ES2873093T3 - Método para el tratamiento de neoplasias malignas - Google Patents

Abstract

Un plásmido que codifica una citocina inmunoestimuladora IL-12 para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene un tumor canceroso, el método comprende: a) inyectar al tumor canceroso una dosis eficaz del plásmido; b) administrar terapia de electroporación al tumor; y c) administrar una dosis eficaz de un antagonista de PD-1 o PD-L1 al sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el tratamiento de neoplasias malignas

Campo de la invención

La presente invención proporciona el suministro intratumoral de inhibidores de puntos de regulación inmunitarios. En particular, proporciona el suministro de inhibidores de puntos de regulación por electroporación intratumoral.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia ha llamado la atención recientemente como un cuarto método después de la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia para el tratamiento de tumores. Dado que la inmunoterapia utiliza la inmunidad inherente a los humanos, se dice que la carga física sobre los pacientes es menor en la inmunoterapia que en las otras terapias. Los enfoques terapéuticos conocidos como inmunoterapias incluyen: terapia de transferencia celular en la cual las células, tales como las células activadas por linfocinas, las células T asesinas naturales o las células T Y5T obtenidas, por ejemplo, a partir de linfocitos T citotóxicos inducidos exógenamente (CTL) o linfocitos de sangre periférica por cultivo de expansión que se transfieren mediante el uso de diversos métodos; terapia de transferencia de células dendríticas o terapia de vacuna peptídica mediante la cual se espera la inducción in vivo de los CTL específicos de antígeno; terapia con células Th1; y la terapia génica inmunitaria en la que los genes que se espera que tengan diversos efectos se introducen ex vivo en las células mencionadas anteriormente para transferirlas in vivo. En estas inmunoterapias, tradicionalmente se sabe que las células T CD4 positivas y las células T CD8 positivas desempeñan una función fundamental.

En los seres humanos con cáncer, la inmunidad antitumoral suele ser ineficaz debido a la estricta regulación asociada con el mantenimiento de la homeostasis inmunitaria. Una de las principales limitaciones es un proceso conocido como "agotamiento de las células T", que resulta de la exposición crónica a antígenos y se caracteriza por la regulación positiva de los receptores inhibidores. Estos receptores inhibidores sirven como puntos de control inmunitarios para prevenir reacciones inmunitarias incontroladas. Se ha demostrado que el bloqueo de uno o varios de estos puntos de regulación inmunitarios con anticuerpos monoclonales (mAb) rescata las células T antitumorales que de otro modo se agotaron y, lo que es más importante, se ha asociado con respuestas clínicas objetivas en pacientes con cáncer.

La activación óptima de las células T requiere señales contemporáneas a través del receptor de células T y moléculas coestimuladoras. CD28, la molécula coestimuladora prototípica, tras la interacción con sus ligandos B7-1 y B7-2, desempeña una función crucial en el cebado inicial de las células T (ver, por ejemplo, Sharpe y otros, (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:203-209). La expansión de células T mediada por CD28 se opone a otro contrarreceptor B7-1,2, el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), que atenúa la proliferación de células T recientemente activadas (ver, por ejemplo, Krummel y otros, (1996) J. Exp. Med. 183:2533-2540; Leach y otros, (1996) Science 271:1734-1736).

La identificación y caracterización de miembros adicionales de la familia CD28 y B7, PD-1 (muerte programada-1), PD-L1 (ligando de muerte programada-1 o B7-H1) y PD-L2 (B7-DC) ha añadido mayor complejidad al proceso de activación de células T y tolerancia periférica en seres humanos. Similar a la interacción B7-1 y B7-2/CTLA-4, las interacciones de PD-1 con PD-L1 y PD-L2 regulan negativamente las respuestas inmunitarias centrales y periféricas (ver, por ejemplo, Fife y otros, (2008) Immunol. Rev. 224:166-82). En consecuencia, el bloqueo de PD-1 basado en anticuerpos, como C^t L^a -4, se está explorando además en ensayos clínicos en humanos para el tratamiento del cáncer (ver, por ejemplo, Berger y otros (2008) Clin. Cancer Res. 14:3044-3051). Sin embargo, al igual que con CTLA-4, todavía se necesitan terapias mejoradas.

La electroporación in vivo es una técnica de suministro de genes que se ha usado con éxito para el suministro eficiente de ADN plasmídico a muchos tejidos diferentes. Los estudios han informado de la administración de electroporación in vivo para el suministro de ADN plasmídico a melanomas B16 y otros tejidos tumorales. La expresión sistémica y local de un gen o ADNc codificado por un plásmido puede obtenerse con la administración de electroporación in vivo. El uso de la electroporación in vivo mejora la captación de ADN plasmídico en el tejido tumoral, lo que resulta en la expresión dentro del tumor, y suministra plásmidos al tejido muscular, lo que resulta en la expresión sistémica de determinadas moléculas inmunomoduladoras, tales como las citocinas.

Se ha demostrado que la electroporación puede usarse para transfectar células in vivo con ADN plasmídico. Estudios recientes han demostrado que la electroporación es capaz de mejorar el suministro de ADN plasmídico como agente antitumoral. La electroporación se ha administrado para el tratamiento de carcinomas hepatocelulares, adenocarcinoma, tumores de mama, carcinoma de células escamosas y melanoma B16.F10 en modelos de roedores. El modelo de melanoma B16.F10 murino, se han usado ampliamente para probar protocolos de inmunoterapia potenciales para el suministro de una molécula inmunomoduladora que incluye citocinas como proteína recombinante o mediante terapia génica.

Pueden utilizarse diversos protocolos conocidos en la técnica para el suministro del plásmido que codifica un inhibidor de punto de regulación que usa electroporación in vivo para el tratamiento del cáncer. Los protocolos conocidos en la técnica describen la terapia génica basada en citocinas mediada por electroporación in vivo, tanto intratumoral como intramuscular, mediante el uso de corrientes de bajo voltaje y de pulso largo (por ejemplo, ADIL DAUD y otros: "Intratumoral electroporation of plasmid interleukin-12: efficacy and biomarker analyses from a phase 2 study in melanoma (OMS-l100)", JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE, BIOMED CENTRAL, vol. 13, Supl núm. 1, 15 de enero de 2015).

Por consiguiente, lo que se necesita en la técnica es una terapia de combinación cosuministrada de terapia con citocinas inmunoestimuladoras intratumorales y con un inhibidor de punto de regulación, codificada en un plásmido y suministrado mediante electroporación al tumor; o mediante suministro sistémico de la proteína terapéutica inhibidora del punto de regulación, ya sea al mismo tiempo o después de la terapia con citocinas inmunoestimuladoras intratumorales, que proporcionará resultados sustancialmente mejorados en la regresión de tumores cancerosos, tal como el melanoma, mientras que mejorará además sustancialmente las tasas de supervivencia a largo plazo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el título de anticuerpos anti-hCTLA-46 semanas después de la inmunización de una llama. La Figura 2 muestra el título de anticuerpos anti-hCTLA-4 en las semanas 0, 9 y 13 después de la inmunización. El título en la semana 9 se midió una semana después de que la llama recibió un refuerzo de 50 pg de proteína hCTLA4. El título en la semana 13 se midió dos semanas después de dos refuerzos de 500 pg de proteína hCTLA-4.

La Figura 3 muestra ELISA de competencia de CTLA-4/B7.1. Se usaron anticuerpos anti-CTLA-4 de ratón en lugar de anticuerpos anti-CTLA-4 humanos.

La Figura 4 muestra los datos del ensayo de secreción de IL-2 de células Jurkat. Se usaron anticuerpos antagonistas de CTLA-4 de ratón y anti-CTLA-4 de ratón en lugar de sus homólogos humanos. El tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-mCTLA-4 muestra un aumento de la producción de IL-2.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un tumor canceroso, el método comprende:

a) inyectar el tumor canceroso con una dosis eficaz de al menos un plásmido que codifica para al menos una citocina o citocinas inmunoestimuladoras;

b) administrar terapia de electroporación al tumor; y

c) administrar una dosis eficaz de un inhibidor de punto de regulación al sujeto. En una determinada modalidad, la terapia de electroporación comprende la administración de al menos un pulso de voltaje durante una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 1 milisegundo. El pulso de voltaje que puede suministrarse al tumor es de aproximadamente 200 V/cm a aproximadamente 1500 V/cm. En otra modalidad, el inhibidor de punto de regulación se administra por vía sistémica. En otra modalidad, el inhibidor de punto de regulación se codifica en un plásmido y se suministra al tumor canceroso mediante terapia de electroporación. En otra modalidad, el o los inhibidores de puntos de regulación se codifican en el plásmido que codifica la citocina inmunoestimuladora y se suministra al tumor canceroso mediante terapia de electroporación. El inhibidor de punto de regulación es un antagonista de PD-1 o PD-L1. En una modalidad adicional, el método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el inhibidor de punto de regulación se selecciona del grupo que consiste en: nivolumab (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO), pembrolizumab (MK-3475, KEYTRUDA), pidilizumab (CT-011) y MPDL328OA (ROCHE). En otra modalidad más, el inhibidor de punto de regulación se administra después de la electroporación de la citocina inmunoestimuladora. La citocina inmunoestimuladora es IL-12. El tumor canceroso es el melanoma. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención abarca un método para tratar a un sujeto que tiene un tumor canceroso, el método comprende:

a) administrar una primera terapia de electroporación en el tiempo T1, en donde el primer tratamiento comprende además inyectar al tumor canceroso una primera dosis eficaz de plásmido que codifica una citocina o citocinas inmunoestimuladoras;

b) administrar una primera terapia de electroporación al tumor en el tiempo T1, la primera terapia de electroporación comprende además la administración de al menos un pulso de voltaje que tiene una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos;

c) administrar un segundo tratamiento en el tiempo T2, en donde el tiempo T2 es un tiempo posterior al tiempo T1, en donde el segundo tratamiento comprende además inyectar al tumor canceroso una segunda dosis eficaz de al menos un plásmido que codifica para al menos una citocina inmunoestimuladora;

d) administrar una segunda terapia de electroporación al tumor en el tiempo T2, la segunda terapia de electroporación comprende además la administración de al menos un pulso de voltaje que tiene una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos;

e) administrar un tercer tratamiento en el tiempo T3, en donde el tiempo T3 es un tiempo posterior al tiempo T2, en donde el tercer tratamiento comprende además inyectar al tumor canceroso una tercera dosis eficaz de plásmido que codifica una proteína terapéutica;

f) administrar una tercera terapia de electroporación al tumor, la tercera terapia de electroporación comprende además la administración de al menos un pulso de voltaje que tiene una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos; y

g) administrar un inhibidor de punto de regulación después del tiempo T3. En otra modalidad, un pulso de voltaje suministrado al tumor tiene una intensidad de campo de aproximadamente 200 V/cm a aproximadamente 1500 V/cm. En una modalidad adicional, el inhibidor de punto de regulación es un antagonista de al menos una diana del punto de regulación de la Tabla 1. El inhibidor de punto de regulación se selecciona del grupo que consiste en: nivolumab (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO), pembrolizumab (MK-3475, KEYTRUDA), pidilizumab (CT-011) y MPDL328OA (ROCHE) y el inhibidor de punto de regulación se suministra de forma sistémica. En otra modalidad, el inhibidor de punto de regulación se codifica en un plásmido y se suministra al tumor canceroso mediante terapia de electroporación. La citocina inmunoestimuladora es IL-12. El tumor canceroso es melanoma.

