JP7111384B2 - 悪性腫瘍の治療に対する方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫調節物質の腫瘍内送達を提供する。特に、本発明は、腫瘍内電気穿孔による共刺激分子の送達を提供する。

最近では、免疫療法は、腫瘍を治療するための手術、化学療法及び放射線療法に続く第４の方法として注目されている。免疫療法がヒトに固有の免疫性を利用することから、患者の肉体的負荷は、免疫療法では他の治療法におけるものより小さいと言われている。免疫療法として知られる治療的アプローチとして、例えば、外因性に誘導された細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、又は様々な方法を使用する拡大培養による末梢血リンパ球から得られたリンホカイン活性化細胞、ナチュラルキラーＴ細胞又はγδＴ細胞等の細胞を移植する細胞移植療法、抗原特異性ＣＴＬのｉｎ ｖｉｖｏでの誘導が期待される樹状細胞移植療法又はペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、及び様々な効果を有すると期待される遺伝子を上記細胞へとｅｘ ｖｉｖｏで導入してそれらをｉｎ ｖｉｖｏへと移植する免疫遺伝子療法が挙げられる。これらの免疫療法では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞は、重大な役割を果たすことがこれまでに知られている。

ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、直接ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を破壊することができる主なエフェクター細胞である。これらの細胞は、ＭＨＣクラス１分子によって提示される抗原ペプチドに厳密に特異的である。対照的に、ＮＫＴ細胞の抗原特異性はそれほど厳密ではなく、それらは固有の免疫応答を示すエフェクター細胞であると考えられる。

ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、腫瘍を直接破壊しないものの、複数の機構によって抗腫瘍免疫応答を調節する根本的な役割を有すると考えられる。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって表される腫瘍抗原ペプチドを認識したＣＤ４陽性Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用によってＣＴＬの活性化及び増殖を促進する。

対照的に、ＣＤ２５陽性／ＣＤ４陽性細胞（調節性Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ）は、抗腫瘍免疫応答及び多様な自己免疫性疾患の進行を阻害することが示された（特許文献１及び非特許文献１を参照されたい）。具体的には、調節性Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的とすることによりヘルパー機能の制御によって細胞毒性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性を抑制することから、いくつかの腫瘍は、それらの増殖にこの系を利用して、免疫系の攻撃を回避すると考えられる。

調節性Ｔ細胞で発現される遺伝子として見出されたＧＩＴＲ（「Ｔｒｅｇ」、非特許文献１を参照されたい）は、細胞表面膜貫通型タンパク質受容体及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇ及び活性化Ｔ細胞に恒常的に存在することが示されている。ＧＩＴＲは、ＧＩＴＲリガンド（以下、「ＧＩＴＲ－Ｌ」と呼ぶ）と呼ばれる、別の膜貫通型タンパク質に結合する。ＧＩＴＲに対する作動性抗体は、調節性Ｔ細胞の免疫抑制活性を抑止することが示され、ＧＩＴＲを介して調節性Ｔ細胞の活性を調節する際に、ＧＩＴＲＬが機能的な役割を果たすことを示唆する（非特許文献２を参照されたい）。同様に、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７等の他の共刺激分子もまた、免疫を賦活するように機能する。

ｉｎ ｖｉｖｏにおける電気穿孔は、様々な組織へのプラスミドＤＮＡの効率的な送達の成功に使用された遺伝子送達法である。研究は、Ｂ１６メラノーマ及び他の腫瘍組織へ
のプラスミドＤＮＡの送達に対するｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の施行を報告した。プラスミドによってコードされる遺伝子又はｃＤＮＡの全身及び局所の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の施行により得ることができる。ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の使用は、腫瘍組織におけるプラスミドＤＮＡ取り込みを増強して腫瘍内での発現をもたらし、また筋組織へプラスミドを送達して、サイトカイン等の分泌タンパク質の全身性の発現をもたらす（例えば特許文献２を参照されたい）。

電気穿孔を使用して、プラスミドＤＮＡによりｉｎ ｖｉｖｏで細胞に形質移入できることが示されている。最近の研究は、電気穿孔が抗腫瘍物質としてのプラスミドＤＮＡの送達を増強し得ることを示した。電気穿孔は、齧歯類モデルにおける肝細胞性癌、腺癌、乳腺腫瘍、扁平上皮癌、及びＢ１６．Ｆ１０メラノーマの治療に対して施行されている。Ｂ１６．Ｆ１０、ＣＴ－２６及びＭＣ－３８のマウスの同系腫瘍モデルは、組換えタンパク質として又は遺伝子療法のいずれかによって、サイトカインを含む免疫調節分子の送達に関して可能性のある免疫療法プロトコルを試験するため、広範囲に使用されている。

当該技術分野において既知の様々なプロトコルは、癌の治療に対するｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を利用する共刺激アゴニストをコードするプラスミドの送達に利用することができる。当該技術分野において既知のプロトコルは、低電圧及び長パルス電流を利用する、腫瘍内及び筋肉内の両方のｉｎ ｖｉｖｏでの電気穿孔を媒介とするサイトカインに基づく遺伝子療法を記載する。

米国特許出願第２００３０４９６９６号 米国特許第８０２６２２３号

S. Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 182 (2001), pp 18-32 McHugh et al., Immunity 16 (2002), PP 311-23

したがって、当該技術分野で必要とされているのは、実質的に長期生存率も改善しながら、黒色腫等の癌腫瘍の退縮における実質的に改善された結果をもたらす、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０Ｌ、及びＣＤ２７のアゴニスト等の共刺激アゴニストをコードするプラスミドの送達に対する電気穿孔プロトコルである。

本発明は、悪性腫瘍の治療に対する方法であって、電気穿孔と組み合わせた、治療用共刺激タンパク質をコードするプラスミドの投与が、遠位腫瘍及び転移と同様に、原発性腫瘍に対して治療効果を有する、方法を提供する。

本発明は、癌性腫瘍を有する被験体を治療する方法であって、治療用タンパク質をコードする有効用量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、前記腫瘍に対して電気穿孔療法を施すこととを含み、前記電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅に亘って、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの少なくとも１回の電圧パルスの施行を更に含む、方法を提供する。或る特定の実施の形態では、前記癌性腫瘍が黒色腫である。更なる実施の形態では、治療用タンパク質をコードする前記プラスミドが、共刺激分子をコードするプラスミドであり、前記共刺激分子はＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０Ｌ、及びＣＤ２７のアゴニストから選択することができる。更なる実施の
形態では、前記プラスミドが少なくとも１つの免疫賦活性サイトカインを更にコードし、前記免疫賦活性サイトカインはＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２とＩＬ－１５との組み合わせから選択することができる。或る特定の実施の形態では、前記腫瘍に送達される前記電圧パルスが約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである。

本発明は、癌性腫瘍を有する被験体を治療する方法であって、該方法は、
時間Ｔ１に第１の治療を施すことと、
ここで前記第１の治療が治療用タンパク質をコードする第１の有効用量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、時間に前記腫瘍に対して第１の電気穿孔療法を施すこととを含み、前記第１の電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続期間を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を更に含む；
時間Ｔ２に第２の治療を施すことと、
ここで時間Ｔ２が時間Ｔ１より後であり、前記第２の治療が、治療用タンパク質をコードする第２の有効用量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、時間Ｔ２に前記腫瘍に対して第２の電気穿孔療法を施すこととを更に含み、前記第２の電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続期間を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を更に含む；
を含む、方法を提供する。或る特定の実施の形態では、前記癌性腫瘍が黒色腫である。更なる実施の形態では、前記治療用タンパク質が共刺激分子であり、前記共刺激分子は、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０Ｌ、及びＣＤ２７のアゴニストから選択することができる。別の実施の形態では、前記プラスミドが、少なくとも１つの免疫賦活性サイトカインを更にコードし、前記免疫賦活性サイトカインがＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２とＩＬ－１５との組み合わせから選択される。或る特定の実施の形態では、前記腫瘍に送達される前記電圧パルスが約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである。更なる実施の形態では、時間Ｔ３において第３の治療が加えられ、ここで時間Ｔ３が時間Ｔ２の後であり、前記第３の治療が治療用タンパク質をコードする第３の有効用量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、前記腫瘍に対して第３の電気穿孔療法を施すこととを更に含み、前記第３の電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続期間を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を更に含む。或る特定の実施の形態は、前記被験体の前記癌性腫瘍に治療用タンパク質をコードする有効用量のプラスミドを注入することと、約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅を有する少なくとも１回の低電圧パルスを使用して被験体の腫瘍内に電気穿孔を施すこととを含み、前記腫瘍に送達される前記電圧パルスが約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである。

本発明は、癌性腫瘍を有する被験体を治療する方法であって、該方法Ｉは、
時間Ｔ１に第１の治療を施すことと、
ここで前記第１の治療が治療用タンパク質をコードする第１の有効用量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、時間に前記腫瘍に対して第１の電気穿孔療法を施すこととを更に含み、前記第１の電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続期間を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を更に含む；
時間Ｔ２に第２の治療を施すことと、
ここで時間Ｔ２が時間Ｔ１よりも後であり、前記第２の治療が治療用タンパク質をコードする第２の有効量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、時間に前記腫瘍に対して第２の電気穿孔療法を施すこととを更に含み、前記第２の電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒の持続期間を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を更に含む；
時間Ｔ３に第３の治療を施すことと、
ここで時間Ｔ３が時間Ｔ２よりも後であり、前記第３の治療が治療用タンパク質をコードする第３の有効量のプラスミドを前記癌性腫瘍に注入することと、前記腫瘍に対して第３の電気穿孔療法を施すこととを更に含み、前記第３の電気穿孔療法が約１００マイク
ロ秒～約２０ミリ秒の持続期間を有する少なくとも１回の高電圧パルスの施行を更に含む；
を含む、方法を提供する。或る特定の実施の形態では、前記癌性腫瘍が黒色腫である。別の実施の形態では、前記治療用タンパク質が共刺激分子であり、前記共刺激分子が、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０Ｌ、及びＣＤ２７のアゴニストから選択される。更なる実施の形態では、前記プラスミドが少なくとも１つの免疫賦活性サイトカインを更にコードし、前記免疫賦活性サイトカインがＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２とＩＬ－１５との組み合わせから選択される。特定の実施の形態では、前記腫瘍に送達される前記電圧パルスが、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである。

