JP2004500047A - キメラ免疫原性組成物およびこれらをコードする核酸 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラポリペプチドをコードする新規なキメラ核酸、これらのポリペプチドをインビトロとインビボとの両方で発現するための構築物、単離されたキメラポリペプチド、薬学的組成物ならびにこれらの組成物を作製および使用する方法を提供する。これらの組成物および方法は、選択された抗原の免疫原性を刺激または増強するため、あるいはこの抗原に対して特異的な細胞免疫応答を刺激または増強するために、特に有用である。本発明の核酸は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の配列を含む、第1のポリペプチドドメインと、抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む。
Description
【0001】
(関連出願)
本出願は、2000年2月9日に出願された米国特許出願番号(「USSN」)09/501,097号(これは1999年10月20日に出願されたUSSN09/421,608のCIPである)の一部継続(CIP)である。上述の出願はそれぞれ、それらの全体が、そして全ての目的のために、明白に本明細書中で参考として援用される。
【0002】
(連邦支援調査についての陳述)
本発明は、国立衛生研究所の助成金RO1 CA72631−01およびRFA CA−95−020のもと連邦政府の支援によってなされた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【0003】
(技術分野)
本発明は、一般的に、免疫学および医学に関する。本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)、Flt−3リガンド(FL)またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインおよび抗原性ポリペプチド(例えば、腫瘍関連抗原または病原体に由来する抗原)を含むキメラ分子を用いて、抗原特異的免疫応答(例えば、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答)を増強するための組成物および方法を提供する。従って、本発明の1つの実施形態は、DNAワクチンに関連する。
【0004】
(背景)
抗原特異的免疫治療は、新生物細胞に対して特異的な免疫を開発し得、一方、正常細胞を攻撃しないので、癌の制御のためのアプローチとして最近現れた。DNAワクチン接種は、抗原をコードするDNA(それ自身は抗原ではない)が被験体に注入される点で、伝統的なワクチン接種と異なる。抗原の産生(すなわち、ワクチンのDNAによってコードされた抗原の発現)は、ワクチン接種された個体の体内で起こる。しかし、従来のDNAワクチンは、制限を有する。例えば、ほとんどのDNAワクチンの主要な欠点は、それらの効力である。
【0005】
(要旨)
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列を含む第1のポリペプチドドメイン、および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。このキメラ核酸の融合タンパク質産物はまた、いくつかのドメインを有し得、任意の順序で、HSPドメインのカルボキシ末端フラグメント、FLドメイン、ETA dIIドメイン、またはGM−CSFドメインの任意の組合せを含む。他のドメインはまた、例えば、融合ポリペプチドを精製するかまたはインサイチュでポリペプチドを同定するなどの際の補助のために付加され得る。代替の実施形態において、第1のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第2のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して5’側にあり、そして第2のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第1のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して5’側にある。従って、このキメラ核酸の融合タンパク質産物は第1のポリペプチドドメインに対してアミノ末端かカルボキシ末端かのいずれかに、抗原性ポリペプチドを有し得;たとえキメラ核酸が2より多いドメインをコードしても、ドメインの任意の順序が受容され得る。
【0006】
1つの実施形態において、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメントは、シャペロン活性(例えば、ペプチドシャペロン活性)を有する。熱ショックタンパク質(HSP)(またはその核酸コード配列)は、例えば、ヒトまたは細菌のHSPを含む任意の生物に由来し得る。HSPは、Mycobacterium(例えば、Mycobacterium tuberculosis)に由来するHSP70のような熱ショックタンパク質70(HSP70)を含み得る。熱ショックタンパク質(HSP)は、配列番号9の残基312〜625によって示される配列、または配列番号9の残基約517〜残基約625によって示される配列、あるいはそれらの機能的等価物を含み得る。
【0007】
代替の実施形態において、Flt−3リガンドポリペプチド(またはその核酸をコードする配列)は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。Flt−3リガンドポリペプチドは、配列番号25の残基約1〜残基約189によって示される配列を含み得る。
【0008】
代替の実施形態において、細胞質トランスロケーションドメイン(またはその核酸コード配列)は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。細胞質トランスロケーションドメインは、毒素(例えば、細菌(例えば、Pseudomonas)由来の毒素(例えば、Pseudomonas外毒素A(ETA dII))に由来し得、例えば、ETA dIIは、配列番号3の残基約247〜残基約417によって示される配列を含む。Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインはまた、配列番号3の残基約253〜残基約364によって示される配列を含む。
【0009】
代替の実施形態において、GM−CSF配列(またはその核酸コード配列)は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。GM−CSF配列は、GM−CSFフラグメント(例えば、ジスルフィド架橋を含むフラグメント)であり得る。GM−CSFフラグメントはまた、配列番号1の残基約18〜残基約22、または残基約34〜残基約41、または残基約38〜残基約48、または残基約52〜残基約61、または残基約94〜残基約115、または残基約95〜残基約111で示されるような配列を含み得る。
【0010】
1つの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、MHCクラスI結合ペプチドエピトープを含む。MHCクラスI結合ペプチドエピトープは、長さが約8のアミノ酸残基と約11、または約15、または約25、または約50のアミノ酸残基との間であり得る。抗原性ポリペプチドは、任意の病原体または微生物に由来し得る。代替の実施形態において、抗原性ポリペプチドは、ヒトウイルス(例えば、ヒトパポバウイルス)のようなウイルスに由来し得る。パポバウイルスは、ヒトパピローマウイルス−16(HPV−16)のようなヒトパピローマウイルス(HPV)であり得る。抗原性ポリペプチドは、ヒトパピローマウイルスE6ポリペプチドまたはヒトパピローマウイルスE7ポリペプチドを含み得る。このウイルスはまた、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(例えば、HIV−1)のようなレンチウイルスであり得る。
【0011】
抗原性ポリペプチドが由来し得る他の病原体としては、ほんのいくつかを挙げると、マラリア、ウシウイルス性下痢症ウイルス、サイトメガロウイルス、脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスが挙げられる。
【0012】
抗原性ポリペプチドはまた、腫瘍特異的または腫瘍関連ポリペプチドであり得る。腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドは、腫瘍細胞の表面に発現される抗原を含み得る。腫瘍特異的または腫瘍関連ポリペプチドは、変異体p53、MAGE−1またはMAGE−3であり得る。
【0013】
1つの実施形態において、核酸は、細胞質のトランスロケーションポリペプチドドメインを含む第3のポリペプチドドメインをさらに含むキメラポリペプチドをコードする。従って、本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインまたは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列(あるいは任意のそれらの組合せ)を含む第1のポリペプチドドメイン、抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン、および細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインを含む第3のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。上記のように、これらのドメインは、任意の順序でキメラ核酸またポリペプチドに存在し得る。
【0014】
細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、任意の供給源(例えば、ヒトおよび細菌など)に由来し得る。細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、Pseudomonas外毒素A(ETA)の細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。Pseudomonas外毒素A(ETA)の細胞質トランスロケーションドメインは、配列番号3の残基約253〜残基約364によって示される配列を含み得る。細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、細菌毒素(例えば、Diptheria、Clostridium、Botulinum、Bacillus、Yersinia、Vibrio cholerae、またはBordetella pertussisに由来する毒素)のような病原体毒素の細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。第3のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第1または第2のドメインをコードする核酸に対して5’側に位置するか、第1または第2のドメインをコードする核酸の間に位置するか、または第1または第2のドメインをコードする核酸に対して3’側に位置する。
【0015】
核酸は、さらに、転写調節配列(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)あるいは翻訳調節配列のような調節核酸配列を含み得る。
【0016】
本発明は、本発明のキメラ核酸を含む発現カセット(例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス)を提供し、これは、例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインを含む第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む。発現カセットは、少なくとも1つのプロモーターおよび1つのコード配列を含む。プロモーターは、構成的、誘導的および組織特異的であり得る。発現カセットはまた、細胞質トランスロケーションドメインに対するコード配列を含み得る。発現カセットはまた、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター(例えば、自己複製RNAベクターSINrep5)のような自己複製RNAレプリコンを含み得る。
【0017】
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインを含む第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む形質転換された細胞を提供する。この核酸はまた、細胞質トランスロケーションドメインに対するコード配列を含み得る。
【0018】
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインを含む第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドを提供する。融合タンパク質は、マルチドメイン化され、本発明のキメラ核酸に対して類似であり得る。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。第1のポリペプチドドメインは、第2のポリペプチドドメインに、非共有結合的に結合し得る。あるいは、第1のポリペプチドドメインは、第2のポリペプチドドメインに共有結合的に結合し得、例えば、それは、組換えタンパク質であり得る。キメラポリペプチドが、マルチドメイン化される場合、結合/融合タンパク質スキームの任意の組合せが考案され得る。
【0019】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸(本発明のキメラ核酸)、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセット(例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス)、またはキメラポリペプチドを含む薬学的組成物を提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン;ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。
【0020】
薬学的組成物は、任意の処方物を含み得、例えば、それは、リン脂質によって処方され得、リポソームを形成し得る。この薬学的組成物は、例えば、経口または非経口投与あるいは銃式(ballistic)投与などに適し得る。この薬学的組成物は、任意の適切な投薬または形態(例えば、錠剤、液体、吸入剤、および注射/銃式のための粒子など)であり得る。
【0021】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチドを含むDNAワクチンを提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン;ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む。融合タンパク質また、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。
【0022】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸またはキメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む粒子を提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドを含む。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。この粒子は、粒子のボンバードメントに適切な任意の材料(例えば、金)を含み得る。
【0023】
本発明は、免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド(このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドドメインを含む第2のポリペプチドを含む)、あるいは核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含むDNAワクチンを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、有効量でのこの組成物の投与は免疫応答を誘発する。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。この方法は、優先的T細胞応答(例えば、優先的細胞傷害性T細胞応答)のような細胞性応答を含む免疫応答を誘発し得る。この方法において、キメラポリペプチドをコードする核酸またはベクターは、裸のDNA分子として投与され得る。本発明の核酸(例えば、裸のDNA)は、遺伝子銃または等価物によって投与され得る。あるいは、この方法において、この組成物はリポソーム処方物として投与され得る。組成物は、吸入剤などによって皮内投与され得る。
【0024】
本発明はまた、病原体による感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド(ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および病原体に由来する抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含む)、あるいは核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含むDNAワクチンを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、この組成物の投与は、その病原体に対する免疫応答を誘発する。
【0025】
本発明はまた、腫瘍抗原に対する哺乳動物のワクチン接種の方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド(ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および腫瘍抗原を含む第2のポリペプチドを含む)、あるいは、核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含む組成物の有効量を含むDNAワクチンを投与する工程を包含し、ここで、この組成物の投与は、その腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する。
【0026】
本発明はまた、抗原に対して哺乳動物をワクチン接種のための薬学的処方物を調製するための組成物の使用を提供し、ここで、この薬学的処方物は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、キメラポリペプチド、またはそれらの組合せを含み、ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;ならびに腫瘍抗原を含む第2のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【0027】
本発明の1以上の実施形態の詳細は、添付される図面および以下の記述に記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、この記述および図面から、そして特許請求の範囲から明白である。
【0028】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、全ての目的において、本明細書中に参考として説明的に援用される。
【0029】
(詳細な説明)
本発明は、キメラポリペプチドをコード新規キメラ核酸、インビボおよびインビトロの両方でこれらのポリペプチドを発現するための構築物、単離されたキメラポリペプチド、薬学的組成物、ならびにこれらの組成物を作製する方法および使用する方法を提供する。これらの組成物および方法は、選択された抗原の免疫原生性を刺激するかまたは増強するか、またはその免疫原に特異的な細胞性免疫応答を刺激するかもしくは増強するために特に有用である。本発明の核酸は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)配列を含む第1のポリペプチドドメイン、および抗原ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含む。
【0030】
本発明の1つの実施形態は、キメラ核酸によりコードされる標的抗原の免疫原性(例えば、DNAワクチン)が、熱ショックタンパク質(Mycobacterium tuberculosis熱ショックタンパク質 70(HSP70)(例えば、配列番号9を参照のこと)のカルボキシ末端タンパク質、またはFlt−3リガンド(例えば、配列番号25を参照のこと)または顆粒−マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)(配列番号1)または細胞質トランスロケーションドメイン(例えば、Pseudomonas ETA dII 配列番号3を参照のこと))をコードする第1のドメイン;ならびに抗原(例えば、病原体または腫瘍由来の抗原性ペプチド)をコードする第2のドメインを含むDNAのキメラ核酸中に存在することにより増強されるという発見に基づく。従って、本発明は、DNAワクチンの効力(従って、臨床効率)を有意に増強するワクチン接種の組成物および方法を提供する。
【0031】
1つの実施形態では、本発明のキメラ核酸は、熱ショックタンパク質(HSP)(例えば、HSP70)のカルボキシ末端ドメイン(CD)を含む第1のドメイン(第1ドメインDNAによりコードされる)および第2のドメイン(第2ドメインDNAによりコードされる)(例えば、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI制限抗原(例えば、MHCクラスI−結合ペプチドエピトープ))を含むキメラポリペプチドを含む免疫原性組成物をコードする。1つの実施形態では、タンパク質のカルボキシ末端フラグメントは、少なくとも10アミノ酸長であるポリペプチドまたはペプチドであり、そして天然に存在するタンパク質の半分のカルボキシ末端に由来する。例えば、HSP70のカルボキシ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列が配列番号9のおおよそ残基312〜約625にわたるHSP70の部分に由来するペプチドであり;このペプチドは、これらの残基のコード領域にわたるDNAによりコードされる。カルボキシ末端ドメイン(CD)フラグメントはまた、配列番号9の残基約517〜約625のアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【0032】
例えば、この免疫原性組成物は、配列番号9の残基517〜625のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAを含む第1のドメイン、および(必要に応じて連結される)MHCクラスI制限抗原をコードする第2のDNAを含む第2のドメインを含むキメラポリペプチドを含み得る。従って、本発明は、パピローマウイルスE7−HSP70−CD融合ポリペプチド、ならびに融合ポリペプチドをコードするキメラ核酸(DNA)を含み得る。必要に応じて、組成物は、HSP70のアミノ末端フラグメント由来の残基を含むポリペプチド(例えば、配列番号9の残基161〜370)をコードするDNAを含む。DNA成分(例えば、第1および第2(ならびに必要に応じて第3の)のDNA)が作動可能に連結される(すなわち、組換えタンパク質上のドメイン上にアレンジされる)順序は、免疫原性に影響することなく変更され得る。例えば、HSPをコードする(またはFlt−3リガンドをコードするか、もしくは細胞質トランスロケーションドメインをコードする)DNA配列は、抗原をコードする配列に対して5’または3’に配置される。1つの実施形態では、抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)が、HSP由来残基、Flt−3リガンド由来残基または細胞質トランスロケーションドメイン由来残基に対してアミノ末端に配置される、DNA構築物が、組み合えポリペプチドをコードするように、これらのポリペプチドをコードする核酸ドメインは、インフレームである(すなわち、DNAは、作動可能に連結される)。
【0033】
以下で議論されるように、抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)は、病原体(例えば、ウイルス)、癌組織(例えば、腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチド)に由来し得る。本発明のDNAワクチンは、発現カセット(例えば、HSPまたはFlt−3リガンドまたは細胞質移動ドメインのカルボキシ末端フラグメントをコードする第1のDNAならびに(必要に応じて連結される)抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)をコードする第2のDNAを含む発現ベクターまたはプラスミドベクター)を含み得る。本発明の治療法は、本明細書中に記載される免疫原性組成物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物において抗原に対する細胞毒性T細胞応答を誘導する方法を含む。
【0034】
代替的な実施形態では、本発明のキメラ核酸または免疫原性組成物は、以下の成分を含む:(a)専門的な抗原提示細胞(APC)に結合するポリペプチド、または、HSPのカルボキシ末端フラグメント、Fit−3リガンドもしくはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)をコードする配列を含む第1のDNA;(b)細胞質トランスロケーターポリペプチド(例えば、ETA dIIを含む)を含む第2のDNA、および(c)抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)をコードする配列を含む第3のDNA。第1、第2および第3のDNAは、作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」は、1つのポリペプチドをコードするDNA配列が別のポリペプチドをコードする別のDNAにインフレームで結合されて、組換えキメラ(すなわち、「融合」)タンパク質を生成することを意味する。作動可能に連結されたDNAメッセージの翻訳は、キメラポリペプチドまたは融合遺伝子産物を生じる。本発明は、キメラ核酸およびキメラポリペプチドを含み、ここで全ての可能な組み合わせで連結される(すなわち、第1、第2および第3のDNAが作動可能に連結される順序は、無関係である)。
【0035】
構築物(例えば、発現カセット、ベクターなど)はまた、調節配列(例えば、転写調節配列または翻訳調節配列)を含み得る。ポリペプチドをコードする配列および調節配列は、適切な分子(例えば、転写アクチベータータンパク質)が、調節配列に結合する場合に、遺伝子発現を可能にする方法で接続される。
【0036】
1つの実施形態において、免疫原性組成物の第1の核酸ドメインは、HSP(例えば、Mycobacterium tuberculosis熱ショックタンパク質70(HSP70)(配列番号9))のフラグメントをコードする。所定のタンパク質の「フラグメント」は、参照ポリペプチドより短い長さのポリペプチドである。例えば、このポリペプチドは、少なくとも9または10アミノ酸長であるが、成熟参照タンパク質またはポリペプチドの総残基数よりも少ない。例えば、M.tuberculosis HSP70のフラグメントは、70kDa未満の分子量である。HSP70のフラグメントは、天然に存在するHSP70のアミノ酸配列に少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する。HSP70フラグメントの長さは、625アミノ酸未満である。このフラグメントは、参照タンパク質の生物学的活性を有し得る。例えば、1つの実施形態において、このフラグメントは、プロフェッショナルな抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞(DC))に結合し得るか、またはこのフラグメントは、細胞質内へのこのキメラポリペプチド(この免疫原性組成物のDNAによってコードされる)のトランスロケーションを媒介し得る。いくつかの実施形態において、この第1のDNAまたは第2のDNA(あるいは、両方)は、熱ショックタンパク質またはETA(dII)(例えば、配列番号3)のフラグメントをコードする。
【0037】
(この免疫原性組成物の)DNAの第2のドメイン(または、細胞質トランスロケーションドメインもまた存在する場合には、第3のドメイン)は、MHCクラスI拘束抗原のような、抗原エピトープをコードし得る。1つの実施形態において、抗原は、ヒトパポバウイルス(例えば、子宮頸癌関連ヒトパピローマウイルス(HPV))のようなウイルスに由来する。このウイルス抗原は、HPV−16由来のE6抗原またはE7抗原の全部または一部であり得る。本発明のキメラ核酸によって発現され得る他のウイルス抗原としては、ウシウイルス下痢症ウイルスのE2抗原;サイトメガロウイルスのppUL83またはpp89;脳炎ウイルスSLEのprM/E;B型肝炎ウイルスのHBV表面抗原またはHBVコア抗原;HIV−1抗原(例えば、gp160);ICP27、gD2、糖タンパク質B、または単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Bが挙げられる。あるいは、抗原は、変異体p53;黒色腫細胞に関連するMAGE−1またはMAGE−3のような、癌(例えば、腫瘍関連)抗原(例えば、腫瘍細胞の表面上に発現される癌関連抗原)であり得る。他の抗原としては、マラリアペプチド(NANP)40、HIV−1 p24、またはインフルエンザ核タンパク質が挙げられる。
【0038】
キメラポリペプチドの第1のドメインをコードするDNAは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、またはそのフラグメントを含み得る。1つの実施形態において、そのコードされるタンパク質は、ジスルフィド架橋(例えば、配列番号1のCys51とCys93に架かるジスルフィド架橋)を含む、機能的GM−CSFフラグメントである。GM−CSFの他の生物学的に活性なフラグメントは、配列番号1の残基18〜22、34〜41、38〜48、52〜61、94〜115、95〜111を含むポリペプチドである。
【0039】
あるいは、第1のポリペプチドドメインをコードするDNAは、Flt3リガンド(FL)(例えば、配列番号25を参照のこと)、CTLA−4、4−1BB、CD40リガンド、またはTNFレセプター配列(またはそのAPC結合フラグメント)、あるいはAPC結合ポリペプチド配列を含み得る。
【0040】