Un programa de tratamiento para un paciente que padece un tumor canceroso, en donde el programa de tratamiento comprende:

a) al menos un ciclo de suministro intratumoral de un plásmido que codifica una citocina inmunoestimuladora por electroporación;

b) un intervalo de al menos 20-120 días después de un ciclo;

c) administración al paciente de un inhibidor de punto de regulación o una combinación del inhibidor de punto de regulación con al menos un ciclo adicional de suministro intratumoral de un plásmido que codifica una citocina inmunoestimuladora por electroporación. El inhibidor de punto de regulación es una terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1. En particular, la terapia anti-PD-1/anti PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en: nivolumab (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO), pembrolizumab (MK-3475, KEYTRUDA), pidilizumab (CT -011) y MPDL328OA (ROCHE). En una modalidad, el ciclo de suministro intratumoral comprende al menos un pulso eléctrico que tiene una intensidad de campo de aproximadamente 20 V/cm a aproximadamente 1500 V/cm y una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos. En una modalidad adicional, el ciclo comprende tres tratamientos el día 1, el día 5 y el día 8. En otra modalidad más, el paciente se trata con al menos 3 ciclos.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en la presente descripción, que incluye las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras como "un, una", "un, una" y "el, la" incluyen sus correspondientes referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Todas las referencias citadas la presente descripción se incorporan como referencia en la misma medida que si cada publicación, solicitud de patente o patente individual se indicara específica e individualmente para incorporarse como referencia.

Definiciones

Como se usa en la presente descripción, las moléculas de "punto de regulación inmunitario" se refieren a un grupo de receptores/ligandos de la superficie de la célula inmunitaria que inducen disfunción o apoptosis de células T. Estas dianas inhibidoras inmunitarias atenúan las reacciones inmunitarias excesivas y aseguran la autotolerancia. Las células tumorales aprovechan los efectos supresores de estas moléculas de punto de regulación. Las moléculas diana de los puntos de regulación inmunitario se describen en la Tabla 1.

Tabla 1: Números de acceso de dianas de puntos de regulación

La frase "inhibidor de punto de regulación inmunitaria" incluye moléculas que evitan la supresión inmunitaria al bloquear los efectos de las moléculas del punto de regulación inmunitaria. Los inhibidores de puntos de regulación pueden incluir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, nanocuerpos, diacuerpos, parejas de unión solubles de moléculas de punto de regulación, productos terapéuticos de moléculas pequeñas, antagonistas peptídicos, etc. Los inhibidores incluyen, pero sin limitarse a, los inhibidores de puntos de regulación descritos en la Tabla 1.

La frase "citocina inmunoestimuladora" incluye las citocinas que median o mejoran la respuesta inmunitaria a un antígeno extraño, que incluyen los antígenos virales, bacterianos o tumorales. Las citocinas inmunoestimuladoras innatas pueden incluir, por ejemplo, TNF-a, IL-1, IL-10, IL-12, IL-15, interferones de tipo I (IFN-a e IPN-P), IFN-y y quimiocinas. Las citocinas inmunoestimuladoras adaptativas incluyen, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-5, TGF-p, IL-l0 e IFN-y. En la Tabla 2 más abajo se proporcionan ejemplos de citocinas inmunoestimuladoras.

Tabla 2: Números de acceso de citocinas inmunoestimuladoras

El término "cáncer" incluye una miríada de enfermedades generalmente caracterizadas por la proliferación celular inapropiada, la proliferación celular anormal o excesiva. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitarse a, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer de cerebro o sarcomas. Dichos cánceres pueden ser provocados por factores ambientales, anomalías cromosómicas, trastornos degenerativos del crecimiento y el desarrollo, agentes mitogénicos, radiación ultravioleta (UV), infecciones virales, expresión inapropiada de un gen en los tejidos, alteraciones en la expresión de un gen o agentes cancerígenos.

El término "tratamiento" incluye, pero no sin limitarse a, inhibición o reducción de la proliferación de células cancerosas, destrucción de células cancerosas, prevención de la proliferación de células cancerosas o prevención del inicio de células malignas o detención o reversión de la progresión de células premalignas transformadas en enfermedad maligna o mejora de la enfermedad.

El término "sujeto" se refiere a cualquier animal, preferentemente, un mamífero tal como un ser humano. Además se pretende por esta invención abarcar los usos veterinarios.

Los términos "electroporación", "electropermeabilización" o "mejora electrocinética" ("EP") tal como se usan indistintamente en la presente descripción se refieren al uso de un pulso de campo eléctrico transmembrana para inducir vías microscópicas (poros) en una biomembrana; su presencia permite que biomoléculas tal como plásmidos, oligonucleótidos, los ARNip, fármacos, iones y agua pasen de un lado de la membrana celular al otro.

El término "biomolécula", como se usa en la presente descripción, abarca anticuerpos codificados por plásmidos, fragmentos de anticuerpos, proteínas inmunomoduladoras de longitud completa, dominios solubles de moléculas ancladas a la membrana, proteínas de fusión y similares.

Anticuerpos

La presente invención proporciona un enfoque inmunoterapéutico para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de células cancerosas en un individuo, o reducir o inhibir el desarrollo de cáncer metastásico en un individuo que padece cáncer. La terapia se logra mediante el suministro sistémico de proteínas terapéuticas o el suministro intratumoral de plásmidos que codifican diversas formas solubles de inhibidores de puntos de regulación, mediante el uso de la electroporación. La terapia con inhibidores de puntos de regulación puede ocurrir antes, durante o después del suministro intratumoral por electroporación de la citocina inmunoestimuladora IL-12.

Los inhibidores de puntos de regulación pueden estar en forma de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los cuales pueden codificarse en un plásmido y suministrarse al tumor por electroporación, o suministrarse como proteínas/péptidos por vía sistémica. Como se señaló anteriormente, el suministro de agentes terapéuticos inhibidores de puntos de regulación puede ocurrir antes, durante o después del suministro intratumoral por electroporación de la citocina inmunoestimuladora IL-12.

El término "anticuerpo", como se usa en la presente descripción, incluye inmunoglobulinas, que son el producto de células B y variantes de las mismas. Una inmunoglobulina es una proteína que comprende uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por los genes de la región constante de la inmunoglobulina kappa y lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como también innumerables genes de la región variable de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, las cuales a su vez definen las clases de la inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Se conocen además subclases de la cadena pesada. Por ejemplo, las cadenas pesadas de la IgG en humanos pueden ser cualquiera de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, y cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente de 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente de 50-70 kDa). La porción N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

Los anticuerpos existen como anticuerpos intactos de longitud completa o como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con diversas peptidasas o productos químicos. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab')2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CHi por un enlace disulfuro. El F(ab')2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de la bisagra lo que convierte así el dímero F(ab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un fragmento Fab con la región bisagra (ver, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Un fragmento Fab y un fragmento Fc se generan al digerir IgG con papaína. La papaína corta en la región de la bisagra justo por encima de los residuos involucrados en el enlace S-S entre cadenas, lo que da como resultado fragmentos Fab monovalentes y el fragmento Fc, que incluye dos fragmentos de la región constante, cada uno de los cuales contiene la parte inferior de los dominios de bisagra, CH2 y CH3. Los fragmentos de la región constante de Fc se estabilizan como un dímero a través del enlace S-S entre cadenas de los residuos inferiores de la región de la bisagra.

La inmunoglobulina "Fc" se refiere clásicamente a la porción de la región constante generada por la digestión con papaína. Incluye la bisagra inferior que tiene los enlaces S-S entre cadenas. El término "Fc", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína dimérica que comprende un par de polipéptidos de la región constante de inmunoglobulina, cada uno de los cuales contiene la parte inferior del dominio bisagra, CH2 y CH3. Tal fragmento "Fc" puede o no contener puente de S-S entre cadenas en la región de la bisagra. Debe entenderse que un Fc puede ser de cualquier clase de Ig y, como tal, puede incluir un dominio CH4 tal como en el caso de la IgM. Se conocen secuencias mutantes de un Fc tal como se describe por Wines y otros, J. Immunol. 15 de mayo de 2000; 164(10):5313-8 y puede usarse en la presente descripción.

Mientras que varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que cualquiera de una variedad de fragmentos de anticuerpos puede sintetizarse de novo ya sea químicamente o mediante el uso de la metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en la presente descripción, incluye además fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo o anticuerpos y fragmentos obtenidos al usar metodologías de ADN recombinante.

Los anticuerpos recombinantes pueden ser anticuerpos convencionales de longitud completa, fragmentos de anticuerpos conocidos a partir de digestión proteolítica, fragmentos de anticuerpos únicos tales como Fv o Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos con dominio eliminado y similares. Los fragmentos pueden incluir dominios o polipéptidos con tan solo uno o algunos aminoácidos delecionados o mutados, mientras que es posible una eliminación más extensa, tal como la deleción de uno o más dominios.

Un anticuerpo Fv tiene un tamaño de aproximadamente 50 Kd y comprende las regiones variables de la cadena ligera y pesada. Un polipéptido Fv de cadena sencilla ("scFv") es un heterodímero VH:VL unido covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias que codifican VH y VL ya sea unidas directamente o unidas por un conector que codifica un péptido. Ver, por ejemplo, Huston, y otros (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883. Una serie de estructuras para convertir las cadenas ligera y pesada de polipéptidos naturalmente añadidos, pero separados químicamente, de una región V de anticuerpo en una molécula scFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión al antígeno. Se ha encontrado una alternativa a los fragmentos de anticuerpos tradicionales anteriores en un conjunto de anticuerpos únicos producidos por los sistemas inmunitarios de camellos, llamas y tiburones. A diferencia de otros anticuerpos, estos reactivos de afinidad están compuestos de solo dos cadenas pesadas; mejor aún, un solo dominio forma los sitios de unión al antígeno para estos anticuerpos con cadena pesada. Los dominios pueden incluso modificarse genéticamente para producir fragmentos de anticuerpos recombinantes de un solo dominio extremadamente pequeños y muy estables, llamados "nanocuerpos". Los plásmidos que codifican solo cadena pesada (VHH), anticuerpos de dominio único y nanocuerpos se contemplan además para el suministro intratumoral por electroporación.

Antagonistas solubles

Los antagonistas/inhibidores de moléculas de puntos de regulación pueden ser parejas de unión solubles de los inhibidores de puntos de regulación de la Tabla 1, tales como PD-L1 soluble, que comprende al menos el dominio extracelular (ECD) de PD-L1. Otros inhibidores de puntos de regulación carecerán de manera similar de dominios transmembrana e intracelular, pero son capaces de unirse a sus parejas de unión y provocar un efecto biológico. Para el suministro intratumoral por electroporación, los ECD se codificarán en un vector de expresión y se expresarán cuando se suministren al tumor.

La forma codificada soluble del inhibidor de punto de regulación puede unirse en el vector de expresión al ADN que codifica otra proteína o polipéptido. Dicho otro polipéptido puede ser la porción Fc de una inmunoglobulina, albúmina o cualquier otro tipo de proteína sérica o fragmento de la misma que mantenga la solubilidad de la molécula inhibidora de punto de regulación. La forma soluble de la molécula inhibidora de punto de regulación puede estar unida a una inmunoglobulina a través de la cadena pesada y/o ligera, que puede ser un fragmento o una cadena pesada o ligera de longitud completa. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo que puede dirigirse a un antígeno asociado con una célula cancerosa o tumor.

