，DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320位的位置的天冬氨酸的氨基酸缺失或置换；和/或在对应于SEQ ID NO:1的320和/或321位的位置后的氨基酸插入。
在另一个方面中，提供了修饰的DNAM-1多肽，其包含在SEQ ID NO:1的对应于295位的位置的赖氨酸和/或对应于333位的位置的赖氨酸的修饰(例如，氨基酸置换或缺失)。
在特定的实施方案中，本公开的修饰的DNAM-1多肽在T细胞中表达时与野生型DNAM-1多肽在T细胞表达时相比具有提高的细胞表面表达或保留。在一些实施方案中，修饰是相对于SEQ ID NO:1或2中列出的野生型人DNAM-1多肽。
附图简述
图1是显示了肿瘤生长C57BL/6J(WT)小鼠和DNAM-1缺陷(CD226KO)小鼠的图示。A.WT或CD226KO小鼠中的B16F10黑素瘤的平均肿瘤生长曲线(n＝7/组，平均±SEM，显示了两个实验的代表性结果)。B.WT或CD226KO小鼠的平均肿瘤生长曲线(n＝8/组，平均±SEM，显示了两个实验的代表性结果)。C.WT或CD226KO小鼠中的MC38-OVAdim的平均肿瘤生长曲线(n＝7-9/组，平均±SEM，显示了两个实验的代表性结果)。D.WT或CD226KO小鼠中的MC38-OVAhi的平均肿瘤生长(n＝7-10/组，平均±SEM，显示了两个实验的代表性结果)。*＝p<0.05，**＝p<0.01，****＝p<0.0001，student’s t-检验。
图2显示了代表性流式细胞术直方图，显示了来自荷瘤WT小鼠的CD8+TIL上的CD226表达(左图和相应的CD226子集量化(右图，n＝15，平均±SD，显示了三个实验的累积结果)。A.B16F10肿瘤。B.MC38肿瘤。C.MC38-OVAdim肿瘤。D.MC38-OVAhi肿瘤。
图3显示了在整个指定的CD226亚组的WT小鼠肿瘤中IFN-γ+、TNF-α+颗粒酶-B+和Ki67+CD8+TIL的相应流式细胞术定量。A.B16F10肿瘤(对于IFN-γ和TNF-α，n＝15，对于GrzB，n＝12，对于Ki67，n＝10，显示了两个实验的累积结果，代表三个独立实验)。B.MC38-OVAdim肿瘤(n＝10，显示了1-3次实验的代表性结果)。单向ANOVA和post-hoc Tukey’s用于多重比较；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。
图4显示了代表性的流式细胞术等高线图，显示了活肿瘤浸润CD8+PD-1+TIM3+和CD8+PD-1+TIM3+TIGIT+LAG3+T细胞(上排)以及相应的IFN-γ产量定量(n＝10，平均±SD，实验进行一次)。使用posthoc Tukey’s单向ANOVA进行多重比较；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。
图5是显示Y319对T细胞功能的重要性的图示。(A)WT和CD226Y小鼠中MC38-OVAdim肿瘤的个体生长曲线(n＝11WT和n＝12CD226Y小鼠，显示了三个实验的代表性结果)。(B)饼图显示了WT和CD226Y小鼠(n＝30WT和n＝31CD226Y小鼠，显示三个实验的累积结果)中存活(绿色)和死亡小鼠(黑色)的数量。(C)(A)中所示实验的相应Kaplan-Meier存活曲线。(D)WT和CD226Y小鼠中MC38-OVAhi肿瘤的个体肿瘤生长曲线(n＝17(Y)-21(WT)，显示了两个中的一个代表性实验)。(E)饼图显示WT和CD226Y小鼠中存活(绿色)和死亡小鼠(黑色)的数量。(n＝57WT和n＝52CD226Y小鼠，显示了两个实验的累积结果)。(F)相应的Kaplan-Meier存活曲线。(G)携带Vk12598多发性骨髓瘤的WT和CD226Y小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝10/组；实验进行了一次)。(H)来自CD226KO、WT或CD226Y小鼠的静息脾CD8+T细胞中的CD226 MFI的流式细胞术定量(n＝6，平均值±SD)。(I)代表性流式细胞术直方图，显示了来自MC38-OVAdim肿瘤的CD8+TIL上的CD226表达。(J)相应的条形图，显示了WT和CD226Y CD8+T细胞中指定的CD226子集的平均频率(左)和单个小鼠中CD8+CD226hi T细胞的频率(右，n＝10，平均值±SD，显示了两个实验的代表性结果)。(K)从WT或CD226Y小鼠的MC38-OVAdim肿瘤分离的CD226neg(左)和CD226dim(右)CD8+T细胞的流式细胞术定量(n＝10/组，平均±SD，显示了两个实验的代表性结果)。(L)IFN-γ+CD8+TIL的流式细胞术定量(n＝18，平均±SD，显示了两个实验的累积结果)。(M)代表性流式细胞术等高线图，显示了活肿瘤浸润CD8+OVA-四聚体+T细胞(左)以及WT和CD226Y小鼠中CD8+四聚体neg和CD8+OVA-四聚体+T细胞中CD226hi T细胞的定量(右，n＝10，平均±SD，显示了两个实验的代表性结果)。(N)CD8+OVA-四聚体+TIL中IFN-γ+的流式细胞术定量(n＝10，平均±SD，一个实验的代表性结果)。(O)由CBA确定的肿瘤组织裂解物中IFN-γ和TNF-α的量化(n＝10，平均±SD，显示了两个实验的代表性结果)。统计：Fisher’s精确检验(B、E)、存活曲线的对数秩(Mantel-Cox)检验(C、F)、单因素ANOVA和posthoc Tukey’s用于多重比较(H、J)；、Student’s t-检验(I、K、L)；*p<0.05，**p<0.01，和****p<0.0001。
图6提供了显示肿瘤浸润CD8+T细胞中CD226的丢失是由CD155介导的结果。(A)CD8+CD226neg TIL的频率与B16F10肿瘤重量(以mg计)的相关性(n＝10，显示了两个实验的代表性结果)。(B)CD8+CD226neg TIL的频率与MC3-OVAdim肿瘤重量(以mg计)的相关性(n＝21，显示了两个实验的代表性结果)。(C)代表性流式细胞术直方图，显示了在存在或不存在板结合的小鼠CD155-Fc以及存在或不存在α-CD155阻断抗体的情况下未经处理的或用板结合的抗CD3刺激的WT脾CD8+T细胞中的CD226表达(顶部)和相应的量化(底部)。(n＝6，平均±SD，显示了两个实验的代表性结果)。(D)CD226内化测定：代表性荧光ImageStream图片显示了用对照IgG(IgG)或CD155-Fc处理的WT(顶部)或CD226Y(底部)CD8+T细胞的CD226表面(红色)和CD226胞内(黄色)染色(左)和相应的胞内CD226 MFI定量(右，n＝100个细胞，平均值±SEM，显示了两个实验的代表性结果)。(E)评估肿瘤和宿主细胞CD155对TIL中的CD226表达影响的实验布局(左)。WT和CD155KO小鼠注射了B16F10Ctrl或B16F10CD155KO细胞，并在接种14天后评估CD8+TIL上的CD226表达(右，n＝7WT→WT，n＝9WT→KO，n＝10KO→WT和n＝8KO→KO，平均±SD，显示了三个实验的代表性结果)。(F)评估CD226Y在CD155介导的CD226下调中的影响的实验布局(左)。WT和CD226Y小鼠注射了B16F10Ctrl或B16F10CD155KO细胞，并在接种14天后评估CD8+TIL上的CD226表达(右，n＝5WT→WT，n＝8WT→CD226Y，n＝9KO→WT和n＝6KO→CD226Y，平均±SD，显示了两个实验的代表性结果)。(G)与(F)相同的实验。WT和CD226Y小鼠注射了B16F10Ctrl或B16F10CD155KO细胞，并在接种14天后对于CD226dim(左)和CD226high(右)评估CD8+TIL上的CD226表达(n＝5WT→WT，n＝8WT→CD226Y，n＝9KO→WT和n＝6KO→CD226Y，平均±SD，显示了两个实验的代表性结果)。统计：Pearsons相关性与线性回归(A和B)，单因素ANOVA和post-hoc Tukey’s用于进行多重比较(C、D、E、F和G)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。
图7是过继性转移实验的方法和结果的图形和示意图。(A)CD226+
(DNAM-1+)和CD226-(DNAM-1-)CD8+T细胞过继性转移到携带B16F10黑素瘤的小鼠中。在第9天，将5×105个DNAM-1+或DNAM-1-gp100特异性CD8+T细胞经静脉转移，并结合单次注射编码gp100的腺病毒疫苗。在第12、14和16天，小鼠接受了瘤内聚I:C/CpG。结果使用Kaplan-Meier-曲线呈现(n＝14只小鼠/组，来自2个独立实验的汇总数据)。****＝p<0.0001，对数秩检验。(B)ACT免疫疗法治疗携带HCmel12hgp100的WT小鼠的实验方案，其给WT过继性转移了WT、CD226KO或CD226Y Pmel-1 T细胞(Cy＝环磷酰胺)。(C-E)瀑布图显示了对于(C)WT.Pmel-1(n＝46)、(C)CD226KO.Pmel-1(n＝34)和(E)CD226Y.Pmel-1 T细胞(n＝42)的ACT治疗后第14天的HCmel12hgp100肿瘤面积相对于治疗前的变化百分比(PD＝进展性疾病、PR＝部分应答和CR＝完全应答)。(F)相应的饼图显示了用指定的Pmel-1 T细胞处理的存活(绿色)和死亡小鼠(黑色)的数量(显示了三个实验的累积结果)。(G)用WT.、CD226KO.或CD226Y.Pmel-1 T细胞治疗的携带HCmel12hgp100 WT小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝46WT.Pmel-1，n＝34CD226KO.Pmel-1和n＝42CD226Y.Pmel-1 T细胞，显示了三个实验的累积结果)。(H)流式细胞术分析显示了肿瘤浸润CD8+CD90.1+CD226hi WT或CD226Y.Pmel-1 T细胞的频率(n＝6WT.和n＝8CD226Y.Pmel-1，平均±SD，实验进行了一次)。(I)流式细胞术分析显示了IFN-γ+肿瘤浸润WT或CD226Y CD8+CD90.1+Pmel-1 T细胞的频率(n＝10(WT.Pmel-1)-13(CD226Y.Pmel-1)，平均±SD，显示了两个实验的累积结果)。(J)评估逆转录病毒超表达CD226对ACT功效影响的实验方案。分离WT.Pmel-1 T细胞并通过逆转录病毒转导空载体(MOCK)或CD226，并过继性转移到携带HCmel12hgp100的WT小鼠中。(K)相应的瀑布图显示了ACT后第14天HCmel12hgp100肿瘤面积相对于治疗前的变化百分比(PD＝进展性疾病、PR＝部分应答和CR＝完全应答)(n＝11MOCK.Pmel-1和n＝12CD226.Pmel-1，实验进行了一次)。统计：Fishers精确检验(F)，用于存活曲线的未配对双尾Student’s t-检验(H、I)对数秩(Mantel-Cox)检验的；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。
图8呈现了评估CD226(DNAM-1)对免疫检查点阻断(ICB)功效的重要性的研究结果。(A)施用抗PD-1抗体的WT或CD226KO(DNAM-1KO)小鼠的平均肿瘤大小。给5-6只C57BL/6WT或DNAM-1KO小鼠的组皮下(s.c.)注射MC38结肠腺癌细胞(1×105个细胞)。相对于肿瘤接种的第0天，小鼠组在第10、12、14和16天接受了250μg cIg或抗PD1(RMP1-14)mAb。WT小鼠组在第9、10、14、17、20和24天接受cIg或抗DNAM-1mAb(250μg i.p.)。在指定时间使用数显卡尺测量了皮下原发性肿瘤生长，并表示为平均肿瘤大小+SEM。(B)瀑布图显示了WT、CD226KO和CD226Y小鼠中抗PD1治疗后第14天MC38-OVAdim肿瘤面积相对于治疗前的变化百分比(PD＝进展性疾病、PR＝部分应答和CR＝完全应答)(n＝9WT，n＝9CD226KO和n＝8CD226Y，代表两个实验)。(C)相应的Kaplan-Meier存活曲线(对于抗PD1，n与(B)中的相同，对于cIg，n＝8WT，n＝9CD226KO和n＝8CD226Y，两个实验的代表性结果)。(D)按指示治疗的WT或CD226Y小鼠中B16F10黑色瘤的平均肿瘤生长曲线(n＝10(WT+cIg和WT+抗PD-1/抗CTLA-4)；n＝7(CD226Y+cIg)；n＝8(CD226Y+抗PD-1/抗CTLA-4，平均±SEM，显示了两个实验的代表性结果))。统计：对数轶(Mantel-Cox)检验用于存活曲线，对数轶(Mantel-Cox)检验用于存活曲线；双因素ANOVA和post-hoc Tukey’s用于多重比较(D)；*p<0.05，***p<0.001和****p<0.0001。
图9显示了T细胞上的CD226(DNAM-1)表达谱。(A)代表性流式细胞术直方图，显示了从健康供体PBMC中分离出的静息和激活的CD8+T细胞随时间推移的CD226表达(左)和相应的CD226 MFI定量(右，n＝4个供体，平均±SD，显示了两个独立实验的代表性结果)。(B)Nanostring分析显示了在指定刺激后健康供体PBMC中IFNG和GZMB的相对表达。(C)代表性流式细胞术直方图，显示了从HNSCC患者分离的CD8+肿瘤浸润T细胞中的CD226表达(左)和相应的量化(右，n＝10，平均±SD)。(D)代表性流式细胞术等高线图，显示了CD226子集中的IFN-γ+细胞(左)和相应的定量(右；n＝10)。(E)显示了CD226子集中的TNF-α+细胞(左)和相应定量(右；n＝10)的相应数据。(F)显示了CD226子集中的Ki67+细胞(左)和相应定量(右；n＝10)的相应数据。(G)Kaplan-Meier存活曲线，显示了具有高CD226(上四分位数)和低CD226(下四分位数)基因表达的HNSCC(左)和SKCM(右)患者的存活概率。统计数据：单因素ANOVA和posthoc Tukey’s用于多重比较(D-F)；*p<0.05，**p<0.01，***和p<0.001。
图10提供了研究结果，显示了CD155参与CD226(DNAM-1)下调。(A)代表性流式细胞术直方图，显示了指定的CHO细胞中的CD155表达。(B)代表性流式细胞术直方图，显示了来自健康供体PBMC的用CHO-OKT3或CHO-OKT3-CD155细胞共培养3h孵育的预激活CD8+T细胞中的CD226表达。(C)CD226随时间表达的相应定量(n＝3个健康供体PBMC的累积结果)。(D)代表性直方图，显示了指定的CHO-OKT3细胞中的CD155表达(左)以及用与指定细胞孵育3h的来自健康供体PBMC的CD8+T细胞中的CD226丢失的量化(右)。(E)与CHO-OKT3或CHO-OKT3-CD155细胞和递增含量的抗CD155阻断抗体孵育的CD8+T细胞中CD226表达的流式细胞术分析(n＝3个健康供体PBMC的代表性结果)。(F)评估黑素瘤样品的CD155表达和CD226+CD8+T细胞的浸润。(G)在缺乏/低(n＝9)和高(n＝15)CD155表达的黑素瘤(n＝24，平均±SD)中，CD226+CD8+对总CD8+T细胞的比率和相应定量。统计：未配对的双尾Student’s t-检验(G)；**p<0.01。
图11表示研究CD8+T细胞中DNAM-1表达与黑素瘤患者应答癌症免疫疗法之间的相关性的研究结果。(A)评估前-ICB黑素瘤样品的CD226+CD8+T细胞浸润以及与反应和存活的相关性。(B)上排：按照应答，CD226+CD8+与总CD8+T细胞的高低比率的列联表。应答者定义为CR和SD/PR，PFS>12个月；无反应者定义为PD和SD/PR，PFS<12个月。下排：Kaplan-Meier存活曲线，显示了接受免疫疗法治疗的黑素瘤患者的无进展存活，其中高(>0.07；蓝色)和低(<0.07；红色)比率的CD226+CD8+/CD8+T细胞由多重IHF确定的(n＝31名患者)。(C)上排：按照应答的高和低计数的CD8+T细胞的列联表。应答与(B)中的定义相同。下排：Kaplan-Meier存活曲线，显示了接受免疫疗法治疗的黑素瘤患者的无进展存活，其中高(>289；蓝色)和低(<289；红色)CD8+T细胞浸润计数(n＝31名患者)由多重IHF确定。统计：Fisher’s精确检验(B，C)，用于存活曲线的对数轶(Mantel-Cox)检验(B，C)。
图12表示评估泛素连接酶E3 Cbl-2是否参与DNAM-1泛素化和内化的研究的结果。评估来自野生型小鼠或带有导致泛素连接酶功能废除的CBL-B基因点突变的小鼠(Cbl-bKI小鼠)的脾脏的CD8+T细胞在刺激后的DNAM-1(CD226)表面表达，所述刺激使用CD3/CD28珠或CD3/CD28/CD155-Fc珠在含有IL-2(50IU/ml hIL-2)的cRPMI培养基的中进行16小时。直方图来自活的CD8+T细胞。
一些图包含颜色表示或实体。彩色示意图可根据要求从申请人或从适当的专利局获得。如果从专利局获得，可能会收取费用。
发明详述
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代该冠词语法对象的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文提及“约”一个值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
如本文所用，“激活”是指细胞在充分连接细胞表面部分以诱导显著的生化或形态变化之后的状态。在T细胞的情况中，这种激活是指T细胞已被充分刺激以诱导细胞增殖的状态。T细胞的激活还可以诱导细胞因子产生和可检测的效应子功能，包括调节或细胞溶解效应子功能的表现。
术语“激活的T细胞”表示当前正经历细胞分裂的、具有可检测的效应子功能(包括细胞因子产生)、执行调节或细胞溶解效应子功能和/或最近已经经历“激活”过程的T细胞。
术语“试剂”包括诱导所需的药理和/或生理效应的化合物。该术语还包括本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的和药学上活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。使用以上术语时，则理解这包括活性剂本身以及药学上可接受的、药学上活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。没有狭窄地解释术语“试剂”，但延伸至小分子、蛋白质分子(如肽、多肽和蛋白质)以及包含它们的组合物，和遗传分子，如RNA、DNA和模拟物及其化学类似物以及细胞试剂。术语“试剂”包括能够产生和分泌本文所指的多肽的细胞以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“试剂”延伸至核酸构建体，包括用于在一系列细胞中表达和分泌的载体，如病毒或非病毒载体、表达载体和质粒。
多肽或多核苷酸的“含量”或“水平”是样品中可检测的水平。这些可以通过本领域技术人员已知的以及还有本文中公开的方法来测量。
如本文所用，“和/或”是指包括一个或多个相关列出的项目的任意和所有可能的组合，以及以替换(或)解释时缺少组合。
术语“激动剂”或“抑制剂”是指防止、阻断、抑制、中和或降低另一种分子(如受体)的生物活性或效应的物质。
如本文所用，术语“抗体”表示包含至少一个与特定抗原特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，通过二硫键互连的两条重(H)链和两条轻(L)链，及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(其可以缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条重链包含轻链可变区(其可以缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，穿插更保守的称为框架区(FR)的区。每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，以以下顺序从氨基-末端排列到羧基-末端：FR1、CDR1、FR1、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，本发明的抗体的FR(或其抗原结合部分)与人种系序列相同，或可以是天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可以基于两个或多个CDR的并排分析来限定。
抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定的类别。根据其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配给不同的类别。存在五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成压裂(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的。
如本文所用，术语“抗原”及其语法等价表述(例如，“抗原的”)是指被特定的体液或细胞免疫的产物特异性结合的化合物、组合物或物质，如抗体分子或T细胞受体。抗体可以是任何类型的分子，包括，例如，半抗原、简单的中间代谢物、糖类(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子，如复合碳水化合物(例如多糖)、磷脂和蛋白质。
术语“抗原结合结构域”是指参与抗原结合的抗原结合分子的区域或部分。这些术语包括任何天然出现的、通过酶可获得的、合成的或遗传工程化的特异性地结合抗原以形成复合物的多肽或糖蛋白。例如，可以使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选恒定结构域的DNA的操纵和表达的重组遗传工程技术，从完整的抗体分子产生抗体的抗原结合片段。这样的DNA是已知的和/或可以容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如，噬菌体-抗体文库)获得，或可以是合成的。可以将DNA测序并通过化学或通过使用分子生物学技术来操纵，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域安排成合适的构造，或引入密码子、形成半胱氨酸残基、改变、增加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或约束的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、单臂抗体、双抗、三抗、四抗、迷你抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也包括如本文所用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任何大小或氨基酸组成并且通常将包含至少一个CDR，该CDR邻近一个或多个框架序列或在一个或多个框架序列的框架中。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此放置。例如，可变区可以是二聚的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性的、示例性的构造包括(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3，(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2，(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构造中，包括以上列出的任一个示例性构造，可变结构域和恒定解耦古语可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链区或接头区来连接。铰链区可以由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其在单个多肽分子中的邻近可变和/或恒定结构域之间形成柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含以上列出的任一个可变和恒定结构域构造彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如，通过二硫键)以非共价结合的同型二聚体或杂二聚体(或其他多聚体)。多特异性抗原结合分子通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合分开的抗原或同一抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，任何多特异性抗原结合分子格式可以适用于本公开的抗体的抗原结合片段的内容中。
“抗原结合分子”表示对靶抗原具有结合亲和性的分子。将理解这个术语延伸至呈现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。本发明实践中有用的代表性抗原结合分子包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段。
如本文使用的，术语“结合”、“特异性结合”或“对……特异性的”是指可测量的和可再现的相互作用，如靶标和抗体之间的结合，其是包括生物分子的异源分子群存在下靶标存在的决定因素。例如，结合或特异性结合靶标(其可以是表位)的抗体是与结合其他靶标相比以更高的亲和性、亲和力、更容易地和/或更高的持续时间结合这个靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体与不相关靶标的结合程序低于抗体结合靶标的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合在来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不需要排他的结合。
如本文所用的术语“生物标志物”是指可以在样品中检测的指示剂，例如，预测、诊断和/或预后。生物标志物可以作为特定表型的指示剂，通过某些分子病理、组织学和/或临床特征来表征。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物、基于糖脂的分子标志物和包含上述任一个的细胞。
术语“癌症”和“癌”是指或描述受试者的生理状况，其特征在于通常以不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃的或胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾的癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞NHL大块病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和Waldenstrom’s巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，以及与显性细胞瘤相关的异常血管增殖、水肿(如与脑肿瘤相关的)、Meigs’s综合征、脑以及头颈癌，和相关转移。在某些实施方案中，适合用本发明抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结直肠癌(CRC)和肝细胞癌。仍然，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移形式。
“化疗剂”包括癌症治疗中使用的化合物。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指在免疫效应细胞中时给细胞提供对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性并产生胞内信号的分子。在一些实施方案中，CAR包含至少胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(在本文也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含源自如以下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面中，多肽组是彼此连接的。
在这整个说明书中，除非文中另外需要，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。因此，术语“包含”等的使用表示所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是可选的并且可能存在或可能不存在。“由……组成”是指包括并限于“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且可能不存在其他元素。“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于公开中针对所列元素指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的，并且可能存在或不存在取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