組換え膜結合型及び可溶型のヒトＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、及び４－１ＢＢＬのコンストラクトの構造を示す図である。示される組換え遺伝子は、ｐＵＭＶＣ３プラスミド骨格に挿入される。単一の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とＧＣＮ４ｐＩＩ三量体化モチーフとを含む可溶性タンパク質は、ＧＩＴＲＬ４、ＯＸ４０Ｌ４、及び４－１ＢＢＬ４と示される。３つの連続するＥＣＤを有する可溶性タンパク質は、追加された３つのＦｃ抗体ドメイン（ヒトＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１、及びマウスＩｇＧ２ａ）のうちの１つを有する又は有しない一本鎖三量体（ＳＣＴ）と示される。異種性膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む膜結合型はＧＩＴＲＬ４－ＴＭ１及びＳＣＴ－ＴＭと示される。また、同一の形態を、前臨床研究のためヒトＥＣＤに代えてマウスＥＣＤで作製した。 可溶性ＧＩＴＲ－Ｆｃ融合タンパク質に対する、可溶性組換えＧＩＴＲＬ４タンパク質の結合を示す機能性ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＨＥＫ２９３同時形質移入アッセイにおける、ＮＦｋＢで駆動されるルシフェラーゼ遺伝子発現に対するＧＩＴＲからの組換えＧＩＴＲリガンド依存性シグナル伝達を示す図である。棒グラフは、細胞溶解物における相対ルシフェラーゼ活性単位を示す。値は、３つの別々の同時形質移入溶解物により測定された活性に対する、平均±ＳＤである。 Ｐｒｏｍｅｇａ ＧＩＴＲ有効性アッセイによるＪｕｒｋａｔレポーター細胞との共培養における細胞表面組換えＧＩＴＲＬタンパク質の活性を示す図である。ＲＬＵは、相対ルシフェラーゼ単位である。ＥＣ５０を、共培養アッセイにおけるＧＩＴＲＬ－形質導入細胞の数として表す。 組換えマウスＧＩＴＲＬタンパク質をコードするプラスミドの腫瘍内電気穿孔による、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける原発性の、治療した（図５Ａ）及び対側の治療していない（図５Ｂ）ＣＴ２６皮下腫瘍における減少を示す図である。治療していない腫瘍及びＧＩＴＲアゴニスト抗体、ＤＴＡ－１で全身を治療したマウスに由来する腫瘍を比較として示す。腫瘍容積の測定を、ＳＤと共に平均としてグラフ化した；＊＝治療なしに対してｐ＜０．０１；＃＝治療なしに対してｐ＜０．０５。 マウスＧＩＴＲＬタンパク質をコードするプラスミドの腫瘍内電気穿孔が、単回の治療から４日後に脾臓においてＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞に結合するＡＨ１－デキストラマーを増加させたことを示す図である。抗ＣＤ４４で染色される対数蛍光強度（ｘ軸）とデキストラマーに結合したＡＨＩペプチド（ｙ軸）による２次元のドットプロットを示す。未処理及びＤＴＡ－１処理したマウスに由来する脾臓細胞を比較のため示す。各グラフで提示されるデータは、単一のマウスの脾臓細胞のものである。 マウスＧＩＴＲＬタンパク質をコードするプラスミドの腫瘍内電気穿孔が、ｐＵＭＶＣ３空ベクター対照による電気穿孔と比較して、リンパ球に浸潤する腫瘍におけるＦｏｘｐ３遺伝子発現を減少させたことを示す図である。各点は、単一のマウスからの３つのＲＴ－ＰＣＲ値を表した。ＣＴ２６腫瘍を有する複数のマウスから全ＲＮＡを分離した：ＥＰ／空ベクター及びＤＴＡ－１コホートに対してｎ＝６、及びＥＰ／ＧＩＴＲＬ４コホートに対してｎ＝１４。％遺伝子発現は、空ベクター対照コホートの平均値に対するものである。

添付の特許請求の範囲を含めて、本明細書で使用される「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」等の単数形の単語は、文脈に別段の明らかな指示がない限り、それらの対応する複数の参照を含む。

本明細書に引用される参照文献はいずれも、あたかも個々の出版物、特許出願、又は特許がそれぞれ具体的且つ個別に参照により援用されることが示されるのと同じ程度に参照により援用される。

定義
本明細書で使用される「共刺激分子」は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間で従事し、抗原提示細胞上の抗原のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）認識に起因するＴ細胞おける刺激シグナル（すなわち、「共刺激」）と結びつく、Ｔ細胞で刺激シグナルを生成する、免疫細胞表面受容体／リガンド群を指す。共刺激分子として、限定されないが、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７等のアゴニストが挙げられる。

本明細書で使用されるように、「Ｔ細胞活性化の共刺激因子」は、共刺激リガンドが結合して、ＴＣＲによって活性化されたＴ細胞を活性化する能力を指す。よく知られているように、共刺激的な活性化は、サイトカインの産生によって、またよく知られており、実施例に記載されるような増殖反応測定法によって、Ｔ細胞について測定することができる。生物学的に活性な可溶型の共刺激分子は、活性化Ｔ細胞上の同族の受容体に対する結合について試験されてもよい。

本明細書で使用される「抗原提示細胞に由来する」可溶型共刺激分子は、可溶性とするために本明細書に記載されるように操作された、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞及び他のかかる抗原提示細胞によって正常に発現される共刺激分子を指す。抗原提示細胞に由来する好ましい可溶性共刺激分子として、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＣＤ１３７－Ｌ、ＣＤ１３４－Ｌ（別名ＯＸ４０－Ｌ）、ＣＤ４０、ＣＤ２８のいずれかが挙げられる。抗原提示細胞に由来する可溶型共刺激分子は、Ｔ細胞上のその同族の受容体／リガンドに生来の共刺激分子が結合し、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を保持する。

「共刺激分子アゴニスト」の用語は、可溶性共刺激分子及び共刺激分子結合パートナーのアゴニストを含む。例えば、ＧＩＴＲ－Ｌの結合パートナーはＧＩＴＲである。ＧＩＴＲのアゴニストは、作動性ＧＩＴＲ抗体、多量体可溶型及び膜貫通型を含むＧＩＴＲ－Ｌポリペプチド、ＧＩＴＲＬ模倣物、又はＧＩＴＲの生物活性に従事し、誘導する他の分子を含んでもよい。

本明細書で使用される、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体「ＧＩＴＲ」リガンド（別名ＧＩＴＲ－Ｌ、ＴＮＦＳＦ１８（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１８））の用語は、この名前と関連する特定の分子、及びＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｉｄ．番号Ｑ９ＵＮＧ２に定義されるＧＩＴＲ－Ｌと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を共有する、共刺激分子としての生体機能を有する任意の他の分子を指す。

本明細書で使用される、「ＣＤ１３７－Ｌ」又は「ＣＤ１３７のアゴニスト」（別名４－１ＢＢリガンド又はＴＮＦＬ９）の用語は、この名前に関連した特定の分子、及びＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｉｄ．番号Ｐ４１２７３に定義されるヒトＣＤ１３７－Ｌと少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも９５％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を共有する、共刺激分子としての生体機能を有する任意の他の分子を指す。

ヒトＣＤ１３７－Ｌは、２５４個のアミノ酸（シグナル配列なし）を含むＩＩ型膜タンパク質である（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｉｄ番号Ｐ４１２７３の配列を参照されたい）。該タンパク質は、１～２８残基に細胞質ドメイン、２９～４９残基に膜貫通ドメイン、及び５０～２５４残基に細胞外ドメインを含む。ＣＤ１３７－Ｌ（１６４５ｂｐ）のヌクレオチド配列は、公的データベース（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３８１１を参照されたい）において利用可能である。ＣＤ１３７－Ｌは、Alderson et al. (1994)
Eur J. Immunol. 24(9):2219-27によって記載される。ＣＤ１３７－Ｌは、Ｂ細胞、単球及び脾臓の樹状細胞を含む抗原提示細胞及びＴリンパ球上で発現される。ＣＤ１３７－Ｌは、活性化Ｔ細胞上のＣＤ１３７と相互作用する。

本明細書で使用される、「ＣＤ１３４－Ｌ」又は「ＣＤ１３４のアゴニスト」（別名ＯＸ４０リガンド又はＴＮＲＳＦ４）の用語は、この名前に関連した特定の分子、及びＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｉｄ．番号Ｐ２３５１０に定義されるＣＤ１３４－Ｌと少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を共有する、共刺激分子としての生体機能を有する任意の他の分子を指す。

ヒトＣＤ１３４－Ｌは、１８３個のアミノ酸（シグナル配列なし）を含むＩＩ型膜タンパク質である。該タンパク質は、１～２３残基に細胞質ドメイン、２４～５０残基に膜貫通ドメイン、及び５１～１８３残基に細胞外ドメインを含む。ＣＤ１３４－Ｌ（１５７～７０８であるコード配列を含む３５１０ｂｐ）のヌクレオチド配列は、公的データベースにおいて利用可能である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３２６．２を参照されたい）。ＣＤ１３４－Ｌは、Godfry et al., J Exp Med. Aug. 1, 1994; 180(2):757-62.に記載される。ＣＤ１３４－Ｌは樹状細胞及び他のＡＰＣによって発現され、活性化Ｔ細胞に存在する、ＣＤ１３４に結合する。