El inhibidor de punto de regulación soluble se suministra como proteína por vía sistémica o intratumoral mediante electroporación, como ácido nucleico. El ácido nucleico se refiere a un compuesto polinucleotídico, que incluye oligonucleótidos, que comprende nucleósidos o análogos de nucleósidos que tienen bases heterocíclicas nitrogenadas o análogos de bases, unidos covalentemente por enlaces fosfodiéster estándar u otros enlaces. Los ácidos nucleicos pueden incluir ARN, ADN, polímeros quiméricos de ADN-ARN o sus análogos. El ADN puede ser un plásmido que exprese una molécula soluble inhibidora de punto de regulación particular de interés.

El plásmido de ADN usado para la electroporación del inhibidor de punto de regulación soluble codificado, es uno que incluye una secuencia codificante de un antígeno recombinante que puede expresarse en una célula de mamífero, cuando dicho plásmido de ADN ingresa después de la electroporación. Preferentemente, la secuencia codificante es una molécula inhibidora de punto de regulación consenso que provoca una respuesta inmunitaria en el tumor diana. En algunas modalidades, la secuencia codificante está optimizada para la expresión en mamíferos, que pueden incluir uno o más de los siguientes: que incluye la adición de una secuencia Kozak, optimización de codones y optimización de ARN. Estas secuencias de codificación optimizadas pueden subclonarse en diversos vectores disponibles comercialmente.

Terapias de combinación

Se contempla que el suministro sistémico de al menos un producto terapéutico inhibidor de punto de regulación o la electroporación intratumoral del ADN plasmídico que codifica los inhibidores de puntos de regulación puede administrarse con otras entidades terapéuticas, en particular, al menos una citocina inmunoestimuladora, es decir, el suministro intratumoral de IL-12 por electroporación. La administración de las terapias de combinación puede lograrse mediante la electroporación sola o una combinación de electroporación y suministro sistémico.

Otras terapias de combinación contempladas son los inhibidores de puntos de regulación combinados con: agonistas de TLR (por ejemplo, Flagelina, CpG); antagonistas de IL-10 (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-10 o anti-IL-10R); antagonistas de TGF-p, agonistas de CD3; antagonistas de la telomerasa, etc.

Con respecto a la terapia de combinación que utiliza un inhibidor de punto de regulación e IL-12, están en progreso estudios clínicos que incluyen la administración sistémica de pembroluzimab (anticuerpo anti-PD-1) y la administración intratumoral, mediante electroporación, de ADN que codifica una citocina inmunoestimuladora, por ejemplo, IL-12. En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de citocinas inmunoestimuladoras. Más abajo se muestra una descripción del estudio clínico y los datos asociados. Se contempla además que puedan usarse otras terapias con antagonistas de PD-1 en combinación con la expresión intratumoral de IL-12. Los antagonistas de PD-1 incluyen, uno o más de nivolumab (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), pembrolizumab (MK-3475, KEYTRUDA, Merck), pidilizumab (CT-011, CURE TECH), MPDL328OA (ROCHE), etc. Estas terapias pueden administrarse sistémicamente a los niveles de dosificación recomendados, o codificarse en un vector o plásmido de expresión y suministrarse intratumoralmente por electroporación con el vector o plásmido de expresión que codifica ⁱL-12. Se contempla además que los genes que codifican IL-12 y los antagonistas de PD-1 estén codificados en el mismo vector de expresión.

Electroporación

Los dispositivos están contemplados para su uso en pacientes afectados por cáncer u otros crecimientos no cancerosos (benignos). Estos crecimientos pueden manifestarse como una lesión, pólipo, neoplasia (por ejemplo, neoplasia urotelial papilar), papiloma, neoplasia maligna, tumor (por ejemplo, tumor de Klatskin, tumor hiliar, tumor urotelial papilar no invasivo, tumor de células germinales, tumor de Ewing, tumor de Askin, tumor neuroectodérmico primitivo, tumor de células de Leydig, tumor de Wilms, tumor de células de Sertoli), sarcoma, carcinoma (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma cloacogénico, adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma uroteliar papilar invasivo, carcinoma urotelial plano), nódulo o cualquier otro tipo de crecimiento canceroso o no canceroso. Los tumores tratados con los dispositivos y métodos de la presente modalidad pueden ser no invasivos, invasivos, superficiales, papilares, planos, metastásicos, localizados, unicéntricos, multicéntricos, de bajo grado y de alto grado.

Los dispositivos están contemplados para su uso en numerosos tipos de tumores malignos (es decir, cáncer) y tumores benignos. Por ejemplo, los dispositivos y métodos descritos en la presente descripción se contemplan para su uso en cáncer cortical suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares (por ejemplo, cáncer periférico, cáncer de vías biliares distales, cáncer de vías biliares intrahepáticas), cáncer de vejiga, cáncer óseo benigno y canceroso (por ejemplo, osteoma, osteoma osteoide, osteoblastoma, osteocrondroma, hemangioma, fibroma condromixoide, osteosarcoma, condrosarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, tumor de células gigantes del hueso, cordoma, linfoma, mieloma múltiple), cáncer de cerebro y sistema nervioso central (por ejemplo, meningioma, astocitoma oligodendrogliomas, ependimoma, gliomas, meduloblastoma, ganglioglioma, Schwannoma, germinoma, craneofaringioma), cáncer de mama (por ejemplo, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, carcinoma lobular in situ, ginecomastia), enfermedad de Castleman (por ejemplo, hiperplasia de ganglios linfáticos gigantes, hiperplasia de ganglios linfáticos angiofoliculares), cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio (por ejemplo, adenocarcinoma del endometrio, adenocantoma, adenocarcinoma papilar seroso, carcinoma de células claras), cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar (adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células pequeñas), tumores carcinoides gastrointestinales (por ejemplo coriocarcinoma, carioadenoma destruens), enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (por ejemplo, cáncer de células renales), cáncer de laringe e hipofaringe, cáncer de hígado (por ejemplo, hemangioma, adenoma hepático, hiperplasia nodular focal, carcinoma hepatocelular), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de células pequeñas de pulmón, cáncer de células no pequeñas de pulmón), mesotelioma, plasmacitoma, cáncer de cavidad nasal y seno paranasal (por ejemplo, estesioneuroblastoma, granuloma de la línea media), cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, cáncer de glándula pituitaria, cáncer de próstata, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma (por ejemplo, rabdomiosarcoma embrionario, rabdomiosarcoma alveolar, rabdomiosarcoma pleomórfico), cáncer de glándulas salivales, cáncer de piel, ambos melanoma y cáncer de piel no melanoma), cáncer de estómago, cáncer testicular (por ejemplo, seminoma, cáncer de células germinales no seminoma), cáncer de timo, cáncer de tiroides (por ejemplo, carcinoma folicular, carcinoma anaplásico, carcinoma poco diferenciado, carcinoma medular de tiroides, linfoma de tiroides), cáncer vaginal, cáncer de vulva y cáncer uterino (por ejemplo, leiomiosarcoma uterino).

Los dispositivos y métodos descritos de la presente modalidad funcionan para tratar tumores cancerosos mediante el suministro a tumores de terapia eléctrica continuamente y/o en pulsos a tumores durante un período de tiempo que varía desde una fracción de segundo a varios días, semanas y/o meses. En una modalidad preferida, la terapia eléctrica es terapia eléctrica de corriente continua.

El término "electroporación" (es decir, hacer que las membranas celulares sean permeables) como se usa en la presente descripción puede ser causado por cualquier cantidad de culombios, voltaje y/o corriente suministrados a un paciente en cualquier período de tiempo suficiente para abrir agujeros en las membranas celulares (por ejemplo, para permitir difusión de moléculas tales como productos farmacéuticos, soluciones, genes y otros agentes en una célula viable).

El suministro de terapia eléctrica al tejido provoca una serie de reacciones biológicas y electroquímicas. A un voltaje suficientemente alto, las estructuras celulares y el metabolismo celular se ven gravemente alterados por la aplicación de la terapia eléctrica. Aunque tanto las células cancerosas como las no cancerosas se destruyen en ciertos niveles de terapia eléctrica, las células tumorales son más sensibles a los cambios en su microambiente que las células no cancerosas. Las distribuciones de macroelementos y microelementos se modifican como resultado de la terapia eléctrica.

En una configuración de electrodo único, el voltaje puede aplicarse durante fracciones de segundos a horas entre un electrodo de plomo y la carcasa del generador, para comenzar la destrucción del tejido canceroso. La aplicación de un voltaje dado puede ser en una serie de pulsos, con cada pulso que dura de fracciones de segundo a varios minutos. En determinadas modalidades, la duración o el ancho del pulso puede ser de aproximadamente. El voltaje bajo puede aplicarse además por una duración de fracciones de segundos a minutos, lo que puede atraer glóbulos blancos al sitio del tumor. De esta manera, el sistema inmunitario mediado por células puede eliminar las células tumorales muertas y puede desarrollar anticuerpos contra las células tumorales. Además, el sistema inmunitario estimulado puede atacar las células tumorales del límite y las de metástasis.

Pueden usarse varios adyuvantes para aumentar cualquier respuesta inmunológica, en dependencia de la especie huésped, que incluye pero no se limita a adyuvantes de Freund (completos e incompletos), sales minerales tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, diversas citocinas, sustancias activas de superficie tales como la lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo Calmette-Guerin).

y Corynebacterium parvum. Alternativamente, la respuesta inmunitaria podría potenciarse mediante la combinación y/o el acoplamiento con moléculas tales como hemocianina de lapa californiana, toxoide tetánico, toxoide diftérico, ovoalbúmina, toxina del cólera o sus fragmentos.

La patente de Estados Unidos núm. 7,245,963 de Draghia-Akli, y otros describe los sistemas de electrodos modulares y su uso para facilitar la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los sistemas de electrodos modulares comprenden una pluralidad de electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona un enlace conductivo desde un controlador de pulso de corriente constante programable a la pluralidad de electrodos de aguja; y una fuente de energía. Un operador puede agarrar la pluralidad de electrodos de aguja que están montados en una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Las biomoléculas se suministran después a través de la aguja hipodérmica al tejido seleccionado. El controlador de pulso de corriente constante programable se activa y el pulso eléctrico de corriente constante se aplica a la pluralidad de electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la biomolécula en la célula entre la pluralidad de electrodos. Todo el contenido de la patente de Estados Unidos núm. 7,245,963 se incorpora por la presente como referencia.

La publicación de patente de Estados Unidos 2005/0052630 describe un dispositivo de electroporación que puede usarse para facilitar eficazmente la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El dispositivo de electroporación comprende un dispositivo electrocinético ("dispositivo EKD") cuya operación se especifica mediante software o soporte lógico inalterable (firmware). El dispositivo EKD produce una serie de patrones de pulso programables de corriente constante entre electrodos en una matriz basada en el control del usuario y la entrada de los parámetros de pulso, y permite el almacenamiento y la adquisición de datos en forma de onda de corriente. El dispositivo de electroporación comprende además un disco de electrodo reemplazable que tiene una matriz de electrodos de aguja, un canal de inyección central para una aguja de inyección y un disco guía extraíble (ver, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos 2005/0052630).