如本文所用，“相应氨基酸残基”(或位置)及其语法变化是指在蛋白质的一级氨基酸序列内的比对基因座出现的残基(或位置)。通过本领域技术人员已知的任何方法来比对相关或变体多肽。这样的方法通常最大化匹配，并且包括如使用手动比对和使用可用的各种算法程序(例如，BLASTP)的方法以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽的序列，本领域技术人员可以使用保守的和相同的氨基酸残基作为指引来鉴定相应的残基。例如，通过将SEQ ID NO:1中列出的人DNAM-1多肽的序列与SEQ ID NO:3中列出的小鼠DNAM-1多肽进行比对，本领域技术人员使用保守的和相同的氨基酸残基作为指引，可以鉴定相应的残基，例如，SEQ ID NO:1的Y322对应于SEQ ID NO:3的Y319。因此，例如，参考包含在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置的酪氨酸修饰的DNAM-1多肽包括参考比对SEQ IDNO:1中列出的DNAM-1多肽时在对应于(即，与其比对)SEQ ID NO:1的氨基酸位置322的氨基酸位置具有酪氨酸修饰的任何DNAM-1多肽。
如本文所用，术语“细胞溶解活性”和“细胞毒性活性”在本文可互换使用，并且是指细胞(例如，CD8+细胞或NK细胞)裂解靶细胞的能力。这样的活性可以使用标准技术来测量，例如，通过放射性地标记靶细胞来测量。
术语“检测”包括任何方式的检测，包括直接和间接检测。
术语DNAM-1和CD226在全文中可互换使用。
如本文所用的术语“DNAM-1多肽”或“CD226多肽”是指包含对应于天然产生的DNAM-1多肽的氨基酸序列的多肽。该术语包括，不限于，前体
DNAM-1多肽，如SEQ ID NO:1(人)和SEQ ID NO:3(小鼠)中列出的那些，以及成熟DNAM-1多肽(即，缺乏N-末端信号序列)，如SEQ ID NO:2(人)和SEQ ID NO:4(小鼠)中列出的。术语“DNAM-1多肽”还包括，不限于，具有与SEQ ID NO:1或2中所列的序列共享至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽(在SEQ ID NO:1或2的整个序列中或包含SEQ IDNO:1或2中所列序列的至少100、150、200、250或300个氨基酸的序列)。示例性DNAM-1多肽还包括修饰的DNAM-1多肽。如本文所用，“修饰的DNAM-1多肽”是指具有如下氨基酸序列的DNAM-1多肽，所述氨基酸序列相对于野生型DNAM-1多肽(例如，野生型人DNAM-1多肽，如SEQID NO:1或2中列出的)含有一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加，即，修饰的DNAM-1多肽是相对于野生型或参照序列修饰的。通常，修饰的DNAM-1多肽保留至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的与野生型或参照DNAM-1多肽(例如，SEQ ID NO:1或2中列出的野生型人DNAM多肽)的序列同一性。在一些实例中，修饰的DNAM-1多肽是“修饰的人DNAM-1多肽”，其是相对于野生型人DNAM-1多肽(如SEQ ID NO:1或2中列出的野生型人DNAM多肽或其功能性片段)具有一个或多个修饰的修饰DNAM-1多肽。通常，修饰的人DNAM-1多肽包含与SEQ ID NO:1或2中列出的序列至少85％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(在SEQ ID NO:1或2的整个序列中或包含SEQ ID NO:1或2中所列序列的至少100、150、200、250或300个氨基酸的序列)。修饰的DNAM-1多肽的非限制性实例包括在对应于SEQ ID NO:1的322位的氨基酸位置包含酪氨酸修饰的那些，如Y322F修饰；在对应于SEQ ID NO:1的329位的氨基酸位置包含丝氨酸修饰的那些，如S329A修饰；和在对应于SEQ ID NO:1的322位的氨基酸位置包含酪氨酸修饰和在对应于SEQ ID NO:1的329位的氨基酸位置包含丝氨酸修饰的那些；如Y322F和S329A修饰；AP-2基序中的修饰；Cbl-b基序中的修饰；在对应于SEQ ID NO:1的295和/或333位的位置的赖氨酸修饰；和/或在对应于SEQ ID NO:1的282位的位置的谷氨酸修饰，在对应于SEQ ID NO:1的286位的位置的亮氨酸修饰和/或对应于SEQ ID NO:1的287位的位置的苯丙氨酸修饰。在更多实例中，本发明的修饰DNAM-1多肽是缺乏野生型DNAM-1多肽的全部或部分IgG1结构域，野生型DNAM-1多肽的全部或部分IgG2结构域，野生型DNAM-1多肽的全部或部分IgG1和IgG2结构域；和/或野生型DNAM-1的全部或部分胞内结构域。对于本公开的目的，将认识到DNAM-1多肽保留野生型DNAM-1多肽提升或促进T细胞功能的能力，并且特别是，其中表达DNAM-1多肽的T细胞的抗肿瘤活性。因此，在特别的实施方案中，在其T细胞上的表达环境中评估DNAM-1多肽的活性，由此评估表达DNAM-1多肽的T细胞的抗肿瘤活性，以确定DNAM-1多肽的活性。如本文所用，“DNAM-1多肽”是指编码DNAM-1多肽的多核苷酸。
“有效量”是实现特定疾病的可测量改善或预防需要的最小量。本文的有效量可以根据以下因素而改变，如：患者的病况、年龄、性别和重量，以及抗体在个体中引发所需应答的能力。有效量还是治疗的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。对于预防性使用，有益的或期望的结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重性或延迟疾病发作的结果，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和疾病发展过程中呈现的中间病理表型。对于治疗性使用，有益的或期望的结果包括临床结果，例如减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有该疾病的那些人的生活质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增强另一种药物作用，如通过靶向、延缓疾病进展和/或延长存活期。在癌症或肿瘤的情况下，药物的有效量可能具有以下作用：减少癌细胞数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓或理想地阻止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即在一定程度上减缓并理想地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症或肿瘤相关的一种或多种症状。在感染的情况下，药物的有效量可能具有以下作用：降低循环或组织中的病原体(细菌、病毒等)滴度；减少病原体感染细胞的数量；抑制(即，在一定程度上减缓或理想地停止)器官的病原体感染；抑制(即在一定程度上减缓并理想地停止)病原体生长；和/或在一定程度上缓解与感染相关的一种或多种症状。有效量可以以一次或多次给药来给药。对于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床情况下所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在给药一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂联合使用可能是或实现期望的结果，则可以考虑以有效量给予单一药剂。
“增强T细胞功能”或“增强T细胞的功能”或其短语变化表示诱导、致使或刺激T细胞以具有持续的或扩大的生物学功能，或更新或重新激活耗尽的或无活性的T细胞。增强的T细胞功能的实例包括以下的任何一种或多种：相对于干预前(例如在工程化T细胞以表达重组DNAM-1前)的水平，增加的IFN-γ分泌、增加的TNF-α分泌、增加的CD8+T细胞的IL-2分泌、增加的增殖、增加的抗原反应性(例如，病毒、病原体或肿瘤清除)。在一些实施例中，增强水平至少为50％，或者为60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％或200％。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
关于基因序列的术语“表达”是指基因转录以产生RNA转录物(例如，mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)，并且在适当情况下，将所得到的mRNA转录产物翻译成蛋白质。因此，从上下文可以清楚地看出，编码序列的表达源自编码序列的转录和翻译。相反，非编码序列的表达源自非编码序列的转录。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用。“表达”通常是指通过其信息(例如，基因编码的和/或表观遗传的信息)转化成细胞中存在的结构并运行的过程。因此，如本文所用，“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸、翻译的多肽，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)的片段也应认为是表达的，无论它们源自由选择性剪接产生的转录产物或降解的转录产物，或来自多肽的翻译后加工，例如，通过蛋白水解。“表达的基因”包括作为mRNA转录成多核苷酸并随后翻译成多肽的那些，以及还有转录成RNA但未翻译成多肽的那些(例如，转移和核糖体RNA)。
“增加的表达”、“增加的表达水平”或“增加的水平”是指相对于对照样品，样品中(例如，在细胞、组织或器官之中或之上)的基因或蛋白质增加或升高的表达或水平。与对照相比，表达或水平可以增加至少或约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％，250％，300％，350％，400％或更多。
“减少的表达”、“减少的表达水平”或“减少的水平”是指相对于对照样品，样品中(例如，在细胞、组织或器官之中或之上)的基因或蛋白质减少或降低的表达或水平。与对照相比，表达或水平可以减少至少或约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。
术语“免疫反应”是指宿主哺乳动物的免疫系统对特定物质(如抗原或免疫原)的任何可检测反应，如先天性免疫反应(例如，Toll受体信号传导级联的激活)、细胞介导的免疫反应(例如由T细胞(如抗原特异性T细胞)介导的反应和免疫系统的非特异性细胞)和体液免疫反应(例如由B细胞介导的反应，如抗体的产生并分泌到血浆、淋巴和/或组织液中)。
术语“胞内信号传导结构域”是指多肽的胞内区域，其产生促进细胞中的效应子功能的信号(例如在T细胞的情况下，包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性)。在嵌合抗原受体的情况下，胞内信号传导结构域至少包含激活信号传导结构域(也称为初级胞内信号传导结构域)，如包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序ITAM的，例如CD3ζ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRlla、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域还包括一个或多个共刺激信号传导结构域，其包括源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子(例如CD28、4-1BB或ICOS信号传导结构域)的那些。提及“异源胞内信号传导结构域”是指通常不存在于所讨论的多肽(例如DNAM-1多肽)中的胞内信号传导结构域，即通常不以其天然状态存在于多肽中。
本文使用时，术语“标记”是指可检测的化合物或组合物。标记通常与试剂(如多核苷酸探针或抗体)直接或间接缀合或融合，并且有助于与其缀合或融合的试剂的检测。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或，在酶标记的情况中，可以催化底物化合物或组合物的化学改变，这产生可检测的产物。
如本文所用，术语“淋巴细胞”是指免疫系统的细胞，其是一种白细胞。淋巴细胞包括但不限于T细胞(细胞毒性和辅助T细胞)、B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。
本文中可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如人、猴和猿，并且包括猴种，例如来自猕猴属(例如食蟹猴，如Macaca fascicularis，和/或恒河猴(Macaca mulatta))，和狒狒(Papio ursinus)，以及狨猴(marmoset)(来自Callithrix属的物种)、松鼠猴(来自Saimiri属的物种)和狨猴(tamarin)(来自Saguinus属)，以及猿种，如黑猩猩(Pan troglodytes))、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类(例如兔、野兔)、牛类(例如牛)、羊类(例如，绵羊)、山羊类(例如山羊)、猪类(例如猪)、马类(例如马)、犬类(例如狗)、猫类(例如猫)、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟，如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要增强的T细胞功能的人，如患有癌症或感染的受试者。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指一种制剂，其形式允许活性成分的生物活性有效，并且不包含对施用组合物或制剂的受试者有不可接受的毒性的附加成分。这种制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(载体、添加剂)是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供所用活性成分的有效剂量的那些。
如本文所用，术语“样品”包括可从受试者提取、未处理、处理、稀释或浓缩的任何生物样本。样品可以包括但不限于生物流体，如全血、血清、红细胞、白细胞、血浆、唾液、尿液、大便(即粪便)、泪液、汗液、皮脂、乳头抽吸物、导管灌洗液、肿瘤渗出液、滑液、腹水、腹膜液、羊水、脑脊液、淋巴液、细针穿刺液、羊水、任何其他体液、细胞裂解物、细胞分泌物、炎症液、精液和阴道分泌物。样品可以包括组织样品和活检、组织匀浆等。有利的样品可以包括包含可检测量的本文教导的任何一种或多种生物标志物的样品。合适地，样品可通过微创方法容易地获得，从而允许从受试者移除或分离样品。在某些实施方案中，样品包含血液，尤其是外周血，或其级分或提取物。通常，样品包含血细胞，如成熟、未成熟或发育中的白细胞，包括淋巴细胞、多形核白细胞、中性粒细胞、单核细胞、网织红细胞、嗜碱性粒细胞、体腔细胞、血细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞或这些细胞的一部分(例如，核酸或蛋白质部分)。在具体实施方案中，样品包含T细胞。
如本文所用，“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“参照水平”、“对照样品”、“对照细胞”、“对照组织”或“对照水平”是指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自相同受试者或个体的健康和/或非患病身体部分(例如，组织或细胞)，但在不同的时间点获得，例如治疗前后。在另一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织从不是被评估的受试者或个体的健康个体获得。在特定实例中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是或包含具有正常或有效免疫功能的T细胞、具有受损或无效免疫功能的T细胞、来自对治疗有反应或敏感的受试者的T细胞或来自对治疗无反应或抗性的受试者的T细胞。在特定的实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其他实例中，参照水平或对照水平是指示或代表特定表型的水平，如具有正常或有效免疫功能的T细胞、具有受损或无效免疫功能的T细胞、来自对治疗有反应或敏感的受试者的T-细胞或来自对治疗无反应或抗性的受试者的T细胞。在更进一步的实施方案中，参照水平或对照水平代表高于或低于其指示或代表特定表型的“截止”，如具有正常或有效免疫功能的T细胞、免疫功能受损或无效的T细胞、来自对治疗有反应或敏感的受试者的T细胞，或来自对治疗无反应或抗性的受试者的T细胞。在特定的实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
如本文所用，术语“序列同一性”是指在比较窗口(例如超过10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200或更多个核苷酸或氨基酸残基)以逐个核苷酸为基础或逐个氨基酸为基础序列相同的基础。因此，“序列同一性百分比”是通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在两个序列中的位置数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。对于本发明的目的，“序列同一性”将理解为表示通过适当方法计算的“匹配百分比”。例如，可以使用DNASIS计算机程序(windows 2.5版；可从Hitachi Software Engineering Co.、Ltd.，South San Francisco，California，USA)，使用软件随附的参考手册中使用的标准默认值进行序列同一性分析。
杂交反应的“严格性”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般来说，较长的探针需要更高的温度用于适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性的DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。因此，较高的相对温度往往会使反应条件更加严格，而较低的温度则不那么严格。有关杂交反应严格性的其他详细信息和解释，参见Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
如本文所定义，“严格条件”或“高严格条件”可以通过以下条件来确定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃下在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，然后用含EDTA的0.1×SSC在55℃下进行10分钟高严格性洗涤。
如本文所用，术语“治疗”是指设计用于在临床病理过程中改变被治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的理想效果包括降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与癌症相关的一种或多种症状，包括但不限于降低(或破坏)癌细胞的增殖、减少由癌症引起的症状，提高癌症患者的生活质量，减少治疗癌症所需的其他药物或疗法的剂量，和/或延长个体的存活期，则个体可能被成功“治疗”。在治疗感染的情况下，如果与感染相关的一种或多种症状得到缓解或消除，包括但不限于减少受试者体内传染性微生物的数量、减轻由感染引起的症状，和/或延长个体的存活期，则个体可能被成功“治疗”。
如本文所用，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌变细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”、“过度增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提及时并不相互排斥。
表1.序列描述
Figure BDA0003319880510000281
Figure BDA0003319880510000291
除非另外特别说明，否则本文描述的每个实施方案加以必要的修改将适用于每个实施方案。
2.具有增强的功能的T细胞
本公开部分基于DNAM-1(也称为CD226)对于T细胞在肿瘤环境中的免疫功能是必不可少的确定。因此，提供了在细胞表面上表达DNAM-1的T细胞，如重组DNAM-1，包括修饰的DNAM-1。同样根据本公开，提供了利用T细胞表面上的DNAM-1表达来增强T细胞(例如，CD8+T细胞)功能的方法，包括增加T细胞激活。因此，作为过继性细胞转移免疫疗法的一部分，本公开的T细胞和方法在癌症治疗中特别有用。本公开的T细胞和方法也可用于治疗感染。例如，可以将本公开的T细胞过继性转移给患有慢性感染的受试者，其中内源性T细胞可能被耗尽。在表面上表达DNAM-1的本公开的T细胞与表面上不表达DNAM-1的T细胞相比，可表现出例如增强的激活(如通过例如IFN-γ、IL-2或TNF表达测量的)、增强的增殖(如通过例如Ki67表达测量的)、增强的细胞溶解活性，和/或增强的抗肿瘤活性。与表面上不表达DNAM-1的T细胞相比，任何一种或多种T细胞免疫功能可提高至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。
2.1 DNAM-1
DNAM-1首先被描述为涉及T细胞的细胞毒性特性的粘附分子(Shibuya等，1996，Immunity 4(6)：573-581)。它主要由CD4和CD8 T细胞、NK细胞、血小板和单核细胞表达，其配体是CD155(脊髓灰质炎病毒受体)和CD112(nectin-2)，它们自身在各种细胞上表达，包括APC、转化的细胞和病毒感染的细胞。DNAM-1似乎参与多个细胞过程：认为它在免疫细胞外渗中很重要，与免疫突触的稳定性有关，是重要的NK细胞激活受体和CD4 T细胞的共同受体。因此，DNAM-1缺陷小鼠更多地对抗GVHD以得到保护，并且更容易产生致癌物诱导的肿瘤发生(参见例如Nabekura等，2010，Proc Natl Acad Sci US A.107(43):18593–18598；Iguchi-Manaka等，2008，J Exp Med.205(13):2959-2964)。
前体人DNAM-1是336个氨基酸多肽(SEQ ID NO:1中所列的)，其通过除去18个氨基酸N-末端信号肽来加工，从而产生318个氨基酸的成熟DNAM-1多肽(SEQ ID NO:2中所列的)。除了信号肽，前体DNAM-1包含230个氨基酸胞外结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸位置19至248)，28个氨基酸的跨膜结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸位置249至276)和60个氨基酸的胞质结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸位置277至336)。尽管DNAM1是Ig超家族的一部分，但其结构独特。例如，胞质结构域与其他Ig超家族成员DNAM-1的同源性很低或没有同源性。
DNAM-1具有两个对于结合CD155重要的胞外结构域：IgG1结构域(大致对应于SEQID NO:1的氨基酸残基19-126)和IgG2结构域(大致对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基135-239)。DNAM-1还含有免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序(YVNY)，用于胞内信号传导(Zhang等，2015，J Exp Med.212(12):2165-2182)。DNAM-1具有三个磷酸化位点：Y322(其是ITT基序)、Y325(其可能参与调控DNAM-1表达)和S329，各自与几个功能相关。尽管已经表明了通过Y322的信号传导是激活NK细胞绝对需要的，但DNAM-1在T细胞中的信号传导的作用仍然是不清楚的。
示例性野生型DNAM-1多肽包括野生型前体DNAM-1多肽(包括SEQ ID NO:1中列出的人野生型前体DNAM-1多肽和SEQ ID NO:3中列出的小鼠野生型前体DNAM-1多肽)和野生型成熟DNAM-1多肽(包括SEQ ID NO:2中列出的人野生型成熟DNAM-1多肽和SEQ ID NO:4中列出的小鼠野生型成熟DNAM-1多肽)。
代表性的前体野生型人DNAM-1多肽具有以下序列(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是Y322、Y325和S329)：
Figure BDA0003319880510000311
代表性的成熟野生型人DNAM-1多肽具有以下序列：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV(SEQ ID NO:2)
代表性的前体野生型小鼠DNAM-1多肽具有以下序列(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是Y319、Y322和S326)：
Figure BDA0003319880510000321
代表性陈述野生型小鼠DNAM-1多肽具有以下序列：
EETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL(SEQ ID NO:4)
在一些实施方案中，本公开的DNAM-1多肽与野生型DNAM-1多肽相比可以呈现增加的在T细胞表面上的保留。这样的DNAM-1多肽相对于野生型DNAM-1多肽包含一个或多个修饰(即，它们是修饰的DNAM-1多肽)，其中在T细胞(例如，CD8+T细胞)的表面上表达时，一个或多个修饰给予DNAM-1多肽增加的细胞表面保留(或降低的内化)。通常，修饰的DNAM-1多肽相对于野生型DNAM-1多肽包含一个或多个氨基酸修饰(例如，缺失、插入或置换)，使得修饰的DNAM-1多肽的氨基酸序列与野生型DNAM-1多肽(如SEQ ID NO:1或2中列出的野生型人DNAM-1多肽)小于100％相同。在一些实例中，修饰的DNAM-1多肽保留至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的与野生型DNAM-1多肽(如SEQ ID NO:1或2中列出的野生型人DNAM-1多肽)的序列同一性。例如，本公开的修饰DNAM-1多肽可以包含SEQ ID NO:1或2中列出的序列或具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，但进一步包含至少一个以下所述的氨基酸修饰，该氨基酸修饰在T细胞(例如，CD8+T细胞)表面上表达时给予DNAM-1多肽增加的细胞表面保留(或降低的内在化)。因此，在特定的实例中，修饰的DNAM-1多肽包含至少一个以下所述的修饰以及与野生型DNAM-1多肽(如SEQ ID NO:1或2中列出的野生型人DNAM-1多肽)具有至多85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的序列。
本文提供的示例性修饰的DNAM-1多肽是在对应于SEQ ID NO:1的322位的氨基酸位置包含酪氨酸修饰的那些，与野生型DNAM-1多肽相比具有增加的T细胞表面上的保留并促进增强的T细胞功能。因此，用于在本公开的T细胞中表达的示例性DNAM-1多肽还包括在对应于SEQ ID NO:1的322位的氨基酸位置包含酪氨酸修饰的DNAM-1。这样的DNAM-1多肽与野生型DNAM-1多肽相比可以呈现降低的(包括消除的)通过残基磷酸化的信号传导。在对应于SEQ ID NO:1的322位的氨基酸位置的酪氨酸修饰可以例如是氨基酸缺失或任何氨基酸置换，如用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸来置换。在特定实例中，氨基酸置换是用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或缬氨酸的置换。在一个实施方案中，置换是用苯丙氨酸(例如，Y322F；如SEQ ID NO:5和6中列出的)或丙氨酸(例如，Y322A)的置换。
前体人DNAM-1Y322F(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是F322)：
Figure BDA0003319880510000331
Figure BDA0003319880510000341
成熟人DNAM-1Y322F：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIFVNYPTFSRRPKTRV(SEQ ID NO:6)
在更多实例中，可以通过靶向参与内在化的氨基酸残基或基序，使得DNAM-1的内在化被抑制或降低，从而实现增加的表面保留。受体(如DNAM-1)的信号传导和功能可以通过内吞性内在化从细胞表面去除受体来调节。针对受体酪氨酸激酶(例如EGFR)、G-蛋白偶联受体以及免疫相关受体(例如(CD3、CD4、CTLA-4等)，已表明了这一原理。存在大量不同的机制和内吞途径，但两个更重要的途径是网格蛋白介导的内吞作用(CME)和泛素化。CME通常通过适体蛋白AP-2与表面受体胞质尾的基序结合来介导。经由AP-2的CME经常与受体再循环和表面再表达有关。相反，受体的多泛素化导致内化和随后的降解。因此，本文提供了修饰的DNAM-1多肽，其包含一个或多个靶向(即消除)AP-2结合基序、E3泛素连接酶结合(Cbl-b)基序和/或泛素化位点的修饰。