本明細書で使用される、「ＣＤ４０」（別名ＴＮＦＲＳＦ５又はＣＤ４０リガンド受容体）の用語は、この名前に関連した特定の分子、及びＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｉｄ．番号Ｐ２５９４２に定義されるヒトＣＤ４０と少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を共有する、共刺激分子としての生体機能を有する任意の他の分子を指す。

ヒトＣＤ４０の配列は、Ｎ末端の２０個のアミノ酸がシグナル配列を表す２７７個のアミノ酸を含む（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｉｄ番号Ｐ２５９４２の配列を参照されたい）。膜貫通ドメインは、１９４～２１５残基に位置し、細胞質のドメインは２１６～２７７残基に位置する。ＣＤ４０（１１７７ｂｐ）のヌクレオチド配列は、公的データベースにおいて利用可能である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２５０を参照されたい）。ＣＤ４０及び様々なアイソフォームはTone et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (4), 1751-1756 (2001)によって記載される。ＣＤ４０は、活性化Ｔ細胞によって発現されるＣＤ４０－Ｌ（別名ＣＤ４０リガンド又はＣＤ１５３）への単球及びＢ細胞の結合によって発現される。

本明細書で使用される「ＣＤ２８」は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対する結合に必要なＭＹＰＰＰＹ（配列番号６３９）モチーフを有する、その単一のＩｇ可変様細胞外ドメイン（Ig variable-like extracellular domain）により、
免疫グロブリンファミリーのメンバーである（Peach et al. (1994) J. Exp. Med. 180:
2049-2058）。ＣＤ２８は、そのホモ二量体化に関与する、Ｉｇ可変様ドメインの後に位
置するシステイン残基を有する。ＣＤ２８のタンパク質配列及びヒトＣＤ２８をコードする核酸は、例えばHarper et al. J. Immunol. (1991) 147: 1037-44に開示される。また
、ＣＤ２８をコードするヒトｍＲＮＡの配列は、例えば、２００９年４月１９日付で最終更新されたＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６１３９に開示される。また、ヒトＣＤ２８の完全タンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０に開示される。

「癌」の用語は、一般に、不適当な細胞増殖、異常又は過度の細胞増殖を特徴とする、多様な疾患を含む。癌の例として、限定されないが、乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵癌、黒色腫、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、又は肉腫が挙げられる。かかる癌は、染色体異常、変性増殖（degenerative growth）及び発育障害、細胞分裂促進薬剤、紫外線（ＵＶ）
、ウイルス感染症、遺伝子の不適当な組織発現、遺伝子発現の変更、又は発癌物質によって引き起こされ得る。

「治療」の用語は、限定されないが、癌細胞の増殖の阻害又は減少、癌細胞の破壊、癌細胞の増殖の予防若しくは悪性細胞の開始の予防、又は形質転換された前癌細胞の悪性疾患への進行の停止若しくは逆転、又はその疾患の改善を含む。

「被験体」の用語は、任意の動物、好ましくはヒト等の哺乳動物を指す。獣医学的用途も、本発明に包含されることが意図される。

本明細書で同義的に使用される、「電気穿孔」、「電気透過化」、又は「電気運動増強」（「ＥＰ」）の用語は、生体膜において微視的な経路（孔）を誘導するための膜貫通性の電界パルスの使用を指し、それら経路の存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン及び水等の生体分子が細胞性膜の一方から他方へと通過することを可能とする。

本明細書で使用される「生体分子」の用語は、抗体、抗体フラグメント、全長の免疫調節タンパク質、膜アンカー分子の可溶性ドメイン、融合タンパク質等をコードするプラスミドを包含する。

抗体
本発明は、個体において腫瘍のサイズを減少させる若しくは癌細胞の増殖を阻害する、又は癌に苦しむ個体において転移性癌の発症を減少させる若しくは阻害する、免疫療法的アプローチを提供する。治療法は、電気穿孔を使用して、様々な可溶型の共刺激分子又はそのアゴニストをコードするプラスミドの腫瘍内送達によって達成される。

共刺激アゴニストは、抗体又は抗体フラグメントの形態であってもよく、いずれもプラスミドにおいてコードされ、電気穿孔によって腫瘍に送達され得る。

本明細書で使用される「抗体」の用語は、Ｔ細胞の生成物及びその変異体であるＴ細胞受容体（ＴｃＲ）と同様に、Ｂ細胞の生成物及びその変異体である、免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンは、多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子と同様に、免疫グロブリンカッパ及びラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、並びにミューの定常領域遺伝子によって実質的にコードされる１以上のポリペプチドを含むタンパク質である。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンに分類され、これらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。また、重鎖のサブクラスが知られている。例えば、ヒトにおけるＩｇＧ重鎖はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブク
ラスのいずれであってもよい。

典型的な免疫グロブリン構造単位は、四量体を含むことが知られている。四量体は、それぞれ同一の２対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）及び１つの「重鎖」（約５０ｋＤ～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）の用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。

抗体は、全長の無傷の抗体、又は多様なペプチダーゼ若しくは化学物質による消化によって産生された、多くの十分に特性評価されたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、Ｆ（ａｂ’）２、すなわちそれ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨ_１に連結された軽鎖であるＦａｂの二量体をもたらすためにヒンジ領域のジスルフィド結合の下の抗体を消化する。Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を壊す穏やかな条件の下で還元して、Ｆ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的にはヒンジ領域（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を
参照されたい）を有するＦａｂフラグメントである。Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントは、パパインによるＩｇＧの消化によって生成される。パパインは、鎖間Ｓ－Ｓ結合形成に含まれる残基のすぐ上のヒンジ領域で切断し、各々ヒンジの下部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、２つの定常領域フラグメントを含む、１価のＦａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを生じる。ヒンジ領域の下部の残基の鎖間Ｓ－Ｓ結合形成にもかかわらず、Ｆｃの定常領域フラグメントは二量体として安定化される。

免疫グロブリン「Ｆｃ」は、古典的にパパインによる消化によって生成された定常領域の部分を指す。これには鎖間のＳ－Ｓ結合を有する下部ヒンジが含まれる。本明細書で使用される「Ｆｃ」の用語は、各々、ヒンジの下部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、１対の免疫グロブリン定常領域ポリペプチドを含む二量体タンパク質を指す。かかる「Ｆｃ」フラグメントは、ヒンジ領域にＳ－Ｓ鎖間結合形成を含んでもよく、含まなくてもよい。Ｆｃは、いずれのＩｇクラスに由来してもよく、それ自体、例えばＩｇＭの場合にはＣＨ４ドメインを含んでいてもよいことが理解されるべきである。Ｆｃの突然変異体配列は、Wines et al., J. Immunol. 2000 May 15; 164(10):5313-8によって記載され
るように既知であり、本発明において使用され得る。

多様な抗体フラグメントが無傷の抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、様々な抗体フラグメントがいずれも、新たに化学的に又は組換えＤＮＡ方法論のいずれかの利用によって合成され得ることを理解するだろう。したがって、本明細書で使用さる抗体の用語は、抗体全体の修飾によって産生された若しくは新たに合成された抗体フラグメント、又は組換えＤＮＡ方法論を用いることにより得られた抗体及びフラグメントも含む。

組換え抗体は、従来の全長抗体、タンパク質消化による既知の抗体フラグメント、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等の特有の抗体フラグメント、ドメイン欠失抗体等であってもよい。フラグメントは、わずか１個又は数個の欠失若しくは変異したアミノ酸を有するドメイン又はポリペプチドを含んでもよいが、１以上のドメインの欠失等のより広範囲な欠失が可能である。

Ｆｖ抗体は、約５０Ｋｄのサイズであり、軽鎖及び重鎖の可変領域を含む。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、直接連結されたか、ペプチドをコードするリンカーによって連結された、ＶＨ及びＶＬをコードする配列を含む、核酸から発現され得る、共有結合で連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。例えば、Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883を参照されたい。抗原結合部位の構造に実質的に
類似する三次元構造へと折り畳む、自然に凝集しているが、化学的には分離されている軽鎖及び重鎖のポリペプチドを抗体Ｖ領域からｓｃＦＶ分子へと変換するための多くの構造。

上記の従来の抗体フラグメントの代わりは、ラクダ、ラマ及びサメの免疫系によって産生された１組の特有の抗体において見出された。他の抗体と異なり、これらの親和性試薬は２つの重鎖のみで構成され、更に良いことに、単一ドメインがこれらの重鎖抗体に対する抗原結合部位を形成する。該ドメインを、「ナノボディ」と呼ばれる極めて小さく、非常に安定した単一ドメイン組換え抗体フラグメントを産生するように、更に遺伝子操作してもよい。重鎖（ＶＨＨ）のみ、すなわち単一ドメイン抗体をコードするプラスミド、及びナノボディもまた、電気穿孔による腫瘍内送達が意図される。

可溶性アゴニスト
共刺激分子のアゴニストは、少なくともＧＩＴＲ－Ｌの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む可溶性ＧＩＴＲ－Ｌ等の可溶性分子であってもよい。他の共刺激分子は、同様に、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを欠くが、それらの結合パートナーに結合して、生物学的作用を誘発することができる。電気穿孔による腫瘍内送達のため、ＥＣＤは発現ベクターにコードされ、腫瘍に送達された場合に発現される。