Las matrices de electrodos y los métodos descritos en la patente de Estados Unidos núm. 7,245,963 y la publicación de patente de Estados Unidos 2005/0052630 se adaptan para una penetración profunda no solo en tejidos tal como el músculo, sino también en otros tejidos u órganos. Debido a la configuración de la matriz de electrodos, la aguja de inyección (para suministrar la biomolécula de elección) además se inserta completamente en el órgano diana, y la inyección se administra perpendicularmente al punto diana, en el área previamente delineada por los electrodos. La captación de los vectores de suministro no virales para su uso en la presente invención puede potenciarse además mediante electroporación de plasma, también denominada transfección por avalancha. Brevemente, las descargas de microsegundos crean microburbujas de cavitación en la superficie del electrodo. La fuerza mecánica creada por el colapso de las microburbujas combinadas con el campo magnético sirve para aumentar la eficiencia del transporte a través de la membrana celular en comparación con el transporte mediado por difusión asociado con la electroporación convencional. La técnica de electroporación de plasma se describe en la patente de Estados Unidos núm. 7,923,251 de Vankov y otros, concedida el 12 de abril de 2011 y la patente de Estados Unidos núm.

8,283,171 de Vankov y otros, concedida el 9 de octubre de 2012. Esta técnica puede emplearse además in vivo para la transformación de células. Chalberg, y otros (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090; Chalberg, y otros patente de Estados Unidos núm. 8,101169 concedida el 24 de enero de 2012.

Estadificación de las lesiones de melanoma

El sistema TNM (ver, por ejemplo, Edge SB y otros (2010) "Melanoma of the skin", AJCC Cancer Staging Manual. 7a ed. Nueva York, NY: Springer-Verlag) se usa para evaluar las características de las lesiones y determinar el estadio de la enfermedad.

Las categorías T (tumor) se basan en el grosor del melanoma y otros factores clave observados en la biopsia de piel (grosor del tumor, índice mitótico y ulceración). La Tabla 3 proporciona una clasificación adicional de las evaluaciones del grupo T.

Tabla 3: Clasificación T para tumores primarios

Las categorías N (ganglios linfáticos) dependen de la presencia/número de ganglio o ganglios linfáticos centinelas/distantes con tumor detectable. Las categorías M (metástasis) dependen de la presencia, ubicación y gravedad de la metástasis. La Tabla 4 proporciona una clasificación adicional de las evaluaciones del grupo N.

Tabla 4: Clasificación N en los ganglios linfáticos regionales

Una vez que se han determinado los grupos T, N y M, se combinan para dar una etapa general, mediante el uso de números romanos I a IV (1 a 4) y algunas veces subdivididos con el uso de letras mayúsculas. La Tabla 5 proporciona una clasificación adicional de las evaluaciones del grupo M.

Tabla 5: Clasificaciones M de metástasis

Ejemplo de estadio IIIB - T1a a T4a, N2c, M0: el tumor puede tener cualquier grosor, pero no está ulcerado. Se ha diseminado a áreas pequeñas de la piel cercana (tumores satélites) o canales linfáticos (tumores en tránsito) alrededor del tumor original, pero los ganglios no contienen melanoma. No hay diseminación distante.

Ejemplo de estadio IV: cualquier T, cualquier N, M1 (a, b o c): el melanoma se ha diseminado más allá del área original de la piel y los ganglios linfáticos cercanos a otros órganos como el pulmón, el hígado o el cerebro, o a áreas distantes de la piel, tejido subcutáneo o ganglios linfáticos distantes.

Medición de resultados clínicos

Los resultados clínicos en los ensayos de melanoma pueden medirse mediante los Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST). RECIST proporciona pautas que definen cuándo los tumores mejoran ("responden"), permanecen igual ("estabilizan") o empeoran ("progresan").

La suma del diámetro más largo (LD) para todas las lesiones diana será la suma de LD del inicio. Esto se usará como referencia para caracterizar la respuesta tumoral objetiva en la lesión o lesiones diana.

a. La respuesta completa (CR) es la desaparición de todas las lesiones diana;

b. La respuesta parcial (PR) muestra al menos una disminución de 30 % en la suma de la LD de las lesiones diana;

c. La Enfermedad Estable (SD) ocurre si no hay suficiente contracción para calificar para PR ni aumento suficiente para calificar para Enfermedad Progresiva (PD); y

d. Enfermedad progresiva (PD): aumento de al menos un 20 % en la suma de la LD de las lesiones diana o la aparición de una o más lesiones nuevas.

Puede usarse además un RECIST "modificado" para medir los resultados del tratamiento clínico. RECIST modificado de "piel": calculado por la suma de todas las lesiones medibles (>0,3 cm). Se usarán los siguientes criterios para definir una lesión tumoral medible: No se definirá un número máximo de lesiones cutáneas; todas las lesiones cutáneas medibles se incluirán en la evaluación del tumor diana; suma de todas las lesiones cutáneas medibles usadas para caracterizar la respuesta a la terapia; y se permiten nuevas lesiones en la piel si la suma total del aumento es <30 % desde el nadir.

Puede usarse una medición adicional más refinada, conocida como Criterios de respuesta inmunológica modificada (irRC) y puede calcularse mediante la suma de todas las lesiones medibles (> 0,3 cm). Pueden usarse los siguientes criterios para definir una lesión tumoral medible: se permiten hasta 10 lesiones viscerales como lesiones índice para evaluación; las nuevas lesiones no excluyen automáticamente una respuesta completa (CR); las nuevas lesiones se añaden a la suma de los diámetros una vez que se consideran medibles; y Carga tumoral irRC modificada = SPD índice SPD Nuevo medible. SPD es la suma de los diámetros perpendiculares de cada lesión. El índice representa 10 lesiones viscerales que se observan antes del tratamiento, y Nuevo medible representa nuevas lesiones que aparecen durante el tratamiento.

La respuesta completa (CR) tanto para RECIST de "piel" modificado como para irRC modificado se define como la desaparición completa de todas las lesiones (medibles o no) y la ausencia de nuevas lesiones durante al menos 4 semanas de duración, confirmado por exploración adicional y visita 4 a 6 semanas después de la primera documentación de CR.

La respuesta parcial (PR) se define como RECIST "cutáneo" modificado: disminución >30 % en el LD desde el inicio. La fecha de respuesta es la fecha de la documentación inicial de respuesta. IrRC modificado: disminución >50 % en el producto de los diámetros desde el inicio. La fecha de respuesta es la fecha de la documentación inicial de respuesta.

La progresión de la enfermedad (PD) se define como RECIST "cutáneo" modificado: aumento >20 % en el LD. Además del aumento relativo de 20 %, la suma debe además demostrar un aumento absoluto de >5 mm2. IrRC modificado: aumento > 25 % en los productos de los diámetros.

Ejemplos

I. Inmunización de las llamas

Los anticuerpos se generaron en llamas (Abcore) siguiendo un método de cebado/refuerzo en el que las tres inmunizaciones iniciales se administraron mediante electroporación de un plásmido que codifica el antígeno de interés seguido de dos refuerzos posteriores con proteínas. El cebado mediante inmunización con ADN se realizó los días 1, 14 y 28 mediante inyección de 250 pg de plásmido que expresa el dominio extracelular de CTLA-4 humano por vía intradérmica en la llama seguido de electroporación y repetición del proceso en un área adyacente. A la llama se le administraron los dos últimos refuerzos los días 56 y 84 mediante inyección subcutánea de 50 pg de proteína CTLA-4 humana (Sino Biological) emulsionada con 2 mL de Adyuvante Incompleto de Freund (MP Biologicals). Se tomaron muestras de sangre durante el proceso de inmunización para controlar los niveles de títulos.

II. Síntesis de ADNc para el aislamiento de anticuerpos de dominio único

Los linfocitos de sangre periférica (PBL) se aíslan de la sangre completa extraída de la llama al final del ciclo de inmunización mediante separación por gradiente de densidad. La sangre completa se mezcla 50:50 con PBS complementado con FBS al 2 % antes de la centrifugación con Lymphoprep (Stemcell), un medio de gradiente de densidad. La capa de PBL se aísla y el ARN total se extrae del PBL mediante el uso de un kit RNeasy maxi (Qiagen). El ADNc se sintetiza mediante el uso de un kit de síntesis de ADNc de primera cadena (GE Healthcare).

III. Aislamiento de anticuerpos de dominio único

Se usa una estrategia de PCR anidada para aislar los genes VHH mediante el uso del ADNc sintetizado a partir del ARN extraído de los PBL de la llama inmunizada. Se realiza una PCR primaria mediante el uso de los cebadores directos MJ1, MJ2, MJ3, VHBACKA6 y el cebador inverso CH2FORTA4 (ver, por ejemplo, Baral y otros, (2013) Curr. Protoc. Immunol. 103: 2.17.1-2.17.57 y Sabir y otros, (2014) CR Biol., 337: 244-249) para amplificar los dominios variables tanto de VHH como de VH. El fragmento VHH (-550-650 pb) se separa del fragmento VH (~ 900 pb) mediante electroforesis en gel y el fragmento VHH se purifica mediante el uso de un kit de extracción en gel (Qiagen). Se realizó una reacción de PCR secundaria mediante el uso de cebadores directos MJ7, VHBACKA5 y cebadores inversos MJ8, F4rev con sitios de restricción Sfil específicos para el vector fagémido pADL-20c (Antibody Design Labs) adjunto a los flancos. Los productos finales de la PCR se ligan en el vector fagémido pADL-20c mediante el uso de los sitios de restricción Sfil. El plásmido ligado se usa después para transformar células de E. coli TG1 electrocompetentes para la presentación en fagos.

El repertorio de VHH se expresa en partículas de fago después de rescatar con el fago auxiliar M13K07 (Antibody Design Labs). El VHH que es específico para CTLA-4 humano se enriquece mediante realización de tres a cinco rondas de purificación por afinidad contra proteína recombinante CTLA-4 humana recubierta en placas de microtitulación Maxisorb (Sigma-Aldrich). El fago unido se eluye mediante la adición de trietilamina 0,1 M. La solución se neutraliza con Tris-HCl 1 M a pH 7,4.

El fago eluido se usa para infectar células TG1 de crecimiento exponencial. Los clones individuales seleccionados en la última ronda de purificación por afinidad se secuencian y prueban contra CTLA-4 humano en un ELISA de unión a fagos. Los clones se cultivan en medio 2xYT complementado con 0,1 pg/mL de carbenicilina y glucosa al 0,2 % a OD ~ 0,5. Después se añade el fago auxiliar M13K07 en un exceso de 20 veces junto con kanamicina a una concentración final de 50 pg/mL. Los clones se amplifican mediante incubación durante la noche a 37 °C con agitación. Después los cultivos de clones se centrifugan a 4000 rpm a 4 °C durante 15 minutos para sedimentar las células. Se transfieren 100 pL de sobrenadante que contiene el fago a placas de microtitulación recubiertas previamente con CTLA-4 humano. Después de una incubación de 2 horas a 37 °C, la placa de microtitulación se lava tres veces con Tween-20 al 0,1 % en PBS (PBST) seguido de la adición de anticuerpo anti-M13 HRP (Abcam). Los fagos con VHH unidos a CTLA-4 humano se detectan mediante la adición de TMB (Pierce). El desarrollo se detiene mediante la adición de H²SO⁴4N y la absorción se lee en un Spectramax (Molecular Devices) ajustado a una OD de 450 nm.