DNAM-1在其胞质尾中对应于SEQ ID NO:1中所示的前体DNAM-1的325-328位(残基YPTF)的氨基酸位置具有AP-2结合基序YXXF。因此，本公开的其他示例性DNAM-1多肽包括其中YXXF AP-2基序已被修饰的那些，使得DNAM-1经由AP-2的CME被减少或消除，从而增加DNAM-1的细胞表面保留。应当理解，AP-2基序可以通过多种修饰中的任何一种来消除，包括在分别对应于SEQ ID NO:1的325-328的位置的任何一个或多个残基Y、P、T、F的氨基酸缺失；对应于SEQ ID NO:1的325位的位置的酪氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的328位的位置的苯丙氨酸的氨基酸置换；和/或在对应于SEQ ID NO:1的325、326或327位的任一个位置后的氨基酸插入。因此，示例性DNAM-1多肽包括在对应于SEQ ID NO:1的325位的位置具有酪氨酸修饰和/或在对应于SEQ ID NO:1的328位的位置具有苯丙氨酸修饰的那些。修饰可以是导致YXXF基序消除的任何修饰(例如缺失和/或置换)。在特定实例中，修饰是置换，例如用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换325位的酪氨酸，和/或用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换328位的苯丙氨酸。在非限制性实例中，DNAM-1多肽包含325位的酪氨酸被丙氨酸置换和328位的苯丙氨酸被丙氨酸置换。
前体人DNAM-1Y325A/F328A(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是A325和A328)：
Figure BDA0003319880510000351
成熟人DNAM-1Y325A/F328A：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNAPTASRRPKTRV(SEQ ID NO:22)
人DNAM-1具有第二个AP-2结合基序EXXXLF，其将靶向AP-2的α2/σ2亚基(a2/s2半复合物)。这个基序存在于野生型人DNAM-1多肽中对应于SEQ ID NO:1的282-287位的氨基酸位置(残基ERRDLF)。因此，本公开的其他示例性DNAM-1多肽包括其中EXXXLF AP-2基序已经被修饰的那些，使得DNAM-1经由AP-2的CME被降低或消除，由此增加DNAM-1的细胞表面停留。应当理解，EXXXLF AP-2基序可以通过多种修饰中的任何一种来消除，包括在分别对应于SEQ ID NO:1的282-287的位置的任何一个或多个残基E、R、R、D、L或F的氨基酸缺失；SEQID NO:1所示的人前体DNAM-1的282位的谷氨酸、286位的亮氨酸和/或287位的苯丙氨酸的氨基酸置换；和/或在分别对应于282-286的位置的残基后的氨基酸残基的插入。在特定实例中，修饰是置换，如用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换282位的谷氨酸；用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换286位的亮氨酸；和/或用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换287位的苯丙氨酸。在非限制性实例中，DNAM-1多肽包含282位的谷氨酸被丙氨酸置换、286位的亮氨酸被丙氨酸置换和287位的苯丙氨酸被丙氨酸置换。
前体人DNAM-1E282A/L286A/F287A(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是A282、A286和A287)：
Figure BDA0003319880510000361
Figure BDA0003319880510000371
成熟人DNAM-1E282A/L286A/F287A：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRARRDAATESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNAPTASRRPKTRV(SEQ ID NO:24)
人DNAM-1在对应于SEQ ID NO:1中所示的前体DNAM-1的320-322的位置具有用于E3泛素连接酶Cbl-b的结合基序((D/N)XpY)。如本文证明的，Cbl-b参与CD155介导的DNAM-1下调，其中Cbl-b功能的废除导致DNAM-1细胞表面保留。因此，本文提供了修饰的DNAM-1多肽，其相对于野生型DNAM-1多肽包含一个或多个修饰，其中修饰靶向Cbl-b(D/N)XpY结合基序和/或泛素化位点，使得与野生型DNAM-1多肽相比，修饰的DNAM-1多肽呈现出增加的细胞表面保留。Cbl-b的结合需要Y322的磷酸化，并且该磷酸化位点的缺失可能会阻止DNAM-1的内在化和降解(与本文的证明一致，即靶向人DNAM-1的Y322导致DNAM-1的细胞表面保留增加)。在其他实例中，DNAM-1多肽在对应于SEQ ID NO:1的320位的位置的任何一个或多个天冬氨酸后或在对应于SEQ ID NO:1的321位的位置的氨基酸残基后包含氨基酸插入，从而消除Cbl-b结合基序。在另一个实例中，DNAM-1多肽在对应于SEQ ID NO:1的320位的位置包含天冬氨酸的氨基酸缺失或置换(例如用丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸的置换)。泛素化发生在赖氨酸(K)残基上。因此，预期为消除这些泛素化位点的在位置295和/或333(相对于SEQ ID NO:1编号)的赖氨酸修饰也会导致DNAM-1的内在化和降解减少，从而导致DNAM-1表面表达的保留。因此，适合在T细胞中表达的本公开的其他DNAM-1多肽包括在对应于SEQ ID NO:1中所示的人前体DNAM-1的295位的位置具有赖氨酸修饰(例如氨基酸缺失、插入和/或置换)的那些和/或在对应于333位的位置具有赖氨酸修饰的那些。在特定实例中，修饰是置换，即用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换295位的赖氨酸；用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸置换333位的赖氨酸。在非限制性实例中，DNAM-1多肽包含295位的赖氨酸被丙氨酸置换，和/或333位的赖氨酸被丙氨酸置换。
前体人DNAM-1K295A(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是A295)：
Figure BDA0003319880510000381
成熟人DNAM-1K295A：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQAAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV(SEQ ID NO:26)
前体人DNAM-1K333A(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是A333)：
Figure BDA0003319880510000382
Figure BDA0003319880510000391
成熟人DNAM-1K333A：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPATRV(SEQ ID NO:28)
前体人DNAM-1K295A/K333A(N-末端信号肽是粗体；下划线的残基是A295和A333)：
Figure BDA0003319880510000392
成熟人DNAM-1K295A/K333A：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQAAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPATRV(SEQ ID NO:30)
适用于在T细胞中表达的其他示例性DNAM-1多肽包括在对应于SEQ ID NO:1的329位的氨基酸位置包含丝氨酸修饰的那些。与野生型DNAM-1多肽相比，此类DNAM-1多肽可通过329位残基的磷酸化而呈现出减少的(包括消除的)信号传导。在对应于SEQ ID NO:1的329位的氨基酸位置的丝氨酸修饰可以是例如氨基酸缺失或任何氨基酸置换，例如用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的置换。在特定实例中，氨基酸置换是用丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或缬氨酸的置换。其他示例性多肽包括在对应SEQ ID NO:1的322位的氨基酸位置包含酪氨酸修饰的那些和在对应于SEQ ID NO:1的329位的氨基酸位置包含丝氨酸修饰的那些。
用于在T细胞中表达的DNAM-1多肽还包括缺乏全部或部分胞质(或胞内)结构域的那些，例如，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基277至336。缺乏全部或部分这个结构域的DNAM-1多肽，特别是包含对应于SEQ ID NO:1的残基322和329的残基的部分，因此可以呈现出降低的(包括消除的)信号传导并有助于增强的T细胞功能。
缺乏胞质结构域的前体人DNAM-1(N-末端信号肽是粗体)：
Figure BDA0003319880510000401
缺乏胞质结构域的成熟人DNAM-1
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLN(SEQ ID NO:8)
因此，在一些实施方案中，DNAM-1多肽包含全部或部分胞外结构域，例如，对应于氨基酸残基19至248，但任选缺乏全部或部分胞质结构域。胞外结构域可以包含全部或部分IgG1结构域，例如大致对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基19-126，和/或全部或部分IgG2结构域，例如大致对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基135-239。
人DNAM-1胞外结构域：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQ(SEQ ID NO:9)
其他示例性DNAM-1多肽可以包括缺乏或部分IgG1结构域(例如大致对应于SEQ IDNO:1的氨基酸残基19-126)的那些，和/或缺乏全部或部分IgG2结构域(例如大致对应于SEQID NO:1的氨基酸残基135-239)的那些。
还考虑了缺乏全部或部分跨膜结构域(例如，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置249至276)的DNAM-1多肽。然而，将认识到确保在T细胞表面上表达DNAM-1多肽，并且不分泌，缺乏内源性DNAM-1跨膜结构域的DNAM-1多肽包含外源性跨膜结构域。来自各种膜结合蛋白质或跨膜蛋白质的跨膜结构域是本领域已知的并且可以连接全部或部分DNAM-1胞外结构域。示例性跨膜结构域包括，但不限于，源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137和CD154的跨膜区的那些。
DNAM-1多肽可以是至少或约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、230或330个氨基酸长。在一些实例中，DNAM-1多肽与SEQ ID NO:5-9或21-30任一个中列出的多肽具有至少或约85％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％序列同一性，只要它们不与野生型DNAM-1多肽具有相同序列(即，与野生型DNAM-1多肽具有低于100％序列同一性)。本公开的修饰DNAM-1多肽相对于野生型DNAM-1多肽(如，野生型人DNAM-1多肽，例如，SEQ ID NO:1或2中所示的)具有修饰(例如，氨基酸置换、缺失和/或插入)。因此，本文提及任何修饰是相对于野生型DNAM-1多肽。例如，认为修饰的DNAM-1多肽在特定位置具有氨基酸置换的情况中，理解为修饰的DNAM-1多肽不包含野生型DNAM-1多肽中该位置存在的内源性氨基酸残基，即，修饰的DNAM-1多肽包含该位置的任何氨基酸残基，除了野生型DNAM-1多肽中该位置存在的氨基酸残基。例如，在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置包含酪氨酸的氨基酸置换的修饰DNAM-1多肽是在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置包含丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱胺氨、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸的修饰DNAM-1多肽。
如将认识到的，本公开的DNAM-1多肽保留野生型DNAM-1多肽促进或有助于T细胞功能的能力，特别是在其中表达的T细胞的抗肿瘤活性，即，表达修饰的DNAM-1多肽的T细胞通常具有与表达野生型DNAM-1多肽(例如，野生型人DNAM-1多肽)的T细胞至少相同且更常见增加的免疫功能。用于评估表达DNAM-1多肽的T细胞的免疫功能的方法是本领域已知的并且描述于下文中。
还提供了编码以上和本文别处描述的DNAM-1多肽的DNAM-1多核苷酸，如编码包含SEQ ID NO:1-9任一个所示的氨基酸序列的DNAM-1多肽或预期具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽的DNAM-1多核苷酸。编码SEQ ID NO:1的前体人DNAM-1多肽的示例性多核苷酸示于SEQ ID NO:10中。
编码SEQ ID NO:1的前体人DNAM-1多肽的多核苷酸(粗体的核苷酸[核苷酸1-54]编码信号序列)：
Figure BDA0003319880510000421
Figure BDA0003319880510000431
2.2表达细胞表面DNAM-1的T细胞
本文提供了在细胞表面上表达DNAM-1的T细胞，包括分离的T细胞。这样的细胞对于增强受试者中的免疫功能(包括T细胞功能)、治疗受试者的癌症和治疗受试者的感染特别有用。表达DNAM-1的T细胞可以是CD4+或CD8+，和/或可以γδT细胞或αβT细胞。在特定的实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
T细胞可以表达重组DNAM-1，包括野生型DNAM-1或其变体，如本文所述的修饰的DNAM-1。在其他实施方案中，T细胞不表达重组DNAM-1，但仅在表面上表达内源性DNAM-1。因此本公开提供了制备用于过继性T细胞疗法(ACT)的T细胞群的方法，包括将编码DNAM-1的多核苷酸引入T细胞中，以产生表达重组DNAM-1的T细胞群，或包括从受试者获得T细胞样品并从样品选择DNAM-1阳性(DNAM-1+)T细胞(即在细胞表面上表达DNAM-1的T细胞)。
2.2.1表达重组DNAM-1的T细胞
本文提供了表达重组和/或修饰DNAM-1的T细胞。因此这样的T细胞与仅表达内源性DNAM-1的T细胞相比具有增加的表面DNAM-1水平。因此，表达重组DNAM-1的T细胞与不表达重组DNAM-1的T细胞(即，仅表达内源性DNAM-1的T细胞)相比可以呈现增强的T细胞功能。因此，本公开还提供了用于增强T细胞功能的方法，所述方法通过将DNAM-1多核苷酸引入细胞中，使得在T细胞中表达重组DNAM-1。通常，重组DNAM-1细胞在T细胞表面上表达。
在T细胞中表达的重组DNAM-1多肽可以是野生型DNAM-1多肽或上述其变体，即，上述的修饰DNAM-1多肽。本文所述的任何DNAM-1多肽可以在T细胞中重组表达。
可以使用本领域公知的用于生成遗传工程化的T细胞的方法来产生表达重组(包括修饰的)DNAM-1的T细胞。通常，使用各种基因转移方法中的任一种将DNAM-1多核苷酸引入T细胞中。这些包括，但不限于，病毒载体基因转移技术和非病毒转移技术，如利用转座子、mRNA、脂质体，或裸DNA的电穿孔或转染的那些。用于将DNAM-1多核苷酸引入T细胞中的示例性病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒(包括慢病毒、γ逆转录病毒和α逆转录病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒(CMV))、α病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒(例如仙台病毒)、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒(例如痘苗病毒)和披膜病毒载体。
逆转录病毒是本领域公知的并且包括，例如，源自B、C和D型逆转录病毒、异嗜性逆转录病毒(例如NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1)、多嗜性逆转录病毒(例如MCF和MCF-MLV)、泡沫病毒和慢病毒的载体，用于随后引入T细胞中。用于构建逆转录病毒载体的示例性逆转录病毒包括禽白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂细胞病灶诱导病毒、鼠肉瘤病毒、网状内皮增生病毒和劳斯肉瘤病毒。在一些实例中，逆转录病毒载体的部分源自不同的逆转录病毒。例如，逆转录病毒LTR可以来自鼠肉瘤病毒、来自劳斯肉瘤病毒的tRNA结合位点、来自鼠白血病病毒的包装信号以及来自禽白血病病毒的第二链合成的起点。
通过将其引入合适的包装细胞系中，重组逆转录病毒可以用于产生转导感受态逆转录病毒载体颗粒。优选，重组病毒载体是复制缺陷型重组病毒。适用于上述逆转录病毒载体的包装细胞系是本领域公知的，易于制备(参见例如WO1995/30763和WO1992/05266)，并可用于创建生产细胞系(也称为载体细胞系或“VCL”)，用于生产重组载体颗粒。优选，包装细胞系由人类亲本细胞(例如HT1080细胞)或貂亲本细胞系制成，其消除了人类血清中的失活。已经描述了许多示例性逆转录病毒系统并且可以在本文中使用(例如，美国专利No.5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman,1989，BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.，1990，Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等，1991,Virology 180:849-852；Burns等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin，1993，Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。在特定的实例中，使用慢病毒载体。用于基于慢病毒的基因转移的示例性方法和载体是本领域已知的并描述于，例如，Wang等，2012，J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等，2003,Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等，2003，Blood.102(2):497-505。
在其他实施方案中，通过电穿孔将重组多核苷酸转移至T细胞中(参见，例如，Chicaybam等，2013，PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等，2000，Gene Therapy 7(16):1431-1437)，任选使用CRISPR-Cas9来靶向插入(Roth等，2018，Nature，559:405-409)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至T细胞中(参见，例如，Manuri等，2010，Hum GeneTher 21(4):427-437；Sharma等，2013，Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等，2009，Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入并表达遗传材料的其他方法包括磷酸钙转移(例如，如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NewYork.N.Y.中所述的)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染、钨粒子促进的微粒轰击(Johnston，1990，Nature，346:776-777)和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，1987，Mol.CellBiol.，7:2031-2034)。
如所了解的，DNAM-1多核苷酸通常可操作地连接启动子，用于随后引入T细胞中并在其中表达。其他启动子元件，例如，增强子，调控转录启动的频率并且也可以利用。用于哺乳动物细胞中的转基因表达中的启动子和增强子是本领域公知的并且任何这样的启动子可以用于在T细胞中表达DNAM-1。用于在T细胞中表达多核苷酸的示例性启动子包括CMV IE基因、EF1a、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中并且已经显示出驱动从克隆至载体中的核酸分子表达中是有效的。启动子的另一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这种启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。其他组成型启动子序列页可以使用，包括，但不限于，猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstrin-Barr病毒立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-la启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
载体还可以包括，例如，聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、允许游离基因复制以及在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColEI或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记)。
2.2.2 T细胞的来源和制备
为了产生本公开的T细胞，细胞通常使用本领域公知的方法获自或源自来自受试者的生物样品(例如，人受试者或非人动物受试者，例如，小鼠、大鼠、兔子、猪、黑猩猩等)。在一些实例中，从接受细胞疗法的受试者，或从源自该受试者的样品，分离和/或另外制备细胞，即细胞是自体同源的。在其他实例中，从接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者分离和/或另外制备细胞，即，细胞是同种异源的或异种的。通常，细胞是原代T细胞，尽管也考虑了来自从生物样品产生的T细胞系的T细胞。
从其获得细胞的样品包括例如组织、流体和其他从受试者直接获取的样品，以及从一个或多个加工步骤获得的样品，如分离、离心、遗传工程化(例如，用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育。示例性样品包括全血、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤组织，和/或由其衍生的细胞。在一些方面中，从其衍生或分离细胞的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自血液成分分离术或白细胞分离术产品。
T细胞的分离可以包括一个或多个分离和/或非基于亲和性的细胞分离总部后。在一些实例中，将细胞洗涤、离心和/或在一种或多种试剂的存在下孵育，例如，以除去不需要的成分，针对所需的成分富集，或裂解或除去对特定试剂敏感的细胞。可以基于一个或多个特异性来分离细胞，如密度、附着特性、大小、对特定成分的敏感性和/或抗性。
在一些实例中，获得来自受试者循环血液的细胞，例如，通过血液成分分离术或白细胞分离术。通常，洗涤从受试者收集的血细胞，以除去血浆部分并置于合适的缓冲液或介质中，用于随后的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。洗涤步骤可以使用半自动化“流经”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理机、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver5)根据制造商的说明来完成。在一些方面中，通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明来完成洗涤步骤。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相同缓冲剂中。或者，可以除去血液成分分离术样品的不合需要的成分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
用于分离T细胞的方法还可以包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度的离心，从外周血分离白细胞。在更多实施方案中，方法包括基于一种或多种标志物(如表面蛋白)表达来分离不同细胞类型的一个或多个步骤。可以使用任何已知的基于这样的标志物的分离方法，包括，例如，基于亲和性或免疫亲和性的分离。例如，可以用特异性结合此类标志物的抗原结合分子孵育，接着通常是洗涤步骤以及从未结合抗原结合分子的那些分离出已经结合抗原结合分子的细胞来完成基于一种或多种标志物(如细胞表面标志物)表达或表达水平的细胞和细胞群的分离。
这样的分离步骤可以基于阳性选择，其中保留已经结合抗原结合分子的细胞用于进一步的使用，和/或基于阴性选择，其中保留未结合抗原结合分子的细胞。如所认识的，分离不需要达到100％的富集或除去特定的细胞群或表达特定标志物的细胞。在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中将从一个步骤阳性或阴性选择的级分接受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤同时耗尽表达多种标志物的细胞，如通过用多种抗原结合分子孵育细胞，每种抗原结合分子对于靶向阴性选择的标志物是特异性的。同样，可以用在各种细胞类型上表达的多种抗原结合分子孵育细胞来同时阳性选择多种细胞类型。
对于本公开的目的，可以基于CD3的表达来选择T细胞。在一些实施方案中，通过在非T细胞上表达的标志物的阴性选择从PBMC样品选择T细胞，所述非T细胞如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14。在一些情况中，没有进行进一步选择，使得T细胞群包含样品中的所有T细胞，包括，例如，CD4+和CD8+T细胞，DNAM-1和DNAM-1+T细胞，以及所有其他表型的T细胞。在其他实例中，使用选择来分离更特定的T细胞亚群。
在本公开的一个实施方案中，选择DNAM-1+T细胞。因此，本公开提供了用于制备用于过继性细胞疗法的T细胞群的方法，该方法通过从受试者获得T细胞样品并从样品选择DNAM1+T细胞。可以评估DNAM-1的表面表达水平并在选择DNAM-1+T细胞时考虑。例如，可以将DNAM-1T细胞分成相对于群中的其他DNAM-1+T细胞表达“低”和“高”，或“低”、“中”和“高”水平的DNAM-1的那些，如按照本领域公知的使用流式细胞术来进行。随后可以保留一个或多个分离的DNAM-1+T细胞亚群，用于本文所述的方法中。
在更多实施方案中，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助和CD8+细胞毒性T细胞。这样的CD4+和CD8+群可以通过阳性或阴性选择进一步分选成亚群，所述阳性或阴性选择针对在一个或多个原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达的标志物或表达至相对较高程度的标志物来进行。在特定的实施方案中，本公开的T细胞是CD8+T细胞。