第2のポリペプチドドメインをコードするDNAは、Psudomonas内毒素A(ETA)のトランスロケーションドメイン配列(例えば、ETAのドメインII(dII)(例えば、配列番号3のおよそ253〜およそ364にわたる残基))のような、トランスロケーションドメイン配列をコードし得る。トランスロケーションドメインは、それが連結するタンパク質またはポリペプチドの、細胞のサイトゾルへのトランスロケーションを誘導するポリペプチドである。例えば、第2のDNAは、Diptheria、Clostridium(Botulinum(例えば、破傷風))、Bacillus anthracis(炭疽)、Yersinia、Vibrio cholerae(コレラ)またはBordetella pertussis毒素由来のペプチドをコードし得る。本発明は、特定の機構によって限定されないが、免疫原性組成物のトランスロケーションドメインをコードするDNAの存在は、エンドソーム/リソソーム画分からサイトゾルへの抗原のトランスロケーションを介して、その組成物によってコードされる抗原のMHCクラスI提示を増強する。好ましくは、毒素をコードする遺伝子の毒素ドメインは、変異または欠失されている。
【0041】
免疫原性組成物は、上記の第1、第2および第3のDNAを必ずしも含む必要はない。代替的実施形態において、第3のドメイン(免疫が所望される標的抗原)をコードするDNAは、HSP(例えば、配列番号9を参照のこと)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(例えば、配列番号25を参照のこと)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン(配列番号3を参照のこと)、またはAPC結合ポリペプチド(トランスロケーターポリペプチドをコードするDNAの非存在下にある)をコードするDNAに作動可能に連結され;別の実施形態において、キメラ核酸は、トランスロケーター(例えば、細胞質トランスロケーター)ポリペプチドをコードするDNAをさらにコードする。例えば、本発明のキメラ核酸は、E7−ETA、E7−HSP70、E7−GM−CSFまたはE7−FL(すなわち、E7−Flt−3リガンド)を含む融合ポリペプチドをコードし得る。本発明の免疫原性組成物は、免疫が要求される抗原をコードするDNAに作動可能に連結された、配列番号25(Flt−3リガンド)のおよそ1〜およそ189の残基をコードするDNAを含み得る。
【0042】
本発明のキメラ核酸はまた、E7−HSP70融合ポリペプチド、GM−ETA(dII)−E7融合ポリペプチド、またはETA(dII)−E7(すなわち、GM成分を含まない)を含む、免疫原性組成物をコードし得る。
【0043】
本発明はまた、DNAワクチンを提供する。DNAワクチン組成物は、(a)熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、あるいはプロフェッショナル抗原提示細胞に結合するポリペプチドをコードする、第1のDNA、および(b)抗原(例えば、MHCクラスI拘束抗原)をコードする、第2のDNAを含む、プラスミドまたは他の発現ベクターを含み得る。このワクチンは、細胞質トランスロケーターポリペプチドをコードするDNAを含む、第3のドメインを含み得る。これらのポリペプチドドメインコード配列(DNA)は、その第1、第2、そして適切な場合には、第3のDNAが、「インフレーム」(作動可能に連結される)になる様式で、発現(例えば、プラスミド)ベクターにクローニングされる。この発現(プラスミド)ベクターが取り込まれた細胞において転写および翻訳される場合、このベクターは、上記のドメイン(例えば、APC結合部分、細胞質トランスロケーター部分、およびクラスI拘束抗原エピトープ)を含む、キメラポリペプチドの産生を指向する。
【0044】
代替的な実施形態において、本発明のキメラ核酸(DNA)(ポリヌクレオチド)、発現カセットおよびポリペプチドは、単離されている。「単離されている」によって、例えば、目的の遺伝子配列にその生物の天然に存在するゲノム中で隣接する遺伝子を含まない、核酸分子を意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター;自律複製プラスミドまたはウイルス;あるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるcDNAあるいはゲノムまたはcDNAフラグメント)として存在する、組換えDNAが含まれる。この用語には、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAもまた含まれる。この用語は、天然に存在するゲノム中で天然においてそれに隣接する1以上の他の遺伝子によって隣接されている所定のDNA配列を含む、ゲノムDNAの大きいセグメント(例えば、コスミドクローンに存在するセグメント)を排除する。本明細書中の「単離された」の定義もまた参照のこと。
【0045】
核酸分子(またはポリヌクレオチド)は、RNAおよびDNA(cDNA、ゲノムDNA、合成(例えば、化学的に合成された)DNAを含む)の両方を含む。一本鎖の場合、この核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。従って、この用語には、例えば、ベクター、自律複製プラスミドまたはウイルス、あるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAのその天然の部位以外の部位に組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるcDNAあるいはゲノムまたはcDNAフラグメント)として存在する、組換えDNAが含まれる。この用語には、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAもまた含まれる。
【0046】
所定の参照配列(例えば、Mycobacterium tuberculosis HSP70(配列番号9)のカルボキシ末端部分、Flt−3リガンド(配列番号25)、GM−CSF(配列番号1)、Pseudomonas ETA dII(配列番号3)の細胞質トランスロケーションドメイン)のヌクレオチド配列を有する鎖、あるいは生物学的に等価な活性を有するに十分高い配列同一性を有するか、または参照配列を有するDNAの鎖またはその相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズする鎖を含む、免疫原性組成物(例えば、キメラポリペプチドまたは「融合タンパク質」)をコードするキメラ核酸(DNA)(本発明の発現カセット、ベクター、DNAワクチンにおけるコード配列を含む)は、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の範囲内の核酸は、参照配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ特定の生物学的活性(例えば、Pseudomonas ETA dIIの細胞質トランスロケーションドメイン)を有するポリペプチドをコードするDNAを含む。さらなる例としては、以下が挙げられる:その免疫原性組成物の第1のドメインをコードする第1のDNAによってコードされるポリペプチドの生物学的活性は、APCに結合し得、第2のDNAによってコードされるペプチドの生物学的活性は、細胞質トランスロケーションドメインであり得、そして第3のDNAによってコードされるペプチドの生物学的活性は、MHCクラスI分子に結合し得る。このDNAは、参照配列に対して、少なくとも約75%の同一性、約85%の同一性、約90%の同一性、約95%の同一性、または約99%の同一性、または100%の同一性を有し得る。
【0047】
配列同一性を計算するために、ヌクレオチドおよびアミノ酸の比較を、Lasergeneソフトウェアパッケージ(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)を使用して行う。使用したMegAlignモジュールは、Clustal V方法(Higginsら、1989、CABIOS5(2):151−153)であった。使用したパラメーターは、ギャップペナルティー10、ギャップ長ペナルティー10であった。
【0048】
あるいは、参照配列(上記)を有するDNAの鎖またはその相補体に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ特定の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする免疫原性組成物をコードするキメラ核酸(DNA)が、本発明の範囲内にある。ハイブリダイゼーションは、標準的な条件(例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1989)に記載のような技術)を使用して行う。「高いストリンジェンシー」とは、高温かつ低塩濃度によって特徴付けられる核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(すなわち、約0.1×SSCの塩濃度、65℃での洗浄条件)をいう。「低い」または「中程度の」ストリンジェンシーとは、低温かつ高塩濃度によって特徴付けられるDNAハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(すなわち、少なくとも1.0×SSCの塩濃度、60℃未満での洗浄条件)をいう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、約42℃かつ約50%ホルムアミドでのハイブリダイゼーション;約65℃、約2×SSCかつ1% SDSでの1回目の洗浄;その後の、約65℃かつ約0.1%×SSCでの2回目の洗浄、を含み得る。参照遺伝子または参照配列に約50%の配列同一性を有するDNA配列を検出するために適切な低いストリンジェンシー条件は、ホルムアミド非存在下での約42℃でのハイブリダイゼーション;約42℃、約6×SSCかつ約1% SDSでの1回目の洗浄;および約50℃、約6%×SSCかつ約1% SDSでの2回目の洗浄、によって検出する。
【0049】
本発明は、哺乳動物において抗原に対する細胞傷害性T細胞応答を誘導する方法を包含し、この方法は、この哺乳動物に、上記の免疫原性組成物をコードするキメラ核酸、またはキメラポリペプチドを投与することによる。1つの実施形態において、この組成物は、裸のDNAとして投与される。この組成物(例えば、DNA、ポリペプチド、ベクターなど)はまた、標的細胞によるDNAまたはポリペプチドの取り込みを増強する薬剤の存在下(例えば、リン脂質処方物(例えば、リポソーム))で投与され得る。
【0050】
この方法は、病原体による感染に対して哺乳動物をワクチン接種するために有用である。1つの実施形態において、本発明のキメラポリペプチド(およびそれらをコードするキメラ核酸)は、この病原体(例えば、ウイルスまたは細菌)由来の抗原を含む。この方法はまた、哺乳動物における癌の発生の予防または既存の癌の処置に有用である。特定の型の癌を発症する危険性がある哺乳動物は、公知の方法(例えば、遺伝子スクリーニング)を使用して同定される。癌を発症する危険性があるかまたは癌を罹患している個体は、その(例えば、第3の)DNAドメインの抗原ドメインが癌(腫瘍)関連抗原(例えば、子宮頸癌に関連するHPV E7)をコードする組成物を投与することによって、処置される(その状態が、「改善される」)。
【0051】
本発明はまた、哺乳動物に直接導入された場合に、その哺乳動物内でのコードされたポリペプチドの発現、および次いで、そのコードされたポリペプチドに特異的なCD8+免疫応答をインビボで誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、生きた脊椎動物細胞に導入された際に、この細胞が、このポリヌクレオチドによってコードされた翻訳産物を産生し得るような、必須の調節エレメント(例えば、転写または翻訳調節エレメント(例えば、プロモーター))を含む核酸であり得る。例えば、このポリヌクレオチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、あるいはそれらの組み合わせまたはフラグメントをコードする、ポリデオキシリボ核酸(DNA)であり得る。
【0052】
それに対する免疫応答が所望される抗原性ポリペプチドをコードするキメラ核酸(DNA)は、転写プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの場合において、このポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、その動物には通常には存在せず;これは、病理学的状態にある動物においてのみ存在する(例えば、ウイルスに関連する異種タンパク質)。他の場合、この抗原は、疾患状態または他の状態において誤調節されている自己ポリペプチド(例えば、腫瘍関連抗原)であり得る。キメラ核酸(例えば、DNAワクチン)によってコードされるこのポリペプチドは、インビボで合成され(すなわち、その動物自身の組織によって産生され);その発現されたキメラタンパク質は、その細胞によってプロセシングされ、そしてMHC分子(例えば、クラスI MHCポリペプチド)によって発現され得る。
【0053】
抗原含有ポリヌクレオチドをコードするキメラ核酸は、インビボ投与のための適切な構築物(例えば、ポリヌクレオチドワクチンに特別に最適化された発現ベクター)に連結され得る。このキメラポリペプチドコード配列は、調節エレメント(例えば、転写プロモーター、エンハンサー)、免疫原性エピトープ、および免疫増強遺伝子または免疫調節遺伝子(これらは、それら自身の調節エレメント(例えば、プロモーター、転写ターミネーター)を有し得る)をコードするさらなるコード配列(例えば、シストロン)に作動可能に連結され;この構築物はまた、細菌の複製起点および/または抗生物質耐性遺伝子を含み得る。このベクターはまた、ポリシストロニックのmRNAの発現のための内部リボソーム侵入部位(IRES)を含み得る。転写ターミネーターには、T7またはSP6プロモーターのような強力なRNAポリメラーゼプロモーターが含まれる。
【0054】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよびDNAワクチンは、コードされる抗原に対する保護免疫を誘発する。例えば、抗原E7をコードするDNA発現ベクターの注入は、腫瘍細胞の死または腫瘍細胞増殖の減少を生じる。腫瘍細胞に対する抗原特異的CTLは、ワクチン接種後に生成される。
【0055】
多くの利点は、本発明のキメラ核酸および発現系のインビボ投与ワクチン接種ストラテジーに関連する。多くの公知のDNAワクチンの欠点は、その限定された効力である。標準的なDNAワクチンとは対照的に、本発明のキメラ核酸(ポリヌクレオチド)およびワクチン接種方法は、強力な抗原特異的免疫療法を生じる。本発明のポリヌクレオチドおよびDNAワクチンは、従来のDNAワクチン(例えば、本発明のキメラ核酸(例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列(あるいは、APC結合ドメインまたは細胞質トランスロケーションドメイン))を含む、第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む、第2のポリペプチドドメイン、を含むキメラポリペプチドをコードする配列)を含まない配列)よりも、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍または少なくとも約40倍の、細胞性免疫応答(例えば、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答)を誘導し得る。
【0056】
ワクチンの効力は、本明細書中に記載のように、当該分野で公知の方法によって(例えば、ワクチン接種後に誘導されたCD8+T細胞前駆体を測定することによって、またはワクチン接種後の病原体(例えば、ウイルス)または腫瘍負荷の減少を測定することによって)決定され得る。本発明は、いかなる特定の作用機構によって限定されないが、DNAワクチンにコードされるポリペプチドは、MHCクラスI経路に入りそして細胞傷害性T細胞応答を惹起する能力を、有し得る。1つの実施形態において、詳細には、本発明のキメラ核酸(例えば、DNAワクチン)は、細胞質トランスロケーションポリペプチドドメイン(「細胞質トランスロケータードメイン」)をコードすることによって、免疫原を、MHCクラスI抗原プロセシング経路に指向するよう設計される。結果として、細胞性T細胞応答の誘発が、最適化される。
【0057】
DNAワクチンの他の利点としては、安全性および大規模生産の簡素化が挙げられる。本発明のワクチンは、家庭用動物または畜産動物、ならびにヒトへの投与に有用である。例えば、裸のプラスミドDNAは、安全であり、低い免疫原性を有し、そして繰り返し投与され得る。DNAワクチンは、高純度で大規模で容易に調製され、そしてタンパク質および他の生物学的ポリマーよりも高度に安定である。例えば、米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,910,488号を参照のこと。
【0058】
ワクチンレシピエントに導入される発現可能なDNAまたは転写されるRNAの量は、使用される転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強度に依存して変化し得る。さらに、免疫応答の大きさは、タンパク質発現のレベルおよび発現される遺伝子産物の免疫原性に依存し得る。一般的に、約1ng〜5mgの間、100ng〜2.5mgの間、または約1μg〜約750μgの間、または約10μg〜約300μgの間の範囲の有効用量であるDNAが、体の組織(例えば、筋肉組織または皮膚組織)に直接投与される。静脈内投与(IV)のための1投薬量のDNAは、約106〜1022コピーのDNA分子である。皮下注射(SC)、皮内導入、皮膚を通じた圧痕、および他の投与様式(例えば、腹腔内送達、静脈内送達、または吸入送達)がまた、適している。例えば、DNAは、例えば、「遺伝子銃」を用いて「バイオリスティック(biolistic)」によって投与され得る。ブースター予防接種が、同様の様式で投与され得る。例えば、米国特許第6,004,287号;同第5,753,477号;同第5,179,022号を参照のこと。
【0059】
DNAワクチンはまた、公知の方法(例えば、Panら、1995、Cancer Res.55(21):4776−4779およびPanら、1995、Nature Med.1(5):471−7に記載される方法)を用いてListeria monocytogenesワクチンの一部として送達されるために処方され得る。ポリヌクレオチド免疫原を用いた予防接種後、免疫応答はまた、対応するポリペプチド免疫原を投与することによってブーストされ得る。
【0060】
キメラ核酸、ベクターまたは他のポリヌクレオチドは、裸であり得、すなわち、レシピエントの免疫系に影響を与えるいずれかのタンパク質、アジュバント、または他の因子と結合していない。裸のDNAは、生理学的受容可能な溶液(例えば、滅菌生理食塩水、または滅菌緩衝化生理食塩水)中で投与される。
【0061】
あるいは、DNAは、リポソームと(例えば、レクチンリポソームまたはDNA−リポソーム混合物として)結合され得る。カルシウムイオンのようなDNAの細胞取り込みを補助する因子(すなわち、トランスフェクション促進因子)がまた、使用され得る。ポリヌクレオチドでコートされた微粒子(例えば、金の粒子)がまた、ワクチンを投与する手段として有用である。小粒子リポソームまたは脂質複合体エーロゾル化合物がまた、使用されて、本発明の核酸を送達し得る(例えば、米国特許第6,090,407号を参照のこと)。
【0062】
(免疫原性組成物の機能的成分):本発明のキメラ核酸は、2または3またはそれより多くの機能ドメインを有するキメラ遺伝子産物を産生するために発現され得る、連続的な核酸配列を含む:第1のポリペプチドドメインは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、またはAPC結合ドメインを含み;そして第2のポリペプチドドメインは、抗原性ポリペプチド(例えば、MHCクラスI制限エピトープ)を含む。キメラ核酸はさらに、細胞質トランスロケーションドメインをコードする配列を含み得る。このコードされる遺伝子産物は、強力な免疫応答(特に、細胞傷害性T細胞応答)を生成する。この応答は、キメラ遺伝子産物を投与するよりも強力であり、そして熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、またはAPC結合部分を伴わない、抗原(例えば、MHCクラスI制限エピトープ)をコードするDNAワクチン;あるいは、1つの実施において、細胞質トランスロケーション部分を投与するよりも、強力である。
【0063】
(抗原特異的免疫応答の増強を与えるHSP70のドメイン):Mycobacterium tuberculosis HSP70のドメイン構造が、以下の実施例5に詳細に記載されるように決定された。少なくとも3つの機能ドメインが、同定された:ATPaseドメイン(配列番号9の残基1〜356を含む)、基質結合ドメイン(SD;配列番号の9残基357〜516を含む)、およびカルボキシ末端ドメイン(CD;配列番号9の残基517〜625を含む)(図16)。このHSP70の各ドメインの裸のDNAワクチンの能力に対する寄与が決定された。各ドメインをコードするDNAは、パピローマウイルス抗原E7をコードするDNAにインフレーム(すなわち、作動可能に)連結される。E7特異的CD8 T細胞免疫応答が、測定された。
【0064】
この結果は、DNAワクチン構築物に組み込まれた場合に、HSP70の細胞質ドメイン(CD)をコードするDNAが、ワクチンによってコードされる標的抗原に対する免疫を生成する際の、このDNAワクチンの能力を増加することを示す。さらに、この細胞質ドメインが、全長HSP70を含むDNA構築物における抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答の増強の大部分の原因である。
【0065】
(定義)
他に示されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に使用される場合、以下の用語は、他に具体化されない限り、それらに与えられた意味を有する。
【0066】
用語「抗原」または「免疫原」は、本明細書中に使用される場合、適切な量(「免疫学的有効量」)(すなわちこれは、細胞性および/または体液性免疫応答を誘発、増加、またはブーストし得る(これはまた、例えば、抑制誘導の場合には、免疫抑制であり得る))で、単独または別の物質と組合わせてか、もしくは結合させてか、もしくは融合されてか(これらは、一度にかまたは数回の間隔にわたって投与され得る)のいずれかで投与される(または核酸(例えば、DNAワクチン)を投与することによってインビボ発現される)場合に、「抗原性」または「免疫原性」である、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、化合物または組成物をいう。
【0067】
用語「発現カセット」は、本明細書中に使用される場合、ヌクレオチド配列と適合性である宿主中で、構造遺伝子の発現に影響を与え得るヌクレオチド配列(すなわち、タンパク質コード配列)をいう。発現カセットは、ポリペプチドコード配列と;および必要に応じて、他の配列(例えば、転写終了シグナル)と作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーター含む。発現をもたらす際に必要であるかまたは有用であるさらなる因子(例えば、エンハンサー)がまた、使用され得る。「作動可能に連結された」は、本明細書中に使用される場合、プロモーターがDNA配列の転写を媒介するような、このDNA配列から上流のプロモーターの連結をいう。従って、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のDNA」ベクターなどを含む。「ベクター」は、細胞を感染、トランスフェクト、一過性もしくは永久的に形質転換し得る核酸を含む。ベクターが裸の核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であり得ることが、認識される。このベクターは、必要に応じて、ウイルスまたは細菌の、核酸および/またはタンパク質、および/または膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど)を含む。ベクターは、DNAのフラグメントが結合され得、そして複製されるようになるレプリコン(例えば、RNAレプリコン(以下の実施例6を参照のこと)、バクテリオファージ)を含むが、これに限定されない。従って、ベクターは、RNA、自律性自己複製環状DNAもしくはRNA、または自律性自己複製線状DNAもしくはRNA(例えば、プラスミド、ウイルスなど(例えば、米国特許第5,217,879号を参照のこと))を含むが、これらに限定されず、そして発現プラスミドおよび非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主になると記載される場合、これらには、染色体外の環状DNAおよび線状DNAならびに宿主染色体に組込まれているDNAの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、このベクターは、有糸分裂の間に自律構造として細胞によって安定に複製され得るか、または宿主ゲノム中に組込まれるかのいずれかであり得る。
【0068】
用語「連結された」または「化学的に連結された」は、例えば、本発明の1つの実施形態におけるような(ここで、ERシャペロンポリペプチドは、抗原性ペプチドに化学的に連結される)2つの部分の任意の化学結合をいう。このような化学結合は、組換え産生された融合タンパク質またはインビボ産生された融合タンパク質のペプチド結合を含む。
【0069】
用語「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第2のポリペプチドまたはペプチドドメインと結合した、少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチドドメインを含む組成物をいう。例えば、1つの実施形態において、本発明は、融合タンパク質(キメラポリペプチド)をコードする単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供し、この融合タンパク質は、少なくとも2つのドメインを含み、第1のポリペプチドドメインは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列を含み、そして第2のポリペプチドドメインは、抗原性ポリペプチドを含む。さらなるドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖などを含み得る。「融合」は、ペプチド結合、化学連結、荷電相互作用(例えば、静電気的な誘引、例えば塩の架橋、H−結合など)などによって生成される結合であり得る。ポリペプチドが組換えである場合、「融合タンパク質」は、共通のメッセージから翻訳され得る。あるいは、このドメインの組成物は、任意の化学手段または静電気的な手段によって連結され得る。本発明のキメラ分子はまた、さらなる配列、例えば、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含み得る。あるいは、ペプチドは、簡単にキャリアへ連結されて、キメラポリペプチドの操作または同定/配置を容易にし得る。
【0070】
用語「抗原性」または「免疫原性」または「免疫原性組成物」は、単独でかまたは別の物質と組合せもしくは連結もしくは融合されてかのいずれかで、「免疫原性」である(すなわち、細胞性および/または体液性免疫応答を、誘発、増加、またはブーストし得る)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、化合物または組成物をいう。免疫原性組成物は、少なくとも約5アミノ酸、10アミノ酸長のペプチド、15アミノ酸長のフラグメント、20アミノ酸長またはこれより長いフラグメントのペプチドであり得る。免疫原は、「キャリア」ポリペプチドおよびハプテン(例えば、別の組成物に融合または連結(化学的かまたは別の方法で)された、融合タンパク質またはキャリアポリペプチド)を含み得る。免疫原は、免疫化ベクターに組換え発現され得、これは、プロモーターに作動可能に連結された免疫原のコード配列を含む単純な裸のDNA(例えば、単純な発現カセット)であり得る。免疫原は、抗体または(MHC分子のペプチド結合部位に結合する場合)Tリンパ球レセプター(TCR)が結合する、抗原決定基もしくはエピトープを含み;これらのエピトープは、代表的に3〜10アミノ酸長である。
【0071】
本明細書中に使用される場合、用語「単離された」は、分子または組成物(例えば、本発明のキメラ核酸またはポリペプチド)をいう場合、この分子または組成物が、少なくとも1つの他の化合物(例えば、タンパク質)、他の核酸(例えば、RNA)、または他の夾雑物(これは、インビボまたはその天然に存在する状態において、この分子または組成物が結合されている)から分離されることを意味する。従って、組成物は、この組成物がインビトロまたはインビボで組換え産生されたことに起因して、この組成物が「天然に」結合されているかまたは結合されている任意の他の成分(例えば、細胞抽出液の場合、細胞膜)から単離されている場合、単離されているとみなされる。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質状態であり得、そして乾燥もしくは水溶液中であり得る。純度および均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)または高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)のような分析的な化学手段を用いて決定され得る。従って、本発明の単離された組成物は、そのインサイチュ環境と通常関連する物質を含まない。たとえタンパク質が均質性のバンドまたは優性なバンドに単離されている場合でも、所望の組成物と共に同時精製される微量の夾雑物が存在し得る。
【0072】
HPV−16 E7ポリペプチドを含む、句「HPVポリペプチド」は、当該分野で周知のポリペプチドを記載する;例えば、HPV−16 E7に関して、例えば、GenBank登録番号AF125673(1999年6月1日)は、完全HPV−16ゲノムおよびHPV−16 E7タンパク質を記載することを参照のこと。
【0073】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、改変体が誘導されたポリペプチドに実質的に対応する構造および活性を有する「アナログ」または「保存的改変体」および「模倣物」または「ペプチド模倣物」もまた含む、本発明の組成物を含み、これには、例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列が挙げられる。
【0074】
用語「薬学的組成物」は、被験体における薬学的使用に適した組成物(例えば、ワクチン)をいう。本発明の薬学的組成物は、例えば、本発明の核酸、またはベクター、または細胞を含む薬理学的有効量の組成物ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む処方物である。
