JP7079729B2 - 異種タンパク質発現のためのプラスミド構築物及びその使用方法 - Google Patents

Description

本明細書とともに電子的に提出される配列表もまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる（ファイル名：ＯＭ１５０７ＷＯ０１－ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、作成日：２０１６年１２月１６日、ファイルサイズ：４１ＫＢ）。

本発明は、治療的に活性な多量体ポリペプチドの各鎖をコードする少なくとも２つの遺伝子の腫瘍内送達のための組換え発現ベクターに関する。多量体をコードする各核酸鎖は、少なくとも１つの翻訳調節エレメントによって分離される。治療用ポリペプチド及び追跡抗原をコードする追加の遺伝子は、核酸鎖に対する追加の翻訳修飾因子を使用して、または発現ベクター内の別個の遺伝子として、追加することができる。

Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドは、長い間、研究者及び産業によって用いられる組換えＤＮＡ分子の重要な源であった。今日、プラスミドＤＮＡは、次世代のバイオテクノロジー産物（例えば、遺伝子医薬品及びＤＮＡワクチン）が、臨床試験及び最終的には医薬品市場に進出するにつれて、ますます重要性が高まっている。発現プラスミドＤＮＡは、治療が必要とされる患者の部位、例えば、腫瘍に治療タンパク質を送達するためのビヒクルとしての用途を見出し得る。

この「腫瘍内送達」は、しばしば腫瘍微小環境への免疫調節物質の送達を含む。近頃、免疫療法は、手術、化学療法、及び放射線療法に続く第４の方法として注目を集めている。免疫療法はヒトに本来備わっている免疫を用いるため、免疫療法における患者の体への負担は他の治療法よりも少ないと言われている。免疫療法として知られる治療手法は、例えば、種々の方法を用いた増殖培養によって外因的に誘導した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）または末梢血リンパ球から得られたリンホカイン活性化細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞等の細胞が移入される細胞移入療法；抗原特異的ＣＴＬのｉｎ ｖｉｖｏ誘導が予想される樹状細胞移入療法またはペプチドワクチン療法；Ｔｈ１細胞療法；及び上記細胞をｉｎ ｖｉｖｏで移入するために種々の効果を有すると予想される遺伝子がそれらにｅｘ ｖｉｖｏで導入される免疫遺伝子療法を含む。これらの免疫療法において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞が重要な役割を果たすことが従来知られている。

Ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔は、多くの異なる組織へのプラスミドＤＮＡの効率的な送達のために成功裏に用いられてきた遺伝子送達技術である。研究によって、Ｂ１６メラノーマ及び他の腫瘍組織へのプラスミドＤＮＡの送達のためのｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の実施が報告されている。プラスミドによってコードされる遺伝子またはｃＤＮＡの全身または局所発現は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の実施によって得ることができる。ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の使用は、腫瘍組織におけるプラスミドＤＮＡの取り込みを増強させて腫瘍内に発現をもたらし、筋肉組織にプラスミドを送達して全身的なサイトカインの発現をもたらす。

電気穿孔は、プラスミドＤＮＡを用いて細胞をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトするために使用できることが示されている。最近の研究により、電気穿孔は抗腫瘍剤としてのプラスミドＤＮＡの送達を増強できることが示された。電気穿孔は、げっ歯類モデルにおいて、肝細胞癌、腺癌、乳腺腫瘍、扁平上皮癌、及びＢ１６．Ｆ１０メラノーマの治療のために実施されてきた。Ｂ１６．Ｆ１０マウスメラノーマモデルは、組換えタンパク質としての、または遺伝子療法による、サイトカインを含む免疫調節分子の送達のための潜在的な免疫療法プロトコルを試験するために広く使用されている。

当該技術分野で既知の種々のプロトコルは、癌の治療のためにｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を用いて免疫調節タンパク質をコードするプラスミドの送達に用いることができる。当該技術分野で既知のプロトコルは、低電圧電流及び長パルス電流を用いて、腫瘍内及び筋肉内の両方で、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔によって媒介されるサイトカインに基づく遺伝子療法を説明する。

癌免疫サイクルの種々の段階に関与する併用免疫療法は、より幅広い患者集団において改善された有効性を提供し得る相乗効果により、腫瘍細胞が免疫系による排除を回避する複数の機構を標的とすることによって免疫エスケープを回避する能力を増強し得る。しばしば、これらの併用治療用の免疫調節タンパク質は、１つ以上のホモまたはヘテロ二量体鎖を含む複雑な分子であり、例えば、遺伝子アジュバント及び共通の腫瘍抗原をコードする融合タンパク質ＩＬ－１２またはＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαである。治療薬としての複数のタンパク質の投与は、複雑かつ高価である。発現プラスミドを用いた複数のコードされたタンパク質の腫瘍内送達の使用は、より単純かつより費用効率が高い。しかしながら、現在の発現プラスミド構築物は、各免疫調節タンパク質の十分な産生の必要性に対応していない。本発明は、適切に配置されたプロモーター及び翻訳修飾因子を用いて複数の免疫調節物質をコードする発現プラスミドを提供することにより、この必要性に対応する。

本発明は、ａ）Ｐは発現プロモーターであり、ｂ）Ａ及びＢは免疫調節分子をコードし、ｃ）Ｔは翻訳修飾エレメントである、式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂによって定義される複数の発現カセットを含む発現プラスミド構築物を提供する。特定の実施形態において、Ｐは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ＳＶ－４０、ｍＰＧＫ、及びβアクチンからなる群から選択され、免疫調節分子は、免疫刺激性サイトカイン、及び少なくとも１つの抗原と融合した遺伝子アジュバントからなる群から選択される。

本発明は、ａ）Ｐは発現プロモーターであり、ｂ）Ａ及びＡ´はヘテロ二量体サイトカインの鎖であり、ｃ）Ｂは少なくとも１つの抗原と融合した少なくとも１つの遺伝子アジュバントであり、ｄ）Ｔは翻訳修飾エレメントである、式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ´－Ｔ－Ｂによって定義される複数の発現カセットを含む発現プラスミドを提供する。特定の実施形態において、Ｐは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ＳＶ－４０、ｍＰＧＫ、及びβアクチンからなる群から選択され、ヘテロ二量体サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、及びＩＬ－２７からなる群から選択され、Ａは、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２３ｐ１９、ＥＢＩ３、ＩＬ－１５からなる群から選択され、Ａ´は、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－２７ｐ２８、及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択され、翻訳修飾エレメントは、Ｐ２Ａファミリーメンバー及びＩＲＥＳからなる群から選択され、遺伝子アジュバントは、Ｆｌｔ３リガンド、ＬＡＭＰ－１、カルレティキュリン、ヒトヒートショックタンパク質９６、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＳＦ１受容体からなる群から選択され、抗原は、ＮＹＥＳＯ－１、ＯＶＡ、ＲＮＥＵ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＳＳＸ－２、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＲＴ－１、Ｔｙｒ、Ｇｐ１００、ＬＡＧＥ－１、サバイビン、ＰＲＳ ｐａｎ－ＤＲ、ＣＥＡペプチドＣＡＰ－１、ＯＶＡ、ＨＣＶ－ＮＳ３、及びＨＰＶワクチンペプチドからなる群から選択される。

本発明は、Ｐは発現プロモーターであり、Ａは少なくとも１つの抗原と融合した少なくとも１つの遺伝子アジュバントであり、Ｂ及びＢ´はヘテロ二量体サイトカインの鎖であり、Ｔは翻訳修飾エレメントである、式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂ－Ｔ－Ｂ´によって定義される複数の発現カセットを含む発現プラスミドを提供する。特定の実施形態において、Ｐは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ＳＶ－４０、ｍＰＧＫ、及びβアクチンからなる群から選択され、ヘテロ二量体サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、及びＩＬ－２７からなる群から選択され、Ａは、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２３ｐ１９、ＥＢＩ３、ＩＬ－１５からなる群から選択され、Ａ´は、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－２７ｐ２８、及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択され、翻訳修飾エレメントは、Ｐ２Ａファミリーメンバー及びＩＲＥＳからなる群から選択され、遺伝子アジュバントは、Ｆｌｔ３リガンド、ＬＡＭＰ－１、カルレティキュリン、ヒトヒートショックタンパク質９６、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＳＦ１受容体からなる群から選択され、抗原は、ＮＹＥＳＯ－１、ＯＶＡ、ＲＮＥＵ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＳＳＸ－２、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＲＴ－１、Ｔｙｒ、Ｇｐ１００、ＬＡＧＥ－１、サバイビン、ＰＲＳ ｐａｎ－ＤＲ、ＣＥＡペプチドＣＡＰ－１、ＯＶＡ、ＨＣＶ－ＮＳ３、及びＨＰＶワクチンペプチドからなる群から選択される。

本発明は、少なくとも１つの腫瘍内電気穿孔パルスを使用して、式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ´－Ｔ－ＢまたはＰ－Ａ－Ｔ－Ｂ´－Ｔ－Ｂ´のいずれかの発現プラスミドを腫瘍内に送達することを含む、対象における腫瘍を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍内電気穿孔パルスは約２００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍの電界強度を有し、対象はヒトであり、腫瘍は、メラノーマ、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、ＣＴＣＬ、頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択され、電気穿孔パルスは、電気化学インピーダンス分光法が可能な発生装置によって送達される。