共刺激分子の可溶性コード形態は、発現ベクターにおいて別のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡに連結されてもよい。かかる他のポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分、アルブミン、又は共刺激分子の溶解度を維持する任意の他の種類の血清タンパク質若しくはそれらのフラグメントであってもよい。可溶性形態の共刺激分子は、フラグメント又は全長の重鎖若しくは軽鎖であってもよい重鎖及び／又は軽鎖を介して免疫グロブリンに連結されてもよい。免疫グロブリンは、癌細胞又は腫瘍に関連する抗原を標的とすることができる抗体であってもよい。また、共刺激分子は、細胞の細胞表面上で発現されてもよく、異種性の三量体化ドメイン（例えばＧＣＮ４）の付加を有してもよく、又はリガンドをより強力にする受容体結合ドメインにおける点突然変異を有してもよい（例えば、Chattopadhyay et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci.,104:19452-19457を参照されたい）。

共刺激分子アゴニストは、核酸として送達される。核酸は、標準的なホスホジエステル結合又は他の連結によって共有結合的に連結された、窒素複素環塩基又は塩基類縁体を有する、ヌクレオシド又はヌクレオシド類縁体を含む、オリゴヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド化合物を指す。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ－ＲＮＡポリマー、又はそれらの類縁体を含んでもよい。ＤＮＡは、目的の特定の共刺激分子アゴニストを発現するプラスミドであってもよい。

コードされた共刺激分子の電気穿孔に使用されるＤＮＡプラスミドは、電気穿孔後の上記ＤＮＡプラスミドの進入により、哺乳動物細胞において発現され得る、組換え抗原のコード配列を含むものである。好ましくは、コード配列は、標的腫瘍中の免疫反応を誘発するコンセンサス共刺激分子アゴニストである。いくつかの形態では、コード配列は、哺乳動物の発現に対して最適化されるコンストラクトであり、Ｋｏｚａｋ配列の付加、コドン最適化、及びＲＮＡ最適化を含む、１以上を含んでもよい。これらの最適化されたコード配列を、多様な商業的に入手可能なベクターへとサブクローニングすることができる。

併用療法
共刺激アゴニストをコードするＤＮＡの腫瘍内電気穿孔を、他の治療実体と共に施行し得ることが意図される。表１は可能な組み合わせを提供する。併用療法の施行は、電気穿孔単独、又は電気穿孔と全身送達との組み合わせによって達成され得る。

他の意図される併用療法は、次ものと組み合わせた共刺激アゴニストである：ＴＬＲアゴニスト（例えばフラジェリン、ＣｐＧ）；ＩＬ－１０アンタゴニスト（例えば抗ＩＬ－１０又は抗ＩＬ－１０Ｒ抗体）；ＴＧＦβアンタゴニスト（例えば抗ＴＧＦβ抗体）；ＰＧＥ２阻害剤；Ｃｂｌ－ｂ（Ｅ３リガーゼ）阻害剤；ＣＤ３アゴニスト；テロメラーゼアンタゴニスト等。特に、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ、及び／又はＧＩＴＲ－Ｌの様々な組み合わせが意図される。ＩＬ－１２及びＩＬ－１５は相乗的な抗腫瘍効果があることが示された（例えば、Kimura et al. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49:71-77を参照されたい）。各分子をコードするＤＮＡは、個別の発現プラスミド上にあ
ってもよく、又は単一の発現プラスミド上で適切なプロモーターと組み合わされてもよく、以下に記載される様々な技術によって腫瘍に送達され得る。

電気穿孔
装置は、癌又は他の非癌性の（良性）増殖に悩む患者における使用が意図される。これらの増殖は病変、ポリープ、新生物（例えば乳頭状尿路上皮新生物）、乳頭腫、悪性腫瘍、腫瘍（例えばクラッキン腫瘍、肝門部腫瘍、非侵襲性乳頭状尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、ユーイング腫瘍、アスキン腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍、ライディッヒ細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、セルトリ細胞腫瘍）、肉腫、癌（例えば扁平上皮癌、総排泄腔癌、腺癌、腺扁平上皮癌、胆管細胞癌、肝細胞癌、侵襲性乳頭状尿路上皮癌、扁平尿路上皮癌）、瘤、又は他の型の癌性若しくは非癌性増殖のいずれかとして現れ得る。本実施形態の装置及び方法で処理される腫瘍は非侵襲性、侵襲性、表在性、乳頭状、扁平、転移性、限局性、単中心性、多中心性、低悪性度、及び高悪性度のいずれかであってもよい。

本装置は多くの型の悪性腫瘍（すなわち癌）及び良性腫瘍への使用が意図される。例えば、本明細書に記載の装置及び方法は、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌（例えば肝門部周囲癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、良性及び癌性の骨癌（例えば骨腫、類骨骨腫、骨芽腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨細胞腫瘍、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系の癌（例えば髄膜腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上皮腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房症）、キャッスルマン病（例えば巨大リンパ節過形成、血管胞状リンパ節過形成）、子宮頚癌、大腸癌、子宮内膜癌（例えば子宮内膜腺癌、腺類癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞癌）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌
）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば絨毛癌、破壊性絨毛膜腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎癌（例えば腎細胞癌）、喉頭下咽頭癌、肝癌（例えば血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔副鼻腔癌（例えば感覚神経芽腫、正中線肉芽腫）、上咽頭癌、神経芽腫、口腔中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫（例えば胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多型細胞型横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌、黒色腫及び非黒色腫両方の皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えば精上皮腫、非精巣上皮腫胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば濾胞状癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌、及び子宮癌（例えば子宮平滑筋肉腫）への使用が意図される。

本発明の実施形態の装置及び方法は、電気療法を連続的に、及び／又は１秒の数分の１～数日間、数週間、及び／又は数か月に及ぶ期間のパルスで腫瘍へと送達することにより癌性腫瘍を治療するようにはたらく。好ましい実施形態では、電気療法は直流電気療法である。

本明細書で使用される「電気穿孔」の用語（すなわち、細胞膜浸透性を与える）は、（例えば、生細胞中への医薬品、溶液、遺伝子及び他の薬剤等の分子の拡散を可能とするため）細胞膜に孔を開けるのに十分な任意の期間に患者に送達される任意の量のクーロン、電圧、及び／又は電流によってもたらされてもよい。

組織に電気療法を送達すると、一連の生物学的及び電気化学反応を引き起こす。十分に高い電圧では、細胞構造及び細胞代謝は、電気療法の施行によって極度に妨げられる。癌性及び非癌性細胞はいずれも一定レベルの電気療法で破壊されるが、腫瘍細胞は、非癌性細胞よりそれらの微小環境の変化に敏感である。多量元素及び微量元素の分布は電気療法の結果変更される。

単電極配置では、リード電極とジェネレーターハウジングとの間に数秒分の１～数時間に亘って電圧を印加して、癌組織の破壊を始めてもよい。所与の電圧の印加は、各パルスが１秒の数分の１～数分間続く一連のパルスであってもよい。或る特定の実施形態では、パルス持続時間又は幅はおおよそのものであってもよい。また、低電圧は、腫瘍部位に白血球を引き付け得る、数秒分の１～数分の持続期間に亘って印加されてもよい。この方法では、細胞媒介免疫系は、死んだ腫瘍細胞を除去し、腫瘍細胞に対する抗体が生じ得る。さらに、賦活された免疫系は、境界型腫瘍細胞及び転移を攻撃する場合がある。

任意の免疫学的応答を増加させるため、宿主の種に応じて、限定されないが、フロイントのアジュバント（完全、及び不完全）、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム等のミネラル塩、様々なサイトカイン、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）多価アルコール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン等の界面活性物質、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin））及びコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）等の潜在的に有用なヒトアジュバントを含む、様々なアジュバントを使
用してもよい。代替的には、キーホールリンペットヘモシニアン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オブアルブミン、コレラ毒素又はそれらのフラグメント等の分子との組み合わせ及び／又はカップリングによって免疫応答を増強してもよい。

Draghia-Akli, et al.による米国特許第７，２４５，９６３号は、モジュール電極システム、及び身体又は植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのそれらの使用を記載する。モジュール電極システムは複数の針電極と、皮下注射針と、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極に導電性リンクを提供する電気的コネクターと、電源とを備える。オペレーターは、支持構造にマウントされ、身体又
は植物の選択された組織にそれらをしっかりと挿入する複数の針電極をつかむことができる。その後、生体分子が選択された組織中への皮下注射針によって送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが活性化され、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容が、引用することにより本明細書の一部をなす。

米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、身体又は植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を効果的に促進するため使用され得る、電気穿孔装置を記載する。該電気穿孔装置は、その操作がソフトウェア又はファームウェアによって指定される、電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御及びパルスパラメーターの入力に基づいたアレイ中の電極間の一連のプログラム可能な定電流パルスパターンをもたらし、電流波形データの蓄積及び獲得を可能とする。また、電気穿孔装置は、針電極アレイを有する取り換え可能な電極ディスクと、注射針に対する中心注射チャネルと、リムーバブルガイドディスクとを備え（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号を参照されたい）、引用することにより本明細書の一部をなす。

米国特許第７，２４５，９６３号、及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイ及び方法は、筋肉等の組織のみならず、他の組織又は臓器中への深い浸透に対して適合される。電極アレイの配置のために、電極によってあらかじめ描写される領域において、注射針（選択された生体分子を送達するため）も完全に標的臓器に挿入され、その注射は標的組織に垂直に施行される。

典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞電気穿孔に必要とされる電場は、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に必要な電場に対する規模に類似する。一実施形態では、電場の規模は、およそ１０Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは約３００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは約１０００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍの範囲に及ぶ。代替的には、電場強度が低いほど（約１０Ｖ／ｃｍ～１００Ｖ／ｃｍ、より好ましくは約２５Ｖ／ｃｍ～７５Ｖ／ｃｍ）、パルス長が長い。例えば、名目上の電場が約２５Ｖ／ｃｍ～７５Ｖ／ｃｍである場合、パルス長は約１０ｍ秒であることが好ましい。