IV. Unión de CTLA-4

La interacción con CTLA-4 se mide mediante la detección de un anticuerpo anti-CTLA-4 humano o un fragmento de anticuerpo que se une a la proteína recombinante CTLA-4 humana inmovilizada (Sino Biological). La proteína CTLA-4 humana recombinante se recubre sobre placas de EIA de alta unión (Corning) durante la noche a 4 °C. Después del lavado de los pocillos con PBST (Tween-20 al 0,1 % en PBS), la placa se bloquea con Super Block (Scytek) durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava con PBST y se añaden muestras de prueba de anti-CTLA-4 humano a los pocillos y se incuban durante 1 hora. Los pocillos se lavan de nuevo con PBST y se añade el anti-IgG humano secundario de cabra (H+L) (Jackson Immunoresearch). Después de 1 hora de incubación, el secundario se lava con PBST y la placa se revela con TMB (Pierce). El desarrollo del color se detiene con H²SO⁴4N y se lee la densidad óptica en un espectrofotómetro ajustado a 450 nm para medir la afinidad de unión del anti-CTLA-4 humano a la proteína recombinante CTLA-4 humana.

Ensayo competitivo de B7 y CTLA-4

In vitro, la actividad anti-CTLA-4 humano se mide por su capacidad para bloquear la interacción entre la proteína CTLA-4 humana con sus ligandos, B7.1 y B7.2. El B7.1 humano o B7.2 humano recombinantes (R&D Systems) se recubren sobre placas de EIA de alta unión (Corning) durante la noche a 4 °C. Después del lavado de los pocillos con PBST (Tween-20 al 0,1 % en PBS), la placa se bloquea con Super Block (Scytek) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se mezcla una titulación de anti-CTLA-4 humano con una concentración constante de anti-CTLA-4 humano recombinante. Después de retirar el Super Block de los pocillos y lavar la placa con PBST, se añade la mezcla de anti-CTLA-4 humano/CTLA-4 humano a los pocillos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBST y se añade anti-CTLA-4 humano biotinilado (R&D Systems) a los pocillos de muestra y se incuban durante 1 hora. La placa se lava de nuevo con PBST y se añade estreptavidina-HRP (Abcam) a los pocillos. Después de 1 hora de incubación, la estreptavidina-HRP no unida se lava con PBST y la placa se revela con TMB (Pierce). El desarrollo del color se detiene mediante la adición de H²SO⁴4N y la densidad óptica se lee en un espectrofotómetro ajustado a 450 nm para medir el bloqueo de la unión de CTLA-4 humano a hB7.1 o hB7.2 mediante la prueba de anti-CTLA-4 humano. muestras. La curva de inhibición se representa y se calcula la IC⁵⁰ mediante el uso del software tal como Prism (GraphPad).

El ensayo anterior se corrió con anticuerpo anti-CTLA-4 de ratón (eBioscience) y proteína mCTLA 100 ng/mL (Sino Biological). Los resultados se muestran en la Figura 3.

VI. Ensayo de liberación de IL-2 de Jurkat

La actividad anti-CTLA-4 humano se mide en un sistema celular por su capacidad para bloquear la inhibición de CTLA-4 de la secreción de IL-2 inducida por B7 en células Jurkat. Se cultivan células Jurkat (At CC) en RPMI-1640 (Corning) complementado con FBS al 10 % y L-glutamina 2 mM. Las células se recogen y se llevan al medio de ensayo (RPMI-1640 complementado con FBS al 5 % y L-glutamina 2 mM) y se siembran en pocillos de una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos (Greiner Bio-One). A continuación, las Jurkats se coestimulan con PHA-L (Sigma) y proteína B7.1 humana recombinante (R&D Systems). Se mezcla una concentración constante de proteína CTLA-4 recombinante humana (R&D Systems) con una titulación de anti-CTLA-4 humano y la solución se añade a las células Jurkat estimuladas y se incuba en una incubadora humidificada con CO² al 5 % a 37 °C durante 2-3 días. Se recolecta el sobrenadante y se miden los niveles de IL-2 mediante el uso de un kit de detección de IL-2 de doble conjunto (R&D systems). La IL-2 medida se representa gráficamente y se calcula la EC⁵⁰ del anti-CTLA-4 en Prism. El ensayo anterior se realizó con el anticuerpo y la proteína CTLA-4 de ratón. Los resultados se muestran en la Figura 4.

VIII. Tumores y ratones

Las células de melanoma murino B16.F10 (CRL 6475; Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD) se mantienen en medio Eagle mínimo de Dulbecco (DMEM) complementado con FCS al 10 % y 0. 2 % de gentamicina. Las células se tratan con tripsina y se lavan en PBS estéril antes de la inyección. Se afeita el flanco izquierdo de ratones C57BL/6 (Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD) y se inyectan subcutáneamente 1 x 10⁶ células en 50 mL de PBS estéril. Cuando se provocaron, los ratones se inyectaron con 5 x 10⁵ células B16.F10 en el flanco derecho. Los tumores se miden mediante el uso de calibradores digitales y el tratamiento se inicia cuando los tumores alcanzan de 3 a 5 mm de diámetro, 7 a 10 días después de la inyección. Los ratones se alojan de acuerdo con las pautas de AALAC.

IX. ADN plasmídico

Se generan plásmidos pUMVC3 (ALDEVERON) que contienen ADN que codifica inhibidores de puntos de regulación (por ejemplo, anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos) e IL-12. El pUMVC3 que contiene un inhibidor de punto de regulación se prepara con un kit sin endotoxinas. Todo el ADN plasmídico se diluye en solución salina inyectable estéril (0,9 %) y se almacena a 20 °C.

X. Tratamiento intratumoral

Los ratones se anestesian mediante el uso de 97 % de oxígeno y 3 % de isoflurano. Los tumores se inyectan con 50 l_il (1,0 |jg/mL) de ADN plasmídico en solución salina estéril mediante el uso de una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 25. Se inserta en el tumor un aplicador que contiene seis electrodos penetrantes de 1 cm de diámetro. Se suministran hasta seis pulsos a 1500 V/ m (99 its, 1 Hz) utilizando un generador de pulsos adecuado. XI. Histología

Los ratones son sacrificados humanamente por asfixia con CO². Los tumores se extirpan y se colocan en tubos cónicos de 50 mL que contienen 10 mL de formalina al 10 %. El tejido se tiñe con H&E después de la fijación, de la siguiente manera: después de la fijación en formalina tamponada neutra al 10 % durante 6 horas, las muestras de tejido representativas se procesan en bloques de parafina mediante el uso de un procesador de tejido Miles VIP (Miles Inc., Mishawaka, IN). Brevemente, los tejidos se deshidratan en grados ascendentes de etanol, se limpian en xileno y se infiltran en parafina (Tissue Prep 2; Fisher Scientific). Después de la incrustación, los tejidos se seccionan en un micrótomo rotatorio estándar y se recuperan secciones de 4 mm de un baño de agua y se montan en portaobjetos de vidrio. Se examinan tres secciones por tumor. Las secciones se secan con calor y se tiñen con H&E (Richard-Allen Scientific, Kalamazoo, MI) mediante el uso de técnicas histológicas estándar.

XII. Inmunohistoquímica

La tinción inmunohistoquímica se realiza para examinar los tumores en busca de la presencia de linfocitos CD4+, linfocitos CD8+ y vasos sanguíneos mediante el uso de los siguientes anticuerpos: anticuerpo de rata contra CD4 de ratón, anticuerpo de rata contra CD8 de ratón (Ly2) y anticuerpo de rata contra CD31 de ratón (PECAM- 1), respectivamente (PharMingen, Cambridge, MA). Los ratones son sacrificados humanamente por asfixia con CO². Los tumores se extirpan con unas tijeras y se elimina la piel, más tarde se congelan inmediatamente en una mezcla de hielo seco y etanol, y se almacenan a (80 °C). Se obtienen secciones congeladas de 5 mm. Para el análisis inmunohistoquímico, se aplica anticuerpo de rata contra CD4 de ratón, anticuerpo de rata contra CD8 de ratón (Ly2) o anticuerpo de rata contra CD31 de ratón (PECAM-1) a las secciones de tejido a una dilución de 1:50 y se incuba durante 30 minutos, seguido por detección con el kit Vector Elite Rat IgG Peroxidase a una concentración de 2X (15 minutos cada uno en anti-IgG biotinilada de rata y complejo ABC). La inmunotinción se lleva a cabo en el equipo de tinción automático Dako. Las secciones se analizan con un aumento de 400X.

XII. Estudio clínico núm. 1: IL-12 intratumoral en el cáncer de mama triple negativo

Este estudio evaluó los efectos farmacodinámicos de la inyección intratumoral de pIL-12 seguida inmediatamente de electroporación. Los pacientes fueron reclutados en un centro de estudio en los Estados Unidos. En este estudio se trató a un mínimo de diez pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) accesible mediante biopsia. Todos los pacientes recibieron un único ciclo de tratamiento de 28 días. Durante la selección, el investigador seleccionó una lesión de control para que no se tratara (es decir, no inyectada, no electroporada). La lesión de control no tratada tenía al menos 0,5 cm de diámetro más largo y era accesible para biopsia. El tratamiento se administró los días 1, 5 y 8. Se permitió un período de ± 2 días para cada tratamiento planificado para adaptarse a las restricciones de programación. Se administró tratamiento a cada lesión planificada como se define más abajo. Los tratamientos consistieron en inyecciones intratumorales de pIL-12 seguidas inmediatamente de electroporación. Al final del ciclo de tratamiento, los pacientes regresaron a la clínica para una evaluación de seguridad general y una muestra de biopsia del tumor (visita de fin del estudio). La visita de fin de estudio (EOS) se realizó antes de iniciar cualquier nuevo tratamiento/régimen contra el cáncer y dentro de los 20 días (± 2 días) del último tratamiento con IT-pIL-12-EP.

Los pacientes tenían un diagnóstico histológico confirmado de cáncer de mama triple negativo (TNBC) localmente avanzado, inoperable, metastásico y/o refractario al tratamiento. La enfermedad refractaria al tratamiento se definió como la persistencia de las lesiones tumorales después de al menos una intervención previa que puede incluir quimioterapia, radiación y/o cirugía, o cualquier combinación de las mismas. Los pacientes deben haber tenido tinciones de ER y PR <5 %, y ser HER2 negativo [inmunohistoquímica 0 a 1+ o hibridación fluorescente in situ (FISH) negativa]. Pueden inscribirse además pacientes con tinción ER o PR de 5-10 %, pero que históricamente habían sido tratados como TNBC. Los pacientes NO deben haber tenido una enfermedad que, en opinión del investigador, se consideró susceptible de tratamiento potencialmente curativo. Los pacientes debían tener un estado funcional según escala del Grupo Oncológico Cooperativo del Este (ECOG) de 0-1, tener > 18 años y una esperanza de vida de al menos 6 meses. Los pacientes pueden haber recibido radioterapia, pero deben tener una enfermedad progresiva después de la radioterapia si las lesiones a tratar se encuentran dentro del campo de radiación. Además, el tratamiento con radiación debe completarse al menos 4 semanas antes del Día 1 del Ciclo 1. Los pacientes deben haber tenido lesiones accesibles para inyección y electroporación, definidas como enfermedad cutánea o subcutánea. Los pacientes deben haber tenido al menos 2 lesiones anatómicamente distintas accesibles para biopsia. Una de estas lesiones permaneció sin tratar y se evaluó en busca de biomarcadores de mayor inmunogenicidad.