【0075】
用語「プロモーター」は、核酸の転写を指向する核酸制御配列の配列である。本明細書中に使用される場合、プロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列(例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメント)を含む。プロモーターまたは、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対ほどに配置され得る遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および成長状態下で活性である。「誘導可能な」プロモーターは、環境の調節または成長の調節下で活性である。「組織特異的」プロモーターは、ある生物の特定の組織型で活性であるが、同じ生物由来の他の組織型では活性でない。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列(例えば、プロモーター、転写因子結合部位の配列)と第2の核酸配列との間の機能的連結をいい、ここで、この発現制御配列は、第2の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【0076】
用語「組換え」は、合成されたかもしくは他の方法でインビトロで操作されたポリヌクレオチド(例えば、「組換えポリヌクレオチド」)、細胞もしくは他の生物系において遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド(「組換えタンパク質」)をいう。例えば、組換え核酸または組換えポリペプチドは、本明細書中に記載される場合、本発明の方法を実施するために使用され得る。「組換え手段」はまた、種々のコード領域もしくはコードドメインまたは異なる供給源からのプロモーター配列を有する核酸の、本発明の実施に使用されるベクターにおけるポリペプチドコード配列の発現(例えば、誘導可能な発現または構成的発現)のための発現カセットまたは発現ベクターへの連結を含む。
【0077】
用語「自己複製RNAレプリコン」は、異種RNAおよび異種タンパク質の発現を可能にするために操作されたRNAウイルス(例えば、αウイルスゲノムRNA(例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスなど))に基づく構築物をいう。これらの組換えベクターは、自己複製し(すなわち、これらは「レプリコン」である)、そして以下により詳細に記載されるように裸のRNAまたは裸のDNAとして細胞に導入され得る。1つの実施形態において、自己複製RNAレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター SINrep5(これは、米国特許第5,217,879号に詳細に記載される)を含む。
【0078】
用語「全身投与」は、組成物または薬物(例えば、本発明のDNAワクチンまたは本明細書中に記載されるキメラ核酸およびポリペプチド)の循環系への導入をもたらすような様式での、組成物または薬物の投与をいう。用語「局所投与」は、特定の解剖学的空間(例えば、腹腔内、髄腔内、硬膜下または特定の器官へのなど)への組成物または薬物の投与をいう。例えば、局所投与としては、肝臓への局所投与のための、組成物または薬物の肝臓動脈への投与が挙げられる。用語「局部投与」は、限定されるかまたは限局性の、解剖学的空間(例えば、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋内注射など)への組成物または薬物の投与をいう。当業者は、局部投与または局所投与がまた、循環系への組成物または化合物の侵入を引き起こし得ることを理解する。
【0079】
(核酸の作製および操作)
本発明の方法は、本明細書中に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸の投与を提供する。組換え融合タンパク質は、インビトロまたはインビボで合成され得る。これらの組成物をコードする核酸は、「裸のDNA」の形態であり得るか、またはこれらは、インビボまたはエキソビボ投与のために、プラスミド、ベクター、組換えウイルス(例えば、「レプリコン」)などに組み込まれ得る。本発明の核酸およびベクターは、インビトロまたはインビボで作製および発現され得、これらの遺伝子およびベクターを作製および発現する多様な手段が、使用され得る。当業者は、所望の遺伝子活性が、本発明を実施するために使用されるベクター内で遺伝子および核酸(例えば、プロモーター)の発現または活性を調節することによって得ることができることを、認識する。遺伝子の発現もしくは活性を増加または減少するために記載される公知の方法、またはこの遺伝子の組織特異性に関して記載される公知の方法のいずれかが、本発明のために使用され得る。本発明は、科学文献および特許文献に十分に記載される当該分野で公知の任意の方法またはプロトコールと組合わせて実施され得る。
【0080】
(一般的な技術)
本発明を実施するために使用され得る核酸配列(RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、組換えウイルス、またはこれらのハイブリッドに関わらず)が、種々の供給源から単離され、遺伝子操作され、増幅され、そして/または組換え発現され得る。任意の組換え発現系が使用され得、これには、細菌細胞に加えて、例えば、哺乳動物細胞発現系、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系、または植物細胞発現系が挙げられる。あるいは、これらの核酸は、例えば、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−418;Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440−3444;Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373−380;Blommers(1994)Biochemistry 33:7886−7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;米国特許第4,458,066号に記載されるような、インビトロで周知の化学合成技術によって合成され得る。次いで、二本鎖DNAフラグメントが、相補鎖を合成し、適切な条件下でこれらの鎖を一緒にアニーリングすることによってか、または適切なプライマー配列を用いてDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってかのいずれかで、得ることができる。
【0081】
核酸の操作のための技術(例えば、配列中に変異を発生させる技術、サブクローニングする技術、プローブを標識する技術、スクリーニングする技術、ハイブリダイゼーションする技術など)は、科学文献および特許文献に十分に記載されている(例えば、Sambrook編,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(第2版),第1〜3巻,Cold Spring Harbor Laboratory(1989);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel編,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1997);LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen編.Elsevier,N.Y.(1993)を参照のこと)。
【0082】
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチドなどは、当該分野で周知の任意の数の一般的な手段によって分析および定量され得る。これらの方法には、例えば、生化学的分析方法(NMR、分光測定、X線撮影、電気泳動、キャリラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、およびハイパーディフュージョン(hyperdiffusion)クロマトグラフィー)、種々の免疫学的方法(例えば、流体またはゲル沈殿反応、免疫拡散法、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動法(例えばSDS−PAGE)、RT−PCR、定量PCR、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射性同位元素標識法、シンチレーション計数法、およびアフィニティクロマトグラフィ法)が挙げられる。
【0083】
(核酸の増幅)
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して核酸を増幅し、以下に使用するための融合タンパク質をコードする配列を産生する:本発明を実施するため;インビボ投与後のワクチンのレベル(例えば、プラスミドまたはウイルスのレベル)をモニタリングするため;その存在および活性CTLの表現型を確認するためなど。当業者は、公知の配列(例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas enotoxin A(ETA dII)の細胞質転座ドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列をコードする配列)を使用して、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計し得る。増幅方法はまた、当該分野で周知であり、これらには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR(PCR PROTOCOLS,A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,ed.Innis,Academic Press,N.Y.(1990)およびPCR STRATEGIES(1995),ed.Innis,Academic Press,Inc.,N.Y.,リガーゼ連鎖反応(LCR)(例えば、Wu(1989)Genomics 4:560;Landegren(1988)Science 241:1077;Barringer(1990)Gene 89:117を参照のこと);転写増幅(例えば、Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173を参照のこと);ならびに自己持続性配列複製(例えば、Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874を参照のこと);Qベータレプリカーゼ増幅(例えば、Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477−1491を参照のこと),自動Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ(例えば、Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10:257−271を参照のこと)ならびに他のRNAポリメラーゼ触媒技術(例えば、NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario);Berger(1987)Methods Enzymol.152:307−316;Sambrook;Ausubel;米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:564を参照のこと。
【0084】
(発現カセットのクローニングおよび構築)
発現カセット(プラスミド、組換えウイルス(例えば、以下に記載されるレプリコンのようなRNAウイルス)および本明細書中に記載される融合タンパク質をコードする他のベクター)を使用して、これらのポリペプチドをインビトロおよびインビボで発現させる。種々の従来の技術によって発現された組換え核酸は、科学文献および特許文献にいて十分に記載される。例えば、Roberts (1987)Nature 328:731;Schneider(1995)Protein Expr.Purif.6435:10;Sambrook,TijssenまたはAusubelを参照のこと。プラスミド、ベクターなどは、天然供給源から単離されるか、ATCCまたはGenBankライブラリのような供給源から入手されるか、または合成もしくは組換え方法によって調製される得る。
【0085】
本発明を実施するために使用される核酸は、安定的または過渡的に細胞(例えば、エピゾーム発現系)中で発現され得る。選択マーカーは、形質転換された細胞上での選択可能な表現型を与えるために取りこまれ得る。例えば、選択マーカーは、エピゾームの維持および複製のためにコードし得るので、宿主ゲノムへの取り込みは必要とされない。例えば、このマーカーは、抗生物質耐性(例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、G418、ベロマイシン、ハイグロマイシン)または除草剤耐性(例えば、クロロスルフロンまたはBasta)をコードし得、所望のDNA配列で形質転換されたこれらの細胞の選択を可能にする(例えば、Blondelet−Rouault(1997)Gene 190:315−317;Aubrecht(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:992−997を参照のこと)。
【0086】
(インビボ核酸投与)
1実施形態において、本発明のキメラ核酸を、インビトロ、エキソビボおよび/またはインビボで、細胞(例えば、ヒトの細胞または他の哺乳動物の細胞)にトランスフェトまたは感染させ得る発現カセット(例えば、プラスミドまたは他のベクター、ウイルス)にクローニングする。任意のアプローチとしては、以下を使用し得る:例えば、脂質またはリポゾームベースの遺伝子送達(例えば、Mannino(1988)BioTechniques 6:682−691;米国特許番号第5,279,833号を参照のこと)、レトロウイルスゲノムの一部として所望の外来性配列を用いた複製欠損レトロウイルスベクター(例えば、Miller(1990)Mol.Cell.Biol.10:4239;Kolberg(1992)J.NIH Res.4:43;Cornetta(1991)Hum.Gene Ther.2:215を参照のこと)。例えばまた、Zhang(1996)Cancer Metastasis Rev.15:385−401;Anderson,Science(1992)256:808−813;Nabel(1993)TIBTECH 11:211−217;Mitani(1993)TIBTECH 11:162−166;Mulligan(1993)Science,926−932;Dillon(1993)TIBTECH 11:167.175;Miller(1992)Nature 357:455−460を参照のこと。
【0087】
発現カセットはまた、ウイルスゲノムから誘導され得る。使用され得るベクターとしては、例えば、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、またはアレナウイルス科由来の、組換え改変されたエンベロープDNAおよびRNAウイルスまたは非エンベロープDNAおよびRNAウイルスが挙げられる。親のベクター特性の各々のアデノウイルスの利点を展開する、キメラベクターがまた使用され得る(例えば、Feng(1997)Nature Biotechnology 15:866−870を参照のこと)。腫瘍サプレッサ遺伝子を含むように、このようなウイルスゲノムを組換えDNA技術によって改変し、そして複製欠損、条件付き複製または複製成分になるように遺伝子操作し得る。このベクターは、複製欠損または条件複製であり得る。ベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロゲノムから誘導され得る。レトロウイルスとしては、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、シミアン免疫欠乏ウイルス(SIV)、ヒト免疫欠乏ウイルス(HIV)、およびそれらの組合せに基づくアデノウイルスを含み得る。例えば、Buchscher(1992)J.Virol.66(5)2731−2739;Johann(1992)J.Virol.66(5):1635−1640(1992);Sommerfelt(1990)Virol.176:58−59;Wilson(1989)J.Virol.63:2374−2378;Miller(1991)J.Virol.65:2220−2224を参照のこと。アデノ関連ウイルス(AAV)ベースのベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生、ならびにインビボおよびエキソビボ治療手順のために細胞を形質導入するために使用され得る。例えば、Okada(1996)Gene Ther.3:957−964;West(1987)Virology 160:38−47;Carter(1989)米国特許第4,797,368号;CarterらWO 93/24641(1993);Kotin(1994)Human Gene Therapy 5:793−801;Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.94:1351(AAVベクターの総説のため)を参照のこと。
【0088】
(自己複製RNAレプリコンを使用するインビボ投与)
上記の発現ベクターおよび組換えウイルスに加えて、自己複製RNAレプリコンを使用して、本発明のタンパク質発現核酸で細胞もしくは組織または全生物を感染し得る。従って、本発明はまた、RNAウイルス(例えば、アルファウイルスゲノムRNA(例えば、シンドビスウイルス;セムリキ森林ウイルス;ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスなど))を取り込み、このウイルスは、異種RNAおよびタンパク質の発現を可能にするように遺伝子操作される。異種配列の高レベルの発現(例えば、本発明の融合タンパク質)は、このウイルス構造遺伝子が同種コード遺伝子によって置換される場合に達成される。
【0089】
これらの組換えRNAは自己複製し(すなわち、このRNAは「レプリコン」である)、そして裸RNAまたはDNAとして細胞中に導入され得る。しかし、これらは、パッケージングし、そして感染性ウイルス粒子として細胞から放出するためにトランス相補体を必要とする。この欠損ヘルパーRNAは、複製に必要とされるcis−作用配列およびポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの発現を駆動するRNAプロモーターを含む。このレプリコンと欠損ヘルパーRNAの両方で同時形質転換した細胞において、このレプリコンRNAから翻訳されたウイルス非構造的タンパク質は、この欠損ヘルパーRNAの複製および転写によりビリオン構造タンパク質を産生することを可能にする。例えば、Bredenbeek(1993)J. Virol. 67:6439−6446を参照のこと。
【0090】
RNAレプリコンワクチンは、以下のアデノウイルスベクターから誘導され得る:例えば、Sindbisウイルス(トガウイルス科のファミリー)(例えば、Xiong(1989)Science 243:1188−1191を参照のこと)、セムリキ森林ウイルス(例えば、Ying(1999)Nat.Med.5:823−827を参照のこと)またはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスウイルス(例えば、Pushko(1997)Virology 239:389−401を参照のこと)ベクター。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてRNAまたはDNAのいずれかとして投与され得、次いでこれは、トランスフェクトされた細胞でまたはインビボでRNAレプリコンに転写される(例えば、Pushko(1997)Virology 239:389−401を参照のこと)。自己複製RNAは、多様な範囲の細胞型を感染し、そして目的の抗原の発現を高レベルで可能にする(例えば、Huang(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7:531−535を参照のこと)。さらに、自己複製RNAは、トランスフェクトされた細胞を結果として溶解する。なぜならば、ウイルスレプリコンは、感染した宿主細胞に対して毒性であるからである(例えば、Frolov(1996)J.Virol.70:1182−1190を参照のこと)。従って、これらのベクターは、宿主ゲノムへの裸DNAワクチンの取り込みに関する重要性を生じない。これは、強力に発癌性であるワクチン展開標的タンパク質(例えば、アデノウイルスE7タンパク質)にとって特に重要である。
【0091】
1実施形態において、この自己複製RNAレプリコンは、例えば、Bredenbeek(1993)J.Virol.67:643 9−6446に詳細に記載されているようなシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5を含む(例えばまた、Herrmann(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.253.524を参照のこと)。
【0092】
(薬学的組成物の処方物および投与)
本発明の種々の実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現カセット、細胞、および粒子を十分な量の薬理学的組成物として個体に投与して、個人における抗原特異的免疫応答(例えば、CTL応答)を生じさせる。
【0093】
核酸、ペプチドおよびポリペプチドのための薬学的に受容可能なキャリアおよび処方物は、当業者に公知であり、そして科学文献および特許文献において詳細に記載されている(例えば、the latest edition of Remington’s Pharmaceutical Science,Maack Publishing Company,Easton,PA(「Remington’s」);Banga;Putney(1998)Nat.Biotechnol.16:153−157;Patton(1998)Biotechniques 16:141−143;Edwards(1997)Science 276:1868−1871;米国特許第5,780,431号;同第5,770,700号;同第5,770,201号を参照のこと)。
【0094】
本発明の方法において使用される核酸およびポリペプチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、単独または薬学的組成物として送達され得る:例えば、全身的、局部的、または局所的;皮下、気管内(例えば、エアロゾルによる)または経粘膜(例えば、頬粘膜、膀胱粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜、鼻粘膜)のような、動脈内、くも膜下腔内(IT)、静脈内(IV)、非経口、胸膜内管腔、局所(topical)投与、経口投与、または局所(local)投与。組成物を送達するための実際の方法は、公知であるか、または当業者に公知であり、そして科学文献および特許文献(例えば、Remingtonの文献)に詳細に記載されている。
【0095】
この薬学的組成物は、任意のプロトコールによって、および種々の単位用量形態で投与され得、投与の方法および経路および頻度、他の薬物が投与されるかどうか、個人の応答などに依存する。代表的な核酸、ペプチドおよびポリペプチドの薬学的組成物の投薬は、当該分野で周知である。このような投薬は、代表的に本質において注意を要し、種々の因子に依存して調節される(例えば、開始応答(例えば、産生された抗原特異的なCTLの量、腫瘍収縮など)、特定の治療状況、患者の健康および耐性)。所望の応答を産生するのに適切な薬学的組成物の量は、「治療的有効量」として規定される。この投薬スケジュールおよびこの使用のための有効量(すなわち、「投薬レジメン」)は、種々の因子(例えば、免疫によって処置または予防される疾患または状態、患者の健康の一般的な状態、患者の身体状態、年齢、薬学的処方物および薬学的組成物の濃度など)に依存する。この投薬レジメンは、薬物動態学(すなわち、吸収、バイオアベイラビリティー、代謝、クリアランスなど(例えば、Remingtonを参照のこと))を考慮する。投薬は、例えば、症状の軽減または緩和をアッセイすることによって、または目的の基準(例えば、抗原特異的CTLの測定レベル)によって経験的に決定され得る。上記のように、単一または複数の投与は、必要とされる場合に用量および頻度に依存して投薬され得、そして患者に耐性である。薬学的組成物は、単独または他の治療学的処置と組合せて、あるいは予防免疫として投与され得る。
【0096】
(キット)
本発明は、上記のような本発明の薬学的組成物を含むキットを提供し、本発明の方法を実施する。代替の実施形態において、このキットは本発明の組換えまたは合成キメラポリペプチド;またはこれらをコードする核酸(例えば、裸DNAの形態(プラスミド)、ウイルス(例えば、アデノウイルス誘導「レプリコン」(シンドビスウイルスレプリコンを含む)などの形態)を含み得る。このキットは、方法(例えば、本発明を実施するために使用される組成物を投与する手段、注射する手段または本発明の核酸もしくはポリペプチドで細胞または患者または動物を感染させる手段、得られた免疫応答(CTL応答)をモニタリングする手段および組成物が投与された個体の反応を評価するする手段など)を教示する指示書を含み得る。
【0097】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、それに照らし合わせた種々の改変または変化は、当業者に示唆され、そして本出願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【0098】
(実施例)
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【0099】
(実施例1:抗原遺伝子のHSP70遺伝子への結合によるDNAワクチン能力の増強およびインビボでの腫瘍の処置)
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)応答を増強し、そしてインビボで腫瘍を処置するために有効であることを証明する。
【0100】
モデル抗原としてHPV−16 E7を使用する、本明細書中に記載されたデータは、熱ショックタンパク質、細胞質転座部分、クラスI MHCエピトープを有するキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNAワクチンより、エピトープに対して強力な免疫特異性が得られることを示す。裸DNAワクチンによって産生された抗原特異的免疫においてMycobacterium tuberculosis熱ショックタンパク質70(HSP70)に結合する効果を評価した。
【0101】
M.tuberculosisHSP70は、HPV−16 E7−発現DNAワクチンの能力を増強する。HPV−16 E7に融合されたHSP70を含むDNAワクチンは、強力なE7−特異的細胞免疫(E7−特異的CD8+T細胞前駆体頻度少なくとも30倍の増加)を惹起し、そして有意なCD8+T細胞依存性予防薬およびHPV−16 E7発現腫瘍細胞に対する治療効果を生じた。
【0102】
このデータは、HPS70が、こE7 DNAワクチンのCD8+T細胞応答を優先的に増強することを示した。フローサイトメトリーによって、検出可能なIFN−γ−発現CD4+T細胞を誘導しないこと、およびE7−特異的抗体を誘導しないことを実証した。E7−HSP70誘導遺伝子をコードしないDNAワクチンは、E7−特異的CD8+T細胞の頻度を野生型E7遺伝子を含む(HSP70遺伝子配列を含まない)ワクチンと比較して40倍増加した。より重要なことには、HSP70遺伝子配列の従来のDNAワクチン(例えば、抗原のみをコードするワクチン)への添加により、構築されたE7発現腫瘍に対して低い有効性のワクチンを有意な強度を有するワクチンに変換した。驚くべきことに、E7−HSP70融合ワクチンは、包括的に標的CD8+T細胞を標的し;免疫性効果および腔腫瘍効果は、完全にCD4非依存性であった。これらの結果は、HSP70の抗原遺伝子への融合が、CD8依存経路を経由してDNAワクチンの強度を穏やかに増強することを示す。
【0103】
ヒトパピローマウイルス(HIV)−誘導体化抗原を選択した。なぜならば、HPV、特にHPV−16は、最も頸部癌に関連するからである。このHPV発癌性タンパク質(E6およびE7)は、ほとんどのHPV−含有頚部癌における細胞の形質転換および同時発現の誘導および維持において重要である。E7および/またはE6タンパク質を標的するワクチンまたは免疫治療により、HPV−関連頚部悪性腫瘍を予防および処置し得る。このデータは、HSPコード配列に連結する抗原コードポリヌクレオチド(例えば、全長E7−コード配列)が、DNAワクチンの強度を増強することを示す。Mycobacterium tuberculosisi HSP70に融合された全長E7を含むDNAワクチンを有する、野生型HPV−16E7を含むDNAワクチンを、免疫応答性発生およびHPV−16 E7発現悪性腫瘍に対して動物を保護するための能力について評価した。E7をコードするDNAを、HSP70をコードするDNAに連結することにより、完全にCD4アームをバイパスする、E7−特異的CD8+T細胞の発現および活性を増加します。この増強したCD8応答は、結果として構築された腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じる。
【0104】
以下の材料および方法を使用して、以下に記載されるデータを得た。
【0105】
プラスミドDNA構築物および処方物:Mycobacterium tuberculosis HSP70をコードするDNAフラグメントは、当該分野で公知である(GENBANK寄託番号Z95324 AL123456;ヌクレオチド10633−12510コードHSP70)。
【0106】
(表1:HSP70のアミノ酸配列)
【0107】
【表1】
(Mycobacterium tuberculosisゲノムのヌクレオチド10633〜12510によってコードされる)。
【0108】
(表2:HSP70をコードするヌクレオチド配列)
【0109】
【表2】
GENBANK登録番号 Z95324 AL123456のヌクレオチド10633〜12510。
【0110】