本発明は、ａ）Ｐは発現プロモーターであり、ｂ）Ａ及びＡ´は免疫調節分子のサブユニットをコードし、ｃ）Ｔは翻訳修飾配列である、式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ´によって定義される複数の発現カセットを含む発現プラスミド構築物を提供する。特定の実施形態において、Ｐは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ＳＶ－４０、ｍＰＧＫ、及びβアクチンからなる群から選択され、Ａは、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２３ｐ１９、ＥＢＩ３、ＩＬ－１５からなる群から選択され、Ａ´は、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－２７ｐ２８、及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択され、Ｔは、Ｐ２Ａ及びＩＲＥＳからなる群から選択される。

ｐＯＭＩ２ＡにおけるヒトＩＬ－１２及びＰ２Ａのプラスミドマップを示す。 ｐＯＭＩ２ＡにおけるヒトＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ及びＰ２Ａのプラスミドマップを示す。 ２つより多くの免疫調節性遺伝子カセットにおける、ＯＭＩ２ｘ２Ａ：プロモーター１＋遺伝子カセットＡ＋Ｐ２Ａ＋遺伝子カセットＢ＋Ｐ２Ａ＋遺伝子カセットＢ´を示す。 ２つより多くの免疫調節性遺伝子カセットにおける、ＯＭＩ２ｘ２Ａ´：プロモーター１＋遺伝子カセットＡ＋Ｐ２Ａ＋遺伝子カセットＡ´＋Ｐ２Ａ＋遺伝子カセットＢの発現のためのベクターのプラスミドマップを示す。 （Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定されたｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１２及びｐＯＭＩＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２でトランスフェクトした細胞のタンパク質発現レベルを示す。（Ｂ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）上のｐＯＭＩＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２と比較して、ｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１２のトランスフェクションによって産生されたＩＬ－１２の増殖活性を示す。 （Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定されたｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１５／ｈＩＬ－１５Ｒａ及びｐＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ－Ｆｃでトランスフェクトした細胞のタンパク質発現レベルを示す。（Ｂ）ｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ及びｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ－Ｆｃのトランスフェクションによって産生されたｈＩＬ－１５の初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖活性を示す。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ受容体細胞を用いて測定された、ＯＭＩＰ２Ａ－ＩＬ１２－Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１ベクターから発現した分泌ＩＬ－１２ ｐ７０ヘテロ二量体を含有する活性組織培養細胞馴化培地を示す。対照（中和抗ＩＬ１２抗体の添加；非トランスフェクト細胞からの馴化培地）は、破線で示されている。

添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の単数形の語は、文脈上明らかに別段の指示のない限り、それらの対応する複数形の指示対象を含む。

本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物、特許出願、または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｉ．定義

分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節等を説明または指すことができる。分子の「活性」はまた、細胞間の相互作用、例えば接着を調節または維持する際の活性、細胞の構造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する際の活性も指すことができる。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］等も意味し得る。

本明細書で使用される「翻訳調節エレメント」または「翻訳修飾因子」は、新生ポリペプチド鎖のピコルナウイルス由来配列が次のアミノ酸との共有結合的アミド結合を防止する、特定の翻訳開始因子またはリボソームスキップ調節因子を意味する。この配列の組込みにより、ヘテロ二量体タンパク質の各鎖と等モルレベルの翻訳されたポリペプチドとの共発現がもたらされる。限定されないが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａを含むリボソームスキップ調節因子の２Ａファミリーが企図され、これらは全てＰＧ／Ｐ切断部位（表５を参照のこと）及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を共有する。

本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が当該技術分野の技術内で用いられ得る。そのような技術は文献において説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。例えば、本発明のある実施形態において、ポリヌクレオチドは環状プラスミドｐＯＭＩ２Ａである。

「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸中の一連のヌクレオチドであり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。

「コード配列」、またはＲＮＡもしくはペプチド等の発現産物（例えば、免疫グロブリン鎖）を「コードする」配列は、発現させたときに該産物の産生をもたらすヌクレオチド配列である。

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または該当する他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能であり得る、一般的に約３００ヌクレオチド以下（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１５０、１７５、２００、２５０、または３００個）の核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、通常は一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ－ヌクレオチド、３Ｈ－ヌクレオチド、１４Ｃ－ヌクレオチド、３５Ｓ－ヌクレオチド、またはビオチン等の標識が共有結合的にコンジュゲートしたヌクレオチドの組込みによって標識され得る。一実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド（それらの一方または両方が標識され得る）は、遺伝子の全長もしくは断片をクローニングするための、または核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用され得る。一般に、オリゴヌクレオチドは人工的に、例えば、核酸合成装置上で調製される。

「タンパク質配列」、「ペプチド配列」もしくは「ポリペプチド配列」、または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の一連の２つ以上のアミノ酸を指す。

「タンパク質」、「ペプチド」、または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続する鎖を含む。

「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」という用語は、通常、細胞もしくは組換えＤＮＡ発現系に見られる他の成分、または任意の他の混入物から部分的または完全に分離された、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子、または混合重合体）またはポリペプチドをそれぞれ含む。これらの成分は、限定されないが、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分、及び外来性ゲノム配列を含む。

単離されたポリヌクレオチド（例えば、ｐＯＭＩ２Ａ）またはポリペプチドは、好ましくは、本質的に均一な分子の組成物であるが、ある程度の不均一性を含んでもよい。

「宿主細胞」という用語は、細胞による物質の産生、例えば、細胞による遺伝子、ポリヌクレオチド（環状プラスミド（例えば、ｐＯＭＩ２Ａ）等）、またはＲＮＡもしくはタンパク質の発現もしくは複製のために、任意の様式で選択、修飾、トランスフェクト、形質転換、成長、または使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を含む。例えば、宿主細胞は、ｐＯＭＩ２Ａプラスミドを維持することができ、また本発明のある実施形態において、プラスミド中のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば、免疫グロブリン鎖の発現を促進することができる、哺乳類細胞もしくは細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、また任意の単離された細胞であり得る。

ｐＯＭＩ２Ａ等の本発明のベクターは、当該技術分野で既知の多くの技術のいずれか、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈、リポフェクション、核内へのベクターの直接マイクロインジェクション、または所与の宿主細胞の種類に適した任意の他の手段に従って宿主細胞に導入され得る。

「カセット」または「発現カセット」は、例えば、定められた制限部位でベクターに挿入され得る、発現産物（例えば、ペプチドまたはＲＮＡ）をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡの断片を指す。発現カセットは、ＤＮＡコード配列に連結されたプロモーター及び／またはターミネーター及び／またはポリＡシグナルを含み得る。

一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、（例えば、直接的に、または他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合してコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。プロモーター配列は、一般に、その３´末端に転写開始部位が結合し、任意のレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または元素を含むように上流（５´方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって好都合に定義される）、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に寄与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）を見ることができる。プロモーターは、エンハンサー及びリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と、または発現されるべき核酸と、作動可能に会合もしくは作動可能に連結され得る。発現制御配列は、前記プロモーターからの発現を制御する場合、プロモーターと作動可能に会合もしくは作動可能に連結される。

遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターは、限定されないが、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：４６６－４７２（１９８８））、ヒトＣＭＶ最初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０（１９８５）；Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ４５：１０１－１０５（１９８６））、マウスＣＭＶ最初期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０（１９８１））、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ最初期プロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１－１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２（１９８２））；原核生物発現ベクター、例えばβ－ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋｏｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１（１９７８））、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５（１９８３））；及び酵母または他の真菌に由来するプロモーターエレメント、例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、またはＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーターを含む。

ウイルス長末端反復プロモーター、例えば、マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ）（Ｆａｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１（１）：３－７（１９８２））、モロニーマウス肉腫ウイルス長末端反復（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（９）：５２３４－５２３８（１９８０））、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（Ｖａｎ Ｂｅｖｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（６）：３３０７－３３１１（１９８０））、ＨＩＶ ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ１００２４５）、ウシ泡沫状ウイルスＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ－００１８３１）、ＲＳＶ５´－ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｋ０００８７）、ＨＩＶ－２ ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ－００１７２２）、トリレトロウイルスＬＴＲ（Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：３７９－３８６（１９８０））、及びヒトヘルペスウイルスＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ－００１８０６）が、本発明のベクターに含まれ得る。

他の許容されるプロモーターは、ヒト及びサルＣＭＶ５プロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、肝特異的発現のためのハイブリッドＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーターをヒトα１－アンチトリプシン（ＨＡＴ）もしくはアルブミン（ＨＡＬ）プロモーターいずれかの転写プロモーターエレメントとコンジュゲートすることによって作製される）、または肝癌特異的発現のためのプロモーター（例えば、ヒトアルブミン（ＨＡＬ、約１０００ｂｐ）もしくはヒトα１－アンチトリプシン（ＨＡＴ、約２０００ｂｐ）のいずれかの転写プロモーターエレメントが、ヒトα１－ミクログロブリン及びビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＰ）の１４５ｂｐ長のエンハンサーエレメントと組み合わされる；ＨＡＬ－ＡＭＢＰ及びＨＡＴ－ＡＭＢＰ）を含む。表１は、用いられ得るプロモーターの例を提供する。

単一のプラスミド構築物上の１つ以上のプロモーターが、１つ以上の発現カセットの発現を駆動するために用いられ得る。

さらに、細菌プロモーター、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーターが、発現を制御するために使用され得る。