El vector de plásmido de ADN (pUMVC3-hIL-12-NGVL331, denominado "pIL-12"), que expresa ADNc de IL-12, contenía las subunidades p35 y p40 de IL-12 humana separadas por un sitio de entrada ribosómico interno impulsado por un solo promotor de CMV. pIL-12 se formuló en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para inyección intratumoral directa después de la EP in vivo. El pIL-12 de grado GMP fue fabricado por VGXI USA y los lotes disponibles se suministraron como viales de 2,0 mL a una concentración de 0,5 mg/mL y un volumen de llenado de 1,5 mL. Los viales sin abrir de pIL-12 se almacenaron en un congelador seguro, con control continuo de la temperatura y con alarma en la farmacia u otro lugar seguro apropiado a -20 °C ± 5 °C. Si se producían variaciones de temperatura, se notificaba al patrocinador del estudio antes de que se utilizara el plásmido pIL-12 para el tratamiento del estudio. Una persona autorizada en el lugar del ensayo registró la recepción y dispensación de la medicación de prueba. Los suministros clínicos no se usaron para ningún otro propósito que no sea el indicado en el protocolo.

Antes de la inyección de plásmido, con el uso de precauciones estériles, se inyectó lidocaína al 1 % alrededor de la lesión para obtener anestesia local. Se utilizaron anestésicos locales alternativos según lo indicado clínicamente y se consideró clínicamente óptimo. Además, el paciente recibió analgésicos o ansiolíticos según fuera necesario antes o durante el tratamiento. Si se inyectaba anestesia local directamente en la lesión para mitigar el malestar, se dejaba pasar un mínimo de 2 minutos para la difusión del tejido antes de inyectar el plásmido. En situaciones que involucran pacientes con enfermedad extensa, se utilizó sedación consciente a discreción del investigador tratante para manejar mejor y minimizar la incomodidad del paciente. La sedación consciente se realizó de acuerdo con las pautas y requisitos institucionales.

Después de inyectar la solución de plásmido en la lesión accesible, se colocó un aplicador estéril que contenía 6 electrodos de acero inoxidable dispuestos en un círculo alrededor del tumor. El aplicador se conectó a la fuente de alimentación y se administraron seis pulsos a una intensidad de campo (E+) de 1500 V/cm y un ancho de pulso de 100 |js a intervalos de 1 segundo a cada tumor previamente inyectado. Los pulsos de electroporación fueron entre seis electrodos de aguja opuestos hexagonales. Después del primer pulso, la polaridad entre los pares de electrodos de aguja opuestos se invirtió y el par de agujas se pulsa de nuevo. Después del pulso emparejado inicial, el suministro de pulsos se rotó en el sentido de las agujas del reloj hasta los siguientes pares de agujas opuestos hasta que se suministraron un total de seis pulsos para completar la secuencia de electroporación. Una vez que la lesión ha sido tratada por completo, se inyecta el siguiente tumor y se somete a electroporación inmediatamente. Se recomendó el uso de guía ecográfica para el tratamiento de lesiones donde sería apropiado un mapeo estructural adicional.

La solución de plásmido se dispensó a una concentración de 0,5 mg/mL. Se usó el tamaño del tumor para calcular la dosis total por lesión y por paciente. Las porciones no usadas de cada vial se desecharon en recipientes de riesgo biológico aprobados y se eliminaron según los requisitos institucionales. En los días de dosificación (Días 1, 5 y 8 del ciclo de tratamiento), el farmacéutico del centro, o el personal designado autorizado por el Investigador Principal, retiró el número requerido de viales de pIL-12 del congelador a -20 °C para descongelar. Una vez descongelada, la solución de dosificación se preparó asépticamente. La administración de la solución de dosificación al sujeto se realizó dentro de las 8 horas de preparación. Para obtener detalles adicionales sobre el almacenamiento, la manipulación y la preparación del plásmido, consulte el Manual de farmacia.

En el examen inicial, se determinaron las lesiones accesibles (AL). Las AL a tratar se seleccionaron antes del ciclo de tratamiento y se midieron en centímetros. El volumen de inyección de plásmido (P) para cada lesión se calculó con la siguiente fórmula: P = ab2/8.

Donde (a) es el diámetro más largo y (b) es el diámetro perpendicular a en centímetros (a). Cada lesión recibió un volumen mínimo de inyección de plásmido de 0,1 mL. Para las lesiones pequeñas con un volumen de P calculado de menos de 0,1 mL, se administró el volumen mínimo de 0,1 mL. No se definió un número máximo de lesiones a tratar, pero el volumen total de inyección de plásmido por paciente por día no debía exceder los 20 mL. Cuando fue apropiado, cada jeringa de tratamiento se llenó con 0,1 mL adicionales al volumen de inyección de plásmido calculado para tener en cuenta el espacio muerto de la aguja. Cada lesión tratada el día 1 del ciclo también se trató los días 5 y 8 de ese ciclo. Para lesiones más grandes, las inyecciones de plásmido y la electroporación se dirigieron a los márgenes periféricos del tumor, que se pensó que representaba el aspecto inmunológicamente más activo del tumor.

Se consideró que un sujeto individual había completado el estudio si el paciente recibió los tres tratamientos IT-pIL-EP (Día 1, 5, 8), se obtuvieron todas las biopsias tumorales requeridas antes y después del tratamiento, y se realizaron evaluaciones de seguimiento de la seguridad de la EOS. La duración de la participación en el estudio fue de aproximadamente 4 semanas para cada paciente. El estudio se completó una vez que el último paciente completó todo el tratamiento requerido y completó la evaluación de seguimiento de seguridad de la EOS. Se esperaba que la duración total del estudio fuera de aproximadamente 12 meses. Se requirieron aproximadamente 10 meses para inscribir a todos los sujetos.

En la selección, el investigador identificó lesiones accesibles para inyección y electroporación, definidas como enfermedad cutánea o subcutánea. Una lesión accesible era aquella a la que se podía llegar desde la superficie con la matriz de agujas de electroporación. Las sondas de la matriz de agujas alcanzaron una profundidad de hasta 1,5 cm. Solo las lesiones accesibles documentadas que estaban en un lugar adecuado y seguro para la aplicación de electroporación fueron elegibles para el tratamiento. Las mismas lesiones accesibles se trataron los días 1, 5 y 8 del ciclo de tratamiento.

En la selección, el investigador designó una lesión anatómicamente distinta como lesión de control, para que no se tratara (es decir, no inyectada, no electroporada). Esta lesión de control fue accesible mediante biopsia.

Todos los pacientes dieron su consentimiento para las biopsias tumorales específicas del estudio en cada uno de dos momentos separados (pretratamiento y EOS) para el análisis molecular e histológico. Se requirió al menos una muestra de biopsia en la selección; las biopsias adicionales fueron opcionales y se obtuvieron si era posible. En la EOS se obtuvo un conjunto de muestras de biopsia posteriores al tratamiento de una lesión no tratada (lesión de control) y al menos una lesión tratada. Para los pacientes con evidencia de regresión o progresión de la lesión tumoral antes de la EOS, se solicitaron muestras de biopsia tumoral al primer signo de cambio tumoral. A discreción del investigador, un equipo central de revisión de patología estaba disponible para facilitar la recolección de muestras de biopsia y asegurar que las muestras recolectadas obtuvieran una cantidad suficiente de tumor para análisis. Todas las muestras de biopsia obtenidas se evaluaron para determinar la presencia de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), expresión de IL-12 y otros marcadores de fenotipo inmunológico o inmunogénico mejorado mediante inmunohistoquímica multiparamétrica (IHC) y Nanostring®. Se realizaron evaluaciones de biomarcadores adicionales basadas en datos emergentes. Los análisis de biomarcadores requieren la comparación de biopsias antes y después del tratamiento que contenían una muestra adecuada y representativa de los tumores de los pacientes. En el caso de que una muestra de biopsia no contenga una cantidad suficiente de tumor, el Patrocinador solicitó lo siguiente según corresponda: tejido tumoral de archivo obtenido dentro de los 90 días anteriores a la selección Y sin administración de terapia sistémica para el cáncer en el ínterin si la muestra del tumor es inadecuada en la Selección/Inicio. Permiso del paciente para obtener biopsias adicionales de lesiones tratadas y/o no tratadas si el muestreo del tumor es inadecuado en la visita de EOS.

El objetivo principal del estudio fue evaluar el potencial de IT-pIL12-EP para promover una firma molecular e histológica proinflamatoria tanto a nivel local como sistémico. Esto se evaluó mediante comparación de la presencia de TIL al inicio (es decir, antes del tratamiento) con biopsias posteriores al tratamiento.

Las muestras de biopsia tumoral emparejadas fueron el método (6-plex IHC) con plataforma de inmunohistoquímica VECTRA (Perkin-Elmer). Esta plataforma emplea imágenes de deconvolución espectral para separar las señales ópticas de cada anticuerpo junto con capacidades de análisis de imágenes de última generación para facilitar una inmunofenotipificación cuantitativa sólida basada en portaobjetos. Los datos se generaron en forma de células positivas totales, células positivas/mm2 o porcentaje de células positivas en una población. Cada muestra se tiñó con 3 conjuntos de tinciones multiplexadas en 6 mediante el uso de secciones de tejido adyacentes. Se realizó un análisis cuantitativo de la distribución de TIL (es decir, intratumoral, estromal e interfase/margen invasivo).

Se plantea la hipótesis de que la transducción satisfactoria de IL-12 dará como resultado un patrón de expresión génica amplio característico de la actividad inmunológica, que incluye, entre otros, (1) regulación positiva de genes diana de interferón-gamma (IFN^y) e IFNY-corriente abajo; (2) regulación positiva de la maquinaria de presentación y procesamiento de antígenos (APM); genes específicos de linaje que reflejan la afluencia/expansión de TIL, específicamente células NK y células T CD8. La comparación de los perfiles de expresión génica basados en NanoString se completó a partir de las muestras de tumores emparejadas obtenidas en la selección y después del tratamiento. Se usó el panel de inmunología humana de NanoString para este análisis, que representa aproximadamente 600 sondas para especies de ARNm de importancia inmunológica, que incluye un subconjunto de transcriptos específicos que reflejan la activación de la vía del interferón, la regulación positiva de la maquinaria de procesamiento y presentación de antígenos (APM) e infiltración de células inmunes. Estos incluyen, pero sin limitarse a, CD3e, CD8a, PD-1, PD-L1, CTLA-4, IFN-y, CCR5, IDO-1, CXCL-10, CXCL-11, IRF-1 y CD80. Los datos se normalizaron y evaluaron para determinar la presencia o ausencia de transcriptos diana. El ARN extraído de cada muestra (aproximadamente 50 ng) se analizó mediante el uso del panel v2 nCounter® GX de Inmunología Humana. Los datos se normalizaron y evaluaron para determinar la presencia o ausencia de transcriptos diana. El cambio en el resultado se evaluó a partir de muestras antes y después del tratamiento en datos emparejados.

