JP2022521541A - 免疫機能を増強するための細胞、組成物、及び方法 - Google Patents

免疫機能を増強するための細胞、組成物、及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、一般に、免疫機能を増強するための、ポリペプチド、細胞、組成物、及び方法に関し、特に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞など、Ｔ細胞の免疫機能に関する。より詳細には、本発明は、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド、組換えＤＮＡＭ－１及び／又は改変ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞、並びにがん又は感染症の処置などのために、これらの細胞を、養子Ｔ細胞移入において使用する方法に関する。本開示はまた、免疫機能が増強されたＴ細胞を調製するための方法；養子細胞療法のためのＴ細胞を調製する方法；対象又は細胞集団におけるＴ細胞の免疫機能を評価するための方法；がんを伴う対象の、がん治療に対する応答性を予測するための方法；及びがんを伴う対象の生存率又は生存時間を予測するための方法にも関する。【選択図】なし

Description

[0002]本開示は、一般には、免疫機能を増強するためのポリペプチド、細胞、組成物、及び方法に関し、特に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞など、Ｔ細胞の免疫機能に関する。より詳細には、本発明は、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド、組換えＤＮＡＭ－１及び／又は改変ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞、並びにがん又は感染症の処置などのために、これらの細胞を、養子Ｔ細胞移入において使用する方法に関する。本開示はまた、免疫機能が増強されたＴ細胞を調製するための方法；養子細胞療法のためのＴ細胞を調製する方法；対象又は細胞集団におけるＴ細胞の免疫機能を評価するための方法；がんを伴う対象の、がん治療に対する応答性を予測するための方法；及びがんを伴う対象の生存率又は生存時間を予測するための方法にも関する。
[0003]ここ数十年間に、がん治療は、著明に進化している。手術、放射線療法、及び化学療法による、従来の処置が、より正確になっただけではなく、新たな処置はまた、がんの発症と関連する、特異的な分子、細胞、及び／又は経路をターゲティングし、特に、異なる、がん、がん病期、及び／又は集団に効果的である、広範にわたる治療も提供しつつある。したがって、手術、放射線療法、及び従来の化学療法（すなわち、がんなど、急速に分裂する細胞を死滅させる薬物の使用を伴う、非ターゲティング化学療法）に加えて、今や、がん治療はまた、例えば、ホルモン治療、ターゲティング療法、及び免疫療法も含む。
[0004]がん免疫療法は、がんを処置するのに、患者の免疫系を利用又は用いることにより機能する。これは、いくつかの機構を介する場合があり、エフェクター細胞の刺激及び／又は調節的細胞の阻害による、免疫応答の非特異的刺激（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γなどのサイトカイン、又はサリドマイド（サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（登録商標））、レナリドミド（レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（登録商標））、ポマリドミド（ポマリスト（Ｐｏｍａｌｙｓｔ）（登録商標））、及びイミキモド（ザイクララ（Ｚｙｃｌａｒａ）（登録商標））などの薬物の投与による）、特異的抗がん免疫応答を刺激又は増強するための能動的免疫化（例えば、子宮頸がんの防止のためのＨＰＶワクチンである、ガルダシル（Ｇａｒｄａｓｉｌ）（登録商標）及びケバリクス（Ｃｅｖａｒｉｘ）（登録商標）、前立腺がんの処置のためのシプリューセルＴ（プロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）（登録商標））、並びに膀胱がんの処置のためのカルメット－ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチンなどのがんワクチンを使用する）、並びに抗体の受動的移入又は活性化免疫細胞の受動的移入（すなわち、養子細胞療法（ＡＣＴ）、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法）を含む、異なる戦略を使用することによりなされうる。がん免疫療法として開発された抗体は、例えば、免疫チェックポイント阻害剤抗体（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、又はＰＤ－Ｌ１をターゲティングする）、及びがん細胞に対する免疫応答を誘導するように、がん細胞における分子をターゲティングする抗体（例えば、抗ＣＤ５２抗体）を含む。
[0005]しかし、がん免疫療法は、がん処置のためのツールボックスの拡大をもたらし、一部の患者には、極めて効果的でありうる一方で、多くの患者は、現在承認されているがん免疫療法から利益を得ない。根本的な非応答性の他に、多くの患者は、現行の免疫チェックポイント遮断抗体に対する耐性を獲得する。したがって、免疫機能を促進し、がん免疫療法及び他の免疫療法などの免疫療法の有効性を増強するための方法及び組成物が、依然として必要とされている。
[0006]本開示は、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１；ＣＤ２２６）が、腫瘍におけるＴ細胞機能に不可欠であるという、予測外の知見に淵源する。本発明者らは、ＤＮＡＭ－１シグナル伝達が、ＤＮＡＭ－１の下方調節を誘導し、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を制限又は低減することを決定した。これに対し、ＤＮＡＭ－１の表面発現の維持また増大は、Ｔ細胞の機能を増強し、抗腫瘍活性を増大させる。表面発現の維持また増大は、例えば、ヒトＤＮＡＭ－１の３２２位におけるチロシンをターゲティングすること（例えば、これを変異又は消失させること）、ヒトＤＮＡＭ－１の３２４～３２７位におけるＡＰ２結合性モチーフをターゲティングすること（例えば、これを変異又は消失させること）；ヒトＤＮＡＭ－１の２８２～２８７位に対応する位置におけるＡＰ－２結合性モチーフをターゲティングすること（例えば、これを変異又は消失させること）；ヒトＤＮＡＭ－１の３２０～３２３位におけるＣｂｌ－ｂ結合性モチーフをターゲティングすること（例えば、これを変異又は消失させること）；及び／又はヒトＤＮＡＭ－１の２９５及び／又は３３３位におけるリシン（複数可）をターゲティングすること（例えば、これを変異又は消失させること）（配列番号１に明示された前駆体ヒトＤＮＡＭ－１と比べた番号付けによる）により果たされうる。したがって、このようにしてポリペプチドをターゲティングする、さらなる改変を有する改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、Ｔ細胞において発現された場合に、Ｔ細胞において発現される野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（例えば、Ｔ細胞において発現される、内因性の野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド）と比較した、細胞表面保持又は細胞表面発現の増大を呈しうる。これは、がん治療に対して、大きな含意を有し、特に、がん免疫療法に対して、大きな含意を有する。詳細には、本明細書で初めて記載される通り、本開示の組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチド及び／又は改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＣＡＲ Ｔ細胞を含むＴ細胞は、対象におけるがんを処置するように、単独処置として、対象へと養子移入される場合もあり、他のがん治療と組み合わせて、対象へと養子移入される場合もある。内因性ＤＮＡＭ－１（高レベルの内因性ＤＮＡＭ－１を含む）を発現するＴ細胞もまた、がんを伴う対象への、後続の養子移入のために単離されうる。ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞の免疫機能の増強はまた、対象における感染症の処置のためにも利用されうる。本開示の組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチド及び／又は改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞は、対象における感染症を処置するように、単独処置として、対象へと養子移入される場合もあり、他の治療と組み合わせて、対象へと養子移入される場合もある。内因性ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞もまた、感染症の処置のための、感染を伴う対象への、後続の養子移入のために単離されうる。本明細書で裏付けられる通り、ＤＮＡＭ－１はまた、Ｔ細胞免疫機能、がんに抗する生存、及びがん治療に対する応答性についてのバイオマーカーでもある。
[0007]したがって、本明細書の一態様では、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較した、細胞表面保持の増大、又は細胞表面発現の増大を呈する改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含み；ヒトＴ細胞であるＴ細胞が提示される。
[0008]一部の実施形態では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンの改変を含む。改変は、例えば、チロシンの、フェニルアラニンによる置換など、アミノ酸置換又はアミノ酸欠失でありうる。
[0009]さらなる実施形態では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２５～３２８位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦの改変を含み、この場合、改変は、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦを消失させる。例えば、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２５位に対応する位置において、チロシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の３２８位に対応する位置において、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の３２５、３２６、若しくは３２７位に対応する位置のうちのいずれか１つの後におけるアミノ酸挿入；並びに／又は３２６及び３２７位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含みうる。
[0010]他の実施形態では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の２８２～２８７位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦの改変を含み、この場合、改変は、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦを消失させる。例えば、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の２８２位に対応する位置における、グルタミン酸のアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号の２８６位に対応する位置における、ロイシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の２８７位に対応する位置における、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の２８２～２８６位に対応する位置における残基のうちのいずれか１つ若しくは複数の後におけるアミノ酸挿入；並びに／又は配列番号１の２８３、２８４、及び２８５位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含みうる。
[0011]さらなる実施形態では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２０～３２２位に対応する位置において、Ｃｂｌ－ｂ結合性モチーフの改変（（Ｄ／Ｎ）ＸｐＹ）を含み、この場合、改変は、Ｃｂｌ－Ｂ結合性モチーフを消失させる。一部の例では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２０位に対応する位置におけるアスパラギン酸のアミノ酸欠失又はアミノ酸置換；及び／又は配列番号１の３２０及び／又は３２１位に対応する位置の後におけるアミノ酸挿入を含む。
[0012]他の実施形態では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の２９５位に対応する位置における、リシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；及び／又は配列番号１の３３３位に対応する位置におけるリシンのアミノ酸置換又はアミノ酸欠失を含む。
[0013]さらなる態様では、本開示は、異種細胞内シグナル伝達ドメインへと融合されていないか、又はこれを含まない組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含み、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞を提示する。一部の実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンの改変を含む。さらなる態様では、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンの改変を含む、組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含むＴ細胞が提供され、この場合、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。これらの態様の、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンの改変は、アミノ酸置換又はアミノ酸欠失、例えば、チロシンの、フェニルアラニンによる置換でありうる。
[0014]上記で記載されたＴ細胞に関する態様の各々についての、一部の実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、細胞質ドメインの全部又は一部を欠く。他の実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、細胞外ドメイン；ＩｇＧ１ドメイン；及び／又はＩｇＧ２ドメインの全部又は一部を含む。
[0015]特定の例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号５～９若しくは２１～３０のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸の配列、又はこれに対する、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を有する配列を含み、この場合、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと同じ配列を含まない（すなわち、野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド（例えば、配列番号１又は２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド）などの野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドに対する、１００％未満の配列同一性を有する）。
[0016]一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞でありうる。特定の例では、Ｔ細胞は、ヒト対象から単離された初代ヒトＰＢＭＣに由来する。
[0017]一部の実施形態では、Ｔ細胞は、組換えＴＣＲ及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、例えば、Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞でありうる。一部の例では、ＣＡＲは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フロシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＡＧＥＡ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、変異体ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、及びＩＧＬＬ１の中から選択される腫瘍抗原に結合する。
[0018]また、本開示のＴ細胞と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物も提供される。医薬組成物は、化学療法剤（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤）、又は抗感染症剤（例えば、抗生剤、抗アメーバ剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、又は抗ウイルス剤）をさらに含みうる。
[0019]本開示のさらなる態様は、養子細胞療法のためのＴ細胞集団を調製する方法であって、Ｔ細胞の試料を、対象から得るステップと；ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞を、試料から選択するステップと；ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞を拡大して、養子Ｔ細胞療法のためのＴ細胞集団を作製するステップとを含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ＤＮＡＭ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／又はＤＮＡＭ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を選択するステップを含む。特定の例では、方法は、ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞を操作して、ＣＡＲ又はトランスジェニックＴＣＲを発現させるステップをさらに含む。したがって、また、このような方法により作製されるＴ細胞集団も提供される。
[0020]別の態様では、対象における免疫機能を増大させる方法であって、対象へと、本開示のＴ細胞（例えば、本明細書で記載される、組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチド及び／又は改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞）、本開示の医薬組成物、又は本開示のＴ細胞集団を投与するステップを含む方法が提供される。
[0021]さらなる態様では、対象におけるがんを処置するための方法であって、対象へと、本開示のＴ細胞（例えば、本明細書で記載される、組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチド及び／又は改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞）、本開示の医薬組成物、又は本開示のＴ細胞集団を投与するステップを含む方法が提供される。一部の例では、方法は、化学療法剤（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤）を、対象へと投与するステップをさらに含む。一部の例では、がんは、皮膚がん（例えば、黒色腫）、肺がん、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵がん、子宮内膜がん、結腸がん、腎がん、食道がん、前立腺がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、神経芽細胞腫、又は肝細胞癌である。さらなる例では、がんは、Ｔ細胞又は医薬組成物の投与の前に、１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤に対して耐性である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞である。他の実施形態では、Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞である。
[0022]別の態様では、対象における感染症を処置するための方法であって、対象へと、本開示のＴ細胞（例えば、本明細書で記載される、組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチド及び／又は改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞）、本開示の医薬組成物、又は本開示のＴ細胞集団を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、感染症は、ウイルス及び／又は細菌による感染症である。感染症は、急性感染症の場合もあり、慢性感染症の場合もある。一部の実施形態では、方法は、抗感染症剤（例えば、抗生剤、抗アメーバ剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、又は抗ウイルス剤）を、対象へと投与するステップをさらに含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞である。他の実施形態では、Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞である。
[0023]また、本開示のＴ細胞（例えば、本明細書で記載される、組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチド及び／又は改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞）、本開示の医薬組成物、又は本開示のＴ細胞集団の、がんを処置すること、感染症を処置すること、及び／又は対象における免疫機能を増強することのための医薬の調製のための使用も提供される。
[0024]本開示のさらなる態様は、対象における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団の免疫機能を評価するための方法であって、対象に由来する試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルを評価するステップと、対象に由来する試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルを、対照試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルと比較するステップとを含む方法に関する。一部の例では、試料における、Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルを評価するステップは、試料における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数又は百分率を検出することを含む。一実施形態では、対照試料は、免疫機能が正常であるか、又は効果的なＴ細胞を含み、対象に由来する試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルの、対照試料における、Ｔ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルと比較した低減は、対象における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団の免疫機能が、損なわれているか、又は効果的でないことを指し示す。さらなる実施形態では、方法は、対象に由来する試料を得るステップであって、試料が、Ｔ細胞又はＴ細胞集団を含むステップと；試料を、Ｔ細胞の表面におけるＤＮＡＭ－１に結合する結合剤（例えば、抗ＤＮＡＭ－１抗体）と接触させるステップと；Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞に結合した場合の結合剤を検出し、これにより、Ｔ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量若しくはレベル、又は対象に由来する試料における、ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞の数若しくは百分率を評価するステップとを含む。一部の例では、対象は、がんを有するか、又は感染症を有する。一部の実施形態では、対象は、化学療法剤又は抗感染症剤などの治療をさらに投与される。
[0025]本開示の別の態様は、がんを伴う対象が、免疫チェックポイント阻害剤による治療に応答する可能性を予測するための方法であって、対象に由来する試料（例えば、Ｔ細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞であるような腫瘍試料）における、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数又は百分率を検出するステップと、対象に由来する試料における、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋細胞の数又は百分率を、参照レベル又は参照量と比較するステップとを含む方法に関する。特定の実施形態では、試料における全ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率としての、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞が検出される。対象が、治療に対して応答性であることが予測される、一部の実施形態では、対象は、治療、例えば、免疫チェックポイント阻害剤をさらに投与される。対象が、治療に対して非応答性であることが予測される、一部の実施形態では、対象は、応答性を改善する治療、例えば、本開示のＴ細胞を投与される。
[0026]また、配列番号１の３２５～３２８位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦの改変を含み、改変が、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦを消失させる、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドも提供される。一部の例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２５位に対応する位置における、チロシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の３２８位に対応する位置における、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の３２５、３２６、若しくは３２７位に対応する位置のうちのいずれか１つの後におけるアミノ酸挿入；並びに／又は３２６及び３２７位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含む。
[0027]別の態様では、配列番号１の２８２～２８７位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦの改変を含み、改変が、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦを消失させる、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが提供される。一部の例では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号の２８２位に対応する位置における、グルタミン酸のアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の２８６位に対応する位置における、ロイシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の２８７位に対応する位置における、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失；配列番号１の２８２～２８６位に対応する位置における残基のうちのいずれか１つ若しくは複数の後におけるアミノ酸挿入；並びに／又は２８３、２８４、及び２８５位に対応する位置における残基のうちの１つ又は複数の欠失を含む。
[0028]さらなる態様では、配列番号１の３２０～３２２位に対応する位置において、Ｃｂｌ－Ｂ結合性モチーフの改変（（Ｄ／Ｎ）ＸｐＹ）を含み、改変が、Ｃｂｌ－ｂ結合性モチーフを消失させる、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが提供される。一例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２０位に対応する位置におけるアスパラギン酸のアミノ酸欠失又はアミノ酸置換；及び／又は配列番号１の３２０及び／又は３２１位に対応する位置の後におけるアミノ酸挿入を含む。
[0029]別の態様では、配列番号１の２９５位に対応する位置におけるリシン、及び／又は配列番号１の３３３位に対応する位置におけるリシンの改変（例えば、アミノ酸置換又はアミノ酸欠失）を含む、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが提供される。
[0030]特定の実施形態では、本開示の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、細胞表面における発現又は保持を、Ｔ細胞において発現された場合の、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較して増大させている。一部の実施形態では、改変は、配列番号１又は２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べた改変である。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウス、及びＤＮＡＭ－１欠損（ＣＤ２２６ＫＯ）マウスにおける腫瘍増殖を示すグラフ表示である。Ａ．ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＫＯマウス（群１つ当たりのｎ＝７、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）における、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫についての、平均値腫瘍増殖曲線である。Ｂ．ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＫＯマウス（群１つ当たりのｎ＝８、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）における、ＭＣ３８についての、平均値腫瘍増殖曲線である。Ｃ．ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＫＯマウス（群１つ当たりのｎ＝７～９、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）における、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍについての、平均値腫瘍増殖曲線である。Ｄ．ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＫＯマウス（群１つ当たりのｎ＝７～１０、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）における、ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉについての、平均値腫瘍増殖曲線である。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定である。 腫瘍保有ＷＴマウスに由来するＣＤ８＋ ＴＩＬにおける、ＣＤ２２６の発現を示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す図である（左パネル及び対応するＣＤ２２６サブセットの定量；右パネル、ｎ＝１５、平均値±ＳＥＭ、３回の実験の累積結果を示す）。Ａ．Ｂ１６Ｆ１０腫瘍である。Ｂ．ＭＣ３８腫瘍である。Ｃ．ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍である。Ｄ．ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ腫瘍である。 表示のＣＤ２２６サブセットにわたり、ＷＴマウスの腫瘍における、ＩＦＮ－γ＋ ＣＤ８＋ ＴＩＬ、ＴＮＦ－α＋ ＣＤ８＋ ＴＩＬ、グランザイムＢ＋ ＣＤ８＋ ＴＩＬ、及びＫｉ６７＋ ＣＤ８＋ ＴＩＬについての、対応するフローサイトメトリー定量を示す図である。Ａ．Ｂ１６Ｆ１０腫瘍（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αについてのｎ＝１５、ＧｒｚＢについてのｎ＝１２、Ｋｉ６７についてのｎ＝１０、２回の実験の累積結果を示し、３つの独立の実験を表す）である。Ｂ．ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍（ｎ＝１０、１～３回の実験についての、代表的な結果を示す）である。多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１である。 対応するＩＦＮ－γ産生の定量を伴う、腫瘍浸潤ＣＤ８＋ ＰＤ－１＋ ＴＩＭ３＋生Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋ ＰＤ－１＋ ＴＩＭ３＋ ＴＩＧＩＴ＋ ＬＡＧ３＋生Ｔ細胞（上行）を示す、代表的なフローサイトメトリーコンタープロットを示す図である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、実験は１回行った）。多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１である。 Ｙ３１９の、Ｔ細胞機能に対する重要性を示すグラフ表示である。（Ａ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍についての、個別の増殖曲線である（ＷＴマウスのｎ＝１１であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝１２であり、３回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｂ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）についての、数を示す円グラフである（ＷＴマウスのｎ＝３０であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝３１であり、３回の実験の累積結果を示す）。（Ｃ）（Ａ）に示した実験についての、対応するカプラン－マイヤー生存曲線である。（Ｄ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ腫瘍についての、個別の腫瘍増殖曲線である（ｎ＝１７（Ｙ）；ｎ＝２１（ＷＴ）；２回の実験のうちの、１回の代表的な実験について示す）。（Ｅ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）についての、数を示す円グラフである（ＷＴマウスのｎ＝５７であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝５２であり、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｆ）対応するカプラン－マイヤー生存曲線である。（Ｇ）Ｖｋ１２５９８多発性骨髄腫を保有する、ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線である（群１つ当たりのｎ＝１０；実験は１回行った）。（Ｈ）ＣＤ２２６ＫＯマウス、ＷＴマウス、又はＣＤ２２６Ｙマウスに由来する休眠脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６のＭＦＩについての、フローサイトメトリー定量である（ｎ＝６、平均値±ＳＥＭ）。（Ｉ）ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍に由来するＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｊ）ＷＴ ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ２２６Ｙ ＣＤ８＋Ｔ細胞における、表示のＣＤ２２６サブセットの平均値頻度（左）、及び個々のマウスにおける、ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の頻度（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）を示す、対応する棒グラフである。（Ｋ）ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＹマウスのＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍から単離されたＣＤ２２６ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞（左）、及びＣＤ２２６ｄｉｍＣＤ８＋Ｔ細胞（右）についての、フローサイトメトリー定量である（群１つ当たりのｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｌ）ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋ ＴＩＬについてのフローサイトメトリー定量である（ｎ＝１８、平均値±ＳＤ、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｍ）腫瘍浸潤ＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋生Ｔ細胞を示す、代表的フローサイトメトリーのコンタープロット（左）、及びＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスの、ＣＤ８＋四量体ｎｅｇＴ細胞及びＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の定量である（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｎ）ＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ＋のフローサイトメトリー定量である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、１回の実験についての、代表的な結果）。（Ｏ）ＣＢＡにより決定される、腫瘍組織溶解物におけるＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの定量である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。統計学的解析：フィッシャーの正確検定（Ｂ、Ｅ）、生存曲線についてのログランク（マンテル－コックス）検定（Ｃ、Ｆ）、多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｈ、Ｊ）、スチューデントのｔ検定（Ｉ、Ｋ、Ｌ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 Ｙ３１９の、Ｔ細胞機能に対する重要性を示すグラフ表示である。（Ａ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍についての、個別の増殖曲線である（ＷＴマウスのｎ＝１１であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝１２であり、３回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｂ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）についての、数を示す円グラフである（ＷＴマウスのｎ＝３０であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝３１であり、３回の実験の累積結果を示す）。（Ｃ）（Ａ）に示した実験についての、対応するカプラン－マイヤー生存曲線である。（Ｄ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ腫瘍についての、個別の腫瘍増殖曲線である（ｎ＝１７（Ｙ）；ｎ＝２１（ＷＴ）；２回の実験のうちの、１回の代表的な実験について示す）。（Ｅ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）についての、数を示す円グラフである（ＷＴマウスのｎ＝５７であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝５２であり、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｆ）対応するカプラン－マイヤー生存曲線である。（Ｇ）Ｖｋ１２５９８多発性骨髄腫を保有する、ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線である（群１つ当たりのｎ＝１０；実験は１回行った）。（Ｈ）ＣＤ２２６ＫＯマウス、ＷＴマウス、又はＣＤ２２６Ｙマウスに由来する休眠脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６のＭＦＩについての、フローサイトメトリー定量である（ｎ＝６、平均値±ＳＥＭ）。（Ｉ）ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍に由来するＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｊ）ＷＴ ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ２２６Ｙ ＣＤ８＋Ｔ細胞における、表示のＣＤ２２６サブセットの平均値頻度（左）、及び個々のマウスにおける、ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の頻度（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）を示す、対応する棒グラフである。（Ｋ）ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＹマウスのＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍から単離されたＣＤ２２６ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞（左）、及びＣＤ２２６ｄｉｍＣＤ８＋Ｔ細胞（右）についての、フローサイトメトリー定量である（群１つ当たりのｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｌ）ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋ ＴＩＬについてのフローサイトメトリー定量である（ｎ＝１８、平均値±ＳＤ、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｍ）腫瘍浸潤ＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋生Ｔ細胞を示す、代表的フローサイトメトリーのコンタープロット（左）、及びＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスの、ＣＤ８＋四量体ｎｅｇＴ細胞及びＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の定量である（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｎ）ＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ＋のフローサイトメトリー定量である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、１回の実験についての、代表的な結果）。（Ｏ）ＣＢＡにより決定される、腫瘍組織溶解物におけるＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの定量である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。統計学的解析：フィッシャーの正確検定（Ｂ、Ｅ）、生存曲線についてのログランク（マンテル－コックス）検定（Ｃ、Ｆ）、多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｈ、Ｊ）、スチューデントのｔ検定（Ｉ、Ｋ、Ｌ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 Ｙ３１９の、Ｔ細胞機能に対する重要性を示すグラフ表示である。（Ａ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍についての、個別の増殖曲線である（ＷＴマウスのｎ＝１１であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝１２であり、３回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｂ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）についての、数を示す円グラフである（ＷＴマウスのｎ＝３０であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝３１であり、３回の実験の累積結果を示す）。（Ｃ）（Ａ）に示した実験についての、対応するカプラン－マイヤー生存曲線である。（Ｄ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ腫瘍についての、個別の腫瘍増殖曲線である（ｎ＝１７（Ｙ）；ｎ＝２１（ＷＴ）；２回の実験のうちの、１回の代表的な実験について示す）。（Ｅ）ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）についての、数を示す円グラフである（ＷＴマウスのｎ＝５７であり、ＣＤ２２６Ｙマウスのｎ＝５２であり、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｆ）対応するカプラン－マイヤー生存曲線である。（Ｇ）Ｖｋ１２５９８多発性骨髄腫を保有する、ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線である（群１つ当たりのｎ＝１０；実験は１回行った）。（Ｈ）ＣＤ２２６ＫＯマウス、ＷＴマウス、又はＣＤ２２６Ｙマウスに由来する休眠脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６のＭＦＩについての、フローサイトメトリー定量である（ｎ＝６、平均値±ＳＥＭ）。（Ｉ）ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍に由来するＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｊ）ＷＴ ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ２２６Ｙ ＣＤ８＋Ｔ細胞における、表示のＣＤ２２６サブセットの平均値頻度（左）、及び個々のマウスにおける、ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の頻度（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）を示す、対応する棒グラフである。（Ｋ）ＷＴマウス又はＣＤ２２６ＹマウスのＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍から単離されたＣＤ２２６ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞（左）、及びＣＤ２２６ｄｉｍＣＤ８＋Ｔ細胞（右）についての、フローサイトメトリー定量である（群１つ当たりのｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｌ）ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋ ＴＩＬについてのフローサイトメトリー定量である（ｎ＝１８、平均値±ＳＤ、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｍ）腫瘍浸潤ＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋生Ｔ細胞を示す、代表的フローサイトメトリーのコンタープロット（左）、及びＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスの、ＣＤ８＋四量体ｎｅｇＴ細胞及びＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の定量である（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｎ）ＣＤ８＋ＯＶＡ四量体＋ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ＋のフローサイトメトリー定量である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、１回の実験についての、代表的な結果）。（Ｏ）ＣＢＡにより決定される、腫瘍組織溶解物におけるＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの定量である（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。統計学的解析：フィッシャーの正確検定（Ｂ、Ｅ）、生存曲線についてのログランク（マンテル－コックス）検定（Ｃ、Ｆ）、多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｈ、Ｊ）、スチューデントのｔ検定（Ｉ、Ｋ、Ｌ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の喪失が、ＣＤ１５５により媒介されることを示す結果を提示する図である。（Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｎｅｇＴＩＬの頻度の、ｍｇ単位のＢ１６Ｆ１０腫瘍の重量との相関である（ｎ＝１０、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｎｅｇＴＩＬの頻度の、ｍｇ単位のＭＣ３－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍の重量との相関である（ｎ＝２１、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｃ）非処置のまま放置されるか、又はプレートに結合させたマウスＣＤ１５５－Ｆｃの存在下又は非存在下、及び抗ＣＤ１５５遮断抗体の存在下又は非存在下において、プレートに結合させた抗ＣＤ３で刺激された、ＷＴ脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２２６発現（上）、並びに対応する定量（下）を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである（ｎ＝６、平均値±ＳＤ、２回の実験からの、代表的な結果を示す）。（Ｄ）ＣＤ２２６内部化アッセイ：対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）又はＣＤ１５５－Ｆｃで処置されたＷＴ ＣＤ８＋Ｔ細胞（上）又はＣＤ２２６Ｙ ＣＤ８＋Ｔ細胞（下）の、ＣＤ２２６についての表面染色（赤）及びＣＤ２２６についての細胞内染色（黄）を示す代表的蛍光ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ画像（左）、並びに細胞内ＣＤ２２６のＭＦＩについての、対応する定量である（右、細胞のｎ＝１００個、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｅ）腫瘍細胞及び宿主細胞におけるＣＤ１５５の、ＴＩＬにおけるＣＤ２２６の発現に対する影響を評価するための実験レイアウトである（左）。ＷＴマウス及びＣＤ１５５ＫＯマウスに、Ｂ１６Ｆ１０Ｃｔｒｌ細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞を注入し、接種の１４日後に、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を評価した（右、ｎ＝７：ＷＴ→ＷＴ、ｎ＝９：ＷＴ→ＫＯ、ｎ＝１０：ＫＯ→ＷＴ及びｎ＝８：ＫＯ→ＫＯ、平均値±ＳＤ、３回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｆ）ＣＤ１５５により媒介されるＣＤ２２６の下方調節におけるＣＤ２２６Ｙの影響を評価するための実験レイアウトである（左）。ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスに、Ｂ１６Ｆ１０Ｃｔｒｌ細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞を注入し、接種の１４日後に、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を評価した（右、ｎ＝５：ＷＴ→ＷＴ、ｎ＝８：ＷＴ→ＣＤ２２６Ｙ、ｎ＝９：ＫＯ→ＷＴ及びｎ＝６：ＫＯ→ＣＤ２２６Ｙ、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｇ）（Ｆ）と同じ実験である。ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスに、Ｂ１６Ｆ１０Ｃｔｒｌ細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞を注入し、接種の１４日後に、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を、ＣＤ２２６ｄｉｍ（左）、及びＣＤ２２６ｈｉｇｈ（右）について評価した（ｎ＝５：ＷＴ→ＷＴ、ｎ＝８：ＷＴ→ＣＤ２２６Ｙ、ｎ＝９：ＫＯ→ＷＴ及びｎ＝６：ＫＯ→ＣＤ２２６Ｙ、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。統計学的解析：線形回帰を伴うピアソン相関（Ａ及びＢ）、多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の喪失が、ＣＤ１５５により媒介されることを示す結果を提示する図である。（Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｎｅｇＴＩＬの頻度の、ｍｇ単位のＢ１６Ｆ１０腫瘍の重量との相関である（ｎ＝１０、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ２２６ｎｅｇＴＩＬの頻度の、ｍｇ単位のＭＣ３－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍の重量との相関である（ｎ＝２１、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｃ）非処置のまま放置されるか、又はプレートに結合させたマウスＣＤ１５５－Ｆｃの存在下又は非存在下、及び抗ＣＤ１５５遮断抗体の存在下又は非存在下において、プレートに結合させた抗ＣＤ３で刺激された、ＷＴ脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２２６発現（上）、並びに対応する定量（下）を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである（ｎ＝６、平均値±ＳＤ、２回の実験からの、代表的な結果を示す）。（Ｄ）ＣＤ２２６内部化アッセイ：対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）又はＣＤ１５５－Ｆｃで処置されたＷＴ ＣＤ８＋Ｔ細胞（上）又はＣＤ２２６Ｙ ＣＤ８＋Ｔ細胞（下）の、ＣＤ２２６についての表面染色（赤）及びＣＤ２２６についての細胞内染色（黄）を示す代表的蛍光ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ画像（左）、並びに細胞内ＣＤ２２６のＭＦＩについての、対応する定量である（右、細胞のｎ＝１００個、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｅ）腫瘍細胞及び宿主細胞におけるＣＤ１５５の、ＴＩＬにおけるＣＤ２２６の発現に対する影響を評価するための実験レイアウトである（左）。ＷＴマウス及びＣＤ１５５ＫＯマウスに、Ｂ１６Ｆ１０Ｃｔｒｌ細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞を注入し、接種の１４日後に、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を評価した（右、ｎ＝７：ＷＴ→ＷＴ、ｎ＝９：ＷＴ→ＫＯ、ｎ＝１０：ＫＯ→ＷＴ及びｎ＝８：ＫＯ→ＫＯ、平均値±ＳＤ、３回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｆ）ＣＤ１５５により媒介されるＣＤ２２６の下方調節におけるＣＤ２２６Ｙの影響を評価するための実験レイアウトである（左）。ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスに、Ｂ１６Ｆ１０Ｃｔｒｌ細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞を注入し、接種の１４日後に、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を評価した（右、ｎ＝５：ＷＴ→ＷＴ、ｎ＝８：ＷＴ→ＣＤ２２６Ｙ、ｎ＝９：ＫＯ→ＷＴ及びｎ＝６：ＫＯ→ＣＤ２２６Ｙ、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。（Ｇ）（Ｆ）と同じ実験である。ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスに、Ｂ１６Ｆ１０Ｃｔｒｌ細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞を注入し、接種の１４日後に、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおけるＣＤ２２６発現を、ＣＤ２２６ｄｉｍ（左）、及びＣＤ２２６ｈｉｇｈ（右）について評価した（ｎ＝５：ＷＴ→ＷＴ、ｎ＝８：ＷＴ→ＣＤ２２６Ｙ、ｎ＝９：ＫＯ→ＷＴ及びｎ＝６：ＫＯ→ＣＤ２２６Ｙ、平均値±ＳＤ、２回の実験についての、代表的な結果を示す）。統計学的解析：線形回帰を伴うピアソン相関（Ａ及びＢ）、多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 養子移入実験の方法及び結果につての、グラフ表示及び概略表示である。（Ａ）ＣＤ２２６＋（ＤＮＡＭ－１＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ２２６－（ＤＮＡＭ－１－）ＣＤ８＋Ｔ細胞の、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を保有するマウスへの養子移入である。９日目に、ＤＮＡＭ－１＋ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はＤＮＡＭ－１－ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞５×１０５個を、ｇｐ１００をコードする、アデノウイルスワクチンの単回注射と共に静脈内移入した。１２、１４、１６日目に、マウスに、腫瘍内ｐｏｌｙＩ：Ｃ／ＣｐＧを施した。カプラン－マイヤー曲線（各群におけるマウスのｎ＝１４、２回の独立の実験からプールされたデータ）を使用して、結果を提示する。＊＊＊＊＝ログランク検定による、ｐ＜０．０００１である。（Ｂ）ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスを、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞の養子移入で処置する、ＡＣＴ免疫療法ための実験プロトコールである（Ｃｙ＝シクロホスファミド）。（Ｃ～Ｅ）（Ｃ）ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１（ｎ＝４６）、（Ｄ）ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１（ｎ＝３４）、及び（Ｅ）ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞（ｎ＝４２）についての、ＡＣＴ療法後１４日目における、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示すウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）。（Ｆ）表示のＰｍｅｌ－１ Ｔ細胞で処置された生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）の数を示す、対応する円グラフである（３回の実験の累積結果を示す）。（Ｇ）ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞で処置されたＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスについての、カプラン－マイヤー生存曲線である（ｎ＝４６：ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ｎ＝３４：ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、及びｎ＝４２：ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、３回の実験の累積結果を示す）。（Ｈ）ＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋ＣＤ２２６ｈｉＷＴ．Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋ＣＤ２２６ｈｉＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す、フローサイトメトリー解析である（ｎ＝６：ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、平均値±ＳＤ、実験は１回行った）。（Ｉ）ＩＦＮ－γ＋ＷＴ ＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はＩＦＮ－γ＋ＣＤ２２６ＹＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す、フローサイトメトリー解析である（ｎ＝１０（ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１）；ｎ＝１３（ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１）、平均値±ＳＤ、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｊ）レトロウイルスによるＣＤ２２６の過剰発現の、ＡＣＴの有効性に対する影響について評価するための実験プロトコールである。ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を単離し、レトロウイルスにより、空ベクター（ＭＯＣＫ）又はＣＤ２２６を、これらへと形質導入し、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスへと養子移入した。（Ｋ）ＡＣＴ後１４日目における、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示す、対応するウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）（ｎ＝１１：ＭＯＣＫ．Ｐｍｅｌ－１及びｎ＝１２：ＣＤ２２６．Ｐｍｅｌ－１、実験は１回行った）。統計学的解析：（Ｆ）については、フィッシャー正確検定であり、対応のないスチューデントの両側ｔ検定（Ｈ、Ｉ）であり、生存曲線については、ログランク（マンテル－コックス）検定であり；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 養子移入実験の方法及び結果につての、グラフ表示及び概略表示である。（Ａ）ＣＤ２２６＋（ＤＮＡＭ－１＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ２２６－（ＤＮＡＭ－１－）ＣＤ８＋Ｔ細胞の、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を保有するマウスへの養子移入である。９日目に、ＤＮＡＭ－１＋ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はＤＮＡＭ－１－ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞５×１０５個を、ｇｐ１００をコードする、アデノウイルスワクチンの単回注射と共に静脈内移入した。１２、１４、１６日目に、マウスに、腫瘍内ｐｏｌｙＩ：Ｃ／ＣｐＧを施した。カプラン－マイヤー曲線（各群におけるマウスのｎ＝１４、２回の独立の実験からプールされたデータ）を使用して、結果を提示する。＊＊＊＊＝ログランク検定による、ｐ＜０．０００１である。（Ｂ）ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスを、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞の養子移入で処置する、ＡＣＴ免疫療法ための実験プロトコールである（Ｃｙ＝シクロホスファミド）。（Ｃ～Ｅ）（Ｃ）ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１（ｎ＝４６）、（Ｄ）ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１（ｎ＝３４）、及び（Ｅ）ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞（ｎ＝４２）についての、ＡＣＴ療法後１４日目における、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示すウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）。（Ｆ）表示のＰｍｅｌ－１ Ｔ細胞で処置された生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）の数を示す、対応する円グラフである（３回の実験の累積結果を示す）。（Ｇ）ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞で処置されたＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスについての、カプラン－マイヤー生存曲線である（ｎ＝４６：ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ｎ＝３４：ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、及びｎ＝４２：ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、３回の実験の累積結果を示す）。（Ｈ）ＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋ＣＤ２２６ｈｉＷＴ．Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋ＣＤ２２６ｈｉＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す、フローサイトメトリー解析である（ｎ＝６：ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、平均値±ＳＤ、実験は１回行った）。（Ｉ）ＩＦＮ－γ＋ＷＴ ＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はＩＦＮ－γ＋ＣＤ２２６ＹＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す、フローサイトメトリー解析である（ｎ＝１０（ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１）；ｎ＝１３（ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１）、平均値±ＳＤ、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｊ）レトロウイルスによるＣＤ２２６の過剰発現の、ＡＣＴの有効性に対する影響について評価するための実験プロトコールである。ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を単離し、レトロウイルスにより、空ベクター（ＭＯＣＫ）又はＣＤ２２６を、これらへと形質導入し、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスへと養子移入した。（Ｋ）ＡＣＴ後１４日目における、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示す、対応するウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）（ｎ＝１１：ＭＯＣＫ．Ｐｍｅｌ－１及びｎ＝１２：ＣＤ２２６．Ｐｍｅｌ－１、実験は１回行った）。統計学的解析：（Ｆ）については、フィッシャー正確検定であり、対応のないスチューデントの両側ｔ検定（Ｈ、Ｉ）であり、生存曲線については、ログランク（マンテル－コックス）検定であり；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 養子移入実験の方法及び結果につての、グラフ表示及び概略表示である。（Ａ）ＣＤ２２６＋（ＤＮＡＭ－１＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ２２６－（ＤＮＡＭ－１－）ＣＤ８＋Ｔ細胞の、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を保有するマウスへの養子移入である。９日目に、ＤＮＡＭ－１＋ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はＤＮＡＭ－１－ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞５×１０５個を、ｇｐ１００をコードする、アデノウイルスワクチンの単回注射と共に静脈内移入した。１２、１４、１６日目に、マウスに、腫瘍内ｐｏｌｙＩ：Ｃ／ＣｐＧを施した。カプラン－マイヤー曲線（各群におけるマウスのｎ＝１４、２回の独立の実験からプールされたデータ）を使用して、結果を提示する。＊＊＊＊＝ログランク検定による、ｐ＜０．０００１である。（Ｂ）ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスを、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞の養子移入で処置する、ＡＣＴ免疫療法ための実験プロトコールである（Ｃｙ＝シクロホスファミド）。（Ｃ～Ｅ）（Ｃ）ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１（ｎ＝４６）、（Ｄ）ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１（ｎ＝３４）、及び（Ｅ）ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞（ｎ＝４２）についての、ＡＣＴ療法後１４日目における、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示すウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）。（Ｆ）表示のＰｍｅｌ－１ Ｔ細胞で処置された生存マウス（緑）及び死亡マウス（黒）の数を示す、対応する円グラフである（３回の実験の累積結果を示す）。（Ｇ）ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞で処置されたＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスについての、カプラン－マイヤー生存曲線である（ｎ＝４６：ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ｎ＝３４：ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、及びｎ＝４２：ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、３回の実験の累積結果を示す）。（Ｈ）ＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋ＣＤ２２６ｈｉＷＴ．Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋ＣＤ２２６ｈｉＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す、フローサイトメトリー解析である（ｎ＝６：ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、平均値±ＳＤ、実験は１回行った）。（Ｉ）ＩＦＮ－γ＋ＷＴ ＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はＩＦＮ－γ＋ＣＤ２２６ＹＣＤ８＋ＣＤ９０．１＋Ｐｍｅｌ－１腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す、フローサイトメトリー解析である（ｎ＝１０（ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１）；ｎ＝１３（ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１）、平均値±ＳＤ、２回の実験の累積結果を示す）。（Ｊ）レトロウイルスによるＣＤ２２６の過剰発現の、ＡＣＴの有効性に対する影響について評価するための実験プロトコールである。ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を単離し、レトロウイルスにより、空ベクター（ＭＯＣＫ）又はＣＤ２２６を、これらへと形質導入し、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスへと養子移入した。（Ｋ）ＡＣＴ後１４日目における、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示す、対応するウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）（ｎ＝１１：ＭＯＣＫ．Ｐｍｅｌ－１及びｎ＝１２：ＣＤ２２６．Ｐｍｅｌ－１、実験は１回行った）。統計学的解析：（Ｆ）については、フィッシャー正確検定であり、対応のないスチューデントの両側ｔ検定（Ｈ、Ｉ）であり、生存曲線については、ログランク（マンテル－コックス）検定であり；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 免疫チェックポイント遮断剤（ＩＣＢ）の有効性に対する、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）の重要性を評価する研究の結果を提示する図である。（Ａ）抗ＰＤ－１抗体を投与されたＷＴ又はＣＤ２２６ＫＯ（ＤＮＡＭ－１ＫＯ）マウスにおける、平均値腫瘍サイズである。Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウス又はＣ５７ＢＬ／６ ＤＮＡＭ－１ＫＯマウス５～６匹ずつの群に、ＭＣ３８結腸腺癌細胞（細胞１×１０５個）を、ｓ．ｃ．注入した。マウスの群に、０日目における腫瘍接種と比べた、１０、１２、１４、及び１６日目に、２５０μｇのｃＩｇ又は抗ＰＤ１（ＲＭＰ１－１４）ｍＡｂを施した。ＷＴマウスの群に、９、１０、１４、１７、２０、及び２４日目に、ｃＩｇ又は抗ＤＮＡＭ－１ ｍＡｂ（２５０μｇのｉ．ｐ．）を施した。皮下における原発腫瘍の増殖は、表示の時点において、デジタル式キャリパーを使用して測定し、平均値腫瘍サイズ＋ＳＥＭを表す。（Ｂ）ＷＴマウス、ＣＤ２２６ＫＯマウス、及びＣＤ２２６Ｙマウスの、抗ＰＤ１療法後１４日目における、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示すウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）（ｎ＝９：ＷＴ、ｎ＝９：ＣＤ２２６ＫＯ及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙであり、２回の実験を表す）。（Ｃ）対応するカプラン－マイヤー生存曲線である（ｎは、（Ｂ）と同様に、抗ＰＤ１についてのｎであり、ｃＩｇについて、ｎ＝８：ＷＴ、ｎ＝９：ＣＤ２２６ＫＯ及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙであり、２回の実験についての、代表的な結果である）。（Ｄ）表示の通りに処置された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫ＷＴマウス又はＢ１６Ｆ１０黒色腫ＣＤ２２６Ｙマウスについての、平均値腫瘍増殖曲線である（ｎ＝１０（ＷＴ＋ｃＩｇ及びＷＴ＋抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４）；ｎ＝７（ＣＤ２２６Ｙ＋ｃＩｇ）；ｎ＝８（ＣＤ２２６Ｙ＋抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す））。統計学的解析：生存曲線についてのログランク（マンテル－コックス）検定；（Ｄ）について、多重比較のための事後チューキーを伴う、二元ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 免疫チェックポイント遮断剤（ＩＣＢ）の有効性に対する、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）の重要性を評価する研究の結果を提示する図である。（Ａ）抗ＰＤ－１抗体を投与されたＷＴ又はＣＤ２２６ＫＯ（ＤＮＡＭ－１ＫＯ）マウスにおける、平均値腫瘍サイズである。Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウス又はＣ５７ＢＬ／６ ＤＮＡＭ－１ＫＯマウス５～６匹ずつの群に、ＭＣ３８結腸腺癌細胞（細胞１×１０５個）を、ｓ．ｃ．注入した。マウスの群に、０日目における腫瘍接種と比べた、１０、１２、１４、及び１６日目に、２５０μｇのｃＩｇ又は抗ＰＤ１（ＲＭＰ１－１４）ｍＡｂを施した。ＷＴマウスの群に、９、１０、１４、１７、２０、及び２４日目に、ｃＩｇ又は抗ＤＮＡＭ－１ ｍＡｂ（２５０μｇのｉ．ｐ．）を施した。皮下における原発腫瘍の増殖は、表示の時点において、デジタル式キャリパーを使用して測定し、平均値腫瘍サイズ＋ＳＥＭを表す。（Ｂ）ＷＴマウス、ＣＤ２２６ＫＯマウス、及びＣＤ２２６Ｙマウスの、抗ＰＤ１療法後１４日目における、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍の面積の、前処置と比べた変化の百分率を示すウォーターフォールプロットである（ＰＤ＝進行、ＰＲ＝部分奏効、及びＣＲ＝完全奏効）（ｎ＝９：ＷＴ、ｎ＝９：ＣＤ２２６ＫＯ及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙであり、２回の実験を表す）。（Ｃ）対応するカプラン－マイヤー生存曲線である（ｎは、（Ｂ）と同様に、抗ＰＤ１についてのｎであり、ｃＩｇについて、ｎ＝８：ＷＴ、ｎ＝９：ＣＤ２２６ＫＯ及びｎ＝８：ＣＤ２２６Ｙであり、２回の実験についての、代表的な結果である）。（Ｄ）表示の通りに処置された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫ＷＴマウス又はＢ１６Ｆ１０黒色腫ＣＤ２２６Ｙマウスについての、平均値腫瘍増殖曲線である（ｎ＝１０（ＷＴ＋ｃＩｇ及びＷＴ＋抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４）；ｎ＝７（ＣＤ２２６Ｙ＋ｃＩｇ）；ｎ＝８（ＣＤ２２６Ｙ＋抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４、平均値±ＳＥＭ、２回の実験についての、代表的な結果を示す））。統計学的解析：生存曲線についてのログランク（マンテル－コックス）検定；（Ｄ）について、多重比較のための事後チューキーを伴う、二元ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 Ｔ細胞における、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）の発現プロファイルを示す図である。（Ａ）健常ドナーＰＢＭＣから単離された休眠ＣＤ８＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の発現を、時間経過にわたり示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラム（左）、及びＣＤ２２６のＭＦＩについての、対応する定量（右、ｎ＝４：ドナー、平均値±ＳＤ、２回の独立の実験についての、代表的な結果を示す）である。（Ｂ）表示の刺激の後の、健常ドナーＰＢＭＣにおける、ＩＦＮＧ及びＧＺＭＢの相対発現を示す、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ解析である。（Ｃ）ＨＮＳＣＣ患者から単離された、ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の発現を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム（左）、及び対応する定量（右、ｎ＝１０、平均値±ＳＤ ）である。（Ｄ）ＣＤ２２６サブセットにわたり、ＩＦＮ－γ＋細胞を示す、代表的フローサイトメトリーのコンタープロット（左）、及び対応する定量（右；ｎ＝１０）である。（Ｅ）ＣＤ２２６サブセットにわたり、ＴＮＦ－α＋細胞を示す、対応するデータ（左）、及び対応する定量（右；ｎ＝１０）である。（Ｆ）ＣＤ２２６サブセットにわたり、Ｋｉ６７＋細胞を示す、対応するデータ（左）、及び対応する定量（右；ｎ＝１０）である。（Ｇ）ＣＤ２２６の遺伝子発現が高度である（上位四分位の）、ＨＮＳＣＣ患者（左）及びＳＫＣＭ患者（右）、並びにＣＤ２２６の遺伝子発現が低度である（下位四分位の）、ＨＮＳＣＣ患者（左）及びＳＫＣＭ患者（右）の生存確率を示す、カプラン－マイヤー生存曲線である。統計学的解析：多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｄ～Ｆ）であり；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）の下方調節における、ＣＤ１５５の関与を示す研究の結果を提示する図である。（Ａ）表示のＣＨＯ細胞における、ＣＤ１５５の発現を示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｂ）ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞又はＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＣＤ１５５細胞と共にインキュベートされた健常ドナーＰＢＭＣに由来する、活性化前ＣＤ８＋Ｔ細胞の、共培養の３時間後における、ＣＤ２２６の発現を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｃ）時間経過にわたる、ＣＤ２２６発現についての、対応する定量（ｎ＝３の健常ドナーＰＢＭＣについての累積結果）である。（Ｄ）表示のＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞における、ＣＤ１５５の発現を示す、代表的ヒストグラム（左）、及び健常ドナーＰＢＭＣに由来する、表示の細胞と共に、３時間にわたりインキュベートされた、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の喪失についての定量（右）である。（Ｅ）漸増量の抗ＣＤ１５５遮断抗体を用いて、ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞又はＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＣＤ１５５細胞と共にインキュベートされた、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６発現についてのフローサイトメトリー解析である（ｎ＝３の健常ドナーＰＢＭＣについての代表的結果）。（Ｆ）ＣＤ１５５の発現、及びＣＤ２２６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞による浸潤についての、黒色腫試料の評価である。（Ｇ）ＣＤ１５５を発現しない／ＣＤ１５５の発現が低度である黒色腫（ｎ＝９）、及びＣＤ１５５の発現が高度である黒色腫（ｎ＝１５）における、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋についての、対応する定量、及び全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比である（ｎ＝２４、平均値±ＳＤ）。統計学的解析：対応のないスチューデントの両側ｔ検定（Ｇ）；＊＊ｐ＜０．０１である。 ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＤＮＡＭ－１の発現と、黒色腫患者における、がん免疫療法に対する応答との相関について探索する研究についての結果を表す図である。（Ａ）ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞による浸潤、並びに応答及び生存との相関についての、ＩＣＢ前黒色腫試料の評価である。（Ｂ）上行：ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の、全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比の高値及び低値を、応答と対比させる分割表である。レスポンダーは、ＰＦＳが、＞１２カ月間である、ＣＲ及びＳＤ／ＰＲと規定し；非レスポンダーは、ＰＦＳが、＜１２カ月間である、ＰＤ及びＳＤ／ＰＲと規定した。下行：マルチプレックスＩＨＦにより決定される、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の比が、高値（＞０．０７；青）及び低値（＜０．０７；赤）である、免疫療法で処置された黒色腫患者の無進行生存を示す、カプラン－マイヤー生存曲線である（患者のｎ＝３１）。（Ｃ）上行：ＣＤ８＋Ｔ細胞カウントの高値及び低値を、応答と対比させる分割表である。応答は、（Ｂ）の通りに規定した。下行：マルチプレックスＩＨＦにより決定される、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤カウントが、高値（＞２８９；青）及び低値（＜２８９；赤）である、免疫療法で処置された黒色腫患者の無進行生存を示す、カプラン－マイヤー生存曲線である（患者のｎ＝３１）。統計学的解析：フィッシャーの正確検定（Ｂ、Ｃ）、生存曲線についてのログランク（マンテル－コックス）検定（Ｂ、Ｃ）である。 ユビキチンリガーゼＥ３ Ｃｂｌ－２が、ＤＮＡＭ－１のユビキチン化及び内部化に関与するのかどうかについて評価する研究の結果を表す図である。野生型マウス、又はユビキチンリガーゼ機能の阻害を結果としてもたらす、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子における点変異を保有するマウス（Ｃｂｌ－ｂＫＩマウス）の脾臓に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２）を含有するｃＲＰＭＩ培地における、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、又はＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１５５－Ｆｃビーズによる、１６時間にわたる刺激の後における、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）の表面発現について評価した。ヒストグラムは、ＣＤ８＋生Ｔ細胞による。
[0043]一部の図は、有色の表示又は実体を含有する。有色の図解は、依頼に応じて、出願者から、又は該当する特許庁から入手可能である。特許庁から得られる場合は、手数料が課せられる場合がある。
１．定義
[0044]そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施又は試験では、本明細書で記載される方法及び材料と同様であるか、又は同等である、任意の方法及び材料が使用されうるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的で、以下の用語が、下記に規定される。
[0045]本明細書では、冠詞である、「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語が、１つであるか、又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つである）ことを指すように使用される。例を目的として述べると、「ある要素」とは、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
[0046]本明細書で使用される「約」という用語は、当業者にたやすく知られる、それぞれの値についての、通例の誤差範囲を指す。本明細書では、「約」つきの値又はパラメータは、この値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（そして、これについて記載する）。
[0047]本明細書で使用される、「活性化」とは、感知可能な生化学的変化又は形態的変化を誘導するのに十分な、細胞表面部分のライゲーションの後における細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈では、このような活性化は、細胞の増殖を誘導するのに十分な程度に刺激された、Ｔ細胞の状態を指す。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカインの産生、及び調節的機能又は細胞溶解性エフェクター機能の行使を含む、検出可能なエフェクター機能も誘導しうる。
[0048]「活性化Ｔ細胞」という用語は、現在、細胞分裂下にあるＴ細胞、サイトカイン産生を含む、検出可能なエフェクター機能を有するＴ細胞、調節的エフェクター機能若しくは細胞溶解性エフェクター機能を果たすＴ細胞、及び／又は直前に「活性化」過程下にあったＴ細胞を意味する。
[0049]「薬剤」という用語は、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を誘導する化合物を含む。用語はまた、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性の代謝物、類似体などを含むがこれらに限定されない、本明細書で詳細に言及される化合物の、薬学的に許容できる、薬理学的有効成分も包含する。上記の用語が使用される場合、これは、活性薬剤自体のほか、薬学的に許容できる、薬理学的に活性の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝物、類似体などを含むことが理解されるものとする。「薬剤」という用語は、狭義に理解されず、低分子、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質などのタンパク質性分子のほか、これらを含む組成物、並びにＲＮＡ、ＤＮＡ、並びにこれらの模倣体及び化学的類似体などの遺伝子分子のほか、細胞薬剤へと拡張される。「薬剤」という用語は、本明細書で言及されるポリペプチドを産生及び分泌することが可能な細胞のほか、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。したがって、「薬剤」という用語は、ある範囲の細胞における、発現及び分泌のための、ウイルス又は非ウイルスベクター、発現ベクター、及びプラスミドなどのベクターを含む核酸構築へと拡張される。
[0050]ポリペプチド又はポリヌクレオチドの「量」又は「レベル」とは、試料における検出可能なレベルである。これらは、当業者に公知であり、また、本明細書でも開示される方法により測定されうる。
[0051]本明細書で使用される、「及び／又は」とは、関連する列挙項目のうちの１つ又は複数の、任意の可能な組合せ、及び全ての可能な組合せのほか、代替的に（「又は」と）解釈される場合は、組合せの欠如を指し、これらを包含する。
[0052]「アンタゴニスト」又は「阻害剤」という用語は、受容体など、別の分子の生物学的活性又は生物学的作用を防止するか、遮断するか、阻害するか、中和するか、又は低減する物質を指す。
[0053]本明細書で使用される、「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合するか、又はこれと相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合性分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互接続された、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子のほか、これらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨとして略記される場合がある）と、重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の、３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬとして略記される場合がある）と、軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変領域へと、さらに細分されうる。各ＶＨ及び各ＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲと、４つのＦＲとから構成される。本発明の異なる実施形態では、本発明の抗体（又はその抗原結合性部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞株列配列と同一である場合もあり、天然で、又は人工的に改変されている場合もある。アミノ酸のコンセンサス配列は、２つ又はこれを超えるＣＤＲについての比較対照解析に基づき、規定されうる。
[0054]抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）など、任意のクラスの抗体を含み、抗体は、特定のクラスの抗体である必要がない。重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスへと割り当てられうる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのクラスのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分けられうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する、重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスの、サブユニット構造及び三次元構成については周知である。
[0055]本明細書で使用された、「抗原」という用語、及びその文法的に同等な表現（例えば、「抗原性」）は、抗体分子又はＴ細胞受容体など、特異的な体液性免疫又は細胞性免疫の生成物が特異的に結合する化合物、組成物、又は物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、及びホルモンのほか、複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、及びタンパク質などの高分子を含む、任意の種類の分子でありうる。
[0056]「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原への結合に参与する、抗原結合性分子の領域又は部分を指す。
[0057]「抗原結合性断片」という用語は、抗原への結合に参与する、抗原結合性分子の部分を指す。これらの用語は、抗原に特異的に結合して、複合体を形成する、任意の、天然に存在するか、酵素により得られるか、合成によるか、又は遺伝子操作される、ポリペプチド又は糖タンパク質を含む。例えば、抗体の抗原結合性断片は、タンパク質分解による消化、又は抗体の可変ドメインと、任意選択で、定常ドメインとをコードするＤＮＡの操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）及び発現を伴う、組換え遺伝子操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）法のような、任意の適切な標準的技法を使用して、完全抗体分子から導出することができる。このようなＤＮＡは、公知である、及び／又は、例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーを含む）から、たやすく入手可能であるか、又は合成されうる。ＤＮＡは、シーケンシングされ、例えば、１つ若しくは複数の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを、適切な立体配置へと配置するか、又はコドンを導入するか、システイン残基を創出するか、アミノ酸を改変するか、付加するか、若しくは欠失させるなどするように、化学的に操作される場合もあり、分子生物学法を使用することにより操作される場合もある。
[0058]抗原結合性断片の非限定例は、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる、最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなど、単離相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを含む。ドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ワンアーム抗体、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、ナノボディー（例えば、一価ナノボディー、二価ナノボディーなど）、低分子モジュラー型免疫医薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインのような、他の操作分子もまた、本明細書で使用される、「抗原結合性断片」という表現の内に包含される。
[0059]抗体の抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成であることが可能であり、一般に、１つ又は複数のフレームワーク配列と隣接するか、又はこれとインフレームの位置にある、少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＨドメインを、ＶＬドメインと会合させた、抗原結合性断片では、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとは、互いに対して、任意の適切な配置に置かれうる。例えば、可変領域は、二量体であることが可能であり、ＶＨ－ＶＨ二量体を含有する場合もあり、ＶＨ－ＶＬ二量体を含有する場合もあり、ＶＬ－ＶＬ二量体を含有する場合もある。代替的に、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨドメインを含有する場合もあり、単量体ＶＬドメインを含有する場合もある。
[0060]ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインへと、共有結合的に連結された、少なくとも１つの可変ドメインを含有しうる。本発明の抗体の抗原結合性断片内で見出されうる、可変ドメイン及び定常ドメインの、非限定で例示的な構成は、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬを含む。上記で列挙された、例示的構成のうちのいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインの、任意の立体配置では、可変ドメインと、定常ドメインとは、互いと、直接連結される場合もあり、完全ヒンジ領域若しくは完全リンカー領域、又は部分的ヒンジ領域若しくは部分的リンカー領域により連結される場合もある。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する、可変ドメイン及び／又は定常ドメインの間に、可撓性の連結又は半可撓性の連結を結果としてもたらす、少なくとも２つの（例えば、５つ、１０、１５、２０、４０、６０、又はこれを超える）アミノ酸からなりうる。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いと、及び／又は１つ若しくは複数の、単量体ＶＨドメイン若しくは単量体ＶＬドメインと、非共有結合的に（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）会合した、上記で列挙された可変ドメイン／定常ドメイン構成のうちのいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含みうる。多特異的抗原結合性分子は、典型的に、各可変ドメインが、個別の抗原、又は同じ抗原における、異なるエピトープに特異的に結合することが可能である、少なくとも２つ異なる可変ドメインを含むであろう。当技術分野で利用可能な、規定の技法を使用して、任意の多特異的抗原結合性分子フォーマットが、本開示の抗体の抗原結合性断片の文脈における使用に適合させられうる。
[0061]「抗原結合性分子」とは、標的抗原に対する結合アフィニティーを有する分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、及び抗原結合活性を呈する、非免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークへと拡張されることが理解されるであろう。本発明の実施において有用な、代表的抗原結合性分子は、抗体及びそれらの抗原結合性断片を含む。「抗原結合性分子」という用語は、抗体及び抗体の抗原結合性断片を含む。
[0062]本明細書で使用される、「～に結合する」、「～に特異的に結合する」、又は「～に特異的な」という用語は、生物学的分子を含む、異種分子集団の存在下において、標的の存在を決定する、標的と抗体との結合など、測定可能で再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープでありうる）に結合するか、又はこれに特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するより大きなアフィニティーで、より大きなアビディティーで、よりたやすく、及び／又は長い持続時間を伴って結合する抗体である。一実施形態では、抗体が、非類縁標的に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される通り、抗体の、標的への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種に由来するタンパク質間で保存されている、タンパク質におけるエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含みうるが、これを要求しない。
[0063]本明細書で使用される、「バイオマーカー」という用語は、試料において検出されうる、例えば、予測的指標、診断的指標、及び／又は予後診断的指標を指す。バイオマーカーは、ある特定の分子的特徴、病理学的特徴、組織学的特徴、及び／又は臨床的特徴により特徴づけられる、特定の表現型についての指標として用いられうる。バイオマーカーは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ）、ポリヌクレオチドのコピー数の変更（例えば、ＤＮＡコピー数）、ポリペプチド、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの修飾（例えば、翻訳後修飾）、炭水化物、糖脂質ベースの分子的マーカー、並びに前述のうちのいずれかを含む細胞を含むがこれらに限定されない。
[0064]「がん」及び「がん性」という用語は、細胞増殖の調節異常により典型的に特徴づけられる、対象における生理学的状態を指すか、又はこれらについて記載する。がんの例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない。このようながんのより特定の例は、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん及び消化器間質がんを含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ又はｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、尿路がん、肝がん（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎（ｋｉｄｎｅｙ又はｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトロームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）のほか、母斑症と関連する、異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連する浮腫など）、メーグス症候群、脳がんのほか、頭頸部がん、及び関連する転移を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明の抗体による処置に適するがんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝がん、膵がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫を含む。一部の実施形態では、がんは、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、胃がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、及び肝細胞癌から選択される。さらに一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、及び乳癌から選択され、これらのがんの転移性形態を含む。