パルス長は、約１０μ秒～約１００ｍ秒であってもよい。任意の所望の数のパルス、典型的には１秒当たり１パルス～１００パルスであってもよい。パルスセット間の遅れは、任意の所望の時間、例えば１秒であってもよい。また、波形、電場強度、及びパルス持続時間は、細胞の種類、及び電気穿孔を介して細胞に入る分子の種類に依存し得る。

また、本発明の非ウイルス送達ベクターの取り込みは、電子なだれ（avalanche）トラ
ンスフェクションとも名付けられた血漿電気穿孔によって増強されてもよい。簡潔には、マイクロ秒放電は、電極表面でキャビテーションマイクロバブルを生じる。磁界と併せてマイクロバブル崩壊によって生じた機械力は、従来の電気穿孔に関連する拡散媒介輸送と比較して、細胞膜を横切る輸送効率を増加させる役目を果たす。血漿電気穿孔の技術は、２０１１年４月１２日付発行のVankov, et al.の米国特許第７，９２３，２５１号、及び２０１２年１０月９日付発行のVankov, et al.の米国特許第８，２８３，１７１号に記載される。また、この技術を細胞の形質転換のためｉｎ ｖｉｖｏで採用してもよい。Chalberg, et al (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090；２０１２年１月２４日付発行のChalberg, et al.の米国特許第８，１０１１６９号。

Ｉ．腫瘍及びマウス
ＡＴＣＣ（ＣＲＬ２６３８）から得られたＣＴ－２６．野生型細胞を解凍し、移植に先
立って最小限に継代した。トリプシンを用いて接着性ＣＴ－２６．野生型細胞をプレートから除去し、細胞生存率をＡＯ／ＰＩ染色によって決定して、生存／死亡数をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ２０００（Nexelcom Biosciences）を使用して行った。細胞を１．０×１０^７生存細胞／ｍｌ又は０．５×１０^７／ｍｌのいずれかの密度でＤＰＢＳに再懸濁し、移植まで氷上に置いた。

腫瘍移植の１日前に、Jackson Laboratoriesから購入した６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＪ（品番０００６５１）マウスの両方の後部脇腹を剃毛した。ピンチ試験（pinch test）に対する反応がなくなるまでマウスをイソフルランで麻酔した。１８Ｇａ針を使用して１．０ｍｌの無菌シリンジにＣＴ－２６．野生型細胞を引き込み、針を移植用の２６Ｇａ針と取り換えた。ＣＴ－２６．野生型細胞を０．１ｍｌの容量で後部脇腹に対して頭側に皮下注射し、１．０×１０^６細胞（原発腫瘍用）又は０．５×１０^６細胞（対側腫瘍用）の移植をもたらした。

腫瘍増殖を、ディジタルキャリパーで腫瘍の長軸及び短軸を測定することにより移植４日後に開始してモニターした。楕円体の容積を推定するため、式（Ａ^２×Ｂ）／２（「Ａ」が短軸で、「Ｂ」が長軸である）を使用して腫瘍容積を計算した。二葉腫瘍（bi-lobed
tumors）、又は皮下よりも深く移植された腫瘍を持つマウスを廃棄した。原発腫瘍容積
が４０ｍｍ^３～９０ｍｍ^３に達すると、マウスを同様の平均腫瘍容積を含むコホートへ無作為化した。マウスをＡＡＬＡＭガイドラインに従って収容する。

ＩＩ．プラスミドＤＮＡ
組換え可溶型及び膜結合型のヒトＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ又は４－１ＢＢ（図１に説明される構造）と同様に、両方の野生型の発現に対するｐＵＭＶＣ３プラスミド（ＡＬＤＥＶＥＲＯＮ）を生成した。各リガンドに対する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を付加した（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＡＦ１２５３０３［ＧＩＴＲＬ］、Ｄ９０２２４［ＯＸ４０Ｌ］、及びＵ０３３９８［４－１ＢＢＬ］）。１つの変種（ＧＩＴＲＬ４、ＯＸ４０Ｌ４及び４－１ＢＢＬ４と表される）では、異種性三量体化ドメインが付加される（Harbury, P.B. Nature 371: 80.）。別の変種（一本鎖三量体、ＳＣＴと表される）では、「ゆらぎ（wobble）」を導入するためのグリシンとセリンとの変化する組み合わせで構成されるリンカ
ー配列によって３つのＥＣＤドメインを順に付加した。リンカーの長さは、１２個～２３個のアミノ酸で変化する。いくつかのコンストラクトでは、ＰＤＧＦ受容体（Thermo FisherのベクターｐＤｉｓｐｌａｙから得られた）に由来する膜貫通ドメインをＥＣＤ（複
数の場合がある）に対してＣ末端に付加した。いくつかのコンストラクトでは、ヒト又はマウスの抗体に由来する定常領域（Ｆｃ）をＥＣＤ（ヒトＦｃ－ＩｇＧ１［InvivoGenの
ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃに由来］、マウスＦｃ－ＩｇＧ１［InvivoGenのｐＦＵＳ
Ｅ－ｍＩｇＧ１－Ｆｃに由来]、マウスＦｃ－ＩｇＧ２ａ［InvivoGenのｐＦＵＳＥ－ｍＩｇＧ２ａ－Ｆｃに由来］）に対してＣ末端に付加した。

マウス及びヒトのＧＩＴＲＬは交差反応しないと報告される（例えば、Bossen et al.,
(2006) J. Biol. Chem. 281:13964-13971を参照されたい）ため、組換えヒトＧＩＴＲＬに対するマウスホモログを、マウスにおける前臨床研究用に構築した。マウスＧＩＴＲＬは、本来二量体である。組み換えマウスＧＩＴＲＬコンストラクトを、ＧＣＮ４多量体化モチーフ（Harbury, P.B. Nature 371: 80.）を使用して、二量体及び三量体の両方とし
て作製した。マウスＧＩＴＲ－Ｆｃに対する二量体型及び三量体型の相対的結合を、機能的ＥＬＩＳＡを使用して比較した。三量体型は、より高い結合親和性を示し、全て更なる研究に使用した（二量体に対するＥＣ５０、３９．２４μＭ、三量体に対するＥＣ５０、１２．３８μＭ）。上に記載される全てのコンストラクトにおいて、ヒトＥＣＤドメインをマウスＧＩＴＲＬ ＥＣＤドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１８３３９１）に置換することにより、前臨床研究で使用されるＳＣＴ形態のマウス版を作製し
た。共刺激分子アゴニスト（すなわち、ＧＩＴＲＬ）を含むｐＵＭＶＣ３は、エンドトキシンを含まないキットにより作製される。全てのプラスミドＤＮＡを、無菌注射用生理食塩水（０．９％）に希釈し、－２０℃で保存した。

ＩＩＩ．組織培養細胞における発現
Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１試薬（カタログ番号：ＭＩＲ ２３００）を用いるＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）細胞へのＧＩＴＲＬプラスミドの形質移入。
形質導入される細胞を、６ウェルディッシュに４０００００個の細胞で定着させる。２４時間後、細胞を４μＬのＭｉｒｕｓ及び１μｇ ＤＮＡで被覆した。細胞を４日後～７日後にウェスタンブロット、フローサイトメトリーによる分析のために採取した。活性アッセイに対しては、分泌されたタンパク質を、細胞上清から採取し、製造業者の指示書（Novagen）に従ってＮｉ^＋－樹脂を使用して精製した。

ＩＶ．ウェスタンブロット及びフローサイトメトリーによるタンパク質検出
ウェスタンブロッティングのため、レムリー（laemmli）ＳＤＳ試料バッファー（Ａｌ
ｆａ Ａｅｓａｒ Ｊ６１３３７）を各試料に添加し、１０分間１００℃で沸騰させて、試料を遠心分離した。２０μｌのタンパク質＋バッファーを１ウェル毎に載せ、最も小さな標準がゲルの底に達するまで、１５０ボルトでゲルを約１時間電気泳動した。ゲルタンパク質を氷上で１時間に亘って１００ボルトでＰＶＤＦ薄膜に転写し、１×ＴＢＳＴによりＰＶＤＦを３回濯いだ後、ＴＢＳＴ中５％ＢＳＡを用いてロッカー（rocker）上で室温にて１時間に亘ってブロックした。濯いだ膜を、ＴＢＳＴ＋５％無脂肪粉乳中に希釈された抗ＮＷＳＨＰＱＦＥＫタグ抗体、ｍＡｂ、マウス（Genscript、Ａ０１７３２－１００
）と共に一晩インキュベートした。ブロットを７００の標識した抗マウス２次抗体（Rockland）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＬＩＣＯＲ撮像装置を使用して画像を分析した。

Ｖ．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのため、細胞をＣａ＋＋又はＭｇ＋＋のない温かいＰＢＳを使用して、ディッシュから除去した。細胞を計数し、５×１０^６細胞／チューブでチューブに分配し、洗浄して、１００μｌ～２００μｌのＦＣバッファー（Ｃａ＋＋又はＭｇ＋＋を含まないＰＢＳ中、５％濾過ＦＢＳ＋０．１％ＮａＮ_３）に再懸濁した。ＰＥ標識抗ＧＩＴＲＬ（クローン１０９１０１、R&D systems）、アイソタイプ対照（クローン１１７１
１、R&D systems）、又は抗ＦＣ及び対応するアイソタイプ対照（Biolegend）を添加し、１時間氷上でインキュベートした。試料をＦＣバッファーで３回洗浄した。試料を抗ＦＣとインキュベートした場合、最初に、ＦＣバッファー中、抗ＧＩＴＲ－ＦＣ融合タンパク質と共に氷上で１時間、細胞をインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ
ＦＡＣＳｃａｎ、ＧＵＡＶＡ １２ＨＴフローサイトメーター（Millipore）又はＬＳ
Ｒ－ＩＩ（Beckman）を使用して、細胞を分析した。