HSP発現プラスミド(pcDNA3−HSP)の生成のために、HSP70−コードDNAを、pKS70からサイトメガロウイルスプロモーターの下流のpcDNA3.1(−)発現ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位にサブクローニングした。HPV−16E7発現プラスミド(pcDNA3−E7)の生成のために、増幅されたフラグメントのそれぞれ5’および3’末端でBamHIおよびHindIII制限部位を生成するように設計されたプラスミドを使用して、PCRによってE7 DNAを増幅した。増幅したE7 DNAを、次いで、pcDNA3.1の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位にクローニングした。E7−HSP70キメラ(pcDNA−E7−HSP70)の生成のために、増幅されたフラグメントの5’および3’末端の両方でBamHI制限部位を生成するように設計されたプライマーを使用して、E7 DNAをPCRによって増幅した。E7 DNAを、次いで、pcDNA3−HSPの5’末端にサブクローニングした。これらの構築物の精度を、DNA配列決定によって確認した。HSPE7またはE7−HSP70遺伝子挿入物を有するプラスミドDNA、および「空の」プラスミドベクターを、サブクローニングに有効なDH5(TM細胞;Life Technologies,USA)にトランスフェクトした。次いで、DNAを増幅し、そして二重CsCL精製(BioServe Biotechnologies,Laurel,Maryland)を使用して精製した。プラスミドDNAの完全性およびEscherichia coli DNAまたはRNAの非存在を、1%アガロースゲル電気泳動を使用して、各調製物について調べた。DNAの濃度は、260nmで測定した光学密度によって決定した。挿入されたE7フラグメントの存在は、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。小網およびカルレティキュラム(calreticulum)ポリペプチド(およびそれらをコードするポリヌクレオチド)は、免疫原性組成物のHSP成分に対して有用な代替物である。
【0111】
(表3:HPV16E7抗原のアミノ酸配列)
【0112】
【表3】
GENBANK登録番号AAD33353。
【0113】
(表4:HPV E7をコードするヌクレオチド配列)
【0114】
【表4】
GENBANK登録番号AF125673のヌクレオチド562〜858。
【0115】
DNAワクチン接種:遺伝子銃粒子媒介性DNAワクチン接種を、標準的なプロトコルに従って、ヘリウム駆動型遺伝子銃(BioRad,Hercules,CA)を使用して行った。簡単には、25mgの1.6μm金マイクロキャリア(Bio−rad,Hercules,CA)および100μlの0.05M スペルミジン(Sigma,St,Louis,MO)を合わせることによって、DNAコーティング金粒子を調製した。プラスミドDNA(50μg)および1.0M CaCl2(100μl)を、渦流により混合しながら、連続的にマイクロキャリアに添加した。この混合物を、室温(RT)で10分間沈殿させた。次いで、マイクロキャリア/DNA懸濁液を遠心分離し(10,000r.p.m.で5秒間)、そして新しい無水エタノールで3回洗浄し、その後、無水エタノール中のポリビニルピロリドン(0.1mg/ml)(Bio−rad,Hercules,CA)(3ml)中に再懸濁した。次いで、この溶液をチュービングに充填し、そして4分間静置した。エタノールを穏やかに除去し、そしてこのチューブを回転することによって、このチュービングの内面にこのマイクロキャリア/DNA懸濁液を均一に付着させた。次いで、このチューブを、0.4リットル/分の窒素ガス流で乾燥させた。次いで、マイクロキャリア/DNAでコーティングされた乾燥チュービングを、0.5インチの薬筒に切断し、そしてキャップ付きの乾燥ビン中で4℃で保存した。結果として、各薬筒は、1μgのプラスミドDNAおよび0.5mgの金を含んだ。DNAコーティング金粒子(1μg DNA/ビュレット)を、ヘリウム駆動型遺伝子銃(Bio−rad,Hercules,CA)を400p.s.i.の排出圧で使用して、マウスの剃毛した腹部領域に送達した。
【0116】
ELISPOTアッセイ:標準的なELISPOTアッセイを使用して、HPV−16E7特異的CD8+T細胞を検出した。96ウェル濾過プレート(Millipore,Bedford,MA)を、50μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中10μg/mlのラット抗マウスIFN−γ抗体(クローンR4−6A2、Pharmingen,San Diego,DA)でコーティングした。4℃で一晩インキュベートした後、このウェルを洗浄し、そして10%ウシ胎児血清を含む培養液でブロックした。ワクチン接種したマウス群の各々から新しく単離した、異なる濃度の脾細胞(1×106/ウェルから始めた)を、15U/mlのインターロイキン−2と共にウェルに添加した。細胞を、1μg/mlのE7特異的H−2DbCTLエピトープ(E7、残基49〜57;配列番号5)と共にかまたはE7特異的H−2DbCTLエピトープなしで、37℃で24時間インキュベートした。培養後、このプレートを洗浄し、次いでこの細胞を、50μlのPBS中5μg/mlのビオチン化IFN−γ抗体(クローンXMG1.2、Pharmingen)と共に、4℃で一晩インキュベートした。6回洗浄した後、50μlPBS中1.25μ/mlのアビジン−アルカリホスファターゼ(Sigma,St.Louis,MO)を添加し、そして室温で2時間インキュベートした。洗浄後、50μlのBCIP/NBT溶液(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を添加することによって、スポットを発色させ、そして室温で1時間インキュベートした。このスポットを解剖顕微鏡を使用して数えた。
【0117】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー:未処置の群のマウスまたはワクチン接種した群のマウス由来の脾細胞を、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(残基49〜57;配列番号5)、またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(残基30〜67;配列番号6)のいずれかと共にインキュベートした。タンパク質またはポリペプチドのどの残基がMHCクラスI抗原性エピトープを提示するかを決定する方法は、当該分野で周知である。E7ペプチドを、20時間、2μg/mlの濃度で添加した。E7特異的CD8+T細胞前駆体およびE7特異的CD4+Tヘルパー細胞応答を検出するために、それぞれ、CD8+CTLエピトープの残基49〜57および残基30〜67を使用した。GolgistopTM(Pharmigen,San Diego,CA)を6時間添加し、その後、培養液から細胞を収集した。次いで、細胞をFACSCAN緩衝液で1回洗浄し、そしてフィコエリトリン(PE)結合したモノクローナルラット抗マウスCD8またはCD4抗体(Pharmingen,San Diego,CA)で染色した。メーカーの使用説明書(Parmingen)に従って、Cytofix/CytopermTMキットを使用して、細胞を、細胞内サイトカイン染色に供した。FITC結合抗IFN−γまたは抗IL−4抗体、および免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体(ラットIgG1)は全てPharmingenから購入した。CELLQuestTMソフトウエアを備えるBecton−Dickenson FACScanTM(Becton Dickson Immunocytometry System,Mountain Veiw,CA)で分析を行った。
【0118】
サイトカインのELISA:脾細胞(4×106)を、最後のワクチン接種の2週間後に収集し、そして24ウェル組織培養プレート中で、全容量2mlのRPMI 1640中10μg/mlのE7タンパク質(10%(vol/vol)ウシ胎児血清、50ユニット/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM 非必須アミノ酸を補充)と共に72時間培養した。上清を収集し、そしてメーカーのプロトコルに従ってELISAキット(Endogen)を使用して、IFN−γおよびIL−4の存在についてアッセイした。
【0119】
抗E7 ELISA:血清中の抗HPV 16E7抗体を、標準的な直接ELISAによって決定した。96μウェルプレートを、10μ/mlの細菌由来HPV−16E7タンパク質(100μl)でコーティングし、そして4℃で一晩インキュベートした。次いで、このウェルを、20%ウシ胎児血清を含有するPBSでブロックした。免疫化後14日のマウスから血清を調製し、PBSで連続的に希釈し、ELISAウェルに添加し、そして37℃で2時間インキュベートした。0.05% Tween−20を含有するPBSで洗浄した後、このプレートを、1/2000希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed,San Francisco,CA)と共に室温で1時間インキュベートした。このプレートを6回洗浄し、TMB(Pierce,Rockford,IL)を用いて発色させ、そして1m H2SO4を用いてとめた。ELISAプレートを標準的なELISA読みとり器を用いて、450nmで読みとった。
【0120】
マウス腫瘍細胞株:マウス腫瘍細胞株TC−1を、標準的な組織培養方法を使用して増殖し、維持した。マウスにおける腫瘍細胞株の増殖および形質転換細胞による腫瘍の形成は、ヒト癌の当該分野で認められたモデルである。HPV−16 E6、E7およびras癌遺伝子を使用して、初代C57BL/6マウス肺上皮細胞を形質転換した。この細胞を、5% CO2、37℃で、RPMI 1640(10%(vol/vol)ウシ胎児血清、50ユニット/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM 非必須アミノ酸、および0.4mg/ml G418を補充)中で増殖させた。腫瘍チャレンジの日に、TC−1細胞をトリプシン処理によって収集し、1X Hanks緩衝化塩溶液で2回洗浄し、最後に、1X Hanks緩衝化塩溶液に再懸濁して、注射のために指示された濃度にした。
【0121】
マウス:6〜8週齢の雄性C57BL/6マウスを、National Cancer Institute(Frederick,Maryland)から購入した。
【0122】
インビボ腫瘍保護:マウス(5匹/群)を、遺伝子銃によって、2μgのHSP DNA、E7 DNA、E7−HSP70 DNA、または挿入物を有さない空のプラスミドでワクチン接種した。1週間後、このマウスを初めのワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス(5匹/群)を、1回ワクチン接種した(さらなるブースターなし)。最後のワクチン接種の1週間後、マウスの右脚に、5×104細胞/マウスのTC−1腫瘍細胞を皮下にチャレンジし、次いで1週間に2回モニタリングした。
【0123】
インビボ腫瘍処置:腫瘍細胞およびDNAワクチンを、上記のように調製した。マウスの右脚に、2×104細胞/マウスのTC−1腫瘍細胞を皮下にチャレンジした。TC−1腫瘍細胞を用いてチャレンジした3日後に、マウスに、2μgのHSP DNA、E7 DNA、E7−HSP70 DNA、または挿入物を有さない空のプラスミドを、遺伝子銃で与えた。1週間後、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス(5匹/群)を、1回ワクチン接種し、腫瘍チャレンジ後にさらにブーストしなかった。マウスを1週間に2回モニタリングした。
【0124】
インビボ抗体枯渇:インビボ抗体枯渇を、標準的な方法を使用して行った。C57BL/6マウスに、遺伝子銃によって2μgのE7−HSP70 DNAをワクチン接種し、1週間後にブーストし、そして5×104細胞/マウスのTC−1腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの1週間前に枯渇を開始した。CD−4特異的モノクローナル抗体(例えば、MAb GK1.5)を、CD4枯渇のために使用し、CD8特異的抗体(例えば、MAb2.43)を、CD8枯渇のために使用し、そしてNK細胞に結合する抗体(例えば、MAb PK136)を、NK1.1枯渇のために使用した。フローサイトメトリー分析によって、これらの適切なリンパ球サブセットの95%より多くが枯渇され、他のサブセットは正常なレベルであることが示された。枯渇は、腫瘍チャレンジの40日後に終結した。
【0125】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種はE7特異的CD8+T細胞媒介性免疫応答を増大する:CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍エフェクターの中で最も重要な成分の1つである。E7−HSP70 DNAワクチンによって生成したE7特異的CD8+T細胞前駆体の頻度を決定するために、酵素結合イムノスポット(ELISPOT)アッセイおよび細胞内サイトカイン染色を使用した。ELISPOTアッセイおよび細胞内サイトカイン染色の両方は、単一の細胞レベルでのIFN−γ産生を測定するために使用される高感度の機能的アッセイであり、従ってこれは、抗原特異的CD8+T細胞を定量するために用いられ得る。図1Aに示されるように、E7 DNAワクチン接種マウス由来の脾細胞106個あたり、わずか14個のE7(49〜57)特異的IFN−γスポット形成CD8+T細胞のみが検出されたことと比較して、E7−HSP70 DNAワクチン接種マウス由来の脾細胞106個あたり、この免疫優性Db制限E7(49〜57;配列番号5)ペプチドに対して特異的な435個のIFN−γスポット形成CD8+T細胞が検出された。pcDNA−3ベクターのみによって生成されたバックグラウンド(3スポット/106の脾細胞)を差し引くと、E7 DNAワクチンおよびE7−HSP70 DNAについて、それぞれ、11個および432個のE7(49〜57)特異的IFN−γスポット形成CD8+T細胞が生成された。同様に、E7(49〜57)特異的CD8+T細胞前駆体の量はまた、CD8および細胞内IFN−γの二重染色を使用して、フローサイトメトリー分析により決定し得る。このアッセイからの値(図1B)は、図1Aに示されるELISPOTの結果と密接に相関した。図1Bに示すように、E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、最大数のE7特異的IFN−γ+CD8+T細胞前駆体を生成し(フローサイトメトリー分析によると約726/106脾細胞)、一方、E7 DNAをワクチン接種したマウスは、ベクター−ワクチン接種したコントロール以上のシグナルを示さなかった。これらのデータは、HSP70またはそのフラグメントをコードするDNAに作動可能に連結されたE7のMHCクラスI制限エピトープが、E7特異的CD8+T細胞前駆体の頻度を少なくとも30倍増加することを示す。
【0126】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種はE7特異的CD4+T細胞媒介性免疫応答を増大しない:E7−HSP70 DNAワクチンにより生成されるE7特異的CD4+T前駆細胞およびサイトカインプロフィールを決定するために、免疫化マウス由来の脾細胞上のCD4表面マーカーおよび細胞内IFN−γまたはIL−4の二重染色を行い、続いて、フローサイトメトリー分析を行った。免疫化マウス由来の脾細胞を、E7ペプチド(残基30〜67;配列番号6)と共に、インビトロで一晩培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。E7ペプチド(残基30〜67;配列番号6)は、HPV−16のE7オープンリーディングフレーム中の大きいTヘルパーエピトープを含む。IFN−γ分泌CD4+T細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析した。図2に示すように、E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAまたはベクターのみをワクチン接種したマウスと比較して、類似の数のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を産生した。HSP70プラスミドと混合したE7 DNAをワクチン接種したマウスは、わずかに多くのCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成したが、ワクチン接種した各群の間のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞数の統計的に有意な差違はなかった。
【0127】
E7特異的CD4+T細胞を検出するCD4染色 対 細胞内IFN−γ染色の能力に対する陽性コントロールとして、Sig/E7/LAMP−1(これは、MHCクラスII分画にE7を標的化する)を発現するDNAワクチンをワクチン接種したマウスの分析は、E7 DNAまたはコントロールプラスミドをワクチン接種したマウスと比較して、3倍のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞の増加を示した。様々なDNAワクチンをワクチン接種したマウスにおけるIL−4分泌E7特異的CD4+T細胞もまた分析した。E7−HSP70 DNA、HSP70 DNAと混合したE7 DNA、野生型E7 DNA、空のプラスミドDNAを接種されたマウスにおいても、ワクチン接種していないマウスにおいても、有意なCD4+IL−4二重陽性細胞は同定され得なかった。MICK−2 IL−4分泌細胞(Pharmingen,San Diego,CA)を陽性コントロールとして使用して、この研究についての首尾良い細胞質内IL−4染色を確認した。これらのデータは、熱ショックタンパク質の全てかまたは一部をコードするDNAを含む本発明のDNAワクチンが、CD4+免疫応答と独立して、そのワクチンによってコードされるエピトープに対するCD8+免疫応答を引き起こすことを示す。
【0128】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種はE7特異的抗体を生成しない:ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV 16E7抗体の量を、最後のワクチン接種の2週間後に、直接酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって決定した。抗E7抗体は、ワクチン接種した群のいずれのマウスの血清においても検出され得なかった(図3)。市販の抗E7モノクローナル抗体(Zymed,San Francisco,CA)、およびSig/E7/LAMP−1キメラを含むワクチンウイルスをワクチン接種したマウス由来の血清を陽性コントロールとして使用して、この研究のために首尾良い抗E7 ELISAを保証した。この結果は、E7 DNAまたはE7−HSP70 DNAワクチンのいずれかによる見かけのE7特異的CD4刺激が全くないことと一致した。
【0129】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種は腫瘍の増殖に対する保護を増大する:E7−HSP70 DNA構築物のワクチン接種がE7発現腫瘍からマウスを保護するか否かを決定するために、異なる用量のDNAワクチンを使用して2つのインビボ腫瘍保護実験を行った。第1の実験について、マウスに、2μgの裸のDNA/マウスを遺伝子銃でワクチン接種し、そして1週間後に同じ用量の裸のDNAをブーストした。第2の実験について、マウスに、2μgの裸のDNA/マウスを遺伝子銃でワクチン接種し、さらなるブーストはしなかった。次いで、最後のワクチン接種の7日後に、このマウスの右脚に、5×104TC−1/マウスを皮下にチャレンジした。ワクチン接種とブースターを受けたマウスについて、E7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたマウスの100%は、TC−1チャレンジの60日後において腫瘍を有さないままであり、一方、E7DNA(HSPコードDNAなし)ワクチン接種を受けたマウスの40%のみが、腫瘍を有さないままであった。逆に、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミドまたはHSP DNAを受けたマウスの全ては、腫瘍チャレンジの15日以内に腫瘍増殖を発症した(図4A)。ブースターなしで一回のワクチン接種を受けたマウスについて、E7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたマウスの100%は、TC−1チャレンジの60日後も腫瘍を有さないままであり、一方、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミド、HSP70 DNAまたはE7 DNAを受けたマウスの全ては、腫瘍チャレンジの15日以内に腫瘍増殖を発症した(図4B)。
【0130】
E7−HSP70 DNAによって生成される抗腫瘍効果が長く継続するか否かを決定するために、これらの腫瘍を有さない動物の右脚に、5×104TC−1細胞/マウスを皮下に再チャレンジした。腫瘍の再チャレンジの30日後まで、腫瘍増殖は観察されなかった(図4A〜B)。要約すると、これらの結果は、HSPポリペプチドをコードするDNA(例えば、E7−HSP70融合体DNA)に作動可能に連結されたMHCクラスI制限抗原性エピトープをコードするDNA構築物は、クラスI制限エピトープを発現する腫瘍(例えば、TC−1腫瘍)の増殖に対する抗腫瘍免疫性を有意に増大することを示す。抗腫瘍効果は、よりストリンジェントな条件下(ブースターワクチンが投与されない)で試験される場合でさえも観察された。E7−HSP70 DNA構築物によって生成される抗腫瘍免疫性は、長く継続した。
【0131】
(樹立されたE7発現腫瘍を有する、E7−HSP70融合DNA欠損(cure)マウスによる治療ワクチン接種):樹立されたTC−1腫瘍を根絶する際のDNAワクチンの効力を試験するために、インビボ腫瘍処置実験を、種々の用量のDNAワクチンを使用して実施した。TC−1細胞を、まず、2×104細胞/マウスの用量でC57BL/6マウスに右脚に皮下注射した。3日後、各マウスを、コントロールプラスミドDNA、HSP70 DNA、野生型E7 DNA、またはE7−HSP70DNAのいずれか2μgを用いて、遺伝子銃を介して皮内処置した。第1の実験について、マウスに、初回免疫(priming)の7日後に、同じワクチン用量で追加免疫(booster)した。第2の実験について、マウスに、初回刺激後にさらなる追加免疫を与えなかった。図5Aに示されるように、追加免疫DNAワクチン接種を受けたマウスについて、TC−1腫瘍は、このE7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたマウスの80%から排除されたが、ワクチン接種しなかったマウスおよび空のプラスミド、HSP70 DNAもしくはE7 DNAを受けたマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後20日以内に、腫瘍増殖を発症した。追加免疫を伴わず1回ワクチン接種を受けたマウスについて、E7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたものの60%が、TC−1チャレンジの70日後に腫瘍を有さないままであったが、ワクチン接種しなかったマウスおよび空のプラスミド、HSP70 DNAもしくはE7 DNAを受けたマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後20日以内に、腫瘍増殖を発症した(図5B)。要約すれば、これらの結果は、(HSPポリペプチドをコードするDNAの非存在下での)野生型E7 DNAでのワクチン接種は、マウスにおける以前に接種されたE7発現腫瘍を根絶しなかったが、HSPポリペプチドをコードするDNAと作動可能に連結されたE7をコードするDNA(例えば、E7−HSP70 DNA)でのワクチン接種は、樹立されたE7発現腫瘍を根絶したことを示した。これらのデータは、E7−HSP70 DNAが抗腫瘍免疫を有意に増強すること、およびDNAワクチン構築物中のHSPポリペプチドをコードするDNAの存在が、このDNAワクチンにより生じる抗腫瘍免疫を、従来のDNAワクチン(すなわち、HSPポリペプチドをコードするDNAを含まないワクチン)により生じる免疫のレベルと比較して増強することを、示した。
【0132】
(HSP70をコードする配列への抗原性エピトープをコードするDNAの融合は、抗腫瘍免疫の生成に必要である):HSP70へのE7の融合が抗腫瘍免疫に必要であったか否かを決定するために、E7−HSP70 DNAを、HSP70 DNAと混合されたE7−DNAと比較し、そしてその抗腫瘍免疫を生じる能力を測定した。E7 DNAおよびHSP70 DNAの両方を同じ細胞へ送達するのを確実にするため、このE7 DNAを、弾丸(bullet)調製前にHSP70 DNAと混合した。従って、単一の弾丸が、E7 DNAおよびHSP70 DNAの両方を含む。免疫学的アッセイおよび腫瘍防御実験(ワクチン追加免疫なし)を、上記のように実行した。このデータは、E7−HSP70 DNAのみがE7特異的CD8+ T細胞媒介性免疫応答を増強することを示した。HSP70 DNAをE7 DNAと混合すると、CD8+ T細胞媒介性免疫応答を増強しなかった。腫瘍防御実験について、E7−HSP70 DNAでワクチン接種したマウスのすべてが、腫瘍チャレンジの60日後に腫瘍を有さないままであった。対照的に、ワクチン接種していないマウスまたはHSP70 DNAと混合したE7 DNAでワクチン接種したマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後15日以内に腫瘍増殖を発症した(図6)。HSP70 DNAへのE7 DNAの融合は、抗腫瘍免疫の生成に必須であった。これらの結果は、MHCクラスI拘束抗原性エピトープをコードするDNAを、APC結合エピトープをコードするDNAおよび/または細胞質トランスロケーションポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結しなければならないことを示す。
【0133】
(CD8+T細胞(CD4+ T細胞またはNK細胞ではない)は、HSP70に融合されたE7を用いるDNAワクチンにより生じる抗腫瘍効果に必須である):E7陽性腫瘍細胞の拒絶に重要であるリンパ球のサブセットを決定するために、インビボ抗体枯渇(depletion)実験を実施した。この抗体枯渇は、腫瘍チャレンジの1週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジの40日後に終了した。図7に示されるように、すべてのナイーブマウスおよびCD8+T細胞を枯渇されたマウスすべては、腫瘍チャレンジ後14日以内に腫瘍を増殖した。対照的に、非枯渇マウスのすべておよびCD4+T細胞枯渇マウスまたはNK1.1細胞枯渇マウスのすべてが、腫瘍チャレンジ50日後に腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、DNAワクチンが、CD4非依存性様式でCD8+T細胞を活性化したこと、およびこれらのCD8+T細胞が、E7−HSP70 DNAワクチンにより生じる抗腫瘍免疫に必須であることを、示す。
【0134】
(CD8+T細胞を刺激する際のHSPの役割):本発明は、いかなる特定の機構によっても制限されないが、本発明のキメラ核酸およびDNAワクチンのHSP70ドメインが、抗原に対する「シャペロン」として作用し得、例えば、このHSP70ドメインがCD8+T細胞の誘導を最適にするように適切な細胞型にその抗原ペプチドを移動するためのシャペロニンであり得る。銃式DNA送達は、皮膚前駆体中にDNAを直接導入する。E7−HSP70 DNAでトランスフェクトした樹状細胞(DC)は、HSP70を発現した。HSP70は、タンパク質のフォールディング、輸送および分解において複数の役割を果す、細胞質ゾルHSPである。これは、MHCクラスI拘束抗原のプロセシングに関与する。従って、このDNAワクチンによりコードされるHSP融合産物を、プロテアソームプロセシングのためにより効率的に標的化し得る。
【0135】
CD8+T細胞は、遺伝子銃媒介性E7−HSP70 DNAワクチン接種において重要な役割を果たし得る。本明細書中に記載されるデータは、CD8+T細胞が、抗腫瘍免疫のエフェクター段階において必要であることを示した。対照的に、CD4+細胞の枯渇またはNK1.1+細胞の枯渇は、E7−HSP70 DNAにより生じる抗腫瘍免疫を減少しなかった。この知見は、タンパク質ベースのHSPワクチンを使用するアプローチと対照的である。このタンパク質ベースのHSPワクチンを使用するアプローチは、CD4+ T細胞およびCD8+T細胞ならびにNK細胞が、腫瘍細胞由来のgp96調製物を使用する抗腫瘍免疫のエフェクター段階において必要であることを示した。
【0136】
プロフェッショナルAPCにより取り込まれるHSP複合体は、MHC−I抗原提示経路へとHSP結合ペプチドを導入することに関与し得る。活性化されたB細胞および単核細胞のみが、HSP70を取り込み得るが、活性化T細胞は、HSP70を輸送しないかもしれない。HSPのレセプター媒介性取り込みがHSP/ペプチド複合体タンパク質ワクチンにとって重要であるが、遺伝子銃媒介性E7−HSP70 DNAワクチンにおける役割を果す見込みがない。このDNAワクチンによりコードされる組換えE7−HSP融合遺伝子は、遺伝子銃を介してDCに直接送達され、レセプター媒介性エンドサイトーシスの必要性を回避した。APCの交差初回免疫(cross−priming)もまた生じ得る。なぜなら、E7−HSP70が他の細胞型(例えば、ケラチノサイト(これもまた遺伝子銃ワクチン接種によりトランスフェクトされた))から放出され得、次いでレセプター媒介性エンドサイトーシスを介してDCに侵入し得るからである。
【0137】
HSP70へのE7の融合が必要なことは、おそらくHSP70 T細胞エピトープの付加が原因で、E7がより免疫原性になることを示唆する。HSP70 DNAによるワクチン接種は、(病原体への先の曝露に起因して)個体に存在し得るHSP70反応性T細胞のプールを拡大する。これらのHSP70反応性T細胞は、結合体化ペプチドに対して反応する強力なヘルパー効果を発揮し得;これは、ELISPOTアッセイにより検出されそして細胞内サイトカイン染色により検出された、E7特異的CD8+T細胞前駆体頻度分布の増加をもたらす機構であり得た。この増加は、E7−HSP70融合遺伝子によりワクチン接種したマウスにおいて観察されたが、HSP70プラスミドと混合したE7プラスミドによりワクチン接種したマウスにおいては観察されなかった。
【0138】
HSPは、抗原非依存性機構を介して、インビボおよびインビトロでT細胞を直接活性化し得る。抗原ペプチドの非存在下で、HSPは、抗原特異的CTLクローンのTNF−αおよびIFN−γの選択を誘導し得る。ヒトHSP−60は、先天免疫系に対する危険シグナルとして作用し得、そしてTヘルパー1(TH1)炎症誘発(proinflammatory)応答を誘導し得る。しかし、E7特異的CD4+T細胞の数の有意な増加は、HSP70 DNA単独でワクチン接種したマウスでもHSP70プラスミドと混合したE7プラスミドでワクチン接種したマウスでも観察されなかった。このDNAワクチンのHSP成分により刺激したγδ T細胞もまた、E7−HSP70 DNAワクチンにより生じる抗腫瘍効果に関与し得る。