[0065]「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化合物を含む。
[0066]「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞において、細胞に、標的細胞、典型的に、がん細胞に対する特異性と、細胞内シグナル発生とをもたらす分子を指す。一部の実施形態では、ＣＡＲは、下記で規定される、刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する、機能的シグナル伝達ドメインを含む、少なくとも、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書ではまた、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む。一部の態様では、ポリペプチドのセットは、互いと連続する。
[0067]本明細書を通して、文脈によりそうでないことが必要とされない限り、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「～を含むこと」という語は、言明されるステップ若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群の包含を含意し、他の任意のステップ若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群の除外を含意しないことが理解されるであろう。したがって、「～を含むこと」という用語などの使用は、列挙される要素が、要求されるか、又は必須であるが、他の要素は、任意選択であり、又は存在しても、存在しなくてもよいことを指し示す。「～からなること」とは、「～からなること」という語句に後続するいかなるものも含むが、これらに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙される要素が、要求されるか、又は必須であり、他のいかなる要素も存在しえないことを指し示す。「～から本質的になること」とは、この語句の後に列挙される任意の要素を含むが、列挙される要素について、本開示で指定される活性又は作用に干渉又は寄与しない、他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になること」という語句は、列挙される要素が、要求されるか、又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが、列挙される要素の活性又は作用に、実質的に影響を及ぼすのかどうかに応じて、存在してもよく、存在しなくてもよいことを指し示す。
[0068]本明細書で使用される、「対応するアミノ酸残基」（又は位置）、及びこれらの文法的変化形とは、タンパク質の一次アミノ酸配列内の、アライメントされた遺伝子座において生じる残基（又は位置）を指す。関連するポリペプチド、又はバリアントのポリペプチドは、当業者公知の任意の方法によりアライメントされる。このような方法は、典型的に、マッチを最大化させ、手作業によるアライメントを使用する方法、利用可能な多数のアライメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）、及び当業者に公知の他のプログラムを使用することによる方法などの方法を含む。ポリペプチドの配列をアライメントすることにより、当業者は、ガイド鎖の通りに保存的なアミノ酸残基、及びガイド鎖と同一なアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定しうる。例えば、配列番号１に明示されたヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドの配列を、配列番号３に明示されたマウスＤＮＡＭ－１ポリペプチドの配列とアライメントすることにより、当業者は、ガイド鎖の通りに保存的なアミノ酸残基、及びガイド鎖と同一なアミノ酸残基を使用して、対応する残基、例えば、配列番号３の３１９位のＹに対応する、配列番号１の３２２位のＹを同定しうる。したがって、例えば、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンの改変を含むＤＮＡＭ－１ポリペプチドへの言及は、配列番号１に明示されたＤＮＡＭ－１ポリペプチドとアライメントされた場合に、配列番号１のアミノ酸位置３２２に対応する（すなわち、アライメントされる）アミノ酸位置に存在するチロシンの改変を有する、任意のＤＮＡＭ－１ポリペプチドへの言及を含む。
[0069]本明細書で使用された、本明細書では、「細胞溶解活性」及び「細胞傷害活性」という用語は、互換的に使用され、細胞、例えば、ＣＤ８＋細胞又はＮＫ細胞が、標的細胞を溶解させる能力を指す。このような活性は、標準的技法を使用して、例えば、標的細胞を放射性標識化することにより測定されうる。
[0070]「検出」という用語は、直接的検出及び間接的検出を含む、任意の検出手段を含む。
[0071]ＤＮＡＭ－１及びＣＤ２２６という用語は、全体を通して、互換的に使用される。
[0072]本明細書で使用される、「ＤＮＡＭ－１ポリペプチド」又は「ＣＤ２２６ポリペプチド」という用語は、天然に存在するＤＮＡＭ－１ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。この用語は、限定せずに述べると、配列番号１（ヒト）及び配列番号３（マウス）に明示された、前駆体ＤＮＡＭ－１ポリペプチドなどの、前駆体ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと、配列番号２（ヒト）及び配列番号４（マウス）に明示された、成熟ＤＮＡＭ－１ポリペプチドなどの、成熟ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（すなわち、Ｎ末端シグナル配列を欠く）とを包含する。「ＤＮＡＭ－１ポリペプチド」という用語はまた、限定せずに述べると、配列番号１又は２に明示された配列（配列番号１若しくは２の配列の全体、又は配列番号１若しくは２に明示された配列のうちの、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、若しくは３００アミノ酸を含む配列にわたり）との、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。例示的なＤＮＡＭ－１ポリペプチドはまた、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドも含む。本明細書で使用される、「改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド」とは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（例えば、配列番号１又は２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドなどの、野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド）と比べて、１つ又は複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸付加を含有するアミノ酸配列を有するＤＮＡＭ－１ポリペプチドを指す、すなわち、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ポリペプチド又は参照ポリペプチドと比べて改変されている。典型的に、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド又は参照ＤＮＡＭ－１ポリペプチド、例えば、配列番号１又は２に明示された、野生型ヒトＤＮＡＭポリペプチドに対する、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を保持する。一部の例では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１若しくは２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド、又はこれらの機能的な断片などの野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べて、１つ又は複数の改変を有する、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドである、「改変ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド」である。典型的に、改変ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１又は２に明示された配列（配列番号１若しくは２の配列の全体、又は配列番号１若しくは２に明示された配列のうちの、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、若しくは３００アミノ酸を含む配列にわたり）との、少なくとも８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む。改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドの非限定例は、配列番号１の３２２位に対応するアミノ酸位置における、Ｙ３２２Ｆ改変などのチロシンの改変を含む改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド；配列番号１の３２９位に対応するアミノ酸位置におけるＳ３２９Ａ改変など、セリンの改変を含む改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド；並びにＹ３２２Ｆ改変及びＳ３２９Ａ改変など、配列番号１の３２２位に対応するアミノ酸位置におけるチロシンの改変、及び配列番号１の３２９位に対応するアミノ酸位置におけるセリンの改変を含む改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド；ＡＰ－２モチーフにおける改変；Ｃｂｌ－ｂモチーフにおける改変；配列番号１の２９５及び／若しくは３３３位に対応する位置におけるリシンの改変；並びに／又は配列番号１の２８２位に対応する位置におけるグルタミン酸の改変、配列番号１の２８６位に対応する位置におけるロイシンの改変、及び／若しくは配列番号１の２８７位に対応する位置におけるフェニルアラニンの改変を含む。さらなる例では、本開示の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１のＩｇＧ１ドメインの全部若しくは一部、野生型ＤＮＡＭ－１のＩｇＧ２ドメインの全部若しくは一部、野生型ＤＮＡＭ－１のＩｇＧ１ドメイン及びＩｇＧ２ドメインの全部若しくは一部；及び／又は野生型ＤＮＡＭ－１の細胞内ドメインの全部若しくは一部を欠く、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドである。理解されるであろうように、本開示の目的で、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、Ｔ細胞機能を促進するか、又はこれを容易とし、特に、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが発現されるＴ細胞の抗腫瘍活性を促進するか、又はこれを容易とする能力を保持する。したがって、特定の実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドの活性は、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞の抗腫瘍活性が、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドの活性を決定するように評価される、Ｔ細胞におけるその発現の文脈で評価される。本明細書で使用される、「ＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
[0073]「有効量」とは、特定の障害の、測定可能な改善又は防止を行うのに要求される、少なくとも最小の量である。本明細書における有効量は、患者の病状、年齢、性別、及び体重、並びに抗体が、個体において所望される応答を誘発する能力などの因子に従い変動しうる。有効量はまた、処置の、治療的に有益な効果が、任意の毒性作用又は有害作用に勝る量でもある。予防的使用のために、有益な結果又は所望される結果は、疾患の生化学的症候、組織学的症候、及び／又は行動学的症候、その合併症、並びに疾患の発症時に提示される、中間的な病理学的表現型を含む、疾患の危険性を消失させるか、若しくは低減すること、疾患の重症度を軽減すること、又は疾患の発生を遅延させることなどの結果を含む。治療的使用のために、有益な結果又は所望される結果は、疾患から生じる、１つ又は複数の症候を減少させること、疾患を患う人の生活の質を増進すること、疾患を処置するのに要求される、他の薬物の用量を減少させること、ターゲティングを介するなど、別の薬物の効果を増強すること、疾患の進行を遅延させること、及び／又は生存を延長することなどの臨床結果を含む。がん又は腫瘍の場合、有効量の薬物は、がん細胞の数を低減すること；腫瘍サイズを低減すること；がん細胞の、末梢臓器への浸潤を阻害すること（すなわち、浸潤を、ある程度緩徐化させるか、又は、望ましくは、これを停止させること）；腫瘍の転移を阻害すること（すなわち、転移を、ある程度緩徐化させ、望ましくは、これを停止させること）；腫瘍増殖を、ある程度阻害すること；及び／又はがん若しくは腫瘍と関連する症候のうちの１つ若しくは複数を、ある程度緩和することにおいて、効果を及ぼしうる。感染症の場合、有効量の薬物は、循環又は組織における病原体（細菌、ウイルスなど）の力価を低減すること；病原体に感染した細胞の数を低減すること；臓器の病原体感染を阻害すること（すなわち、病原体感染を、ある程度緩徐化させるか、又は、望ましくは、これを停止させること）；病原体の増殖を阻害すること（すなわち、病原体の増殖を、ある程度緩徐化させ、望ましくは、これを停止させること）；及び／又は感染症と関連する症候のうちの１つ若しくは複数を、ある程度緩和することにおいて、効果を及ぼしうる。有効量は、１回又は複数回の投与により投与することができる。本発明の目的では、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効量は、予防的処置又は治療的処置を、直接的又は間接的に達するのに十分な量である。臨床の文脈で理解される通り、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、又は医薬組成物と共に達成できる場合もあり、達成できない場合もある。したがって、「有効量」は、１つ又は複数の治療剤を投与する文脈でも考えられる場合もあり、１つ又は複数の他の薬剤と共に、所望される結果が達成されうるか、又は達成される場合に、単一の薬剤は、有効量で施されていると考えることができる。
[0074]「Ｔ細胞機能の増強」若しくは「Ｔ細胞の機能を増強すること」、又はこれらの文法的変化形は、Ｔ細胞が、持続的生物学的機能を有するか、若しくは生物学的機能を増幅するように誘導するか、仕向けるか、若しくは刺激するか、又は枯渇させられたＴ細胞若しくは不活性Ｔ細胞を、再生するか、若しくは再活性化させることを意味する。Ｔ細胞機能の増強の例は、介入の前（例えば、組換えＤＮＡＭ－１を発現するように、Ｔ細胞を操作する前）における、このようなレベルと比べた、ＣＤ８＋ Ｔ細胞からの、ＩＦＮ－γの分泌の増大、ＴＮＦ－αの分泌の増大、ＩＬ－２の分泌の増大、増殖の増大、抗原応答性（例えば、ウイルス、病原体、又は腫瘍の除去）の増大のうちの、任意の１つ又は複数を含む。一部の実施形態では、増強のレベルは、少なくとも、５０％であり、代替的に、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、又は２００％である。この増強を測定する方式は、当業者に公知である。
[0075]遺伝子配列に関する「発現」という用語は、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を産生する、遺伝子の転写と、適切な場合は、結果として得られるｍＲＮＡ転写物の、タンパク質への翻訳とを指す。したがって、文脈から明らかとなる通り、コード配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳から生じる。逆に、非コード配列の発現は、非コード配列の転写から生じる。
[0076]「発現のレベル」又は「発現レベル」という用語は、一般に、互換的に使用される。「発現」とは、一般に、情報（例えば、遺伝子によりコードされた情報、及び／又は後成的情報）が、細胞に存在し、作動する構造へと転換される過程を指す。したがって、本明細書で使用される、「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、なお又はポリヌクレオチド及び／若しくはポリペプチドの修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を指す場合がある。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたポリペプチドの断片、又はポリヌクレオチド及び／若しくはポリペプチドの修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）もまた、それらが、代替的スプライシング又は分解転写物により生じた転写物に由来するのであれ、例えば、タンパク質分解による、ポリペプチドの翻訳後プロセシングに由来するのであれ、発現されたと考えられるものとする。「発現された遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてのポリヌクレオチドへと転写され、次いで、ポリペプチドへと翻訳される遺伝子を含むが、また、ＲＮＡへと転写されるが、ポリペプチドへは翻訳されない遺伝子（例えば、転移ＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）も含む。
[0077]「発現の増大」、「発現レベルの上昇」、又は「レベルの上昇」とは、試料における（例えば、細胞、組織、又は臓器における（ｉｎ又はｏｎ））遺伝子又はタンパク質の発現又はレベルの、対照試料と比べた増大又は上昇を指す。発現又はレベルは、対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、若しくはこれを超えて、又はおよそこれらの比率増大しうる。
[0078]「発現の低下」、「発現レベルの低下」、又は「レベルの低下」とは、試料における（例えば、細胞、組織、又は臓器における（ｉｎ又はｏｎ））遺伝子又はタンパク質の発現又はレベルの、対照試料と比べた低下又は低減を指す。発現又はレベルは、対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくはこれ未満に、又はおよそこれらの比率低下しうる。
[0079]「免疫応答」という用語は、自然免疫応答（例えば、Ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介性免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞などのＴ細胞、及び免疫系の非特異的細胞により媒介される応答）、及び体液性免疫応答（例えば、抗体の、血漿、リンパ、及び／又は組織液への発生及び分泌など、Ｂ細胞により媒介される応答）など、宿主哺乳動物の免疫系による、特定の物質（抗原又は免疫原など）に対する、任意の検出可能な応答を指す。
[0080]「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞におけるエフェクター機能（例えば、Ｔ細胞の場合、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性）を促進するシグナルを生じさせるポリペプチドの細胞内領域を指す。キメラ抗原受容体の文脈では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）、例えば、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２のシグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ドメインなど、少なくとも活性化シグナル伝達ドメイン（また、一次細胞内シグナル伝達ドメインとも称される）を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはまた、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激の一因となる分子に由来する、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、又はＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン）を含む、１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインも含む。「異種細胞内シグナル伝達ドメイン」への言及とは、正常では、問題のポリペプチド（例えば、ＤＮＡＭ－１ポリペプチド）に存在しない、すなわち、正常では、その天然状態にあるポリペプチドに存在しない細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。
[0081]本明細書で使用される場合の、「標識」という用語は、検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、典型的に、ポリヌクレオチドプローブ又は抗体などの試薬へと、直接的に又は間接的にコンジュゲートされるか又は融合され、コンジュゲートされるか又は融合された試薬の検出を容易とする。標識は、それ自体が検出可能な場合（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）もあり、酵素標識の場合は、検出可能な生成物を結果としてもたらす、基質化合物又は組成物の化学的変更を触媒しうる。
[0082]本明細書で使用される、「リンパ球」という用語は、白血球の種類である、免疫系の細胞を指す。リンパ球は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞）、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含むがこれらに限定されない。
[0083]本明細書で互換的に使用される、「患者」、「対象」、「宿主」、又は「個体」という用語は、治療又は予防が所望される、任意の対象、特に、脊椎動物対象、なおより特定すると、哺乳動物対象を指す。本発明の範囲内に収まる、適切な脊椎動物動物は、霊長動物（例えば、ヒト、サル、及び類人猿であり、マカク属（Ｍａｃａｃａ）（例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、及び／又はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）などのカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ））、及びヒヒ（チャクマヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ））のほか、マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）（マーモセット属（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）に由来する種）、リスザル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ ｍｏｎｋｅｙ）（リスザル属（Ｓａｉｍｉｒｉ）に由来する種）、及びタマリン（ｔａｍａｒｉｎ）（タマリン属（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）に由来する種）のほか、チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）（チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）などの類人猿種）などに由来するサル種を含む）、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ科動物（例えば、ウサギ、野ウサギ）、ウシ科動物（例えば、ウシ）、ヒツジ科動物（例えば、ヒツジ）、ヤギ科動物（例えば、ヤギ）、ブタ科動物（例えば、ブタ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどの愛玩鳥類など）、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、及び魚類を含む、脊索動物亜門（Ｃｈｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを含むがこれらに限定されない。好ましい対象は、がん又は感染症を伴う対象など、Ｔ細胞機能の増強を必要とするヒトである。
[0084]「医薬組成物」という用語又は「医薬製剤」とは、有効成分（複数可）の生物学的活性が効果的となることを可能とするような形態にあり、組成物又は製剤が投与される対象に対して、許容できない程度に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。このような製剤は、滅菌製剤である。「薬学的に許容できる」賦形剤（媒体、添加剤）とは、利用される有効成分の有効用量をもたらすように、対象の哺乳動物へと、妥当な形で投与されうる賦形剤である。
[0085]本明細書で使用される、「試料」という用語は、対象から抽出される場合もあり、処理されない場合もあり、処理される場合もあり、希釈される場合もあり、濃縮される場合もある、任意の生物学的検体を含む。試料は、限定せずに述べると、全血液、血清、赤血球、白血球、血漿、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、涙液、汗、皮脂、乳首吸引物、乳管洗浄液、腫瘍滲出物、滑液、腹水（ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄ、ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｆｌｕｉｄ）、羊水、脳脊髄液、リンパ、細針吸引物、羊水、他の任意の体液、細胞溶解物、細胞分泌生成物、炎症液、精液、及び膣分泌物などの体液を含みうる。試料は、組織試料及び組織生検、組織ホモジネートなどを含みうる。有利な試料は、本明細書で教示される、１つ又は複数の、任意のバイオマーカーを、検出可能量で含む試料を含みうる。試料は、対象からの試料の採取又は単離を可能とする、侵襲が最小限である方法により、たやすく得られることが適切である。ある特定の実施形態では、試料は、血液、とりわけ、末梢血、又はその画分若しくは抽出物を含有する。典型的に、試料は、リンパ球、多形核白血球、好中球、単球、網状赤血球、好塩基球、体腔細胞、血球、好酸球、巨核細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞を含む成熟白血球、未成熟白血球、又は発生白血球などの血液細胞、又はこのような細胞の画分（例えば、核酸画分又はタンパク質画分）を含む。詳細な実施形態では、試料は、Ｔ細胞を含む。
[0086]本明細書で使用される、「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「参照レベル」、「対照試料」、「対照細胞」、「対照組織」、又は「対照レベル」とは、比較の目的で使用される、試料、細胞、組織、標準物質、又はレベルを指す。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織は、同じ対象又は個体の、体内（例えば、組織又は細胞）の、健常部分及び／又は非罹患部分から得られるが、異なる時点において、例えば、治療の前及び後に得られる。別の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織は、評価される対象又は個体ではない健常個体から得られる。特定の例では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織は、免疫機能が正常であるか、若しくは効果的なＴ細胞、免疫機能が損なわれているか、若しくは有効でないＴ細胞、治療に対して応答性であるか、若しくは感受性の対象に由来するＴ細胞、又は治療に対して非応答性であるか、又は耐性である対象に由来するＴ細胞であるか、又はこれらを含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらなる例では、参照レベル又は対照レベルは、免疫機能が正常であるか、又は効果的なＴ細胞、免疫機能が損なわれているか、又は有効でないＴ細胞、治療に対して応答性であるか、又は感受性の対象に由来するＴ細胞、又は治療に対して非応答性であるか、又は耐性である対象に由来するＴ細胞など、特定の表現型を指し示すか、又は表すレベルである。なおさらなる実施形態では、参照レベル又は対照レベルは、上回るか、若しくは下回ると、免疫機能が正常であるか、又は効果的なＴ細胞、免疫機能が損なわれているか、又は有効でないＴ細胞、治療に対して応答性であるか、又は感受性の対象に由来するＴ細胞、又は治療に対して非応答性であるか、又は耐性である対象に由来するＴ細胞など、特定の表現型を指し示すか又は表す「カットオフ」を表す。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
[0087]本明細書で使用される、「配列同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウにわたり（例えば、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、又はこれを超えるヌクレオチド又はアミノ酸残基にわたり）、ヌクレオチドの一対一対応ベース、又はアミノ酸の一対一対応ベースで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたり、最適にアライメントされた、２つの配列を比較し、両方の配列において、同一な核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）、又は同一なアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で除し、結果に、１００を乗じて、配列同一性の百分率をもたらすことにより計算される。本発明の目的で、「配列同一性」とは、適切な方法により計算された「マッチ百分率」を意味するように理解されるであろう。例えば、配列同一性解析は、ソフトウェアに付随する参照用マニュアルにおいて使用される、標準デフォルトを使用する、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ；米国、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社から市販されている）を使用して実行されうる。
[0088]ハイブリダイゼーション反応の「厳密性」は、当業者により、たやすく決定可能であり、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する、経験的な計算である。一般に、長いプローブが、適正なアニーリングのために、高温を要求するのに対し、短いプローブは、低温を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、変性させたＤＮＡが、それらの溶融温度を下回る環境下において相補鎖が存在する場合に、再アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイズ可能な配列との間で所望される相同性が高度であるほど、使用されうる相対温度は高温となる。結果として、高相対温度が、反応条件をより厳密とする傾向があるのに対し、低温は、反応条件をより厳密でなくする傾向があるということになる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性の、さらなる詳細及び説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照されたい。
[0089]本明細書で規定される、「厳密な条件」又は「高度の厳密性の条件」は、（１）洗浄のために、低イオン強度及び高温、例えば、５０℃における、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを利用する条件；（２）ハイブリダイゼーション時に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、５０％の（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、４２℃における、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを伴う、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５と共に利用する条件；又は（３）０．２倍濃度のＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）における、４２℃で、１０分間にわたる洗浄に続く、５５℃における、ＥＤＴＡを含有する、０．１倍濃度のＳＳＣからなる、１０分間にわたる、高厳密性の洗浄を伴う、４２℃において、５０％のホルムアミド、５倍濃度のＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５倍濃度のデンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを利用する溶液における、一晩にわたるハイブリダイゼーション条件により同定されうる。
[0090]本明細書で使用される、「処置」という用語は、臨床病態の経過において、処置される個体又は細胞の天然の経過を変更するために設計された、臨床的介入を指す。処置の所望の効果は、疾患の進行速度の減少、病状の改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）又は緩和、及び寛解又は予後の改善（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）を含む。例えば、がん性細胞の増殖を低減すること（又はがん性細胞を破壊すること）、がんから生じる症候を減少させること、がんを患う人の生活の質を増進すること、がんを処置するのに要求される、他の薬物若しくは治療の用量を減少させること、及び／又は個体の生存を延長することを含むがこれらに限定されない、がんと関連する、１つ又は複数の症候を、和らげるか、又は消失させる場合、個体は、「処置」に成功しうる。感染症の処置の文脈では、対象における感染性微生物の数を低減すること、感染症から生じる症候を軽減すること、及び／又は個体の生存を延長することを含むがこれらに限定されない、感染症と関連する、１つ又は複数の症候を、和らげるか、又は消失させる場合、個体は、「処置」に成功しうる。
[0091]本明細書で使用される、「腫瘍」とは、全ての新生物性細胞増殖、及び悪性であれ、良性であれ、全ての増殖、並びに全ての前がん性細胞及び前がん性組織、並びにがん性細胞及びがん性組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、「過剰増殖性障害」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される通り、相互に除外的ではない。
Figure 2022521541000001
Figure 2022521541000002
[0092]本明細書で記載される各実施形態は、そうでないことが特別に言明されない限り、変更すべき点は変更して、各実施形態及びあらゆる実施形態に適用される。
２．機能が増強されたＴ細胞
[0093]本開示は、ＤＮＡＭ－１（また、ＣＤ２２６とも称される）が、腫瘍環境におけるＴ細胞の免疫機能に不可欠であることの決定に部分的に基づく。したがって、改変ＤＮＡＭ－１を含む、組換えＤＮＡＭ－１など、細胞表面において、ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞が提示される。また、本開示に従い、Ｔ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の発現を利用して、Ｔ細胞の活性化の増大を含み、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）機能を増強する方法も提示される。したがって、本開示のＴ細胞及び方法は、特に、養子細胞移入免疫療法の一部としての、がんの処置において有用である。本開示のＴ細胞及び方法はまた、感染症の処置においても有用である。例えば、本開示のＴ細胞は、慢性感染症を伴う対象へと、養子移入される場合があり、この場合、内因性Ｔ細胞は、枯渇させられうる。表面においてＤＮＡＭ－１を発現する本開示のＴ細胞は、例えば、表面においてＤＮＡＭ－１を発現しないＴ細胞と比較した活性化の増強（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、又はＴＮＦの発現により測定される）、増殖の増強（例えば、Ｋｉ６７の発現により測定される）、細胞溶解活性の増強、及び／又は抗腫瘍活性の増強を呈しうる。任意の１つ又は複数のＴ細胞の免疫機能は、表面においてＤＮＡＭ－１を発現しないＴ細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、若しくはこれを超えて、又はおよそこれらの比率増大させられうる。
２．１ ＤＮＡＭ－１
[0094]ＤＮＡＭ－１は、まず、Ｔ細胞の細胞傷害性特性に関与する接着分子として記載された（Ｓｈｉｂｕｙａら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４（６）：５７３～５８１）。ＤＮＡＭ－１は、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、血小板、並びに単球により、主に発現され、そのリガンドは、ＡＰＣ、形質転換細胞、及びウイルス感染細胞を含む、広範にわたる細胞において発現されるＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体）、及びＣＤ１１２（ネクチン２）である。ＤＮＡＭ－１は、複数の細胞過程に関与していると思われる：ＤＮＡＭ－１は、免疫細胞の遊出において重要であり、免疫学的シナプスの安定性に関連しており、重要なＮＫ細胞活性化受容体であり、ＣＤ４ Ｔ細胞に対する共受容体であると考えられている。したがって、ＤＮＡＭ－１欠損マウスは、ＧＶＨＤに対してはよく保護されるが、発癌物質誘導性腫瘍形成を受けやすい（例えば、Ｎａｂｅｋｕｒａら、２０１０、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、１０７（４３）：１８５９３～１８５９８；Ｉｇｕｃｈｉ－Ｍａｎａｋａら、２００８、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、２０５（１３）：２９５９～２９６４を参照されたい）。
[0095]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１は、３１８アミノ酸の成熟ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（配列番号２に明示されている）をもたらすように、１８アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドの除去によりプロセシングされる、３３６アミノ酸のポリペプチド（配列番号１に明示されている）である。シグナルペプチドに加えて、前駆体ＤＮＡＭ－１は、２３０アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸位置１９～２４８）、２８アミノ酸の膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸位置２４９～２７６）、及び６０アミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸位置２７７～３３６）を含む。ＤＮＡＭ－１は、Ｉｇスーパーファミリーの一部であるが、その構造において固有である。例えば、ＤＮＡＭ－１の細胞質ドメインは、他のＩｇスーパーファミリーメンバーと、ほとんど、又は全く、相同性を共有しない。
[0096]ＤＮＡＭ－１は、ＣＤ１５５へのその結合に重要な、２つ細胞外ドメイン：ＩｇＧ１ドメイン（配列番号１のアミノ酸残基１９～１２６にほぼ対応する）、及びＩｇＧ２ドメイン（配列番号１のアミノ酸残基１３５～２３９にほぼ対応する）を有する。ＤＮＡＭ－１はまた、細胞内シグナル伝達のための免疫グロブリンチロシンテール（ＩＴＴ）モチーフ（ＹＶＮＹ）（Ｚｈａｎｇら、２０１５、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、２１２（１２）：２１６５～２１８２）も含有する。ＤＮＡＭ－１は、各々が、いくつかの機能と関連する、３つのリン酸化部位：Ｙ３２２（ＩＴＴモチーフに存在する）、Ｙ３２５（ＤＮＡＭ－１の発現の調節に関与している可能性がある）、及びＳ３２９を有する。Ｙ３２２を介するシグナル伝達が、ＮＫ細胞の活性化に絶対的に要求されることは示されているが、Ｔ細胞におけるＤＮＡＭ－１シグナル伝達の役割は明らかになっていない。
[0097]例示的な野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型前駆体ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（配列番号１に明示された、ヒト野生型前駆体ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと、配列番号３に明示された、マウス野生型前駆体ＤＮＡＭ－１ポリペプチドとを含む）と、野生型成熟ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（配列番号２に明示された、ヒト野生型成熟ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと、配列番号４に明示された、マウス野生型成熟ＤＮＡＭ－１ポリペプチドとを含む）とを含む。
[0098]代表的な前駆体野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、以下の配列（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ｙ３２２、Ｙ３２５、及びＳ３２９である）：
Figure 2022521541000003
を有する。
[0099]代表的な成熟野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、以下の配列：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV（配列番号２）
を有する。
[00100]代表的な前駆体野生型マウスＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、以下の配列（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ｙ３１９、Ｙ３２２、及びＳ３２６である）：
Figure 2022521541000004
を有する。
[00101]代表的な成熟野生型マウスＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、以下の配列：
EETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL（配列番号４）
を有する。
[00102]一部の実施形態では、本開示のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、Ｔ細胞表面保持の、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較した増大を呈しうる。このようなＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べて、１つ又は複数の改変（すなわち、それらは、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドである）を含み、１つ又は複数の改変は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の表面で発現された場合の、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドの細胞表面保持の増大（又は内部化の減少）を付与する。典型的に、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１又は２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドなどの野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと、１００％未満同一であるように野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べて、１つ又は複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、挿入、又は置換）を含む。一部の例では、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１又は２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドなどの野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドに対する、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を保持する。例えば、本開示の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１若しくは２に明示された配列、又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を有する配列を含みうるが、下記に記載される、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の表面で発現された場合の、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドの細胞表面保持の増大（又は内部化の減少）を付与する、少なくとも１つのアミノ酸改変をさらに含む。特定の例では、したがって、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、下記に記載される改変のうちの少なくとも１つと、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド、例えば、配列番号１又は２に明示された、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド配列に対する、最大で、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、又は９８％の配列同一性を有する配列とを含む。
[00103]本明細書で提示される、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドの例は、Ｔ細胞表面保持を、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較して増大させ、Ｔ細胞機能の増強を容易とする、配列番号１の３２２位に対応するアミノ酸位置におけるチロシンの改変を含む改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドである。したがって、本開示のＴ細胞における発現のための、例示的なＤＮＡＭ－１ポリペプチドはまた、配列番号１の３２２位に対応するアミノ酸位置におけるチロシンの改変を含むＤＮＡＭ－１も含む。このようなＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、３２２位における残基のリン酸化を介する、シグナル伝達の、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較した低減（消失を含む）を呈しうる。配列番号１の３２２位に対応するアミノ酸位置における、チロシンの改変は、例えば、アミノ酸欠失、又は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、若しくはバリンによる置換など、任意のアミノ酸置換でありうる。特定の例では、アミノ酸置換は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンによる置換である。一実施形態では、置換は、フェニルアラニン（例えば、配列番号５及び６に明示された置換などのＹ３２２Ｆ）又はアラニン（例えば、Ｙ３２２Ａ）による置換である。
[00104]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ Ｙ３２２Ｆ（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ｆ３２２である）：
Figure 2022521541000005
[00105]成熟ヒトＤＮＡＭ－１ Ｙ３２２Ｆ：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIFVNYPTFSRRPKTRV（配列番号６）
[00106]さらなる例では、表面保持の増大は、ＤＮＡＭ－１の内部化が、阻害又は低減されるように、内部化に関与するアミノ酸残基又はモチーフをターゲティングすることにより達成されうる。ＤＮＡＭ－１など、受容体のシグナル伝達及び機能は、エンドサイトーシスによる内部化を介する、受容体の、細胞表面からの除去により調節されうる。この原理は、受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ）、Ｇタンパク質共役受容体について示されているが、また、免疫関連受容体、例えば、（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＴＬＡ－４など）についても示されている。多数の異なる機構及びエンドサイトーシス経路が存在するが、より重要な経路のうちの２つは、クラスリン媒介型エンドサイトーシス（ＣＭＥ）及びユビキチン化である。ＣＭＥは、通例、アダプタータンパク質ＡＰ－２の、表面受容体の細胞質テールにおけるモチーフへの結合により媒介される。ＡＰ－２を介するＣＭＥは、しばしば、受容体のリサイクリング及び表面での再発現と関連する。逆に、受容体のポリユビキチン化は、内部化及び後続の分解をもたらす。したがって、本明細書では、ＡＰ－２結合性モチーフ、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合性（Ｃｂｌ－ｂ）モチーフ、及び／又はユビキチン化部位をターゲティングする（すなわち、これを消失させる）、１つ又は複数の改変を含む改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが提示される。
[00107]ＤＮＡＭ－１は、その細胞質テールの、配列番号１に明示された前駆体ＤＮＡＭ－１の３２５～３２８位（残基ＹＰＴＦ）に対応するアミノ酸位置に、ＡＰ－２結合性モチーフである、ＹＸＸＦを有する。したがって、他の例示的な、本開示のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、ＡＰ－２を介する、ＤＮＡＭ－１のＣＭＥが、低減されるか、又は消失させられ、これにより、ＤＮＡＭ－１の細胞表面保持を増大させるように、ＹＸＸＦであるＡＰ－２モチーフが改変された、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含む。理解されるであろうように、ＡＰ－２モチーフは、それぞれ、配列番号１の３２５～３２８位に対応する位置における、残基Ｙ、Ｐ、Ｔ、Ｆのうちの、任意の１つ又は複数のアミノ酸欠失；配列番号１の３２５位に対応する位置における、チロシンのアミノ酸置換、及び／若しくは配列番号１の３２８位に対応する位置における、フェニルアラニンのアミノ酸置換；並びに／又は配列番号１の３２５、３２６、又は３２７位に対応する位置のうちのいずれか１つの後におけるアミノ酸挿入を含む、多数の改変のうちのいずれかにより消失させられうる。したがって、例示的なＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２５位に対応する位置における、チロシンの改変、及び／又は配列番号１の３２８位に対応する位置における、フェニルアラニンの改変を有する、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含む。改変は、ＹＸＸＦモチーフの消失を結果としてもたらす、任意の改変（例えば、欠失及び／又は置換）でありうる。特定の例では、改変は、３２５位におけるチロシンの、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、若しくはバリンによる置換；及び／又は３２８位におけるフェニルアラニンの、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、チロシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、若しくはバリンによる置換などの置換である。非限定例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、３２５位におけるチロシンの、アラニンによる置換、及び３２８位におけるフェニルアラニンの、アラニンによる置換を含む。
[00108]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ Ｙ３２５Ａ／Ｆ３２８Ａ（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ａ３２５及びＡ３２８である）：