CD8+T细胞可以进一步富集或耗尽原初(naive)、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。例如，可以进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，如改善给药后的长期存活、扩增和/或植入，这在某些方面在此类亚群中是特别强大的(参见例如Terakura等，2012，Blood.1:72-82；Wang等，2012，J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，TCM细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些实施方案中，是基于对表达或高表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。因此，CD8+群针对TCM细胞富集的分离可以通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞和阳性选择或富集表达CD62L的细胞来进行。
可以使用本领域已知的任何方法来孵育和/或培养分离的T细胞。孵育步骤可以包括培养、栽培、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育细胞。这样的条件包括设计来诱导群中的细胞增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于遗传工程化的那些，如用于引入DNAM-1多肽和/或其他多核苷酸，如编码嵌合抗原受体的多核苷酸，如以下进行扩增。
在一些实施方案中，刺激条件(例如，以促进细胞扩增)包括暴露于一种或多种能够激活TCR复合物的胞内信号传导结构域的试剂，例如，配体。例如，试剂可以启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号传导级联。这样的试剂可以包括抗体，如对于结合固体支持物(如珠子)的TCR组分和/或共刺激受体(例如，抗CD3、抗CD28抗体)是特异性的那些，和/或一种或多种细胞因子。任选，扩增方法可以进一步包括将抗CD3和/或抗CD28抗体加入培养基中的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-1和/或IL-15。用于T细胞的培养和扩增的方法是本领域公知的并包括例美国专利No.6,040,1 77，Klebanoff等，2012，J Immunother.35(9):651-660，Terakura等2012Blood.1:72-82和Wang等，2012，J Immunother.35(9):689-701中描述的那些。
在一些实施方案中，通过加入培养启动组合物饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))并将培养物孵育足以扩大T细胞数量的时间来扩增T细胞。非分裂饲养细胞可以包含γ-照射的PBMC饲养细胞。在更多实施方案中，孵育可以进一步包括添加作为饲养细胞的非分裂EBV转化的淋巴母细胞(LCL)，其可以任选用γ射线照射。在一些实施方案中，通过用抗原刺激原初或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者分离T细胞并用相同抗原在体外刺激细胞来产生对巨细胞病毒抗原是抗原特异性的T细胞系或克隆。
在遗传工程化之前或结合遗传工程化，如工程化来表达如上所述的重组DNAM-1，可以将细胞进行孵育和/或培养。此外，表达DNAM-1(包括重组和/或内源性DNAM-1)的T细胞也可以表达一种或多种其他重组多肽。在其中T细胞表达重组DNAM-1的实施方案中，在T细胞修饰来表达重组DNAM-1之前、、同时或之后，可以将其他重组多肽工程化至T细胞中。在特定实例中，本公开的示例性T细胞表达重组受体，包括转基因T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
在特定实施方案中，本文所述的T细胞表达重组抗原受体，如CAR，即，是CAR T细胞。示例性抗原受体，包括CAR，以及用于工程化并将这些受体引入细胞中的方法，包括例如国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012129514、WO2014031687、WO2013166321、WO2013071154、WO2013123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利No.：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118中描述的那些，和/或Sadelain等，2013，Cancer Discov.3(4):388-398；Davila等，2013，PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等，2012，Curr.Opin.Immunol.，24(5):633-39；Wu等，Cancer，2012年3月，18(2):160-75中描述的那些。在一些方面中，抗原受体包括美国专利No.:7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开No.：WO2014055668中描述的那些。
CAR包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(或胞质结构域)。胞外抗原结合结构域可以是结合配体的受体或受体结构域或可以是抗体或其抗原结合部分，如抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区，例如，scFv抗体片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域进一步包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区，例如，IgG4铰链区，和/或CH1/CL和/或Fc区。恒定区或部分通常是人IgG，如IgG4或IgG1。恒定区的部分可以作为抗原识别组分(例如，scFv)和CAR的跨膜结构域之间的间隔区。示例性间隔物包括单独的IgG4铰链。连接CH2和CH3结构域的IgG4铰链，或连接CH3结构域的IgG4铰链。示例性间隔物包括，但不限于，Hudecek等，2013，Clin.Cancer Res.，19:3153，国际专利申请公开号WO2014031687和美国专利No.8,822,647中描述的那些。
抗原结合结构域通常结合肿瘤抗原。抗原结合区结合的示例性肿瘤抗原包括，但不限于，TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MART-1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含来自NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1和NKp80的抗原结合结构域。然而，在特定实施方案中，CAR的抗原结合结构域不包含DNAM-1的抗原结合结构域(例如，DNAM-1的胞外结构域)。因此，在一些实施方案中，本公开的T细胞不含有连接或包含外源性胞内信号传导结构域的DNAM-1多肽，所述外源性胞内信号传导结构域可以模拟如下所述的通过抗原受体复合物的激活(即，在一些实施方案中，T细胞上表达的DNAM-1多肽不连接或不包含可以模拟通过抗原受体复合物的激活的外源性胞内信号传导结构域)。
胞内信号传导结构域包含一种或多种胞内信号传导组分，如模拟通过抗原受体复合物的激活的信号传导组分，如TCR复合物，和/或经由另一种细胞表面受体的信号。在一些实施方案中，所述信号可以免疫刺激和/或共刺激。因此，胞内信号传导结构域通常负责其中已经引入了CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能的激活(例如，在T细胞的情况中，细胞毒性活性或辅助活性包括细胞因子的分泌)。
用于CAR中的胞内信号传导结构域的实例是本领域公知的并且包括在抗原受体结合后协同作用以启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。因为通过单独的TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还可以包括第二和/或共刺激信号。因此，CAR可以包括启动通过TCR的抗原依赖性初级激活的初级胞内信号传导结构域和以抗原无关性方式作用来提供第二或共刺激信号的第二胞质结构域或共刺激结构域。
以刺激方式作用的初级胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，已知其作为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。已经用于产生CARS的含初级胞内信号传到结构与的ITAM的实例包括CD3ζ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRlla,FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。示例性共刺激信号传导结构域是包含共刺激分子的胞内结构域的那些，即，除了淋巴细胞有效应答抗原所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，和特异性结合CD83的配体等。例如，CD27共刺激已经证明能在体外增强人CART细胞的扩增、效应子功能和存活，并在体内增强人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等，Blood.201；119(3):696-706)。此类共刺激分子的更多实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和CD19a。如所认知的，CAR可以包含2个或更多个共刺激信号传导结构域，如2、3、4、5、6、7、8或更多。
CAR的跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面中，结构域源自任何膜结合的或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的α、β或ζ链。
在一些实例中，T细胞是TCR缺陷的。TCR缺陷T细胞包括缺少功能性TCR的那些(例如，T细胞，工程化使得它们在细胞表面上不表达任何功能性TCR，工程化使得它们不表达一个或多个包含功能性TCR的亚基，或工程化使得它们在细胞表面上产生非常小的功能性TCR)和表达实质性受损的TCR的那些(例如，通过表达突变的或截短形式的一个或多个TCR亚基)。TCR缺陷T细胞包括美国专利申请No.9663763和美国专利公开No.20070036773中描述的那些。可以通过靶向编码特异性TCR(如TCR-α和TCR-β)和/或CD3链(例如，CD3ζ)的核酸，如通过将小发夹RNA(shRNA)引入靶向核酸的T细胞，或使用锌指核酸酶、转录激活子-样效应子核酸酶(TALEN)或CRISPR/Cas9系统来破坏内源性TCR，从而产生这样的T细胞。
在其他实施方案中，TCR缺陷细胞，如US9663763中描述的那些，从本发明中明确排除，即，在一些实施方案中，本公开的T细胞表达功能性TCR。功能性TCR可以是内源性的或重组TCR。
可以通过各种已知方法中的任一种来测量T细胞的生物活性。可以在体外、体内(例如，使用疾病的动物模型，如癌症或感染的动物模型)或离体评估T细胞的活性。评估的参数包括通过ELISA或流式细胞术评估的T细胞与抗原的特异性结合。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法，如Kochenderfer等，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等，J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定，来测量T细胞破坏靶细胞的能力。在特定的实施方案中，通过评估某些蛋白质(即，T细胞功能生物标志物)的表达和/或分泌，如CD107a、IFN-γ、IL-2、TNF和Ki67，来测量细胞的生物活性。例如，IFN-γ、IL-2和TNF可以用作用于CD8+T细胞激活的生物标志物；CD107a可以用作用于脱粒的标志物；和Ki67可以用作用于T细胞增殖的生物标志物。
根据本公开可以使用本领域已知用于检测T细胞功能生物标志物的任何方法。这样的方法包括，但不限于，FACS、Western印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射性免疫测定、点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分子、SAGE、MassARRAY技术和FISH，及其组合。
还可以，或替换地，通过评估临床结果来测量生物活性，所述临床结果如肿瘤负荷或载荷的减少。例如，可以给小的癌症动物模型(例如，携带肿瘤的小鼠)注射本公开的T细胞并可以监测和评估肿瘤负荷(如以下实施例中描述的)。
3.药物组合物和制剂
本文还提供了包含本公开的T细胞和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂。药物组合物还可以包含一种或多种其他活性剂，如一种或多种化疗剂或一种或多种抗感染剂。这些的非限制性实例在以下部分中详细描述并且任何一种或多种可以包括在本公开的药物组合物中。
可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如，小分子、核酸或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编辑(1980))混合来制备如本文所述的药物组合物和制剂。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者是无毒的，并且包括但不限于，缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；和金属配合物(例如，锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于胃肠外给药。或者，载体可以适用于静脉内、腹膜内、肌内或舌下给药。在特定实例中，药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体，用于临时制备无菌注射液或分散液。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本发明的药物组合物中的用途。在特定实施方案中，合适的载体包括但不限于汉克平衡盐溶液(HBSS)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
如所认知的，药物组合物通常在制造和储存条件下必须无菌和稳定。对于本公开的目的，将药物组合物配制成溶液。可以通过各种剂型给药T细胞和任选一种或多种其他药剂。因此，可以将药物组合物配制成单剂量或多剂量制备物。考虑本领域普通技术人员已知的任何生物学上可接受的剂型，包括，不限于，液体、溶液、悬浮液、乳液、注射剂(包括皮下、肌内、静脉内和经皮)、输注剂，及其组合。
4.治疗用途
本公开提供了用于增强受试者免疫功能(包括T细胞功能)的方法、用于治疗受试者癌症的方法和用于治疗感染的方法，上述方法通过将本文所述的表达DNAM-1的T细胞给药于受试者。因此，本公开的T细胞可以作为过继性细胞转移疗法的一部分给药于受试者，用于增强受试者的免疫功能，如用于治疗癌症或感染。
给药细胞以用于过继性细胞疗法的方法是已知的并且可以结合本公开来使用。例如，过继性T细胞疗法描述于例如美国专利申请公开No.2003/0170238；美国专利No.4,690,915；Rosenberg，2011，Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)；Themeli等，2013，NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等，2013，BiochemBiophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等，2013，PLoS ONE 8(4):e61338。
过继性细胞疗法可以通过自体转移来进行，其中从将接受细胞疗法的受试者或从来自此类受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面中，本公开的T细胞源自需要治疗的受试者，并且细胞在分离和加工后被施用于同一受试者。在其他实施方案中，细胞疗法通过同种异体转移进行，其中细胞是从将接受或最终接受细胞疗法的受试者之外的受试者分离和/或以其他方式制备的。在这样的实施方案中，细胞源自第一受试者，然后施用于相同物种的不同的第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相同或相似。例如，第二受试者可能表达与第一受试者相同的HLA类或超类型。还考虑异种转移，其中T细胞是从与将接受细胞疗法的受试者不同物种的受试者分离和/或以其他方式制备的细胞。
细胞可以通过任何合适的方式给药，例如通过推注、通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经隔膜注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射、结膜下注射、Tenon下注射、球后注射、球周注射或后巩膜注射。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给药，并且如果需要局部治疗，病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸腔内、颅内或皮下给药。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞的单次推注施用来施用。在其他实施方案中，例如在不超过3天的时间段内进行细胞的多次推注施用，或通过细胞的连续输注施用。
可以根据待治疗的疾病类型、T细胞类型、疾病的严重程度和病程、受试者的临床状况、受试者的临床病史和对治疗的反应，以及主治医师的判断力来确定合适的剂量。剂量可以根据在特定患者中诊断出的疾病的类型和阶段来凭经验确定。在本公开的内容中，给药于患者的剂量应足以随着时间在受试者中产生有益的治疗反应。剂量的大小也将取决于在特定患者中给药特定化合物所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度。确定特定情况的适当剂量在从业者的技能范围内。在一些实施方案中，以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量以小的增量增加，直到在情况下达到最佳效果。为方便起见，如果需要，总的日剂量可以划分并在一天中按部分给药。根据治疗医师的决定，可以每天给药或隔日给药。还可以在较长时间段(数周、数月或数年)内定期或连续给药，例如通过使用皮下胶囊、小袋或贮库，或通过贴剂或泵。
在一个实施方案中，将T细胞以约105至1011个细胞的量给药于受试者，如至少或约105、106、107、108、109、1010或1011个细胞。在特定的实施方案中，以108至1010个细胞的量给药T细胞。可以以任何认为是治疗性的且安全的频率给药T细胞，如以一周一次或多次的频率给药(例如，每日，或一周2、3、4、5或6次)，或每2、3、4、5、6、7、8、9、10、111、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周一次的频率给药。
本公开的T细胞可以单独给药或结合一种或多种其他治疗给药，包括一种或多种用于治疗癌症的抗癌治疗(例如，手术、放疗或化疗)，或一种或多种用于治疗感染的抗感染治疗。示例性治疗包括放疗、手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单抗疗法或上述疗法的组合。在一些实施方案中，其他疗法是放疗。在其他实施方案中，其他疗法是手术。在特定实施方案中，其他疗法是放疗和手术的组合。在一些实施方案中，其他疗法是伽马辐射。受试者可以在本公开的T细胞之前和/或之后暴露于一种或多种其他疗法。在一些实施方案中，受试者在给予T细胞的同时暴露于一种或多种其他疗法。在此类实施方案中，T细胞和其他疗法可以是例如在相同的制剂(如上述药物组合物)或在不同的制剂中。
化疗剂的非限制性实例包括厄洛替尼(
Figure BDA0003319880510000571
Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(
Figure BDA0003319880510000572
Millennium Pharm.)、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐孢菌素A、卡非佐米、17-AAG(格尔德霉素)、根霉酚、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(
Figure BDA0003319880510000573
AstraZeneca)、舒尼替布(
Figure BDA0003319880510000574
Pfizer/Sugen)、来曲唑(
Figure BDA0003319880510000575
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0003319880510000576
Novartis)、非那舒酯(
Figure BDA0003319880510000577
Novartis)、奥沙利铂(
Figure BDA0003319880510000578
Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、亚叶酸、雷帕霉素(Sirolimus，
Figure BDA0003319880510000579
Wyeth)、Lapatinib(
Figure BDA00033198805100005710
GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SCH 66336)、索拉非尼(NEXAVAR)、Bayerfiib(
Figure BDA0003319880510000581
AstraZeneca)、AG1478、烷化剂，如噻替哌和
Figure BDA0003319880510000582
环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、丙硫丹、哌硫丹；苯并多巴、碳醌、美托多巴、乌多巴等氮丙啶类；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；醋酸菌素(尤其是布拉他辛和布拉他西酮)；喜树碱(包括拓扑替康和伊立替康)；苔藓抑素；卡司他丁；CC-1065(包括其阿多来辛、卡泽来新和比泽莱辛合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；肾上腺皮质激素(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶，包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、丙戊酸、莫西司他多拉司他；阿地白介素、滑石多霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；胰蛋白酶抑制剂；嗜血素；海绵抑素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、氯霉嗪、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸甲氯乙胺、美法仑、新氮芥、苯乙酮、泼尼莫司汀、曲磷酰胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲类，例卡莫司汀、氯唑菌素、福替莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素1I和加利车霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994 33:183-186)；动力霉素，包括动力霉素A；双膦酸盐，如氯膦酸盐；安奈斯霉素；以及新制癌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、红霉素、氮杂丝氨酸、博来霉素、仙人掌霉素、角豆素、樟脑霉素、亲碳素、嗜铬霉素、更生霉素、柔红霉素、去托霉素、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，
Figure BDA0003319880510000583
(阿霉素)、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依柔比星、伊达比星、马塞洛霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、哌霉素、泊弗霉素、嘌呤霉素、奎拉霉素、罗柔比星、链黑素、链脲佐菌素、结核菌素、乌苯美司、净司他丁、唑霉素；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如地蝶呤、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙酯；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫胺嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如阿西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依西他滨、氟尿苷；雄激素，如卡甾酮、丙酸屈莫他酮、表甾烷醇、美皮司坦、睾酮内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如弗洛林酸；乙酰丙酮；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；烯尿嘧啶；安吖啶；贝司他韦；比生群；依达沙酯；去脂胺；地美可辛；二嗪酮；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；lentinan；氯奈宁；美登素类，如美登素和安丝菌素；米托瓜松；米托蒽醌；吗匹丹酚；硝胺；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛氧蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0003319880510000591
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根瘤菌素；四唑呋喃；螺锗；牛磺酸；三嗪酮；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、藜芦素A、roridin A和蛇形菌素)；氨基甲酸酯；长春花碱；达卡巴嗪；甘露糖碱；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；派泊溴烷；加胞嘧啶；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉醇类，例如TAXOL(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、
Figure BDA0003319880510000592
(不含Cremophor)、紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，IL)和
Figure BDA0003319880510000593
(多西紫杉醇、多西他赛；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥；
Figure BDA0003319880510000594
(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；
Figure BDA0003319880510000595
(长春瑞滨)；诺凡酮；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨
Figure BDA0003319880510000596
伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸，如视黄酸；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
化疗剂还包括(i)用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括
Figure BDA0003319880510000597
柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、碘氧芬、4-羟基三苯氧胺、曲昔芬、克昔芬、LY117018、奥那普利司通和
Figure BDA0003319880510000598
(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，芳香酶调节肾上腺中雌激素的产生，如，例如4(5)-咪唑、氨基鲁米特、
Figure BDA0003319880510000599