【0139】
E7−HSP70は、増強されたMHCクラスI提示を通じて強力なCD8+ T細胞応答を生じるが、MHCクラスII提示経路に抗原を標的化する他の構築物は、増強されたCD4+ T細胞応答を提供し得る。MHCクラスI拘束経路およびMHCクラスII拘束経路を直接増強するワクチンの投与を、同時投与し得る。例えば、E7のMHCクラスII提示経路を増強するためのLAMP−1エンドソーム/リソソーム標的化シグナルを第2のDNAがコードするDNA構築物(例えば、キメラSig/E7/LAMP−1 DNAワクチン)を、抗原特異的CD4+T細胞を刺激するために、本発明の核酸およびワクチンと同時投与し得る。MHCクラスII標的化ワクチン(例えば、Sig/E7/LAMP−1)と組み合わせた、本明細書中に記載されるE7−HSP70ワクチンは、相乗様式で免疫系の複数のアーム(arm)を活性化し得、有意に増強されたCD4+ T細胞応答およびCD8+ T細胞応答ならびに強力な抗腫瘍効果をもたらし得る。
【0140】
これらの結果は、本発明の例示的キメラ核酸(HSP70およびHPV−16 E7融合タンパク質をコードする、DNA融合構築物)は、バリスティック(ballistics)により投与されるDNAワクチンの形態で、抗原E7単独をコードするDNAワクチンよりも強力な、E7特異的CD8+ T細胞媒介性免疫応答およびHPV−16 E7発現マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果を生じ得ることを示す。従って、これらのデータは、抗原遺伝子(またはそのフラグメント)へのHSP70配列の融合(および、本明細書中に記載されるような、カルボキシ末端HSPドメインの融合)が、DNAワクチンの効力を大いに増強することを示す。このストラテジーは、病理(例えば、感染性疾患)の予防および処置、ならびに腫瘍および癌の系(特に既知の腫瘍特異的抗原を有する系)に対して、適用可能である。
【0141】
(実施例2:GM−CSFおよびPseudomonas外毒素AのトランスロケーションドメインをコードするDNA配列を抗原遺伝子に連結することによるDNAワクチン効力の増強)
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、インビボで抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強するためおよび腫瘍を処置するために有効であることを示す研究を記載する。
【0142】
免疫原性「融合タンパク質」組成物をコードするキメラ核酸を構築した。そのDNAは、抗原をコードする配列に(作動可能に連結された)GM−CSF(またはそのフラグメント)ドメインをコードした。本発明はいかなる特定の機構によっても限定されないが、生じる融合タンパク質は、その中に含まれる抗原の、GM−CSFレセプターを発現する細胞(例えば、プロフェッショナルAPCおよびその前駆体)への標的化を増強し得た。ETAポリペプチド(例えば、Pseudomonas外毒素AのドメインII(ETA(dII))(配列番号3)をコードするDNAの存在は、MHCクラスI提示を増強するように、エンドソーム区画/リソソーム区画から細胞質への抗原のトランスロケーションを媒介し得る。
【0143】
DNAキメラ(GM−ETA(dII)−E7)を、GM−CSFおよびETA(dII)をコードするDNA配列を、モデル抗原E7の遺伝子に融合することによって作製した。ヒト癌の当該分野で認識されるマウスモデルを、その構築物により惹起される免疫原性および抗腫瘍活性を評価するために使用した。GM−ETA(dII)−E7キメラDNAワクチンを使用するマウスの免疫は、筋肉内注射もしくは皮内注射を介して、E7発現マウス腫瘍細胞株(TC−1)に対する、E7特異的なCD8+ T細胞免疫応答およびCD4+ T細胞免疫応答ならびに有効な抗腫瘍防御および処置を増強した。この劇的な抗腫瘍効果は、他の構築物(特に、GM−E7、ETA(dII)−E7、またはGM−ETA(dII))をコードするDNAワクチンにおいては観察されなかった。本明細書中に記載されるDNAワクチン接種ストラテジーは、癌および病原性微生物による感染についての抗原特異的免疫療法に有用である。
【0144】
(外因性抗原のMHCクラスI提示の改善は、Pseudomonas外毒素AのドメインII(ETA(dII))を使用して試験され得るDNAワクチン効力を増強するためのストラテジーである):ETAは、タンパク質合成をブロックする、細菌Pseudomonas aeruginosa由来の毒素である。ドメインIIすなわちETA(dII)は、エンドソーム区画/リソソーム区画から細胞質へのトランスロケーションを可能にし、これは、外因性抗原のMHCクラスI提示の増強をもたらす。ドメインIはLDL結合を担い、そしてドメインIIIはADP−リボシルトランスフェラーゼと結合する毒性能力を有し、ETAのこれら望ましくない部分は置換もしくは欠失される。下記のデータは、DNAキメラ(GM−ETA(dII)−E7)を使用して生成された。HPV−16 E7を、モデル抗原として使用した。なぜなら、これは、HPV関連悪性疾患において広範に発現されそして十分に特徴付けられている、臨床的に関連する腫瘍形成タンパク質であるからである。GM−CSF DNAは、種々のAPCに取り込まれ得、樹状細胞(DC)成熟の増強を誘導する。抗原と連結することにより、GM−CSFはまた、GM−CSFレセプター(GM−CSF−R)を発現する細胞(例えば、プロフェッショナルAPCおよびその前駆体)へのその抗原の標的化を増強し得る。DNA形態である抗原と連結したETA(dII)は、エンドソーム区画/リソソーム区画から細胞質へと抗原をトランスロケートでき得、増強したMHCクラスI提示を生じ得る。GM−ETA(dII)−E7の例に従って設計されたキメラDNA構築物によるワクチン接種は、MHCクラスI拘束経路およびMHCクラスII拘束経路の両方の活性化に必要な能力提供し、増強されたE7特異的免疫応答および抗腫瘍効果を生じる。
【0145】
以下の材料および方法を、下記のデータを生成するために使用した。
【0146】
(プラスミドDNA構築物および調製):マウスGM−CSFをコードするDNAフラグメントを、5’末端プライマー
【0147】
【化1】
(配列番号11)および3’末端プライマー(EcoRI)
【0148】
【化2】
(配列番号12)を用いるPCRにより得た。GM−CSFを形質導入したB−16黒色腫細胞から生成したcDNAを、PCRのために鋳型として使用した。
【0149】
(表5;マウスGM−CSFのアミノ酸配列)
【0150】
【表5】
(配列番号1);GENBANK登録番号X02333。
【0151】
(表6:マウスGM−CSFのcDNA配列)
【0152】
【表6】
(配列番号2);GENBANK登録番号X05906;「atg」開始部位に下線を付す。
【0153】
増幅産物を、その後pSP73ベクター(Promega)のBglII部位およびEcoRI部位にクローニングして、pSP73−GMを生成した。同じストラテジーを、ヒトGM−CSF(GENBANK登録番号M11220)を使用して、NA構築物を作製するために使用した。あるいは、第1のDNAは、Flt−3リガンド(FL)、CTLA−4、4−1BB、CD40リガンド、またはTNFレセプターのすべてはまたAPC結合フラグメントをコードする。これらのタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、当業者に容易に利用可能である。所定のポリペプチドまたはタンパク質が抗原提示細胞(APC)(例えば、マクロファージまたはDC)に結合するか否かを決定することはまた、当該分野で公知である。例えば、そのポリペプチド(ならびにAPCに結合しないことが公知であるコントロールポリペプチド)を、検出可能なマーカーで標識し、そしてAPCとともにインキュベートする。その細胞を洗浄した後、(コントロールと比較した)APC上またはAPC中の標識の検出は、そのポリペプチドがAPC結合ドメインまたはAPC結合配列を有することを示す。
【0154】
ETAのドメインIIを含むDNAフラグメントを、5’末端プライマー
【0155】
【化3】
(配列番号13)および3’末端プライマー
【0156】
【化4】
(配列番号14)を用いるPCRにより生成した。
【0157】
(表7:ETAのアミノ酸配列)
【0158】
【表7】
(配列番号3);GENBANK登録番号K01397 M23348;残基1〜25=シグナルペプチド;成熟ペプチドの開始は下線を付した「A」;トランスロケーションドメインは残基247〜417に広がる。
【0159】
(表8:ETAをコードするcDNA)
【0160】
【表8】
(配列番号4);GENBANK登録番号K01397 M23348。
【0161】
増幅された生成物を、引き続いてpSP73−GMのEcoRIおよびBamHI部位へクローニングし、pSP73−GM−ETA(dII)を生成する。HPV−16 E7を含むDNAフラグメントを、5’末端プライマー(5’−GGGAGGATCCTCATGCATGGAGATACACCT−3’(配列番号15))および3’末端プライマー(5’−GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG−3’(配列番号16))を用いてPCRによって合成した。プラスミドpCMVneoBamHI−E7を、このPCR反応についてテンプレートとして使用した。増幅された生成物を、さらにpSP73−GM−ETA(dII)のBamHIおよびHindIII部位へクローニングし、pSP73−GM−ETA(dII)−E7を生成した。GM−ETA(dII)−E7の配列を、DNA配列決定によって確認した。pcDNA3.1−GM−ETA(dII)−E7を、BglIIおよびHindII制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって得、そして単離されたGM−ETA(dII)−E7フラグメントをサイトメガロウイルスプロモーターの下流のpcDNA3.1(−)発現ベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−GM−ETA(dII)を、BglIIおよびBamHI制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA (dII)−E7の消化によって生成し、そして単離されたGM−ETA (dII)フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のBamHIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−ETA(dII)−E7を、EcoRIおよびHindIII制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって得、そして単離されたETA(dII)−E7フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のEcoRIおよびHindIIIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−GMを、pBglIIおよびBamHI制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって生成し、そして単離されたマウスGM−CSFフラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のBamHIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−ETA(dII)を、EcoRIおよびBamHI制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって得、そして単離されたETA(dII)フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のEcoRIおよびBamHIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−E7を、BamHIおよびHindIII制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって生成し、そして単離されたE7フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−GM−E7の生成について、このE7フラグメントを、5’末端プライマー(5’−CCCAGATCTAATCATGCATG−3’(配列番号17))および3’末端プライマー(5’−GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG−3’(配列番号18))を用いてPCRによって合成した。増幅されたE7生成物を、BglIIIおよびHindIIIで消化し、そしてさらにpSP73−GMのBamHIおよびHindIII部位へクローニングした。GM−E7フラグメントを、BglIIおよびHindIIIでの消化によってpSP73−GM−E7から単離し、そしてpcDNA3.1(−)の特有のBamHIおよびHindII部位へクローニングした。
【0162】
これらの構築物の正確さを、DNA配列決定によって確認した。GM、ETA(dII)、E7、GM−ETA(dII)、ETA(DII)−E7、GM−E7またはGM−ETA(DII)−E7遺伝子挿入部分を有するプラスミドDNAおよび「空」のプラスミドベクターを、サブクローニング有効DH5(TM細胞(Life Technologies、USA))にトランスフェクトした。ついでこのDNAを増幅し、そして二重CsCl精製(BioServe Biotechnologies、Laurel、Maryland)を使用して精製した。プラスミドDNAの完全性およびEscherichia coli DNAまたはRNAの非存在を、1%アガロースゲル電気泳動を使用して各調製物について調べた。DNA濃度を、260nmでの吸光度測定によって決定した。挿入したE7フラグメントの存在を、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。
【0163】
(DNAワクチン接種):遺伝子銃粒子媒介DNAワクチン接種を、標準的プロトコールに従ってそして上に記載のようにヘリウム打ち込み遺伝子銃(Bio−Rad、Hercules、CA)を使用して実施した。
【0164】
(細胞形質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー):ナイーブまたはワクチン接種された群のマウス由来の脾細胞を、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(残基49〜57;配列番号5)またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(残基30〜67)と共にインキュベートした。E7ペプチドを、20時間2μg/mlの濃度で添加した。E7特異的CD8+T細胞前駆体およびE7特異的CD4+Tヘルパー細胞応答を検出するように、CD8+CTLエピトープ残基49〜57および残基30から67をそれぞれ使用した。Golgistop(Pharmigens、San Diego、CA)を培養物から細胞を収穫する6時間前に添加した。次いで、細胞をFACSCAN緩衝液中で1回洗浄し、そしてフィコエリトリン(PE)結合体化モノクローナルラット抗マウスCD8またはCD4抗体(Pharmingen、San Diego、CA)で染色した。細胞を、メーカー(Pharmingen)の指示に従ってCytofix/Cytopermキットを使用して細胞内のサイトカイン染色に共した。FITC結合体化抗IFN−γまたは抗IL−4抗体および免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体(ラットIgG1)は、Pharmingenからすべて購入した。分析をCELLQuestソフトウェアを用いるBecton−Dickenson FACScanで行った(Becton Dickson Immunocytometry System、Mountain View、CA)。
【0165】
(マウスおよびマウス腫瘍細胞):マウスならびに腫瘍細胞(TC−1細胞など)の生成および維持は、上の実施例1に記載した。
【0166】
(インビボ腫瘍保護):腫瘍保護実験のため、マウス(グループあたり5匹)を、遺伝子銃を介してGM、ETA(dII)、E7、GM−ETA(dII)、ETA(DII)−E7、GM−E7またはGM−ETA(DII)−E7遺伝子挿入部分および「空」プラスミドベクターを有する2μgのプラスミドDNAでワクチン接種した。1週間後、マウスを最初のワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス(グループあたり5匹)を、1回ワクチン接種した(さらなるブースト無しに)。最後のワクチン接種1週間後、マウスを右脚に皮下的に5×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞でチャレンジし、週2回モニターした。
【0167】
(インビボ抗体枯渇):インビボ抗体枯渇の方法を、上に記載している。簡単には、C57BL/6マウスを、遺伝子銃を介して2μgGM−ETADII−E7 DNAでワクチン接種し、1週間後ブーストし、そして5×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞でチャレンジした。枯渇を、腫瘍チャレンジの1週間前に開始した。MAb GK1.5をCD4枯渇について使用し、MAb2.43をCD8枯渇について使用し、そしてMAb PK136をNK1.1枯渇について使用した。フローサイトメトリー分析は、適切なリンパ球サブセットの95%より多くを、通常レベルの他のサブセットで枯渇することを示した。枯渇を腫瘍チャレンジ後40日で終了した。
【0168】
(GM−ETA(dII)−E7融合DNAワクチンの生成および特徴づけ):GM−ETA(dII)−E7、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)、およびE7の構築物を示す略図を図8に示す。
【0169】
(GM−ETA (dII)−E7融合DNAでのワクチン接種は、E7特異的CD8+T細胞媒介免疫応答を高める):CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍エフェクターの間で最も重大な成分の1つである。GM−ETA(DII)−E7 DNAワクチンで生成されるE7特異的CD8+T細胞前駆体頻度を決定するように、細胞内サイトカイン染色を使用した。E7(49−57)特異的CD8+T細胞前駆体の量を、CD8および細胞内IFN−γに対する二重染色を使用するフローサイトメトリー分析によって決定した。このアッセイからの値は、示されるELISPOT結果に近く相関した。図9に示すように、GM−ETA(dII)−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、フローサイトメトリー分析により最も高い数のE7特異的IFN−γ+CD8+T細胞前駆体を生成した。一方、E7、GM−CSF、ETA(dII)、GM−ETA(dII)、GM−E7、またはETA−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、ベクターワクチン接種コントロールより大きくシグナルを示さなかった。
【0170】
(GM−ETA(dII)−E7融合DNAのワクチン接種もまた、E7特異的CD4+T細胞媒介免疫応答を高める):E7特異的CD4+T細胞前駆体細胞およびGM−ETA(dII)−E7 DNAワクチンによって生成されるサイトカインプロファイルを決定するように、二重染色を、免疫化マウス由来の脾細胞上のCD4表面カーカーおよび細胞内IFN−γに対して実施し、引き続きフローサイトメトリーを実施した。免疫化マウス由来の脾臓細胞をE7ペプチド(配列番号7の残基30から67)と共にインビトロで一晩培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方に対して染色した。E7ペプチド(配列番号7の残基30から67)は、HPV−16のE7オープンリーディングフレームタンパク質におけるメジャーTヘルパーエピトープを含む。タンパク質またはペプチドのポリペプチド配列内のTヘルパー細胞エピトープを決定する方法は、当該分野で周知である。
【0171】
IFN−γ分泌CD4+T細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用して分析した。図10に示すように、GM−ETA(dII)−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、E7 DNA、GM−CSF、ETA(dII)、GM−ETA(dII)、ETA−E7 DNAまたはベクター単独でワクチン接種されたマウスと比較してより多くの数のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成した。GM−ETA(dII)−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、類似のレベルのE7特異的CD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成した。これらの結果は、GM−CSFが、ワクチン接種されたマウスにおいてIFN−γ分泌E7特異的CD4+T細胞を高める際に重要な役割を果たすことを示す。これらの結果はまた、標的抗原をコードするDNAに作動可能に連結されたGM−CSFコード配列を含むDNAワクチンが、抗原コード配列単独を含むワクチンより強力であることを示す。
【0172】
(GM−ETA(dII)−E7融合DNAを有するワクチン接種は、TC−1腫瘍の成長に対するマウスの保護を高める):GM−ETA(dII)−E7 DNA構築物でのワクチン接種が、E7発現腫瘍に対してマウスを保護するかどうかを決定するように、インビボ腫瘍保護実験を、種々のDNAワクチンを使用して行った。マウスを、遺伝子銃を介して2μgの裸のDNA/マウスでワクチン接種し、そして1週間後同じ用量でブーストした。次いでこのマウスを、最後のワクチン接種7日後に右脚に皮下に5×104TC−1/マウスでチャレンジした。GM−ETA(dII)−E7 DNAワクチン接種を受けた100%のこれらのマウスのすべては、TC−1チャレンジ後30日無腫瘍を維持したが、ワクチン接種されていないマウスおよびE7、GM−CSF、ETA(dII)、GM−ETA(dII)、GM−E7、ETA−E7 DNAまたは空のプラスミドを受けたマウスは、腫瘍チャレンジ後15日以内に腫瘍増殖を起こした(図11)。GM−ETA(dII)−E7 DNAによって生じた抗腫瘍効果が、長く持続するかどうかを決定するために、これらの無腫瘍動物を、5×104TC−1細胞/マウスで左脚の皮下に再チャレンジした。腫瘍増殖は、腫瘍再チャレンジ後30日まで観察されなかった。これらの結果は、GM−ETA(dII)−E7融合DNAが、有意にTC−1腫瘍の増殖に対する抗腫瘍免疫性を高め、そしてGM−ETA(DII)−E7 DNAによって生じた抗腫免疫性が、長く持続することを示した。
【0173】
(CD8+T細胞は、GM−ETA(dII)−E7 DNAワクチンによって生じる抗腫瘍効果について必須である):E7陽性腫瘍細胞の拒絶に重要なリンパ球のサブセットを決定するために、インビボ抗体枯渇実験を行った。抗体枯渇は、腫瘍チャレンジ1週間前に始め、そして腫瘍チャレンジ後図12に示す日で終了した。図12に示すように、すべてのナイーブマウスおよびすべてのCD8+T細胞の枯渇マウスは、腫瘍チャレンジ後14日以内に腫瘍を増殖した。対照的に、すべての非枯渇マウスおよびすべてのCD4+T細胞またはNK1.1細胞の枯渇マウスは、腫瘍チャレンジ後無腫瘍日を維持した。これらの結果は、CD8+T細胞が、GM−ETAdII−E7 DNAワクチンによって生じる抗腫瘍免疫性について必須であることを示す。
【0174】
本明細書中で記載されるデータは、本発明のキメラ核酸(DNA構築物(APC結合ドメイン、細胞質トランスロケーションドメイン、および抗原エピトープを有するキメラポリペプチドをコードする))が、コードされる抗原エピトープに特異的な強力な免疫応答を誘導することを示す。マウス腫瘍において、この結果は、生成されるキメラにおいてGM−CSF(GM)遺伝子、ETA(dII)遺伝子、およびHPV−16 E7遺伝子の融合物が、E7特異的CD8+およびCD4+T細胞媒介免疫応答およびHPV−16 E7発現マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果高めることを示した。
【0175】
GM−ETA(dII)−E7キメラを使用するマウスの免疫化は、筋肉内注射又は皮内注射を介するE7発現マウス腫瘍細胞株(TC−1)に対するE7特異的免疫応答ならびに効果的抗腫瘍保護および処置を媒介し得た。この劇的な抗腫瘍効果は、他の構築物(特に、GM−E7、ETA(dII)−E7、またはGM−ETA(dII))をコードするDNAワクチンにおいては観察されなかった。さらに、他の構築物を受けたマウスよりもより多くのCD8+およびCD4+T細胞応答をGM−ETA(dII)−E7を受けたマウスにおいて観察した。これらの結果は、GM−ETA(dII)−E7キメラDNAが、選択された抗原(例えば、癌免疫治療における腫瘍抗原、または病原体に関連する病理学を処置または予防するための病原体に対する抗原)に対する細胞媒介応答を高める新規の戦略を表わすことを示した。この結果はまた、ワクチンの成分が、効果のあるE7特異的免疫応答および抗腫瘍効果の発生において重要であることを示す。
【0176】
この結果は、GM−CSF遺伝子が、GM−ETA(dII)−E7およびETA(dII)−E7 DNA構築物の比較によって示されるように、GM−ETA(dII)−E7融合タンパク質において重要な成分であることを示した。ETA(dII)−E7構築物は、GM−ETA(dII)−E7のGM−CSF成分が欠けていた。このことが、高められたE7特異的CD8+またはCD4+T細胞媒介免疫応答および抗腫瘍効果の不足を説明し得る。
【0177】
GM−CSFは、顆粒球およびAPCの生成を誘導し、そして樹状細胞(DC)に対して免疫刺激性シグナルとして作用する。さらに、GM−CSFはプロフェッショナルAPCを標的としそしてその分化を促進する。これは、APCが、GM−CSFレセプターを有しているからである。本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、GM−ETA(dII)−E7融合タンパク質は、MHCならびにDCおよび他のAPC上の同時刺激分子発現において、GM−CSFドメインに起因する変化を誘導し得る。その結果、ETA(dII)−E7において観察されない体液性および細胞媒介免疫応答を高める。これらの観察は、樹状細胞上のGM−CSFドメインの免疫促進効果が、免疫応答の発生およびGM−ETA(dII)−E7融合タンパク質の抗腫瘍効果に対して重大な成分であることを示した。
【0178】
本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、本発明の抗原特異的免疫治療アプローチは、DCの表面分子を標的にし得る。このことが、抗原をプロセシングおよび表示のためにDCへ方向付け得る。免疫原性組成物のAPC結合成分として使用し得る他のポリペプチドとして、Flt−3リガンド(FL)、CD40リガンド、TNFα、および41BBが挙げられる。このようなポリペプチドをコードするDNAは、本発明の免疫原性組成物またはDNAワクチンの第1のDNA成分として有用である。Flt3リガンド(Flt3−lまたはFL)は、インビボで樹状細胞の機能および量を増大し得る。Flt3(fms様チロシンキナーゼ3)は、当該分野で公知のマウスチロシンキナーゼレセプターであり、そしてFlt3を使用して対応するリガンド、Flt3−Lを同定し、引き続きクローニングした(Hannumら、1994、Nature.368:643−648;Maraskovskyら、J.of Experimental Med.,(1996)184:1953−1962;199638)。CD40リガンド(CD154)もまた、有用である;DCに対する効果のためワクチン潜在性を高め得る。TNF−αは、ワクチン潜在性を高めるための別のストラテジーを示す;TNF−αは、リンパ様の組織へのDCの移動ならびにランゲルハンス細胞の分化および発生を促進し得る。ワクチン潜在性を高める別のストラテジーは、4−1BBL(4−1BB(CD137)に結合する腫瘍壊死因子ファミリーのサイトカイン)の使用である。4−1BBとの相互作用に続くDC上の4−1BBL発現は、CD28レセプターを介するシグナル送達に依存せずに増殖開始のためT細胞へ第2の同時刺激シグナルを提供する。ワクチン性剤性を高めるこれらのストラテジーは、GM−ETA(dII)−E7中のGM−CSFと類似の様式でDC表面分子を使用し、DCに対する抗原の標的化、その後のDC分化の誘導ならびに抗原プロセシングおよび表示の増進を可能にする。
【0179】
Diptheria、Clostridium、Botulinum(テタヌス)、Bacillus、Yersinia、Vibrio cholerae(コレラ)またはBordetella pertussis毒素は、治療適用を有し得る細菌由来分子を示す。このような分子は、本発明のDNAワクチンにコードされる融合ポリペプチドにおけるETAドメインの分子と同様の様式で機能し得る。これらのドメインは、エンドソーム/リソソーム区画から細胞質への抗原のトランスロケーションを介するMHCクラスI表示の増進を生じ得る(特に、毒素をコードする遺伝子の毒性ドメインが、変異されるかまたは欠失される場合)。
【0180】
所定のポリペプチドまたはタンパク質フラグメントが、細胞質トランスロケート活性を有しており、従って本発明の融合タンパク質の中のドメインとして本発明の範囲内に入るかどうかの決定は、以下のように決定した。炭疽毒素致死因子(LF)を、外来タンパク質を真核生物細胞のサイトゾルへトランスロケートするように示した。これはDiphteria毒素の機構に似ている。Yersiniae細胞毒YopEおよびYopHは、トランスロケーションドメインとして有用であり、そして宿主細胞膜を横切りマクロファージのサイトゾルへの抗原の内面化に有用である。Bordetella pertussisアデニル化毒素(CyaA)は、細胞膜を介してサイトゾルへ直接トランスロケートし、従ってMHCクラスI抗原ハンドリングを高める。従って、本発明の融合タンパク質およびワクチン(例えば、GM−ETA(dII)−E7融合タンパク質におけるETA(dII)ドメイン)によって使用されるワクチン潜在性を高めるためのストラテジーは、これらの細菌毒のトランスロケーションドメインの生物学的機構と同様であり得る。これらのドメインは、抗原がエンドソーム/リソソーム区画からサイトゾルへ逃げることを可能にし得、MHCクラスI表示の増進を生じる。
【0181】