Según la disponibilidad de tejido tumoral después de los análisis de los criterios de valoración principales, se realizan las siguientes evaluaciones:

Análisis citométrico de flujo multiparamétrico

Se realiza una inmunofenotipificación citométrica de flujo detallada de muestras de tejido tumoral para probar la hipótesis de que el tratamiento con IT-pIL12-EP conduce a un aumento de TIL. Los TlL se aíslan de las muestras tumorales previas y posteriores al tratamiento y se tiñen con 3 paneles de anticuerpos de inmunofenotipificación (Tabla 2). Las células vivas se analizan mediante el uso de un citómetro de flujo multiláser y se analizan con el uso del software de análisis de células individuales FLOWJO (FlowJo, LLC).

XII. Estudio clínico núm. 2: Tratamiento del melanoma con IL-12 intratumoral y postratamiento con un inhibidor de punto de regulación

Este estudio de fase 2 evaluó la seguridad, la actividad antitumoral y los efectos inmunológicos de la electroporación del plásmido IL-12 intratumoral en el melanoma avanzado. Los pacientes recibieron tratamiento, inyección de plásmido/electroporación en las lesiones accesibles, los días 1, 5 y 8 de cada ciclo de tratamiento de 90 días. La respuesta se evaluó después de cada ciclo de tratamiento. Se realizaron evaluaciones de seguridad (examen clínico y evaluaciones de laboratorio) para todos los pacientes tratados antes del inicio de la terapia y a intervalos regulares. La gravedad de los eventos adversos se calificó de acuerdo con los criterios de terminología común para eventos adversos del Instituto Nacional del Cáncer, versión 4.0.

Los pacientes elegibles tenían melanoma metastásico documentado patológicamente, estadios III/C o IV, con al menos una lesión subcutánea o cutánea accesible para inyección/electroporación. Los pacientes debían tener un estado funcional según la escala del Grupo Oncológico Cooperativo del Este (ECOG) de no más de 2, tener una función renal, hepática y de la médula ósea adecuada (creatinina <2 x límite superior de la normalidad, bilirrubina dentro de los límites normales institucionales, recuento absoluto de neutrófilos> 1000/mm3 y un recuento de plaquetas> 100000/mm3). Los pacientes con marcapasos electrónicos fueron excluidos del estudio.

El plásmido pUMVC3-hIL-12-NGVL331 se produjo en condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) en VGXI Incorporated (The Woodlands, TX) y se suministró en viales estériles a una concentración final de 2,1 mg/mL y se almacenó a -80 °C. Antes de su uso, el plásmido se descongeló a 4 °C y se diluyó con solución salina estéril hasta la concentración requerida, 0,5 mg/mL.

Se aplicó lidocaína alrededor de cada sitio del tumor y a todos los pacientes se les ofrecieron analgésicos intravenosos (sulfato de morfina) y/o ansiolíticos (lorazepam) antes del tratamiento. La solución de plásmido se inyectó mediante el uso de una aguja de calibre 25 en el nódulo tumoral. Se insertó en el tumor un aplicador estéril que contenía seis electrodos de aguja dispuestos en círculo y se aplicaron seis pulsos con una intensidad de campo de 1.500 V/cm y una duración de pulso de 100 ps con el uso del sistema de electroterapia OncoSec Medical (OncoSec Medical Inc., San Diego, CA). Los tratamientos se realizaron los días 1, 5 y 8.

El plásmido se dispensó a 0,5 mg/mL. El volumen de inyección de plásmido se calculó mediante el uso de la fórmula P = V/4, donde P es el volumen de inyección de plásmido y V es el volumen tumoral estimado. El volumen tumoral se estimó mediante el uso de la fórmula V = ab2/2 donde a es el diámetro más largo y b es el siguiente diámetro más largo perpendicular a en cualquier dimensión. Se permitió un volumen máximo de inyección de plásmido de 1 mL (máximo de 0,5 mg de plásmido) por día de tratamiento, distribuido en 1-4 lesiones accesibles.

La evaluación de la enfermedad para el criterio de valoración principal para la tasa de respuesta global se evaluó mediante una modificación de los Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) que permitieron medir la carga tumoral del melanoma metastásico cutáneo y subcutáneo en tránsito, RECIST de piel modificada. La carga tumoral al inicio del estudio incluyó lesiones medidas mediante examen clínico y CT, sin un número máximo de lesiones cutáneas para permitir una contabilidad precisa del estado de la enfermedad de los pacientes. Las nuevas lesiones en las evaluaciones de enfermedad posteriores al tratamiento se añadieron a la carga tumoral y no indicaron enfermedad progresiva (EP). La enfermedad progresiva (EP) se definió por un aumento del 20 % o más en la carga tumoral y la enfermedad estable (SD) por un aumento en la carga tumoral de menos de 20 % con una duración de al menos 90 días. La respuesta parcial (PR) se definió por una disminución de 30 % o más en la carga tumoral, y los pacientes con una respuesta completa (CR) no tenían evidencia de enfermedad con una evaluación clínica y radiológica completa.

La tasa de respuesta global mediante una modificación de los Criterios de respuesta relacionados con la inmunidad (irRC) para las lesiones cutáneas se evaluó como un criterio de valoración de respuesta secundaria. Se evaluaron las tasas de regresión local y distante de lesiones individuales en lesiones inyectadas/electroporadas y lesiones no inyectadas/no electroporadas. El tiempo hasta la respuesta objetiva, el tiempo hasta la progresión (TTP), la duración de la respuesta (DOR) y la supervivencia libre de progresión (PFS) se evaluaron en la población de eficacia evaluable. Seguimiento y supervivencia a largo plazo.

Los pacientes se siguieron a intervalos regulares tras la interrupción del estudio para la progresión, la supervivencia general y las terapias posteriores al tratamiento durante un máximo de 5 años.

En ciertos pacientes, después de un intervalo sin tratamiento, se administraron terapias anti-PD-1 o anti-PD-L1. Los pacientes fueron evaluados de nuevo para las respuestas como se describió anteriormente. La Tabla 3 resume un análisis retrospectivo de los pacientes que recibieron terapia adicional con inhibidores de puntos de regulación después de la electroporación del plásmido IL-12.

Tabla 3: Análisis clínico de la terapia de inhibidor de punto de regulación con electroporación del plásmido secuencial IL-12.

Además del tratamiento sistémico con inhibidor de PD-1, los pacientes se tratan simultáneamente con electroporación del plásmido IL-12 con un intervalo posterior de aproximadamente 20-120 días, por ejemplo, después del intervalo, un tratamiento que usa un inhibidor de punto de regulación, por ejemplo, anti-PD- 1 o anti-PD-L1, se administra solo o en combinación con otro ciclo (tratamiento en los días 1, 5 y 8) de electroporación del plásmido IL-12.

XIV. Anexo al estudio clínico núm. 2

Se inició un protocolo de adición al estudio de fase 2 inicial descrito anteriormente para evaluar la seguridad, la actividad antitumoral y los efectos inmunológicos similares de IT-IL12-EP en pacientes tratados con un régimen de tratamiento más frecuente. Los pacientes recibieron tratamiento los días 1, 8 y 15 con ciclos posteriores cada 6 semanas (Régimen A), o tratamiento los días 1, 5 y 8 cada 6 semanas (Régimen B) hasta un total de 9 ciclos de tratamiento. Las poblaciones de estudio se añadieron de acuerdo con el programa de tratamiento asignado: Régimen A, Régimen B y Régimen A/B. Los pacientes en el régimen A/B incluyeron pacientes que comenzaron el estudio recibiendo el régimen A, pero cuyo programa de tratamiento se cambió al régimen B durante la participación en el estudio. La respuesta se evaluó cada 12 semanas y se realizaron evaluaciones de seguridad antes del inicio de la terapia y a intervalos regulares.

Si bien la dosis de vector pIL-12 y su preparación fueron las mismas, el vector usado en la enmienda se formuló en tampón fisiológicamente compatible, por ejemplo, tampón fosfato, para inyección (sWFI) para inyección intratumoral directa.

XV. Estudio clínico núm. 3 - Tratamiento del melanoma con una combinación de inhibidor de punto de regulación y electroporación de IL-12 intratumoral

Este es un ensayo multicéntrico, de fase II, abierto, brazo único de pIL-12 EP intratumoral en combinación con pembrolizumab en pacientes con melanoma. Los pacientes evaluables (n = 42) inician el tratamiento con pembrolizumab después del primer ciclo de pIL-12 EP intratumoral. El pembrolizumab se administra en dosis planas de 200 mg cada 3 semanas a partir del ciclo 2. Los ciclos de pIL-12 EP intratumoral (cada ciclo que consiste en tratamiento en los días 1, 5 y 8) ocurren cada 6 semanas siempre que los pacientes tengan lesiones accesibles para EP. Se evalúa la respuesta de los pacientes cada 12 semanas. Los pacientes continuarán con la terapia si tienen una enfermedad estable o mejor, definida en la evaluación del investigador en el momento de las evaluaciones de la enfermedad. La terapia se administra hasta la progresión de la enfermedad o hasta una toxicidad inaceptable. La mejor tasa de respuesta general (BORR), CR PR, dentro de las 24 semanas posteriores al primer tratamiento con pIL-12 EP y pembrolizumab se determinan mediante el uso de RECIST v1.1 o RECIST modificado mediante la evaluación del investigador y se comparan con las tasas históricas de pembrolizumab como monoterapia en una población similar. Además, los eventos adversos definidos como seguridad y tolerabilidad se evalúan mediante el uso de NCI CTCAE versión 4.0. Otros criterios de valoración abordados en este ensayo incluyen la duración de la respuesta (DOR) para quienes experimentan CR o PR, supervivencia libre de progresión histórica de 24 semanas (PFS definida por la duración entre la fecha de inicio del tratamiento y la primera fecha de progresión de la enfermedad o muerte a 24), supervivencia global (OS) y mejor tasa de respuesta global (CR PR).

Son elegibles los pacientes con melanoma con enfermedad metastásica o localmente avanzada progresiva que no es susceptible de tratamiento local definitivo con intención curativa. Se pretende que los pacientes tengan una lesión sin tratar cuando hay presentes 3 o más lesiones tratables visibles. Además, los pacientes deben tener un diagnóstico histológico o citológico de melanoma con enfermedad progresiva localmente avanzada o metastásica que no sea susceptible de terapia local definitiva con intención curativa y tener al menos un tumor accesible para inyección intratumoral y EP según la evaluación del investigador. Es posible que los pacientes hayan recibido quimioterapia, inmunoterapia o radioterapia previa y todas las terapias anteriores se hayan interrumpido 4 semanas antes de la primera dosis del tratamiento del estudio (el ipilimumab debe interrumpirse 6 semanas antes). Se prohíbe a los pacientes recibir vacunas vivas dentro de los 30 días anteriores a la primera dosis del tratamiento del estudio o usar cualquier otra forma de terapia antineoplásica durante el estudio; que incluye quimioterapia sistémica, terapia biológica, inmunoterapia no especificada en este protocolo.

El plásmido pUMVC3-hIL-12-NGVL331 se produjo en condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) en VGXI Incorporated (The Woodlands, TX) y está formulado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para inyección intratumoral directa seguida de EP in vivo. El plásmido se suministrará en viales de 2,0 mL a una concentración de 0,5 mg/mL y un volumen de llenado de 1,5 mL.