(醋酸甲地孕酮)、
Figure BDA00033198805100005910
(依西美坦；Pfizer)、formestanie、法屈唑、
Figure BDA00033198805100005911
(沃洛唑)、
Figure BDA00033198805100005912
(来曲唑；Novartis)和
Figure BDA00033198805100005913
(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素药，如氟他胺、尼鲁他胺、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；布舍瑞林、曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己烯雌酚、普力马、氟甲睾酮、所有反式维甲酸、芬维A胺以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号通路中基因表达的反义寡核苷酸，如，例如Ralf和H-Ras；(vii)核酶，如VEGF表达抑制剂(例如，
Figure BDA0003319880510000601
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，如基因治疗疫苗，例如
Figure BDA00033198805100006014
Figure BDA0003319880510000602
和
Figure BDA0003319880510000603
Figure BDA0003319880510000604
rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，如
Figure BDA0003319880510000605
Figure BDA0003319880510000606
rmRH；(ix)任何上述物质的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
抗癌抗体也是化疗剂并且可用于本文的方法和组合物中。此类抗体包括但不限于阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(
Figure BDA0003319880510000607
Genentech)；西妥昔单抗(
Figure BDA0003319880510000608
Imclone)；帕尼单抗(
Figure BDA0003319880510000609
Amgen)、利妥昔单抗(
Figure BDA00033198805100006010
Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠单抗(
Figure BDA00033198805100006011
2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(
Figure BDA00033198805100006012
Genentech)、托西妥单抗(Bexxar，Corixia)和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(
Figure BDA00033198805100006013
Wyeth)。具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的其他人源化单克隆抗体包括：阿波利珠单抗、阿塞珠单抗、阿特利珠单抗、巴匹珠单抗、比伐珠单抗美登、坎妥珠单抗美坦、赛德珠单抗、赛妥珠单抗聚乙二醇、cidfusituzumab、cidtuzumab、达克珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、erlizumab、非维珠单抗、芳妥珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、伊妥珠单抗奥佐米星、伊匹单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利珠单抗、莫他珠单抗、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗、诺维珠单抗、numavizumab、奥瑞珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕斯科珠单抗、培昔单抗、帕妥珠单抗、pexicozuma、雷利珠单抗、雷珠单抗、reslivizumab、reslizumab、瑞思利珠单抗、罗维珠单抗、卢利珠单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗、sontuzumab、他卡妥珠单抗四西坦、tadocizumab、talizumab、tefibazumab、tocilizumab、托利珠单抗、tucotuzumab celmoleukin、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗、优特克单抗、visilizumab和抗白介素12(ABT-874/J695，WyethResearch and Abbott Laboratories)，其是一种专门重组人序列的全长IgG.sub.1.lamda抗体，经基因修饰以识别白细胞介素-12p40蛋白。
化疗剂还包括EGFR抑制剂，其涉及结合或另外与EGFR直接相互作用并防止或降低其信号传导活性的化合物，并且可替换地称为“EGFR拮抗剂”。此类药剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4.943,55)及其变体，如嵌合225(C225或西妥昔单抗；
Figure BDA0003319880510000611
)和重塑人225(H225)(参见，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，完全人、EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所述的；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF或帕尼单抗(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD55900(Stragliotto等，Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗)，针对EGFR的人源化EGFR抗体，可与EGF和TGF-α竞争EGFR结合(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；全人抗体，称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3并描述于美国专利No.6,235,883；MDX-447(Medarex公司)；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns等，2004，J.Biol.Chem.279(29):30375-30384)。抗EGFR抗体可以与细胞毒剂偶联，从而产生免疫偶联物(参见例如EP659439A2，Merck PatentGmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，如美国专利No.5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498，以及以下PCT公开：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中描述的化合物。特别的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、厄洛替尼、
Figure BDA0003319880510000612
Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替尼
Figure BDA0003319880510000613
4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4--d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)-；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(-二甲氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼(
Figure BDA0003319880510000621
GSK572016或N-[3-氯-4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰)乙基]氨基]甲基]-2--呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
其他化疗剂是酪氨酸激酶抑制剂，包括之前段落中记载的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，如可从Takeda获得的TAK165；CP-724,714，口服ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双重-HER抑制剂，如EkB-569(可从Wyeth获得)，其优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR超表达细胞；拉帕替尼(GSK572016；可从Glaxo-SmithKline获得)，口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartid获得)；pan-HER抑制剂，如卡那替尼(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，如可从ISIS Pharmaceuticals获得的抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132；非HER靶向TK抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0003319880510000622
可从Glaxo SmithKline获得)；多靶向酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼(
Figure BDA0003319880510000623
可从Pfizer获得)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如瓦他拉尼(PTK787/ZK222584，可从Novartis/Schering AG获得)；MAPK胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia获得)；喹唑啉，如PD 153035、4-(3-氯苯胺)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如与HER编码核酸结合的分子)；喹喔啉(美国专利No.5,804,396)；色氨酸(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；pan-HER抑制剂，如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼
Figure BDA0003319880510000631
PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imcloen)，雷帕霉素(西罗莫司，
Figure BDA0003319880510000632
)；或如以下任何专利公开中所述的：美国专利No.5,804,396；WO 1999/09016(American Cyanamid)；WO 1998/43960(AmericanCyanamid)；WO 1997/38983(Warner Lambert)；WO 1999/06378(Warner Lambert)；WO1999/06396(Warner Lambert)；WO 1996/30347(Pfizer，Inc)；WO 1996/33978(Zeneca)；WO1996/3397(Zeneca)和WO 1996/33980(Zeneca)。
化疗剂还包括地塞米松、干扰素、秋水仙碱、美托品、环孢菌素、两性霉素、甲硝唑、阿仑单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、氨磷汀、三氧化二砷、天冬酰胺酶、BCG live、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、克拉屈滨、右旋苯丙胺、右旋苯甲酸非格司亭、醋酸组氨瑞林、伊布单抗、干扰素α-2a、干扰素α-2b、来那度胺、左旋咪唑、美司钠、甲氧沙林、诺龙、奈拉滨、诺夫妥单抗、奥培夫金、帕利弗明、帕米膦酸钠、聚乙二醇化丁烯二甲酸乙二醇酯、聚乙二醇酯、奎纳克林、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、唑来膦酸盐和唑来膦酸，及其药学上可接受的盐。
化疗剂还包括氢化可的松，醋酸氢化可的松、醋酸可的松、新戊酸替可的松、曲安奈德、曲安奈德醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松、氟轻松、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松、地塞米松、地塞米松、地塞米松17-戊酸氢化可的松、二丙酸阿氯米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、泼尼碳酸盐、17-丁酸氯倍他松、17-丙酸氯倍他索、己酸氟可龙、新戊酸氟可龙和醋酸氟泼尼松；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构形式(feG)(IMULAN BioTherapeutics，LLC)；抗风湿药，如硫唑嘌呤、环孢素(环孢素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、来氟米诺环素、柳氮磺吡啶、肿瘤坏死因子α(TNF-α)阻断剂，如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(瑞利米单抗)(Humira)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、白介素1(IL-1)阻断剂，如阿那白滞素(Kineret)，T细胞共刺激阻断剂，如阿巴西普(Orencia)，白介素6(IL-6)阻断剂，如托珠单抗
Figure BDA0003319880510000641
白介素13(IL-13)阻断剂，如lebrikizumab；干扰素α(IFN)阻断剂，如Rontalizumab；β7整合素阻断剂，如rhuMAbβ7；IgE通路阻断剂，如抗-M1prime；分泌型同源三聚体LTa3和膜结合异源三聚体LTa1/β2阻断剂，例如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；其他研究性药物，如硫铂、PS-341、苯基丁酸盐、ET-18-OCH3或法呢基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832)；槲皮素、白藜芦醇、云杉醇、表没食子儿茶碱没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、桦木酸及其衍生物等多酚类；自噬抑制剂，如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，
Figure BDA0003319880510000642
)；β-拉帕酮；拉帕舒尔；秋水仙碱；桦木酸；乙酰喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素；替加氟
Figure BDA0003319880510000643
贝沙罗汀
Figure BDA0003319880510000644
双膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如
Figure BDA0003319880510000645
或
Figure BDA0003319880510000646
)、依替膦酸盐
Figure BDA0003319880510000647
NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐
Figure BDA0003319880510000648
阿仑膦酸盐
Figure BDA0003319880510000649
帕米膦酸盐
Figure BDA00033198805100006410
替鲁膦酸盐
Figure BDA00033198805100006411
)，或利塞膦酸盐
Figure BDA00033198805100006412
和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如
Figure BDA00033198805100006413
疫苗；perifosine、COX-2抑制剂(例如塞来昔布或依托考昔)、蛋白酶体抑制剂(例如PS341)；CCI-779；替比法尼(R11577)；奥拉非尼，ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥默森钠
Figure BDA00033198805100006414
吡蒽酮；法呢基转移酶抑制剂，例如lonafarnib(SCH 6636，SARASARTM)；和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，例如CHOP，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写；和FOLFOX，奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写。
化疗剂还包括具有镇痛、解热和抗炎作用的非甾体抗炎药。NSAID包括环氧化酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体实例包括阿司匹林、丙酸衍生物，如布洛芬、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪和萘普生，乙酸衍生物，如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、双氯芬酸，烯醇酸衍生物，如吡罗昔康、美洛昔康、屈昔康、氯诺昔康和异昔康，芬那酸衍生物，如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸和COX-2抑制剂，如塞来昔布、依托考昔、罗美昔布、帕瑞昔布、罗非昔布、罗非昔布和伐地昔布。NSAID可用于缓解如下病症的症状，如类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、Reiter’s综合征、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、术后疼痛、由于炎症和组织损伤引起的轻度至中度疼痛、发热、肠梗阻和肾绞痛。
在其他实例中，将本公开的T细胞结合抗感染药物给药。抗感染药物合适地选自抗微生物剂，包括但不限于杀死或抑制微生物(如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等)生长的化合物，并且因此包括抗生素、杀虫剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗疟剂、抗结核剂和抗病毒剂。抗感染药物在其范围内还包括驱虫剂和杀线虫剂。说明性的抗生素包括喹诺酮类(例如，氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、奥索利酸、培氟沙星、罗索沙星、替马沙星、托氟沙星、司帕沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星；吉米沙星；和加雷沙星)、四环素、甘氨酰环素和恶唑烷酮(例如，金霉素、地甲环素、强力霉素、莱美环素、美他环素、米诺环素、土霉素、四环素、替加环素；利奈唑胺、依哌唑胺)、糖肽类、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、阿贝卡星、布特罗辛、地贝卡星、福替霉素、庆大霉素、卡那霉素、美霉素、奈替米星、核糖霉素、西索米星、壮观霉素、链霉素、妥布霉素)、-内酰胺类(例如亚胺培南、美罗培南、比阿培南、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢曼多、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑林、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢尼特、头孢噻肟、头孢替安、头孢匹米唑、头孢吡胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布坦、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑南、头孢乙腈、头孢氨苄、头孢霉素、头孢洛定、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢硝唑、头孢西丁、头孢替坦、氨苄西林、卡鲁莫南、氟氧头孢、莫沙内酰胺、脒西林、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄青霉素、苄青霉素、卡非西林、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、磺苄西林、替莫西林、替卡西林、头孢托仑、SC004、KY-020、头孢地尼、头孢布坦、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑仑、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-2000、LY206763)、利福霉素、大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、夹竹桃霉素、罗基霉素、罗莎霉素、罗红霉素、金霉素)、酮内酯类(例如，泰利霉素、头孢霉素)、香豆素、林可酰胺(例如，克林霉素、林可霉素)和氯霉素。示例性抗病毒剂包括硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉夫定、去羟肌苷、依法韦仑、泛昔洛韦、福米韦森钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸奈非那韦、奈韦拉平、磷酸奥司他韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。杀虫剂或抗原生动物的非限制性实例包括阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝唑、盐酸甲硝唑和戊脒羟乙磺酸盐。驱虫药可以是选自甲苯咪唑、吡喃噻唑、阿苯达唑、伊维菌素和噻菌灵中的至少一种。示例性抗真菌剂可以选自两性霉素B、两性霉素B胆固醇硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素微粒、灰黄霉素超微粒、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素和氢氯化物。抗疟药的非限制性实例包括盐酸氯喹、磷酸氯喹、强力霉素、硫酸羟氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、乙胺嘧啶和乙胺嘧啶与磺胺多辛。抗结核药包括但不限于氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷丁和硫酸链霉素。
在一些实施方案中，将T细胞给药于其的受试者患有癌症。癌症的实例包括但不限于，癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃的癌或胃癌，包括胃肠道癌和胃肠道间质癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾的癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤)(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞NHL；大块病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和Waldenstrom’s的巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，以及与晶状体病、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs’综合征、脑以及头颈癌和相关转移相关的异常血管增殖。在某些实施方案中，适合用本发明抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波济肉瘤、类癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结直肠癌(CRC)和肝细胞癌。然而，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌，包括这些癌症的转移形式。在特定的实施方案中，癌症是黑素瘤或肺癌，合适地是转移性黑素瘤或转移性肺癌。
在一些实施方案中，个体患有对一种或多种免疫疗法具有抗性的癌症，包括一种或多种免疫检查点抑制剂，包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。对抑制剂的耐药性可能表现为癌症复发或难治性癌症。复发可能是指癌症在治疗后在原位或新位点再次出现。在一些实施方案中，对免疫检查点抑制剂的抗性表现为在用抑制剂治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，对免疫检查点抑制剂的抗性导致对治疗没有反应的癌症。癌症可能在治疗开始时具有耐药性，也可能在治疗期间变得耐药。在一些实施方案中，癌症处于早期或晚期。
在本公开的特定实施方案中，受试者可以进行白细胞去除术，其中白细胞被离体收集、富集或耗尽以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如，T细胞，基本上如上所述。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法进行扩增，并任选地进行工程化以表达重组DNAM-1和/或其他重组分子(例如TCR或CAR)。有需要的受试者随后可以接受高剂量化疗的标准治疗，然后是外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或同时，受试者接受本公开的扩增T细胞的输注。在另一方面，扩增的细胞在手术之前或之后施用。
在一些实施方案中，受试者患有感染并且将本公开的T细胞给药于受试者以治疗感染。感染包括但不限于由病毒、朊病毒、细菌、类病毒、寄生虫、原生动物和真菌引起的感染。病毒的非限制性实例包括逆转录病毒科人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)；和其他分离株，如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；钙病毒科(例如，引起肠胃炎的菌株，包括诺沃克病毒和相关病毒)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒、布尼亚病毒、静脉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、轮状病毒和轮状病毒)；双病毒科；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、VACV、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、δ型肝炎的病原体(认为是乙肝病毒的缺陷卫星)、非A、非B型肝炎的病原体(类1＝内部传播；类2＝肠胃外传播(即丙肝)；和星状病毒。已知具有致病性的代表性细菌包括致病性巴氏杆菌属种(例如多杀性巴氏杆菌)、葡萄球菌属种(例如金黄色葡萄球菌)、链球菌属种(例如化脓性链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌(草绿色组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧菌)、肺炎链球菌)、奈瑟菌属种(例如淋病奈瑟菌、脑膜炎球菌)(例如，产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)和侵袭性大肠杆菌(EIEC))，博德特氏菌属、弯曲杆菌属、军团菌属(例如嗜肺军团菌)、假单胞菌属、志贺氏菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌)、布鲁氏菌属、弗朗西斯氏菌属、拟杆菌属、梭菌属种(例如，艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌)、分枝杆菌属种(例如，结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、关赛分枝杆菌、戈多纳分枝杆菌)、幽门螺杆菌、伯氏疏螺旋体、单核细胞增生李斯特菌、肠球菌属、炭疽芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、梅毒螺旋体、细长螺旋体、钩端螺旋体和伊克氏菌。非限制性致病真菌包括新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉和申克孢子丝。示例性致病原生动物、蠕虫、疟原虫，例如恶性疟原虫、疟疾疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫；弓形虫；布氏锥虫，克氏锥虫；血吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫；多诺瓦利什曼原虫；贾第鞭毛虫；隐孢子虫；等等。