(実施例3:Pseudomonas外毒素AのトランスロケーションドメインをコードするDNAの抗原遺伝子との連結によるDNAワクチン潜在性の増進)
次の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を高めるおよびインビボで腫瘍を処置するために有効であることを示す研究を記載する。
【0182】
本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、ETAドメインおよびHPV−16 E7抗原を含む融合タンパク質をコードするDNAワクチンは、特に遺伝子銃で皮内に投与された核酸についてETAコード配列を有しないワクチンよりも多くの数の抗原提示細胞(APC)に対してE7の分布を導き得る。ポリペプチドドメインETA(dII)は、他の細胞による取り込みのためタンパク質を放出し得る。
【0183】
免疫学的アッセイは、ETA(dII)へ融合されたE7を用いるワクチン接種が、E7特異的CD4または抗体の優位な増加を伴わずにE7特異的CD8+T細胞前駆体頻度または抗体増進において30倍の増加を導くことを示した。インビトロの研究は、ETA(dII)−E7 DNAでトランスフェクトされた細胞が、野生型E7 DNAでトランスフェクトされた細胞よりも有効な様式でMHCクラスI経路を介してE7抗原を与えることを示した。さらに、ETA融合タンパク質でパルスされた骨髄由来樹状細胞は、野生型E7タンパク質でパルスされた樹状細胞よりも有効な様式でMHCクラスI経路を介してE7抗原を与えた。CD8+T細胞媒介免疫性の驚くほどの増進は、効力ある皮下腫瘍保護および肺転移の処置を導いた。これらのデータは、本発明の組成物および方法が、発現された抗原の広がりの増加によって抗原特異的DNAワクチン潜在性を高め得ることを示唆する。例えば、ETA抗原融合タンパク質またはキメラをコードするDNAワクチンの投与は、融合タンパク質(抗原を含むがETAドメインを欠いているポリペプチドをコードする同様のDNAワクチンに関連する)において発現される抗原の細胞内広がりを増加し得る。
【0184】
(実施例4:抗原コード配列のFL(Flt−3リガンド)配列への連結によるDNAワクチン効力の増強)
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強し、インビボでの腫瘍の処置に効果的であることを示す研究を記載する。
【0185】
Flt3−リガンド(FL)は、専門的な抗原提示細胞(特に樹状細胞)の産生において重要なサイトカインである。本発明は任意の特定の機構によって限定されないが、Flt3リガンドドメインが、免疫が望ましい抗原に連結する組換え分子(FLおよび抗原を含む融合タンパク質)が、抗原をAPC(例えば、樹状細胞)に標的化し得る。
【0186】
抗原としてHPV−16 E7を使用して、裸のDNAワクチンによって産生される抗原特異的な免疫の効力に対する、Flt3−リガンド(FL)抗原構築物(図19)の効果を評価した。配列番号25の残基1〜189は、FL由来であり、残基190−287は、E7由来である(配列番号25の288位の「Z」は、終止を示す)。FL−E7融合ポリペプチドをコードするDNA構築物を、遺伝子銃によって皮内に投与した。キメラFL/E7融合遺伝子を含むワクチンは、FLコード配列の非存在下で、野生型E7遺伝子を含むワクチンと比較してE7特異的CD+8T細胞の頻度を劇的に増加することが見出された。
【0187】
インビトロ研究は、FL/E7 DNAをトランスフェクトされた細胞が、野生型E7 DNAをトランスフェクトされた細胞よりも効率的な様式で、MHCクラスI経路を介するE7抗原を提示したことを示した。さらに、FL/E7融合タンパク質をパルスされた骨髄由来樹状細胞は、野生型E7タンパク質をパルスされた樹状細胞よりも効率的な様式で、MHCクラスI経路を介するE7抗原を提示した。より重要なことには、この融合は、あまり効率的ではないワクチンを、樹立されたE7発現転移性腫瘍に対して有意な効力を有するワクチンに変換した。興味深いことに、FL/E7融合ワクチンは、主に、CD8+T細胞を標的とし、そして抗腫瘍効果は、完全にCD4非依存性であった。これらのデータは、抗原をコードするものへのFlt3−リガンドDNAの融合がCD8依存性経路を介するDNAワクチンの効力を増強することを示した。
【0188】
(実施例5:抗原特異的免疫応答の増強を与えるHSP70のドメイン)
以下の実施例は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメントを含む第1ポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする本発明のキメラ核酸が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強し、インビボでの腫瘍の処置に効果的であることを示す研究を記載する。
【0189】
Mycobacterium tuberculosis HSP70のドメイン構造を決定した。少なくとも3つの機能的ドメインを同定した:ATPaseドメイン(配列番号9の残基1〜356を含む)、基質結合ドメイン(SD;配列番号9の残基357〜516を含む)、およびカルボキシ末端ドメイン(CD;配列番号9の残基517〜625を含む)(図16)。裸のDNAワクチンの効力に対するこのHSP70の各ドメインの寄与を決定した。各ドメインをコードするDNAは、インフレームで、すなわち作動可能に、パピローマウイルス抗原E7をコードするDNAに連結された。E7特異的CD8T細胞免疫応答を測定した。
【0190】
標準的な遺伝子銃DNA送達法を使用して、(i)HSP70遺伝子;(ii)野生型HPV−16 E7遺伝子;(iii)HSP70のATPaseドメインに融合したHPV−16 E7遺伝子(E7−ATP);(iv)HSP70の基質結合ドメイン(SD)に融合したHPV−16 E7遺伝子(E7−SD);または(v)HSP70の細胞質ドメイン(CD)に融合したHPV−16 E7遺伝子(E7−CD)を含むDNAワクチンで、C57BL/6マウスを皮内的にワクチン接種した。キメラE7/熱ショックタンパク質構築物のすべてを、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、pcDNA3.1(−)発現ベクターの複数クローニング部位にクローン化した(図17)。インビボ抗腫瘍免疫応答を、E7特異的CD8+T細胞媒介免疫を評価するために、E7特異的MHCクラスIペプチド(RAHYNIVTF;配列番号7のアミノ酸49〜57)を使用して細胞内サイトカイン染色によって分析した。
【0191】
図18Aは、E7特異的CD8+T細胞前駆体頻度を示す代表的なFASCANである。ワクチン接種されたマウス由来の脾細胞を、一晩、E7ペプチド(配列番号7のアミノ酸49〜57)でインビトロで培養し、そしてCD8発現と細胞内IFN−γとの両方について染色した。種々のDNA構築物(E7−HSP70、E7−ATP、E7−SD、E7−CD、またはE7のみ)で免疫されたマウスにおけるIFN−γ分泌CD8+T細胞前駆体の数を、フローサイトメトリーを使用して分析した。E7−HSP70 DNAをワクチン接種されたマウスが、最も多い数のE7特異的CD8+前駆体を生成した。E7−CDは、二番目に多い量のE7特異的CD8+前駆体を生成し、E7−HSP70のみに匹敵し得た(E7−SD、E7−ATP、および野生型E7より大きい)。
【0192】
IFN−γ−産生E7特異的CD8+T細胞の平均数は、図18Bに示される。細胞の数は、E7抗原ペプチド(配列番号7の残基49〜57)の存在下(黒塗り棒)および非存在下(白抜き棒)でフローサイトメトリーによって決定した。データは、3×105個の脾細胞当たりのCD8+IFN−γ+細胞の平均数±SEMとして表した。結果は、DNAワクチン構築物に組み込まれる場合、HSP70の細胞質ドメインをコードするDNAは、DNAワクチンによってコードされる標的抗原に対して免疫を生成する際におけるそのDNAワクチンの効力を増加することを示す。さらに、全長HSP70を含むDNAワクチンにおける抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答の増強の大部分を説明する。
【0193】
例えば、全長HSP70に融合されたE7を用いるワクチン接種は、E7特異的CD8+T細胞前駆体頻度において30倍増加を導いた(3×105個の脾細胞当たり約365個)(図18A〜B)。HSP70のATPドメインに融合したE7でのワクチン接種は、わずかに増加したE7特異的CD8+T細胞前駆体頻度を生成した(3×105個の脾細胞当たり約58個)。同様に、HSP70のSDドメインに融合したE7でのワクチン接種は、3×105個の脾細胞当たり約85個のE7特異的CD8+T細胞前駆体を生成した。対照的に、HSP70のCDドメインに融合したE7でのワクチン接種は、3×105個の脾細胞当たり約296個のE7特異的CD8+T細胞前駆体(全長HSP70に融合されたE7をワクチン接種されたマウスから得られる量に類似する量)を生成する。これらの結果は、HSP70のCDドメインが、DNAワクチンにおける増強された抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答の大部分を与えることを示す。
【0194】
これらのデータは、全長HSP70またはHSP70のCDドメイン(HSP70の他の部分をコードするDNAの非存在下)の、抗原ペプチド(例えば、HPV−16E7)への融合をコードするDNAは、抗原に対する抗原特異的CD8+T細胞免疫応答を非常に増強することを示す。免疫応答の増強は、CTL応答を刺激する際に重要であると考えられたATPaseドメインの領域(例えば、配列番号9の残基161〜370)においてより多くのN末端配列を欠く構築物において観測された。このデータは、HSPのCDドメインをコードする構築物を含むDNAワクチンが、他のHSP配列の不在下でさえ、DNAワクチンによってコードされる標的抗原に対する抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答を増強したことを示す。
【0195】
(実施例6:本発明の融合タンパク質を発現する自己複製RNAウイルスの投与が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答の生成を増強する)
1つの実施形態において、本発明は、本発明のキメラタンパク質(熱ショックポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインおよび少なくとも1つの抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインを含むタンパク質)を発現し得る自己複製RNAレプリコンを提供する。以下の実施例は、本発明の方法を使用して、これらの構築物が、インビボで抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強するのに効果的であることを示す研究を記載する。モデル系として、HPV−16 E7およびMycobacterium tuberculosis HSP70を含む融合タンパク質を、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター、SINrep5においてインビボで発現させた。このベクターにより作り出される抗原特異的免疫の効力を決定した。これらの結果はまた、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター中インビボで発現される熱ショックポリペプチドおよび抗原性ペプチドを含む融合タンパク質が、インビボで抗原特異的CTL応答を増強するのに効果的であることを示す。
【0196】
これらの実験は、E7/HSP70融合遺伝子を含むRNAレプリコンワクチンがワクチン接種されたマウスにおける野生型E7遺伝子を含むワクチンよりも有意に高いE7特異的T細胞媒介免疫応答を産生することを示した。さらに、インビトロ研究は、E7/HSP70 RNAレプリコントランスフェクトアポトーシス細胞由来のE7抗原が、骨髄由来樹状細胞により取り込まれ得、そして野生型E7 RNAレプリコントランスフェクトアポトーシス細胞よりも効率的にMHCクラスI経路を介して提示され得ることを示した。より重要なことには、HSP70のE7への融合は、あまり効果的でないワクチンをE7発現腫瘍に対して有意な効力を有するワクチンに変換した。この抗腫瘍効果は、NK細胞およびCD8+T細胞に依存した。これらの結果は、HSP70の抗原遺伝子への融合が、自己複製RNAワクチンの効力を大きく増強したことを示した。これらの結果は、E7をHSP70に連結するシンドビスRNAワクチンが、完全にCD4アームを迂回して、E7特異的CD8+T細胞およびNK細胞の増殖および活性化を劇的に増加し、そしてE7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じたことを示した。
【0197】
抗腫瘍効果を促進するためのシンドビスRNAワクチンの機構がさらに調査された。シンドビスE7/HSP70 RNAワクチンが宿主細胞のアポトーシス死を誘導し得、そして樹状細胞がこれらの細胞に食作用することを促進し得、E7特異的CD8+T細胞の増殖および活性化を劇的に増加し得る。この増強されたCD8応答は、E7発現腫瘍細胞株に対する強力な抗腫瘍性免疫を生じる。
【0198】
HPV−16 E7を、ワクチン開発に対するモデル抗原として選択した。なぜなら、HPV、特にHPV−16は、上記のように、大部分の頚部癌と関連するからである。
【0199】
(プラスミドDNA構築物および調製):ベクターpcDNA3−HSP70、pcDNA3−E7、およびpcDNA3−E7/HSP70が、Chen(2000)上記によって記載されるように作製された。シンドビスウイルスRNAレプリコンベクター、SINrep5は、Bredenbeek(1993)J.Virol.67:6439−6446によって記載されている。ベクターSINrep5−HSP70、SINrep5−E7、およびSINrep5−E7/HSP70は、pcDNA3−HSP70、pcDNA3−E7、およびpcDNA3−E7/HSP70をそれぞれ、Xba IおよびPme I制限酵素で切断することによって、Mycobacterium tuberculosis HSP70、HPV−16 E7およびキメラE7/HSP70を単離することによって作製された。消化された産物を、ゲルを使用して単離した。これらの単離されたDNAフラグメントは、さらに、SINrep5ベクターの対応するXabIおよびPml I部位にクローン化して、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、およびSINrep5−E7/HSP70構築物を作製した。これらの構築物の正確さを、DNA配列決定によって確認した。
【0200】
(インビトロRNA調製):SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70およびSINrep5からのRNA転写物の作製は、Mandl(1998)Nature Med 4:1438−1440によって記載されるプロトコルを使用して実行された。SpeIを使用して、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70およびSINrep5からのRNAレプリコンの合成のためのDNA鋳型を線形化した。RNAワクチンを、インビトロで転写し、そして販売業者のマニュアルに従って標準的なインビトロ転写キット(Life Technologies,Rockville,MD)からのSP6 RNAポリメラーゼおよびキャッピングアナログを使用してキャッピングした。合成の後に、DNAを、DNase Iで消化することによって枯渇した。合成されたRNAを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを使用して定量化し、分析した(例えば、Mandl(1998)上記を参照のこと)。精製されたRNAを、アリコートに分割して、動物のワクチン化のためおよびBHK21細胞株のトランスフェクションのために使用した。転写物のタンパク質発現を、エレクトロポレーションを使用して、RNAのBHK21細胞へのトランスフェクションによって評価した。
【0201】
(細胞株):乳児のハムスター腎臓(BHK21)細胞を、ATCC(Rockville、MD)から得、そして5%FBS、10%トリプトースホスフェートブロス、2mMグルタミン、および抗生物質で増殖させた。細胞を37℃で加湿された5%CO2雰囲気下で維持し、そして二日毎に継代させた。TC−1細胞の産生および維持を、Lin(1996)Cancer Res.56:21−26によって記載されるように行った。腫瘍チャレンジの日に、TC−1細胞を、トリプシン処理によって収穫し、1×Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、最後に、1×HBSS中で再懸濁して注射のために設計した濃度に再懸濁した。
【0202】
(SINrep5 RNAワクチンのE7タンパク質発現についてのELISA):SINrep5−E7およびSINrep5−E7/HSP70 RNAからのE7タンパク質の発現を、間接的なELISA法によって決定した。E7タンパク質の量を、SIN5rep−E7またはSINrep5−E7/HSP70トランスフェクトBHK21細胞からの細胞溶解物を使用して決定した。簡単に言うと、1000万個のBHK21細胞が、Liljestrom(1991)J.Virol.65:4107−4113によって記載されるように、エレクトロポレーションを介してそれぞれ、4μgのSINrep5、SINrep5−E7、SINrep5−HSP70またはSINrep5−E7/HSP70のRNA転写物をトランスフェクトされた。トランスフェクトされたBHK21細胞を、エレクトロポレーションの16〜20時間後に回収した。96マイクロウェルプレートを、最終容積100μlで種々のSINrep5 RNAをトランスフェクトされたコートされたBHK21細胞溶解物であり、4℃で一晩インキュベートした。細菌由来HPV−16 E7タンパク質を、ポジティブコントロールとして使用した。次いで、ウェルを20%ウシ胎仔血清を含むPBSでブロックした。希釈した抗E7Ab(Zymed、San Francisco、CA)を、ELISAウェルに加え、そして37℃で2時間インキュベートした。0.05%Tween−20を含むPBSで洗浄した後に、プレートを、1時間室温(RT)で、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed、San Francisco、CA)の1/2000希釈物とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、1−StepTM Turbo TMB−ELISA(Pierce,Rockford,IL)で展開し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、450nmで標準的なELISAリーダーで読んだ。次いで、細胞溶解物のE7タンパク質の量を、標準化されたE7タンパク質と比較することによって、計算し、決定した。
【0203】
(マウス):National Cancer Institute(Frederick,MD)からの6〜8週齢の雌性C57BL/6マウスを購入し、そしてJohns Hopkins Hospital(Baltimore,MD)の腫瘍学動物施設で飼育した。全ての動物の手順を、許可されたプロトコルに従い、実験動物の適切な使用および注意についての推奨に従って行った。
【0204】
(RNAワクチン接種):全てのSINrep5 RNAワクチンを、上記のようにインビトロ転写を使用して作製した。RNA濃度を、260nmで測定した光学密度によって決定した。RNA転写物の完全性および量を、さらに、変性ゲル電気泳動を使用してチェックした。マウスに、筋肉内で、SINrep5−E7/HSP70(これは、0.1、1および10μgの量で投与される)を除いて、10μgの種々のSINrep5 RNAを右後肢にワクチン接種した。
【0205】
(E7抗体についてのELISA):血清中の抗HPV16E7抗体を、Wu(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11671−1165によって記載されるように直接的なELISAによって決定した。96マイクロウェルプレートを、100μlの5μ/ml細菌由来HPV−16 E7タンパク質でコートし、そして4℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを20%ウシ胎仔血清を含むPBSでブロックした。血清を、免疫の14日後にマウスから調製し、連続的にPBSで希釈し、ELISAウェルに加え、そして37℃で2時間インキュベートした。0.05%Tween−20を含むPBSで洗浄した後に、プレートを、1時間室温(RT)で、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed、San Francisco、CA)の1/2000希釈物とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、1−StepTM Turbo TMB−ELISA(Pierce,Rockford,IL)で展開し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、450nmで標準的なELISAリーダーで読んだ。
【0206】
(INF−γについての酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)):脾細胞を、ワクチン接種の2週間後に収穫し、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49〜57)(Feltkamp(1993)Eur.J.Immunol.23:2242−2249を参照のこと)またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(例えば、Tindle(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5887−5891を参照のこと)とともに、24ウェル組織培養プレート中の10%(容積/容積)ウシ胎仔血清、50単位/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補充した総容積2mlのRPMI 1640中で6日間、培養した。上清を集め、製造業者のプロトコルに従って、ELISAキット(Endogen、Woburn、MA)を使用してIFN−γの存在についてアッセイした。
【0207】
(細胞傷害性Tリンパ球(CTL)アッセイ):CTLアッセイを、Corr(1999)J.Immunol.163:4721−4727によって記載されるように、96ウェル丸底プレートで行った。細胞溶解を、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の定量的測定によって決定した(例えば、Corr(1999)上記を参照のこと)。脾細胞を、RNAワクチン接種の2週間後に集め、そしてE7ペプチド(aa49〜57)とともに、24ウェル組織培養プレート中の10%(容積/容積)ウシ胎仔血清、50単位/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補充した総容積2mlのRPMI 1640中で6日間、エフェクター細胞として培養した。TC−1腫瘍細胞を標的細胞として使用した。TC−1細胞を種々のエフェクター/標的(E/T)比で脾細胞とともに混合した。5時間37℃でのインキュベーションの後に、50μlの培養培地を、CytoToxTMアッセイキット(Promega、Madison、WI)の製造業者のプロトコルに従って、培養培地におけるLDHの量を評価するために回収した。溶解の割合を、以下の式から計算した:100×(A−B)/(C−D)。ここで、Aは、実験エフェクターシグナル値の読みであり、Bは、エフェクター自発バックグラウンドシグナル値であり、Cは、標的細胞からの最大シグナル値であり、Dは、標的自発バックグラウンドシグナル値である。
【0208】
(細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析):ネイティブまたはワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、E7特異的CD4+Tヘルパー細胞前駆体を検出するために、MHCクラスIIペプチド(Tindle(1999)上記)を含むE7ペプチド(aa30〜67)とともにインキュベーションした。E7ペプチドを、20時間10μg/mlの濃度で加えた。GolgitopTM(PharMingen、San Diego、CA)を、培養物からの細胞を収集する6時間前に加えた。次いで、細胞を、FACScanTM緩衝液中で1回洗浄し、そしてフィコエリトリン(PE)結合モノクローナルラット抗マウスCD4抗体(PharMingen、San Diego、CA)で染色した。細胞を、製造業者(PharMingen)の指示に従って、Cytofix/CytopermTM キットを使用する細胞内サイトカイン染色に供した。FITC結合抗IFN−γ抗体および免疫グロブリンアイソタイプ制御抗体(rat IgG1)を、すべてPharMingenから購入した。分析を、CELLQuestTMソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry System,Mountain View,CA)を用いて、Becton Dickinson FACScanTMで行った。
【0209】
(インビボ腫瘍保護実験):腫瘍保護実験のために、異なった用量のSINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70および空のSINrep5 RNAワクチンを使用して、マウス(1群当り5匹)を筋肉内注射(IM)して免疫した。免疫14日後、マウスを尻尾の静脈における1×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞を使用して、静脈内注射(IV)した。3週間後、マウスを安楽死させた。各マウスにおける肺重量および肺小結節の数を、ブラインド様式の実験によって評価および計測した。
【0210】
(インビボ抗体枯渇実験):インビボ抗体枯渇のための手順は、例えば、Lin(1996)前出;Wu(1995)J.Exp.Med.182:1415−1421によって以前に記載されている。簡潔には、マウスを1μgの自己複製するSINrep5−E7/HSP70RNAを使用して筋肉内にワクチン接種し、そして、尻尾の静脈注射を介して1×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞を使用してチャレンジさせた。枯渇を腫瘍チャレンジの前1週間で開始した。MAbGK1.5(Dialynas(1983)J.Immunol.131:2445)をCD4枯渇のために使用し、MAb2.43 Sarimiento(1980)J.Immunol.125:2665)をCD8枯渇のために使用し、そして、MAb PK136(Koo(1986)J.Immunol.137:3742)をNK1.1枯渇のために使用した。フローサイトメトリー分析は、95%を超える適切なリンパ球サブセットが、他のサブセットの正常なレベルを有して枯渇される。腫瘍チャレンジ後21日目に枯渇が終了し得る。
【0211】
(細胞表面マーカー染色およびフローサイトメトリー分析):ネイティブなまたはワクチン接種されたマウスの群から取り出された脾細胞を、Ji(1999)Human Gene Therapy 10:2727−2740に記載されるような細胞表面マーカー染色を使用してすぐに処置した。次いで細胞を、FACSCANTM緩衝液およびPE結合体化モノクローナルラット抗マウス−NK1.1抗体およびFITC結合体化モノクローナルラット抗マウスCD3抗体(Pharmigen,San Diego,CA)を使用して1回洗浄した。NK細胞の集団を、抗NK1.1抗体を用いて染色し、そして抗CD3抗体を用いて染色されていなかった。種々の自己複製するRNAワクチンで免疫化したマウスのNK細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【0212】
(骨髄由来の樹状細胞(DC)の産生および培養):DCを、Lu(2000)J.Exp.Med.191:541−550によって記載されるようにGMC−SFの存在中で、骨骨髄細胞の培養によって生成した。簡単には、骨髄は、マウスの頚骨から選択される。赤血球が溶解され、そして、残りの細胞を、ナイロンメッシュを通して、骨および残渣の小さな部分を枯渇し得る。この細胞を回収し、そして、1×106細胞/mlをRMPI1640中(5%FCS、2mMβ−メルカプトエタノール、1%非必須アミノ酸、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Life Technologies,Pockville,MD)および100U/ml GM−CSF(PharMingen,San Diego,CA)で充填した)の24ウェルプレートにプレートした。培地のツーハイブリッドシステムを2日毎に交換し、そして、非粘着性細胞を7日目に収穫した。回収された細胞をフローサイトメトリー分析(FACS)によってDCマーカーについて特徴付けた。
【0213】
(E7−特異的CD8+T細胞株の産生):E7−特異的CD8+細胞株の産生を、Sig/E7/LAMP−1ワクシニアの腹腔内注射によって、雌マウスC57BL/6(H−2b)マウスを免疫することによって行なった。脾細胞を8日目に収穫した。最初のインビトロ刺激のために、6日間、20U/mlの濃度のIL−2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49−57)を使用してパルスした。E7特異的CTL細胞株の増殖を24ウェルプレート中でE7特異的なCTLを含む1×106脾細胞を3×106の照射された脾細胞と混合(2ml/ウェル)することによって、そして、20U/mlの濃度のIL−2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49−57)と共にそれらをパルスすることによって行なった。この手順を6日毎に反復した。E7 CTL株をCTLアッセイによって特徴付けた。フローサイトメトリーを行なって、CD8マーカーの発現を実証した。
【0214】
(インビトロ細胞死分析):以前に記述されるように、1000万個のBHK21細胞を4μgのSINrep5、SINrep5−E7、SINrep5−HSP70またはSINrep5−E7/HSP70 RNA転写産物とトランスフェクトした。ネイティブなBHK21細胞またはSINrep5 RNAなしでエレクトロポレーションしたBHK21細胞をコントロールとして使用した。BHK21細胞を回収し、そして、24時間毎に、72時間まで評価した。アポトーシスのおよび壊死のBHK21細胞の割合を、製造業者のプロトコルに従って、アネキシンVアポトーシス検出キット(PharMingen,San Diego,CA)を使用して分析し、フローサイトメトリーを後に続けた。