Figure 2022521541000006
[00109]成熟ヒトＤＮＡＭ－１ Ｙ３２５Ａ／Ｆ３２８Ａ：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNAPTASRRPKTRV（配列番号２２）
[00110]ヒトＤＮＡＭ－１は、ＡＰ－２のアルファ２／シグマ２サブユニット（ａ２／ｓ２半複合体）をターゲティングする、第２のＡＰ－２結合性モチーフである、ＥＸＸＸＬＦを有する。このモチーフは、野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドの、配列番号１の２８２～２８７位（残基ＥＲＲＤＬＦ）に対応するアミノ酸位置に存在する。したがって、他の例示的な、本開示のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、ＡＰ－２を介する、ＤＮＡＭ－１のＣＭＥが、低減されるか、又は消失させられ、これにより、ＤＮＡＭ－１の細胞表面保持を増大させるように、ＥＸＸＸＬＦであるＡＰ－２モチーフが改変された、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含む。理解されるであろうように、ＥＸＸＸＬＦである、ＡＰ－２モチーフは、それぞれ、配列番号１の２８２～２８７位に対応する位置における、残基Ｅ、Ｒ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、又はＦのうちの、任意の１つ又は複数のアミノ酸欠失；配列番号１に明示された、ヒト前駆体ＤＮＡＭ－１の２８２位における、グルタミン酸のアミノ酸置換、２８６位における、ロイシンのアミノ酸置換、及び／若しくは２８７位における、フェニルアラニンのアミノ酸置換；並びに／又はそれぞれ、配列番号１の２８２～２８６位に対応する位置における残基の後におけるアミノ酸残基の挿入を含む、多数の改変のうちのいずれかにより消失させられうる。特定の例では、改変は、２８２位におけるグルタミン酸の、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、チロシン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、若しくはバリンによる置換；２８６位におけるロイシンの、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、フェニルアラニン、リシン、メチオニン、チロシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、若しくはバリンによる置換；及び／又は２８７位におけるフェニルアラニンの、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、チロシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、若しくはバリンによる置換などの置換である。非限定例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、２８２位におけるグルタミン酸の、アラニンによる置換、２８６位におけるロイシンの、アラニンによる置換、及び２８７位におけるフェニルアラニンの、アラニンによる置換を含む。
[00111]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ Ｅ２８２Ａ／Ｌ２８６Ａ／Ｆ２８７Ａ（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ａ２８２、Ａ２８６、及びＡ２８７である）：
Figure 2022521541000007
[00112]成熟ヒトＤＮＡＭ－１ Ｅ２８２Ａ／Ｌ２８６Ａ／Ｆ２８７Ａ：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRARRDAATESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNAPTASRRPKTRV（配列番号２４）
[00113]ヒトＤＮＡＭ－１はまた、配列番号１に明示された前駆体ＤＮＡＭ－１の３２０～３２２位に対応する位置において、Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＣｂｌ－ｂに対する結合性モチーフ（（Ｄ／Ｎ）ＸｐＹ）も有する。本明細書で裏付けられる通り、Ｃｂｌ－ｂは、ＣＤ１５５媒介性ＤＮＡＭ－１下方調節に関与し、この場合、Ｃｂｌ－ｂ機能の阻害は、ＤＮＡＭ－１の細胞表面保持を結果としてもたらす。したがって、本明細書では、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べて、１つ又は複数の改変を含む、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが提示され、この場合、改変は、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、細胞表面保持の、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較した増大を呈するように、Ｃｂｌ－ｂ（Ｄ／Ｎ）ＸｐＹ結合性モチーフ及び／又はＣｂｌ－ｂユビキチン化部位をターゲティングする。Ｃｂｌ－ｂの結合は、Ｙ３２２のリン酸化を要求し、このリン酸化部位の非存在は、ＤＮＡＭ－１の内部化及び分解（ヒトＤＮＡＭ－１のＹ３２２のターゲティングが、ＤＮＡＭ－１の細胞表面保持の増大を結果としてもたらすことの、本明細書における裏付けと符合する）を防止しうる。他の例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、Ｃｂｌ－ｂ結合性モチーフを消失させるように、配列番号１の３２０位に対応する位置におけるアスパラギン酸、又は配列番号１の３２１位に対応する位置におけるアミノ酸残基のうちの、任意の１つ又は複数の後において、アミノ酸挿入を含む。さらなる例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２０位に対応する位置におけるアスパラギン酸のアミノ酸欠失又はアミノ酸置換（例えば、アラニン、リシン、システイン、グルタミン、チロシン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン酸、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はバリンによる置換）を含む。ユビキチン化は、リシン（Ｋ）残基において生じる。その帰結として、これらのユビキチン化部位を消失させる、２９５及び／又は３３３位（配列番号１と比べた番号付けによる）におけるリシンの改変もまた、ＤＮＡＭ－１の内部化及び分解の減少をもたらし、このために、ＤＮＡＭ－１の表面発現の保持をもたらすことが予測される。したがって、Ｔ細胞における発現に適する、さらなる本開示のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１に明示された、ヒト前駆体ＤＮＡＭ－１の、配列番号１の２９５位に対応する位置におけるリシン、及び／又は配列番号１の３３３位に対応する位置におけるリシンの改変（例えば、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、及び／又はアミノ酸置換）を有するＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含む。特定の例では、改変は、置換、すなわち、２９５位におけるリシンの、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、チロシン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン酸、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はバリンによる置換；３３３位におけるリシンの、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニン、チロシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はバリンによる置換である。非限定例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、２９５位におけるリシンの、アラニンによる置換、及び／又は３３３位におけるリシンの、アラニンによる置換を含む。
[00114]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ Ｋ２９５Ａ（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ａ２９５である）：
Figure 2022521541000008
[00115]成熟ヒトＤＮＡＭ－１ Ｋ２９５Ａ：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQAAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV（配列番号２６）
[00116]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ Ｋ３３３Ａ（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ａ３３３である）：
Figure 2022521541000009
[00117]成熟ヒトＤＮＡＭ－１ Ｋ３３３Ａ：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPATRV（配列番号２８）
[00118]前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ Ｋ２９５Ａ／Ｋ３３３Ａ（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とし；下線を付された残基は、Ａ２９５及びＡ３３３である）：
Figure 2022521541000010
[00119]成熟ヒトＤＮＡＭ－１ Ｋ２９５Ａ／Ｋ３３３Ａ：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQAAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPATRV（配列番号３０）
[00120]Ｔ細胞における発現に適する、他の例示的なＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２９位に対応するアミノ酸位置におけるセリンの改変を含むＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含む。このようなＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、３２９位における残基のリン酸化を介する、シグナル伝達の、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較した低減（消失を含む）を呈しうる。配列番号１の３２９位に対応するアミノ酸位置における、セリンの改変は、例えば、アミノ酸欠失、又は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、若しくはバリンによる置換など、任意のアミノ酸置換でありうる。特定の例では、アミノ酸置換は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンによる置換である。さらなる例示的なポリペプチドは、配列番号１の３２２位に対応するアミノ酸位置における、チロシンの改変；及び配列番号１の３２９位に対応するアミノ酸位置における、セリンの改変を含むポリペプチドを含む。
[00121]Ｔ細胞における発現のためのＤＮＡＭ－１ポリペプチドはまた、例えば、配列番号１のアミノ酸残基２７７～３３６に対応する細胞質（又は細胞内）ドメインの全部又は一部を欠くＤＮＡＭ－１ポリペプチドも含む。このドメインは、配列番号１の３２２～３２９位に対応する位置において、チロシン残基及びセリン残基を含有する。したがって、このドメインの全部又は一部を欠き、特に、配列番号１の残基３２２～３２９に対応する残基を含む一部を欠くＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、シグナル伝達の低減（消失を含む）を呈することが可能であり、Ｔ細胞機能の増強を容易としうる。
[00122]細胞質ドメインを欠く前駆体ヒトＤＮＡＭ－１（Ｎ末端シグナルペプチドは、太字とする）：
Figure 2022521541000011
[00123]細胞質ドメインを欠く成熟ヒトＤＮＡＭ－１：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLN（配列番号８）
[00124]したがって、一部の実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、例えば、アミノ酸残基１９～２４８に対応するが、任意選択で、細胞質ドメインの全部又は一部を欠く、細胞外ドメインの全部又は一部を含む。細胞外ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸残基１９～１２６のあたりに対応するＩｇＧ１ドメインの全部又は一部、及び／又は、例えば、配列番号１のアミノ酸残基１３５～２３９のあたりに対応するＩｇＧ２ドメインの全部又は一部を含みうる。
[00125]ヒトＤＮＡＭ－１細胞外ドメイン：
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQ（配列番号９）
[00126]他の例示的なＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸残基１９～１２６のあたりに対応するＩｇＧ１ドメインの全部又は一部、及び／又は、例えば、配列番号１のアミノ酸残基１３５～２３９のあたりに対応するＩｇＧ２ドメインの全部又は一部を欠くＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含みうる。
[00127]例えば、配列番号１のアミノ酸位置２４９～２７６に対応する膜貫通ドメインの全部又は一部を欠くＤＮＡＭ－１ポリペプチドもまた、想定される。しかし、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、Ｔ細胞の表面において発現され、分泌されないことを確保するために、内因性ＤＮＡＭ－１膜貫通ドメインを欠くＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、外因性膜貫通ドメインを含むことが理解されるはずである。当技術分野では、様々な膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する膜貫通ドメインが公知であり、ＤＮＡＭ－１細胞外ドメインの全部又は一部へと連結されうる。例示的な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体である、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４の、アルファ、ベータ、又はゼータ鎖の、膜貫通領域（複数可）に由来する膜貫通ドメインを含むがこれらに限定されない。
[00128]ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、２３０、又は３３０アミノ酸の長さであるか、又はおよそこれらの長さでありうる。一部の例では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、それらが、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと同じ配列を有さない（すなわち、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドに対する配列同一性が、１００％未満である）という条件下で、配列番号５～９又は２１～３０のうちのいずれか１つに明示されたポリペプチドと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を有する。本開示の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、例えば、配列番号１又は２に明示された野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド、野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドなどの野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べて、改変（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入）を有する。その帰結として、本明細書における、任意の改変に対する言及は、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比べた改変に対する言及である。例えば、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、特定の位置において、アミノ酸置換を有すると言われる場合、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドのこの位置に存在する、内因性アミノ酸残基を含まない、すなわち、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドのこの位置に存在するアミノ酸残基を除き、この位置における任意のアミノ酸残基を含むことが理解される。例えば、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンのアミノ酸置換を含む、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号１の３２２位に対応する位置において、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、又はバリンを含む、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドである。
[00129]理解されるであろうように、本開示のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、Ｔ細胞機能を促進するか、又はこれを容易とする能力を保持し、特に、本開示のＤＮＡＭ－１ポリペプチドが発現されるＴ細胞の抗腫瘍活性を促進するか、又はこれを容易とする能力を保持する、すなわち、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを発現するＴ細胞は、典型的に、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド（例えば、野生型ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチド）を発現するＴ細胞と少なくとも同じ免疫機能を有し、より典型的には、これより増大した免疫機能を有する。当技術分野では、ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞ポリペプチドの免疫機能を評価するための方法が公知であり、下記で記載される。
[00130]配列番号１～９のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列、或いはこれに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を有するポリペプチドを含むＤＮＡＭ－１ポリペプチドをコードするＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチドなど、本明細書の上記及び別の箇所で記載されている、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドをコードするＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチドもまた、提供される。配列番号１の前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドをコードする、例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１０に明示される。
[00131]配列番号１の前駆体ヒトＤＮＡＭ－１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（太字のヌクレオチド［ヌクレオチド１～５４］は、シグナル配列をコードする）：
Figure 2022521541000012
２．２ 細胞表面ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞
[00132]本明細書では、細胞の表面においてＤＮＡＭ－１を発現する単離Ｔ細胞を含むＴ細胞が提示される。このような細胞は、特に、対象における免疫機能（Ｔ細胞機能を含む）を増強し、対象におけるがんを処置し、対象における感染症を処置するために有用である。ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の場合もある、及び／又はγδ Ｔ細胞又はαβ Ｔ細胞の場合もある。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
[00133]Ｔ細胞は、本明細書で記載される改変ＤＮＡＭ－１など、野生型ＤＮＡＭ－１又はそのバリアントを含む組換えＤＮＡＭ－１を発現しうる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、組換えＤＮＡＭ－１を発現せず、表面において、内因性ＤＮＡＭ－１を発現するだけである。したがって、本開示は、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）のためのＴ細胞集団を調製するための方法であって、組換えＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞集団を作製するように、Ｔ細胞へと、ＤＮＡＭ－１をコードするポリヌクレオチドを導入するステップを含むか、又はＴ細胞の試料を、対象から得るステップと、ＤＮＡＭ－１陽性（ＤＮＡＭ－１＋）Ｔ細胞（すなわち、細胞の表面上でＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞）を、試料から選択するステップとを含む方法を提示する。
２．２．１ 組換えＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞
[00134]本明細書では、組換えＤＮＡＭ－１及び／又は改変ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞が提示される。したがって、このようなＴ細胞は、内因性ＤＮＡＭ－１だけを発現するＴ細胞と比較して、表面ＤＮＡＭ－１のレベルを上昇させている。したがって、組換えＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞は、Ｔ細胞機能の、組換えＤＮＡＭ－１を発現しないＴ細胞（すなわち、内因性ＤＮＡＭ－１だけを発現するＴ細胞）と比較した増強を呈しうる。したがって、本開示はまた、Ｔ細胞において、組換えＤＮＡＭ－１を発現するように、ＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することにより、Ｔ細胞の機能を増強するための方法も提示する。典型的に、組換えＤＮＡＭ－１は、Ｔ細胞の表面において発現される。
[00135]Ｔ細胞において発現される組換えＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、上記で記載された、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチド又はそのバリアント、すなわち、上記で記載された、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドでありうる。本明細書で記載される、任意のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、Ｔ細胞において、組換えにより発現されうる。
[00136]組換えＤＮＡＭ－１（改変ＤＮＡＭ－１を含む）を発現するＴ細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞を作出するための、当技術分野で周知の方法を使用して作製されうる。一般に、ＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチドは、多数の遺伝子移入法のうちのいずれか１つを使用して、Ｔ細胞へと導入される。これらは、ウイルスベクターによる遺伝子移入技術、及びトランスポゾン、ｍＲＮＡ、リポソーム、又はネイキッドＤＮＡの電気穿孔若しくはトランスフェクションを利用する非ウイルス的移入法などの非ウイルス的移入法を含むがこれらに限定されない。ＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチドの、Ｔ細胞への導入のための、例示的なウイルスベクターは、限定せずに述べると、レトロウイルス（レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、及びアルファレトロウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、マラミクソウイルス（例えば、センダイウイルス）、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）、及びトガウイルスベクターを含む。
[00137]当技術分野では、レトロウイルスベクターが周知であり、例えば、後続のＴ細胞への導入のための、Ｂ、Ｃ、及びＤ型レトロウイルス、異種指向性レトロウイルス（例えば、ＮＺＢ－Ｘ１、ＮＺＢ－Ｘ２、及びＮＺＢ９－１）、ポリトロープ性レトロウイルス、例えば、ＭＣＦ及びＭＣＦ－ＭＬＶ、スピューマウイルス、並びにレンチウイルスに由来するベクターを含む。レトロウイルスベクターの構築のための、例示的なレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細胞内皮症ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスを含む。一部の例では、レトロウイルスベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来する。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し、ｔＲＮＡ結合性部位は、ラウス肉腫ウイルスに由来し、パッケージングシグナルは、マウス白血病ウイルスに由来し、第２鎖の合成起点は、トリ白血病ウイルスに由来しうる。
[00138]組換えレトロウイルスベクターは、それらを適切なパッケージング細胞株へと導入することにより、形質導入コンピテントのレトロウイルスベクター粒子を作出するのに使用されうる。好ましくは、組換えウイルスベクターは、複製欠損組換えウイルスである。当技術分野では、上記で記載されたレトロウイルスベクターを伴う使用に適するパッケージング細胞株が周知であり、たやすく調製され（例えば、国際公開第１９９５／３０７６３号及び国際公開第１９９２／０５２６６号を参照されたい）、組換えベクター粒子の産生のための産生細胞株（また、ベクター細胞株又は「ＶＣＬ」とも称する）を創出するのに使用されうる。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）、又はミンク親細胞株から作られ、これにより、ヒト血清における不活性化が起きなくなる。多数の例示的なレトロウイルス系について記載されており、本明細書でも利用されうる（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；同第６，２０７，４５３号；同第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｓｍａｎ、１９８９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７：９８０～９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、１９９０、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５～１４；Ｓｃａｒｐａら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８０：８４９～８５２；Ｂｕｒｎｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：８０３３～８０３７；並びにＢｏｒｉｓ－Ｌａｗｒｉｅ及びＴｅｍｉｎ、１９９３、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、３：１０２～１０９）。特定の例では、レンチウイルスベクターが使用される。当技術分野では、レンチウイルスベースの遺伝子移入のための、例示的な方法及びベクターが公知であり、例えば、Ｗａｎｇら、２０１２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９～７０１；Ｃｏｏｐｅｒら、２００３、Ｂｌｏｏｄ．１０１：１６３７～１６４４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、５０６：９７～１１４；及びＣａｖａｌｉｅｒｉら、２００３、Ｂｌｏｏｄ．、１０２（２）：４９７～５０５において記載されている。
[00139]他の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、電気穿孔（例えば、Ｃｈｉｃａｙｂａｍら、２０１３、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（３）：ｅ６０２９８、及びＶａｎ Ｔｅｄｅｌｏｏら ２０００、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７（１６）：１４３１～１４３７を参照されたい）を介して、Ｔ細胞へと導入され、任意選択で、インサートをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（Ｒｏｔｈら、２０１８、Ｎａｔｕｒｅ、５５９：４０５～４０９）により導入される。一部の実施形態では、組換え核酸は、転位（例えば、Ｍａｎｕｒｉら、２０１０、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２１（４）：４２７～４３７；Ｓｈａｒｍａら、２０１３、Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ、２、ｅ７４；及びＨｕａｎｇら、２００９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５０６：１１５～１２６を参照されたい）を介して、Ｔ細胞へと導入される。遺伝子素材を、免疫細胞に導入し、発現させる、他の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．、Ｎ．Ｙ．において記載されている）、プロトプラスト融合、カチオンリポソーム媒介性トランスフェクション、タングステン粒子促進型パーティクルガン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：７７６～７７７）、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈降（Ｂｒａｓｈら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７：２０３１～２０３４）を含む。
[00140]理解される通り、ＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチドは、一般に、Ｔ細胞における、後続の導入及び発現のために、プロモーターに作動可能に連結される。さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節するものであり、これらもまた、利用されうる。哺乳動物細胞におけるトランス遺伝子発現における使用のための、プロモーター及びエンハンサーは、当技術分野で周知であり、任意のこのようなプロモーターは、Ｔ細胞において、ＤＮＡＭ－１を発現させるのに使用されうる。Ｔ細胞におけるポリヌクレオチドの発現のための、例示的なプロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ１ａ、ユビキチンＣ、又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドにおいて広範に使用されており、ベクターへとクローニングされた核酸分子からの発現を駆動するのに効果的であることが示されている。プロモーターの別の例は、即初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、これに作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能な、強力な構成的プロモーター配列である。サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用されうる。
[00141]ベクターはまた、例えば、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えば、ウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来する）、エピソームにおける複製、及び原核生物における複製を可能とするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点及びＣｏｌ Ｅｌ、又は当技術分野で公知の他のエレメント）、及び／又は選択を可能とするエレメント（例えば、アンピシリン耐性遺伝子及び／又はゼオシンマーカー）も含みうる。
２．２．２ Ｔ細胞の調達及び調製
[00142]本開示のＴ細胞を作製するために、細胞は、当技術分野で周知の方法を使用して、典型的に、対象（例えば、ヒト対象又は非ヒト動物対象、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、チンパンジーなど）に由来する生物学的試料から得られるか、又は導出される。一部の例では、細胞は、細胞療法を施される対象、又はこのような対象に由来する試料から単離される、及び／又は他の形で調製される、すなわち、細胞は、自家細胞である。他の例では、細胞は、細胞療法を施される予定の対象、又は細胞療法を最終的に施される対象以外の対象から単離される、及び／又は他の形で調製される、すなわち、細胞は、同種細胞又は異種細胞である。典型的に、細胞は、生物学的試料から作出されたＴ細胞株に由来するＴ細胞もまた想定されるが、初代Ｔ細胞である。
[00143]細胞が得られる試料は、例えば、組織、体液、及び対象から直接的に採取される、他の試料のほか、分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、及び／若しくはインキュベーションなど、１つ又は複数の処理ステップから得られる試料を含む。例示的な試料は、全血液、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍組織、並びに／又はこれらに由来する細胞を含む。一部の態様では、細胞が導出又は単離される試料は、血液若しくは血液由来試料であるか、又はアフェレーシス生成物若しくはリューカフェレーシス生成物であるか、若しくはこれらに由来する。
[00144]Ｔ細胞の単離は、１つ又は複数の、調製ステップ及び／又は非アフィニティーベースの細胞分離ステップを含みうる。一部の例では、細胞は、例えば、望ましくない成分を除去する、所望の成分についてエンリッチするか、又は特定の試薬に対して感受性の細胞を溶解させるか、若しくは除去するように、１つ又は複数の試薬の存在下で洗浄、遠心分離、及び／又はインキュベートされる。細胞は、密度、接着特性、サイズ、特定の成分に対する感受性及び／又は耐性など、１つ又は複数の特性に基づき分けられうる。
[00145]一部の例では、対象の循環血に由来する細胞は、例えば、アフェレーシス又はリューカフェレーシスにより得られる。典型的に、対象から回収された血液細胞は、血漿画分を除去するように洗浄され、後続の処理ステップに適切な、緩衝液又は培地に入れられる。一部の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄される。一部の実施形態では、洗浄液は、カルシウム及び／若しくはマグネシウム、並びに／又は多くの二価カチオン若しくは全ての二価カチオンを欠く。洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式の「フロースルー型」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用して達せられうる。一部の態様では、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、接線流濾過（ＴＦＦ）により達せられる。洗浄の後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液に再懸濁されうる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望されない成分が除去され、細胞が、培養培地に、直接再懸濁される場合もある。
[00146]Ｔ細胞を単離する方法はまた、赤血球の溶解、及びＰｅｒｃｏｌｌ勾配又はＦｉｃｏｌｌ勾配を介する遠心分離による、末梢血からの、白血球の調製など、密度ベースの細胞分離法も含みうる。さらなる実施形態では、表面タンパク質、細胞内マーカー、又は核酸など、１つ又は複数のマーカーの発現に基づき、異なる細胞型を分離する、１つ又は複数のステップも、方法に組み入れられる。このようなマーカーに基づく分離のための、例えば、アフィニティーベースの分離又は免疫アフィニティーベースの分離を含む、任意の公知の方法が使用されうる。例えば、細胞表面マーカーなど、１つ又は複数のマーカーの発現又は発現レベルに基づく、細胞及び細胞集団の分離は、一般に、洗浄ステップ、及び抗原結合性分子に結合した細胞の、抗原結合性分子に結合しなかった細胞からの分離が後続する、このようなマーカーに特異的に結合する抗原結合性分子を伴うインキュベーションにより達成されうる。
[00147]このような分離ステップは、抗原結合性分子に結合した細胞が、さらなる使用のために保持される陽性選択に基づく場合、及び／又は抗原結合性分子に結合しなかった細胞が保持される陰性選択に基づく場合がある。理解されるであろうように、分離は、特定のマーカーを発現する特定の細胞集団又は細胞の、１００％のエンリッチメント又は除去を結果としてもたらす必要がない。一部の例では、１つのステップから陽性選択又は陰性選択された画分が、後続の陽性選択又は陰性選択など、別の分離ステップにかけられる、複数ラウンドにわたる分離ステップが実行される。一部の例では各々が、陰性選択にターゲティングされたマーカーに特異的である、複数の抗原結合性分子と共に、細胞をインキュベートすることなどにより、複数のマーカーを同時に発現する細胞を、単一の分離ステップが枯渇させうる。同様に、多様な細胞型において発現される、複数の抗原結合性分子と共に、細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞型が、同時に陽性選択されうる。
[00148]本開示の目的で、Ｔ細胞は、ＣＤ３の発現に基づき選択されうる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ１４など、Ｂ細胞、単球、又は他の白血球など、Ｔ細胞以外の細胞において発現されるマーカーの陰性選択により、ＰＢＭＣ試料から分離される。場合によって、Ｔ細胞集団が、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＤＮＡＭ－１－ Ｔ細胞及びＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞、並びにＴ細胞の、他の全ての表現型を含む、試料における全てのＴ細胞を含むように、さらなる選択はなされない。他の例では、選択は、より特定のＴ細胞亜集団を単離するのに使用される。
[00149]本開示の一実施形態では、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞が選択される。したがって、本開示は、Ｔ細胞の試料を、対象から得、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞を、試料から選択することにより、養子細胞療法のためのＴ細胞集団を調製する方法を提示する。ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞を選択する場合に、ＤＮＡＭ－１の表面発現レベルが評価され、考慮される場合がある。例えば、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞は、当技術分野で周知の通り、フローサイトメトリーを使用することなどにより、集団における他のＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞に照らして、「低」及び「高」レベルのＤＮＡＭ－１、又は「低」、「中」、及び「高」レベルのＤＮＡＭ－１を発現するＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞へと分けられうる。次いで、単離されたＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の亜集団のうちの１つ又は複数は、本明細書で記載される方法における使用のために保持されうる。
[00150]さらなる実施形態では、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋選択ステップは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するのに使用される。このようなＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、１つ又は複数のナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及び／又はエフェクターＴ細胞の亜集団において発現されるか、又は比較的高度に発現されるマーカーについての陽性選択又は陰性選択により、亜集団へと、さらに分取されうる。したがって、本開示のＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
[00151]ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、それぞれの亜集団と関連する表面抗原に基づく、陽性選択又は陰性選択などにより、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、及び／又は幹細胞様セントラルメモリーＴ細胞について、さらにエンリッチされる場合もあり、これらを枯渇させられる場合もある。例えば、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についてのエンリッチメントは、一部の態様では、このような亜集団において、特に、ロバストである、投与後における、長期にわたる生存、拡大、及び／又は生着を改善するなど、有効性を増大させるように実行されうる（例えば、Ｔｅｒａｋｕｒａら ２０１２、Ｂｌｏｏｄ．、１：７２～８２；Ｗａｎｇら、２０１２、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９～７０１を参照されたい）。一部の実施形態では、ＴＣＭ細胞についてのエンリッチメントは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１２７の、陽性の表面発現又は高度の表面発現に基づき；一部の実施形態では、ＴＣＭ細胞についてのエンリッチメントは、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現するか、又はこれらを高度に発現する細胞についての陰性選択に基づく。したがって、ＴＣＭ細胞についてエンリッチされたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞についての、陽性選択又はエンリッチメントにより実行されうる。
[00152]単離Ｔ細胞は、当技術分野で公知の、任意の方法を使用してインキュベート及び／又は培養されうる。インキュベーションステップは、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ、ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、及び／又は繁殖を含みうる。一部の実施形態では、細胞は、刺激条件又は刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件は、集団における細胞の増殖、拡大、活性化、及び／又は生存を誘導するようにデザインされた条件、抗原への曝露を模倣するようにデザインされた条件、及び／又はＤＮＡＭ－１ポリヌクレオチド、及び／又は下記で拡張される通り、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドなど、他のポリヌクレオチドの導入のためなど、遺伝子操作のために、細胞をプライミングするようにデザインされた条件を含む。
[00153]一部の実施形態では、刺激条件（例えば、細胞の拡大を容易とする刺激条件）は、１つ又は複数の薬剤、例えば、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能なリガンドへの曝露を含む。例えば、薬剤は、Ｔ細胞における、ＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを誘発しうる。このような薬剤は、ビーズなどの固体支持体へと結合させたＴＣＲ成分及び／若しくは共刺激受容体に特異的な抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体）などの抗体、及び／又は１つ若しくは複数のサイトカインを含みうる。任意選択で、拡大法は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を、培養培地へと添加するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５を含む。Ｔ細胞を、培養及び拡大するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，０４０，１７７号、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、２０１２、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６５１～６６０、Ｔｅｒａｋｕｒａら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ．、１：７２～８２、及びＷａｎｇら、２０１２、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９～７０１に記載されている方法を含む。
[00154]一部の実施形態では、Ｔ細胞は、それらを、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）など、培養誘発組成のフィーダー細胞へと添加し、Ｔ細胞の数を拡大するのに十分な時間にわたり、培養物をインキュベートすることにより拡大される。非分裂フィーダー細胞は、ガンマ照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含みうる。さらなる実施形態では、インキュベーションは、任意選択で、ガンマ線により照射されうる、非分裂ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を、フィーダー細胞として添加することをさらに含みうる。複数の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＴリンパ球又は抗原特異的Ｔリンパ球を、抗原で刺激することにより得られる。例えば、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞株又はクローンは、感染した対象から、Ｔ細胞を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞を、同じ抗原で刺激することにより作出されうる。
[00155]細胞は、上記で記載された通りに、組換えＤＮＡＭ－１を発現するように操作することなどの遺伝子操作の前に、又はこれを伴ってインキュベート及び／又は培養されうる。さらに、組換えＤＮＡＭ－１及び／又は内因性ＤＮＡＭ－１を含むＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞はまた、１つ又は複数の他の組換えポリペプチドも発現しうる。Ｔ細胞が、組換えＤＮＡＭ－１を発現する実施形態では、Ｔ細胞が、組換えＤＮＡＭ－１を発現するように、改変される前に、これと同時に、又はこの後で、他の組換えポリペプチド（複数可）も、Ｔ細胞へと操作されうる。特定の例では、本開示の例示的なＴ細胞は、トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、組換え受容体を発現する。
[00156]特定の実施形態では、本明細書で記載されるＴ細胞は、ＣＡＲなどの組換え抗原受容体を発現する、すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞である。ＣＡＲを含む、例示的な抗原受容体、及びこのような受容体を操作し、細胞へと導入する方法は、例えば、国際特許出願公開第２０００１４２５７号、同第２０１３１２６７２６号、同第２０１２１２９５１４号、同第２０１４０３１６８７号、同第２０１３１６６３２１号、同第２０１３０７１１５４号、同第２０１３１２３０６１号；米国特許出願公開第２００２１３１９６０号、同第２０１３２８７７４８号、同第２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号、及び同第８，４７９，１１８号において記載されている抗原受容体及び方法、並びに／又はＳａｄｅｌａｉｎら、２０１３、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．、３（４）：３８８～３９８；Ｄａｖｉｌａら、２０１３、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（４）：ｅ６１３３８；Ｔｕｒｔｌｅら、２０１２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４（５）：６３３～３９；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２０１２年３月１８日、（２）：１６０～７５により記載されている抗原受容体及び方法を含む。一部の態様では、抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号において記載されているＣＡＲ、及び国際特許出願公開第２０１４０５５６６８号において記載されているＣＡＲを含む。
[00157]ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（又は細胞質ドメイン）を含む。細胞外抗原結合性ドメインは、受容体、又はリガンドに結合する受容体のドメインの場合もあり、抗体又は抗体の可変重（ＶＨ）鎖領域及び／若しくは可変軽（ＶＬ）鎖領域、例えば、ｓｃＦｖ抗体断片など、その抗原結合性部分の場合もある。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域、並びに／又はＣＨ１／ＣＬ領域及び／若しくはＦｃ領域など、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む。定常領域又は部分は、一般に、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１など、ヒトＩｇＧの定常領域又は部分である。定常領域の部分は、抗原認識成分、例えば、ｓｃＦｖと、ＣＡＲの膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として用いられうる。例示的なスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジ単独、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインへと連結されたＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＨ３ドメインへと連結されたＩｇＧ４ヒンジを含む。例示的なスペーサーは、Ｈｕｄｅｃｅｋら ２０１３、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９：３１５３、国際特許出願公開第２０１４０３１６８７号、及び米国特許第８，８２２，６４７号において記載されているスペーサーを含むがこれらに限定されない。
[00158]抗原結合性ドメインは、一般に、腫瘍抗原に結合する。抗原結合性領域が結合する、例示的な腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フロシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＡＧＥＡ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、変異体ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、及びＩＧＬＬ１を含むがこれらに限定されない。