一実施形態において、プロモーターはヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターである。ｈＣＭＶプロモーターは、様々な哺乳動物細胞種において高レベルの発現を提供する。

細胞内の転写及び翻訳制御配列がコード配列の発現を誘導または制御する場合、コード配列は該配列の「制御下にある」、該配列に「機能的に会合される」、「作動可能に連結される」、または「作動可能に会合される」。例えば、遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへのコード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介転写を誘導し、次いで、（それがイントロンを含有する場合）スプライシングされ得、また任意選択的に、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る。遺伝子に作動可能に連結されたターミネーター／ポリＡシグナルは、ＲＮＡへの遺伝子の転写を終結させ、ＲＮＡ上へのポリＡシグナルの付加を誘導する。

「発現する」及び「発現」という用語は、遺伝子、ＲＮＡ、またはＤＮＡ配列内の情報が顕在化されることを可能にするかまたは顕在化させることを意味し、例えば、対応する遺伝子の転写及び翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を産生させることを意味する。「発現する」及び「発現」は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写及びＲＮＡからタンパク質への転写を含む。ＤＮＡ配列は細胞内でまたは細胞によって発現され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質等の「発現産物」を形成する。発現産物自体も、細胞によって「発現される」と言える。

「形質転換」という用語は、細胞への核酸の導入を意味する。導入された遺伝子または配列は、「クローン」と称され得る。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容する宿主細胞は、「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞を含む任意の源に由来してもよいか、または異なる属もしくは種の細胞に由来してもよい。当該技術分野で非常によく知られている形質転換法の例として、リポソーム送達、電気穿孔、ＣａＰＯ４形質転換、ＤＥＡＥ－デキストラン形質転換、マイクロインジェクション、及びウイルス感染が挙げられる。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含む。「ベクター」という用語は、宿主を形質転換するために、また任意選択的に、導入された配列の発現及び／または複製を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が宿主細胞に導入され得るビヒクル（例えば、プラスミド）を指してもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、発現系において発現され得る。「発現系」という用語は、ベクターによって運搬され、宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を好適な条件下で発現することができる宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。一般的な発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞及びベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ならびにウイルス、例えばアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。

「免疫刺激性サイトカイン」（単数または複数）という用語は、免疫応答を刺激する能力を有する免疫に関与する細胞によって自然に分泌されるタンパク質を指す。免疫刺激性サイトカインの例を表２Ａ及び表２Ｂに提供する。

本明細書で使用される「共通の腫瘍抗原を含有する遺伝子アジュバント」という句は、受容体チロシンキナーゼと表４に記載されるような既知の腫瘍抗原との融合タンパク質を指す。

ＩＩ．概要

本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞、特に腫瘍細胞のトランスフェクション後に複数のタンパク質の十分な発現を可能にする発現ベクターを提供する。

有効性及び安全性を向上させるように設計された、本明細書に記載される変更点のいくつかまたは全部を含むベクターが提供される。ベクターの最適化は、適切なペプチドをコードする配列の組込み、及び遺伝子発現を最大化するための部位の微調整を含む。ペプチドは、サイズに関係なく、また、例えばグリコシル化及びリン酸化の場合のように、翻訳後修飾されているかどうかにかかわらず、任意の翻訳産物であると理解されたい。

本発明は、翻訳制御エレメント、例えば、発現されるべき遺伝子配列に作動可能に連結されたＰ２Ａを含む発現ベクターを提供する。特定の実施形態において、発現ベクターは、少なくとも２つの翻訳されるべき核酸配列を含み、翻訳制御エレメントは、翻訳されるべき配列のうちの少なくとも１つに作動可能に連結される。ベクターは、既知であるか、または当業者によって構築されてもよく、本明細書に後述する実施例に示されるような本発明の配列に加えて、配列の所望の転写を達成するために必要な全ての発現エレメントを含有する。ベクターは、それらの使用に応じて、原核生物または真核生物宿主系のいずれかに使用されるエレメントを含有する。当業者は、どの宿主系が特定のベクターに適合するかを知っている。

組換え遺伝子の発現は、適切な遺伝子の転写及びメッセージの効率的な翻訳に依存する。これらのプロセスのいずれか一方を正しく行うことができないと、所与の遺伝子の発現が失敗に終わる可能性がある。単一のプラスミドから１つより多くの遺伝子を発現させる必要がある場合、これはさらに複雑になる。従来、発現されるべき遺伝子の間には内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が用いられていた。ＩＲＥＳは、それらのサイズのために、また第２の遺伝子の翻訳効率が第１の遺伝子よりもはるかに低いために限界がある。最近の研究により、ピコルナウイルスポリタンパク質２Ａ（「Ｐ２Ａ」）ペプチドの使用が、Ｐ２Ａペプチドに隣接する複数のタンパク質の化学量論的発現をもたらすことが分かった（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（２０１１）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ６：３１８５５６を参照のこと）。

例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７等のヘテロ二量体タンパク質を含む多様な免疫調節物質、及び発現プラスミドに共通の腫瘍抗原を含有する遺伝子アジュバント、例えば、Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１融合タンパク質の適切な組換え発現。これは、プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔によって腫瘍に送達される（腫瘍内送達）場合に特に当てはまる。

免疫刺激性サイトカインの例を表２Ａに提供する。

また、表２Ｂに記載されるような自然免疫制御因子も免疫刺激のために企図される。

いくつかの研究によって、翻訳修飾因子は多量体タンパク質をコードする遺伝子の翻訳を効率的に駆動できることが示されている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰｌｏＳ ＯＮＥ ６：１－８；Ｉｂｒａｈｉｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：８４５－８６０；Ｓｚｙｍｃｚａｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９－５９４を参照されたい）。表５は、翻訳修飾因子の例を提供する。

ＩＩＩ．デバイス及び使用

本発明は、腫瘍内遺伝子の電気泳動転写に用途を見出す。具体的には、本発明のプラスミド構築物は、十分な濃度のいくつかの組換えによって発現させる免疫調節分子、例えば、多量体サイトカインまたは多量体サイトカインの組み合わせ、天然または遺伝子改変形態の共刺激分子、共通の腫瘍抗原を含有する遺伝子アジュバント等を作製するために使用することができる。組織、例えば、腫瘍内への本発明のプラスミド構築物の移入を達成するために、電気穿孔デバイスが用いられる。

本発明の実施形態のデバイス及び方法は、ほんの一瞬から数日、数週、及び／または数ヶ月に及ぶ期間にわたって、腫瘍に連続的に及び／またはパルスで電気治療を送達することにより癌性腫瘍を治療するのに役立つ。好ましい実施形態において、電気治療は、直流電気治療である。

本明細書で使用される「電気穿孔」（すなわち、細胞膜を透過性にすること）は、（例えば、治療薬、溶液、遺伝子、及び他の薬剤等の分子の生細胞への拡散を可能にするために）細胞膜に穴を開けるのに十分な任意の期間で患者に送達される任意の量のクーロン、電圧、及び／または電流によって引き起こされ得る。

組織への電気治療の送達は、一連の生物学的及び電気化学的反応を引き起こす。十分に高い電圧では、電気治療の適用によって細胞構造及び細胞代謝が大幅に妨げられる。癌性細胞及び非癌性細胞の両方が、ある特定のレベルの電気治療で破壊されるが、腫瘍細胞は非癌性細胞よりもそれらの微小環境における変化に対する感受性が高い。多量原子及び微量原子の分布は電気治療の結果として変化する。電気穿孔付近の細胞の破壊は、不可逆的電気穿孔として知られている。

可逆的電気穿孔の使用も企図される。可逆的電気穿孔は、電極を用いて印加される電力が標的組織の電界閾値未満である場合に行われる。印加される電力が細胞の閾値未満であるため、細胞はそれらのリン脂質二重層を修復して通常の細胞機能を継続することができる。可逆的電気穿孔は、典型的には、薬物または遺伝子（または通常は細胞膜透過性ではない他の分子）を細胞内に入れることを含む処置によって行われる（Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）"Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｅｐ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ"．２０１０ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ：２７４３－６）。

単一電極構成において、癌性組織の破壊を開始するために、鉛電極と発電機筐体との間にわずか数秒から数時間電圧が印加され得る。所与の電圧の印加は一連のパルスであってもよく、各パルスはわずか数秒から数分持続する。特定の実施形態において、パルスの期間及び幅は、約～であり得る。また低電圧がわずか数秒から数分の期間印加されてもよく、それによって白血球を腫瘍部位に引き寄せることができる。このようにして、細胞媒介性免疫系は、死滅した腫瘍細胞を除去することができ、腫瘍細胞に対する抗体を発生させることができる。さらに、刺激された免疫系は、境界性腫瘍細胞及び転移を攻撃することができる。

宿主種に応じて、限定されないが、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、無機塩、例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、種々のサイトカイン、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを含む種々のアジュバントが、任意の免疫学的応答を高めるために使用され得る。代替として、免疫応答は、破傷風トキソイド、ジフテリア毒素、卵白アルブミン、コレラ毒素、またはそれらの断片等の分子と組み合わせることによって、及び／またはカップリングすることによって増強することができる。

Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム及びそれらの使用について記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極；皮下針；プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極に導電結合を提供する電気コネクタ；及び電源を備える。操作者は支持構造上に取り付けられた複数の針電極を把持し、体内または植物内の選択された組織内にそれらをしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子が皮下針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが起動され、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加される定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得る電気穿孔デバイスについて記載している。電気穿孔デバイスは、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって特定される動電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を備える。ＥＫＤデバイスは、使用者の制御及びパルスパラメータの入力に基づいて、アレイの電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを形成し、電流波形データの格納及び収集を可能にする。電気穿孔デバイスはまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針のための中央注入チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクも備える（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号を参照のこと）。

米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイ及び方法は、筋肉等の組織だけではなく他の組織または器官の深部への侵入にも適合される。電極アレイの構成のために、電極によって予め輪郭が定められた領域内で、（選択された生体分子を送達するために）注射針も標的器官内に完全に挿入され、注射が標的組織に垂直に投与される。

電気化学インピーダンス分光法（「ＥＩＳ」）を組み込んだ電気穿孔デバイスも包含される。そのようなデバイスは、ｉｎ ｖｉｖｏのリアルタイム情報、具体的には腫瘍内電気穿孔の効率を提供し、条件の最適化を可能にする。ＥＩＳを組み込んだ電気穿孔デバイスの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１６１２０１に見出すことができる。

他の代替の電気穿孔技術も企図される。Ｉｎ ｖｉｖｏ プラスミド送達は、コールドプラズマを用いて行うこともできる。プラズマは、物質の４つの基本状態のうちの１つであり、その他は「固体」「液体」、及び「気体」である。プラズマは、未結合の正粒子及び負粒子からなる電気的に中性な媒体である（すなわち、プラズマの全体的な電荷はほぼゼロである）。プラズマは、気体を熱することによって、またはレーザーもしくは電磁波発生器によって印加される強電磁場に供することによって形成することができる。これによって電子の数を減少または増加させ、イオンと称される正または負の電荷を持つ粒子を形成し（Ｌｕｏ， ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｓｍａ ５：２８６８－２８７０）、また存在する場合は分子結合の解離を伴う。

コールドプラズマ（すなわち、非熱的プラズマ）は、好適な電極へのパルス状高電圧シグナルの送達によって生成される。コールドプラズマデバイスは、ガス噴射デバイスまたは誘電体バリア放電（ＤＢＤ）デバイスの形態を取り得る。低温プラズマは、それらが比較的低いガス温度でプラズマを提供するという理由から非常に強い興味及び関心を集めてきた。そのような温度でのプラズマの提供は、創傷治癒、抗細菌処理、種々の他の医学療法及び滅菌法を含む様々な用途にとって興味深いものである。先に述べたように、コールドプラズマ（すなわち、非熱的プラズマ）は、好適な電極へのパルス状高電圧シグナルの送達によって生成される。コールドプラズマデバイスは、ガス噴射デバイス、誘電体バリア放電（ＤＢＤ）デバイス、または多周波多調波電源の形態を取ることができる。

誘電体バリア放電デバイスは、コールドプラズマを発生させるために異なるプロセスに依存する。誘電体バリア放電（ＤＢＤ）デバイスは、誘電体層によって覆われた少なくとも１つの導電性電極を含む。電気帰還路は、コールドプラズマ処理を受ける標的基板によって提供され得る接地によって、または電極のための内蔵接地を提供することによって形成される。誘電体バリア放電デバイスのためのエネルギーは、上で述べたような高電圧電源によって提供され得る。より一般的に、エネルギーは、パルス状ＤＣ電圧の形態で誘電体バリア放電デバイスに入力され、プラズマ放電を形成する。誘電体層のために、放電は導電性電極及び電極エッチングから分離され、ガスの加熱が低減される。パルス状ＤＣ電圧は、様々な型の操作を達成するために振幅及び周波数が異なり得る。そのようなコールドプラズマ発生の原理を組み込んだ任意のデバイス（例えば、ＤＢＤ電極デバイス）は、本発明の種々の実施形態の範囲内に属する。

コールドプラズマは、外来核酸で細胞をトランスフェクトするために用いられてきた。具体的には、腫瘍細胞のトランスフェクションである（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１７２９－１７３３；及びＣｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０３：１５－２１を参照されたい）。

デバイスは、癌または他の非癌性（良性）増殖に罹患した患者における使用のために企図される。これらの増殖は、病変、ポリープ、新生物（例えば、乳頭状尿路上皮新生物）、パピローマ、悪性病変、腫瘍（例えば、クラッキン腫瘍、門部腫瘍、非侵襲性乳頭状尿路上皮腫瘍、胚細胞性腫瘍、ユーイング腫瘍、アスキン腫瘍、原発性神経外胚葉性腫瘍、ライディッヒ細胞腫、ウィルムス腫瘍、セルトリ細胞腫）、肉腫、細胞腫（例えば、扁平上皮癌、総排泄腔癌、腺癌、腺扁平上皮癌、胆管細胞癌、肝細胞癌、侵襲性乳頭状尿路上皮癌、平坦型尿路上皮癌）、塊、または任意の他の種類の癌性もしくは非癌性増殖のいずれかとして、それら自体で顕在化し得る。本発明の実施形態のデバイス及び方法を用いて治療される腫瘍は、非侵襲性、侵襲性、表在性、乳頭状、平坦型、転移性、局所性、単中心性、多中心性、低悪性度、及び高悪性度のいずれかであり得る。

デバイスは、多数の種類の悪性腫瘍（すなわち、癌）及び良性腫瘍における使用のために企図される。例えば、本明細書に記載されるデバイス及び方法は、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌（例えば、肝外胆管癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）膀胱癌、良性及び癌性の骨癌（例えば、骨腫、類骨腫、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳癌及び中枢神経系癌（例えば髄膜腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、乳管内上皮内癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺棘細胞癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道癌、膀胱癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、咽頭癌及び下咽頭癌、肝臓癌（例えば血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔癌及び副鼻腔癌（例えば、感覚神経芽腫、正中線肉芽腫）、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌及び中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌、メラノーマ性及び非メラノーマ性皮膚癌の両方（メルケル細胞癌を含む）、胃癌、精巣癌（例えば精上皮腫、非セミノーマ性胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞状癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌、及び子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）における使用のために企図される。

ＩＶ．併用療法

免疫調節性タンパク質をコードするＤＮＡの腫瘍内電気穿孔は、他の治療実体とともに施行され得ることが企図される。表６は可能性のある組み合わせを提供する。併用療法の施行は、電気穿孔単独によって、または電気穿孔と全身送達との組み合わせによって達成され得る。

本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照すると最良に理解されるが、それらは本発明を特定の実施形態に限定するものではない。

実施例

Ｉ．一般的方法

分子生物学における標準的な方法が記載されている。Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ。また、標準的な方法はＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．にも見られ、細菌細胞及びＤＮＡ変異誘発におけるクローニング（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞及び酵母のクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質及びタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）について記載している。

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化を含むタンパク質精製の方法が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５－１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；ｐｐ．４５－８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４－３９１を参照されたい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の生成、精製、及び断片化が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（上記参照）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的技術が利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

蛍光標示式細胞分取検出系（ＦＡＣＳ（登録商標））を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマー及びプローブを含む核酸、ポリペプチド、ならびに抗体を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ。

免疫系の組織学の標準的方法が記載されている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）ヒトＴｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｈｉａｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，Ｐａ．；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙを参照されたい。

例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージ及びデータベースが入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖ．）；Ｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１－７４２；Ｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１－７４２；Ｗｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７－１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７－２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３－４６９０を参照されたい。

ＩＩ．ヒトＩＬ－１２ ｐ３５及びｐ４０サブユニットのｐＯＭＩ２Ａへのサブクローニング

ｐＵＭＶＣ３骨格をＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ，ＮＤ）から購入した。ｈＩＬ１２ｐ４０にインフレームで連結された翻訳調節エレメントＰ２Ａ（Ｐ２Ａ－ｈＩＬ１２ｐ４０）をコードする１０７１ｂｐ ＤＮＡ断片（遺伝子ブロック）をＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ、カタログ番号Ｍ０５３０Ｓ）を用いてｐ４０遺伝子ブロックをＰＣＲ増幅し、標準的な制限酵素対及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ、カタログ番号１５２２４－０１７）を用いてＣＭＶプロモーター／エンハンサー下流のｐＵＭＶＣ３にライゲートした。制限酵素消化によりＰ２Ａ－ｈＩＬ１２ｐ４０／ｐＯＭＩ２Ａの陽性クローンを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。

ヒトｐ３５は、クローニングを容易にするために内部ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、及びＸｂａ１部位を除去した７８９ｂｐ遺伝子ブロックとしてＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）に注文した。ｐ３５遺伝子ブロックを前述のようにＰＣＲ増幅し、Ｐ２Ａ－ｈＩＬ１２ｐ４０／ｐＯＭＩ２Ａにおいてｐ４０遺伝子ブロックの上流にライゲートした。制限酵素消化によりｈＩＬ１２ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｐ４０／ｐＯＭＩ２Ａの陽性クローンを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。

他のヘテロ二量体サイトカイン、一本鎖サイトカイン、または自然免疫制御因子（表２Ａ、２Ｂ）を、ＩＬ－１２と類似したｐＯＭＩ２Ａベクターにクローニングした。

ＩＩＩ．ＩＬ－１５－Ｐ２Ａ－ＩＬ－１５ＲαのｐＯＭＩ２Ａへのサブクローニング

翻訳調節エレメントＰ２Ａにインフレームで一緒に連結されたｈＩＬ１５及びｈＩＬ１５Ｒαをコードする１３８４ｂｐ遺伝子ブロックをＩＤＴに注文した。遺伝子ブロックを前述のようにＰＣＲ増幅し、ｐＯＭＩ２Ａにライゲートした。制限酵素消化により陽性クローンを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。