【0215】
(標的細胞としてアポトーシス細胞を用いてパルス化されたDCを使用するCTLアッセイ):標的細胞としてアポトーシス細胞でパルス化されたDCを使用するCTLアッセイが、改変を用いて、Albert(1998)Nature392:86−89;Albert(1998)J.Exp.Med.188:1359−1368によって記載されるプロトコルと同様のプロトコルを使用して行なわれる。簡潔には、1000万個のBHK21細胞を、エレクトロポレーションを介して、4μgの種々の自己複製SINrep5 RNAとトランスフェクトした。BHK21細胞をエレクトロポレーション後16〜20時間で回収した。SINrep5−E7、またはSINrep5−E7/HSP70 RNA転写産物でトランスフェクトされたBHK21細胞におけるE7タンパク質発現のレベルは、ELISAによって決定される場合、類似していた。次いで、3×105トランスフェクトされたBHK21細胞を、48時間、37℃で、1×105の骨髄由来DCと同時インキュベートした。次いで、これらの調製されたDCを標的細胞として使用し、そして、Db制限されたE7特異的CD8+T細胞をエフェクター細胞として使用した。CTLアッセイを、最終容量200μlで、種々の比率(1:1、3:1、9:1、および27:1)で共に混合したエフェクター細胞および標的細胞(ウェル当り1×104)を用いて行なった。37℃で5時間インキュベートした後、50μlの培養培地を回収して、上記のように、培養培地中のLDHの量を評価した。トランスフェクトされていないBHK21細胞、トランスフェクトされたBHK21細胞単独、未処理のDC単独、およびCD8+T細胞株単独と同時インキュベートすることは、ネガティブコントロールとして含まれる。
【0216】
(自己複製するRNA構築物の構築および特徴付け):プラスミドDNA構築物の作製および引き続く自己複製するSINrep5 RNA構築物の調製を上記のように行なった。SINrep5ベクターは、SindibisウイルスRNAレプリカーゼおよびSP6プロモーターをコードする遺伝子を含む(例えば、Bredenbeek(1993)前出)。SINrep5、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70 DNA構築物を図20Aに示す。さらに、SP6RNAポリメラーゼを使用するこれらのDNA構築物由来のRNA転写産物の概略図である。メチル化されたM7G「キャップ」は、mRNAの5’末端に位置し、自己複製(レプリカーゼ)についての原因のある配列、目的の遺伝子(すなわち、MHCクラスIペプチドエピトープ、E7、HSP70、E7/HSP70など)、およびポリアデニル化末端(AAAA)が後に続く。ELISAを行なって、種々の自己複製RNA構築物でトランスフェクトされたBHK細胞による、E7タンパク質の発現を実証する。SINrep5−E7およびSINrep5−E7/HSP70は、類似の量のE7タンパク質を発現した。
【0217】
(自己複製するSINrep5−E7/HSP70 RNAを用いるワクチン接種は、E7特異的細胞障害性免疫応答を増強する):CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍免疫性を誘導するための最も重要なエフェクターの1つである。SINrep5−E7/HSP70 RNAワクチンによって産生されるE7特異的なCD8+T細胞反応の量を決定するために、CTLアッセイが使用される。マウスを、筋肉内注射を介して、種々のSINrep5自己複製RNAワクチンで免疫した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。細胞障害性アッセイを行なうために、種々の自己複製SINrep5 RNAワクチンからの脾細胞を、エフェクター細胞として、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49−57)を使用して6日間培養した。TC−1腫瘍細胞は標的細胞として存在する。TC−1細胞を、種々のE/T(エフェクター/標的率)で脾細胞と混合した。細胞融解をLDHの定量的な測定によって、決定した。本明細書中にも示されているCTLアッセイは、2つの行なわれた実験の1つの代表的な実験である。
【0218】
自己複製RNA E7/HSP70ワクチンは、他のRNAワクチンと比較する場合、特異的な溶解の有意により高い割合を生じた(*:P<0.001、一方向のANOVA)。自己複製SINrep5−E7/HSP70は、他のSINrep5 RNAワクチン(P<0.001、一方向のANOVA)でワクチン接種されたマウスと比較して特定の溶解の有意により高い割合を生成した。SINrep5−E7/HSP70 RNAの特定の溶解を生成する能力は、自己複製SINrep5−E7RNA(32.7%対8.8%、E/T率45/1、P<0.001)の溶解性の約4倍であることが見出されている。
【0219】
(自己スプライシングSINrep5−E7/HSP70 RNAを用いるワクチン接種は、高レベルのINF−γを分泌するためのE7特異的CD8+を増強する):自己複製するSINrep5−E7/HSP70 RNAによって産生されるE7特異的なCD8+T細胞の免疫学的応答の程度を決定するために、ELISAが使用し、培養された脾細胞の上清におけるINF−γの濃度を検出する。マウスを、筋肉内注射を介して、種々のSINrep5自己複製RNAワクチンで免疫した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。種々の自己複製RNAワクチンからの脾細胞を、6日間、MHCクラスIエピトープを含む(かまたはいずれのペプチドも使用しない)E7ペプチド(aa49−57)を使用してインビトロで培養した。ネガティブコントロールとして、ELISAをまた、ペプチドなしで行なった。培養培地における上清を回収し、ELISAを使用して、INF−γ濃度を検出する。
【0220】
E7ペプチド(aa49−57)を使用して刺激された自己複製E7/HSP70 RNA群由来の脾細胞は、他のRNAワクチン(P<0.001、一方向ANOVA)と比較して、最も高い濃度のINF−γを分泌した。これらの結果はまた、HSP70のE7への融合が、INF−γ−分泌E7特異的CD8+T細胞活性を有意に増強する。従って、CD8+T細胞は、E7のMHCクラスIによって誘導され得る。注意:E7ペプチド(aa49−57)を用いて刺激した、自己複製E7/HSP70 RNA群から、群脾細胞は、他のRNAワクチン(*:P<0.001、一方向ANOVA)と比較して、最も高いINF−γの濃度を分泌した。
【0221】
(自己複製SINrep5−E7/HSP RNAを用いるワクチン接種は、有意なE7特異的CD4+T細胞媒介免疫応答を生成しない):これらのRNAワクチンのそれぞれによるE7特異的CD4+T前駆体細胞およびサイトカインプロフィールの生成を調べるために、当業者らは、免疫されたマウスから得られた脾細胞上のCD4表面マーカーおよび細胞内IFN−γについての二重染色を行ない、フローサイトメトリー分析を続けた。この脾細胞をE7ペプチド(aa30−67)を使用して一晩中インビトロで培養し、そして、CD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。E7ペプチド(aa30〜67)は、HPV−16のE7オープンリーディングフレームタンパク質における主なTヘルパーエピトープを含む(例えば、Tindle(1991)前出)IFN−γ分泌CD4+T細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して分析される。
【0222】
SINrep5−E7/HSP70 RNAを使用してワクチン接種したマウスは、SINrep5−E7 RNA(15/3×105脾細胞対12/3×105脾細胞、p>0.05)または他のRNA群を用いてワクチン接種したマウスと比較した類似した多数のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を作製した。空のプラスミド、E7、HSP70、またはE7/HSP70 RNAを使用してワクチン接種したネイティブなマウスを染色するフローサイトメトリーを使用して観察される多数のE7特異的なCD4+IFN−γ+細胞における有意な差異はない。ワクチン接種したSig/E7/Lami−1 DNAマウス(Ji(1999)前出)由来の脾細胞は、細胞内IFN−γ、この研究のために細胞内IFN染色のためのポシティブコントロールとして使用され得る。
【0223】
ワクチン接種されたマウスの血清における抗HPV16E7抗体の質を、種々の希釈(1:000、1:500、1:1000)でのワクチン接種後2週間で、直接酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して決定した。SINrep5−E7/HSP70は、他のRNAワクチン構築物によって産生される抗体に比較してワクチン接種されたマウスの血清におけるE7特異的抗体のより高い力価を生じなかった。
【0224】
(TC−1腫瘍の増殖に対する自己複製SINrep5−E/HSP70 RNAを使用するワクチン接種):自己複製SINrep5−E7/HSP70 RNAを使用するワクチン接種が、E7発現腫瘍に対して、マウスを保護するか否か決定するために、インビボ腫瘍保護実験は、右後脚において筋肉内投与された、SINrep5−E7/HSP70RNAの異なった用量を使用して行なった。マウスを同様に、10μgの自己複製SINrep5、SINrep5−HSP70、およびSINrep5−E7RNAでワクチン接種される。異なった用量の自己複製SINrep5−E7/HSP70RNA(0.1μg、1μgおよび10μgを含む)はまたマウスに注射された。ワクチン接種1週間後、マウスを、2×104細胞/マウスの用量で、静脈内尻尾静脈注射を介して、TC−1腫瘍細胞でチャレンジさせた。マウスを1週間に2回モニターし、そして、腫瘍チャレンジ後、21日目に屠殺した。この肺小結節を、腫瘍チャレンジ21日後に評価した。空のSINrep5(10μg)、SINrep5−HSP70(10μg)、SINrep5−E7(10μg)およびSINrep5−E7/HSP70 RNA(0.1μg、1μg、または10μg)を使用してワクチン接種した後、35日後に肺をマウスから解剖した。肺小結節の平均数は、HPV−16E7発現腫瘍増殖を制御する際に、種々の自己複製RNAワクチンの効果の測定として使用した。
【0225】
自己複製E7/HSP70RNAワクチン(0.1μg、1μg、および10μg)でワクチン接種したマウスの平均肺小結節を、他のRNAワクチン(P<0.001、1方向ANOVA)を使用してワクチン接種したマウスと比較すると、非常に低かった。これらの結果は、自己複製RNA SINrep5−E7/HSP70ワクチンが、0.1μgの低用量でさえ、静脈内腫瘍チャレンジからマウスを保護することを実証したが、インサートなしで10μgのSINrep5からのRNAでワクチン接種したが、10μgのSINrep5−E7、または10μgのSINprep5−HSP70は、TC−1腫瘍チャレンジから多数の肺小結節を発症する。
【0226】
(CD8+T細胞およびNK細胞は、SINrep5−E7/HSP70 RNAワクチンを用いるワクチン接種によって抗腫瘍効果が産生されるのに重要である):E7発現腫瘍細胞に対する保護のために重要であるリンパ球のタイプを決定するために、インビボ抗体枯渇(CD8+T細胞およびNK細胞の)実験を行なった(自己複製RNAワクチンで免疫したマウスの脾細胞由来のNK細胞の割合は、免疫しないものよりも高く、そして、種々の自己複製RNAワクチンの間のNK細胞の割合の間には有意な差異はみなれなかった)。この抗体枯渇は、腫瘍チャレンジの前1週間で始まり、腫瘍チャレンジ後の21日目に終了する。
【0227】
CD8+T細胞およびNK1.1細胞が枯渇したマウスの平均肺小結節は、非枯渇群のそれよりも有意に大きかった。さらに、NK1.1細胞の枯渇は、CD8+枯渇マウス由来の肺小結節腫瘍のより高い平均数を生じた。
【0228】
比較すると、CD4+Tが枯渇したマウス由来の平均肺小結節は、非枯渇のマウスから得られた結果と類似し、CD4+T細胞が、この効果を生成する際に重要でないことを示す。これらの結果は、CD8+T細胞が、SINrep5−E7/HSP70 RNAワクチンによって産出された抗原特異的抗癌免疫に必須であること、NK細胞(ここで、E7/HSP70 RNAワクチンに制限されない)が、同様に重要な役割を果たしていることを示唆する。
【0229】
NK細胞の効果がE7/HSP70ワクチンに限定され得るか否か、またはそれが使用されるベクターの結果であるか否かがまた調べられた。CD3(−)、NK1.1(+)細胞のフローサイトメトリー分析は、それらの存在が天然のマウスに比較した全ての構築物(E7/HSP70、E7、HSP70、およびコントロールプラスミド)におけるそれらの存在が顕著な増加するか否かを開示し、NK細胞が、E7/HSP70ワクチンに制限されない抗腫瘍効果の重要なエフェクターであることを示す。
【0230】
(自己複製RNAワクチン誘導アポトーシス):種々のプラスミドSINrep5RNAワクチンからインビトロでのRNA転写は、エレクトロポレ−ションを介して、BHK21細胞へトランスフェクトされる。RNAおよび不要なBHK21を有さないエレクトロポレ−ションされたBHK21細胞は、コントロールとして使用される。アポトーシスおよび壊死BHK21細胞は、アネキシンV−FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)によって染色され、フローサイトメトリー分析が後に続く。
【0231】
アポトーシス性BHK21細胞の割合は、SINrep5 RNAワクチンで24時間〜72時間(代表的には、SIN5−E7/HSP70 70.3±3.6%で24時間、49.3±4.2%で48時間、18.0±3.1%で72時間、P<0.001、一方向ANOVA)トランスフェクトされた場合、統計学的減少を開示した。SINrep5RNAワクチンでトランスフェクトされたBHK21細胞は、他の2つのコントロール群と比較して24、48または72時間後により高い割合を生じた。統計学的な差異は、種々のSINrep5 RNAのアポトーシスの割合において見出されなかった。
【0232】
(SINrep5−E7/Hsp70 RNAを使用してトランスフェクトした細胞でパルス化した樹状細胞におけるMHCクラスI経路を介してE7の増強された提示):増強されたインビボにおけるE7特異的CD8+T細胞免疫応答についての推定機構は、種々のE7構築物を発現する細胞からアポトーシス性体の取り込みによってMHCクラスI経路を通る、E7の提示であり、また「交差プライミング」ともいう。関連プライミング実験は、種々の自己複製RNAとトランスフェクトされたBHK21細胞からアポトーシス体でパルス化した樹状細胞におけるE7を提示するMHCクラスIを特徴付けるために行なわれる。以前に記載されるように、BHK21細胞は、異なったE7含有自己複製RNAでトランスフェクトした細胞における安定して高いトランスフェクション効率および類似のE7発現を有することが示されている。トランスフェクトされたBHK21細胞は、骨髄由来のDCと同時インキュベートされる。DCは、標的細胞として使用されるが、E7特異的CD8+T細胞は、エフェクター細胞として機能する。種々のE/T比率を有するCTLアッセイが行なわれる。
【0233】
SINrep5−E7/HSP70 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞と同時インキュベートしたDC標的細胞は、SINrep5−E7(P<0.001)でトランスフェクトしたBHK21細胞で同時インキュベートしたDCと比較して、有意により高い割合の特異的な溶解を生じた。これらの結果は、樹状細胞が、E7/HSP70融合タンパク質を含むアポトーシス体を用いてパルス化した樹状細胞が、野生型E7タンパク質を含むアポトーシス体でパルス化された樹状細胞よりもより効率的にMHCクラスI経路を介して、E7抗原を提示することを示唆する。従って、HSP70のE7への融合は、E7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強する;および、本発明は、いずれの特定の機構によっても制限されないが、その増強は「交差プライミング」を介して起こるようである。
【0234】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それにも関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が行なわれ得る。従って、他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【0235】
種々の図中の同様の参照記号は、同様のエレメントを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1Aは、ELISPOTアッセイの結果を示す棒グラフである。IFN−γ産生E7特異的CD8+T細胞前駆体の数を、ELISPOTアッセイを使用して決定した。スポットの数は、各ワクチン接種をした群における3回の標準誤差の平均である。E7−HSP70 DNAでワクチン接種したマウスは、最も高いIFN−γ+スポット数を生じた。示されたデータは、E7特異的スポット形成細胞を表す(E7 CTLペプチドの非存在下で検出されるスポット数を減算している)。図1Bは、フローサイトメトリー分析の結果を示す図である。ワクチン接種したマウス由来の脾臓を、一晩E7ペプチド(残基49−57;RAHYNIVTF;配列番号5)と共にインビトロで培養し、そしてCD8および細胞内IFN−γの両方について染色した。種々の組換えDNAワクチンで免疫化したマウス中のIFN−γ分泌CD8+T細胞前駆体の数を標準的なフローサイトメトリーにより分析した。E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、最も高いIFN−γ+CD8+二重陽性T細胞を生じた。3×105の脾細胞中のCD8+IFN−γ+二重陽性T細胞の数を、上段右角に示す。図1A〜Bに示されるデータは、E7−HSP70 DNAワクチンで免疫化したC57BL/6マウス中のE7特異的CD8+T細胞前駆体の頻度を示す。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、HSP70 DNA (E7+HSP)と混合した、空のプラスミド、(pcDNA3)、HSP70 DNA(HSP)、E7 DNA(E7)、E7−HSP70 DNA(E7/HSP)もしくはE7 DNAで免疫化するか、またはワクチンを受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、2μgのDNA/マウスを2回与えた。脾細胞を、最後のDNAワクチン接種の10日後に収集した。
【図2】
図2は、種々の組換えDNAワクチンを接種したマウス中のIFN−γ分泌E7特異的CD4+細胞のフローサイトメトリー分析の図である。C57BL/6マウスを、図1A〜1Bに記載されるように免疫化した。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、一晩E7ペプチド(残基30〜67;DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRL;配列番号6)と共にインビトロで培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。IFN−γ分泌CD4+T細胞の数を、フローサイトメトリーにより分析した。E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAをワクチン接種したマウスと比較して、匹敵するCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成する。3×105の脾細胞中のCD4+IFN−γ+二重陽性T細胞の数は、上段右角に示される。
【図3】
図3は、種々の組換えDNAワクチンで免疫化したC57BL/6マウスにおけるE7−特異抗体応答を示す棒グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、コントロールプラスミド(挿入なし)、野生型HSP70、野生型E7またはE7−HSP70 DNAで免疫化した。ワクチン接種の14日後に、免疫化したマウスから血清サンプルを得た。E7−特異的抗体の応答を、血清の連続希釈物を使用して、ELISAにより検出した。1:80希釈からの結果を示し、これは、450nmSEにおける平均吸光度(O.D.)を示す。
【図4】
図4Aおよび4Bは、E7−HSP70 DNAを用いるワクチン接種が、TC−1腫瘍の増殖に対してマウスを保護することを示す線グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、空のプラスミド(pcDNA3)、HSP70 DNA(HSP)、E7 DNA(E7)、またはE7−HSP70 DNA(E7/HSP)で免疫化した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスあたり5×104のTC−1細胞を用いて、マウスを右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、1週間に2回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。TC−1チャレンジの60日後、腫瘍を有さないマウスを、マウスあたり5×104のTC−1細胞を、マウスを右脚において皮下に再チャレンジした。図4Aに示したデータを作成するために、各マウスに2μgのDNAワクチンを受けさせた。1週間後、このマウスを、1回目のワクチン接種と同じ型かつ同じ量のDNAを再ワクチン接種させた。図4Bに示したデータを作成するために、各マウスを、さらなるブースターなしで、2μgのDNAワクチンの1回の注射のみを受けさせた。
【図5】
図5Aおよび図5Bは、E7−HSP70 DNAを用いるワクチン接種が、既存のTC−1腫瘍細胞を根絶することを示す線グラフである。各マウスを、初めに、2×104TC−1細胞を用いて皮下にチャレンジし、続いて、遺伝子銃を使用して、空のプラスミド(pcDNA3)、HSP70 DNA(HSP)、E7 DNA(E7)、またはE7−HSP70 DNA(E7/HSP)をDNAワクチン接種させた。このマウスを、1週間に2回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。図5Aに示したデータを作製するために、各マウスに、腫瘍チャレンジの3日後および10日後に2μgのDNAワクチンを受けさせ、そして図5Bのために、各マウスに、腫瘍チャレンジの3日後のみに2μgのDNAワクチンを受けさせた。ならなるブースターは与えなかった。
【図6】
図6は、E7−HSP70 DNAにより生成された抗腫瘍免疫性が、E7遺伝子配列へのHSP70 DNA配列の融合を必要とすることを示す、線グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、HSP70 DNA(E7+HSP)と混合したE7−HSP70 DNA(E7/HSP)もしくはE7 DNAで免疫化したか、またはワクチンを受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、1匹のマウスあたり2μgのDNAを1回だけ与えた。そのワクチン接種の1週間後、マウスを、1匹のマウスあたり5×104のTC−1細胞で、右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、1週間に2回、触診法および視診により腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図7】
図7は、E7−HSP70 DNAワクチンの効力に対するリンパ球サブセット抑制の効果を示す、直線グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して2μgのE7−HSP70 DNAで免疫化し、そして1週間後、2μgのE7−HSP70 DNAでチャレンジした。最後のワクチン接種の2週間後、マウスを、1匹のマウスあたり5×104のTC−1細胞を用いて、右脚において皮下にチャレンジした。細胞抑制は、腫瘍チャレンジの1週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジ後40日続いた。MAb GK1.5をCD4抑制のために使用し、MAb 2.43をCD8抑制のために使用し、そしてMAb PK136をNK1.1抑制のために使用した。フローサイトメトリー分析は、95%を越える適切なリンパ球サブセットが他のサブセットの正常なレベルで抑制されたことを明らかにした。このマウスを、一週間に2回、触診法および視診により腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図8】
図8は、GM−ETA(dII)−E7、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)、E7の構築物の図である。
【図9】
図9は、GM−ETA(DII)−E7 DNAワクチンで免疫化したC57BL/6マウスにおけるE7−特異的CD8+T細胞前駆体を決定するために行った、細胞内サイトカイン染色を示すフローサイトメトリー分析の図である。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して皮内に、GM、ETA(dII)、E7、GM−ETA(dII)、ETA(DII)−E7、GM−E7またはGM−ETA(DII)−E7遺伝子挿入物を有するプラスミドDNAまたは「空の」プラスミドベクターで免疫化したか、またはワクチン接種を受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、1匹のマウスあたり2μgのDNAを2回与えた。最後のDNAワクチン接種の10日後に脾臓を収集した。ワクチン接種したマウス由来の非細胞を、E7ペプチド(残基49〜57;配列番号5)と共に一晩インビトロで培養し、そしてCD8および細胞内IFN−γの両方について染色した。種々の組換えDNAワクチンで免疫化したマウスにおけるIFN−γ分泌CD8+T細胞前駆体の数を、フローサイトメトリーにより分析した。GM−ETA(DII)−E7 DNAをワクチン接種したマウスは、最も高いIFN−γ+CD8+二重陽性T細胞を生じた。
【図10】
図10は、種々の組換えDNAワクチンをワクチン接種したマウスにおけるIFN−γ分泌E7−特異的CD4+細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。C57BL/6マウスを、図2について上記するように免疫化した。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、一晩、E7ペプチド(残基30−67;配列番号6)と共にインビトロで培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。IFN−γ分泌CD4+T細胞の数を、フローサイトメトリーにより分析した。GM−ETA(DII)−E7 DNAをワクチン接種したマウスは、GM−E7 DNAをワクチン接種したマウスと比較して匹敵するCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生じた。GM−ETA(dII)−E7をワクチン接種したマウスは、空のプラスミド(pcDNA3)、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)またはE7 DNAで免疫化したマウスよりも多数のE7特異的CD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生じた。
【図11】
図11は、GM−ETA(DII)−E7 DNAでのワクチン接種が、TC−1腫瘍に対してマウスを防護することを示す線図である。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、1匹のマウスあたり2μgの空のプラスミド(pcDNA3)、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)、E7 DNAまたはGM−ETA(dII)−E7 DNAで免疫化した。1週間後、このマウスを、1回目のワクチン接種と同じ型かつ同じ量のDNAを再ワクチン接種させた。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを、1匹のマウスあたり5×104TC−1細胞を用いて、右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、1週間に2回、腫瘍増殖の証拠について、触診法および視診によりモニターした。TC−1チャレンジの60日後、腫瘍を有さないマウスを、1匹のマウスあたり5×104TC−1細胞を用いて、右脚において皮下に再チャレンジした。
【図12】
図12は、GM−ETAdII−E7 DNAワクチンの効力に対するリンパ球サブセットの抑制の効果を示す、線図である。C57BL/6 マウスを、遺伝子銃を使用して2μgのGM−ETAdII−E7 DNAで免疫化し、そして1週間後、2μgのGM−ETAdII−E7 DNAをブーストした。最後のワクチン接種の2週間後、マウスを、1匹のマウスあたり、5×104のTC−1細胞を、右脚において皮下に再チャレンジした。抑制は、腫瘍のチャレンジの1週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジ後、示された日数続いた。MAb GK1.5(Dialynasら,1983,J.Immunol.131:2445−2451)を、CD4について使用し、MAb2.43(Sarmientoら,1980,J.Immunol.125:2665−2672)をCD8抑制について使用し、そしてMAb PK136(Kooら,1986,J.Immunol.137:3742−3747)をNK1.1抑制について使用した。フローサイトメトリー分析は、適切なリンパ球サブセットの95%以上が、他のサブセットの正常なレベルに枯渇したことを明らかにした。マウスを、1週間に2回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図13】
図13は、E7−HSP70免疫原性構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である。
【図14】
図14は、GM−ETA(dII)−E7免疫原構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である。この構築物のGM−CSF部分、ETA(dII)、およびE7部分を、ブラケットで示す。
【図15】
図15は、ETAのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である(シグナル配列なし)。免疫原構築物を作成する際に使用される残基247−417(および対応するヌクレオチド配列)に、ブラケットを付す。