[00159]一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０に由来する抗原結合性ドメインを含む。しかし、特定の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合性ドメインは、ＤＮＡＭ－１の抗原結合性ドメイン（例えば、ＤＮＡＭ－１の細胞外ドメイン）を含まない。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴ細胞は、下記で記載される、抗原受容体複合体を介して活性化を模倣しうる、外因性の細胞内シグナル伝達ドメインへと連結されるか、又はこれを含む、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含有しない（すなわち、一部の実施形態では、Ｔ細胞において発現されるＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、抗原受容体複合体を介して活性化を模倣しうる、外因性の細胞内シグナル伝達ドメインへと連結されないか、又はこれを含まない）。
[00160]細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体などの抗原受容体複合体を介する活性化、及び／又は別の細胞表面受容体を介するシグナルを模倣するシグナル伝達成分など、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達成分を含む。一部の実施形態では、シグナルは、免疫刺激性の場合もあり、及び／又は共刺激性の場合もある。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＣＡＲが導入された免疫細胞の、正常なエフェクター機能（例えば、Ｔ細胞の場合、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性）のうちの少なくとも１つの活性化の一因となる。
[00161]当技術分野では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例が周知であり、抗原受容体会合の後に、シグナル伝達を誘発するように、協同して作用する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共受容体の細胞質配列のほか、同じ機能的能力を有する、これらの配列の、任意の誘導体又はバリアント、及び任意の組換え配列を含む。ＴＣＲ単独を介して生じるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であるので、二次シグナル及び／又は共刺激シグナルもまた、組み入れられうる。したがって、ＣＡＲは、ＴＣＲを介する抗原依存性一次活性化を誘発する、一次細胞内シグナル伝達ドメインと、二次シグナル又は共刺激シグナルをもたらすように、抗原非依存的に作用する、二次細胞質ドメイン又は共刺激ドメインとを含みうる。
[00162]刺激性に作用する、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）として公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。ＣＡＲを作出するのに使用されている、ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲｌｌａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２のＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子、すなわち、リンパ球の、抗原に対する効率的な応答に要求される、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子の細胞内ドメインを含む、共刺激シグナル伝達ドメインである。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７による共刺激は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の拡大、エフェクター機能、及び生存を増強し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ヒトＴ細胞の存続及び抗腫瘍活性を強化することが裏付けられている（Ｓｏｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２、１１９（３）：６９６～７０６）。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒ ベータ、ＩＬ２Ｒ ガンマ、ＩＬ７Ｒ アルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、及びＣＤ１９ａを含む。理解されるであろうように、ＣＡＲは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はこれを超える共刺激シグナル伝達ドメインなど、２つ又はこれを超える共刺激シグナル伝達ドメインを含みうる。
[00163]ＣＡＲの膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もある。一部の態様では、供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体である、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４の、アルファ、ベータ、又はゼータ鎖の、膜貫通領域（複数可）に由来する膜貫通領域を含む。
[00164]一部の例では、Ｔ細胞は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。ＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲを欠くＴＣＲ欠損Ｔ細胞（例えば、細胞表面に、機能的ＴＣＲを発現しないように操作されるか、機能的ＴＣＲを含む、１つ又は複数のサブユニットを発現しないように操作されるか、又は細胞表面に、極めてわずかの機能的ＴＣＲしか産生しないように操作されたＴ細胞）、及び実質的に損なわれたＴＣＲ（例えば、ＴＣＲのサブユニットのうちの１つ又は複数の変異形態又は切断形態の発現により）を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞を含む。ＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、米国特許第９６６３７６３号及び米国特許公開第２００７００３６７７３号において記載されているＴＣＲ欠損Ｔ細胞を含む。このようなＴ細胞は、例えば、核酸をターゲティングする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の、Ｔ細胞への導入、又は内因性ＴＣＲを破壊する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用などにより、ＴＣＲ－α及びＴＣＲ－βなどの特異的ＴＣＲ、並びに／又はＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）をコードする核酸をターゲティングすることにより作製されうる。
[00165]他の実施形態では、米国特許第９６６３７６３号において記載されているＴＣＲ欠損細胞などのＴＣＲ欠損細胞は、本発明から、明示的に除外される、すなわち、一部の実施形態では、本開示のＴ細胞は、機能的ＴＣＲを発現する。機能的ＴＣＲは、内因性ＴＣＲの場合もあり、組換えＴＣＲの場合もある。
[00166]Ｔ細胞の生物学的活性は、多数の公知の方法のうちのいずれかにより測定されうる。Ｔ細胞の活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて評価される場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて（例えば、がん又は感染症についての動物モデルなど、疾患についての動物モデルを使用して）評価される場合もあり、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて評価される場合もある。評価するためのパラメータは、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによる、Ｔ細胞の、抗原への特異的結合を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞が、標的細胞を破壊する能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、３２（７）：６８９～７０２（２００９）、及びＨｅｒｍａｎらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８５（１）：２５～４０（２００４）において記載されている細胞傷害作用アッセイなど、当技術分野で公知の、任意の適する方法を使用して測定されうる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－２、ＴＮＦ、及びＫｉ６７など、ある特定のタンパク質（すなわち、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカー）の発現及び／又は分泌についてアッセイすることにより測定されうる。例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化についてのバイオマーカーとして使用される場合があり；ＣＤ１０７ａは、脱顆粒についてのマーカー使用される場合があり；Ｋｉ６７は、Ｔ細胞増殖についてのバイオマーカーとして使用されうる。
[00167]本開示に従い、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカーを検出するための、当技術分野で公知の、任意の方法が使用されうる。このような方法は、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、放射免疫アッセイ、ドットブロット法、免疫検出法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ又はＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法、ＦＩＳＨ、及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
[00168]生物学的活性はまた、又は代替的に、腫瘍量又は腫瘍負荷の低減などの臨床転帰を評価することによっても測定されうる。例えば、がんについての小型動物モデル（例えば、腫瘍を保有するマウス）は、本開示のＴ細胞を注入され、腫瘍量をモニタリング及び評価されうる（下記の例で記載されるモデルなど）。
３．医薬組成物及び医薬製剤
[00169]本明細書ではまた、本開示のＴ細胞と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物及び医薬製剤も提示される。医薬組成物はまた、１つ若しくは複数の化学療法剤、又は１つ若しくは複数の抗感染症剤など、１つ又は複数の他の活性薬剤も含みうる。これらの非限定例は、下記の節で詳述され、これらのうちの任意の１つ又は複数は、本開示の医薬組成物に組み入れられうる。
[00170]本明細書で記載される医薬組成物及び医薬製剤は、所望の程度の純度を有する有効成分（例えば、低分子、核酸、又はポリペプチド）を、１つ又は複数の、任意選択の、薬学的に許容できる担体（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより調製されうる。薬学的に許容できる担体は、一般に、利用される投与量及び濃度で、レシピエントに対して、非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む、抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルチノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むがこれらに限定されない。
[00171]一実施形態では、薬学的に許容できる担体は、非経口投与に適する。代替的に、担体は、静脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、又は舌下投与に適しうる。特定の例では、薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即席調製のための、滅菌水溶液又は滅菌分散液を含む。当技術分野では、薬学的活性物質のための、このような培地及び薬剤の使用が周知である。任意の従来の培地又は薬剤が、活性化合物に対して不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が想定される。特定の実施形態では、適切な担体は、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）及びリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を含むがこれらに限定されない。
[00172]理解されるであろうように、医薬組成物は、典型的に、製造及び保管の条件下で、無菌であり、安定でなければならない。本開示の目的で、医薬組成物は、溶液として製剤化される。Ｔ細胞と、任意選択で、１つ又は複数の他の薬剤とは、様々な剤形により投与されうる。したがって、医薬組成物は、単回投与用調製物として製剤化される場合もあり、複数回投与用調製物として製剤化される場合もある。当業者に公知の、任意の生物学的に許容できる剤形、及びこれらの組合せが想定される。このような剤形の例は、限定せずに述べると、液体、溶液、懸濁液、エマルジョン、注射剤（皮下注射剤、筋内注射剤、静脈内注射剤、及び皮内注射剤を含む）、注入剤、及びこれらの組合せを含む。
４．治療的使用
[00173]本開示は、対象における免疫機能（Ｔ細胞機能を含む）を増強するための方法、対象におけるがんを処置するための方法、及び対象へと、本明細書で記載される、ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞を投与することにより、感染症を処置するための方法を提示する。したがって、本開示のＴ細胞は、がん又は感染症を処置するなどのために、対象へと、対象における免疫機能を増強するための養子細胞移入療法の一部として投与されうる。
[00174]養子細胞療法のために、細胞を投与するための方法は公知であり、本開示と共に使用されうる。例えば、養子Ｔ細胞療法については、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；米国特許第４，６９０，９１５号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２０１１、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、８（１０）：５７７～８５；Ｔｈｅｍｅｌｉら、２０１３、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１（１０）：９２８～９３３；Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０１３、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、４３８（１）：８４～９；Ｄａｖｉｌａら、２０１３、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（４）：ｅ６１３３８において記載されている。
[00175]養子細胞療法は、細胞が、細胞療法を施される対象、又はこのような対象に由来する試料から単離及び／又は他の形で調製される、自家移入により実行されうる。したがって、一部の態様では、本開示のＴ細胞は、処置及び細胞を必要とする対象から導出され、単離及び処理の後に、同じ対象へと投与される。他の実施形態では、細胞療法は、細胞が、細胞療法を施される予定の対象、又は細胞療法を最終的に施される対象以外の対象から単離及び／又は他の形で調製される、同種移入により実行される。このような実施形態では、細胞は、第１の対象から導出され、次いで、同じ種であるが、異なる、第２の対象へと投与される。一部の実施形態では、第１の対象と、第２の対象とは、遺伝子的に同一であるか、又は類似する。例えば、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラス又はスーパータイプを発現しうる。Ｔ細胞が、細胞療法を施される対象と異なる種の対象から単離及び／又は他の形で調製される、異種移入もまた、想定される。
[00176]細胞は、任意の適切な手段、例えば、ボーラス注入剤、注入、例えば、静脈内注入又は皮下注入、眼内注入、眼周囲注入、網膜下注入、硝子体内注入、経中隔注入、強膜下注入、脈絡膜内注入、前房内注入、結膜下注入、テノン嚢下注入、球後注入、球周囲注入、又は傍強膜後送達により投与されうる。一部の実施形態では、細胞は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与により投与され、局所処置が所望される場合、病変内投与により投与される。非経口注入剤は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸腔内投与、頭蓋内投与、又は皮下投与を含む。一部の実施形態では、所与の用量は、細胞の単回ボーラス投与により投与される。他の実施形態では、細胞の、複数回にわたるボーラス投与は、例えば、３日間を超えない期間にわたり、又は細胞の連続注入投与により実施される。
[00177]適切な投与量は、処置される疾患の種類、Ｔ細胞の種類、疾患の重症度及び経過、対象の臨床状態、対象の病歴及び処置への応答、並びに主治医の熟慮に基づき決定されうる。投与量は、特定の患者において診断された疾患の種類及び病期を検討することにより、経験的に決定されうる。患者へと投与される用量は、本開示の文脈では、対象において、時間経過にわたり、有益な治療的応答をもたらすのに十分であるものとする。用量のサイズもまた、特定の患者における、特定の化合物の投与に随伴する、任意の有害副作用の、存在、性格、及び程度により決定されるであろう。特定の状況に適正な投与量の決定は、医療実施者の技術の範囲内にある。一部の実施形態では、処置は、化合物の最適未満用量である、小投与量により開始される。その後、投与量は、状況下における最適効果に達するまで、小増分ずつ増大させられる。簡便のため、所望の場合、１日の全投与量は、分割され、その日の間に、部分量で投与されうる。投与は、主治医による決定に応じて、毎日なされる場合もあり、隔日でなされる場合もある。投与はまた、定期的になされる場合もあり、皮下カプセル、小袋、若しくはデポ剤の使用を介して、又はパッチ若しくはポンプを介するなど、長期間（数週間、数カ月間、又は数年間）にわたり、連続ベースでなされる場合もある。
[00178]一実施形態では、Ｔ細胞は、対象へと、細胞少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、若しくは１０１１個又は約これらの個数など、細胞約１０５～１０１１個の間の量で投与される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞１０８～１０９個の間の量で投与される。Ｔ細胞は、毎週１回若しくは複数回（例えば、毎日、又は毎週２、３、４、５、若しくは６回）、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、又はこれを超える週数の期間ごとに１回の頻度など、治療的であり、安全であると考えられる、任意の頻度で投与されうる。
[00179]本開示のＴ細胞は、単独で投与される場合もあり、がんの処置のための、１つ若しくは複数の抗がん治療（例えば、手術、放射線療法、又は化学療法）、又は感染症の処置のための、１つ若しくは複数の抗感染症治療を含む、１つ又は複数の他の治療と共に投与される場合もある。例示的な治療は、放射線療法、手術（例えば、腫瘍摘出術及び乳腺切除術）、化学療法、遺伝子治療、ＤＮＡ治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体治療、又は前出の組合せを含む。一部の実施形態では、さらなる治療は、放射線療法である。他の実施形態では、さらなる治療は、手術である。特定の実施形態では、さらなる治療は、放射線療法と手術との組合せである。一部の実施形態では、さらなる治療は、ガンマ照射である。対象は、本開示のＴ細胞の前及び／又は後に、１つ又は複数の他の治療へと曝露されうる。一部の実施形態では、対象は、Ｔ細胞が投与されるのと同時に、１つ又は複数の他の治療へと曝露される。このような実施形態では、Ｔ細胞と、さらなる治療とは、例えば、同じ製剤（上記で記載した医薬組成物など）の場合もあり、異なる製剤の場合もある。
[00180]化学療法剤の非限定例は、エルロチニブ（タルセバ（ＴＡＲＣＥＶＡ）（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩＰｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ベルケード（ＶＥＬＣＡＤＥ）（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、ジスルフィラム、没食子酸エピガロカテキン、サリノスポラミドＡ、カルフィルゾミブ、１７－ＡＡＧ（ゲルダナマイシン）、ラジシコール、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨ－Ａ）、フルベストラント（ファスロデックス（ＦＡＳＬＯＤＥＸ）（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スニチニブ（スーテント（ＳＵＴＥＮＴ）（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｓｕｇｅｎ）、レトロゾール（フェマーラ（ＦＥＭＡＲＡ）（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（グリベック（ＧＬＥＥＶＥＣ）（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フィナスネート（バタラニブ（ＶＡＴＡＬＡＮＩＢ）（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（エロキサチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、５－ＦＵ（５－フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ラパミューン（ＲＡＰＡＭＵＮＥ）（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（タイケルブ（ＴＹＫＥＲＢ）（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファミブ（ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ（ネキサバル（ＮＥＸＡＶＡＲ）（登録商標）、ＢａｙｅｒＬａｂｓ）、ゲフィチニブ（イレッサ（ＩＲＥＳＳＡ）（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、チオテパなどのアルキル化剤、及びシトキサン（ＣＹＴＯＸＡＮ）（登録商標）シクロホスファミド；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（トポテカン及びイリノテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン合成アナログ、カルゼレシン合成アナログ、及びビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；アドレノコルチコステロイド（プレドニゾン及びプレドニゾロンを含む）；酢酸シプロテロン；５α－レダクターゼ（フィナステリド及びデュタステリドを含む）；ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタットドラスタチン；アルデスロイキン、滑石、デュオカルマイシン（合成アナログである、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア類；エンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンγＩＩ及びカリケアマイシンωＩＩ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９９４、３３：１８３～１８６）；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシンのほか、ネオカルチノスタチン発色団、及び類縁の色素タンパク質である、エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）（登録商標）（ドキソルビシン）、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン；ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；葉酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダムノール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール（ＴＡＸＯＬ）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、アブラキサン（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）（登録商標）（クレモフォール非含有）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、及びタキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）（ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）；クロラムブシル；ジェムザール（ＧＥＭＺＡＲ）（登録商標）（ゲムシタビン）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ゼローダ（ＸＥＬＯＤＡ）（登録商標））；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；並びに上記のうちのいずれかの、薬学的に許容できる塩、酸、及び誘導体を含む。
[00181]化学療法剤はまた、（ｉ）例えば、タモキシフェン（ノルバデックス（ＮＯＬＶＡＤＥＸ）（登録商標）；タモキシフェンクエン酸塩を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びフェアストン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）（登録商標）（トレミフィンクエン酸塩）を含む、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などのホルモンの、腫瘍に対する作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；（ｉｉ）例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲース（ＭＥＧＡＳＥ）（登録商標）（酢酸メゲストロール）、アロマシン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ）（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン、ファドロゾール、リビゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ）（登録商標）（ボロゾール）、フェマーラ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びアリミデックス（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）（登録商標）（アナストロゾ－ル；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）など、副腎内のエストロゲンの産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；（ｉｉｉ）フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ブセレリン、トリプテレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ジエチルスチルベストロール、プレマリン、フルオキシメステロン、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸、フェンレチニドのほか、トロキサシタビン（ａ１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；（ｉｖ）プロテインキナーゼ阻害剤；（ｖ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、Ｒａｌｆ、及びＨ－Ｒａｓなど、異常な細胞増殖に関与しているシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；（ｖｉｉ）ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、アンジオザイム（ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ）（登録商標））及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；（ｖｉｉｉ）遺伝子治療ワクチン、例えば、アロベクチン（ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ）（登録商標）、レウベクチン（ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ）（登録商標）、及びバクシド（ＶＡＸＩＤ）（登録商標）などのワクチン；プロロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）（登録商標）、ｒＩＬ－２；ルルトテカン（ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ）（登録商標）；アバレリクス（ＡＢＡＲＥＬＩＸ）（登録商標）ｒｍＲＨなどのトポイソメラーゼ１阻害剤；並びに（ｉｘ）上記のうちのいずれかの、薬学的に許容できる塩、酸、及び誘導体も含む。
[00182]抗がん抗体もまた、化学療法剤であり、本明細書における方法及び組成物において利用されうる。このような抗体は、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；セツキシマブ（アービタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ベクティビックス（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ペルツズマブ（オムニターグ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）（登録商標）、２Ｃ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｒｉｘｉａ）などの抗体、及び抗体薬物コンジュゲートである、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ）（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）を含むがこれらに限定されない。本発明の化合物と組み合わせて、薬剤としての治療可能性を有する、さらなるヒト化モノクローナル抗体は、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネウズマブ、ビバツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、及びインターロイキン１２のｐ４０タンパク質を認識するように遺伝子改変された、専一的な組換えヒト配列による、完全長ＩｇＧ１λ抗体である抗インターロイキン１２（ＡＢＴ－８７４／Ｊ６９５、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む。
[00183]化学療法剤はまた、ＥＧＦＲに結合するか、又は、他の形でこれと直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を防止又は低減する化合物を指し、代替的に、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」とも称する、「ＥＧＦＲ阻害剤」も含む。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号を参照されたい）、並びにキメラ型２２５（Ｃ２２５又はセツキシマブ；アーブティックス（ＥＲＢＵＴＩＸ）（登録商標））及び改変型ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．を参照されたい）など、これらの変異体；ＥＧＦＲターゲティング完全ヒト抗体である、ＩＭＣ－１１Ｆ８（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されている、ＥＧＦＲに結合するヒト化抗体及びキメラ抗体；並びにＡＢＸ－ＥＧＦ又はパニツムマブなど、ＥＧＦＲに結合するヒト抗体（国際公開第９８／５０４３３号、Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎを参照されたい）；ＥＭＤ ５５９００（Ｓｔｒａｇｌｉｏｔｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３２Ａ：６３６～６４０（１９９６））；ＥＧＦＲへの結合について、ＥＧＦ及びＴＧＦアルファと競合する、ＥＧＦＲに対するヒト化抗体であるＥＭＤ７２００（マツズマブ）（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体である、ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３、及びＥ７．６．３として公知であり、ＵＳ６，２３５，８８３に記載されている完全ヒト抗体；ＭＤＸ－４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ）；並びにｍＡｂ ８０６又はヒト化ｍＡｂ ８０６（Ｊｏｈｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（２９）：３０３７５～３０３８４（２００４））を含む。抗ＥＧＦＲ抗体を、細胞傷害剤とコンジュゲートし、これにより、イムノコンジュゲート（例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨによる、欧州特許第６５９４３９号を参照されたい）を作出することができる。ＥＧＦＲアンタゴニストは、米国特許第５，６１６，５８２号、同第５，４５７，１０５号、同第５，４７５，００１号、同第５，６５４，３０７号、同第５，６７９，６８３号、同第６，０８４，０９５号、同第６，２６５，４１０号、同第６，４５５，５３４号、同第６，５２１，６２０号、同第６，５９６，７２６号、同第６，７１３，４８４号、同第５，７７０，５９９号、同第６，１４０，３３２号、同第５，８６６，５７２号、同第６，３９９，６０２号、同第６，３４４，４５９号、同第６，６０２，８６３号、同第６，３９１，８７４号、同第６，３４４，４５５号、同第５，７６０，０４１号、同第６，００２，００８号、及び同第５，７４７，４９８号のほか、以下のＰＣＴ公開：国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９８／５００３８号、国際公開第９９／０９０１６号、及び国際公開第９９／２４０３７号に記載されている化合物などの低分子を含む。特定の低分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＯＳＩ－７７４（ＣＰ－３５８７７４、エルロチニブ、タルセバ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３、２－プロペンアミド、Ｎ－［４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－７－［３－（４－モルホリニル）プロポキシ］－６－キナゾリニル］－ジヒドロクロリド、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））４－（３’－クロロ－４’－フルオロアニリノ）－７－メトキシ－６－（３－モルホリノプロポキシ）キナゾリン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ１０５１８０（（６－アミノ－４－（３－メチルフェニル－アミノ）－キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ－１３８２（Ｎ８－（３－クロロ－４－フルオロ－フェニル）－Ｎ２－（１－メチル－ピペリジン－４－イル）－ピリミド［５，４－ｄ］ピリミジン－２，８－ジアミン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ－１６６（（Ｒ）－４－［４－［（１－フェニルエチル）アミノ］－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－６－イル］－フェノール）；（Ｒ）－６－（４－ヒドロキシフェニル）－４－［（１－フェニルエチル）アミノ］－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン）；ＣＬ－３８７７８５（Ｎ－［４－［（３－ブロモフェニル）アミノ］－６－キナゾリニル］－２－ブチンアミド）；ＥＫＢ－５６９（Ｎ－［４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－３－シアノ－７－エトキシ－６－キノリニル］－４－（ジメチルアミノ）－２－ブテンアミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｐｆｉｚｅｒ）；ラパチニブ（タイケルブ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６又はＮ－［３－クロロ－４－［（３－フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］－６［５［［（２－メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］－２－フラニル］－４－キナゾリンアミン）など、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重チロシンキナーゼ阻害剤を含む。
[00184]他の化学療法剤は、前出の段落で言及されたＥＧＦＲターゲティング薬；武田薬品工業株式会社から市販されているＴＡＫ１６５などの、低分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ＥｒｂＢ２受容体チロシンキナーゼの選択的経口阻害剤である、ＣＰ－７２４，７１４（Ｐｆｉｚｅｒ ａｎｄ ＯＳＩ）；ＥＧＦＲに優先的に結合するが、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲの両方を過剰発現する細胞を阻害する、ＥＫＢ－５６９（Ｗｙｅｔｈから市販されている）などの二重ＨＥＲ阻害剤；ＨＥＲ２及びＥＧＦＲの経口チロシンキナーゼ阻害剤である、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６；Ｇｌａｘｏ－ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから市販されている）；ＰＫＩ－１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓから市販されている）；カネルチニブ（ＣＩ－１０３３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの汎ＨＥＲ阻害剤；ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販されているアンチセンス薬剤である、ＩＳＩＳ－５１３２など、Ｒａｆ－１シグナル伝達を阻害するＲａｆ－１阻害剤；メシル酸イマチニブ（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから市販されている、グリベック（登録商標））などの非ＨＥＲターゲティングＴＫ阻害剤；スニチニブ（Ｐｆｉｚｅｒから市販されている、スーテント（登録商標））などのマルチターゲティングチロシンキナーゼ阻害剤；バタラニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧから市販されている、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）などのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節型キナーゼＩ阻害剤ＣＩ－１０４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている）；４－（３－クロロアニリノ）キナゾリンであるＰＤ１５３０３５などのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ ５９３２６、ＣＧＰ ６０２６１、及びＣＧＰ ６２７０６などのピロロピリミジン；４－（フェニルアミノ）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジンである、ピラゾロピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５－ビス（４－フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチルホスチン；ＰＤ－０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ－Ｌａｍｂｅｒ）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードする核酸に結合するアンチセンス分子）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；チルホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ－７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＣＩ－１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））；ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＣＩ－１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ－５６９（Ｗｙｅｔｈ）；セマキシニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ－７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＩＮＣ－１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）、ラパマイシン（シロリムス、ラパミューン（登録商標））を含むチロシンキナーゼ阻害剤であるか；又は以下の特許公開：米国特許第５，８０４，３９６号；国際公開第１９９９／０９０１６号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；国際公開第１９９８／４３９６０号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；国際公開第１９９７／３８９８３号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第１９９９／０６３７８号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第１９９９／０６３９６号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第１９９６／３０３４７号（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）；国際公開第１９９６／３３９７８号（Ｚｅｎｅｃａ）；国際公開第１９９６／３３９７号（Ｚｅｎｅｃａ）及び国際公開第１９９６／３３９８０号（Ｚｅｎｅｃａ）のうちのいずれかに記載されているチロシンキナーゼ阻害剤である。
[00185]化学療法剤はまた、デキサメタゾン、インターフェロン、コルヒチン、メトプリン、シクロスポリン、アンホテリシン、メトロニダゾール、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アミホスチン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、生ＢＣＧ、ベバクジマブ、ベキサロテン、クラドリビン、クロファラビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキン、デキスラゾキサン、エポエチンアルファ、エロチニブ、フィルグラスチム、酢酸ヒストレリン、イブリツモマブ、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、レナリドマイド、レバミソール、メスナ、メトキサレン、ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、パリフェルミン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、キナクリン、ｒａｓｂウリカーゼ、サルグラモスチム、テモゾロミド、ＶＭ－２６、６－ＴＧ、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ゾレドロネート、及びゾレドロン酸、並びにこれらの薬学的に許容できる塩も含む。
[00186]化学療法剤はまた、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ピバル酸チキソコルトールピ、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ベタメサゾン、ベタメサゾンリン酸ナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルオコルトロン、ヒドロコルチゾン－１７－ブチレート、ヒドロコルチゾン－１７－バレレート、アクロメタゾンジプロピオネート、吉草酸ベタメサゾン、ベタメサゾン二プロピオナート、プレドニカルベート、クロベタゾン－１７－ブチレート、クロベタゾール－１７－プロピオネート、カプロン酸フルオコルトロン、ピバル酸フルオコルトロン、及び酢酸フルプレドニデン；フェニルアラニン－グルタミン－グリシン（ＦＥＧ）及びそのＤ－異性体形態（ｆｅＧ）（ＩＭＵＬＡＮ ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＬＬＣ）などの免疫選択的抗炎症ペプチド（ＩｍＳＡＩＤ）；アザチオプリン、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、Ｄ－ペニシラミン、金の塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミドミノサイクリン、スルファサラジン、エタネルセプト（エンブレル）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（ヒュミラ）、セルトリズマブペゴル（シムジア）、ゴリムマブ（シンポニー）などの腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）遮断剤、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）などのインターロイキン１（ＩＬ－１）遮断剤、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）などのＴ細胞共刺激遮断剤、トシリズマブ（アクテムラ（ＡＣＴＥＭＥＲＡ）（登録商標））などのインターロイキン６（ＩＬ－６）遮断剤；レブリキズマブなどのインターロイキン１３（ＩＬ－１３）遮断剤；ロンタリズマブなどのインターフェロンアルファ（ＩＦＮ）遮断剤；ｒｈｕＭＡｂベータ７などのベータ７インテグリン遮断剤；抗Ｍ１プライムなどのＩｇＥ経路遮断剤；抗リンホトキシンアルファ（ＬＴａ）などの、分泌型ホモトリマーＬＴａ３遮断剤及び膜結合型ヘテロトリマーＬＴａ１／β２遮断剤などの抗リウマチ薬；放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；チオプラチン、ＰＳ－３４１、フェニルブチレート、ＥＴ－１８－ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ－７３９７４９、Ｌ－７４４８３２）など、その他の治験薬剤；ケルセチン、レベラトロール、ピセアタンノール、没食子酸エピガロカテキン、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸、及びこれらの誘導体などのポリフェノール；クロロキンなどのオートファジー阻害剤；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、マリノール（ＭＡＲＩＮＯＬ）（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、及び９－アミノカンプトテシン）；ポドフィロトキシン；テガフール（ウフトラル（ＵＦＴＯＲＡＬ）（登録商標））；ベキサロテン（タルグレチン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ）（登録商標））；クロドロネート（例えば、ボネフォス（ＢＯＮＥＦＯＳ）（登録商標）又はオスタック（ＯＳＴＡＣ）（登録商標））、エチドロネート（ジドロカル（ＤＩＤＲＯＣＡＬ）（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ゾメタ（ＺＯＭＥＴＡ）（登録商標））、アレンドロネート（フォサマックス（ＦＯＳＡＭＡＸ）（登録商標））、パミドロネート（アレディア（ＡＲＥＤＩＡ）（登録商標））、チルドロネート（スケリッド（ＳＫＥＬＩＤ）（登録商標））、又はリセドロネート（アクトネル（ＡＣＴＯＮＥＬ）（登録商標））などのビスホスホネート；及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）；セラトープ（ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ）（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ペリホシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ又はエトリコシキブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ＣＣＩ－７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ジェナセンス（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ）（登録商標））などのＢｃｌ－２阻害剤；ピクサントロン；ロナファルニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＳＣＨ ６６３６、サラサル（ＳＡＲＡＳＡＲ）（商標））；並びに上記のうちのいずれかの、薬学的に許容できる塩、酸、又は誘導体のほか、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの混合療法のための略号であるＣＨＯＰ；及びオキサリプラチン（エロキサチン（商標））を、５－ＦＵ及びロイコボリンと混合した治療レジメンのための略号であるＦＯＬＦＯＸなど、上記のうちの２つ又はこれを超えるものの組合せも含む。
[00187]化学療法剤はまた、鎮痛効果、解熱効果、及び抗炎症効果を伴う、非ステロイド系抗炎症薬も含む。ＮＳＡＩＤは、酵素シクロオキシゲナーゼの非選択的阻害剤を含む。ＮＳＡＩＤの詳細な例は、アスピリン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、及びナプロキセンなどのプロピオン酸誘導体、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナクなどの酢酸誘導体、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、及びイソキシカムなど、エノール型の酸誘導体、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸などのフェナム酸誘導体、及びセレコキシブ、エトリコシキブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブなどのＣＯＸ－２阻害剤を含む。ＮＳＡＩＤは、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、急性痛風、月経困難症、転移性骨疼痛、頭痛及び片頭痛、手術後疼痛、炎症及び組織損傷に起因する、軽度～中等度の疼痛、発熱、イレウス、及び腎疝痛などの状態の症状の緩和に適応でありうる。