一旦将细胞给药于受试者，可以通过任一种已知的方法测量T细胞的生物活性(例如，T细胞激活、T细胞增殖、细胞毒性活性和/或抗肿瘤活性)。评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内，例如通过成像测量，或离体，例如通过ELISA或流式细胞术测量。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量细胞破坏靶细胞的能力，如Kochenderfer等，J.Immunotherapy，32(7):689-702(2009)和Herman等，J.Immunological Methods，285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在特定实施方案中，通过测定某些蛋白质(例如，T细胞功能生物标志物)的表达和/或分泌来测量生物活性，如CD107a、IFN-γ、IL-2、TNF和Ki67。还可以通过或替换地通过评估临床结果(如肿瘤负荷或载荷的减轻)来测量生物活性。在一些方面中，评估毒性结果、细胞的持久性和/或扩增，和/或宿主免疫应答的存在或不存在。
根据本公开可以使用本领域已知的检测T细胞功能生物标志物的任何方法。这样的方法包括，但不限于，FACS、蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射性免疫测定、点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH，及其组合。
在一些实施方案中，通过蛋白质表达检测了样品中的任一种或多种T细胞功能生物标志物。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)测定蛋白质表达。在一些实施方案中，使用特异性结合生物标志物的抗体检测任一种或多种T细胞功能生物标志物。
在特定实施方案中，与给药T细胞之前相比，通过检测和/或测量产生IFN-γ的CD8+T细胞和/或增强的细胞溶解活性来评估受试者中激活的CD8+T细胞。IFN-γ可以通过本领域已知的任何方式测量，包括例如涉及细胞固定、透化和使用抗IFN-γ抗体染色的细胞内细胞因子染色(ICS)。细胞溶解活性可以通过本领域已知的任何方式来测量，例如，使用混合效应细胞和靶细胞的细胞杀伤试验。在其他实施方案中，细胞因子(如IFN-γ、TNF-α和白介素，如IL-2)的释放被评估为活化的CD8+T细胞的标志物。细胞因子释放可以通过本领域已知的任何方式来测量，例如，使用蛋白质印迹、ELISA或免疫组织化学测定来检测含有T细胞的样品中释放的细胞因子的存在。在进一步的实施方案中，T细胞增殖通过确定Ki67+CD8+T细胞的百分比来检测(例如，通过FACS分析)。在一些实施方案中，T细胞增殖通过测定Ki67+CD4+T细胞的百分比来检测(例如，通过FACS分析)。在一些实施方案中，T细胞来自外周血。在其他实施方案中，T细胞来自肿瘤。
5.诊断用途
如本文所证明的，DNAM-1对肿瘤环境中T细胞的免疫功能很重要，并且是癌症存活和对癌症治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)反应性的预后。因此，DNAM-1可用作T细胞功能的生物标志物。因此，本公开内容还提供了通过确定获自受试者的T细胞上的DNAM-1含量或水平和/或群体中DNAM-1+T细胞的数量或百分比来评估受试者的免疫功能和/或受试者中T细胞(例如CD4+或CD8+T细胞)的免疫功能的方法。本公开还提供了通过确定获自受试者的T细胞中的DNAM-1的表达水平、获自受试者的T细胞上的DNAM-1的含量或水平和/或群体中DNAM-1+T细胞的数量或百分比来预测受试者在癌症中存活的可能性或患有癌症的受试者的存活时间的方法。还提供了通过确定获自受试者的T细胞中的DNAM-1的表达水平、获自受试者的T细胞上的DNAM-1的含量或水平和/或群体中DNAM-1+T细胞的数量或百分比来预测患有癌症的受试者对癌症疗法(例如使用免疫检查点抑制剂)作出反应的可能性的方法。在一些实施方案中，表面DNAM-1水平用作T细胞免疫功能、癌症存活和/或对治疗的反应性的生物标志物。在特定实施方案中，群评估体中DNAM-1+T细胞的数量并用作生物标志物(例如表面DNAM-1呈阳性的T细胞的数量或百分比)。在又一个实施方案中，评估DNAM-1+CD8+T细胞的数量或百分比，例如，肿瘤浸润DNAM-1+CD8+T细胞/总CD8+T细胞的数量。在进一步的实施方案中，DNAM-1的表达水平用作癌症存活的生物标志物。
T细胞可以获自含T细胞的患者样品，其合适地选自组织样品，如肿瘤或流体样品，如外周血。在一些实施方案中，在用治疗组合物治疗之前、之中和/或之后获得样品。因此，在特定实施方案中，所述方法可以用于监测治疗期间或治疗之后的T细胞免疫功能，且因此，在一些实例中，可以监测治疗的有效性。在一些实施方案中，组织样品是福尔马林固定和石蜡包埋的、存档的、新鲜的或冷冻的。
可以基于本领域已知的任何合适的标准，包括但不限于DNA、mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝数，来定性和/或定量测定DNAM-1或DNAM-1+细胞的水平或含量。在特定实施方案中，定量评估DNAM-1表达水平、T细胞表面上的DNAM-1蛋白质的含量或DNAM-1+T细胞的数量。在一些实例中，将来自受试者的样品中的DNAM-1表达水平、T细胞表面上的DNAM-1蛋白质的含量或DNAM-1+T细胞的数量与第二样品进行比较，第二样品是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织，并且已知DNAM-1水平与特定的表型(例如，免疫功能(例如，有效的免疫功能，或无效的或受损的免疫功能)、对治疗的响应性(例如，对治疗完全响应、部分响应或无响应)、或存活时间(例如，数月，或数年))相关。在其他实例中，将来自受试者的样品中的DNAM-1表达水平、T细胞表面上的DNAM-1蛋白质的含量或DNAM-1+T细胞的数量与参照水平/含量/数量进行比较，其中已知参照水平与特定表型相关，或是截留、高于或低于，已知其与特定的表型(例如，免疫功能(例如，有效的免疫功能，或无效的或受损的免疫功能)、对治疗的响应性(例如，对治疗完全响应、部分响应或无响应)、或存活时间(例如，数月，或数年))相关。通过将样品中的DNAM-1或DNAM-1+细胞的水平或含量与参照或对照进行相比，可以进行例如免疫功能、对治疗的响应性和/或癌症存活的评估。例如，在待评估免疫功能的情况中，参照或对照可以与正常的免疫功能或有效的免疫功能，或异常的免疫功能、无效的免疫功能或受损的免疫功能相关。因此可以通过将样品中的DNAM-1水平与第二样品中的DNAM-1水平进行比较来确定受试者的免疫功能和/或获自受试者的样品中的T细胞的免疫功能，已知第二样品中的DNAM-1水平与T细胞的免疫功能相关。例如，在某些实施方案中，与第二样品中的水平/含量相比，受试者样品中的DNAM-1的水平/含量降低或减少。在第二样品表示正常免疫功能或有效免疫功能的情况中，受试者样品中比较较低的DNAM-1水平/含量表示受试者样品中的T细胞具有受损的、异常或无效的免疫功能。在其他实施方案中，与第二样品中的水平/含量相比，受试者样品中的DNAM-1水平/含量增加或升高。在第二样品表示受损的、异常或无效的功能的情况中，受试者样品中比较较高的DNAM-1水平/含量表示受试者样品中的T细胞具有正常或有效的免疫功能，并且延伸至受试者具有正常或有效的免疫功能。在第二样品表示正常或有效的免疫功能的情况中，受试者样品中比较较高的DNAM-1水平/含量可以表示受试者样品中的T细胞具有提高或特别有效的免疫功能，并且延伸至受试者具有提高的或特别有效的免疫功能。在更多实施方案中，通过将样品中的DNAM-1水平与第二样品中的DNAM-1水平进行比较来确定受试者的免疫功能和/或来自受试者的样品中的T细胞的免疫功能。已知第二样品的DNAM-1水平与T细胞的免疫功能相关。例如，在某些实施方案中，与第二样品中的水平/含量相比，受试者样品中的DNAM-1的水平/含量降低或减少。
在一些实施方案中，增加或升高的水平或含量是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，通过标准的领域已知方法(如本文所述的那些)检测的DNAM-1的水平或含量，总体增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％或更高中的任一个。在某些实施方案中，升高的含量或水平是参照样品、参照细胞、参照组织、对照细胞或对照组织中的DNAM-1的表达水平/含量的至少约1.5×、1.75×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、25×、50×、75×或100×中的任一个。
在其他实施方案中，降低的水平或含量是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，通过标准的领域已知方法(如本文所述的那些)检测的DNAM-1的水平或含量，总体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个。在某些实施方案中，降低的水平或含量是指参照样品、参照细胞、参照组织、对照细胞或对照组织中的DNAM-1的表达水平/含量降低至少约0.9×、0.8×、0.7×、0.6×、0.5×、0.4×、0.3×、0.2×、0.1×、0.05×或0.01×中的任一个。
在特定实施方案中，评估群体中DNAM+T细胞的数量或百分比。“DNAM+T细胞”是在其表面上表达可检测水平或高于认为是表示“阳性”结果的预定水平的水平的DNAM-1的T细胞。在一个实施方案中，测定DNAM+CD+T细胞的数量，例如，群体(例如，肿瘤浸润T细胞的群)中DNAM+CD8+T细胞/总CD8+T细胞的数量。
可以通过各种方法来分析样品中DNAM-1的水平或含量，或DNAM+T细胞的数量，这些方法中的许多是本领域已知的并且被本领域技术人员所了解，包括，但不限于，免疫组织化学(“IHC”)、免疫荧光(IF)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合分析、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、基于血液的定量分析(例如血清ELISA)、生化酶活性测定、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(“PCR”)，包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增类型检测方法，如例如，分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达剖析和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可以通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的各种分析中的任何一种。在特定实施方案中，通过FACS、IF或IHC检测和/或分析T细胞上的DNAM-1表面表达。例如，通过FACS、IF或IHC检测T细胞上的DNAM-1表面表达来评估群体中DNAM-1+T细胞的数量或百分比(例如DNAM-1+CD8+T细胞的数量或百分比)。应当理解，在此类方法中，来自受试者的生物样品与直接或间接标记(例如荧光标记)的抗DNAM-1抗体接触，然后检测在表面上表达DNAM-1的T细胞与抗体之间形成的复合物。在进一步的实施方案中，还在与抗DNAM-1抗体接触之前、之中或之后标记、选择或分离T细胞，如通过使用抗CD3和/或抗CD8抗体。
在将所述方法用于确定用癌症治疗受试者的响应性的可能性的情况中，如免疫检查点级联，或癌症存活时间，受试者可能患有任何癌症。在一些实例中，癌症是实体癌症或肿瘤。在其他实例中，癌症是白血病。癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃的癌或胃癌，包括胃肠道癌和胃肠道间质癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾的癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散黑色素瘤、恶性黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B-细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞NHL；大块病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS-相关淋巴瘤；和Waldenstrom’s巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，以及与显性细胞瘤、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs’综合征、脑以及头颈癌和相关转移相关的异常血管增殖。在某些实施方案中，适合用本发明抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自黑素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌、头颈癌和结肠直肠癌。
在一些实例中，一旦对受试者的免疫反应、癌症存活或对癌症治疗的响应性进行评估，则进一步给予受试者治疗(例如过继性细胞治疗、化学治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)、抗感染治疗和/或上述任何其他疗法)。例如，如果确定受试者可能对癌症疗法(例如化疗剂，如免疫疗法，如免疫检查点抑制剂疗法)有反应或具有特定的存活时间(任何存活时间)，则该受试者可以施用癌症疗法(例如化疗剂，如免疫疗法，如免疫检查点抑制剂疗法)。如果确定受试者不太可能对癌症治疗有反应或免疫功能受损，则可以向受试者施用治疗以增强免疫功能(包括T细胞功能)和/或对治疗的响应性，如上文第4节中任何描述的内容。在特定实施方案中，向受试者施用本文所述的表达DNAM-1(包括内源性、重组和/或修饰的DNAM-1)的T细胞。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现将通过以下非限制性实施例来描述特定优选的实施方案。
实施例
实施例1
材料和方法
小鼠
野生型(WT)C57BL/6购自Walter and Eliza Hall Institute for MedicalResearch或内部培育。C57BL6 Pmel-1 TCRtg GFP小鼠(Glodde等，2017年)、C57BL/6CD226缺陷型(CD226KO)小鼠(Gilfillan等，2008年)、C57BL/6CD226KO Pmel-1 TCRtg GFP小鼠、C57BL/6CD226Y319F(CD226Y)小鼠(Zhang等，2015年)、C57BL/6CD226Y Pmel-1 TCRtg GFP小鼠和C57BL/6CD155缺陷型(CD155KO)(Li等，2018年)小鼠在内部饲养并在QIMRBerghofer医学研究所维持。大于6周龄的小鼠与适当的模型进行性别匹配。每个实验的每组处理或小鼠品系中的小鼠数量在图例中指示。在所有研究中，根据预先建立的标准，没有小鼠被排除在外，并在治疗实验中治疗前立即应用随机化。实验是在QIMR Berghofer医学研究所动物伦理委员会批准的情况下进行的。
细胞系和培养
将小鼠B16F10(黑素瘤)(最初获自ATCC)、B16F10ctrl、B16F10CD155KO(Li等，2018，JClin Invest 128，2613-2625)、MC38(结肠腺癌，380VMC，3800MC38)、MC38-OVAdim、MC38-OVAhi(Gilfillan等，2008，J Exp Med 205，2965-2973)、HEK293T(来自澳大利亚布里斯班QIMRBerghofer的A/Prof Steven Lane的惠赠)和RM-1(前列腺癌)(Blake等，2016，CancerDiscov6，446-459)细胞在补充了10％胎牛血清(FCS；Cell Sera)、1％谷氨酰胺(Gibco)、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸(Gibco)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM；Gibco)中生长。将小鼠LWT1(黑素瘤)(Ferraride Andrade等，2014，Cancer Res 74，7298-7308)和HCmel12-PmelKO-Tyrp1-Scarlett-hgp100(HCmel12hgp100)(黑素瘤)(Effern等，正在审核中)细胞在由补充了10％FCS(CellSera)、1％谷氨酰胺(Gibco)、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸(Gibco)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)组成的“完全RPMI培养基”中培养。CHO衍生细胞系在补充了4％谷氨酰胺(Gibco)和2％次黄嘌呤、胸苷(Corning)的CHO完全培养基(Thermo Fisher)中培养。B16F10及其变体，HCmel12hgp100、RM-1和LWT1细胞系在37℃、5％CO2下维持。所有MC38衍生的细胞系都在37℃、10％CO2下维持。CHO衍生的细胞系在37℃、8％CO2并在125rpm下维持。按前所述(Effern等，正在审核中)，产生了缺乏内源性gp100并表达标记到酪氨酸酶相关蛋白1基因座的人gp100表位的HCmel12细胞系。注射和监测程序在之前的研究中有描述(Glodde等，2017，Immunity 47，789-802e789；Li等，2018，J ClinInvest128，2613-2625)。所有细胞系的支原体检测均呈阴性，但未常规进行细胞系验证。
原代细胞培养
对于体外研究，将从小鼠脾脏中分离的骨髓细胞和/或T细胞的单细胞悬液在另外补充了1mM HEPES(Gibco)和50μM 2-巯基乙醇(Sigma)的“完全RPMI培养基”(如上所述)中，在37℃，5％CO下培养。
CHO-OKT3和CHO-OKT3-CD155超表达细胞的产生
人PVR(NM_006505，NP_006496)从R&D Systems RDC1289亚克隆到pLenti-EF1a(Origene)中。慢病毒是根据制造商的说明(Clontech)使用Lenti-X Single Shot包装系统生产的。CHO-OKT3(亚克隆2E5；Immuno-Oncology Discovery，Bristol-Myers Squibb)细胞用聚凝胺(Sigma；5μg/ml)转导，并针对CD155表达进行分选。
CRISPitope-工程化的细胞系(Hcmel12hgp100)的产生
HCmel12hgp100细胞系如先前所述(Effern等，正在审核中)产生。简而言之，通过靶向CRISPR/Cas9产生了HCmel12黑素瘤细胞中Pmel基因的稳定敲除。HCmel12细胞用px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSPCas9(Addgene#42230)质粒转染，该质粒编码的双链DNA寡核苷酸靶向编码鼠Pmel基因外显子1中的pmel-1T细胞表位的基因组区的上游。Pmel敲除单细胞克隆的基因组畸变通过下一代测序来表征，并使用网络工具OutKnocker(Schmid-Burgk等，2014，Genome Res 24，1719-1723)进行分析。将质粒px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSPCas9用作目标选择器。将靶向所需靶基因C-末端的双链DNA寡核苷酸克隆到BbsI消化的px330中以生成功能性sgRNA。框架选择器pCAS9-mCherry-Frame+0、pCAS9-mCherry-Frame+1和pCAS9-mCherry-Frame+2是Veit Hornung的礼物(LMU，德国慕尼黑；Addgene#66939、#66940和#66941)。基于先前描述的pCRISPaint-mNeon-PuroR质粒(Schmid-Burgk等，2016，NatCommun 7，12338)，克隆了通用供体质粒。通用供体pCRISPaint-mNeon-PuroR是VeitHornung(LMU，慕尼黑，德国)的礼物。使用分子克隆方法，通过以下方式进一步修饰pCRISPaint-mNeon-PuroR质粒：(1)用杀稻瘟素抗性盒交换嘌呤霉素抗性盒，(2)用甘氨酸(GGG)交换抗性盒的蛋氨酸起始密码子(ATG)以防止从随机基因组整合的转录，(3)通过mScarlet荧光蛋白交换mNeon荧光蛋白，以及(4)将FLAG标签和人gp100表位(aa25-33)添加到荧光蛋白(C-末端)。CRISPitope工程化的HCmel12黑素瘤细胞是通过CRISPR辅助的表位插入靶向Pmel基因的C-末端产生的。对于CRISPitope质粒转染，将50.000-100.000HCmel12-gp100敲除细胞接种于96孔板中，并用Opti-MEM I(Life Technologies)中的200ng DNA(50ng目标选择器、50ng框架选择器和100ng通用供体)转染，根据制造商的说明使用0.6μlFugene转染试剂(Promega))。选择之后，使用FACS Aria III高速细胞分选仪(BD)对CRISPitope工程化的细胞系针对mScarlet表达进行分选，并随后建立单个细胞系的多克隆培养物。
肿瘤移植
同基因C57BL/6小鼠队列皮下(s.c.)注射100-200μl PBS中的1×105B16F10黑素瘤、1×105或1×106MC38结肠腺癌、2×105HCmel12hgp100(2×105)细胞或1×106MC38OVAdim、MC38OVAbright或MCA1956纤维肉瘤细胞，进入小鼠的后胁中。按照指示测量肿瘤大小，并使用电子卡尺记录为以毫米为单位的两次垂直测量的平均值。使用以下公式计算肿瘤面积，以mm2计：A＝长度×宽度。除非另有说明，否则处死肿瘤超过150mm2的小鼠。实验以四只或更多只小鼠为一组进行。
MCA诱发的致癌作用
对于3-甲基胆蒽(MCA；Sigma)致癌物诱导的纤维肉瘤，给指定基因型的雄性小鼠皮下注射100μL无菌玉米油中的5μg或25μg MCA，并监测纤维肉瘤的发展。
实验性转移
对于原发性转移B16F10黑素瘤(1×105细胞)，静脉内注射LWT1黑色素瘤(5×105细胞)或RM-1前列腺癌(1×104细胞)。如前所述(Blake等，2016，Cancer Discov 6，446-459)，14天后，通过对肺表面上的肿瘤集落进行计数，量化肺中的转移负荷。
Vk*MYC骨髓瘤移植模型
可移植的Vk*MYC骨髓瘤细胞系Vk12598如前所述(Nakamura等，2018，Cancer Cell33，634-648e635)进行维持和扩增。将Vk12598 MM细胞(5×105)i.v.注射至指定基因型小鼠的尾静脉中。根据机构伦理准则每天监测存活情况，出现瘫痪和行动不便的迹象时，将小鼠安乐死。
免疫检查点阻断
对于MC38-OVAdim肿瘤，在肿瘤细胞皮下注射后第10、14、18和22天，通过i.p.注射100μl PBS中的250μg大鼠抗小鼠PD-1IgG2a(克隆RMP1-14；BioXcell)或大鼠对照IgG2amAb(克隆1-1；Leinco)进行了PD-1的治疗阻断。对于B16F10，在肿瘤细胞皮下注射后第6、9、12和15天，使用i.p.注射100μl PBS中的250μg大鼠抗小鼠PD-1IgG2a(克隆RMP1-14；BioXcell)和250μg仓鼠抗小鼠CTLA-4IgG2a(克隆UC10-4F10-11；BioXcell)或大鼠对照IgG2a mAb(克隆1-1；Leinco)以及对照仓鼠IgG(BioXcell)，进行了PD-1和CTLA-4的治疗阻断。
过继性T细胞免疫疗法
按照之前所述的(Glodde等，2017，Immunity 47，789-802)，略有修改，进行了ACT免疫治疗。简而言之，移植的B16F10黑素瘤直径达到>5mm的尺寸时，通过单次i.p.注射100μl PBS中的2mg(100mg/kg)环磷酰胺，将小鼠针对ACT进行预调节，一天之后，静脉内递送200μl PBS中的从用抗CD137抗体处理2周的Pmel-1 TCR转基因小鼠的脾脏分离到的0.5×106gp100-特异性CD90.1+CD8+DNAM-1+或DNAM-1-Pmel-1 T细胞(100μg i.p.大鼠抗小鼠CD137；克隆3H3；BioXcell；在100ml PBS中，每3天)。通过单次i.p.注射100μl PBS中的5×108PFU的重组腺病毒载体Ad-gp100在体内激活过继性转移的T细胞。在过继性Pmel-1 T细胞转移后的第3、6和9天癌周注射100μl盐水中的50μg CpG 1826(MWG Biotech)和50μg聚肌苷：聚胞苷酸(聚(I:C)，Invivogen)。
组织处理
使用标准实验方案处理肿瘤和外周淋巴样组织。简而言之，从小鼠收集肿瘤或淋巴器官并使用GentleMACS匀浆机(Mitenyi)按照制造商的说明分离，接着与“完全RPMI培养基”中的1mg/ml胶原蛋白酶D(Sigma)和1mg/ml DNaseI(Roche)在37℃下孵育。30-45min后，将组织通过70μm细胞过滤器(Greiner)并进一步分析。
流式细胞术
如前所述(Gao等，Glodde等)杀死小鼠并收获器官并准备用于流式细胞术。来自不同器官的单细胞悬液在Fc封闭缓冲液(含2％FBS和抗CD16/32(克隆2.4G2；从ATCC获得的杂交瘤)的PBS)中在冰上孵育15分钟。靶向以下表位的试剂或抗体购自BioLegend：CD3(145-2C11)、CD8(53-6.7)、CD90.1(OX-7)、CD44(IM7)、Vb13(MR12-3)、CD62L(MEL-14)、DNAM-1(10E5)、IFN-γ(XMG1.2)、TIGIT(1G9)、TCRβ(H57-597)、TNF(MP6-XT220)、Zombie Yellow或Aqua Fixable Viability试剂盒。靶向以下表位的试剂或抗体购自eBioscience：CD45.2(104)和TCRβ(H57-597)。靶向以下表位的试剂或抗体购自BD Biosciences：PD-1(J43)和Ki67(B56)。从Andrew Brooks教授，DMI/PDI/University of Melbourne购买OVA-四聚体(SIINFEKL)。对于四聚化，每10-15分钟添加六次链霉亲和素-APC(Biolegend)，直至达到1:1.7＝单体：SA-APC比率。组装的四聚体在一周内使用。四聚体染色在冰上进行30'。通过使用BD Liquid Counting Beads(BD Biosciences)计算细胞数。对于胞内细胞因子检测，将富含淋巴细胞的肿瘤匀浆在补充了10％FCS、细胞刺激混合物加蛋白质转运抑制剂(刺激的细胞)(eBioscience)或GolgiStop和GolgiPlug(未刺激的对照细胞)(均来自BDBiosciences)的RPMI-1640中，在37℃下孵育4小时。细胞表面染色后，使用胞内固定和透化缓冲剂组(eBioscience)固定和透化样品，并用1×透化缓冲液中的抗体染色。对于核内染色，单细胞悬浮液如上所述用抗细胞表面抗原的抗体染色，使用FoxP3 Fix/Perm缓冲剂试剂盒(Biolegend)固定和透化，然后进行核内染色。在BD LSR Fortessa流式细胞仪(BDBiosciences)、CytoFLEX(Beckman Coulter)或Cytek Aurora(3激光)流式细胞仪(Cytek)上获得细胞。使用FlowJo V10软件(FlowJo，LLC)进行分析。在适当下采样到指定数量后，在FlowJoV10.2中对串联样品进行tSNE分析，并使用基于R的“tSNE图”脚本进行可视化。
细胞分选