活性の増加を示すＩＬ－１５の変異体形態も、前述のようにｐＯＭＩ２Ａベクターにサブクローニングした（例えば、Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：３５９８を参照のこと）。

ＩＶ．ＩＬ－１５－Ｐ２Ａ－ＩＬ－１５Ｒα－ＩｇＧ１ＦｃのｐＯＭＩ２Ａへのサブクローニング

ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列決定をコードする７０８ｂｐ ＤＮＡ遺伝子ブロックをＩＤＴに注文した。遺伝子ブロックを前述のようにＰＣＲ増幅し、ｐＯＭＩ２ＡにおいてＩＬ－１５－Ｐ２Ａ－ＩＬ－１５Ｒαの下流にライゲートした。次に、ＩＬ１５ＲａとＦｃの間の停止部位をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発反応（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ、カタログ番号２００５２１）により除去した。最後に、完全ＩＬ１５－Ｐ２Ａ－ＩＬ１５Ｒα－ＩｇＧ１Ｆｃ配列をＰＣＲ増幅し、ｐＯＭＩ２Ａに再びライゲートした。

Ｖ．ＩＮＦγのｐＯＭＩ２Ａへのサブクローニング

全長ヒトＩＮＦγコード配列をコードする５０１ｂｐ ＤＮＡ遺伝子ブロックをＩＤＴに注文した。遺伝子ブロックを前述のようにＰＣＲ増幅し、ｐＵＭＶＣ３（Ａｌｄｅｖｅｒｏｎ）にライゲートした。制限酵素消化により陽性クローンを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。最後に、ＩＦＮγインサートをＰＣＲ増幅し、種々のｐＯＭＩ２Ａベクターにライゲートした。

ＶＩ．ＦＬＴ３Ｌ－抗原融合タンパク質構築物の作製

ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）は、Ｔ細胞の優先的提示のために抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原を誘導することが示されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ． ２０１４，Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１，７１：６１３２）。Ｆｌｔ３Ｌから分泌された可溶性の形態は、様々なタンパク質またはペプチド抗原に融合される（表４：Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．２０１４）。ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質構築物を作製するための例示的なプロトコルが示される。

各々が、ＩｇＫシグナルペプチド配列に続いて、Ｆｌｔ３ＬのＥＣＤ、短いヒンジ領域、及びＮＹ－ＥＳＯ－１抗原の３つの異なるセグメントを含有する３つの遺伝子ブロックをＩＤＴから得た。ＰＣＲを用いて隣接する制限部位を加え、これらの３つの融合タンパク質構築物をｐＵＭＶＣ３（配列番号１７～２２）に導入した。マウスにおける前臨床試験のために、Ｆｌｔ３Ｌも卵白アルブミン遺伝子（配列番号２４）由来のＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド抗原を含有する３つのペプチドのコンカテマーに融合した。ｐＵＭＶＣ３から、３つの融合構築物がｐＯＭＩ－２ｘ２Ａに導入される（後述する）。

同じ方法を用いて、ウイルス抗原を使用して代替の融合タンパク質（表４）が構築される。

同じ方法を用いて、全長カルレティキュリンを含む代替の融合タンパク質（表３）が構築される。

同定された共通の腫瘍抗原に加えて、患者特異的ネオ抗原を同定することができ、その患者に合わせた免疫原性ペプチド抗原を腫瘍内電気穿孔を介した個別化療法のためにＦｌｔ３Ｌに融合することができる（例えば、Ｂｅｃｋｈｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０，１２０：２２３０を参照のこと）。

全ての免疫調節性タンパク質の型は、マウス相同配列を用いて並行して構築され、前臨床試験に使用される。

ＶＩＩ．単一転写物から３つのタンパク質を発現させるためのＯＭＩ－２ｘ２Ａの作製

ベクターの概略図を図３に示す。単一の多シストロン性メッセージから３つ全てのタンパク質を発現させることができるようにエクソンスキップモチーフを介在させて、同じプロモーターから３つ全ての遺伝子を発現させる。

例示的なサブクローニングプロトコルがＩＬ－１２ヘテロ二量体サイトカイン及びＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１について示される。ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１をコードするＤＮＡ遺伝子ブロック（ＩＤＴ）を上流Ｐ２Ａ部位及び隣接する制限部位を用いてＰＣＲ増幅し、ｈＩＬ－１２ｐ４０の下流にライゲートした。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）を行ってｐ４０の停止部位３´を欠失させた。制限酵素消化により陽性クローンを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。

同じ方法を用いて、既に多シストロン性メッセージ内に存在する３つの遺伝子の上流または下流のいずれかに第４の遺伝子を加えることができる。

ＸＩＩＩ．ＥＬＩＳＡ

製造業者の推奨に従ってＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ－１（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，カタログ番号ＭＩＲ ２３００）を使用して、ＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１２及びＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒ、ならびにＯＭＩ２ｘ２Ａ－ＩＬ１２－Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１のクローンをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。２日後、上清を収集し、５分間３０００ｒｐｍで回転させてあらゆる細胞片を除去した。清澄な上清を新しい試験管に移し、アリコートし、－８６℃で凍結させた。複合体を特異的に検出するＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮカタログ番号ＤＹ１２７０，ＤＹ６９２４）を用いて、馴化培地中のｈＩＬ－１２ｐ７０及びｈＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質のレベルを定量化した。ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１融合タンパク質のレベルを抗Ｆｌｔ３Ｌ抗体を用いてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮカタログ番号ＤＹ３０８）により定量化した。

ｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１２及びｐＯＭＩＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２でトランスフェクトした細胞からのｈＩＬ－１２ｐ７０の発現及び分泌の比較により、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、ｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１２が、トランスフェクトされた細胞によって分泌された成熟ヘテロ二量体ｐ７０タンパク質のより高い発現レベルをもたらしたことが明らかになった（図４Ａ）。ｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα及びｐＯＭＩ２Ａ－ｈＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＦｃドメインでトランスフェクトした細胞からの発現及び分泌をＥＬＩＳＡにより測定し、図５Ａに示す。

ＸＩＸ．ウェスタンブロットによるタンパク質の検出

ウェスタンブロット法のために、Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ試料緩衝液ＮｕＰＡＧＥ ４Ｘ ＬＤＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各試料に加え、１００℃で１０分間沸騰させ、試料を遠心分離した。２３μのタンパク質＋試料緩衝液をウェルごとにローディングし、最小量の標準液がゲルの底に達するまで１５０ボルトで約１時間ゲルを流した。ゲルタンパク質をＰＶＤＦ膜に１時間１００ボルトで転写し、１×ＴＢＳＴですすぎ、次いで、ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡを用いてロッカー上で１時間室温でブロックした。すすいだ膜をＴＢＳＴ＋５％脱脂粉乳中に希釈したウサギ抗２Ａペプチド抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢＳ０３１）または抗ＨＡ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３７２４）で一晩インキュベートした。ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にコンジュゲートしたロバ抗ウサギ二次抗体で１時間室温でインキュベートした。増強化学発光試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてブロットを展開し、デジタル画像システム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上でキャプチャした。Ｆｌｔ３Ｌ－ＯＶＡ及びＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１のためにプローブしたＨＥＫ２９３馴化上清のウェスタンブロットにより、これらの融合タンパク質が安定であり、分泌され、予想された分子量を有していたことが明らかになった。

ＸＸ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイ

凍結ヒトＰＢＭＣをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ、カタログ番号ＰＣＳ－８００－０１１）から購入し、解凍し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２及び１０μｇ／ｍＬ ＰＨＡ－Ｌを添加したＲＰＭＩ １６４０中で５日間前刺激した。次いで、乳白色の９６ウェルプレートの３通りのウェルに細胞（２×１０４）を播種し、Ｉｌ－１２ｐ３５／ｐ４０ヘテロ二量体を含有するＨＥＫ２９３細胞培養上清の量を増加させながら、増殖培地（１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含有するＲＰＭＩ １６４０）中で７２時間培養し、前述のようにＥＬＩＳＡによりタンパク質濃度を決定した。非トランスフェクト細胞からの上清を陰性対照として用いた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ、カタログ番号Ｇ７５７０）を製造業者によって記載されるように１×に希釈し、１００ｕＬを各ウェルにピペット分注した。プレートを室温で１０分間穏やかに振盪し、次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で積分時間１秒で発光を読み取った。

ＩＬ－１２発現プラスミドを発現及び分泌するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの培養上清を細胞に加え、増殖応答を測定した。ＯＭＩＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２と比較して３倍高いＯＭＩＰ２Ａ－ｈＩＬ－１２の希釈係数を用いて、ＰＢＭＣ増殖に対する最大半量応答を得た（６９２４４対１９５４８）。相対的なｐ７０タンパク質濃度を正規化したとき、２つのベクターから発現したＩＬ－１２ｐ７０は、ヒトＰＢＭＣにおいて細胞増殖を刺激する相当な能力を有していた（図４Ｂ）。

この結果は、ｐＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１２が、所与の用量のプラスミドから３倍高いＩＬ－１２媒介性Ｔ細胞増殖をもたらし得ることを示唆するものであった。

ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ ＣＡ、カタログ番号ＰＢ００９－３）から購入し、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含有するＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、次いで黒色の９６ウェルプレートの３通りのウェルに播種した（ウェル当たり２×１０４細胞）。増加する量のＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有ＨＥＫ２９３細胞培養上清（前述のようにＥＬＩＳＡによって決定される）を加え、細胞を３日間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ、カタログ番号Ｇ８０８０）をウェルに加えた後、３７℃で４時間インキュベートした。得られた蛍光シグナル（Ｅｘ ５６０／Ｅｍ ５９０ｎｍ）をＣｙｔａｔｉｏｎ ３プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ ＶＴ）上で読み取った。

ｐＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒａ及びｐＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１５／ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃでトランスフェクトした細胞から発現したタンパク質はどちらも、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞増殖を刺激した（図５Ｂ）。

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を用いて、ｐＯＭＩＰ２Ａ－ＩＬ１２－Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する細胞からの組織培養上清を機能的ＩＬ－１２ ｐ７０の発現について試験した。これらの細胞は、ヒトＩＬ－１２受容体、及びＳＴＡＴ４によって駆動されるアルカリホスファターゼの分泌形態を発現するように操作される。

このレポーターアッセイは、製造業者のプロトコルに従って行われた（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎカタログ番号ｈｋｂ－ｉｌ１２）。分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現は、製造業者のプロトコルに従って測定された（Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎカタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｌ）。

ＯＭＩＰ２Ａ多シストロン性ベクターから発現及び分泌したＩＬ－１ ｐ７０タンパク質は、ＳＥＡＰタンパク質の誘導において強い活性を示した（図６）。この活性はｒｈＩＬ－１２タンパク質対照に匹敵し、ＩＬ－１２抗体を中和することによってブロックされた（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＢ－２１９－ＮＡ）（図６）。

ｐＯＭＩＰ２Ａベクターから発現し、ＨＥＫ２９３細胞の培養培地に分泌したヒトＦｌｔ３Ｌ及びＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質を、表面ＴＨＰ－１単核球細胞上で発現されるＦＬＴ３受容体への結合について試験した。

Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ－１を用いて、ＨＥＫ細胞をｐＯＭＩＰ２Ａ－ｈＦｌｔ３ＬまたはｐＯＭＩＰ２Ａ－ｈＦｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１（８０－１８０ａａ）でトランスフェクトした。７２時間後に上清を収集した。分泌ＦＬＴ３Ｌタンパク質の量をｈＦｌｔ３Ｌ ＥＬＩＳＡを用いて定量化した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号ＤＹ３０８）。

ＴＨＰ－１単球細胞株をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＴＩＢ－２０２）中で培養した。各実験ごとに、７５０，０００個のＴＨＰ－１細胞をＦｃ緩衝液（ＰＢＳ＋５％濾過ＦＢＳ＋０．１％ＮａＮ３）中で洗浄し、ヒトＦｃブロック（ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４２２３０１）で１０分間プレインキュベートし、次いで、１５０ｎｇの組換えｈＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＡＡ１７９９９．１）、または１５０ｎｇのｈＦｌｔ３ＬもしくはｈＦｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１タンパク質を含有するＨＥＫ２９３馴化培地で１時間４℃でインキュベートした。次いで、細胞をＦｃ緩衝液中で洗浄し、ビオチン化抗ｈＦｌｔ３Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ３０８）で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＦｃ緩衝液中で洗浄し、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７ ２ｏＡｂで１時間インキュベートした（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、番号Ｓ３２３５７）。細胞を再び洗浄し、Ｇｕａｖａ １２ＨＴサイトメータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＲｅｄ－Ｒチャネルで使用してフローサイトメトリーにより分析した。Ｆｌｔ３受容体を発現しないＨＥＫ２９３細胞も陰性対照として試験した。

９０％を超えるＴＨＰ－１細胞が、ｐＯＭＩＰ２Ａベクターから発現したｈＦｌｔ３Ｌ及びｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質の両方で平均蛍光強度の増加を示したことから、これらの組換えタンパク質が細胞表面上のＦｌｔ３受容体に効率的に結合することが示唆される。

組換えＦｌｔ３Ｌタンパク質の機能性をさらに調べるために、ＨＥＫ２９３馴化培地を用いてマウス脾細胞における樹状細胞成熟の誘導について試験した。

Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍を担持するＣ５８／ＢＬ６マウスから脾臓を切除した。無菌条件下で、脾臓をＤＭＥＭ培地に入れて７０ミクロンのセルストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通し、３ｍｌシリンジからのプランジャのゴム先端部を使用して機械的に解離させた。脾臓が完全に解離してから、１０％ＦＢＳを含むＨＢＳＳ（ＰＦＢ）１０ｍｌを使用してストレーナーを洗浄した。遠心分離機で１０分間３００ｘｇでフロースルーを回転させて細胞をペレット化した。細胞をＰＦＢで１回洗浄した。赤血球を製造業者の指示に従ってＡＣＫ溶解緩衝液で溶解した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ１０４９２０１）。細胞を４０ミクロンのセルストレーナーに通して１５ｍｌ円錐管に濾過し、遠心分離機で３００ｘｇで回転させた。脾臓からの単一細胞懸濁液を完全ＲＰＭＩ－１０培地に再懸濁した。１５０万個の脾細胞を１２ウェルプレートに蒔き、約３時間プレートに接着させた。非接着細胞を除去し、マウスＧＭＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びマウスＩＬ４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの完全ＲＰＭＩ－１０培地を加えた。１週間２日置きに培地を交換した。接着樹状細胞は、３通りのウェルにおいて、１ｍｌのＨＥＫ２９３馴化上清（１００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質を含有する）で７日間処置した。１００ｎｇの組換えヒトＦｌｔ－３リガンドタンパク質を陽性対照として比較した（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＡＡ１７９９９．１）。プレートから細胞を穏やかに剥離し、フローサイトメトリー分析によりＣＤ１１ｃ＋細胞の数を決定した。

ＣＤ３（－）ＣＤ１１ｃ（＋）樹状細胞の数を集計したとき、ｐＯＭＩＰ２Ａ－Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１プラスミドでトランスフェクトした細胞からの馴化培地は、非トランスフェクト細胞からの馴化培地を用いてインキュベートした脾細胞と比較してこれらの細胞の数に著しい増加をもたらした。

この結果は、ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質が、マウス脾細胞においてＦｌｔ３受容体が媒介するｅｘ－ｖｉｖｏの樹状細胞の成熟を刺激するよう機能できることを示唆するものであった。

ＸＸＩ．マウス及び腫瘍

Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから６～８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６ＪまたはＢａｌｂ／ｃマウスを得て、ＡＡＬＡＭガイドラインに従って飼育した。

１０％ＦＢＳ及び５０ｕｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したマッコイ５Ａ培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン）でＢ１６．Ｆ１０細胞を培養した。０．２５％トリプシンを用いたトリプシン処理により細胞を採取し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。麻酔下のマウスには、総体積０．１ｍｌ中１００万個の細胞を各マウスの右側腹部に皮下注射した。総体積０．１ｍｌ中５０万個の細胞を各マウスの左側腹部に皮下注射した。８日目から開始して、平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達するまでデジタルノギスの測定により腫瘍増殖をモニタリングした。腫瘍が所望の体積を有する段階になってから、非常に大きいまたは小さい腫瘍を有するマウスを間引いた。残りのマウスを各１０匹のマウスの群に分け、右側腹部に移植された腫瘍の体積により無作為化した。

Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスにおけるＢ１６ＯＶＡ、ならびにＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴ２６及び４Ｔ１を含むさらなる腫瘍細胞型を試験した。

このプロトコルは、処置腫瘍（原発）及び未処置腫瘍（対側）に対する影響を同時に試験するための標準モデルとして用いられた。４Ｔ１腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃマウスにおいて胚転移も定量化した。

ＸＸＩＩ．腫瘍内処置

処置のためにマウスをイソフルランで麻酔した。環状プラスミドＤＮＡを滅菌０．９％生理食塩水中で１ｕｇ／ｕｌに希釈した。２６ゲージ針付き１ｍｌシリンジを使用して原発腫瘍の中心に５０ｕｌのプラスミドＤＮＡを注射した。注射直後に電気穿孔を行った。ＤＮＡの電気穿孔は、１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓのパルス、０．５ｃｍの６針電極の臨床的電気穿孔パラメータを用いて、Ｍｅｄｐｕｌｓｅｒを使用して達成した。使用された代替のパラメータは、ＢＴＸ発電機、または前述のようなインピーダンス分光法を組み込んだ発電機のいずれかを使用する４００Ｖ／ｃｍ、１０ミリ秒のパルスであった。腫瘍体積を週に２回測定した。原発及び対側の総腫瘍負荷が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させた。