Antes de la inyección de plásmido, con precauciones estériles, se puede inyectar lidocaína al 1 % alrededor de la lesión o todas las lesiones destinadas a IT-pIL-12 EP para obtener anestesia local. Además, el paciente puede recibir analgésicos o ansiolíticos según sea necesario antes o durante el tratamiento. Después de inyectar la solución de plásmido en el tumor accesible, se coloca un aplicador estéril que contiene 6 electrodos de acero inoxidable dispuestos en un círculo dentro o alrededor del tumor. El aplicador se conectará a la fuente de alimentación y se administrarán seis pulsos a una intensidad de campo (E+) de 1500 V/cm y un ancho de pulso de 100 |js a intervalos de 1 segundo a cada tumor previamente inyectado. La EP después de la inyección intratumoral de pIL-12 suministra pulsos eléctricos controlados en un patrón de pulso de onda cuadrada, lo que produce un potencial transmembrana óptimo para que ocurra la electroporación 39. Los pulsos de electroporación se encuentran entre seis electrodos de aguja opuestos hexagonales. Después del primer pulso, la polaridad entre los pares de electrodos de aguja opuestos se invierte y el par de agujas se pulsa de nuevo. Después del pulso emparejado inicial, el suministro de pulsos se gira en el sentido de las agujas del reloj hasta los siguientes pares de agujas opuestas hasta que se administran un total de seis pulsos para completar la secuencia de electroporación. Cuando se inyectan varios tumores el mismo día, la EP debe realizarse inmediatamente después de la inyección de plásmido para cada tumor. Una vez que un tumor ha sido completamente tratado, el siguiente tumor puede inyectarse con plásmido y electroporarse inmediatamente.

Todos los tratamientos del ensayo se administran de forma ambulatoria. La pIL-12 intratumoral se administra como agente único para el ciclo uno. A partir de entonces, comenzando en el Ciclo 3 impar, primero se administra pIL-12 intratumoral seguido de un período de observación mínimo de 60 minutos entre los dos tratamientos.

La pIL-12 intratumoral seguida de EP se administra en cada ciclo impar siempre que el sujeto tenga al menos una lesión superficial accesible (ASL) para el tratamiento. Un ASL se define como la que cumple los siguientes criterios; (1) al menos 0,3 cm x 0,3 cm en los diámetros perpendiculares más largos, (2) en un lugar adecuado para la aplicación de electroporación. En un caso en el que un sujeto pueda tener múltiples ASL, debe tratarse el número máximo de lesiones en cada ciclo, teniendo en cuenta (1) la tolerabilidad del paciente y (2) no exceder la dosis diaria máxima de 20 mL. Antes del inicio de un nuevo ciclo de tratamiento de pIL-12 EP, el investigador determinará las ASL para el tratamiento durante ese ciclo. Se deben tratar las mismas ASL todos los días del ciclo (es decir, días 1, 5, 8). Las lesiones previamente tratadas, previamente identificadas presentes al inicio del estudio que no se trataron, y las lesiones nuevas que aparecen durante el curso del estudio que cumplen con la definición de una ASL pueden tratarse siempre que el volumen máximo de inyección de plásmido por paciente por día no exceda 20 mL. Si no hay ASL presentes en los ciclos posteriores, el sujeto puede saltarse ese ciclo de pIL-12 y continuar en el calendario de estudios. Cuando sea posible, una lesión debe permanecer sin tratar durante el ciclo 1 para permitir la biopsia de una lesión no tratada (ver sección 6.1.2.3).

Pembrolizumab (Merck & Co., NJ) es un mAb humanizado potente y altamente selectivo del isotipo IgG4/kappa diseñado para bloquear directamente la interacción entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2. Este anticuerpo se suministra en una solución inyectable a 100 mg/4 mL y cada dosis de 200 mg se administra por vía intravenosa al paciente. Pembrolizumab debe administrarse al comienzo de cada ciclo (después del ciclo 1 de IT-PIL-12 solamente), el Día 1 del ciclo (± 3 días) después de que se hayan completado todos los procedimientos/evaluaciones. El pembrolizumab se administra como una perfusión intravenosa de 30 minutos (los intervalos del ciclo de tratamiento pueden aumentar debido a la toxicidad como se describe en la Sección 5.2). La respuesta y la progresión en este estudio se evalúan mediante el uso de los nuevos criterios internacionales propuestos por el Comité de Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) [JNCI 92 (3): 205­ 216, 2000]. Los cambios en solo el diámetro más grande (medición unidimensional) de las lesiones tumorales se usan en RECIST v1.1 o en los criterios RECIST modificados.

Enfermedad medible:

Masas neoplásicas que se pueden medir con precisión en 2 diámetros perpendiculares en el plano. Tanto su diámetro más largo como su perpendicular más larga deben ser mayores o iguales a 10 mm o 2 veces el grosor del corte axial. Los ganglios linfáticos deben tener una longitud de línea en el eje corto de > 15 mm. Los ganglios linfáticos malignos deben poder medirse en 2 diámetros perpendiculares. Tanto su diámetro más largo como su perpendicular más larga deben ser mayores o iguales a 15 mm o 2 veces el grosor del corte axial. El punto final cuantitativo se definirá como el producto del diámetro más largo con su perpendicular más larga.

Enfermedad no medible:

Las lesiones no medibles son aquellas que no son adecuadas para una evaluación cuantitativa a lo largo del tiempo. Éstas incluyen:

1. Masas neoplásicas que son demasiado pequeñas para medir, porque su diámetro ininterrumpido más largo o su perpendicular más largo son menos de 10 mm o dos veces el grosor del corte axial.

2. Masas neoplásicas cuyos límites no pueden distinguirse. Esto incluye masas que no pueden demarcarse del tejido circundante debido a un contraste inadecuado, masas con una morfología demasiado compleja o aquellas con una composición tisular muy heterogénea.

3. Otros tipos de lesiones que se cree con seguridad que representan tejido neoplásico, pero difíciles de cuantificar de manera reproducible. Estos incluyen metástasis óseas, metástasis leptomeníngeas, ascitis maligna, derrames pleurales/pericárdicos, enfermedad inflamatoria de la mama, linfangitis cutánea/pulmonar, lesiones quísticas, masas abdominales mal definidas, etc.

Además, de Wolchok y otros (2009) se adoptó un Criterio de respuesta relacionado con la inmunidad (irRC) modificado para el protocolo actual y puede usarse en la evaluación de los objetivos secundarios. Para irRC, solo se tienen en cuenta las lesiones diana seleccionadas al inicio del estudio y las nuevas lesiones medibles.

Una vez finalizado el seguimiento de seguridad, todos los pacientes entran en la fase de seguimiento de supervivencia a menos que retiren el consentimiento para la recopilación de datos adicional o se cumplan los requisitos de seguridad. La monitorización radiológica continúa (1) hasta el inicio de un nuevo tratamiento contra el cáncer, (2) hasta la progresión documentada de la enfermedad o (3) hasta la muerte, lo que ocurra primero. Las imágenes radiográficas en el seguimiento pueden realizarse según esté clínicamente indicado o según el estándar de atención local. Las consultas de seguimiento a largo plazo pueden incluir lo siguiente:

• Fecha de la primera progresión (si la primera progresión no se ha producido antes de la entrada en la Fase de seguimiento)

• Terapia de seguimiento para el tratamiento del melanoma (que incluye radiación, tratamiento contra el cáncer, terapias adyuvantes o cirugías)

• Resolución de AE y SAE en curso al momento de ingresar al seguimiento de supervivencia

• Estado (vivo, sin evidencia de enfermedad, vivo con enfermedad, fallecido)

• Causa y fecha de muerte (si corresponde)

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un plásmido que codifica una citocina inmunoestimuladora IL-12 para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene un tumor canceroso, el método comprende:

a) inyectar al tumor canceroso una dosis eficaz del plásmido;

b) administrar terapia de electroporación al tumor; y

c) administrar una dosis eficaz de un antagonista de PD-1 o PD-L1 al sujeto.

2. El plásmido para su uso en el método de la reivindicación 1, en donde la terapia de electroporación comprende la administración de al menos un pulso de voltaje durante una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos.

3. El plásmido para su uso en el método de la reivindicación 2, en donde el pulso de voltaje suministrado al tumor tiene una intensidad de campo de aproximadamente 200 V/cm a aproximadamente 1500 V/cm.

4. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el antagonista de PD-1 o PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1.

5. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde

a) el antagonista de PD-1 o PD-L1 se codifica en un plásmido adicional y se suministra al tumor canceroso mediante terapia de electroporación; o

b) el antagonista de PD-1 o PD-L1 se codifica en el plásmido que codifica la citocina inmunoestimuladora y se suministra al tumor canceroso mediante terapia de electroporación.

6. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el antagonista de PD-1 o PD-L1 se administra por vía sistémica.

7. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6, en donde el antagonista de PD-1 o PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en: nivolumab (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO), pembrolizumab (MK-3475, KEYTRUDA), pidilizumab (CT-011) y MPDL328OA (ROCHE).

8. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el antagonista de PD-1 o PD-L1 se administra después de la electroporación de la citocina inmunoestimuladora IL-12.

9. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el plásmido codifica las subunidades IL-12 p35 e IL-12 p40 separadas por un sitio de entrada ribosómico interno.

10. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el tumor canceroso es cáncer de mama triple negativo.

11. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el tumor canceroso es melanoma.

12. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el método comprende, además:

a) administrar un primer tratamiento en el tiempo T1, en donde el primer tratamiento comprende inyectar al tumor canceroso una primera dosis eficaz del plásmido que codifica la citocina inmunoestimuladora IL-12;

b) administrar una primera terapia de electroporación al tumor en el tiempo T1, la primera terapia de electroporación comprende la administración de al menos un pulso de voltaje que tiene una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos;

c) administrar un segundo tratamiento en el tiempo T2, en donde el tiempo T2 es un tiempo posterior al tiempo T1, en donde el segundo tratamiento comprende inyectar al tumor canceroso una segunda dosis eficaz del plásmido que codifica la citocina inmunoestimuladora IL-12;

d) administrar una segunda terapia de electroporación al tumor en el tiempo T2, la segunda terapia de electroporación comprende la administración de al menos un pulso de voltaje que tiene una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos;

e) administrar un tercer tratamiento en el tiempo T3, en donde el tiempo T3 es un tiempo posterior al tiempo T2, en donde el tercer tratamiento comprende inyectar al tumor canceroso una tercera dosis eficaz de plásmido que codifica una proteína terapéutica;

f) administrar una tercera terapia de electroporación al tumor en el tiempo T3, la tercera terapia de electroporación comprende la administración de al menos un pulso de voltaje que tiene una duración de aproximadamente 100 microsegundos a aproximadamente 20 milisegundos; y

g) administrar una primera dosis eficaz del antagonista de PD-1 o PD-L1 después del tiempo T3.

13. El plásmido para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el método comprende, además:

a) al menos un ciclo de suministro intratumoral del plásmido que codifica la citocina inmunoestimuladora IL12 por electroporación;

b) un intervalo de al menos 20-120 días después de un ciclo;

c) administración al paciente de al menos una dosis eficaz del antagonista de PD-1 o PD-L1 o una combinación de al menos una dosis eficaz del antagonista de PD-1 o PD-L1 con al menos un ciclo adicional de suministro intratumoral del plásmido que codifica la citocina inmunoestimuladora IL-12 por electroporación.

14. El plásmido para su uso en el método de la reivindicación 13, en donde el ciclo comprende tres tratamientos el día 1, el día 5 y el día 8.

15. El plásmido para su uso en el método de la reivindicación 13, en donde el paciente se trata con al menos 3 ciclos.