[00188]他の例では、本開示のＴ細胞は、対象へと、抗感染症薬と共に投与される。抗感染症薬は、限定せずに述べると、ウイルス、細菌、酵母、真菌、原虫などの微生物を死滅させるか、又はこれらの増殖を阻害する化合物を含む抗微生物剤から適切に選択され、したがって、抗生剤、抗アメーバ剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、及び抗ウイルス剤を含む。抗感染症薬はまた、それらの範囲内に、駆虫剤及び殺線虫剤も含む。例示的な抗生剤は、キノロン（例えば、アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ロソキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、スパルフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン；ゲミフロキサシン；及びガレノキサシン）、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、及びオキサゾリジノン（例えば、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン；リネゾリド、エペレゾリド）、グリコペプチド、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォルチミシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メオマイシン（ｍｅｏｍｙｃｉｎ）、ネチルミシン、リボスタマイシン、シソミシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、β－ラクタム（例えば、イミペネム、メロペネム、ビアペネム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフトキシム、セフゾナム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セフィネタゾール、セフォキシチン、セフォテタン、アズトレオナム、カルモナム、フロモキセフ、モキサラクタム、アミジノシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、ベンジルペニシリン、カルフェシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ピペラシリン、スルベニシリン、テモシリン、チカルシリン、セフジトレン、ＳＣ００４、ＫＹ－０２０、セフジニル、セフチブテン、ＦＫ－３１２、Ｓ－１０９０、ＣＰ－０４６７、ＢＫ－２１８、ＦＫ－０３７、ＤＱ－２５５６、ＦＫ－５１８、セフォゾプラン、ＭＥ１２２８、ＫＰ－７３６、ＣＰ－６２３２、Ｒｏ０９－１２２７、ＯＰＣ－２００００、ＬＹ２０６７６３）、リファマイシン、マクロリド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン）、ケトリド（例えば、テリスロマイシン、セスロマイシン）、クメルマイシン、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、及びクロラムフェニコールを含む。例示的な抗ウイルス剤は、アバカビル硫酸塩、アシクロビルナトリウム、アマンタジン塩酸塩、アンプレナビル、シドフォビル、デラビルジンメシル酸塩、ジダノシン、エファビレンツ、ファムシクロビル、フォミビルセンナトリウム、フォスカルネットナトリウム、ガンシクロビル、インジナビル硫酸塩、ラミブジン、ラミブジン／ジドブジン、ネルフィナビルメシル酸塩、ネビラピン、オセルタミビルリン酸塩、リバビリン、リマンタジン塩酸塩、リトナビル、サキナビル、サキナビルメシル酸塩、スタブジン、バラシクロビル塩酸塩、ザルシタビン、ザナミビル、及びジドブジンを含む。抗アメーバ剤又は抗原虫剤の非限定例は、アトバコン、クロロキン塩酸塩、クロロキンリン酸塩、メトロニダゾール、メトロニダゾール塩酸塩、及びペンタミジンイセチオン酸塩を含む。駆虫剤は、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、アルベンダゾール、イベルメクチン、及びチアベンダゾールから選択される少なくとも１つでありうる。例示的な抗真菌剤は、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢ硫酸コレステリル複合体、アムホテリシンＢ脂質複合体、リポソーム型アムホテリシンＢ、フルコナゾール、フルシトシン、マイクロサイズグリセオフルビン、ウルトラマイクロサイズグリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ナイスタチン、及びテルビナフィン塩酸塩から選択されうる。抗マラリア剤の非限定例は、クロロキン塩酸塩、クロロキンリン酸塩、ドキシサイクリン、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、メフロキン塩酸塩、プリマキンリン酸塩、ピリメタミン、及びスルファドキシンを伴うピリメタミンを含む。抗結核剤は、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、エタンブトール塩酸塩、イソニアジド、ピラジナミド、リファブチン、リファムピン、リファペンチン、及びストレプトマイシン硫酸塩を含むがこれらに限定されない。
[00189]一部の実施形態では、Ｔ細胞が投与される対象は、がんを有する。がんの例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない。このようながんのより特定の例は、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん及び消化器間質がんを含む胃がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、尿路がん、肝がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトロームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）のほか、母斑症と関連する、異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連する浮腫など）、メーグス症候群、脳がんのほか、頭頸部がん、及び関連する転移を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明の抗体による処置に適するがんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝がん、膵がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫を含む。一部の実施形態では、がんは、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、胃がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、及び肝細胞癌から選択される。さらに一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、及び乳癌から選択され、これらのがんの転移性形態を含む。詳細な実施形態では、がんは、黒色腫又は肺がん、適切には、転移性黒色腫又は転移性肺がんである。
[00190]一部の実施形態では、個体は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む、１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤を含む、１つ又は複数の免疫療法に対して耐性であるがんを有する。阻害剤に対する耐性は、がんの再発又は不応性がんとして顕在化しうる。再発は、処置後の、元の部位又は新たな部位における、がんの再出現を指す場合がある。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤に対する耐性は、阻害剤による処置時における、がんの進行として顕在化する。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤に対する耐性は、処置に応答しないがんを結果としてもたらす。がんは、処置の開始時に耐性の場合もあり、処置期間中に耐性となる場合もある。一部の実施形態では、がんは、早期がん又は後期がんである。
[00191]本開示の特定の実施形態では、対象は、上記で本質的に記載した通り、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択及び／又は単離するように、白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、回収されるか、エンリッチされるか、又は枯渇させられる、リューカフェレーシスを受ける場合がある。これらのＴ細胞単離株は、当技術分野で公知の方法により拡大され、任意選択で、組換えＤＮＡＭ－１、及び／又は他の組換え分子（例えば、ＴＣＲ又はＣＡＲ）を発現するように操作されうる。その後、それを必要とする対象は、高用量化学療法による標準的処置に続き、末梢血幹細胞移植を受ける場合がある。ある特定の態様では、移植の後に、又は移植と共時的に、対象は、拡大された本開示のＴ細胞の注入を施される。さらなる態様では、拡大された細胞は、手術の前又は後に投与される。
[00192]一部の実施形態では、対象は、感染症を有し、本開示のＴ細胞は、対象へと、感染症の処置のために投与される。感染症は、ウイルス、プリオン、細菌、ウイロイド、寄生虫、原虫、及び真菌により引き起こされる感染症を含むがこれらに限定されない。ウイルスの非限定例は、ＨＩＶ－１（また、ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ－ＩＩＩとも称される）；及びＨＩＶ－ＬＰなど、他の単離株など、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のヒト免疫不全ウイルス；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコックサッキーウイルス、リノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ノーウォークウイルス及び類縁のウイルスを含む、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、メタ肺炎ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（大半のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（１型及び２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（天然痘ウイルス、ＶＡＣＶ、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；並びに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病因物質、デルタ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルスのサテライトを欠くと考えられる）の病原体、Ａ型以外、Ｂ型以外の肝炎（クラス１＝内部感染型；クラス２＝非経口感染型（すなわち、Ｃ型肝炎））；及びアストロウイルス）の病原体を含む。病原性であることが公知である、代表的細菌は、病原性のパスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌属）、アガラクチア菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌属）、連鎖球菌属（緑色連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ウシ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｃ）種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（例えば、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、及び腸管組織侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ））、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種（例えば、ラジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、及び放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉ）を含む。非限定的な病原性の真菌は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、及びスポロトリクス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）を含む。例示的な病原性の原虫、蠕虫は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、及び三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）などのプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）；トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）；ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）；ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）；クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などを含む。
[00193]細胞が、対象へと投与されると、Ｔ細胞の生物学的活性（例えば、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の増殖、細胞溶解活性、及び／又は抗腫瘍活性）は、多数の公知の方法のうちのいずれかにより測定されうる。評価するためのパラメータは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、例えば、イメージングによる、又はｅｘ ｖｉｖｏにおける、例えば、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによる、操作Ｔ細胞若しくは天然Ｔ細胞又は他の免疫細胞の、抗原への特異的結合を含む。ある特定の実施形態では、細胞が、標的細胞を破壊する能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、３２（７）：６８９～７０２（２００９）、及びＨｅｒｍａｎらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８５（１）：２５～４０（２００４）において記載されている細胞傷害作用アッセイなど、当技術分野で公知の、任意の適する方法を使用して測定されうる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－２、ＴＮＦ、及びＫｉ６７など、ある特定のタンパク質（すなわち、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカー）の発現及び／又は分泌についてアッセイすることにより測定されうる。生物学的活性はまた、又は代替的に、腫瘍量又は腫瘍負荷の低減などの臨床転帰を評価することによっても測定されうる。一部の態様では、毒性転帰、細胞の存続及び／若しくは拡大、及び／又は宿主免疫応答の存在若しくは非存在が評価される。
[00194]本開示に従い、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカーを検出するための、当技術分野で公知の、任意の方法が使用されうる。このような方法は、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、放射免疫アッセイ、ドットブロット法、免疫検出法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ又はＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法、ａｎｄＦＩＳＨ、及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
[00195]一部の実施形態では、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカーのうちの、任意の１つ又は複数は、試料において、タンパク質の発現により検出される。一部の実施形態では、タンパク質の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）により決定される。一部の実施形態では、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカーのうちの、任意の１つ又は複数は、バイオマーカーに特異的に結合する抗体を使用して検出される。
[00196]特定の実施形態では、対象における活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／又は細胞溶解活性の増強を、Ｔ細胞を投与する前と比較して検出及び／又は測定することにより評価される。ＩＦＮ－γは、例えば、細胞の固定、透過化、及びＩＦＮ－γに対する抗体による染色を伴う、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を含む、当技術分野で公知の任意の手段により測定されうる。細胞溶解活性は、例えば、エフェクター細胞と、標的細胞とを混合した細胞殺滅アッセイを使用する、当技術分野で公知の任意の手段により測定されうる。他の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２などのインターロイキンなどのサイトカインの放出が、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞のマーカーとして評価される。サイトカイン放出は、例えば、Ｔ細胞を含有する試料における、放出サイトカインの存在を検出するのに、ウェスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、又は免疫組織化学アッセイを使用する、当技術分野で公知の任意の手段により測定されうる。さらなる実施形態では、Ｔ細胞の増殖は、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率を決定することにより（例えば、ＦＡＣＳ解析により）検出される。一部の実施形態では、Ｔ細胞の増殖は、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率を決定することにより（例えば、ＦＡＣＳ解析により）検出される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、末梢血に由来する。他の実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍に由来する。
５．診断的使用
[00197]本明細書で裏付けられる通り、ＤＮＡＭ－１は、腫瘍環境におけるＴ細胞の免疫機能に重要であり、がんに抗する生存及びがん治療（例えば、免疫チェックポイント阻害剤療法）に対する応答性について予後診断的である。したがって、ＤＮＡＭ－１は、Ｔ細胞機能についてのバイオマーカーとして使用されうる。したがって、本開示はまた、対象から得られたＴ細胞における、ＤＮＡＭ－１の量若しくはレベル、及び／又は集団における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数若しくは百分率を決定することにより、対象の免疫機能、及び／又は対象におけるＴ細胞の免疫機能（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）を評価するための方法も提示する。本開示はまた、対象から得られたＴ細胞における、ＤＮＡＭ－１の発現レベル、対象から得られたＴ細胞における、ＤＮＡＭ－１の量若しくはレベル、及び／又は集団における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数若しくは百分率を決定することにより、対象が、がんに抗して生存する可能性、又はがんを伴う対象の生存時間を予測するための方法も提示する。また、対象から得られたＴ細胞における、ＤＮＡＭ－１の発現レベル、対象から得られたＴ細胞における、ＤＮＡＭ－１の量若しくはレベル、及び／又は集団における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数若しくは百分率を決定することにより、がんを伴う対象が、免疫チェックポイント阻害剤などによるがん治療に応答する可能性を予測するための方法も提供される。一部の実施形態では、表面ＤＮＡＭ－１レベルは、Ｔ細胞の免疫機能、がんに抗する生存、及び／又は治療に対する応答性についてのバイオマーカーとして使用される。特定の実施形態では、集団におけるＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数が評価され、バイオマーカー（例えば、表面ＤＮＡＭ－１について陽性であるＴ細胞の数又は百分率）として使用される。なおさらなる実施形態では、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数又は百分率、例えば、全ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する、腫瘍浸潤ＤＮＡＭ－１＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が評価される。さらなる実施形態では、ＤＮＡＭ－１の発現レベルは、がんに抗する生存についてのバイオマーカーとして使用される。
[00198]Ｔ細胞は、腫瘍などの組織試料、及び末梢血などの体液試料から適切に選択される、Ｔ細胞を含有する患者の試料から得られうる。一部の実施形態では、試料は、治療用組成物による処置の前、処置時、及び／又は処置の後に得られる。したがって、特定の実施形態では、方法は、処置時及び処置の後における、Ｔ細胞の免疫機能をモニタリングし、したがって、一部の例では、処置の有効性をモニタリングするのに使用されうる。一部の実施形態では、組織試料は、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された、アーカイブ試料であるか、採取したての試料であるか、又は凍結試料である。
[00199]ＤＮＡＭ－１又はＤＮＡＭ－１＋細胞のレベル又は量は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片、及び／又は遺伝子コピー数を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の、任意の適切な基準、に基づき、定性的及び／又は定量的に決定されうる。特定の実施形態では、Ｔ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の発現レベル、ＤＮＡＭ－１タンパク質の量、又はＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数は、定量的に評価される。一部の例では、Ｔ細胞におけるＤＮＡＭ－１の発現レベル、ＤＮＡＭ－１の量、又は対象に由来する試料における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織であり、ＤＮＡＭ－１レベルが、特定の表現型（例えば、免疫機能（例えば、有効な免疫機能、又は有効でない免疫機能若しくは損なわれた免疫機能）、治療に対する応答性（例えば、治療による完全奏効、部分奏効、又は非奏効）、又は生存時間（例えば、月数又は年数単位の））と相関することが公知である、第２の試料と比較される。他の例では、ＤＮＡＭ－１の発現レベル、Ｔ細胞におけるＤＮＡＭ－１の量、及び／又は対象に由来する試料における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数は、参照レベル／量／数と比較され、この場合、参照レベルは、特定の表現型と相関することが公知であるか、又は上回るか、若しくは下回ると、特定の表現型（例えば、免疫機能（例えば、有効な免疫機能、又は有効でない免疫機能若しくは損なわれた免疫機能）、治療に対する応答性（例えば、治療による完全奏効、部分奏効、又は非奏効）、又は生存時間（例えば、月数又は年数単位の））と相関することが公知であるカットオフである。試料におけるＤＮＡＭ－１又はＤＮＡＭ－１＋細胞のレベル又は量を、参照又は対照と比較することにより、例えば、免疫機能、治療に対する応答性、及び／又はがんに抗する生存についての評価がなされうる。例えば、免疫機能が評価されている場合、参照又は対照は、免疫機能が正常であるか、又は有効であることと相関する場合もあり、異常な免疫機能、有効でない免疫機能、又は損なわれた免疫機能と相関する場合もある。対象の免疫機能、及び／又は対象に由来する試料における、したがって、Ｔ細胞の免疫機能は、試料におけるＤＮＡＭ－１レベルを、ＤＮＡＭ－１のレベルが、Ｔ細胞の免疫機能との、公知の相関を有する、第２の試料におけるＤＮＡＭ－１レベルと比較することにより決定されうる。例えば、ある特定の実施形態では、対象試料におけるＤＮＡＭ－１のレベル／量は、第２の試料におけるレベル／量と比較して低下させられるか、又は低減される。第２の試料が、免疫機能が正常であるか、又は有効であることを表す場合、これと比較した、対象試料における、ＤＮＡＭ－１の低レベル／量は、対象試料におけるＴ細胞の、免疫機能が損なわれているか、免疫機能が異常であるか、又は免疫機能が有効ではないことを指し示し、拡張により、対象の、免疫機能が損なわれているか、免疫機能が異常であるか、又は免疫機能が有効ではないことを指し示す。他の実施形態では、対象試料におけるＤＮＡＭ－１のレベル／量は、第２の試料におけるレベル／量と比較して増大又は上昇させられる。第２の試料が、機能が損なわれているか、機能が異常であるか、又は機能が有効ではないことを表す場合、これと比較した、対象試料における、ＤＮＡＭ－１の高レベル／量は、対象試料におけるＴ細胞の、免疫機能が正常であるか、又は有効であることを指し示し、拡張により、対象の免疫機能が、正常であるか、又は有効であることを指し示す。第２の試料が、免疫機能が正常であるか、又は有効であることを表す場合、これと比較した、対象試料における、ＤＮＡＭ－１の高レベル／量は、対象試料におけるＴ細胞の、免疫機能が改善されているか、又は、特に、有効であることを指し示し、拡張により、対象の免疫機能が、改善されているか、又は、特に、有効であることを指し示しうる。さらなる実施形態では、対象の免疫機能、及び／又は対象に由来する試料における、Ｔ細胞の免疫機能は、試料におけるＤＮＡＭ－１レベルを、ＤＮＡＭ－１のレベルが、Ｔ細胞の免疫機能との、公知の相関を有する、第２の試料におけるＤＮＡＭ－１レベルと比較することにより決定される。例えば、ある特定の実施形態では、対象試料におけるＤＮＡＭ－１のレベル／量は、第２の試料におけるレベル／量と比較して低下させられるか、又は低減される。
[00200]一部の実施形態では、レベル又は量の増大又は上昇は、本明細書で記載される方法など、当技術分野で公知の標準的方法により検出される、ＤＮＡＭ－１のレベル又は量の、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織と比較した、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、又はこれを超える比率のうちのいずれかの全体的増大を指す。ある特定の実施形態では、量又はレベルの上昇は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織におけるＤＮＡＭ－１の発現レベル／量の、少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかである。
[00201]他の実施形態では、レベル又は量の低減は、本明細書で記載される方法など、当技術分野で公知の標準的方法により検出される、ＤＮＡＭ－１のレベル又は量の、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織と比較した、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれ未満の比率のうちのいずれかの全体的低減を指す。ある特定の実施形態では、レベル又は量の低減は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織におけるＤＮＡＭ－１の発現レベル／量の、少なくとも約０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、又は０．０１倍のうちのいずれかの低下を指す。
[00202]特定の実施形態では、集団における、ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞の数又は百分率が評価される。「ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞」は、検出可能なレベルのＤＮＡＭ－１、又は「陽性」結果を表すと考えられる所定のレベルを超えるレベルのＤＮＡＭ－１を、それらの表面において発現するＴ細胞である。一実施形態では、ＤＮＡＭ＋ ＣＤ＋ Ｔ細胞の数又は百分率、例えば、集団（例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞の集団）における、全ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する、ＤＮＡＭ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が決定される。
[00203]試料における、ＤＮＡＭ－１のレベル若しくは量、又はＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞の数は、多くが、当技術分野で公知である、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、免疫蛍光（ＩＦ）、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化させた細胞分取（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースのアッセイ（例として述べると、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素的活性アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザン解析、ノーザン解析、全ゲノムシーケンシング、定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ－ＰＣＲ」）を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、及び他の増幅型検出法（例えば、分枝状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ解析、遺伝子発現プロファイリング、並びに／又は「ＳＡＧＥ」（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のほか、タンパク質アレイ解析、遺伝子アレイ解析、及び／又は組織アレイ解析により実施されうる、多種多様なアッセイのうちのいずれか１つを含むがこれらに限定されない、多数の方法により解析され、当業者により理解されうる。特定の実施形態では、Ｔ細胞における、ＤＮＡＭ－１の表面発現は、ＦＡＣＳ、ＩＦ、又はＩＨＣにより検出及び／又は解析される。例えば、集団における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数又は百分率（例えば、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数又は百分率）が、ＦＡＣＳ、ＩＦ、又はＩＨＣにより、Ｔ細胞における、ＤＮＡＭ－１の表面発現を検出することにより評価される。理解されるであろうように、このような方法では、対象に由来する生物学的試料が、直接的に、又は間接的に標識化された（例えば、蛍光的に標識化された）抗ＤＮＡＭ－１抗体と接触され、次いで、表面においてＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞と、抗体との複合体の形成が検出される。さらなる実施形態では、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ８抗体を使用することなどにより、Ｔ細胞はまた、抗ＤＮＡＭ－１抗体との接触の前、接触時、又は接触の後にも標識化、選択、又は単離される。
[00204]方法が、がんを伴う対象の、免疫チェックポイント遮断剤などの治療に対する応答の可能性、又はがんに抗する生存時間を決定するのに使用される場合、対象は、任意のがんを有しうる。一部の例では、がんは、固形がん又は充実性腫瘍である。他の例では、がんは、白血病である。がんの非限定例は、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん及び消化器間質がんを含む胃がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、尿路がん、肝がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトロームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）のほか、母斑症と関連する、異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連する浮腫など）、メーグス症候群、脳がんのほか、頭頸部がん、及び関連する転移を含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体による処置に適するがんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝がん、膵がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫を含む。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、肺がん、乳がん、膀胱がん、腎細胞癌、肝がん、頭頸部がん、及び結腸直腸がんから選択される。
[00205]一部の例では、対象の免疫応答、がんに抗する生存、又はがん治療に対する応答性についての評価がなされたら、対象は、治療（例えば、養子細胞療法、化学療法（例えば、免疫チェックポイント阻害剤療法）、抗感染症治療、及び／又は上記で記載された、他の任意の治療）をさらに投与される。例えば、対象が、がん治療（例えば、免疫チェックポイント阻害剤療法などの免疫療法などの化学療法剤）に応答するか、又は特定の生存時間（任意の生存時間）を有する可能性が高いことが決定される場合は、対象に、がん治療（例えば、免疫チェックポイント阻害剤療法などの免疫療法などの化学療法剤）が投与されうる。対象が、がん治療に応答する可能性が低いか、又は免疫機能が損なわれていることが決定される場合は、対象に、上記の第４節で記載されたいずれかの治療など、免疫機能（Ｔ細胞機能を含む）及び／又は治療に対する応答性を増強するための治療が投与されうる。特定の実施形態では、対象は、本明細書で記載される、ＤＮＡＭ－１を発現するＴ細胞（内因性ＤＮＡＭ－１、組換えＤＮＡＭ－１、及び／又は改変ＤＮＡＭ－１を含む）を投与される。
[00206]本発明が、たやすく理解され、実施されうるために、以下の非限定例を目的として、特定の好ましい実施形態が記載される。
実施例１
材料及び方法
マウス
[00207]野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６を、Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入するか、又は自社で飼育した。Ｃ５７ＢＬ６ Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲｔｇ ＧＦＰマウス（Ｇｌｏｄｄｅら、２０１７）、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ２２６欠損（ＣＤ２２６ＫＯ）マウス（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら、２００８）、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ２２６ＫＯ Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲｔｇ ＧＦＰマウス、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ２２６Ｙ３１９Ｆ（ＣＤ２２６Ｙ）マウス（Ｚｈａｎｇら、２０１５）、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ２２６Ｙ Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲｔｇ ＧＦＰマウス、及びＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ１５５欠損（ＣＤ１５５ＫＯ）マウス（Ｌｉら、２０１８）を、自社で飼育し、ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで維持した。６週齢を超えるマウスを、適切なモデルと、性別をマッチさせた。各群の処置におけるマウスの数、又は各実験のためのマウス株を、図のキャプションに指し示す。全ての研究では、あらかじめ確立された基準に基づき、マウスを除外することはなく、無作為化は、治療実験における処置の直前に適用した。実験は、ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された通りに行った。
細胞株及び培養物
[00208]マウスＢ１６Ｆ１０（黒色腫）細胞（元は、ＡＴＣＣから得た）、Ｂ１６Ｆ１０ｃｔｒｌ細胞、Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ細胞（Ｌｉら、２０１８、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２８、２６１３～２６２５）、ＭＣ３８（結腸腺癌）細胞、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ細胞、ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ細胞（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら、２００８、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０５、２９６５～２９７３）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａの、Ｓｔｅｖｅｎ Ｌａｎｅ准教授の恵与による）、及びＲＭ－１（前立腺癌）細胞（Ｂｌａｋｅら、２０１６、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ、６、４４６～４５９）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｃｅｌｌ Ｓｅｒａ）、１％のグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）において増殖させた。マウスＬＷＴ１（黒色腫）（Ｆｅｒｒａｒｉ ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅら、２０１４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７４、７２９８～７３０８）細胞、及びＨＣｍｅｌ１２－ＰｍｅｌＫＯ－Ｔｙｒｐ１－Ｓｃａｒｌｅｔｔ－ｈｇｐ１００（ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００）（黒色腫）細胞（Ｅｆｆｅｒｎら、審査中）を、１０％のＦＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｅｒａ）、１％のグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）からなる、「完全ＲＰＭＩ培地」において培養した。ＣＨＯ由来細胞株を、４％のグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び２％のヒポキサンチン、チミジン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補充された、ＣＨＯ完全培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において培養した。Ｂ１６Ｆ１０細胞株及びそのバリアント、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００細胞株、ＲＭ－１細胞株、並びにＬＷＴ１細胞株を、５％のＣＯ２、３７℃で維持した。全てのＭＣ３８由来細胞株を、１０％のＣＯ２、３７℃で維持した。ＣＨＯ由来細胞株を、８％のＣＯ２、３７℃、１２５ｒｐｍで維持した。内因性ｇｐ１００を欠き、チロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子座へとタグ付けされたヒトｇｐ１００エピトープを発現するＨＣｍｅｌ１２細胞株を、既に記載されている通りに（Ｅｆｆｅｒｎら、審査中）作出した。注入手順及びモニタリング手順は、かつての研究（Ｇｌｏｄｄｅら、２０１７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４７、７８９～８０２ ｅ７８９；Ｌｉら、２０１８、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２８、２６１３～２６２５）において記載した。全ての細胞株は、定期的にマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）検査を行い陰性であったが、定期的な細胞株認証は実施しなかった。
初代細胞培養物
[00209]ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために、マウスの脾臓から単離した、骨髄細胞及び／又はＴ細胞の、単一細胞懸濁液を、５％のＣＯ２、３７℃下の、１ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及び５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を加えて補充した、「完全ＲＰＭＩ培地」（上記で記載した）において培養した。
ＣＨＯ－ＯＫＴ３過剰発現細胞及びＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＣＤ１５５過剰発現細胞の作出
[00210]ヒトＰＶＲ（ＮＭ＿００６５０５、ＮＰ＿００６４９６）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＲＤＣ１２８９から、ｐＬｅｎｔｉ－ＥＦ１ａ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）へとサブクローニングした。製造元の指示書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従い、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｈｏｔ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して、レンチウイルスを作製した。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ；５μｇ／ｍｌ）により、ＣＨＯ－ＯＫＴ３（サブクローン２Ｅ５；Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）細胞に形質導入し、ＣＤ１５５の発現について、細胞を分取した。
ＣＲＩＳＰｉｔｏｐｅ操作細胞株（Ｈｃｍｅｌ１２ｈｇｐ１００）の作出
[00211]ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００細胞株を、既に記載されている通りに（Ｅｆｆｅｒｎら、審査中）作出した。略述すると、ターゲティングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により、ＨＣｍｅｌ１２黒色腫細胞における、Ｐｍｅｌ遺伝子の、安定的ノックアウトをもたらした。ＨＣｍｅｌ１２細胞に、マウスＰｍｅｌ遺伝子のエクソン１における、ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞エピトープをコードするゲノム領域の上流をターゲティングする、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをコードするｐｘ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳＰＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ型番：４２２３０）プラスミドをトランスフェクトした。Ｐｍｅｌノックアウト単一細胞クローンのゲノム異常を、次世代シーケンシングにより特徴づけ、ウェブツールであるＯｕｔＫｎｏｃｋｅｒ（Ｓｃｈｍｉｄ－Ｂｕｒｇｋら、２０１４、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、２４、１７１９～１７２３）を使用して解析した。プラスミドである、ｐｘ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳＰＣａｓ９を、標的セレクターとして使用した。所望の標的遺伝子のＣ末端をターゲティングする、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＢｂｓＩで消化されたｐｘ３３０へとクローニングして、機能的ｓｇＲＮＡを作出した。フレームセレクターである、ｐＣＡＳ９－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｆｒａｍｅ ＋０、ｐＣＡＳ９－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｆｒａｍｅ ＋１及びｐＣＡＳ９－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｆｒａｍｅ ＋２は、Ｖｅｉｔ Ｈｏｒｎｕｎｇ氏（ＬＭＵ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍｍａｎｙ；Ａｄｄｇｅｎｅ型番：６６９３９、６６９４０、及び６６９４１）から恵与された。ユニバーサルのドナープラスミドを、既に記載されている通りに（Ｓｃｈｍｉｄ－Ｂｕｒｇｋら、２０１６、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、７、１２３３８）、ｐＣＲＩＳＰａｉｎｔ－ｍＮｅｏｎ－ＰｕｒｏＲプラスミドに基づきクローニングした。ユニバーサルのドナーである、ｐＣＲＩＳＰａｉｎｔ－ｍＮｅｏｎ－ＰｕｒｏＲは、Ｖｅｉｔ Ｈｏｒｎｕｎｇ氏（ＬＭＵ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍｍａｎｙ）から恵与された。分子クローニング法を使用した、ｐＣＲＩＳＰａｉｎｔ－ｍＮｅｏｎ－ＰｕｒｏＲプラスミドを、（１）ピューロマイシン耐性カセットの、ブラストサイジン耐性カセットによる交換、（２）ゲノムへのランダムの組込みからの転写を防止するための、耐性カセットのメチオニン開始コドン（ＡＴＧ）の、グリシン（ＧＧＧ）による交換、（３）ｍＮｅｏｎ蛍光タンパク質の、ｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光タンパク質による交換、及び（４）ＦＬＡＧタグ及びヒトｇｐ１００エピトープ（アミノ酸２５－３３）の、蛍光タンパク質（Ｃ末端）への付加によりさらに改変した。エピトープのＣＲＩＳＰＲ支援型挿入により、Ｐｍｅｌ遺伝子のＣ末端をターゲティングすることにより、ＣＲＩＳＰｉｔｏｐｅにより操作されたＨＣｍｅｌ１２黒色腫細胞を作出した。ＣＲＩＳＰｉｔｏｐｅプラスミドによるトランスフェクションのために、ＨＣｍｅｌ１２－ｇｐ１００ノックアウト細胞５０，０００～１００，０００個を、９６ウェルプレートに播種し、製造元の指示書に従い、０．６μｌのＦｕ遺伝子トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、２００ｎｇのＤＮＡ（５０ｎｇの標的セレクター、５０ｎｇのフレームセレクター、及び１００ｎｇのユニバーサルドナー）をトランスフェクトした。選択の後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）を使用して、ＣＲＩＳＰｉｔｏｐｅ操作細胞株を、ｍＳｃａｒｌｅｔの発現について分取し、その後、個々の細胞株のポリクローナル培養物を確立した。
腫瘍の移植
[00212]同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホートに、１００～２００μｌのＰＢＳにおける、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞１×１０５個、ＭＣ３８結腸腺癌細胞１×１０５若しくは１×１０６個、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００細胞２×１０５個、又はＭＣ３８ＯＶＡｄｉｍ細胞、ＭＣ３８ＯＶＡｂｒｉｇｈｔ細胞、又はＭＣＡ１９５６線維肉腫細胞１×１０６個を、マウスの脇腹後部へと皮下（ｓ．ｃ．）注入した。腫瘍サイズは、指し示される通りに測定し、電子キャリパーを使用して、２つの直交する測定値の平均値としてミリメートル単位で記録した。腫瘍の面積は、式：Ａ＝長さ×幅を使用して、ｍｍ２単位で計算した。そうでないことが言明されない限りにおいて、１５０ｍｍ２を超える腫瘍を伴うマウスは屠殺した。実験は、４匹又はこれを超えるマウスの群において実施した。
ＭＣＡ誘導発癌
[00213]３－メチルコラントレン（ＭＣＡ；Ｓｉｇｍａ）による、発癌物質誘導線維肉腫のために、表示の遺伝子型の雄マウスに、１００μＬ滅菌トウモロコシ油における、５μｇ又は２５μｇのＭＣＡを皮下注入し、線維肉腫の発生についてモニタリングした。
実験による転移
[00214]一次転移のために、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫（細胞１×１０５個）、ＬＷＴ１黒色腫（細胞５×１０５個）、又はＲＭ－１前立腺癌（細胞１×１０４個）を、静脈内注入した。転移量は、既に記載されている通り（Ｂｌａｋｅら、２０１６、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ、６、４４６～４５９）、１４日後に、肺において、肺表面のコロニーをカウントすることにより定量した。
Ｖｋ＊ＭＹＣ骨髄腫移植モデル
[00215]移植用のＶｋ＊ＭＹＣ骨髄腫細胞株である、Ｖｋ１２５９８を、既に記載されている通りに（Ｎａｋａｍｕｒａら、２０１８、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、３３、６３４～６４８ ｅ６３５）、維持及び拡大した。Ｖｋ１２５９８ ＭＭ細胞（５×１０５個）を、表示の遺伝子型のマウスの尾静脈へと、ｉ．ｖ．注入した。生存は、施設の倫理ガイドラインに従い、毎日モニタリングし、マウスは、麻痺及び運動低減の徴候を発症したら、安楽死させた。
免疫チェックポイント遮断
[00216]ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍について、腫瘍細胞のｓ．ｃ．注入後１０、１４、１８、及び２２日目に、１００μｌのＰＢＳにおける、２５０μｇのラット抗マウスＰＤ－１ ＩｇＧ２ａ（クローンＲＭＰ１－１４；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、又はラット対照ＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（クローン１－１；Ｌｅｉｎｃｏ）のｉ．ｐ．注射により、ＰＤ－１の治療的遮断を実施した。Ｂ１６Ｆ１０について、腫瘍細胞のｓ．ｃ．注入後６、９、１２、及び１５日目に、１００μｌのＰＢＳにおける、２５０μｇのラット抗マウスＰＤ－１ ＩｇＧ２ａ（クローンＲＭＰ１－１４；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、及び２５０μｇのハムスター抗マウスＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ（クローンＵＣ１０－４Ｆ１０－１１；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、又はラット対照ＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（クローン１－１；Ｌｅｉｎｃｏ）、及び対照ハムスターＩｇＧ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のそれぞれのｉ．ｐ．注射を使用して、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の治療的遮断を実施した。
養子Ｔ細胞免疫療法
[00217]ＡＣＴ免疫療法を、わずかな改変を伴うが、既に記載されている通りに（Ｇｌｏｄｄｅら、２０１７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４７、７８９～８０２）実施した。略述すると、移植されたＢ１６Ｆ１０黒色腫が、直径＞５ｍｍのサイズに達したら、抗ＣＤ１３７抗体（３日ごと、１００ｍｌのＰＢＳにおける、１００μｇのｉ．ｐ．ラット抗マウスＣＤ１３７；クローン３Ｈ３；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）で、２週間にわたり処理された、Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲトランスジェニックマウスの脾臓から単離されたｇｐ１００特異的ＣＤ９０．１＋ＣＤ８＋ＤＮＡＭ－１＋Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＤＮＡＭ－１－Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞０．５×１０６個（２００μｌのＰＢＳにおける）の静脈内送達の１日前に、１００μｌのＰＢＳにおける、２ｍｇ（１００ｍｇ／ｋｇ）のシクロホスファミドの、単回ｉ．ｐ．注射により、マウスを、ＡＣＴのために条件付けした。１００μｌのＰＢＳにおける、５×１０８ＰＦＵの組換えアデノウイルスベクターである、Ａｄ－ｇｐ１００の、ｉｎ ｖｉｖｏ単回ｉ．ｐ．注射により、養子移入されたＴ細胞を活性化させた。１００μｌの生理食塩液における、５０μｇのＣｐＧ １８２６（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び５０μｇのポリイノシン酸：ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、養子Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞移入の３、６、及び９日後において、腫瘍周囲に注入した。