ＸＸＩＩＩ．腫瘍内発現

ＩＴ－ＥＰ（３５０ｖ／ｃｍ、８ １０ミリ秒のパルス）の１日後、２日後、または７日後に、種々の時点で屠殺したマウスから腫瘍組織を単離し、導入遺伝子の発現を決定した。マウスから腫瘍を切除し、液体窒素中のクライオチューブに移した。凍結した腫瘍を３００ｕｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を含む４ｍｌ試験管に移し、氷上に配置し、３０秒間均質化した（ＬａｂＧｅｎ ７１０ホモジナイザー）。ライセートを１．５ｍｌ遠心管に移し、１０，０００ｘｇで１０分間、４℃で回転させた。上清を新しい試験管に移した。回転及び移動手順を３回繰り返した。腫瘍抽出物は、製造業者の指示に従って直ちに分析するか（Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌ ＭＣＹＴＯＭＡＧ－７０Ｋ、Ｍｉｌｌｅｐｏｒｅ）、または－８０℃で凍結させた。組換えＦｌｔ３Ｌ－ＯＶＡは、捕捉用抗Ｆｌｔ３Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ カタログ番号ＤＹ３０８）及び以下の検出用抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ１－１９６）を使用して標準的なＥＬＩＳＡプロトコル（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。

我々のＦｌｔ３Ｌ－追跡抗原－融合タンパク質の発現及び機能について試験するために、マウスＦｌｔ３Ｌ（細胞外ドメイン）と卵白アルブミン遺伝子（配列番号２５）由来ペプチドとの融合物をＯＭＩ２Ａベクター中に構築し、前述のように腫瘍内で電気穿孔した。

種々の免疫調節タンパク質のマウス相同体を含有するｐＯＭＩ２Ａベクターの腫瘍内電気穿孔後、ＥＬＩＳＡによって腫瘍ホモジネート中に著しいレベルのＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、ＩＮＦγ（表９）、及びＦｌｔ３Ｌ－ＯＶＡ組換えタンパク質（表ｘ１０）が全て検出可能であった。

ＸＸＩＶ．腫瘍退縮

ｐＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１２対ｐＯＭＩＩＲＥＳ－ＩＬ－１２の電気穿孔後の腫瘍退縮の比較により、ｐ３５及びｐ４０サブユニットの発現にＰ２Ａエクソンスキップモチーフを使用すると、より高いｐ７０ ＩＬ－１２の発現をもたらすだけではなく（図４Ａ）、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍退縮により良好な有効性ももたらすことが示された。

処置及び未処置腫瘍の両方の退縮の程度が、ＯＭＩＰ２Ａ－ｍＩＬ－１２プラスミドの用量を増加させた電気穿孔によって増加した。

ｐＯＭＩＰ２Ａ－ｍＩＬ１２のＩＴ－ＥＰがＢａｌｂ／ｃマウスにおける４Ｔ１原発腫瘍の増殖及び胚転移に影響を及ぼす能力についても試験した。マウスの右側腹部に１００万個の４Ｔ１細胞を皮下注射し、２５万個の４Ｔ１細胞を左側腹部に注射した。右側腹部のより大きな腫瘍をエンプティベクター（ｐＵＭＶＣ３、Ａｌｄｅｖｅｒｏｎ）またはｐＯＭＩＰ２Ａ－ｍＩＬ１２を用いたＩＴ－ＥＰに供した。腫瘍体積を２日置きに測定し、１９日目にマウスを屠殺し、肺を切除して重量を計測した。

ＩＬ－１２による全身処置が４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおいて胚転移を軽減できることが以前に報告されている（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２：４１１１）。我々の所見は、腫瘍の局所的なＩＴ－ＥＰ処置もこのモデルにおいてこれらの腫瘍細胞の肺への転移を減少させたことを示唆するものである。

Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に加えて、ｐＯＭＩＰ２Ａ－ｍＩＬ１２の電気穿孔もまた、原発（処置）及び対側（未処置）両方のＢ１６ＯＶＡ及びＣＴ２６腫瘍の退縮をもたらす。４Ｔ１腫瘍モデルにおいて、ＥＰ／ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２後に原発腫瘍が退縮し、マウスが肺重量における著しい現象を示したことから、肺転移の減少が示唆される。我々は、ＯＭＩＰ２Ａ－ｍＩＬ１２のＩＴ－ＥＰが、２つの異なるマウスの系統の４つの異なる腫瘍モデルにおいて腫瘍負荷を減少させることができることを示す。

マウスＩＬ－１２ ｐ７０及びヒトＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質の両方を発現するプラスミドの電気穿孔は、７日で処置腫瘍の完全退縮を引き起こした。

電気穿孔により免疫調節遺伝子が導入されたとき、マウスにおける原発及び対側腫瘍の両方の体積がエンプティベクター対照の電気穿孔と比較して著しく減少したことから、処置腫瘍微小環境内の局所的な影響だけではなく、全身的な免疫の増加も示唆される。

ＸＸＩＶ．フローサイトメトリー

ＩＴ－ｐＩＬ１２－ＥＰ処置後の種々の時点にマウスを屠殺し、腫瘍及び脾臓組織を外科的に除去した。

脾臓を７０ミクロンのフィルタに押し付けて脾細胞を単離した後、赤血球溶解（ＲＢＣ溶解緩衝液、ＶＷＲ、４２０３０１ＯＢＬ）、及びＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ＣＬ５０３５）による分取を行った。リンパ球をＳＩＩＮＦＥＫＬ－四量体（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔ０３００２）で染色した後、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２２５）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００４５１）、抗ＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００７４２）、抗ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５４６）、及び生体染色（ｌｉｖｅ－ｄｅａｄ Ａｑｕａ；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ－３４９６６）を含有する抗体カクテルで染色した。細胞を固定し、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で分析した。

腫瘍用のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社の腫瘍解離キット１３０－０９６－７３０、Ｃチューブ、１３０－０９３－２３７）を使用して腫瘍を解離させ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｈｅａｔｅｒｓ（１３０－０９６－４２７）を使用して均質化した。細胞を４℃で５分間８００ｘｇでペレット化し、５ｍＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＦＢ）に再懸濁し、５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ－Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）上に重ねた。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅカラムを、中断することなく室温で２０分間、遠心分離機で１５００ｘｇで回転させた。リンパ球層をＰＢＦで洗浄した。Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５３１４２）を含む５００ｕＬのＰＦＢに細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。９６ウェルプレートにおいて、細胞を、製造業者の指示に従って、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍における免疫優勢抗原であるＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体（ＭＢＬ）の溶液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。抗ＣＤ４５－ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００７２３）、抗ＣＤ３－ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２３２）、抗ＣＤ４－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１２－００４１）、抗ＣＤ８ａ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １７－００８１）、抗ＣＤ４４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０３０２８）、抗ＣＤ１９－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５５）、抗ＣＤ１２７（１３５０１０）、抗ＫＬＲＧ１（１３８４１９）を含む抗体染色カクテルを加え、３０分間室温でインキュベートした。細胞をＰＦＢで３回洗浄した。１％パラホルムアルデヒドを含むＰＦＢ中、氷上で１分間細胞を固定した。細胞をＰＦＢで２回洗浄し、暗所に４℃で保存した。試料をＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で分析した。

ＩＴ－ｐＩＬ１２－ＥＰは、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍における優勢抗原である卵白アルブミン由来のＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対する循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘導する。これらのデータは、局所的なＩＬ－１２治療がマウスの全身的な腫瘍免疫をもたらし得ることを示唆するものである。

原発腫瘍内におけるＯＭＩ２Ａ－ｐＩＬ－１２の電気穿孔は、対側の未処置腫瘍内のＴＩＬの組成を著しく変更することができる。これらの結果は、ｐＯＭＩ２Ａ－ＩＬ－１２を用いた腫瘍内処置が未処置腫瘍の免疫環境に影響を及ぼし得ることを示しており、全身的な抗腫瘍免疫応答をもたらすことが示唆される。この結論は、脾臓における腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出の増加（表１６）、対側腫瘍の退縮（表１２）、及び肺転移の減少（表１３）によって裏付けられる。

ＸＸＶ．マウスの遺伝子発現の分析

ｐＯＭＩＰ２Ａ－ＩＬ１２及びｐＯＭＩ－Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１プラスミドのＩＴ－ＥＰによって誘導した処置及び未処置腫瘍における遺伝子発現の変化の分析にＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを使用した。メスを使用してマウスから注意深く腫瘍組織を採取し、液体窒素中で瞬間凍結させた。天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、ＭＬ５４型）を使用して組織の重量を計測した。１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を組織に加え、氷上でプローブホモジナイザーを使用して均質化した。製造業者の指示を使用してＴｒｉｚｏｌからＲＮＡを抽出した。Ｄｎａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＮ０５２５）処理により汚染ＤＮＡを除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して全ＲＮＡ濃度を決定した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術を用いて遺伝子発現プロファイリングを行った。端的に述べると、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（Ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｅ´ｖ１´Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５０ｎｇの全ＲＮＡを９６℃で一晩ハイブリダイズした。このパネルは、５６１個の免疫学関連マウス遺伝子と、陽性対照（全体的なアッセイ性能を評価するための種々の濃度のスパイクＲＮＡ）及び（全ＲＮＡ入力における差を正規化するための）１５個の陰性対照の２種類の組み込まれた対照をプロファイルする。次いで、ハイブリダイズした試料を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ ＳＰＲＩＮＴ（商標）Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用して各ＲＮＡ種の出現頻度についてデジタル的に分析した。ｎＳｏｌｖｅｒ（商標）分析ソフトウェア２．５パックを使用して粗ｍＲＮＡ存在量（出現頻度）を分析した。このプロセスでは、ハウスキーピング遺伝子の幾何平均、陰性対照の平均、及び陽性対照の幾何平均から得た正規化係数を用いた。