ＨＥＫ２９３ヒト細胞へと形質導入された場合、これらのコンストラクトに由来するタンパク質が合成され、適切に細胞外空隙（可溶型）又は細胞表面へと局在化され、ウェスタンブロットによる抗ＮＷＳＨＰＱＦＥＫタグ抗体、及びフローサイトメトリーによる抗ＧＩＴＲＬ Ａｂによって検出可能であった。膜結合型三量体化組換えＧＩＴＲＬタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞で発現された場合、可溶性ＧＩＴＲ－ＦＣ融合タンパク質に結合した。

ＶＩ．機能性ＥＬＩＳＡによる受容体結合
抗ヒト－Ｆｃ抗体（Pierce、３１１２５）を、平底の９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Costar、カタログ番号３６９０）に添加し、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、室温にて１時間インキュベートした。ウェルを１５０μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、デカントして乾燥させた。１５０μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Scytek、ＡＡＡ９９９）を付加することによりウェルをブロックし、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルの組換えヒトＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８ Ｆｃキメラタンパク質（R&D、６
８９－ＧＲ－１００）を５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。試料を室温で１時間インキュベートした後、洗浄した。ＰＢＳで５倍からゼロまで希釈した５０μｌの５０００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＩＴＲＬ標準組換えのヒトＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８（R&D、６
９８７－ＧＬ－０２５）、ＰＢＳで５倍から０まで希釈した５０μｌの適切なＨＥＫ２９３培養上清（遺伝子発現を有しない陰性対照）、及び可溶性ヒトＧＩＴＲＬタンパク質の滴定も行って、３連で添加した。試料を１時間室温でインキュベートした後、再度洗浄した。ＰＢＳで５００ｎｇ／ｍｌに希釈した５０μｌ／ウェルのマウス抗ヒトビオチン化ｈＧＴＩＲＬ抗体（R&D、ＢＡＭ６９４３）を各ウェルに添加し、１時間室温でインキュベ
ートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルの１：１５０００のストレプトアビジンＨＲＰ（Abcam、７４０３）を添加した。試料を室温で１時間インキュベートした。洗浄後に、５０
μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Pierce、カタログ番号３４０２８）を添加し、試料を１０分間インキュベートした。反応を２５μｌ／ウェルのＨ_２ＳＯ_４の添加で停止した。波長補正を５４０ｎｍ又は５７０ｎｍに設定して、４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダを使用して、光学密度を決定した。培養上清中のＧＩＴＲＬの濃度を、結合及び検出について抗ＧＩＴＲＬ抗体を使用する従来のＥＬＩＳＡ、及びＧＩＴＲＬタンパク質標準（R&D、６９８７－ＧＬ－０２５）によって決定した。

可溶性ＧＩＴＲＬ４及びＧＩＴＲＬ－ＳＣＴ－Ｆｃタンパク質は、商業的に入手可能なＧＩＴＲＬタンパク質（R&D ６９８７－ＧＬ－０２５、表３）より２倍超高い親和性、
及び２倍超高い比活性（１ｎｇ当たりの活性単位、図２）でＥＬＩＳＡにおいてＧＩＴＲ－ＦＣ融合タンパク質に結合する。可溶性組換えＧＩＴＲＬタンパク質は、架橋されたＭＫ－４１６６に匹敵するＧＩＴＲ結合親和性を実証した。

ＶＩＩ．ＮＦｋＢルシフェラーゼリポーターアッセイ
ＧＩＴＲＬプラスミドを、ＮＦｋＢで駆動されるプロモーター（Promega）の制御下で
ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドと共にＨＥＫ２９３ヒト細胞へと形質導入した。ヒトＧＩＴＲ遺伝子（Origene）を発現するプラスミド、及びウミシイタケルシフ
ェラーゼを発現するプラスミドは、恒常的なＣＭＶプロモーターの制御（Promega、形質
導入変異性に対する制御）下にある。形質移入の４８時間後、細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼアッセイキット（Promega、Ｅ１９１０）を使用するホタル及びウミシイ
タケのルシフェラーゼ活性の両方について分析した。可溶性ＧＩＴＲＬタンパク質は、レポーター細胞株系においてＮＦｋＢに対するＧＩＴＲのシグナル伝達を刺激した（図４）。

可溶性ＧＩＴＲＬタンパク質を、製造業者の指示書（Novagen）によりＮｉ＋－樹脂を
使用して、血清不含状態のＨＥＫ２９３培養上清を精製した。精製されたタンパク質を、Ａ２８０吸光度、及びＥＬＩＳＡによって正規化した。タンパク質のモル等価物を、ヒトＧＩＴＲ及びＮＦ－ｋＢで駆動される分泌されたルシフェラーゼを発現する、操作されたＪｕｒｋａｔ細胞に添加した（ＧＩＴＲ効力試験、Promega、ＣＳ１８４００２）。用量
応答を各タンパク質について測定し、商業的に入手可能な可溶性ヒトＧＩＴＲＬ（R&D systems）と比較した。架橋抗体、すなわちＲ＆Ｄ ＧＩＴＲＬ標準（R&D systems）に対する抗ＨＡ、及び本発明者らのＧＩＴＲＬタンパク質に対する抗ＮＷＳＨＰＱＦＥＫタグ（Genscript）の添加を伴って、及び添加を伴わずに、製造指示によりアッセイを実行した
。

また、共培養刺激にアッセイプロトコルを適合させることによりＧＩＴＲ効力アッセイ（Promega、ＣＳ１８４００２）において細胞表面ＧＩＴＲＬタンパク質を試験した。細
胞表面ＧＩＴＲＬタンパク質をコードするプラスミドで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞を培養の４日後にＰＢＳ－Ｍｇ＋＋－Ｃａ＋＋を含むディッシュから取り出し、平底９６ウェル組織培養トレー（Corning）において１０００００細胞／ウェルから１細胞／ウェ
ルまで段階希釈で蒔き、基体に接着するように一晩置いた。解凍し、使用したＪｕｒｋａｔ細胞（Promega、ＣＳ１８４００２）を製造業者の指示書に従ってＧＩＴＲＬ発現ＨＥ
Ｋ２９３細胞上に重ね、７時間共培養した。上清を共培養物から除去し、ＢｉｏＴｅｋルミノメータを使用して、標準的なプロトコル（Promega、ＧＩＴＲ効力アッセイ）に記載
されるように、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、陰性対照として形質移入されていない細胞、及び各実験の陽性対照としての可溶性Ｒ＆Ｄ ＧＩＴＲＬと比較した。

可溶性ＧＩＴＲＬ４及びＧＩＴＲＬ－ＳＣＴ－ＦＣは、商業的に入手可能なヒトＧＩＴＲＬ（R&D Systems）よりも、このＧＩＴＲ活性アッセイにおいてそれぞれ３倍超及び１
０倍超のより良好な効力を有した。また、ＧＩＴＲ効力アッセイにおいて、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞と共培養した場合、細胞表面ＧＩＴＲＬは、強い活性化を示した（図４）。

ＶＩＩＩ．初代ヒトＴ細胞刺激、及び可溶性ＧＩＴＲＬの細胞表面結合
初代ヒトＰａｎ Ｔ細胞（Allcells、ＰＢ００９－１）を、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１０μｇ／ｍｌ）単独で、若しくは可溶性抗ＣＤ２８（１５Ｅ８、１μｇ／ｍｌ）と組み合わせて、又は可溶性ＧＩＴＲＬによる先の形質移入を伴って、及び伴わずにＨＥＫ２９３細胞に由来する培養上清で一晩被覆されたウェル中に蒔いた。細胞を４日間ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。刺激されていない対照細胞を、平行してＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに蒔いた。

細胞表面結合について、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激された細胞を、氷上でＦＣバッファー（マグネシウム又はカルシウムを含まないＰＢＳ中、５％濾過ＦＢＳ＋０．１％ＮａＮ３）を用いて洗浄した。細胞を、氷上で１時間ＨＥＫ２９３培養上清と共に、又は該培養上清なしでインキュベートした。ＦＣバッファー中で洗浄後に、細胞を複合化抗体、すなわちＦＩＴＣ複合化－ＳｔｒｅｐＴＡＧ ＩＩ抗体（GenScript、Ａ１０７３６－１
００）、ＦＩＴＣ複合化アイソタイプ対照（Invitrogen、ＧＭ４９９２）、ＰＥ複合化ヒトＧＩＴＲ抗体と共にインキュベートした。細胞をＦＣバッファーで洗浄し、上に記載されるようなフローサイトメトリーによって分析する。

増殖アッセイのため、刺激した細胞又は刺激していない対照の複製ウェルを、ＡＯ／ＰＩ生体染色溶液（Nexcelom、ＣＳ２－０１０６－５ＭＬ）で染色し、刺激の４日後に Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ ２０００で計数した。

サイトカイン産生アッセイのため、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＰａｎ Ｔ細胞（Allcells）を、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ又は０．５μｇ／ｍｌのBiolegend製の抗ヒトＣ
Ｄ３（カタログ番号１００２０７）及び可溶性アゴニストＧＩＴＲＬ分子で共刺激した。抗ヒトＣＤ２８（カタログ番号１０２１１１）を陽性対照として使用した。上清を収集する前に、共刺激したＴ細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。細胞上清中のヒトＩＦＮ－γ及びＩＬ－２のレベルをＲ＆Ｄ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＹ４８５－０５及びカタログ番号ＤＹ４０２－０５）によって測定した。