DNAM-1+或DNAM-1-pmel-1T细胞在抗CD137处理(每三天100μg ip)两周周后从pmel-1TCR转基因小鼠的脾脏中分离，用抗CD8、CD90.1和DNAM-1的抗体染色，并使用BDFACSAria II细胞分选仪(BD Biosciences)进行纯化。
小鼠T细胞刺激测定
对于小鼠T细胞激活，脾细胞或当指定的MACS分离的CD8+T细胞在平底96孔板中，用结合板的抗CD3(克隆145-2C11；Biolegend；1-2-5μg/ml，50-100-250ng/孔)加上可溶性抗CD28(克隆37.51；Biolegend；1-2μg/ml)，以0.5-2×106细胞/ml激活。在一些实验中，存在0.3μg/孔的板结合CD155-Fc(Sino Biological)或无关的人IgG1(BioXCell)。抗体/蛋白质的平板结合在PBS中4℃进行过夜，并在实验前立即用PBS洗涤孔。
CD226内化
使用MACS技术(Miltenyi)根据制造商的方案从脾脏的单细胞悬液中分离指定基因型的CD8+T细胞。分离后，用在补充了20IU/ml人IL-2(Novartis)的“完全RPMI培养基”中的可溶性抗-CD3(克隆145-2C11；Biolegend；1μg/ml)和可溶性抗-CD28(克隆37.51；Biolegend；1μg/ml)以1-2×106细胞/ml的浓度刺激细胞48小时。然后将细胞接种在用hIgG1(IgG；BioXcell；0.3μg/孔)或人IgG1羧基末端Fc区融合的重组mCD155(CD155-Fc；Sino Biological；0.3μg/孔)在4℃下包被过夜的平底96孔板中。在37℃下孵育1h后，收获5％CO2细胞并对以下进行表面染色：CD8+(BV421；克隆53-6.7；Biolegend)和CD226(AF647；克隆10E5；Biolegend)，然后固定、透化并对CD226进行胞内染色(PE；克隆480.1；Biolegend)。然后立即在四束激光、12通道Amnis ImageStreamX MkII(Amnis，EMDMillipore，Seattle，WA，USA)上以×60倍放大倍数低速采集细胞。使用IDEAS软件(Amnis)进行数据分析。分析的门控策略涉及基于“梯度RMS”选择焦点细胞。选择具有高“纵横比”和低“面积”值的细胞，因为它们可能是单线态并在CD8+(BV421)细胞上被压制。最后，选择质量好的、集中的和居中的细胞，并分析每组至少100个细胞。
免疫突触形成的分析
突触形成测定如先前描述的(Markey等，2015，J Immunol Methods 423，40-44)进行，稍加修改。通过冲洗来自指定基因型的处死小鼠的后腿的长骨来制备骨髓衍生的树突细胞。将细胞以1-3×106细胞/ml接种于补充了1ng/ml小鼠GM-CSF的“完全RPMI培养基”中。三到四天后收集非贴壁细胞并进一步培养。在体外分化至少7天后进行实验。根据制造商的说明，在测定前一天收获BMDC并用Cell Trace Violet(CTV；Life Technologies)标记，并用1μg/ml H2-Db结合肽hgp10025-33肽(KVPRNQDWL；模拟表位)过夜装载肽。同一天，使用MACS技术(Miltenyi)根据制造商的说明从脾脏单细胞悬液中分离指定基因型的CD8+T细胞，并以1×106细胞/ml接种于10-20U hIL-2中(Novartis)。第二天，按照制造商的方案收集T细胞并标记CFSE(Biolegend)。然后将BMDC和T细胞以1:2＝T:DC的比例在37℃、5％CO2下共培养1h。在孵育期结束时，细胞在室温下用3×体积的1.5％多聚甲醛固定，然后在含有2％(v/v)FCS(Cell Sera)的PBS中在抗CD16/CD32存在下对LFA-1(PE-Cy7；克隆H155-78；Biolegend)进行表面染色(克隆2.4G2；内部生产)。表面染色后，清洗并使用100μL 0.1％Triton-X(Sigma)透化细胞。向每个样品中加入3μL鬼笔环肽(AlexaFluor 647；LifeTechnologies)，并将细胞在室温下孵育30分钟。在整个染色过程中，非常小心地处理细胞，并谨慎地避免涡旋、彻底重悬或EDTA以维持已建立的突触形成。在染色期结束时，洗涤细胞并立即在四激光、12通道Amnis ImageStreamXMkII(Amnis)上以×60倍放大倍数低速采集。使用IDEAS软件(Amnis)进行数据分析。分析的门控策略涉及基于“梯度RMS”选择焦点细胞。选择具有中间“纵横比”和中间“面积”值的细胞，因为它们可能是双峰。我们对双重阳性的CTV+和CFSE+“事件”进行了子门控。最后，选择质量好的、集中的和居中的，并分析每组至少40个突触。然后应用界面mask并将T细胞定义为目的靶标。界面mask内的LFA-1和鬼笔环肽的荧光强度作为免疫突触力量和强度的替代标记。使用非参数单因素方差分析确定统计显著性。
小鼠T细胞的逆转录转导
合成全长小鼠CD226 cDNA序列并将其分开克隆(BioMatik)到MSCV-IRES-GFP质粒(A/Prof Steven Lane惠赠，QIMR Berghofer，布里斯班，澳大利亚；Addgene#20672)中。为了生成逆转录病毒，将HEK293T细胞以4×106细胞/培养皿的浓度涂布在10cm培养皿上过夜。第二天，将包装质粒pCL-Eco(A/Prof Steven Lane惠赠，QIMR Berghofer,，布里斯班，澳大利亚)和编码MSCV-IRES-GFP-Mock或MSCV-IRES-GFP-CD226 WT-full-length的质粒按照制造商的方案，以3:1＝Fugene:DNA比例与Fugene6(Promega)混合，并应用于HEK293T细胞过夜。然后更换培养基，并在接下来的48小时内收集两次病毒上清液。将逆转录病毒上清液以17.000g离心2-6h以浓缩病毒，并立即储存在-80℃。对于转导，将CD8+T细胞以每孔1-3×106接种在6孔板中，该板已在5μg/ml Retronectin(Takara Bio Inc.)和病毒上清液中以1:1体积/体积比包被过夜并加入4μg/ml聚凝胺(Sigma)。spinfection在30℃下以2000g的速度进行2小时，没有加速或减速。2-4小时后更换培养基。在一些实验中，24小时后重复spinfection。将细胞维持在100IU/ml人IL-2(Novartis)和2ng/ml小鼠IL-7(Biolegend)中并检查纯度，直至用于实验和ACT中。
细胞因子微球芯片
将肿瘤单细胞悬液重悬于等体积的“完全RPMI培养基”中并在37℃，5％CO2下孵育4-5h，接着收集上清液。将上清液储存在-80℃，直至使用基于细胞因子微球芯片(BD)使用制造商的实验方案进行分析。
人T细胞刺激测定
将PBMC解冻并用DNAse I(Roche)处理，以除去死细胞，然后培养。将1×105PBMC在U-底96孔板中的200μl体积中的RPMI-1640(Gibco)+10％FCS(Cell Sera)中培养。通过添加2×105CD3/CD28刺激剂珠子(Thermo Fisher Scientific)实现T细胞激活。将培养物在37℃，5％CO2下孵育。在完成培养阶段时，将细胞针对表面标志物进行染色并通过流式细胞术进行分析。
使用人工APC的人CD226-CD155相互作用
将来自人健康血液使用RosetteSep(Stemcell)的Ficoll处理并富集的CD3+T细胞以1×105细胞/孔涂布于U-底96孔板中。将5×104的OKT3单表达或OKT3和CD155双表达的CHO细胞用于在体外将CD155递呈给人T细胞。在每个时间点收获共同培养的T细胞并使用PBS中的2％PFA固定。对于CD8+T细胞的预激活，将制得的T细胞在补充了25μL/ml抗CD3/CD28四聚抗体(Stemcell)和80IU/ml人IL-2(PeproTech)的“完全RPMI培养基”中培养7至10天。对于CD155阻断，用所述剂量的CHO与滴定的抗人CD155抗体(克隆SKII.4，Biolegend)预先孵育30分钟，然后与人T细胞共同培养。
患者和样本
涉及人类参与者的所有程序都获得了QIMR Berghofer医学研究所人类研究伦理委员会(HREC)(EC00278)和皇家布里斯班妇女医院HREC(EC00172)的批准，并且该研究符合赫尔辛基宣言。根据参与医院/研究机构人类研究伦理委员会的程序和指南，在获得书面知情同意后收集所有组织和血液样本。
HNSCC样本
HNSCC样本来自Metro North HHS，Royal Brisbane and Women's Hospital，布里斯班，澳大利亚。根据制造商的方案，使用包含组织解聚平台(GentleMACS，Miltenyi)在内的市售Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)处理新鲜样品。外周血单个核细胞(PBMC)通过Ficoll密度梯度离心从肿瘤切除时从患者身上采集的血液样本中分离出来。然后将PBMC和肿瘤单细胞悬液冷冻保存直至进一步使用。将冷冻保存的样品解冻并在含有10μg/mlDNAse I(Sigma)的RPMI 1640中孵育，并在37℃下孵育1小时以消除结块和碎片。使用的T细胞刺激物是5μl的抗CD3和抗CD28微珠(Dynabeads，ThermoFisher Scientific)，以约2×105个细胞/孔在RPMI 1640(Gibco)加10％FCS(Cell Sera)中，在37℃，5％CO2下培养4小时，然后染色进行流式细胞术。
黑素瘤样本
存档的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本获自澳大利亚黑色素瘤研究所(MIA)的放射学证实的非淋巴IV期黑素瘤(AJCC)预治疗患者，作为来自肿瘤核心和肿瘤边距的组织微阵列。患者人口统计学和免疫治疗干预见表2。所有患者在2015年1月至2018年5月期间接受了基于PD1的免疫治疗，并根据机构规定提供了使用样品的书面知情同意书。审查了所有接受免疫疗法治疗的患者的病理报告。如果有足够的存档FFPE组织和临床注释用于分析，则选择该病例纳入。
表2
Figure BDA0003319880510000851
Figure BDA0003319880510000861
LDH＝乳酸脱氢酶，ICB＝免疫检查点阻断，Nivo＝纳武单抗；Pembro＝派姆单抗，Ipi＝伊匹单抗；CR＝完全响应；PR＝部分响应，SD＝稳定的疾病，PD＝进展性疾病
人CD155的免疫组织化学染色
将TMA在superfrost+载玻片上以3μm切片并在真空下储存直至进行IHC。载玻片在65℃下脱水20分钟，在二甲苯中脱石蜡并在分级乙醇中再水合。抗原修复在EDTA缓冲液(pH9)中于Decloaking Chamber(Biocare Medical)中以100℃进行20分钟。IHC在Autostainer-Plus(DAKO)上进行。将抗CD155的兔抗人一抗(D3G7H；CST)在室温下使用1:100稀释液孵育45分钟，并按照制造商的说明使用MACH3兔HRP聚合物检测系统(Biocare)和DAB Chromogen Kit(Biocare)显像。载玻片用稀释的苏木精复染。然后将CD155评估为膜阳性肿瘤细胞的百分比，并记录免疫组织化学信号的最大强度。CD155表达使用H-score方法分配并如下分类：低(0-99)或高(200-300)。
多重免疫组织荧光(mIHF)染色
使用上述TMA和多谱荧光成像，我们定量了黑素瘤样品中CD8+T细胞上的CD226表达。SOX10用于识别黑素瘤细胞，且将DAPI用作核染色剂。将样本在superfrost+显微镜载玻片上以4μm切片并在真空下储存，直至进行mIHF。使用EDTA靶标修复缓冲液(DAKO)进行热诱导抗原修复，使用抗原decloaker以100℃进行20分钟，并在含有吐温20(TBS-T)(pH 7.6)的Tris缓冲盐水溶液中洗涤。在自动组织染色机(DAKO)上进行染色。根据制造商的说明使用OPAL多重TSA检测系统(PerkinElmer)使一抗可视化，在连续染色轮次之间使用EDTA缓冲液在100℃下加热20分钟以剥离先前结合的抗体/HRP复合物。将一抗在梵高黄色稀释剂(VanGogh Yellow Diluent)(Biocare)中稀释并孵育30分钟，然后是两步聚合物-HRP检测系统(Biocare)，然后用基于TSA的荧光团(Opal Reagent Pack；PerkinElmer)标记。按照括号中列出的抗体稀释度和Opal荧光团的按顺序依次使用以下一抗/克隆：CD8/144b(1:1000；Opal570)、CD226/102(1:500；Opal520)和SOX10/BC34(1:500；Opal690)。
多重IHF图像获取和分析
使用Vectra成像系统(PerkinElmer)扫描荧光染色的载玻片。使用混合荧光在4倍放大倍数下进行全玻片扫描，然后进行20倍多谱成像。使用Inform分析软件(PerkinElmer；v2.2.1)对图像进行光谱分离，然后进行组织和细胞分段。处理合并的数据文件，并使用Spotfire图像映射工具(Tibco Spotfire Analyst；v7.6.1)设置荧光阈值，然后使用Spotfire进行分段细胞计数。使用“Cutoff Finder”工具(Budczies等2012，PLoS One 7，e51862)确定了将患者分层为“高CD226+CD8+/CD8+”对比“低CD226+CD8+/CD8+”或“高CD8+”对比“低CD8+”。
人PBMC的基因表达分析
将来自健康供体的分离的PBMC以0.5×106细胞/孔接种到48孔板上。在同种型对照(MOPC-21小鼠IgG1；BioLegend；1μg/ml)存在下或用或不用次优浓度的抗CD3(克隆OKT3；BioLegend，200pg/ml)或抗CD226(克隆DX11；BioLegend；1μg/ml)将细胞刺激48小时。收获刺激过的细胞并重悬于350μL的RLT裂解缓冲液(Qiagen)中。将裂解的细胞立即冷冻并送到Core Diagnostics(海沃德，加利福尼亚)进行Nanostring分析。
癌症基因组图谱(TCGA)转录组分析
使用基于R的软件包CGDS-R和TCGAbiolinks，通过cBioportal for CancerGenomics(http://www.cbioportal.org)访问和分析TGCA癌症群的基因表达数据(RNA-seq)。遵循了TCGA数据使用指南(https://cancergenome.nih.gov/)。我们针对目的基因检索了单个基因表达值作为RPKM标准化读取计数。
移动平均分析
移动平均分析如先前公开的那样进行(Glodde等，2017，Immunity 47，789-802e789；Riesenberg等，2015，Nat Commun 6，8755)。将小于1的RPKM值设置为1，以避免在log2转换时出现负表达值。通过平均CD226表达值的增加对样品进行排序。使用n＝20的样品窗口大小计算肿瘤组织中CD8B、NCAM、IFNG、PVR、GZMB和NECTIN2基因表达的移动平均值，并将各自的彩色趋势线添加到条形图中。非参数Spearman秩相关性的显著性通过渐进Spearman相关性检验使用原始log2表达值来确定。
统计学分析
用GraphPad Prism 7和8(GraphPad Software)确定了统计分析。如果没有另外说明，将Student's t-检验用于2个组的比较，将单因素ANOVA用于多个组的比较，并将posthoc Tukey's检验用于多重比较。体内实验的显著性通过用于Kaplan-Meier存活分析的对数秩(Mantel-Cox)检验或针对多重比较的双因素方差分析与posthoc Tukey’s检验来计算。使用Fisher’s精确检验来确定无肿瘤小鼠比例的显著性。组间差异显示为平均值±SD。小于0.05的P值被认为具有统计学意义。p<0.05＝*；p<0.01＝**；p<0.001＝***；p<0.0001＝****。
实施例2
DNAM-1缺陷型小鼠中CD8 T细胞介导的应答
与大多数其他激活受体相反，DNAM-1(或CD226)在小鼠的原初(
Figure BDA0003319880510000891
T,TN)和中枢记忆(TCM)CD8+T细胞上同样地表达，而发现只有一小部分效应记忆(TEM)CD8+T细胞为DNAM-1阴性(数据未显示)。然而，在脾CD8+T细胞的T细胞受体(TCR)刺激后，CD226均匀上调(数据未显示)。
在野生型(C57BL/6J)和DNAM-1缺陷型(也称为DNAM-1KO或CD226KO)小鼠中评估CD8+T细胞介导的应答。如实施例1中所述，将B16F10、MC38、MC38OVAbright或MC38OVAbright细胞皮下注射到小鼠后腰中，并在15-25天评估肿瘤的大小。随后对小鼠实施安乐死并进行流式细胞术以检测浸润肿瘤的总CD8+和OVA特异性CD8+T细胞。
如图1中所示，CD226KO小鼠明显比野生型小鼠更容易受到肿瘤进展的影响。在分析MC38OVAbrigh肿瘤中的细胞后，与在野生型小鼠中观察到的相比，观察到CD226KO小鼠中更快的肿瘤生长与肿瘤浸润CD8+T细胞的百分比降低有关(数据未显示)。此外，与野生型小鼠相比，在CD226KO小鼠中观察到产生IFN-γ的CD8+T细胞的频率较低。这些数据表明CD8+T细胞介导的抗肿瘤应答在DNAM-1缺陷型小鼠中受损。
实施例3
评估肿瘤微环境中的DNAM-1-T细胞功能
为了进一步评估肿瘤微环境中的CD226-(即DNAM-)T细胞功能，检查了MC38-OVAhiC57BL/6J(WT)小鼠中的CD226阳性(CD226+)和CD226阴性(CD226-)CD8+T细胞。WT小鼠中浸润MC38-OVAhi肿瘤的CD8+T细胞上的CD226表达的流式细胞术分析表明了CD226-CD8+T细胞在肿瘤中积累(数据未显示)。然而，在这个群体中，与CD2261+CD8+T细胞相比，产生IFN-γ的细胞的频率明显较低(数据未显示)。此外，与CD226+CD8+T细胞相比，CD226-CD8+T细胞中的Ki67+细胞频率也降低了，表明CD226-CD8+T细胞作为一个群体的增殖能力低于CD226+CD8+T细胞。这些数据表明功能失调的CD226-CD8+T细胞在肿瘤微环境中积累。
在进一步的研究中，发明人通过流式细胞术分析了WT小鼠中肿瘤浸润的CD8+T细胞，并揭示T细胞可以基于它们的CD226表达细分为三个亚群。高比例的肿瘤浸润性CD8+T细胞为CD226阴性(CD226neg)，第二个亚群表达中等水平的CD226，与静息T细胞相似(CD226dim)，和第三个亚群表达高水平的CD226(CD226hi)，与体外激活的T细胞相似(图2)。鉴于CD226作为激活受体起作用，假设了CD226表面表达与T细胞效应子功能相关。引人注目的是，发现了CD226表面表达与从B16F10或MC38肿瘤中分离的离体再刺激的CD8+T细胞产生效应细胞因子、颗粒酶B和增殖的能力之间存在显著关联，如通过Ki67染色所示(图3)。由于发现CD226neg T细胞功能失调，因此评估了从B16F10黑素瘤中分离的CD226和抑制性免疫受体CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的表达。抑制性免疫受体在T细胞激活时上调，并与效应子功能的丧失有关(Thommen和Schumacher，2018；Wherry和Kurachi，2015)。然而，仅基于多种抑制性受体的表达来识别功能失调的T细胞是不够的。在小鼠中，未观察到CD226表达与抑制性受体(PD-1、CD96、LAG3、TIGIT、TIM-3)之间严格的关联(数据未显示)。有趣的是，PD-1+Tim-3+或PD-1+Tim-3+LAG3+TIGIT+CD8+T细胞中的CD226neg亚群迄今为止最不可能产生IFN-γ。相反，尽管存在多种抑制性免疫受体，但CD226hi T细胞在离体再刺激后仍然能够产生大量的IFN-γ(图4)。因此，数据表明与多种抑制性免疫受体的表达相比，CD226是更特定的定义TME中的T细胞功能的标志物。
实施例4
酪氨酸319对T细胞功能的重要性的评估
如实施例2和3中所证明的，DNAM-1是抗肿瘤免疫中T细胞上的关键受体。然而，DNAM-1促进细胞毒性反应的机制尚不清楚。小鼠DNAM-1中的酪氨酸319(对应于人DNAM-1中的酪氨酸322)是NK细胞体外和体内功能所必需的。为了研究该残基在T细胞中的重要性，使用了表达包含Y319F突变的DNAM-1(即CD226)的DNAM-1KI小鼠(也称为CD266Y小鼠)。
初步研究证明了这个突变没有影响免疫细胞发育，因为与WT小鼠相比，在健康的CD226Y中没有观察到各种淋巴细胞群中有显著差异(数据未显示)。其次，与先前公开的在NK细胞中的体外发现(Zhang等，2015)相一致，与WT对照相比，C226Y小鼠显示出对NK细胞依赖性甲基胆蒽(MCA)诱发的致癌作用和实验性转移的更高的易感性(数据未显示)。值得注意的是，与C226Y小鼠相比，全局CD226KO小鼠具有显著削弱的肿瘤控制，表明了CD226的Y319磷酸化仅是部分有助于体内NK细胞介导的肿瘤免疫。
基于这些发现，假设了Y319信号传输是T细胞介导的肿瘤免疫性至少部分所需的。为了检验这个假设，进行了第一个研究，其中将MC38-OVAdim肿瘤(MC38变体，其表达中等水平的外源抗原卵清蛋白)移植到WT、CD226KO(DNAMKO)和CD226Y(DNAMKI)小鼠中。令人惊讶地，观察到MC38-OVAdim肿瘤在CD226Y小鼠中生长显著减慢，且一些肿瘤被完全排斥，而所有肿瘤在WT中逐渐生长，在CD226KO小鼠中生长更快(数据未显示)。流式细胞术分析揭示了与WT小鼠相比，CD226Y小鼠中OVA特异性DNAM-1-CD8+T细胞的频率较低(数据未显示)，并且与WT小鼠相比，Ki67+CD8+T细胞和产生IFN-γ的CD8+T细胞的频率相似(数据未显示)。WT、CD226KO和CD226Y小鼠中肿瘤浸润CD8+OVA特异性T细胞的总数相似，而且重要的是，与WT小鼠相比，CD226Y中DNAM-1阴性细胞的频率显著更低(WT中的约22％vs.CD226Y小鼠中的约5％)。
在随后的研究中，将MC38-OVAdim的免疫原性变体或高水平(MC38-OVAhi)的原型T细胞抗原卵清蛋白(OVA)导入WT或CD226Y小鼠中。与WT小鼠相比，在携带MC38-OVAdim的CD226Y小鼠中观察到显著降低的肿瘤生长和更高的肿瘤排斥率，导致CD226Y小鼠的存活显著延长(图5A-C)。将MC38-OVAhi肿瘤注入WT和CD226Y小鼠的群中时，最初没有观察到差异，因为两组中的所有肿瘤都被排斥。然而，大概是由于抗原丢失，WT小鼠的肿瘤经常复发(26/57)，但CD226Y小鼠的复发显著减少，52只小鼠中只有9只复发(图5D、E)。因此，观察到CD226Y小鼠的存活显著延长(图5F)。这些来自实体瘤的发现在血液学癌症模型中得到证实。与WT小鼠相比，注射VK12598多发性骨髓瘤细胞的CD226Y小鼠也显示出改善的肿瘤控制和延长的存活期(图5G)。
有趣的是，在原初CD226Y小鼠中，观察到脾CD8+T细胞中CD226表达略有增加(图5H)。为了理解为什么Y319中的突变导致改善的肿瘤控制，评估了肿瘤浸润CD8+T细胞的表型。与WT小鼠相比，在CD226Y小鼠中发现了CD226hi CD8+T细胞的频率明显更高，而CD226negCD8+T细胞浸润肿瘤的频率反而降低(图5I-K)。有趣的是，从CD226Y小鼠肿瘤中检测到分离的较高频率的产生IFN-γ的TIL(图5L)和更低程度的产生TNF-α的TIL(数据未显示)。由于肿瘤细胞表达卵清蛋白，因此评估了OVA特异性(四聚体+)和非特异性(四聚体neg)CD8+TIL中的CD226表面表达和效应子功能。CD226表面表达在WT小鼠中的两个T细胞亚群之间具有可比性。重要的是，与从CD226Y小鼠中分离的四聚体neg相比，OVA特异性四聚体+T细胞表现出显著增加的CD226表面表达和增加的IFN-γ量(图5M，N)。因此，在CD226Y小鼠的TME中观察到较高量的IFN-γ和TNF-α(图5O)。
基于此，推断Y319的突变导致DNAM-1(即CD226)表面表达的保留。这些数据进一步表明Y319F突变不会损害T细胞功能，如在NK细胞中所见，而是提高了CD8+T细胞的抗肿瘤特性。
增加的CD226表面表达可以增强T细胞的粘附并改善免疫突触形成，从而导致优异的细胞因子产生。虽然在人CD4+T细胞中，通过S329转导的CD226信号显示对突触形成很重要，但对T细胞中通过Y319信号转导的相关性知之甚少。因此，我们通过使用ImageStream系统对LFA-1和鬼笔环肽强度进行流式显微镜定量，评估了抗原特异性CD8+T细胞与骨髓衍生树突细胞(BMDC)的突触质量。为此，将Pmel-1 TCR转基因小鼠与CD226Y或CD226KO小鼠(本文称为WT.Pmel-1、CD226Y.Pmel-1和CD226KO.Pmel-1)杂交，并孵育CFSE标记的MACS富集的CD8+T细胞与CTV标记的hgp10025-33肽脉冲的WT BMDC。孵育1h后，测定T细胞-BMDC双联体界面处的LFA-1和鬼笔环肽染色的强度。CD226KO.Pmel-1 T细胞明显显示出突触质量受损，而CD226Y.Pmel-1 T细胞的突触质量与WT.Pmel-1 T细胞相似(数据未显示)。这一发现表明了CD226表面表达的丧失，而不是Y磷酸化位点的丧失，降低了T细胞形成高质量突触的能力。因此，CD226表面表达的丧失可能导致肿瘤浸润性T细胞的效应子功能受损。总之，携带通过Y319消除CD226信号传导的点突变的小鼠具有优异的抗肿瘤免疫，这与CD8+TIL中CD226表达和效应细胞因子产生增加有关。
实施例5
肿瘤细胞CD155与DNAM-1相互作用
从原初CD155缺陷型小鼠中分离的免疫细胞具有轻微升高的DNAM-1(即CD226)表达。由于CD226neg T细胞的频率与肿瘤重量(图6A、B)与表达高水平CD155的两种肿瘤模型之间存在显著相关性(Li等2018，J Clin Invest 128，2613-2625)，假设了CD226表面表达的丧失可能是由肿瘤细胞来源的CD155介导的。虽然在体外未刺激的T细胞中，CD155-Fc略微降低了CD226的表达，但它完全阻止了TCR诱导的CD226上调(图6C)。使用ImageStream系统，对存在CD155-Fc或对照IgG情况下的预激活T细胞中的表面和胞内CD226水平进行定量(图6D)。简而言之，表面CD226用AF647缀合抗体(克隆10E5)染色，然后用PE缀合抗体(克隆480.1)对CD226进行胞内染色。值得注意的是，克隆10E5阻断了480.1的结合，但并非反之亦然，允许了对CD226的胞内部分进行特异性评估。事实上，与对照IgG相比，CD155与CD226连接显著增加了胞内CD226的MFI(图6D)。这表明了CD226-CD155相互作用后有一个主动的内化过程。为了验证CD155在体内驱动CD226下调的发现，我们将表达CD155的(B16F10ctrl)或CD155缺陷型的(B16F10CD155KO)B16F10黑素瘤细胞注射入WT或CD155缺陷型(CD155KO)小鼠中(图6E)。该实验设置有助于剖析肿瘤细胞与宿主细胞CD155对下调肿瘤浸润CD8+T细胞中CD226表面表达的重要性。有趣的是，与B16F10ctrl黑素瘤相比，WT和CD155KO小鼠中CD226negT细胞浸润B16F10CD155KO黑素瘤的频率显著降低(图6E)。一致地，在携带B16F10CD155KO黑色素瘤的WT和CD155KO小鼠中观察到明显更高的CD226hi T细胞频率(数据未显示)。这个数据支持TME中高水平的CD155有助于T细胞中CD226下调的观点。
鉴于CD226Y小鼠中肿瘤浸润性CD8+T细胞表现出增加的CD226表达(参见图5)，假设通过Y319的信号传导对于CD155介导的CD226内在化可能很重要。为了在体内对这进行测试，将B16F10ctrl或B16F10CD155KO黑素瘤细胞注入WT或CD226Y小鼠中(图6F)。与之前的发现一致，CD226Y小鼠中浸润B16F10ctrl肿瘤的或WT小鼠中浸润B16F10CD155KO的CD226neg T细胞频率显著降低，而CD226hi T细胞的频率增加(图6F)。有趣的是，在携带B16F10CD155KO黑素瘤的CD226Y小鼠中没有观察到较少的CD226neg细胞，表明CD155通过Y319触发CD226的下调。值得注意的是，仍然发现了浸润CD155缺陷型肿瘤的CD226neg T细胞，因此其他机制似乎有助于CD226下调。
实施例6
T细胞DNAM-1表达对过继性细胞转移的功效的作用
在携带B16F10黑素瘤的小鼠中评估过继性细胞转移(ACT)免疫疗法中使用的T细胞上的CD226(即DNAM-1)表达的作用。如实施例1中所述进行ACT免疫疗法。简而言之，从pmel1-TCRtg小鼠的脾脏中分选CD226+(DNAM-1+)和DNAM-1-(CD226-)黑素瘤特异性CD8+T细胞。这些T细胞识别黑色素细胞谱系抗原gp100，并能够识别和破坏黑素瘤细胞。单剂量环磷酰胺后，DNAM-1+或DNAM-1-pmel1 T细胞，连同gp100(V)的腺病毒疫苗，随后在肿瘤内注射3次免疫刺激性核酸(I、CpG+聚I:C)。如图5A中所示，与DNAM-1-T细胞相比，DNAM-1-T细胞在控制B16F10黑素瘤方面的效果明显不太有效，表明ACT免疫疗法的功效在很大程度上依赖于DNAM-1+T细胞。