ｐＯＭＩＰ２Ａ－ＩＬ１２電気穿孔後の４Ｔ１及びＭＣ－３８腫瘍モデルにおける処置及び未処置腫瘍からの抽出物のさらなるＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析により、リンパ球及び単球細胞表面マーカーならびにＩＮＦγによって調節される遺伝子の同様の上方制御が明らかになったことから、ＩＬ－１２が腫瘍微小環境に及ぼすこれらの影響が複数のマウス腫瘍モデルに対して一般化できることが示唆される。

処置及び未処置腫瘍からの組織の遺伝子発現分析は、ｐＯＭＩＰ２Ａ－ＩＬ１２のＩＴ－ＥＰによって腫瘍ＴＩＬの大幅な増加を示すフローサイトメトリー分析を裏付けるものである。また、インターフェロンγによって調節される遺伝子の増加は、腫瘍内の免疫刺激環境の誘導を示唆している。チェックポイントタンパク質の発現における著しい増加は、ＩＴ－ｐＩＬ１２－ＥＰが併用されるチェックポイント阻害剤の作用のための基質を増加させ得ることを示唆している。

ヒトＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質単独をコードするＯＭＩプラスミドの腫瘍内電気穿孔もまた、腫瘍退縮及び腫瘍ＴＩＬの免疫表現型に対する変化に影響を及ぼした。

Ｆｌｔ３Ｌに融合した追跡抗原をコードするプラスミドの電気穿孔に対する宿主応答を調べるために、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍をｐＯＭＩ－Ｆｌｔ３Ｌ－ＯＶＡで電気穿孔し、ＯＶＡ抗原に対する宿主応答を測定した。１００万個のＢ１６Ｆ１０細胞をマウスの右腹側部に注射した。７日後、腫瘍をｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２－ｍＦｌｔ３Ｌ－ＯＶＡ、エンプティベクターで電気穿孔したか、または未処置のままにした。電気穿孔は、Ｇｅｎｅｓｉｓ発電機を４００Ｖ／ｃｍ、８ １０ミリ秒のパルスで使用して行った。ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２－ｍＦＬＴ３－ＯＶＡで腫瘍退縮が観察された（表１５）。

ＦＬｔ３Ｌ－ＯＶＡ融合タンパク質をコードするプラスミドを腫瘍内に導入してから７日後に、マウスにおける追跡抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を鼠径リンパ節で調べた。

電気穿孔処理から７日後にリンパ節を単離した。マウスを屠殺し、鼠径リンパ節を切除し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＦＢ）中ですり潰し、次いで７０マイクロフィルタを通して濾過した。細胞を遠心分離機において４℃で３００ｘｇにてペレット化し、ＰＦＢ中で洗浄し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）上でカウントした。

Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５３１４２）を含むＰＦＢにリンパ節細胞のペレットを穏やかに再懸濁した。次いで、細胞を、製造業者の指示に従ってＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体（ＭＢＬ）の溶液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６６）、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２２８）、抗ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５５５）、抗ＣＤ１２７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８ａ（ＭＢＬ Ｄ２７１－４）、抗ＣＤ４４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０３０２８）、抗ＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０９１１０）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００５４７）、抗ＫＬＲＧ１（１３８４１９）、抗ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０４４４８）を含む抗体染色カクテルを加え、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＦＢで洗浄した。１％パラホルムアルデヒドを含むＰＦＢ中、氷上で１分間細胞を固定した。細胞をＰＦＢで３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）によって分析した。

ＯＶＡをマウスにおける代替の追跡抗原として用いて、我々は、Ｆｌｔ３Ｌ－融合タンパク質として腫瘍内に電気穿孔された追跡抗原に対する循環Ｔ細胞を容易に検出できることを実証した。

ＸＸＶ．マウス尾静脈への水力学的注射によるプラスミドの導入

ＯＭＩプラスミドから発現されるＦｌｔ３Ｌ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの尾静脈内への５ｕｇのプラスミドの水力学的注射によって試験した。７日後、マウスを屠殺し、脾臓を切除し、重量を計測し、フローサイトメトリーによる細胞組成の変化の分析のために解離させた。

脾細胞を前述のように単離し、ＰＦＢで洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５３１４２）を含むＰＦＢに再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。以下を含有する抗体カクテルを加えた：抗ＮＫ１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１０８７３１）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００５４７）、抗Ｆ４／８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １２３１４９）、抗ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５５５）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０７６４５）、抗ＣＤ８（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄ２７１－４）、抗ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０４７２２）、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１７３０８）、抗ＣＤ４０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １２４６３０）、抗ＧＲ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０８４２４）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１７３２４）、抗ＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０５０２４）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０１２１２）。３７℃でインキュベートする。細胞をＰＦＢで３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）により分析した。

ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質（８０－１８０ ａａ）の一部に融合したヒトＦｌｔ３ＬまたはヒトＦＬｔ３Ｌコードするプラスミドの導入は、脾臓においてＣＤ１１＋樹状細胞（ＤＣ）の増加をもたらす。さらに、これらのＤＣの大半は高レベルのＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩを示し、それらが成熟ＤＣであることを示唆している。さらに、これらのＤＣの一部はより高いレベルの細胞表面ＣＤ８６を示しており、それらが活性化されたことが示唆される。

これらのデータは、これらのプラスミドから発現され、マウスにおいてＤＣの成熟及び活性化をもたらす、活性Ｆｌｔ３リガンドへの暴露と一致している（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｂｌｏｏｄ ９６：８７８）。

配列識別子

Claims (15)

1. 式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ´によって表される発現カセットを含む、発現プラスミド。
   式中、
   ａ）Ｐは発現プロモーターであり、
   ｂ）ＡはＩＬ－１２ｐ３５をコードし、
   ｃ）Ａ´はＩＬ－１２ｐ４０をコードし、
   ｄ）Ｔは２Ａリボソームスキップ調節因子をコードする。
2. Ｐは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ＳＶ－４０プロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、及びβアクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の発現プラスミド。
3. 前記Ａ－Ｔ－Ａ´が、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の核酸配列を含む、請求項１または２に記載の発現プラスミド。
4. 式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ´－Ｔ－Ｂまたは式Ｐ－Ｂ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ａ´によって表される発現カセットを含む、発現プラスミド。
   式中、
   ａ）Ｐは発現プロモーターであり、
   ｂ）ＡはＩＬ－１２ｐ３５をコードし、
   ｃ）Ａ´はＩＬ－１２ｐ４０をコードし、
   ｄ）Ｂは少なくとも１つの腫瘍抗原と融合した少なくとも１つの遺伝子アジュバントをコードし、前記遺伝子アジュバントは、Ｆｌｔ３リガンド、ＬＡＭＰ－１、ヒトヒートショックタンパク質９６、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＣＳＦ１受容体からなる群から選択され、
   ｅ）Ｔは翻訳修飾エレメントである。
5. Ｐは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ＳＶ－４０プロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、及びβアクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項４に記載の発現プラスミド。
6. 前記翻訳修飾エレメントは、２Ａリボソームスキップ調節因子及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される、請求項４または５に記載の発現プラスミド。
7. 前記遺伝子アジュバントは、前記Ｆｌｔ３リガンドである、請求項４～６のいずれかに記載の発現プラスミド。
8. 前記抗原は、ＮＹＥＳＯ－１抗原、ＯＶＡ抗原、ＲＮＥＵ抗原、ＭＡＧＥ－Ａ１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ２抗原、Ｍａｇｅ－Ａ１０抗原、ＳＳＸ－２抗原、Ｍｅｌａｎ－Ａ抗原、ＭＡＲＴ－１抗原、チロシナーゼ抗原、Ｇｐ１００抗原、ＬＡＧＥ－１抗原、サバイビン抗原、ｈＴＥＲＴ抗原、ＰＲＳ ｐａｎ－ＤＲ抗原、Ｂ７－Ｈ６抗原、ＨＰＶ Ｅ７抗原、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７抗原、ＨＰＶ１１ Ｅ６抗原、ＨＰＢ６ｂ／１１ Ｅ７抗原、インフルエンザ ＨＡ抗原、インフルエンザ ＮＡ抗原、ポリオーマウイルス抗原、ＣＥＡペプチドＣＡＰ－１抗原、ＨＣＶ－ＮＳ３抗原、及びＨＰＶワクチンペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の発現プラスミド。
9. 前記Ａ－Ｔ－Ａ´が、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の核酸配列を含む、請求項４～８のいずれかに記載の発現プラスミド。
10. 対象における腫瘍を治療するために使用され、
    少なくとも１つの腫瘍内電気穿孔パルスを使用して、腫瘍内に送達される、請求項１～９のいずれかに記載の発現プラスミド。
11. 前記腫瘍内電気穿孔パルスは２００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項１０に記載の発現プラスミド。
12. 前記対象はヒトである、請求項１０に記載の発現プラスミド。
13. 前記腫瘍は、メラノーマ、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、ＣＴＣＬ、及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の発現プラスミド。
14. 前記腫瘍内電気穿孔パルスは、電気化学インピーダンス分光法が可能な発生装置によって送達される、請求項１０に記載の発現プラスミド。
15. 式Ｐ－Ａ－Ｔ－Ｂによって表される発現カセットを含む、発現プラスミド。
    式中、
    ａ）Ｐは発現プロモーターであり、
    ｂ）Ａは免疫刺激性サイトカインをコードし、
    ｃ）Ｂは少なくとも１つの抗原と融合した遺伝子アジュバントをコードし、
    ｄ）Ｔは翻訳修飾エレメントである。

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