組織の処理
[00218]標準的プロトコールを使用して、腫瘍及び末梢リンパ系組織を処理した。略述すると、腫瘍又はリンパ系臓器を、マウスから摘出し、製造元の指示書に従い、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、これを解離させるのに続き、３７℃で、「完全ＲＰＭＩ培地」における、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）を伴うインキュベーションを行った。３０～４５分後、組織を、７０μｍの細胞ストレーナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に通し、さらに解析した。
フローサイトメトリー
[00219]マウスを屠殺し、臓器を摘出し、既に記載されている通りに（Ｇａｏら、Ｇｌｏｄｄｅら）、フローサイトメトリーのために調製した。多様な臓器に由来する、単一細胞懸濁液を、氷上のＦｃ遮断緩衝液（２％のＦＢＳ及び抗ＣＤ１６／３２（クローン２．４Ｇ２；ＡＴＣＣから得られるハイブリドーマ）を含有するＰＢＳ）において、１５分間にわたりインキュベートした。以下のエピトープをターゲティングする、試薬又は抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した：ＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ８（５３－６．７）、ＣＤ９０．１（ＯＸ－７）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、Ｖｂ１３（ＭＲ１２－３）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、ＤＮＡＭ－１（１０Ｅ５）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）、ＴＩＧＩＴ（１Ｇ９）、ＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７）、ＴＮＦ（ＭＰ６－ＸＴ２２０）、Ｚｏｍｂｉｅ Ｙｅｌｌｏｗ、又はＡｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット。以下のエピトープをターゲティングする、試薬又は抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した：ＣＤ４５．２（１０４）及びＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７）。以下のエピトープをターゲティングする、試薬又は抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した：ＰＤ－１（Ｊ４３）及びＫｉ６７（Ｂ５６）。ＯＶＡ四量体（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）は、ＤＭＩ／ＰＤＩ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｅｌｂｏｕｒｎｅのＡｎｄｒｅｗ Ｂｒｏｏｋｓ教授から購入した。四量体化のために、単量体：ＳＡ－ＡＰＣ比が、１：１．７に達するまで、１０～１５分間ごと、６回にわたり、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）を添加した。アセンブルされた四量体は、１週間以内に使用した。氷上で、３０分間にわたり、四量体染色を実施した。細胞数は、ＢＤ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することにより計算した。細胞内サイトカイン検出のために、リンパ球エンリッチ腫瘍ホモジネートを、３７℃で、４時間にわたり、１０％のＦＣＳ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ＋タンパク質輸送阻害剤（刺激細胞）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、又はＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及びＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（非刺激対照細胞）（いずれも、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を補充されたＲＰＭＩ－１６４０においてインキュベートした。細胞表面染色の後、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、試料を、固定及び透過化し、１倍濃度の透過化緩衝液において、抗体で染色した。核内染色のために、単一細胞懸濁液を、前述の通り、細胞表面抗原に対する抗体で染色し、ＦｏｘＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）を使用して、固定及び透過化するのに続き、核内染色を行った。細胞は、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、又はＣｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ（３レーザー型）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｃｙｔｅｋ）において捕捉した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して、解析を実行した。表示の数に適切なダウンサンプリングの後、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０．２において、連結試料についてのｔＳＮＥ解析を実施し、Ｒベースの「ｔＳＮＥプロット」スクリプトを、視覚化のために使用した。
細胞の分取
[00220]ＤＮＡＭ－１＋ｐｍｅｌ－１Ｔ細胞、又はＤＮＡＭ－１－ｐｍｅｌ－１Ｔ細胞を、抗ＣＤ１３７処理（３日ごと、１００μｇのｉ．ｐ）の２週間後に、ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲトランスジェニックマウスの脾臓から単離し、ＣＤ８、ＣＤ９０．１、及びＤＮＡＭ－１に対する抗体で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。
マウスＴ細胞刺激アッセイ
[00221]マウスＴ細胞を活性化させるために、脾臓細胞、又は、適応の場合、ＭＡＣＳ分離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（クローン１４５－２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ；ウェル１つ当たり５０～１００～２５０ｎｇである、１～２～５μｇ／ｍｌ）＋可溶性抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ；１～２μｇ／ｍｌ）をプレートに結合させた、平底９６ウェルプレートにおいて、１ｍｌ当たりの細胞０．５～２×１０６個で活性化させた。一部の実験では、プレートに結合させたＣＤ１５５－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、又は関連性がないヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を、ウェル１つ当たり０．３μｇで存在させた。プレートへの、抗体／タンパク質の結合は、ＰＢＳにおいて、４度で、一晩にわたり実施し、ウェルは、実験の直前に、ＰＢＳで洗浄した。
ＣＤ２２６の内部化
[00222]製造元のプロトコールに従い、ＭＡＣＳ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、表示の遺伝子型のＣＤ８＋Ｔ細胞を、脾臓の単一細胞懸濁液から単離した。単離の後、細胞を、１ｍｌ当たりの細胞１～２×１０６個の濃度で、２０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を補充した「完全ＲＰＭＩ培地」における、可溶性抗ＣＤ３（クローン１４５－２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ；１μｇ／ｍｌ）抗体、及び可溶性抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ；１μｇ／ｍｌ）抗体により、４８時間にわたり刺激した。次いで、細胞を、ｈＩｇＧ１（ＩｇＧ；ＢｉｏＸｃｅｌｌ；ウェル１つ当たり０．３μｇ）、又はヒトＩｇＧ１のカルボキシ末端のＦｃ領域へと融合した組換えｍＣＤ１５５（ＣＤ１５５－Ｆｃ；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；ウェル１つ当たり０．３μｇ）により、４℃で、一晩にわたりコーティングされた平底９６ウェルプレートに播種した。５％のＣＯ２、３７℃で、１時間にわたるインキュベーションの後、細胞を採取し、ＣＤ８＋（ＢＶ４２１；クローン５３－６．７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）、及びＣＤ２２６（ＡＦ６４７；クローン１０Ｅ５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）について表面染色するのに続き、ＣＤ２２６（ＰＥ；クローン４８０．１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）の、固定、透過化、及び細胞内染色を行った。次いで、速やかに、細胞を、４レーザー、１２チャネル式のＡｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ ＭｋＩＩ（Ａｍｎｉｓ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）において、拡大率を６０倍として、低速度で捕捉した。ＩＤＥＡＳソフトウェア（Ａｍｎｉｓ）を使用して、データ解析を実施した。解析のためのゲーティング戦略は、「エネルギー勾配の二乗平均平方根」に基づき、焦点の合った細胞の選択を伴う。「アスペクト比」が高値であり、「面積」が低値である細胞は、シングレットである可能性が高いので、これらを選択し、ＣＤ８＋（ＢＶ４２１）細胞に対してサブゲートをかけた。最後に、品質が良好であり、焦点が合い、中心化された細胞を選択し、群１つ当たりの細胞少なくとも１００個について解析した。
免疫学的シナプス形成の解析
[00223]シナプス形成アッセイを、わずかな改変を伴うが、既に記載されている通りに（Ｍａｒｋｅｙら、２０１５、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、４２３、４０～４４）実施した。骨髄由来樹状細胞は、表示の遺伝子型を有する、屠殺されたマウスの後肢に由来する長骨を洗い出すことにより調製した。細胞を、１ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ－ＣＳＦを補充した「完全ＲＰＭＩ培地」において、１ｍｌ当たりの細胞１～３×１０６個で播種した。３～４日後、非接着細胞を回収し、さらに培養した。実験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化の少なくとも７日後に実施した。アッセイの前日に、ＢＭＤＣを採取し、製造元の指示書に従い、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、一晩にわたり標識し、１μｇ／ｍｌのＨ２－Ｄｂ結合性ペプチドである、ｈｇｐ１００２５－３３ペプチド（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ；Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）で、ペプチドローディングした。同じ日に、製造元の指示書に従い、ＭＡＣＳ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、表示の遺伝子型を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を、脾臓の単一細胞懸濁液から単離し、１０～２０ＵのｈＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）において、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個で播種した。翌日、Ｔ細胞を採取し、製造元のプロトコールに従い、ＣＦＳＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）で標識化した。次いで、ＢＭＤＣと、Ｔ細胞とを、Ｔ：ＤＣ比を、１：２として、５％のＣＯ２、３７℃で、１時間にわたり共培養した。インキュベーション時間の終了時に、細胞を、室温で、３倍容量の１．５％パラホルムアルデヒドにより固定するのに続き、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｅｒａ）を含むＰＢＳ中において抗Ｄ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２；自社製）の存在下でＬＦＡ－１（ＰＥ－Ｃｙ７；クローンＨ１５５－７８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）の表面染色を行った。表面染色の後、細胞を洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ）１００μＬを使用して透過化した。３μＬのファロイジン（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、各試料へと添加し、細胞を、室温で、３０分間にわたりインキュベートした。全染色過程において、確立されたシナプス形成を維持するように、細胞は、極めて注意深く処理し、ボルテクシング、完全な再懸濁、又はＥＤＴＡを、意図的に回避した。染色時間の終了時に、細胞を洗浄し、速やかに、４レーザー、１２チャネル式のＡｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸＭｋＩＩ（Ａｍｎｉｓ）において、拡大率を６０倍として、低速度で捕捉した。ＩＤＥＡＳソフトウェア（Ａｍｎｉｓ）を使用して、データ解析を実施した。解析のためのゲーティング戦略は、「エネルギー勾配の二乗平均平方根」に基づき、焦点の合った細胞の選択を伴う。「アスペクト比」が中間値であり、「面積」が中間値である細胞は、ダブレットである可能性が高いので、これらを選択した。本発明者らは、二重陽性ＣＴＶ＋及びＣＦＳＥ＋「イベント」にサブゲートをかけた。最後に、品質が良好であり、焦点が合い、中心化された細胞を選択し、群１つ当たりのシナプス少なくとも４０個について解析した。次いで、インターフェースマスクを適用し、Ｔ細胞を、目的の標的として規定した。インターフェースマスク内の、ＬＦＡ－１及びファロイジンの蛍光強度を、免疫学的シナプスの強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ及びｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）についてのサロゲートマーカーとして用いる。統計学的有意性は、ノンパラメトリックの一元ＡＮＯＶＡを使用して決定した。
レトロウイルスによる、マウスＴ細胞への形質導入
[00224]全長マウスＣＤ２２６ ｃＤＮＡ配列を合成し、ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミド（ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａの、Ｓｔｅｖｅｎ Ｌａｎｅ准教授の恵与による；Ａｄｄｇｅｎｅ型番：２０６７２）へと、個別にクローニングした（ＢｉｏＭａｔｉｋ）。レトロウイルスの作出のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍのディッシュに、ディッシュ１枚当たりの細胞４×１０６個の濃度で、一晩にわたり播種した。翌日、パッケージングプラスミドであるｐＣＬ－Ｅｃｏ（ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａの、Ｓｔｅｖｅｎ Ｌａｎｅ准教授の恵与による）、及びＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－Ｍｏｃｋ又はＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－ＣＤ２２６ ＷＴ－ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈをコードするプラスミドを、製造元のプロトコールに従い、Ｆｕ遺伝子６（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、Ｆｕ遺伝子：ＤＮＡ比を３：１として混合し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと、一晩にわたり適用した。次いで、培地を置きかえ、４８時間後に、ウイルス上清を、２回にわたり回収した。ウイルスを濃縮するために、レトロウイルス上清を、１７，０００ｇで、２～６時間にわたりスピニングし、速やかに、－８０℃で保管した。形質導入のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ株式会社）と、ウイルス上清とのｖｏｌ／ｖｏｌ比を、１：１として、一晩にわたりコーティングされた６ウェルプレートに、ウェル１つ当たり１～３×１０６個で播種し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加した。スピンフェクションを、３０℃、加速又は減速を伴わない２０００ｇで、２時間にわたり実施した。２～４時間後に、培地を置きかえた。一部の実験では、２４時間後に、スピンフェクションを反復した。細胞を、１００ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及び２ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）において維持し、実験及びＡＣＴにおいて使用されるまで、純度について点検した。
サイトカインビーズアレイ
[00225]腫瘍の単一細胞懸濁液を、等容量の「完全ＲＰＭＩ培地」に再懸濁し、５％のＣＯ２、３７℃で、４～５時間にわたり、インキュベートするのに続き、上清を回収した。上清は、製造元のプロトコールを使用する、サイトカインビーズアレイ（ＢＤ）を使用する解析まで、－８０℃で保管した。
ヒトＴ細胞刺激アッセイ
[00226]ＰＢＭＣを融解させ、培養の前に、ＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理して、死細胞を除去した。１×１０５個のＰＢＭＣを、Ｕ字底９６ウェルプレートに、２００ｍｌの容量の、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％のＦＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｅｒａ）において培養した。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズ２×１０５個（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより達成した。培養物は、５％のＣ０２、３７℃でインキュベートした。培養時間が終了したら、細胞を、表面マーカーについて染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
人工ＡＰＣを使用する、ヒトＣＤ２２６－ＣＤ１５５間相互作用
[00227]Ｆｉｃｏｌｌにより処理され、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を使用して、ヒト健常血液からエンリッチされたＣＤ３＋Ｔ細胞を、ウェル１つ当たりの細胞１×１０５個で、Ｕ字底９６ウェルプレートへと播種した。ＯＫＴ３単一発現ＣＨＯ細胞、又はＯＫＴ３／ＣＤ１５５二重発現ＣＨＯ細胞５×１０４個を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ１５５を、ヒトＴ細胞へと提示した。共培養されたＴ細胞を採取し、各時点に、ＰＢＳにおいて２％のＰＦＡを使用して固定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、あらかじめ活性化させるために、調製されたＴ細胞を、２５μｌ／ｍｌの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８四量体抗体（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び８０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充した「完全ＲＰＭＩ培地」において、７～１０日間にわたり培養した。ＣＤ１５５を遮断するために、滴定された抗ヒトＣＤ１５５抗体（クローンＳＫＩＩ．４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｅｄ）を、ヒトＴ細胞との共培養の前に、ＣＨＯ細胞と共に、表示の投与量で、３０分間にわたりプレインキュベートした。
患者及び検体
[00228]ヒトの参加者を伴う、全ての手順は、ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＲＥＣ）（ＥＣ００２７８）、及びＲｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＨＲＥＣ（ＥＣ００１７２）の両方による承認を受け、本研究は、ヘルシンキ宣言に準拠した。全ての組織試料及び血液試料は、参加する病院／研究機関のＨｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる手順及びガイドラインに従い、説明同意文書を得た後で回収した。
ＨＮＳＣＣ検体
[00229]ＨＮＳＣＣ検体は、Ｍｅｔｒｏ Ｎｏｒｔｈ ＨＨＳ、Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａから恵与された。いずれも、製造元のプロトコールに従い、組織解離プラットフォーム（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含む、市販のＴｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、新鮮な試料を処理した。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、腫瘍切出し時に患者から採取された血液試料から単離した。次いで、ＰＢＭＣ及び腫瘍の単一細胞懸濁液を、さらなる使用まで低温保存した。低温保存試料を融解させ、１０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ １６４０においてインキュベートし、３７℃で、１時間にわたりインキュベートして、凝集及び破砕物を消失させた。使用したＴ細胞刺激剤は、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％のＦＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｅｒａ）において、ウェル１つ当たりの細胞およそ２×１０５個の、５μｌの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、フローサイトメトリーのための染色の前に、５％のＣＯ２、３７℃で、４時間にわたり培養した。
黒色腫の検体
[00230]Ｘ線撮影により、病期ＩＶ（ＡＪＣＣ）の非リンパ系黒色腫が確認された、処置前患者に由来する、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋（ＦＦＰＥ）された、アーカイブ組織検体を、Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＭＩＡ）から、腫瘍のコア及び腫瘍の縁辺部に由来する組織マイクロアレイとして得た。患者についての人口学的解析、及び免疫療法による介入を、表２に列挙する。全ての患者は、２０１５年１月～２０１８年５月の間に、ＰＤ１ベースの免疫療法を施され、施設の規則に従い、試料の使用についての説明同意文書を提出した。免疫療法で処置される、全ての患者からの病理学報告を精査した。解析に十分なＦＦＰＥアーカイブ組織及び臨床注釈が存在する場合は、症例を、組入れのために選択した。
Figure 2022521541000013
ヒトＣＤ１５５についての免疫組織化学染色
[00231]ＴＭＡを、スーパーフロストプラススライドガラスにおいて、３μｍで切片化し、ＩＨＣを実施するまで、真空下で保管した。スライドを、６５℃で、２０分間にわたり脱水し、キシレンにおいて脱パラフィン化し、エタノール系列において再水和させた。抗原賦活化を、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）のＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）において、１００℃で、２０分間にわたり実施した。ＩＨＣを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ－Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）において実施した。１：１００希釈液を使用して、ＣＤ１５５（Ｄ３Ｇ７Ｈ；ＣＳＴ）に対する抗ヒト一次ウサギ抗体を、室温で、４５分間にわたりインキュベートし、製造元の指示書に従い、ＭＡＣＨ３ Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰポリマー検出システム（Ｂｉｏｃａｒｅ）、及びＤＡＢ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎキット（Ｂｉｏｃａｒｅ）を使用して視覚化した。スライドを、希釈されたヘマトキシリンで対比染色した。次いで、ＣＤ１５５を、膜陽性腫瘍細胞の百分率として査定し、免疫組織化学シグナルの最大強度を記録した。Ｈスコア法を使用して、ＣＤ１５５の発現を割り当て、以下：低（０～９９）、又は高（２００～３００）の通りに類別した。
マルチプレックス免疫組織蛍光（ｍＩＨＦ）染色
[00232]上記で言及したＴＭＡ及び多重スペクトル蛍光イメージングを使用して、本発明者らは、黒色腫試料のＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の発現を定量した。ＳＯＸ１０を使用して、黒色腫細胞を同定し、ＤＡＰＩを、核染色として使用した。検体を、４μｍで、スーパーフロストプラス顕微鏡スライドへと切片化し、ｍＩＨＦを実施するまで、真空下で保管した。Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒを使用して、ＥＤＴＡ標的賦活化緩衝液（ＤＡＫＯ）による熱誘導抗原賦活化を、１００℃で、２０分間にわたり実施し、Ｔｗｅｅｎ ２０を伴うトリス緩衝生理食塩液溶液（ＴＢＳ－Ｔ）（ｐＨ７．６）において洗浄した。染色は、自動式組織染色機（ＤＡＫＯ）において行った。既に結合させた抗体／ＨＲＰ複合体を除去するのに、逐次的な染色ラウンドの間で、ＥＤＴＡ緩衝液を使用し、１００℃で２０分間にわたる加熱を伴い、製造元の指示書に従い、ＯＰＡＬマルチプレックスＴＳＡ検出システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、一次抗体を視覚化した。一次抗体を、Ｖａｎ Ｇｏｇｈ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ）において希釈し、３０分間にわたり、インキュベートするのに続き、２ステップのポリマー－ＨＲＰ検出システム（Ｂｉｏｃａｒｅ）にかけ、次いで、ＴＳＡベースのフルオロフォア（Ｏｐａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐａｃｋ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識付けした。以下の一次抗体／クローン：ＣＤ８／１４４ｂ（１：１０００；Ｏｐａｌ５７０）、ＣＤ２２６／１０２（１：５００；Ｏｐａｌ５２０）、及びＳＯＸ１０／ＢＣ３４（１：５００；Ｏｐａｌ６９０）を、括弧内に列挙された、抗体希釈液及びＯｐａｌフルオロフォアと共に、列挙された順序で、逐次的に使用した。
マルチプレックスのＩＨＦ画像収集及び解析
[00233]Ｖｅｃｔｒａイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蛍光染色スライドを走査した。混合蛍光に続き、２０×の多重スペクトルイメージングを使用して、全スライドスキャニングを、４倍の拡大率で行った。画像を、スペクトル分割するのに続き、Ｉｎｆｏｒｍ解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；ｖ２．２．１）を使用して、組織及び細胞のセグメント化を行った。融合されたデータファイルを加工し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ画像マッピングツール（Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ａｎａｌｙｓｔ；ｖ７．６．１）を使用して、蛍光閾値を設定するのに続き、Ｓｐｏｔｆｉｒｅを使用して、セグメント化された細胞をカウントした。「低ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋／ＣＤ８＋」と対比した「高ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋／ＣＤ８＋」又は「低ＣＤ８＋」と対比した「高ＣＤ８＋」への、患者の層別化は、「Ｃｕｔｏｆｆ Ｆｉｎｄｅｒ」ツール（Ｂｕｄｃｚｉｅｓら、２０１２、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、７、ｅ５１８６２）を使用して決定した。
ヒトＰＢＭＣについての遺伝子発現解析
[00234]健常ドナーから単離されたＰＢＭＣを、ウェル１つ当たりの細胞０．５×１０６個で、４８ウェルプレートへと播種した。細胞を、アイソタイプ対照（ＭＯＰＣ－２１マウスＩｇＧ１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；１μｇ／ｍｌ）、又は抗ＣＤ２２６（クローンＤＸ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；１μｇ／ｍｌ）の存在下で、最適未満濃度の抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、２００ｐｇ／ｍｌ）を伴うか、又は伴わずに、４８時間にわたり刺激した。刺激された細胞を採取し、３５０μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に再懸濁した。溶解させた細胞は、速やかに凍結させ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ解析のために、Ｃｏｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へと送付した。
がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）によるトランスクリプトーム解析
[00235]ＴＧＣＡがんコホートの遺伝子発現データ（ＲＮＡ－ｓｅｑ）にアクセスし、Ｒベースのパッケージである、ＣＧＤＳ－Ｒ及びＴＣＧＡｂｉｏｌｉｎｋｓを使用する、ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）を介して解析した。ＴＣＧＡデータ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の使用についてのガイドラインに従った。本発明者らは、ＲＰＫＭ正規化リードカウントとして、目的の遺伝子についての個々の遺伝子発現値を読み出した。
移動平均解析
[00236]移動平均解析を、既に公表されている（Ｇｌｏｄｄｅら、２０１７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４７、７８９～８０２ ｅ７８９；Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇら、２０１５、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、６、８７５５）通りに実施した。１未満のＲＰＫＭ値は、ｌｏｇ２変換時において、負の発現値を回避するために、１とした。平均化されたＣＤ２２６の発現値が増加するように、試料を順序づけた。ｎ＝２０の試料ウィンドウサイズを使用して、腫瘍組織における、ＣＤ８Ｂ、ＮＣＡＭ、ＩＦＮＧ、ＰＶＲ、ＧＺＭＢ、及びＮＥＣＴＩＮ２の遺伝子発現の移動平均を計算し、それぞれの有色の傾向線を、棒グラフに付加した。ノンパラメトリックのスピアマンランク相関の有意性は、元のｌｏｇ２発現値を使用する、漸近的スピアマン相関検定により決定した。
統計学的解析
[00237]統計学的解析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７及び８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により決定した。そうでないことが言明されない限り、２つの群の比較には、スチューデントのｔ検定を使用し、多重群の比較には、多重比較のための事後チューキー検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡを使用した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験の有意性は、カプラン－マイヤー生存解析のためのログランク（マンテル－コックス）検定、又は多重比較のための事後チューキー検定を伴う、二元ＡＮＯＶＡにより計算した。フィッシャーの正確検定を使用して、無腫瘍マウスの比率の有意性を決定した。群間差は、平均値±ＳＤとして示す。０．０５未満のＰ値を、統計学的に有意であると考えた。ｐ＜０．０５＝＊；ｐ＜０．０１＝＊＊；ｐ＜０．００１＝＊＊＊；ｐ＜０．０００１＝＊＊＊＊である。
実施例２
ＤＮＡＭ－１欠損マウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞媒介性応答
[00238]他の大半の活性化受容体と対照的に、ＤＮＡＭ－１（又はＣＤ２２６）は、マウスのナイーブ（ＴＮ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びセントラルメモリー（ＴＣＭ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞において、均一に発現されるが、ごく小比率のエフェクターメモリー（ＴＥＭ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＤＮＡＭ－１陰性であることが見出された（データは示さない）。しかし、脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が刺激されると、ＣＤ２２６は、一様に上方調節される（データは示さない）。
[00239]ＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介性応答を、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウス及びＤＮＡＭ－１欠損（代替的に、ＤＮＡＭ－１ＫＯ又はＣＤ２２６ＫＯと称される）マウスにおいて評価した。マウスに、実施例１で記載した通りに、脇腹後部へと、Ｂ１６Ｆ１０細胞、ＭＣ３８細胞、又はＭＣ３８ＯＶＡｂｒｉｇｈｔ細胞を皮下注入し、腫瘍のサイズを、１５～２５日間にわたり評価した。その後、マウスを安楽死させ、フローサイトメトリーを実施して、全ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤腫瘍、及びＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤腫瘍を検出した。
[00240]図１に示される通り、ＣＤ２２６ＫＯマウスは、野生型マウスより、有意に、腫瘍進行を受けやすかった。ＭＣ３８ＯＶＡｂｒｉｇｈｔ腫瘍において、細胞を解析したところ、ＣＤ２２６ＫＯマウスにおける腫瘍増殖の加速化が、腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率の、野生型マウスにおいて観察される百分率と比較した低減（データは示さない）と関連することが観察された。さらに、ＣＤ２２６ＫＯマウスでは、野生型マウスと比較して、低頻度のＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞が観察された。これらのデータは、ＤＮＡＭ－１欠損マウスでは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介性抗腫瘍応答が損なわれていることを指し示す。
実施例３
腫瘍微小環境における、ＤＮＡＭ－１－Ｔ細胞機能の評価
[00241]腫瘍微小環境における、ＣＤ２２６－（すなわち、ＤＮＡＭ－）Ｔ細胞の機能について、さらに評価するために、ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウスにおける、ＣＤ２２６陽性（ＣＤ２２６＋）ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＣＤ２２６陰性（ＣＤ２２６－）ＣＤ８＋ Ｔ細胞について検討した。ＷＴマウスの、ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ腫瘍における、ＣＤ２２６発現についてのフローサイトメトリー解析は、ＣＤ２２６－ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、腫瘍において蓄積されることを指し示した（データは示さない）。しかし、この集団内では、ＩＦＮ－γ産生細胞の頻度は、ＣＤ２２６１＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、有意に低度であった（データは示さない）。さらに、ＣＤ２２６－ＣＤ８＋ Ｔ細胞の中の、Ｋｉ６７＋細胞の頻度もまた、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して低度であったことは、集団としてのＣＤ２２６－ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞より増殖性ではなかったことを指し示す。これらのデータは、機能不全性ＣＤ２２６－ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、腫瘍微小環境に蓄積されることを指し示す。
[00242]さらなる研究では、本発明者らは、ＷＴマウスにおける腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞について、フローサイトメトリーにより解析し、Ｔ細胞が、それらのＣＤ２２６発現に基づき、３つのサブセットへと細分されうることを明らかにした。高比率の腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２２６陰性（ＣＤ２２６ｎｅｇ）であり、第２のサブセットは、中間レベルのＣＤ２２６を発現し、休眠Ｔ細胞（ＣＤ２２６ｄｉｍ）に類似し、第３のサブセットは、高レベルのＣＤ２２６（ＣＤ２２６ｈｉ）を発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性化Ｔ細胞に類似した（図２）。ＣＤ２２６が、活性化受容体として機能することを踏まえると、ＣＤ２２６の表面発現は、Ｔ細胞のエフェクター機能と相関することが仮定された。驚くべきことに、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍又はＭＣ３８腫瘍から単離され、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて再刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２２６表面発現と、エフェクターサイトカインである、グランザイムＢを産生し、Ｋｉ６７染色により指し示される通りに増殖する能力との間には、重要な関連が存在することが見出された（図３）。ＣＤ２２６ｎｅｇＴ細胞は、機能不全性であることが見出されたので、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫から単離されたＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）における、ＣＤ２２６及び阻害性免疫受容体の発現について評価した。Ｔ細胞が活性化されると、阻害性免疫受容体は上方調節され、エフェクター機能の喪失と関連する（Ｔｈｏｍｍｅｎ及びＳｃｈｕｍａｃｈｅｒ、２０１８；Ｗｈｅｒｒｙ及びＫｕｒａｃｈｉ、２０１５）。しかし、複数の阻害性受容体の発現だけに基づく、機能不全性Ｔ細胞の同定は不十分である。マウスでは、ＣＤ２２６の発現と、阻害性受容体（ＰＤ－１、ＣＤ９６、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３）との厳密な関連は、観察されなかった（データは示さない）。興味深いことに、ＰＤ－１＋Ｔｉｍ－３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＰＤ－１＋Ｔｉｍ－３＋ＬＡＧ３＋ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２２６ｎｅｇサブセットは、はるかにわずかのＩＦＮ－γしか、産生することが可能でなかった。これに対し、ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞は、複数種の阻害性免疫受容体の存在にもかかわらず、ｅｘ ｖｉｖｏにおける再刺激時に、なおも大量のＩＦＮ－γを産生することが可能であった（図４）。したがって、データは、ＣＤ２２６が、ＴＭＥにおけるＴ細胞の機能性を規定するのに、複数の阻害性免疫受容体の発現と比較して、より特異的なマーカーであることを示唆する。
実施例４
チロシン３１９の、Ｔ細胞機能に対する重要性についての評価
[00243]実施例２及び３において裏付けられた通り、ＤＮＡＭ－１は、抗腫瘍免疫のＴ細胞において、極めて重要な受容体である。しかし、どの機構により、ＤＮＡＭ－１が、細胞傷害性応答を容易とするのかは、明らかでなかった。マウスＤＮＡＭ－１におけるチロシン３１９（ヒトＤＮＡＭ－１におけるチロシン３２２に対応する）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞機能に、絶対的に要求される。Ｔ細胞におけるこの残基の重要性について探索するために、Ｙ３１９Ｆ変異を含むＤＮＡＭ－１（すなわち、ＣＤ２２６）を発現するＤＮＡＭ－１ＫＩマウス（また、ＣＤ２６６Ｙマウスとも称される）を使用した。
[00244]予備研究は、健常ＣＤ２２６Ｙマウスにおいて、多様なリンパ球集団の、ＷＴマウスと比較した、著明な差違は、観察されなかったので、この変異が、免疫細胞の発生に影響を及ぼさないことを裏付けた（データは示さない）。第２に、ＣＤ２２６Ｙマウスが、ＮＫ細胞依存性メチルコラントレン（ＭＣＡ）誘導発癌、及び実験による転移に対する、ＷＴ対照と比較した高感受性（データは示さない）を示したことは、既に公表されたｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＫ細胞における知見（Ｚｈａｎｇら、２０１５）と符合する。グローバルＣＤ２２６ＫＯマウスの腫瘍のコントロールが、ＣＤ２２６Ｙマウスと比較して、著明に損なわれたことは注目に値し、ＣＤ２２６の、Ｙ３１９のリン酸化は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞媒介性腫瘍免疫に、部分的に寄与するに過ぎないことを示唆する。
[00245]これらの知見に基づき、Ｙ３１９シグナル伝達は、Ｔ細胞媒介性腫瘍免疫に、少なくとも部分的に要求されることが仮定された。この仮説を検証するために、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍（中間レベルの、外来抗原であるオボアルブミンを発現するＭＣ３８バリアント）を、ＷＴマウス、ＣＤ２２６ＫＯ（ＤＮＡＭＫＯ）マウス、及びＣＤ２２６Ｙ（ＤＮＡＭＫＩ）マウスへと移植する、第１の研究を実施した。驚くべきことに、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ腫瘍は、ＣＤ２２６Ｙマウスでは、著明に緩徐に増殖し、一部の腫瘍は、完全に拒絶されたのに対し、ＷＴマウスでは、全ての腫瘍が、徐々に増殖し、ＣＤ２２６ＫＯマウスでは、急速に増殖する（データは示さない）ことが観察された。フローサイトメトリー解析は、ＣＤ２２６Ｙマウスにおける、ＯＶＡ特異的ＤＮＡＭ－１－ＣＤ８＋ Ｔ細胞の、ＷＴマウスと比較した低頻度（データは示さない）、並びにＫｉ６７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞の、ＷＴマウスと比較した、同等の頻度（データは示さない）を明らかにした。ＷＴマウス、ＣＤ２２６ＫＯマウス、及びＣＤ２２６Ｙマウスにおける、腫瘍浸潤ＣＤ８＋ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の総数は、同等であり、重要なことは、ＣＤ２２６Ｙマウスでは、ＤＮＡＭ－１陰性細胞の頻度が、ＷＴマウスと比較して、著明に低度であることであった（ＷＴマウスにおける約２２％と対比した、ＣＤ２２６Ｙマウスにおける約５％）。
[00246]後続の研究では、原型的Ｔ細胞抗原であるオボアルブミン（ＯＶＡ）の免疫原性バリアントである、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ、又は高レベルのＯＶＡを有する免疫原性バリアント（ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ）を、ＷＴマウス又はＣＤ２２６Ｙマウスへと導入した。ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍを保有するＣＤ２２６Ｙマウスでは、ＷＴマウスと比較した、腫瘍増殖の著明な低減、及び高比率の腫瘍拒絶の結果として、生存の著明な延長が観察された（図５Ａ～Ｃ）。ＭＣ３８－ＯＶＡｈｉ腫瘍を、ＷＴマウス及びＣＤ２２６Ｙマウスのコホートへと注入したところ、いずれの群でも、全ての腫瘍が拒絶されたので、当初、差違は観察されなかった。しかし、おそらく、抗原の喪失に起因して、ＷＴマウス（５７例中の２６例）では、腫瘍が再発することが多かったが、ＣＤ２２６Ｙマウスでは、再発は、著明に低減され、５２例中９例のマウスだけが再発した（図５Ｄ、５Ｅ）。したがって、ＣＤ２２６Ｙマウスについて、生存の著明な延長が観察された（図５Ｆ）。充実性腫瘍からのこれらの知見は、血液がんモデルでも確認された。ＶＫ１２５９８多発性骨髄腫細胞を注入されたＣＤ２２６Ｙマウスもまた、ＷＴマウスと比較した、腫瘍コントロールの改善、及び生存の延長を示した（図５Ｇ）。
[00247]興味深いことに、ナイーブＣＤ２２６Ｙマウスでは、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６発現のわずかな増大が観察された（図５Ｈ）。Ｙ３１９における変異が、なぜ、腫瘍コントロールの改善をもたらしたのかを理解するために、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を評価した。ＣＤ２２６ｎｅｇマウスでは、ＷＴマウスと比較した、有意に高頻度のＣＤ２２６ｈｉＣＤ８＋Ｔ細胞が見出されるのと対照的に、低頻度のＣＤ２２６ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤腫瘍が見出された（図５Ｉ～Ｋ）。興味深いことに、ＣＤ２２６Ｙマウスの腫瘍から単離された、高頻度のＩＦＮ－γを産生するＴＩＬ（図５Ｌ）、及び、程度は劣るが、高頻度のＴＮＦ－αを産生するＴＩＬ（データは示さない）が検出された。腫瘍細胞は、オボアルブミンを発現したので、ＯＶＡ特異的（四量体＋）ＣＤ８＋ ＴＩＬ及びＯＶＡ非特異的（四量体ｎｅｇ）ＣＤ８＋ ＴＩＬにおける、ＣＤ２２６表面発現及びエフェクター機能を評価した。ＷＴマウスでは、ＣＤ２２６の表面発現は、いずれのＴ細胞サブセットの間でも、同等であった。重要なことは、ＣＤ２２６Ｙマウスから単離されたＯＶＡ特異的四量体＋Ｔ細胞が、四量体ｎｅｇと比較して、ＣＤ２２６表面発現の有意な増大、及びＩＦＮ－γ量の有意な増大を示したことである（図５Ｍ、Ｎ）。こうして、ＣＤ２２６ＹマウスのＴＭＥでは、高量のＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αが観察された（図５Ｏ）。
[00248]これに基づき、Ｙ３１９の変異は、ＤＮＡＭ－１（すなわち、ＣＤ２２６）の表面発現の保持をもたらすことが結論づけられる。これらのデータは、Ｙ３１９Ｆ変異が、ＮＫ細胞において見られるように、Ｔ細胞機能を損なわず、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の抗腫瘍特性を改善することをさらに指し示す。
[00249]ＣＤ２２６の表面発現の増大は、Ｔ細胞の接着を増強し、免疫学的シナプスの形成を改善し、優れたサイトカイン産生をもたらすことができた。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞では、Ｓ３２９を介するＣＤ２２６シグナル伝達は、シナプス形成に重要であることが示されたが、Ｔ細胞における、Ｙ３１９を介するシグナル伝達の関連性については、ほとんど知られていない。したがって、本発明者らは、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムを使用する、ＬＦＡ－１及びファロイジンの強度の、フロー－顕微鏡定量により、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）とのシナプス品質について評価した。このために、Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲトランスジェニックマウスを、ＣＤ２２６Ｙマウス又はＣＤ２２６ＫＯマウス（本明細書では、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１マウス、ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１マウス、及びＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１マウスと称する）と交配させ、ＣＦＳＥ標識化ＭＡＣＳエンリッチＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＴＶ標識化ｈｇｐ１００２５－３３ペプチドパルスＷＴ ＢＭＤＣとインキュベートした。インキュベーションの１時間後、Ｔ細胞－ＢＭＤＣダブレットのインターフェースにおける、ＬＦＡ－１染色及びファロイジン染色の強度を決定した。ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞が、シナプス品質の劣化を、明確に示したのに対し、ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞のシナプス品質は、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞と同様であった（データは示さない）。この知見は、ＣＤ２２６表面発現の喪失が、高品質のシナプスを形成する、Ｔ細胞の能力を減少させるのに対し、Ｙリン酸化部位の喪失は、これを減少させないことを示唆した。したがって、ＣＤ２２６表面発現の喪失は、腫瘍浸潤Ｔ細胞のエフェクター機能の損耗に寄与しうる。まとめると、Ｙ３１９を介する、ＣＤ２２６シグナル伝達を阻害する点変異を保有するマウスは、ＣＤ８＋ ＴＩＬにおける、ＣＤ２２６発現及びエフェクターサイトカイン産生の増大と関連する、優れた抗腫瘍免疫を有する。
実施例５
腫瘍細胞における、ＣＤ１５５の、ＤＮＡＭ－１との相互作用