在随后的研究中，使用WT.Pmel-1、CD226KO.Pmel-1或CD226Y.Pmel-1 T细胞，用ACT疗法治疗携带黑素瘤的WT小鼠。为此，给WT小鼠皮下注射HCmel12hgp100黑素瘤，一种源自原代Hgf-Cdk4黑素瘤的小鼠黑素瘤细胞系，其经过工程改造以表达被Pmel-1 T细胞识别的高亲和力抗原hgp100。一旦肿瘤直径达到约5毫米，小鼠就用单剂量环磷酰胺进行化疗预处理。第二天，一组小鼠接受WT.Pmel-1、CD226KO.Pmel-1或CD226Y.Pmel-1 T细胞，然后接受固有免疫刺激(图7B)。WT.Pmel-1 T细胞的过继性转移诱导了稳健的抗肿瘤免疫，44个中有13个完全响应者(CR，与基线相比，治疗后第14天肿瘤缩小>90％)(图7C)。相比之下，CD226KO.Pmel-1 T细胞在很大程度上未能诱导CR(34个中有2个)(图7D)。证实了之前的发现的是，使用CD226Y.Pmel-1 T细胞的ACT免疫疗法优于WT.Pmel-1 T细胞的转移(42个中有23个CR)，导致长期存活小鼠的数量显著增加并提高了存活率(图7E-G)。肿瘤浸润性Pmel-1 T细胞的流式细胞术分析显示，与WT.Pmel-1 T细胞相比，CD226Y.Pmel-1 T细胞表现出与IFN-γ和TNF-α产生增加相关的CD226表达增加(图7H和I)。与B16F10黑素瘤模型相似，在过继性转移的WT.Pmel-1 T细胞中，抑制性免疫受体的表达与CD226之间没有严格的相关性(数据未显示)。
由于CD8+T细胞中的CD226表面表达与优良的肿瘤控制相关，因此假定了CD226的超表达可能是改进过继性细胞转移疗法的合理策略。为了在治疗上增加CD226表达，WT.Pmel-1 T细胞用对照(MOCK.Pmel-1)或编码CD226的逆转录病毒载体(CD226.Pmel-1)转导，然后使用ACT方案过继性转移到携带HCmel12hgp100的WT小鼠中(图7J)。事实上，与MOCK.Pmel-1 T细胞相比，CD226在Pmel-1 T细胞中的超表达提高了治疗效果并增加了CR的数量(图7K)。
实施例7
DNAM-1在免疫检查点抑制剂疗法中的重要性
在携带MC38结肠腺癌的WT和CD226KO(DNAM-1KO)小鼠中评估DNAM-1表达在免疫检查点抑制剂治疗中的重要性。简而言之，如实施例1中所述的，给小鼠皮下注射MC38结肠腺癌细胞，然后在肿瘤接种后第10、12、14和16天，给药对照Ig(cIg)或抗PD1(RMP1-14)mAb。WT小鼠组在第9、10、14、17、20和24天接受cIg或抗CD226 mAb。如图8A中所示，与单独接受抗PD1抗体的WT小鼠相比，CD226KO小鼠和接受抗DNAM-1抗体的WT小鼠中抗PD1抗体的功效显著降低。
在随后的研究中，给WT、CD226KO或CD226Y小鼠注射MC38-OVAdim细胞并用抗PD1免疫疗法治疗。虽然CD226KO小鼠完全没有产生抗肿瘤反应，但用对照IgG(cIgG)治疗的CD226Y小鼠显示出与用抗PD1治疗的WT小鼠相似的反应。重要的是，用抗PD-1治疗的CD226Y小鼠存活率最高(图8B和C)。还通过在免疫原性差的B16F10模型中提高抗PD1+抗CTLA4联合免疫疗法的功效来强调CD226对ICB的重要性(图8D)。综上所述，我们的数据证明了CD8+T细胞中的CD226表面表达与癌症免疫疗法的功效相关。因此，有效的免疫检查点抑制剂疗法需要DNAM-1。
实施例8
TIL中DNAM-1表达与效应子功能的相关性
使用临床前小鼠模型，DNAM-1(即CD226)显示出(a)在肿瘤浸润性CD8+T细胞中下调，(b)对CD8+T细胞效应子功能很重要，和(c)是抗肿瘤免疫和免疫疗法所需的(见上文)。然后进行研究以证实从健康供体的PBMC中分离的人CD8+T细胞在激活后显示CD226上调，与从小鼠获得的结果一致(图9A)。与小鼠相比，在健康志愿者的血液中观察到了可变但显著比例的CD226阴性T细胞(～20％)。为了评估CD226对T细胞功能的重要性，进行了在存在或不存在CD226阻断抗体(克隆DX11)的情况下激活的PBMC的RNA表达分析。在该测定中，TCR刺激后的IFNG和GZMB表达在很大程度上取决于CD226(图9B)。接着，评估了从头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者的肿瘤组织样本中分离的CD8+T细胞中的CD226表达。与小鼠相似，人肿瘤浸润性CD8+T细胞表现出不同的CD226表面表达(图9C)。离体刺激的CD8+TIL的流式细胞术分析显示CD226表面表达和效应子功能之间存在显著相关性，如通过IFN-γ、TNF-α、Ki67和CD107a染色增加所证明的(图9D-F)。重要的是，CD226基因表达与来自TCGA数据库的HNSCC(HNSC)和皮肤黑素瘤(SKCM)群组中存活率的提高显著相关(图9G)。在这些数据集中，观察到CD226基因表达与CD8B、IFNG和GZMB之间的显著相关性，但与NCAM1(CD56)(经典的NK细胞标记物)之间没有观察到(数据未显示)。有趣的是，还观察到CD226和PVR(CD155)之间的轻微但显著的负相关，但与NECTIN2(CD112)基因表达没观察到(数据未显示)。
实施例9
CD155结合介导人CD8+T细胞中的DNAM-下调
在小鼠中，CD155被鉴定为CD8+T细胞中DNAM-1(CD226)下调的主要驱动子。为了评估CD155对人CD8+T细胞中CD226表面表达的影响，建立了稳定表达OKT3和高水平hCD155的CHO细胞(图10A)。预激活的人CD8+T细胞与CHO-OKT3细胞一起孵育时，观察到CD226表面表达增加，而与CHO-OKT3-CD155细胞共培养时，CD226表面表达显著降低(图10B)。事实上，时程分析揭示了在共培养开始后1小时内，大部分CD8+T细胞已失去CD226表面表达(图10C)。为了证实这些发现并评估CD155的含量是否影响CD226下调，建立了了表达不同水平的CD155的CHO-OKT3细胞。事实上，在共培养试验中观察到CD155剂量依赖性CD226下调(图10D)。在另一组实验中，将递增含量的CD155阻断抗体加入共培养物中，验证了CD155在体外人CD8+T细胞中的CD226下调中的特定作用(图10E)。因此，假设癌症患者中的CD8+TIL应在CD155高TME中表达较低水平的CD226。为了测试这一点，来自一个充分注释的黑素瘤患者群的34个FFPE样本进行了CD155染色(图10F)。CD155的免疫组织化学揭示了一个亚组的患者表现出不存在/低(n＝9)或高(n＝15)的CD155表达水平(数据未显示)。随后的多重免疫组织荧光(IHF)分析证实了TME中总CD8+T细胞中的CD226+CD8+比例与CD155表达水平呈负相关(图10H)。总之，该数据支持肿瘤细胞CD155介导肿瘤浸润性CD8+T细胞中的CD226表面表达下调的观点。
实施例10
CD8+TILS中的CD226表面表达与黑素瘤患者对ICB的反应相关
由于增加的CD226表面表达改善了临床前小鼠模型中的T细胞效应子功能和癌症免疫疗法的功效，接着研究了人黑素瘤患者对ICB的反应是否取决于CD226+CD8+TIL的存在。为此，使用多重IHF在来自充分注释的黑素瘤患者群的31个ICB治疗前的FFPE样品中检测到肿瘤浸润性CD226+CD8+T细胞/总CD8+T细胞的数量(图11A)。事实表明，CD8+T细胞中的CD226+CD8+的比例与对ICB的反应(图11B)和改善的无进展(PFS，HR3.38；p＝0.036)(图11B)显著相关。对总体存活率观察到相似的趋势(数据未显示)，尽管在统计上不显著。值得注意的是，这种患者分层不能用总CD8+T细胞计数来解释，因为对ICB、PFS或OS的反应均与高CD8+T细胞计数显著相关(图11C)。因此，数据表明CD226染色可以识别TME内的高功能CD8+T细胞，并提高对ICB反应的预测。总体而言，证明了CD8+T细胞中CD226表面表达与癌症患者中有效的抗肿瘤免疫和癌症免疫治疗相关。因此，CD155诱导的CD226下调代表了肿瘤用于逃避免疫系统的一种新的且被低估的抗性机制。
实施例11
CBL-B参与T细胞中的DNAM-1表面表达
为了评估泛素连接酶E3 Cbl-2是否参与DNAM-1泛素化和内化，在含有IL-12(50IU/ml hIL-2)的cRPMI培养基中用CD3/CD28珠子或CD3/CD28/CD155-Fc珠子刺激16h后，评估来自野生型小鼠或在CBL-B基因中带有导致泛素连接酶功能消除的点突变的小鼠(Cbl-bKI小鼠)的脾脏的CD8+T细胞的DNAM-1(CD226)表面表达。如图12中所示，Cbl-bKI小鼠对CD155介导的CD226下调具有部分抗性。
实施例12
T细胞中修饰的DNAM-1的超表达
合成了几个编码野生型和修饰的DNAM-1的核酸构建体并亚克隆至逆转录病毒表达载体pMSCV-IRES-GFP II(Holst等，2006，Nat Protoc.1(1):406-17)中。生产出含有DNAM-1构建体的逆转录病毒载体后，将在体外将载体转导至Pmel-1 T细胞中，并基于GFP表达纯化细胞。将通过测量T细胞增殖和细胞因子产生在体外评估每个DNAM-1构建体的影响。逆转录病毒转导的pmel-1T细胞也将用于ACT免疫治疗模型中，以评估单个DNAM-1构建体超表达的影响。
构建体包括编码野生型小鼠DNAM-1的多核苷酸；DNAM-1No IgG1，其编码缺少IgGl结构域的多肽，即缺少SEQ ID NO:3中列出的野生型DNAM-1的氨基酸30-127，从而包含野生型DNAM-1的氨基酸1-29和128-333；DNAM-1No IgG1+IgG2，其编码缺少IgGl和IgG2结构域的多肽，即缺少SEQ ID NO:3中列出的野生型DNAM-1的氨基酸30-127和138-237，从而包含野生型DNAM-1的氨基酸1-29和128-137和128-333；DNAM-1No intracellular，其编码缺少胞内(或胞质)结构域的多肽，即缺少SEQ ID NO:3中列出的野生型DNAM-1的氨基酸275-333，从而包含野生型DNAM-1的氨基酸1-274；DNAM-1S326A，其编码相对于SEQ ID NO:3中列出的野生型DNAM-1包含S326A突变的多肽；和DNAM-1Y319A/S326A，其编码相对于SEQ ID NO:3列出的野生型DNAM-1包含Y319A突变和S326A突变的多肽。
野生型小鼠DNAM-1(多核苷酸)：
Atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttctctcgaagaccaaaaccaagactctaa(SEQ ID NO:11)
野生型小鼠DNAM-1(多肽)
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL(SEQ ID NO:3)
DNAM-1 No IgG1(多核苷酸)
Atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttctctcgaagaccaaaaccaagactctaa(SEQ ID NO:12)
DNAM-1 No IgG1(多肽)
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL(SEQ ID NO:13)
DNAM-1 No IgG1+IgG2(多核苷酸)
Atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgatagttttgagatagcagcaccctcgataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttctctcgaagaccaaaaccaagactctaa(SEQ ID NO:14)
DNAM-1 No IgG1+IgG2(多肽)
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSDSFEIAAPSIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL(SEQ IDNO:15)
DNAM-1 No intracellular(多核苷酸)
Atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttaa(SEQID NO:16)
DNAM-1 No intracellular(多肽)
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFIL(SEQ ID NO:16)
DNAM-1 S326A(多核苷酸)
Atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttcgctcgaagaccaaaaccaagactctaa(SEQ ID NO:17)
DNAM-1 S326A(多肽)：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFARRPKPRL(SEQ ID NO:18)
DNAM-1 Y319A/S326A(多核苷酸)
Atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacattgctgtaaactatccaactttcgctcgaagaccaaaaccaagactctaa(SEQ ID NO:19)
DNAM-1 Y319A/S326A(多肽)
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIAVNYPTFARRPKPRL(SEQ ID NO:20)
本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文中。
本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本申请的有效的“现有技术”。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制为任何一个实施方案或特定的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对示例的特定实施方案进行各种修改和变化。所有这些修改和变化都旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims (73)

1.一种T细胞，包含修饰的DNAM-1多肽，其中：
与野生型DNAM-1多肽相比，修饰的DNAM-1多肽呈现出增加的在细胞表面上的保留；并且
T细胞是人T细胞。
2.权利要求1的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的322位的位置上的酪氨酸的修饰。
3.权利要求2的T细胞，其中所述修饰是氨基酸置换或缺失。
4.权利要求2或权利要求3的T细胞，其中修饰的用苯丙氨酸置换酪氨酸。
5.权利要求1-4任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325-328位的位置上的AP-2结合基序YXXF的修饰，其中修饰消除了AP-2结合基序YXXF。
6.权利要求1-5任一项的T细胞，其中：
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325位的位置上的酪氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的328位的位置上的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325、326或327位的任一个位置后的氨基酸插入；和/或
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的326和327位的位置的一个或多个残基的缺失。
7.权利要求1-6任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282-287位的位置上的AP-2结合基序EXXXLF的修饰，其中修饰消除了AP-2结合基序EXXXLF。
8.权利要求1-7任一项的T细胞，其中：
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282位的位置上的谷氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的286位的位置上的亮氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的287位的位置上的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282-286的位置的任一个或多个残基后的氨基酸插入；和/或
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的283、284和285位的位置上的一个或多个残基的缺失。
9.权利要求1-8任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320-322位的位置上的Cbl-B结合基序((D/N)XpY)的修饰，其中修饰消除了Cbl-B结合基序。
10.权利要求1-9任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320位的位置上的天冬氨酸的氨基酸缺失或置换。
11.权利要求1-10任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320和/或321位的位置后的氨基酸插入。
12.权利要求1-11任一项的T细胞，其中，其中DNAM-1多肽包含在对应于295位的位置上的赖氨酸的氨基酸置换或缺失。
13.权利要求1-12任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的333位的位置上的赖氨酸的氨基酸置换或缺失。
14.权利要求1的T细胞，其中DNAM-1多肽缺乏全部或部分胞质结构域。
15.权利要求1至14任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含全部或部分胞外结构域。
16.权利要求1至15任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含IgG1结构域。
17.权利要求1至16任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含IgG2结构域。
18.权利要求1至17任一项的T细胞，其中DNAM-1多肽包含SEQ ID NO:5-9或21-30任一个中列出的氨基酸序列，或与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中DNAM-1多肽不包含与野生型DNAM-1多肽相同的序列。
19.权利要求1至18任一项的T细胞，其中T细胞是CD8+T细胞。
20.权利要求1至19任一项的T细胞，其中T细胞是CD4+T细胞。
21.权利要求1至20任一项的T细胞，其中T细胞是αβT细胞或γδT细胞。
22.权利要求1至21任一项的T细胞，其中T细胞源自从人受试者分离的原代人PBMC。
23.权利要求1至22任一项的T细胞，其包含重组TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。
24.权利要求23的T细胞，其中CAR结合选自TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖酰单唾液酸神经节苷酯、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MART-1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1之中的肿瘤抗原。
25.一种药物组合物，包含权利要求1-24任一项的T细胞和药学上可接受的载体。
26.权利要求25的药物组合物，进一步包含化疗剂或抗感染剂。
27.权利要求26的药物组合物，其中化疗剂是免疫检查点抑制剂。
28.权利要求27的药物组合物，其中免疫检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1和PD-L1抑制剂。
29.权利要求26的药物组合物，其中抗感染剂选自抗生素、抗阿米巴剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗疟剂、抗结核剂和抗病毒剂。
30.一种制备用于过继性细胞疗法的T细胞群的方法，包括：
从受试者获得T细胞样品；
从样品选择DNAM+T细胞；和
扩增DNAM+T细胞，以产生用于过继性T细胞疗法的T细胞群。
31.权利要求36的方法，其中该方法包括选择DNAM+CD8+T细胞。
32.权利要求36的方法，其中该方法包括选择DNAM+CD4+T细胞。
33.权利要求36至38任一项的方法，进一步包括将DNAM+T细胞工程化，以表达CAR或转基因TCR。
34.由权利要求30至33任一项的方法产生的T细胞群。
35.一种提高受试者免疫功能的方法，包括将权利要求1至24任一项的T细胞、权利要求25至29任一项的药物组合物或权利要求34的T细胞群给药于受试者。
36.一种用于治疗受试者癌症的方法，包括将权利要求1至24任一项的T细胞、权利要求25至29任一项的药物组合物或权利要求34的T细胞群给药于受试者。
37.权利要求36的方法，进一步包括将化疗剂给药于受试者。
38.权利要求37的方法，其中化疗剂是免疫检查点抑制剂。
39.权利要求38的方法，其中免疫检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1和PD-L1抑制剂。
40.权利要求35至39任一项的方法，其中癌症是皮肤癌(例如，黑素瘤)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、肾癌、食道癌、前列腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、神经母细胞瘤或肝细胞癌。
41.权利要求35至40任一项的方法，其中在给药T细胞或药物组合物前，癌症对一种或多种免疫检查点抑制剂是耐药的。
42.权利要求35至41任一项的方法，其中T细胞是自体的。
43.权利要求35至41任一项的方法，其中T细胞是同种异体的。
44.一种用于治疗受试者感染的方法，包括将权利要求1至24任一项的T细胞、权利要求25至29任一项的药物组合物或权利要求40的T细胞群给药于受试者。
45.权利要求44的方法，其中感染是病毒和/或细菌感染。
46.权利要求44或权利要求45的方法，其中感染是急性感染。
47.权利要求44或权利要求45的方法，其中感染是慢性感染。
48.权利要求44至47任一项的方法，进一步包括将抗感染剂给药于受试者。
49.权利要求48的方法，其中抗感染剂选自抗生素、抗阿米巴剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗疟剂、抗结核剂和抗病毒剂之中。
50.权利要求44至49任一项的方法，其中T细胞是自体的。
51.权利要求44至49任一项的方法，其中T细胞是同种异体的。
52.权利要求1至24任一项的T细胞、权利要求25至29任一项的药物组合物或权利要求34的T细胞群用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
53.权利要求1至24任一项的T细胞、权利要求25至29任一项的药物组合物或权利要求34的T细胞群用于制备用于治疗感染的药物的用途。
54.权利要求1至24任一项的T细胞、权利要求25至29任一项的药物组合物或权利要求34的T细胞群用于制备用于增强受试者免疫功能的药物的用途。
55.一种用于评估受试者中的T细胞或T细胞群的免疫功能的方法，包括评估来自受试者样品中的T细胞群中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平并将来自受试者样品中的T细胞群中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平与对照样品中的T细胞群中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平，或与参照水平，进行比较。
56.权利要求55的方法，其中评估样品中的T细胞群中的T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平包括检测T细胞群中的DNAM1+T细胞的数量或百分比。
57.权利要求55或56的方法，其中对照样品包含具有正常或有效免疫功能的T细胞，并且与对照样品中的T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平相比，来自受试者样品中的T细胞群中的一个或多个T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平降低表明受试者中的T细胞或T细胞群的免疫功能受损或无效。
58.权利要求55至57任一项的方法，包括：
从受试者获得样品，其中样品包含一个T细胞或T细胞群；
将样品接触结合剂，所述结合剂结合T细胞表面上的DNAM-1；和
当结合到T细胞群中的一个或多个T细胞时，检测该结合剂，由此评估来自受试者的样品中的T细胞表面上的DNAM-1的含量或水平或DNAM+T细胞的数量或百分比。
59.权利要求58的方法，其中结合剂是抗DNAM-1抗体。
60.权利要求55至59任一项的方法，其中受试者患有癌症或感染。
61.一种用于预测癌症受试者将响应使用免疫检查点抑制剂的治疗的可能性的方法，包括检测来自受试者的样品中的DNAM-1+CD8+T细胞的数量或百分比，并将来自受试者的样品中的DNAM-1+CD8+T细胞的数量或百分比与参照水平或含量进行比较。
62.权利要求61的方法，其中检测了作为样品中的总CD8+T细胞百分比的DNAM-1+CD8+T细胞的百分比。
63.权利要求61或62的方法，其中样品是肿瘤样品并且T细胞是肿瘤浸润性T细胞。
64.一种修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的325-328位的位置上的AP-2结合基序YXXF的修饰，其中所述修饰消除了AP-2结合基序YXXF。
65.权利要求64的修饰的DNAM-1多肽，其中：
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325位的位置上的酪氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的328位的位置上的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的325、326或327位的任一个位置后的氨基酸插入；和/或
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的326和327位的位置的一个或多个残基的缺失。
66.一种修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的282-287位的位置上的AP-2结合基序EXXXLF的修饰，其中所述修饰消除了AP-2结合基序EXXXLF。
67.权利要求66的修饰的DNAM-1多肽，其中：
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282位的位置上的谷氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的286位的位置上的亮氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的287位的位置上的苯丙氨酸的氨基酸置换或缺失；
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的282-286的位置的任一个或多个残基后的氨基酸插入；和/或
DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的283、284和285位的位置上的一个或多个残基的缺失。
68.一种修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的320-322位的位置上的Cbl-B结合基序((D/N)XpY)的修饰，其中修饰消除了Cbl-B结合基序。
69.权利要求68的修饰的DNAM-1多肽，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320位的位置上的天冬氨酸的氨基酸缺失或置换。
70.权利要求68或69的修饰的DNAM-1多肽，其中DNAM-1多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的320和/或321位的位置后的氨基酸插入。
71.一种修饰的DNAM-1多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的295位的位置上的赖氨酸和/或在对应于SEQ ID NO:1的333位的位置上的赖氨酸的修饰(例如，氨基酸置换或缺失)。
72.权利要求64至71任一项的修饰的DNAM-1多肽，其与在T细胞中表达时的野生型DNAM-1多肽相比，在T细胞中表达时具有增加的表面保留。
73.权利要求64-72任一项的修饰的DNAM-1多肽，其包含SEQ ID NO:5-9或21-30任一个中列出的氨基酸序列，或与其具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中DNAM-1多肽不包含与野生型DNAM-1多肽相同的序列。
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