組換え可溶性ＧＩＴＲＬ４は、刺激した初代ヒトｐａｎ Ｔ細胞の細胞表面に結合した。

ＧＩＴＲＬ４を発現するプラスミドで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞に由来する培養上清の添加は、抗ＣＤ３抗体と架橋するＴＣＲに対する初代ヒトＴ細胞の増殖の反応を増加させるが、抗ＣＤ２８抗体より小さな程度に過ぎない。ＧＴＲＬタンパク質の付加もまた、ＴＲＣの架橋に応答してサイトカイン産生を増加させる。

まとめると、これらのデータは、細胞へ導入された場合に、組換えＧＩＴＲＬタンパク質をコードするプラスミドが発現され、Ｔ細胞上の細胞表面内因性ＧＩＴＲに結合して、刺激することができることを示す。腫瘍微小環境内では、Ｔリンパ球上の細胞表面ＧＩＴＲの刺激は、腫瘍微小環境内のこれらのリンパ球の活性化を増強し、腫瘍細胞に対する免疫応答を促進すると予想される。

ＩＸ．初代マウスＴ細胞における組換えＧＩＴＲＬに対するマウスホモログとＤＴＡ－１との比較。
マウス組換えＧＩＴＲＬタンパク質はＨＥＫ２９３細胞で発現され、細胞（ＴＭドメインを含んでいるもの）の保持、又は培養培地中への分泌をウェスタンブロットによって確認した。初代マウス脾臓細胞の表面上のＧＩＴＲに結合することは、抗ＳｔｒｅｐＴＡＧ
ＩＩ抗体（Genscript）を使用するフローサイトメトリーによって確認された。さらに
、精製された可溶性マウスＧＩＴＲＬタンパク質の付加と共に、最適以下の用量の抗ＣＤ３（１４５２Ｃ１１）による初代マウスＴ細胞の刺激の増加が精製されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の両方で観察され、同様に全脾臓細胞培養物でも観察された。各場合において、組換えマウスＧＩＴＲＬは、ＧＩＴＲアゴニスト抗体であるＤＴＡ－１（BXcell、ＢＥ００６３）に匹敵するか、より良好なＴ細胞共刺激活性を示した。例えば、０．５μｇ／ｍｌの１４５２Ｃ１１抗ＣＤ－３ Ａｂ（Biolegend、１００２０７）と共に蒔いた
全脾臓細胞では、ＤＴＡ－１は１．２９μＭのＥＣ５０を有し、ｍＧＩＴＲＬ－ＳＣＴ－ＦｃＩｇＧ２ａは０．４７３μＭのＥＣ５０を有し、ｍＧＩＴＲＬ４は３．３２μＭのＥＣ５０を有した。

Ｘ．腫瘍内治療
マウスに治療用イソフルランで麻酔をかけた。環状プラスミドＤＮＡを無菌の０．９％生理食塩水中に１μｇ／μｌまで希釈した。５０μｌのプラスミドＤＮＡを、２６Ｇａの針を備える１ｍｌシリンジを使用して、原発腫瘍の中央に注入した。注射直後に電気穿孔を行った。ＤＮＡの電気穿孔は、３５０Ｖ／ｃｍ、各々１秒間隔で間隔をおいて１０ミリ秒の８回のパルスを供給するＢＴＸ ＥＣＭ ８３０方形波エレクトロポレーターを使用して達成された。電気穿孔は、２本の針から２本の向かい合った針へ電流を一方向性に送達するように構成され、０．５ｃｍ間隔で間隔をおいた針を備えたＭｅｄｐｕｌｓｅｒハンドルによって送達された。腫瘍サイズが許容される場合、電気穿孔針を腫瘍に挿入した。治療は、０日目、４日目及び７日目、又は研究によっては０日目及び４日目に行なわれた。治療に続いて、先に記載されるようなディジタルキャリパーを使用して、２日～３日毎に腫瘍容積を決定した。原発又は対側の腫瘍容積が１０００ｍｍ^３に達した場合、マウスを安楽死させた。

各実験のために、１０匹～１５匹のマウスコホートを、組換えマウスＧＩＴＲＬタンパク質をコードするプラスミドで電気穿孔し、１日目に５００μｇのＤＴＡ－１ ＧＩＴＲアゴニスト抗体により腹腔内で治療した、又は治療せず放置したコホートと比較した。

治療していないマウスと比較して、電気穿孔した腫瘍に対する腫瘍容積は、著しく減少された（図５Ａ）。さらに、統計学的に有意な減少が、マウスの対側脇腹の治療していない腫瘍でも観察された（図５Ｂ）。治療した腫瘍は、全身性ＤＴＡ－１治療に匹敵する容積の減少を実証した。

ＸＩ．フローサイトメトリーによる脾臓及び腫瘍におけるＴ細胞の特性評価
腫瘍及び脾臓を屠殺したマウスから切除し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに入れた。脾臓を７０ミクロンのストレーナーに押しつけることにより脾細胞を単離し、それらを低張の赤血球溶解（ＡＣＫバッファー；ThermoFisher）に供した。分離脾細胞を、染色に先立ってｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Cedarlane）を使用して精製した。腫瘍を、腫瘍用Ｇｅｎｔ
ｌｅ－ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍分離キット１３０－０９６－７３０、Ｃ－チューブ、１３０－０９３－２３７）を使用し分離し、Heaters（１３０－０９６－４２７）を
備えるＭｉｌｔｅｎｙｉ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標） Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用してホモジナイズした。全ての試料の準備ができるまで、試料を氷上に保存した。細胞を４℃にて５分間、１２００ｒｐｍ（８００×ｇ）でペレット化し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＦＢ）に再懸濁して、１５ｍＬ円錐形遠心分離管で５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ－Ｍ（Cedarlane）の上に重ねた。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅカ
ラムを、中断することなく（with no brake）室温にて２０分間、２０００ｒｐｍ（１５
００×ｇ）の遠心分離機で回転させた。リンパ球層を１０ｍＬのＰＢＦに移した後、４℃で５分間、１２００ｒｐｍ（８００×ｇ）で遠心分離した。細胞ペレットをＦｃブロック（BD Biosciences、５５３１４２）を含む５００μＬのＰＦＢに優しく再懸濁した。９６ウェルプレートにおいて、細胞を製造業者の指示に従ってＡＨ１－デキストラマー（immu
dex、ＪＧ３２９４－ＡＰＣ）の溶液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。抗
ＣＤ４５－ＡＦ４８８（Biolegend、１００７２３）、抗ＣＤ３－ＢＶ７８５（Biolegend、１００２３２）、抗ＣＤ４－ＰＥ（eBioscience、１２－００４１）、抗ＣＤ８ａ－Ａ
ＰＣ（eBioscience、１７－００８１）、抗ＣＤ４４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Biolegend、１０３０２８）、抗ＣＤ１９－ＢＶ７１１（Biolegend、１１５５５）を含む抗体染色カクテ
ルを添加し、３０分間室温でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＦＢ中、氷上にて１５分間固定した。細胞をＰＦＢで洗浄し、暗所に４℃で保存した。試料をＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Beckman）で分析した。

ＧＩＴＲＬの腫瘍内電気穿孔は、脾臓におけるＡＨ１－デキストラマー結合ＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞を増加させた（図６）。ＣＴ２６腫瘍において、免疫優性抗原を表すＡＨ１ペプチドに結合する活性化されたＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増加は、治療されたマウスにおけるＣＴ２６腫瘍に対する全身性免疫の増加を示す。

治療された腫瘍内の遺伝子発現変更を測定するためＲＴ－ＰＣＲを使用した。急速凍結した腫瘍をＰＢＳに再懸濁し、穏やかなＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Miltenyl Biotech）を使用してホモジナイズした。その後、ホモジェネートをＴｒｉｚｏｌ（Life Technologies Corp.）へ移した。製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡを単離した後、
ＤＮａｓｅ処理を行った。１μｇのＲＮＡを使用してｃＤＮＡを作製した（ｄｓＤＮａｓｅを含むＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット、Thermo Fisher Scientific）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Thermo Fisher Scientific.）及びＣＦＸ９６（Biorad）を
使用して、ＲＴ－ＰＣＲを行った。相対ｍＲＮＡのレベルを１８ｓに正規化し、サイクル数を使用し、２－ΔΔＣＴ法（Livak et al, Methods, 2001）を使用して、各製品の量を計算した。

ＧＩＴＲＬの腫瘍内電気穿孔は、治療した腫瘍内のＦｏｘｐ３遺伝子発現を減少させた（図７）。Ｆｏｘｐ３転写因子の発現は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するマーカーであり、腫瘍微小環境内の免疫抑制機能を担う。ＧＩＴＲアゴニスト抗体であるＤＴＡ－１は、腫瘍内のＴｒｅｇの数を減らすことが知られており、また腫瘍に存在するＦｏｘｐ３遺伝子のレベルを低下させることも示されている（Schaer et al., (2013) Cancer Immunol
Res. 1:320-331）。同様に、本発明者らは、ｐＵＭＶＣ３空ベクターで電気穿孔された
腫瘍と比較して、ｐＵＭＶＣ３－ＧＩＴＲ４で電気穿孔された腫瘍におけるＦｏｘｐ３遺伝子レベルの減少を観察した。

治療したマウスの脾臓及び腫瘍によるＴ細胞のこれらの分析は、組換えＧＩＴＲＬをコードするプラスミドの腫瘍内電気穿孔が、治療した腫瘍内のＴｒｅｇレベルを変更することができ、全身の腫瘍抗原反応性エフェクターＴ細胞の増加をもたらすことを示唆する。