[00250]ナイーブＣＤ１５５欠損マウスから単離された免疫細胞は、ＤＮＡＭ－１（すなわち、ＣＤ２２６）の発現を、わずかに上昇させた。ＣＤ２２６ｎｅｇＴ細胞の頻度と、腫瘍重量との間で、著明な相関（図６Ａ、Ｂ）が観察され、いずれの腫瘍モデルも高レベルのＣＤ１５５を発現していた（Ｌｉら、２０１８、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２８、２６１３～２６２５）ので、ＣＤ２２６表面発現の喪失は、腫瘍細胞由来ＣＤ１５５により媒介されうることが仮定された。ＣＤ１５５－Ｆｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの非刺激Ｔ細胞では、ＣＤ２２６の発現を、わずかに低減したのに対し、ＣＤ２２６の、ＴＣＲ誘導性上方調節は、完全に防止した（図６Ｃ）。ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムを使用して、ＣＤ１５５－Ｆｃ又は対照ＩｇＧの存在下における、活性化前Ｔ細胞の表面及び細胞内におけるＣＤ２２６レベルを定量した（図６Ｄ）。略述すると、表面ＣＤ２２６を、ＡＦ６４７コンジュゲート抗体（クローン１０Ｅ５）で染色するのに続き、ＰＥコンジュゲート抗体（クローン４８０．１）によるＣＤ２２６の細胞内染色を行った。クローン１０Ｅ５は、４８０．１の結合を遮断するが、この逆は成り立たないことから、ＣＤ２２６の細胞内画分についての特異的評価を可能とすることは、注目に値する。実際、ＣＤ１５５の、ＣＤ２２６とのライゲーションは、細胞内ＣＤ２２６のＭＦＩを、対照ＩｇＧと比較して、有意に増大させた（図６Ｄ）。これは、ＣＤ２２６－ＣＤ１５５間相互作用の後における、活性の内部化過程を示唆した。ＣＤ１５５が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＤ２２６の下方調節を駆動するという知見を検証するために、本発明者らは、ＣＤ１５５発現Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１０ｃｔｒｌ）、又はＣＤ１５５欠損Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ）を、ＷＴマウス又はＣＤ１５５欠損マウス（ＣＤ１５５ＫＯ）へと注入した（図６Ｅ）。この実験設定は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２２６表面発現の下方調節に対する、腫瘍細胞ＣＤ１５５の、宿主細胞ＣＤ１５５と対比した重要性についての精査を容易とした。興味深いことに、ＣＤ２２６ｎｅｇＴ細胞浸潤Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ黒色腫の頻度は、ＷＴマウス及びＣＤ１５５ＫＯマウスのいずれにおいても、Ｂ１６Ｆ１０ｃｔｒｌ黒色腫と比較して、有意に低減された（図６Ｅ）。併せると、Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ黒色腫を保有する、ＷＴマウス及びＣＤ１５５ＫＯマウスのいずれにおいても、著明に高頻度のＣＤ２２６ｈｉＴ細胞が観察された（データは示さない）。このデータは、ＴＭＥにおける、高レベルのＣＤ１５５が、Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の下方調節に寄与するという考えを裏書きする。
[00251]ＣＤ２２６Ｙマウスにおける腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ２２６発現の増大を示した（図５を参照されたい）ことを踏まえると、Ｙ３１９を介するシグナル伝達が、ＣＤ２２６の、ＣＤ１５５媒介性内部化に重要でありうることが仮定された。これを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて検証するために、Ｂ１６Ｆ１０ｃｔｒｌ黒色腫細胞又はＢ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ黒色腫細胞を、ＷＴマウス又はＣＤ２２６Ｙマウスへと注入した（図６Ｆ）。ＣＤ２２６ＹマウスにおけるＣＤ２２６ｎｅｇＴ細胞浸潤Ｂ１６Ｆ１０ｃｔｒｌ腫瘍、又はＷＴマウスにおける浸潤性Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ腫瘍の頻度が、有意に低減されたのに対し、ＣＤ２２６ｈｉＴ細胞の頻度が増大した（図６Ｆ）ことは、前出の知見と符合した。興味深いことに、Ｂ１６Ｆ１０ＣＤ１５５ＫＯ黒色腫を保有するＣＤ２２６Ｙマウスにおいて、ＣＤ２２６ｎｅｇ細胞の減少が観察されなかったことは、ＣＤ１５５が、Ｙ３１９を介して、ＣＤ２２６の下方調節を誘発することを示唆する。注目に値することには、ＣＤ２２６ｎｅｇＴ細胞浸潤ＣＤ１５５欠損腫瘍が、依然として見出されたので、さらなる機構が、ＣＤ２２６の下方調節に寄与すると考えられる。
実施例６
Ｔ細胞におけるＤＮＡＭ－１発現の、養子細胞移入の効率に対する効果
[00252]養子細胞移入（ＡＣＴ）免疫療法において使用されるＴ細胞における、ＣＤ２２６（すなわち、ＤＮＡＭ－１）発現の効果を、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を保有するマウスにおいて評価した。ＡＣＴ免疫療法を、実施例１において記載した通りに実施した。略述すると、ＣＤ２２６＋（ＤＮＡＭ－１＋）黒色腫特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＤＮＡＭ－１－（ＣＤ２２６－）黒色腫特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ｐｍｅｌ１－ＴＣＲｔｇマウスの脾臓から分取した。これらのＴ細胞は、黒色腫細胞系統の抗原であるｇｐ１００を認識し、黒色腫細胞を認識し、破壊することが可能である。シクロホスファミド、ＤＮＡＭ－１＋ｐｍｅｌ１ Ｔ細胞又はＤＮＡＭ－１－ｐｍｅｌ１ Ｔ細胞の、ｇｐ１００に対するアデノウイルスワクチン（Ｖ）を伴う単回投与の後、３回にわたる、免疫刺激核酸（Ｉ；ＣｐＧ＋ポリＩ：Ｃ）の腫瘍内注射を行った。図５Ａに示される通り、ＤＮＡＭ－１－Ｔ細胞が、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫のコントロールにおいて、ＤＮＡＭ－１＋Ｔ細胞と比較して、有意に効果的でなくなったことは、ＡＣＴ免疫療法の有効性が、大部分、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞に依存することを指し示す。
[00253]後続の研究では、黒色腫保有ＷＴマウスを、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を使用するＡＣＴ療法で処置した。このために、ＷＴマウスに、Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞により認識される、高アフィニティー抗原であるｈｇｐ１００を発現するように操作された、初代Ｈｇｆ－Ｃｄｋ４黒色腫に由来する、マウス黒色腫細胞株である、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００黒色腫を、ｓ．ｃ．注入した。腫瘍が、直径約５ｍｍに達したら、化学療法による条件付けのために、マウスを、単回投与シクロホスファミドで処置した。翌日、マウスのコホートに、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞、又はＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を施すのに続き、自然免疫刺激を施した（図７Ｂ）。ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞の養子移入は、ロバストな抗腫瘍免疫を誘導し、４４例中１３例の完全レスポンダー（ＣＲ；治療後１４日目における腫瘍退縮が、ベースラインと比較して、＞９０％である）をもたらした（図７Ｃ）。これに対し、ＣＤ２２６ＫＯ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞は、大部分、ＣＲを誘導することに失敗した（３４例中２例）（図７Ｄ）。ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を使用するＡＣＴ免疫療法が、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞の移入より優れており（４２例中２３例のＣＲ）、長期生存マウスの数の有意な増大、及び生存の有意な改善を結果としてもたらした（図７Ｅ～７Ｇ）ことは、前出の知見を確認する。腫瘍浸潤Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞についてのフローサイトメトリー解析は、ＣＤ２２６Ｙ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの産生の、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞と比較した増大と関連する、ＣＤ２２６発現の増大を示したこと（図７Ｈ及び７Ｉ）を明らかにした。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルと同様に、養子移入されたＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞では、阻害性免疫受容体の発現と、ＣＤ２２６の発現との、厳密な相関が観察されなかった（データは示さない）。
[00254]ＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の表面発現は、優れた腫瘍のコントロールと相関していたので、ＣＤ２２６の過剰発現は、養子細胞移入療法を改善するための、合理的な戦略でありうることが仮定された。ＣＤ２２６発現を、治療的に増大させるために、ＡＣＴプロトコールを使用する、ＨＣｍｅｌ１２ｈｇｐ１００保有ＷＴマウスへの養子移入の前に、ＷＴ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞へと、対照レトロウイルスベクター（ＭＯＣＫ．Ｐｍｅｌ－１）又はＣＤ２２６をコードするレトロウイルスベクター（ＣＤ２２６．Ｐｍｅｌ－１）を形質導入した（図７Ｊ）。実際、Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の過剰発現は、治療有効性を改善し、ＣＲの数を、ＭＯＣＫ．Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞と比較して増大させた（図７Ｋ）。
実施例７
免疫チェックポイント阻害剤療法における、ＤＮＡＭ－１の重要性
[00255]免疫チェックポイント阻害剤療法における、ＤＮＡＭ－１発現の重要性を、ＭＣ３８結腸腺癌を保有するＷＴマウス及びＣＤ２２６ＫＯ（ＤＮＡＭ－１ＫＯ）マウスにおいて評価した。略述すると、また、実施例１で記載した通りに、マウスに、腫瘍接種後１０、１２、１４、及び１６日目において、対照Ｉｇ（ｃＩｇ）、又は抗ＰＤ１（ＲＭＰ１－１４）ｍＡｂが投与される前に、ＭＣ３８結腸腺癌細胞を、ｓ．ｃ．注入した。ＷＴマウスの群には、ｃＩｇ又は抗ＣＤ２２６ ｍＡｂを、９、１０、１４、１７、２０、及び２４日目に施した。図８Ａに示される通り、抗ＰＤ１抗体の有効性は、ＣＤ２２６ＫＯマウス、及び抗ＤＮＡＭ－１抗体を施されたＷＴマウスでは、抗ＰＤ１抗体を単独で施されたＷＴマウスと比較して、有意に減少していた。
[00256]後続の研究では、ＷＴマウス、ＣＤ２２６ＫＯマウス、又はＣＤ２２６Ｙマウスに、ＭＣ３８－ＯＶＡｄｉｍ細胞を注入し、抗ＰＤ１免疫療法で処置した。ＣＤ２２６ＫＯマウスが、抗腫瘍応答を惹起することに、完全に失敗したのに対し、対照ＩｇＧ（ｃＩｇＧ）で処置されたＣＤ２２６Ｙマウスは、抗ＰＤ１で処置されたＷＴマウスと同様の応答を示した。重要なことは、抗ＰＤ－１で処置されたＣＤ２２６Ｙマウスが、最良の生存率を示した（図８Ｂ及び８Ｃ）ことである。ＩＣＢに対する、ＣＤ２２６の重要性はまた、免疫原性が低度であるＢ１６Ｆ１０モデルにおける、抗ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４組合せ免疫療法の有効性の改善によっても強調された（図８Ｄ）。まとめると、本発明者らのデータは、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の表面発現が、がん免疫療法の有効性と相関することを裏付けた。したがって、効果的な免疫チェックポイント阻害剤療法は、ＤＮＡＭ－１を要求する。
実施例８
ＴＩＬにおける、ＤＮＡＭ－１発現の、エフェクター機能との相関
[00257]前臨床マウスモデルを使用して、ＤＮＡＭ－１（すなわち、ＣＤ２２６）が、（ａ）腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞において下方調節され、（ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能に重要であり、（ｃ）抗腫瘍免疫及び免疫療法に要求されることを示した（上記を参照されたい）。次いで、研究を実施して、健常ドナーのＰＢＭＣから単離された、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が、活性化されると、ＣＤ２２６の上方調節を提示したことを確認したことは、マウスから得られた結果と符合する（図９Ａ）。マウスと対照的に、可変的ではあるが、有意な比率のＣＤ２２６陰性Ｔ細胞（約２０％）が、健常ボランティアの血液中で観察された。Ｔ細胞機能に対する、ＣＤ２２６の重要性を評価するために、ＣＤ２２６遮断抗体（クローンＤＸ１１）の存在下、又は非存在下で活性化させたＰＢＭについての、ＲＮＡ発現解析を実施した。このアッセイでは、ＴＣＲ刺激時における、ＩＦＮＧ及びＧＺＭＢの発現は、大部分、ＣＤ２２６に依存した（図９Ｂ）。次に、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）患者に由来する腫瘍組織試料から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２２６発現を評価した。マウスと同様に、ヒト腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２２６の、可変的な表面発現を示した（図９Ｃ）。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて刺激されたＣＤ８＋ ＴＩＬについてのフローサイトメトリー解析は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、Ｋｉ６７、及びＣＤ１０７ａの染色の増大により証拠立てられる通り、ＣＤ２２６の表面発現と、エフェクター機能との、有意な相関を示した（図９Ｄ～９Ｆ）。重要なことは、ＣＤ２２６遺伝子発現が、ＴＣＧＡデータベースによる、ＨＮＳＣＣ（ＨＮＳＣ）コホート及び皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）コホートにおける生存の改善と、有意に関連した（図９Ｇ）ことである。これらのデータセットでは、ＣＤ２２６遺伝子発現とＣＤ８Ｂ、ＩＦＮＧ、及びＧＺＭＢとの間では、有意な相関が観察されたが、古典的ＮＫ細胞マーカーである、ＮＣＡＭ１（ＣＤ５６）との相関は、観察されなかった（データは示さない）。興味深いことに、ＣＤ２２６と、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）との間では、わずかながら、有意な逆相関が観察されたが、ＮＥＣＴＩＮ２（ＣＤ１１２）遺伝子発現との逆相関もまた、観察されなかった（データは示さない）。
実施例９
ＣＤ１５５への結合は、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞における、ＤＮＡＭ－１の下方調節を媒介する
[00258]マウスでは、ＣＤ１５５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）下方調節の、主要な駆動因子として同定された。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の表面発現に対する、ＣＤ１５５の影響を評価するために、ＯＫＴ３及び高レベルのｈＣＤ１５５を、安定的に発現するＣＨＯ細胞を作出した（図１０Ａ）。活性化前ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞と共にインキュベートしたところ、ＣＤ２２６の表面発現の増大が観察されたのに対し、ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＣＤ１５５細胞との共培養において、ＣＤ２２６の表面発現は、実質的に低減された（図１０Ｂ）。実のところ、時系列解析は、共培養開始後１時間以内に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ２２６の表面発現を喪失したこと（図１０Ｃ）を明らかにした。これらの知見を確認し、ＣＤ１５５の量が、ＣＤ２２６の下方調節に影響を及ぼすのかどうかについて評価するために、多様なレベルのＣＤ１５５を発現するＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞を作出した。実際、共培養アッセイでは、ＣＤ１５５の用量に依存する、ＣＤ２２６の下方調節が観察された（図１０Ｄ）。別の実験セットでは、漸増量のＣＤ１５５遮断抗体を、共培養物へと添加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の、ＣＤ２２６の下方調節における、ＣＤ１５５の特異的役割について検証した（図１０Ｅ）。したがって、がん患者におけるＣＤ８＋ ＴＩＬは、ＣＤ１５５が高レベルであるＴＭＥにおいて、低レベルのＣＤ２２６を発現することが仮定された。これについて検証するために、十分に注釈された黒色腫患者コホートに由来するＦＦＰＥ試料３４例を、ＣＤ１５５について染色した（図１０Ｆ）。ＣＤ１５５についての免疫組織化学は、ＣＤ１５５の発現の非存在／低度のＣＤ１５５発現レベルを示す患者の亜群（ｎ＝９）、又は高度のＣＤ１５５発現レベルを示す患者の亜群（ｎ＝１５）（データは示さない）を明らかにした。後続のマルチプレックス免疫組織蛍光（ＩＨＦ）解析は、ＴＭＥにおける全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋の比が、ＣＤ１５５の発現レベルと負に相関することを確認した（図１０Ｈ）。まとめると、このデータは、腫瘍細胞におけるＣＤ１５５が、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６表面発現の下方調節を媒介するという考えを裏書きした。
実施例１０
ＣＤ８＋ ＴＩＬにおける、ＣＤ２２６の表面発現は、黒色腫患者におけるＩＣＢの応答と相関する
[00259]ＣＤ２２６の表面発現の増大は、前臨床マウスモデルにおける、Ｔ細胞のエフェクター機能及びがん免疫療法の有効性を改善するので、次に、ヒト黒色腫患者における、ＩＣＢに対する応答が、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋ ＴＩＬの存在に依存するのかどうかについて問うた。このために、マルチプレックスＩＨＦを、十分に注釈された黒色腫患者コホートに由来する、ＩＣＢ処置前のＦＦＰＥ試料３１例において使用して、全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する、腫瘍浸潤ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出した（図１１Ａ）。実際、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、ＩＣＢに対する応答と、有意に関連し（図１１Ｂ）、無進行生存を改善した（ＰＦＳ、ＨＲ３．３８；ｐ＝０．０３６）（図１１Ｂ）。統計学的に有意ではないが、全生存についても、同様の傾向が観察された（データは示さない）。注目すべきことは、ＩＣＢに対する応答も、ＰＦＳも、ＯＳも、高ＣＤ８＋Ｔ細胞カウントと、有意に相関しなかったので、この患者の層別化が、全ＣＤ８＋Ｔ細胞カウントによっては説明されなかったことである（図１１Ｃ）。したがって、データは、ＣＤ２２６についての染色が、ＴＭＥ内の、高度に機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞を同定し、ＩＣＢに対する応答の予測を改善することを示唆する。全体として、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２２６の表面発現は、がん患者における、効果的な抗腫瘍免疫及びがん免疫療法と関連することが裏付けられた。したがって、ＣＤ２２６の、ＣＤ１５５誘導性下方調節は、腫瘍により、免疫系から逃避するのに使用されてる、新規の、過小評価されている耐性機構を表す。
実施例１１
Ｔ細胞におけるＤＮＡＭ－１の表面発現における、ＣＢＬ－Ｂの関与
[00260]ユビキチンリガーゼＥ３ Ｃｂｌ－２が、ＤＮＡＭ－１のユビキチン化及び内部化に関与するのかどうかについて評価するために、野生型マウス、又はユビキチンリガーゼ機能の阻害を結果としてもたらす、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子における点変異を保有するマウス（Ｃｂｌ－ｂＫＩマウス）の脾臓に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２）を含有するｃＲＰＭＩ培地における、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、又はＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１５５－Ｆｃビーズによる、１６時間にわたる刺激の後における、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）の表面発現について評価した。図１２に示される通り、Ｃｂｌ－ｂＫＩマウスは、ＣＤ１５５媒介性のＣＤ２２６下方調節に対して、部分的に耐性である。
実施例１２
Ｔ細胞における、改変ＤＮＡＭ－１の過剰発現
[00261]野生型ＤＮＡＭ－１及び改変ＤＮＡＭ－１をコードする、いくつかの核酸構築物を合成し、レトロウイルス発現ベクターである、ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ ＩＩへとサブクローニングした（Ｈｏｌｓｔら、２００６、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．、１（１）：４０６～１７）。ＤＮＡＭ－１構築物を含有するレトロウイルスベクターを作製した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ベクターを、Ｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞へと形質導入し、ＧＦＰ発現に基づき、細胞を精製した。Ｔ細胞の増殖及びサイトカインの産生を測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、各ＤＮＡＭ－１構築物の影響を評価する。個々のＤＮＡＭ－１構築物の過剰発現の影響を評価するのに、レトロウイルスにより形質導入されたｐｍｅｌ－１ Ｔ細胞を、ＡＣＴ免疫療法モデルにおいてもまた使用する。
[00262]構築物は、野生型マウスＤＮＡＭ－１をコードするポリヌクレオチド；ＩｇＧ１ドメインを欠く、すなわち、配列番号３に明示された野生型ＤＮＡＭ－１のアミノ酸３０～１２７を欠き、これにより、野生型ＤＮＡＭ－１のアミノ酸１～２９及び１２８～３３３を含むポリペプチドをコードする、ＩｇＧ１を伴わないＤＮＡＭ－１；ＩｇＧ１ドメイン及びＩｇＧ２ドメインを欠く、すなわち、配列番号３に明示された野生型ＤＮＡＭ－１のアミノ酸３０～１２７及び１３８～２３７を欠き、これにより、野生型ＤＮＡＭ－１のアミノ酸１～２９及び１２８～１３７及び１２８～３３３を含むポリペプチドをコードする、ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２を伴わないＤＮＡＭ－１；細胞内（又は細胞質）ドメインを欠く、すなわち、配列番号３に明示された野生型ＤＮＡＭ－１のアミノ酸２７５～３３３を欠き、これにより、野生型ＤＮＡＭ－１のアミノ酸１～２７４を含むポリペプチドをコードする、細胞内配列を伴わないＤＮＡＭ－１；配列番号３に明示された野生型ＤＮＡＭ－１と比べて、Ｓ３２６Ａ変異を含むポリペプチドをコードする、ＤＮＡＭ－１ Ｓ３２６Ａ；及び配列番号３に明示された野生型ＤＮＡＭ－１と比べて、Ｙ３１９Ａ変異及びＳ３２６Ａ変異を含むポリペプチドをコードする、ＤＮＡＭ－１ Ｙ３１９Ａ／Ｓ３２６Ａを含んだ。
野生型マウスＤＮＡＭ－１（ポリヌクレオチド）：
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野生型マウスＤＮＡＭ－１（ポリペプチド）：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL（配列番号３）
ＩｇＧ１（ポリヌクレオチド）を伴わないＤＮＡＭ－１：
atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttctctcgaagaccaaaaccaagactctaa（配列番号１２）
ＩｇＧ１（ポリペプチド）を伴わないＤＮＡＭ－１：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL（配列番号１３）
ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２（ポリヌクレオチド）を伴わないＤＮＡＭ－１：
atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgatagttttgagatagcagcaccctcgataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttctctcgaagaccaaaaccaagactctaa（配列番号１４）
ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２（ポリペプチド）を伴わないＤＮＡＭ－１：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSDSFEIAAPSIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFSRRPKPRL（配列番号１５）
細胞内（ポリヌクレオチド）を伴わないＤＮＡＭ－１：
atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttaa（配列番号１６）
細胞内（ポリペプチド）を伴わないＤＮＡＭ－１：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFIL（配列番号１６）
ＤＮＡＭ－１ Ｓ３２６Ａ（ポリヌクレオチド）：
atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacatttatgtaaactatccaactttcgctcgaagaccaaaaccaagactctaa（配列番号１７）
ＤＮＡＭ－１ Ｓ３２６Ａ（ポリペプチド）：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIYVNYPTFARRPKPRL（配列番号１８）
ＤＮＡＭ－１ Ｙ３１９Ａ／Ｓ３２６Ａ（ポリヌクレオチド）：
atggcttatgttacttggcttttggctattcttcatgtgcacaaagcactgtgtgaagagacattgtgggacacaacagttcggctttctgagactatgactctggaatgtgtatatccattgacgcataacttaacccaggtggagtggaccaagaacactggcacaaagacagtgagcatagcagtttacaaccctaaccataatatgcatatagaatctaactacctccatagagtacacttcctaaactcaacagtggggttccgcaacatgagcctttccttttacaatgcctcagaagcagacattggcatctactcctgcttgtttcatgctttcccaaatggaccttgggaaaagaagataaaagtagtctggtcagatagttttgagatagcagcaccctcggatagctacctgtctgcagaacctggacaagatgtcacactcacttgccagcttccaaggacttggccagtgcaacaagtcatatgggaaaaagtccagccccatcaggtagacatcttagcttcctgtaacctatctcaagagacaagatacacttcaaagtacctaagacaaacaaggagcaactgtagccaggggagcatgaagagcatcctcatcattccaaatgccatggccgctgactcaggactttacagatgtcgctcagaggccattacaggaaaaaacaagtcctttgtcataaggctgatcataactgatggtggaaccaataaacattttatccttcccatcgttggagggttagtttcactgttacttgtcatcctaattatcatcattttcattttatataacaggaagagacggagacaggtgagaattccacttaaagagcccagggataaacagagtaaggtagccaccaactgcagaagtcctacttctcccatccagtctacagatgatgaaaaagaggacattgctgtaaactatccaactttcgctcgaagaccaaaaccaagactctaa（配列番号１９）
ＤＮＡＭ－１ Ｙ３１９Ａ／Ｓ３２６Ａ（ポリペプチド）：
MAYVTWLLAILHVHKALCEETLWDTTVRLSETMTLECVYPLTHNLTQVEWTKNTGTKTVSIAVYNPNHNMHIESNYLHRVHFLNSTVGFRNMSLSFYNASEADIGIYSCLFHAFPNGPWEKKIKVVWSDSFEIAAPSDSYLSAEPGQDVTLTCQLPRTWPVQQVIWEKVQPHQVDILASCNLSQETRYTSKYLRQTRSNCSQGSMKSILIIPNAMAADSGLYRCRSEAITGKNKSFVIRLIITDGGTNKHFILPIVGGLVSLLLVILIIIIFILYNRKRRRQVRIPLKEPRDKQSKVATNCRSPTSPIQSTDDEKEDIAVNYPTFARRPKPRL（配列番号２０）
[00263]本明細書で引用される、あらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
[00264]本明細書における、任意の参考文献の引用は、このような参考文献が、本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの容認としては考えられないものとする。
[00265]本明細書を通して、目的は、本発明を、いずれか１つの実施形態又は特徴の詳細な集成へと限定せずに、本発明の好ましい実施形態について記載することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、例示された特定の実施形態には、多様な改変及び変化がなされうることを理解するであろう。全てのこのような改変及び変化は、付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
［関連出願］
[0001]本出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１９年２月２７日に出願された、「免疫機能を増強するための細胞、組成物、及び方法」と題する、豪州仮出願第２０１９９００６２１号の優先権を主張する。

Claims (73)

  1. 改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドを含むＴ細胞であって、
    前記改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較して細胞表面保持の増大を呈し、
    ヒトＴ細胞である、
    Ｔ細胞。
  2. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２２位に対応する位置において、チロシンの改変を含む、請求項１に記載のＴ細胞。
  3. 前記改変が、アミノ酸置換又はアミノ酸欠失である、請求項２に記載のＴ細胞。
  4. 前記改変が、前記チロシンの、フェニルアラニンによる置換である、請求項２又は請求項３に記載のＴ細胞。
  5. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２５～３２８位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦの改変を含み、前記改変が、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦを消失させるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  6. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２５位に対応する位置において、チロシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２８位に対応する位置において、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２５、３２６、若しくは３２７位に対応する位置のうちのいずれか１つの後におけるアミノ酸挿入を含む；並びに／又は
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２６及び３２７位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含む、
    請求項１～５のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  7. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８２～２８７位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦの改変を含み、前記改変が、前記ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦを消失させるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  8. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８２位に対応する位置において、グルタミン酸のアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号の２８６位に対応する位置において、ロイシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８７位に対応する位置において、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８２～２８６位に対応する位置における残基のうちのいずれか１つ若しくは複数の後におけるアミノ酸挿入を含む；並びに／又は
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８３、２８４、及び２８５位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含む、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  9. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２０～３２２位に対応する位置において、Ｃｂｌ－Ｂ結合性モチーフの改変（（Ｄ／Ｎ）ＸｐＹ）を含み、前記改変が、前記Ｃｂｌ－Ｂ結合性モチーフを消失させる、請求項１～８のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  10. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２０位に対応する位置におけるアスパラギン酸のアミノ酸欠失又はアミノ酸置換を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  11. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２０及び／又は３２１位に対応する位置の後におけるアミノ酸挿入を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  12. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、２９５位に対応する位置におけるリシンのアミノ酸置換又はアミノ酸欠失を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  13. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３３３位に対応する位置におけるリシンのアミノ酸置換又はアミノ酸欠失を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  14. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、細胞質ドメインの全部又は一部を欠く、請求項１に記載のＴ細胞。
  15. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、細胞外ドメインの全部又は一部を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  16. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、ＩｇＧ１ドメインを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  17. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、ＩｇＧ２ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  18. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号５～９若しくは２１～３０のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸の配列、又はこれに対する、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を有する配列を含み、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと同じ配列を含まない、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  19. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  20. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  21. 前記Ｔ細胞が、αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞である、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  22. 前記Ｔ細胞が、ヒト対象から単離された初代ヒトＰＢＭＣに由来する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  23. 組換えＴＣＲ及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  24. 前記ＣＡＲが、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＡＧＥＡ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、変異体ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、及びＩＧＬＬ１の中から選択される腫瘍抗原に結合する、請求項２３に記載のＴ細胞。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
  26. 化学療法剤又は抗感染症剤をさらに含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 前記化学療法剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の中から選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 前記抗感染症剤が、抗生剤、抗アメーバ剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、及び抗ウイルス剤の中から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  30. 養子細胞療法のためのＴ細胞集団を調製する方法であって、
    Ｔ細胞の試料を、対象から得るステップと；
    ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞を、前記試料から選択するステップと；
    前記ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞を拡大して、養子Ｔ細胞療法のためのＴ細胞集団を作製するステップと
    を含む方法。
  31. ＤＮＡＭ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を選択するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
  32. ＤＮＡＭ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を選択するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
  33. 前記ＤＮＡＭ＋Ｔ細胞を操作して、ＣＡＲ又はトランスジェニックＴＣＲを発現させるステップをさらに含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  34. 請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法により作製されるＴ細胞集団。
  35. 対象における免疫機能を増大させる方法であって、前記対象へと、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項３４に記載のＴ細胞集団を投与するステップを含む方法。
  36. 対象におけるがんを処置するための方法であって、前記対象へと、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項３４に記載のＴ細胞集団を投与するステップを含む方法。
  37. 化学療法剤を、前記対象へと投与するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記化学療法剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の中から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記がんが、皮膚がん（例えば、黒色腫）、肺がん、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵がん、子宮内膜がん、結腸がん、腎がん、食道がん、前立腺がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、神経芽細胞腫、又は肝細胞癌である、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記がんが、前記Ｔ細胞又は医薬組成物の投与の前に、１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤に対して耐性である、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記Ｔ細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記Ｔ細胞が、同種Ｔ細胞である、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 対象における感染症を処置するための方法であって、前記対象へと、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項４０に記載のＴ細胞集団を投与するステップを含む方法。
  45. 前記感染症が、ウイルス及び／又は細菌による感染症である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記感染症が、急性感染症である、請求項４４又は請求項４５に記載の方法。
  47. 前記感染症が、慢性感染症である、請求項４４又は請求項４５に記載の方法。
  48. 抗感染症剤を、前記対象へと投与するステップをさらに含む、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記抗感染症剤が、抗生剤、抗アメーバ剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、及び抗ウイルス剤の中から選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記Ｔ細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記Ｔ細胞が、同種Ｔ細胞である、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項３４に記載のＴ細胞集団の、がんを処置するための医薬の調製のための使用。
  53. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項３４に記載のＴ細胞集団の、感染症を処置するための医薬の調製のための使用。
  54. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項３４に記載のＴ細胞集団の、対象における免疫機能を増強するための医薬の調製のための使用。
  55. 対象における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団の免疫機能を評価するための方法であって、前記対象に由来する試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルを評価するステップと、前記対象に由来する前記試料における、前記Ｔ細胞又は前記Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の前記量又はレベルを、対照試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量若しくはレベル、又は参照レベルと比較するステップとを含む方法。
  56. 試料における、Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルを評価するステップが、前記Ｔ細胞集団における、ＤＮＡＭ－１＋ Ｔ細胞の数又は百分率を検出することを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記対照試料が、免疫機能が正常であるか、又は効果的なＴ細胞を含み、前記対象に由来する前記試料における、Ｔ細胞又はＴ細胞集団におけるＴ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルの、前記対照試料における、Ｔ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量又はレベルと比較した低減が、前記対象における、前記Ｔ細胞又はＴ細胞集団の免疫機能が、損なわれているか、又は効果的でないことを指し示す、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. 前記対象に由来する試料を得るステップであって、前記試料が、Ｔ細胞又はＴ細胞集団を含むステップと；
    前記試料を、Ｔ細胞の表面におけるＤＮＡＭ－１に結合する結合剤と接触させるステップと；
    前記Ｔ細胞又は前記Ｔ細胞集団におけるＴ細胞に結合した場合の前記結合剤を検出し、これにより、前記Ｔ細胞の表面における、ＤＮＡＭ－１の量若しくはレベル、又は前記対象に由来する前記試料における、ＤＮＡＭ＋ Ｔ細胞の数若しくは百分率を評価するステップと
    を含む、
    請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記結合剤が、抗ＤＮＡＭ－１抗体である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記対象が、がんを有するか、又は感染症を有する、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. がんを伴う対象が、免疫チェックポイント阻害剤による治療に応答する可能性を予測するための方法であって、前記対象に由来する試料における、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数又は百分率を検出するステップと、前記対象に由来する前記試料における、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋細胞の数又は百分率を、参照レベル又は参照量と比較するステップとを含む方法。
  62. 前記試料における全ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率としての、ＤＮＡＭ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の前記百分率が検出される、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記試料が、腫瘍試料であり、前記Ｔ細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞である、請求項６１又は６２に記載の方法。
  64. 配列番号１の３２５～３２８位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦの改変を含み、前記改変が、ＡＰ－２結合性モチーフであるＹＸＸＦを消失させるものである、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  65. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２５位に対応する位置において、チロシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２８位に対応する位置において、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２５、３２６、若しくは３２７位に対応する位置のうちのいずれか１つの後におけるアミノ酸挿入を含む；並びに／又は
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２６及び３２７位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含む、
    請求項６４に記載の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  66. 配列番号１の２８２～２８７位に対応する位置において、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦの改変を含み、前記改変が、ＡＰ－２結合性モチーフＥＸＸＸＬＦを消失させるものである、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  67. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８２位に対応する位置において、グルタミン酸のアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号の２８６位に対応する位置において、ロイシンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８７位に対応する位置において、フェニルアラニンのアミノ酸置換若しくはアミノ酸欠失を含む；
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８２～２８６位に対応する位置における残基のうちのいずれか１つ若しくは複数の後におけるアミノ酸挿入を含む；並びに／又は
    前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の２８３、２８４、及び２８５位に対応する位置における残基のうちの１つ若しくは複数の欠失を含む、
    請求項６６に記載の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  68. 配列番号１の３２０～３２２位に対応する位置において、Ｃｂｌ－ｂ結合性モチーフの改変（（Ｄ／Ｎ）ＸｐＹ）を含み、前記改変が、前記Ｃｂｌ－Ｂ結合性モチーフを消失させる、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  69. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２０位に対応する位置におけるアスパラギン酸のアミノ酸欠失又はアミノ酸置換を含む、請求項６８に記載の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  70. 前記ＤＮＡＭ－１ポリペプチドが、配列番号１の３２０及び／又は３２１位に対応する位置の後におけるアミノ酸挿入を含む、請求項６８又は６９に記載の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  71. 配列番号１の２９５位に対応する位置におけるリシン、及び／又は配列番号１の３３３位に対応する位置におけるリシンの改変（例えば、アミノ酸置換又はアミノ酸欠失）を含む、改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  72. Ｔ細胞において発現された場合の表面保持を、Ｔ細胞において発現された場合の、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと比較して増大させている、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
  73. 配列番号５～９若しくは２１～３０のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸の配列、又はこれに対する、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又はおよそこれらの比率の配列同一性を有する配列を含み、野生型ＤＮＡＭ－１ポリペプチドと同じ配列を含まない、請求項６４～７２のいずれか一項に記載の改変ＤＮＡＭ－１ポリペプチド。
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