ＧＩＴＲＬ単独療法に加えて、ＣＴ２６同系腫瘍モデルを使用して組み合わせ研究を行った。ＧＩＴＲＬ４－ＴＭ１をコードするｐＵＭＶＣ３プラスミドを、ＩＬ－１２サイトカインのｐ３５及びｐ４０のサブユニットをコードするｐＵＭＶＣ３と共に腫瘍内に電気穿孔した（A Daud et al., (2008) J. Clin. Oncol. 26:5896-5903）。

第１のＥＰ治療後６日目、８日目、１１日目及び１３日目に測定した、ｐＵＭＶＣ３ベクター対照又はｐＵＭＶＣ３－ＩＬ１２プラスミド単独と比較して、治療していない対側腫瘍の平均腫瘍容積の統計学的に有意な減少が見られた。さらに、治療していない腫瘍の完全腫瘍退縮にはより速い速度があった。例えば、治療開始後１９日目に７匹／１５匹のマウスが完全退縮した対側腫瘍を有したのに対し、ＩＬ－１２治療コホートはわずか１匹／１５匹であった。さらに、ｐＵＭＶＣ３－ＩＬ－１２単独と比較して、原発（治療した
）及び対側（治療していない）の両方に対して完全奏功（ＣＲ）を有するマウスの数の増加が観察された。

これらの結果は、原発（治療された）腫瘍の腫瘍微小環境におけるＧＩＴＲＬ及びＩＬ－１２による併用療法が、治療されていない対側腫瘍に対するＩＬ－１２単独よりも大きな効能を有していたことを示す。

Ｘ．ＩＬ－１２、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ、ＧＩＴＲＬによる腫瘍内治療
ＩＬ－１２、ＩＬ１５、及びＧＩＴＲＬは、いずれも免疫系の賦活に個別の効果を有する。ＩＬ－１２α及びβのサブユニット、ＩＬ１５及びＩＬ－１５Ｒａ、並びに組換えＧＩＴＲＬをコードするプラスミドを、共に（別々のプラスミド上又は単一のプラスミド中で）対側腫瘍モデルのＣＴ２６腫瘍に電気穿孔し、これらの５つの遺伝子の組み合わせがＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて樹立された腫瘍の退縮に更に効能を有するかどうかを判断する。また、５つ全ての遺伝子をコードする単一の大きなプラスミドの腫瘍内電気穿孔を、治療していないマウスと比較して、効能について試験する。さらに、これらの遺伝子の試験を組み合わせて及び別々に、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおけるＢ１６Ｆ１０の対側腫瘍モデルで行う。腫瘍容積を経時的に測定し、完全寛解のマウス割合を測定する。

ＸＩ．組織学
マウスをＣＯ_２窒息によって人道的に屠殺する。腫瘍を切除し、１０ｍｌの１０％ホルマリンを含む５０ｍｌの円錐管に入れる。組織を固定後にＨ＆Ｅで以下通り染色する：６時間の１０％中性緩衝ホルマリン中での固定の後、代表的な組織試料をＭｉｌｅｓ ＶＩＰ組織プロセッサー（インディアナ州ミシャワカのMiles Inc.）を使用して、パラフィンブロックへと加工する。簡潔には、組織を上昇する等級のエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、パラフィン中に浸透させる（Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｅｐ ２、Fisher Scientific）。包埋に続いて、標準的な回転ミクロトーム上で組織から切片を作製し、４ｍｍの切
片を水浴から回収してスライドガラスにマウントする。１つの腫瘍当たり３つの切片を検査する。切片を加熱乾燥し、標準的な組織学の技術を使用して、Ｈ＆Ｅ（ミシガン州カラ
マズーのRichard-Allen Scientific）で染色する。

ＸＩＩ．免疫組織化学
免疫組織化学染色を、以下の抗体、すなわち、ラット抗マウスＣＤ４、ラット抗マウスＣＤ８（Ｌｙ２）、及びラット抗マウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）（マサチューセッツ州ケンブリッジのPharMingen）をそれぞれ使用して、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球及び血管の存在について腫瘍を検査するために行う。マウスをＣＯ_２窒息によって人道的に屠殺した。腫瘍をハサミで切除し、皮膚を除去した後、直ちにドライアイス及びエタノールの混合物中で凍結して保存した（８０℃）。５ｍの凍結切片を得た。免疫組織化学分析のため、ラット抗マウスＣＤ４、ラット抗マウスＣＤ８（Ｌｙ２）、又はラット抗マウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）を１：５０の稀釈で組織切片に施行し、３０分間インキュベートした後、２倍濃度（各ビオチン化抗ラットＩｇＧ及びＡＢＣ複合体中で１５分間）でＶｅｃｔｏｒ ＥｌｉｔｅラットＩｇＧペルオキシダーゼキットを用いて検出する。免疫染色をＤａｋｏ自動染色器で行う。切片を倍率４００倍で分析する。

ＸＩＩＩ．統計学的手法
統計学的分析は、分散分析、マンホイットニーの検定又は両側スチューデントのｔ検定によって行なわれる。

Claims (20)

1. 癌性腫瘍を有する被験体を治療するために用いられる医薬であって、膜結合型ＧＩＴＲＬをコードする第１の核酸と、ＩＬ－１２及び／又はＩＬ－１５をコードする第２の核酸とを含み、前記治療は、有効用量の前記第１の核酸と前記第２の核酸とを前記癌性腫瘍に注入することと、前記腫瘍に対して電気穿孔療法を施すこととを含み、前記電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅に亘って、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの少なくとも１回の電圧パルスの施行を含む、医薬。
2. 前記第２の核酸がＩＬ－１２及びＩＬ－１５をコードする、請求項１に記載の医薬。
3. 前記第１の核酸と前記第２の核酸とが、同一の発現プラスミド上に存在する、請求項１又は２に記載の医薬。
4. 前記膜結合型ＧＩＴＲＬが、
   異種性膜貫通ドメインと結合した、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）一本鎖三量体（ＳＣＴ）を含むか、又は
   ＧＣＮ４ｐＩＩ三量体化モチーフ及び異種性膜貫通ドメインと結合した、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬。
5. 前記腫瘍に送達される前記少なくとも１回の電圧パルスが約３００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
6. 前記腫瘍が黒色腫である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬。
7. 癌性腫瘍を有する被験体を治療するために用いられる医薬であって、膜結合型ＧＩＴＲＬをコードする第１の核酸と、ＩＬ－１２及び／又はＩＬ－１５をコードする第２の核酸とを含み、前記治療は、
   前記治療が第１の有効用量の前記第１の核酸と前記第２の核酸とを前記癌性腫瘍に注入することと、第１の時間（Ｔ１）に前記腫瘍に対して第１の電気穿孔療法を施すことと； 第２の有効用量の第１の核酸と前記第２の核酸とを前記癌性腫瘍に注入することと、第２の時間（Ｔ２）に前記腫瘍に対して第２の電気穿孔療法を施すこととを含み、
   前記時間Ｔ２が前記時間Ｔ１より後であり、かつ
   前記第１及び第２の電気穿孔療法がそれぞれ約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を含む；
   医薬。
8. 前記第２の核酸がＩＬ－１２及びＩＬ－１５をコードする、請求項７に記載の医薬。
9. 前記第１の核酸と前記第２の核酸とが、同一の発現プラスミド上に存在する、請求項７又は８に記載の医薬。
10. 前記膜結合型ＧＩＴＲＬが、
    異種性膜貫通ドメインと結合した、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）一本鎖三量体（ＳＣＴ）を含むか、又は
    ＧＣＮ４ｐＩＩ三量体化モチーフ及び異種性膜貫通ドメインと結合した、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬。
11. 前記腫瘍に送達される前記少なくとも１回の電圧パルスが約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである、請求項７～１０のいずれか一項に記載の医薬。
12. 前記腫瘍が黒色腫である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の医薬。
13. 前記時間Ｔ１が第０日目であり、前記時間Ｔ２が第４日目である、請求項７～１２のいずれか一項に記載の医薬。
14. 前記治療が、第３の有効用量の前記第１の核酸と前記第２の核酸とを前記癌性腫瘍に注入することと、第３の時間（Ｔ３）に前記腫瘍に対して第３の電気穿孔療法を施すこととを含み、ここで時間Ｔ３が時間Ｔ２の後であり、前記第３の電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅を有する少なくとも１回の電圧パルスの施行を含む、請求項７～１３のいずれか一項に記載の医薬。
15. 前記時間Ｔ３に施行される少なくとも１回の電圧パルスが約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍである、請求項１４に記載の医薬。
16. 前記時間Ｔ３が第７日目である、請求項１４又は１５に記載の医薬。
17. 前記少なくとも１回の電圧パルスが約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅を有する低電圧パルスを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬。
18. 前記少なくとも１回の電圧パルスが３５０Ｖ／ｃｍである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬。
19. 前記電気穿孔療法は、１０ミリ秒の８回のパルスを含む、請求項１８に記載の医薬。
20. 被験体における癌性腫瘍及び転移を治療するために用いられる医薬であって、
    膜結合型ＧＩＴＲＬをコードする第１の核酸と、ＩＬ－１２及び／又はＩＬ－１５をコードする第２の核酸とを含み、
    ここで、前記第１の核酸と前記第２の核酸とが、同一の発現プラスミド上に存在してもよく、
    前記治療は、有効用量の前記第１の核酸と前記第２の核酸とを前記癌性腫瘍に注入することと、前記腫瘍に対して電気穿孔療法を施すこととを含み、前記電気穿孔療法が約１００マイクロ秒～約２０ミリ秒のパルス幅に亘って、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの少なくとも１回の電圧パルスの施行を含む、医薬。
    

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