【図16】
図16は、全長Mycobacterium tuberculosisHSP7Oタンパク質(配列番号9)のドメイン構造を示す図である。ATPaseドメイン(残基1−356)に下線を付し;基質結合ドメイン(SD;残基357−516)は斜体であり、そしてC末端ドメイン(CD:残基517−625)は太字である。
【図17】
図17は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるプラスミド構築物の図である。キメラE7/熱ショックタンパク質構築物のすべて(E7−HSP7O、E7−ATP、E7−SD、E7−CDおよびE7)を、サイトメガロウイルスプロモーターの下流の、発現ベクターのマルチプルクローニング部位へクローン化した。
【図18】
図18Aは、Hspフラグメント−抗原キメラ(E7−HSP7O、E7−ATP、E7−SD、E7−CDおよびE7)をコードする核酸構築物を含む組換えDNAワクチンで免疫化したマウス中のIFN−γ E7−特異的CD8+細胞のフローサイトメトリー分析の図である。図18Bは、IFN−γ産生E7−特異的CD8+T細胞の平均の数を示す棒グラフである。
【図19】
図19は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるプラスミド構築物の図である。
【図20】
図20Aは、SlNrep5、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70 DNA構築物の概略図を示す。図20Bは、上記の実施例6に詳細に記載されるSP6 RANポリメラーゼを使用するこれらのDNA構築物に由来するRNA転写物の概略図を示す。
(関連出願)
本出願は、2000年2月9日に出願された米国特許出願番号(「USSN」)09/501,097号(これは1999年10月20日に出願されたUSSN09/421,608のCIPである)の一部継続(CIP)である。上述の出願はそれぞれ、それらの全体が、そして全ての目的のために、明白に本明細書中で参考として援用される。
【0002】
(連邦支援調査についての陳述)
本発明は、国立衛生研究所の助成金RO1 CA72631−01およびRFA CA−95−020のもと連邦政府の支援によってなされた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【0003】
(技術分野)
本発明は、一般的に、免疫学および医学に関する。本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)、Flt−3リガンド(FL)またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインおよび抗原性ポリペプチド(例えば、腫瘍関連抗原または病原体に由来する抗原)を含むキメラ分子を用いて、抗原特異的免疫応答(例えば、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答)を増強するための組成物および方法を提供する。従って、本発明の1つの実施形態は、DNAワクチンに関連する。
【0004】
(背景)
抗原特異的免疫治療は、新生物細胞に対して特異的な免疫を開発し得、一方、正常細胞を攻撃しないので、癌の制御のためのアプローチとして最近現れた。DNAワクチン接種は、抗原をコードするDNA(それ自身は抗原ではない)が被験体に注入される点で、伝統的なワクチン接種と異なる。抗原の産生(すなわち、ワクチンのDNAによってコードされた抗原の発現)は、ワクチン接種された個体の体内で起こる。しかし、従来のDNAワクチンは、制限を有する。例えば、ほとんどのDNAワクチンの主要な欠点は、それらの効力である。
【0005】
(要旨)
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列を含む第1のポリペプチドドメイン、および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。このキメラ核酸の融合タンパク質産物はまた、いくつかのドメインを有し得、任意の順序で、HSPドメインのカルボキシ末端フラグメント、FLドメイン、ETA dIIドメイン、またはGM−CSFドメインの任意の組合せを含む。他のドメインはまた、例えば、融合ポリペプチドを精製するかまたはインサイチュでポリペプチドを同定するなどの際の補助のために付加され得る。代替の実施形態において、第1のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第2のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して5’側にあり、そして第2のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第1のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して5’側にある。従って、このキメラ核酸の融合タンパク質産物は第1のポリペプチドドメインに対してアミノ末端かカルボキシ末端かのいずれかに、抗原性ポリペプチドを有し得;たとえキメラ核酸が2より多いドメインをコードしても、ドメインの任意の順序が受容され得る。
【0006】
1つの実施形態において、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメントは、シャペロン活性(例えば、ペプチドシャペロン活性)を有する。熱ショックタンパク質(HSP)(またはその核酸コード配列)は、例えば、ヒトまたは細菌のHSPを含む任意の生物に由来し得る。HSPは、Mycobacterium(例えば、Mycobacterium tuberculosis)に由来するHSP70のような熱ショックタンパク質70(HSP70)を含み得る。熱ショックタンパク質(HSP)は、配列番号9の残基312〜625によって示される配列、または配列番号9の残基約517〜残基約625によって示される配列、あるいはそれらの機能的等価物を含み得る。
【0007】
代替の実施形態において、Flt−3リガンドポリペプチド(またはその核酸をコードする配列)は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。Flt−3リガンドポリペプチドは、配列番号25の残基約1〜残基約189によって示される配列を含み得る。
【0008】
代替の実施形態において、細胞質トランスロケーションドメイン(またはその核酸コード配列)は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。細胞質トランスロケーションドメインは、毒素(例えば、細菌(例えば、Pseudomonas)由来の毒素(例えば、Pseudomonas外毒素A(ETA dII))に由来し得、例えば、ETA dIIは、配列番号3の残基約247〜残基約417によって示される配列を含む。Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインはまた、配列番号3の残基約253〜残基約364によって示される配列を含む。
【0009】
代替の実施形態において、GM−CSF配列(またはその核酸コード配列)は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。GM−CSF配列は、GM−CSFフラグメント(例えば、ジスルフィド架橋を含むフラグメント)であり得る。GM−CSFフラグメントはまた、配列番号1の残基約18〜残基約22、または残基約34〜残基約41、または残基約38〜残基約48、または残基約52〜残基約61、または残基約94〜残基約115、または残基約95〜残基約111で示されるような配列を含み得る。
【0010】
1つの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、MHCクラスI結合ペプチドエピトープを含む。MHCクラスI結合ペプチドエピトープは、長さが約8のアミノ酸残基と約11、または約15、または約25、または約50のアミノ酸残基との間であり得る。抗原性ポリペプチドは、任意の病原体または微生物に由来し得る。代替の実施形態において、抗原性ポリペプチドは、ヒトウイルス(例えば、ヒトパポバウイルス)のようなウイルスに由来し得る。パポバウイルスは、ヒトパピローマウイルス−16(HPV−16)のようなヒトパピローマウイルス(HPV)であり得る。抗原性ポリペプチドは、ヒトパピローマウイルスE6ポリペプチドまたはヒトパピローマウイルスE7ポリペプチドを含み得る。このウイルスはまた、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(例えば、HIV−1)のようなレンチウイルスであり得る。
【0011】
抗原性ポリペプチドが由来し得る他の病原体としては、ほんのいくつかを挙げると、マラリア、ウシウイルス性下痢症ウイルス、サイトメガロウイルス、脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスが挙げられる。
【0012】
抗原性ポリペプチドはまた、腫瘍特異的または腫瘍関連ポリペプチドであり得る。腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドは、腫瘍細胞の表面に発現される抗原を含み得る。腫瘍特異的または腫瘍関連ポリペプチドは、変異体p53、MAGE−1またはMAGE−3であり得る。
【0013】
1つの実施形態において、核酸は、細胞質のトランスロケーションポリペプチドドメインを含む第3のポリペプチドドメインをさらに含むキメラポリペプチドをコードする。従って、本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインまたは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列(あるいは任意のそれらの組合せ)を含む第1のポリペプチドドメイン、抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン、および細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインを含む第3のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。上記のように、これらのドメインは、任意の順序でキメラ核酸またポリペプチドに存在し得る。
【0014】
細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、任意の供給源(例えば、ヒトおよび細菌など)に由来し得る。細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、Pseudomonas外毒素A(ETA)の細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。Pseudomonas外毒素A(ETA)の細胞質トランスロケーションドメインは、配列番号3の残基約253〜残基約364によって示される配列を含み得る。細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、細菌毒素(例えば、Diptheria、Clostridium、Botulinum、Bacillus、Yersinia、Vibrio cholerae、またはBordetella pertussisに由来する毒素)のような病原体毒素の細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。第3のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第1または第2のドメインをコードする核酸に対して5’側に位置するか、第1または第2のドメインをコードする核酸の間に位置するか、または第1または第2のドメインをコードする核酸に対して3’側に位置する。
【0015】
核酸は、さらに、転写調節配列(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)あるいは翻訳調節配列のような調節核酸配列を含み得る。
【0016】
本発明は、本発明のキメラ核酸を含む発現カセット(例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス)を提供し、これは、例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインを含む第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む。発現カセットは、少なくとも1つのプロモーターおよび1つのコード配列を含む。プロモーターは、構成的、誘導的および組織特異的であり得る。発現カセットはまた、細胞質トランスロケーションドメインに対するコード配列を含み得る。発現カセットはまた、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター(例えば、自己複製RNAベクターSINrep5)のような自己複製RNAレプリコンを含み得る。
【0017】
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインを含む第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む形質転換された細胞を提供する。この核酸はまた、細胞質トランスロケーションドメインに対するコード配列を含み得る。
【0018】
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメインを含む第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドを提供する。融合タンパク質は、マルチドメイン化され、本発明のキメラ核酸に対して類似であり得る。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。第1のポリペプチドドメインは、第2のポリペプチドドメインに、非共有結合的に結合し得る。あるいは、第1のポリペプチドドメインは、第2のポリペプチドドメインに共有結合的に結合し得、例えば、それは、組換えタンパク質であり得る。キメラポリペプチドが、マルチドメイン化される場合、結合/融合タンパク質スキームの任意の組合せが考案され得る。
【0019】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸(本発明のキメラ核酸)、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセット(例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス)、またはキメラポリペプチドを含む薬学的組成物を提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン;ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。
【0020】
薬学的組成物は、任意の処方物を含み得、例えば、それは、リン脂質によって処方され得、リポソームを形成し得る。この薬学的組成物は、例えば、経口または非経口投与あるいは銃式(ballistic)投与などに適し得る。この薬学的組成物は、任意の適切な投薬または形態(例えば、錠剤、液体、吸入剤、および注射/銃式のための粒子など)であり得る。
【0021】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチドを含むDNAワクチンを提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン;ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む。融合タンパク質また、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。
【0022】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸またはキメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む粒子を提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドを含む。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。この粒子は、粒子のボンバードメントに適切な任意の材料(例えば、金)を含み得る。
【0023】
本発明は、免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド(このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および抗原性ポリペプチドドメインを含む第2のポリペプチドを含む)、あるいは核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含むDNAワクチンを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、有効量でのこの組成物の投与は免疫応答を誘発する。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。この方法は、優先的T細胞応答(例えば、優先的細胞傷害性T細胞応答)のような細胞性応答を含む免疫応答を誘発し得る。この方法において、キメラポリペプチドをコードする核酸またはベクターは、裸のDNA分子として投与され得る。本発明の核酸(例えば、裸のDNA)は、遺伝子銃または等価物によって投与され得る。あるいは、この方法において、この組成物はリポソーム処方物として投与され得る。組成物は、吸入剤などによって皮内投与され得る。
【0024】
本発明はまた、病原体による感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド(ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および病原体に由来する抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含む)、あるいは核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含むDNAワクチンを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、この組成物の投与は、その病原体に対する免疫応答を誘発する。
【0025】
本発明はまた、腫瘍抗原に対する哺乳動物のワクチン接種の方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド(ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;および腫瘍抗原を含む第2のポリペプチドを含む)、あるいは、核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含む組成物の有効量を含むDNAワクチンを投与する工程を包含し、ここで、この組成物の投与は、その腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する。
【0026】
本発明はまた、抗原に対して哺乳動物をワクチン接種のための薬学的処方物を調製するための組成物の使用を提供し、ここで、この薬学的処方物は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、キメラポリペプチド、またはそれらの組合せを含み、ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン;ならびに腫瘍抗原を含む第2のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【0027】
本発明の1以上の実施形態の詳細は、添付される図面および以下の記述に記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、この記述および図面から、そして特許請求の範囲から明白である。
【0028】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、全ての目的において、本明細書中に参考として説明的に援用される。
【0029】
(詳細な説明)
本発明は、キメラポリペプチドをコード新規キメラ核酸、インビボおよびインビトロの両方でこれらのポリペプチドを発現するための構築物、単離されたキメラポリペプチド、薬学的組成物、ならびにこれらの組成物を作製する方法および使用する方法を提供する。これらの組成物および方法は、選択された抗原の免疫原生性を刺激するかまたは増強するか、またはその免疫原に特異的な細胞性免疫応答を刺激するかもしくは増強するために特に有用である。本発明の核酸は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)配列を含む第1のポリペプチドドメイン、および抗原ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインを含む。
【0030】
本発明の1つの実施形態は、キメラ核酸によりコードされる標的抗原の免疫原性(例えば、DNAワクチン)が、熱ショックタンパク質(Mycobacterium tuberculosis熱ショックタンパク質 70(HSP70)(例えば、配列番号9を参照のこと)のカルボキシ末端タンパク質、またはFlt−3リガンド(例えば、配列番号25を参照のこと)または顆粒−マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)(配列番号1)または細胞質トランスロケーションドメイン(例えば、Pseudomonas ETA dII 配列番号3を参照のこと))をコードする第1のドメイン;ならびに抗原(例えば、病原体または腫瘍由来の抗原性ペプチド)をコードする第2のドメインを含むDNAのキメラ核酸中に存在することにより増強されるという発見に基づく。従って、本発明は、DNAワクチンの効力(従って、臨床効率)を有意に増強するワクチン接種の組成物および方法を提供する。
【0031】
1つの実施形態では、本発明のキメラ核酸は、熱ショックタンパク質(HSP)(例えば、HSP70)のカルボキシ末端ドメイン(CD)を含む第1のドメイン(第1ドメインDNAによりコードされる)および第2のドメイン(第2ドメインDNAによりコードされる)(例えば、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI制限抗原(例えば、MHCクラスI−結合ペプチドエピトープ))を含むキメラポリペプチドを含む免疫原性組成物をコードする。1つの実施形態では、タンパク質のカルボキシ末端フラグメントは、少なくとも10アミノ酸長であるポリペプチドまたはペプチドであり、そして天然に存在するタンパク質の半分のカルボキシ末端に由来する。例えば、HSP70のカルボキシ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列が配列番号9のおおよそ残基312〜約625にわたるHSP70の部分に由来するペプチドであり;このペプチドは、これらの残基のコード領域にわたるDNAによりコードされる。カルボキシ末端ドメイン(CD)フラグメントはまた、配列番号9の残基約517〜約625のアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【0032】
例えば、この免疫原性組成物は、配列番号9の残基517〜625のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAを含む第1のドメイン、および(必要に応じて連結される)MHCクラスI制限抗原をコードする第2のDNAを含む第2のドメインを含むキメラポリペプチドを含み得る。従って、本発明は、パピローマウイルスE7−HSP70−CD融合ポリペプチド、ならびに融合ポリペプチドをコードするキメラ核酸(DNA)を含み得る。必要に応じて、組成物は、HSP70のアミノ末端フラグメント由来の残基を含むポリペプチド(例えば、配列番号9の残基161〜370)をコードするDNAを含む。DNA成分(例えば、第1および第2(ならびに必要に応じて第3の)のDNA)が作動可能に連結される(すなわち、組換えタンパク質上のドメイン上にアレンジされる)順序は、免疫原性に影響することなく変更され得る。例えば、HSPをコードする(またはFlt−3リガンドをコードするか、もしくは細胞質トランスロケーションドメインをコードする)DNA配列は、抗原をコードする配列に対して5’または3’に配置される。1つの実施形態では、抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)が、HSP由来残基、Flt−3リガンド由来残基または細胞質トランスロケーションドメイン由来残基に対してアミノ末端に配置される、DNA構築物が、組み合えポリペプチドをコードするように、これらのポリペプチドをコードする核酸ドメインは、インフレームである(すなわち、DNAは、作動可能に連結される)。
【0033】
以下で議論されるように、抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)は、病原体(例えば、ウイルス)、癌組織(例えば、腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチド)に由来し得る。本発明のDNAワクチンは、発現カセット(例えば、HSPまたはFlt−3リガンドまたは細胞質移動ドメインのカルボキシ末端フラグメントをコードする第1のDNAならびに(必要に応じて連結される)抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)をコードする第2のDNAを含む発現ベクターまたはプラスミドベクター)を含み得る。本発明の治療法は、本明細書中に記載される免疫原性組成物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物において抗原に対する細胞毒性T細胞応答を誘導する方法を含む。
【0034】
代替的な実施形態では、本発明のキメラ核酸または免疫原性組成物は、以下の成分を含む:(a)専門的な抗原提示細胞(APC)に結合するポリペプチド、または、HSPのカルボキシ末端フラグメント、Fit−3リガンドもしくはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)をコードする配列を含む第1のDNA;(b)細胞質トランスロケーターポリペプチド(例えば、ETA dIIを含む)を含む第2のDNA、および(c)抗原(例えば、MHCクラスI制限抗原)をコードする配列を含む第3のDNA。第1、第2および第3のDNAは、作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」は、1つのポリペプチドをコードするDNA配列が別のポリペプチドをコードする別のDNAにインフレームで結合されて、組換えキメラ(すなわち、「融合」)タンパク質を生成することを意味する。作動可能に連結されたDNAメッセージの翻訳は、キメラポリペプチドまたは融合遺伝子産物を生じる。本発明は、キメラ核酸およびキメラポリペプチドを含み、ここで全ての可能な組み合わせで連結される(すなわち、第1、第2および第3のDNAが作動可能に連結される順序は、無関係である)。
【0035】
構築物(例えば、発現カセット、ベクターなど)はまた、調節配列(例えば、転写調節配列または翻訳調節配列)を含み得る。ポリペプチドをコードする配列および調節配列は、適切な分子(例えば、転写アクチベータータンパク質)が、調節配列に結合する場合に、遺伝子発現を可能にする方法で接続される。
【0036】
1つの実施形態において、免疫原性組成物の第1の核酸ドメインは、HSP(例えば、Mycobacterium tuberculosis熱ショックタンパク質70(HSP70)(配列番号9))のフラグメントをコードする。所定のタンパク質の「フラグメント」は、参照ポリペプチドより短い長さのポリペプチドである。例えば、このポリペプチドは、少なくとも9または10アミノ酸長であるが、成熟参照タンパク質またはポリペプチドの総残基数よりも少ない。例えば、M.tuberculosis HSP70のフラグメントは、70kDa未満の分子量である。HSP70のフラグメントは、天然に存在するHSP70のアミノ酸配列に少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有する。HSP70フラグメントの長さは、625アミノ酸未満である。このフラグメントは、参照タンパク質の生物学的活性を有し得る。例えば、1つの実施形態において、このフラグメントは、プロフェッショナルな抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞(DC))に結合し得るか、またはこのフラグメントは、細胞質内へのこのキメラポリペプチド(この免疫原性組成物のDNAによってコードされる)のトランスロケーションを媒介し得る。いくつかの実施形態において、この第1のDNAまたは第2のDNA(あるいは、両方)は、熱ショックタンパク質またはETA(dII)(例えば、配列番号3)のフラグメントをコードする。
【0037】
(この免疫原性組成物の)DNAの第2のドメイン(または、細胞質トランスロケーションドメインもまた存在する場合には、第3のドメイン)は、MHCクラスI拘束抗原のような、抗原エピトープをコードし得る。1つの実施形態において、抗原は、ヒトパポバウイルス(例えば、子宮頸癌関連ヒトパピローマウイルス(HPV))のようなウイルスに由来する。このウイルス抗原は、HPV−16由来のE6抗原またはE7抗原の全部または一部であり得る。本発明のキメラ核酸によって発現され得る他のウイルス抗原としては、ウシウイルス下痢症ウイルスのE2抗原;サイトメガロウイルスのppUL83またはpp89;脳炎ウイルスSLEのprM/E;B型肝炎ウイルスのHBV表面抗原またはHBVコア抗原;HIV−1抗原(例えば、gp160);ICP27、gD2、糖タンパク質B、または単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Bが挙げられる。あるいは、抗原は、変異体p53;黒色腫細胞に関連するMAGE−1またはMAGE−3のような、癌(例えば、腫瘍関連)抗原(例えば、腫瘍細胞の表面上に発現される癌関連抗原)であり得る。他の抗原としては、マラリアペプチド(NANP)40、HIV−1 p24、またはインフルエンザ核タンパク質が挙げられる。
【0038】
キメラポリペプチドの第1のドメインをコードするDNAは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、またはそのフラグメントを含み得る。1つの実施形態において、そのコードされるタンパク質は、ジスルフィド架橋(例えば、配列番号1のCys51とCys93に架かるジスルフィド架橋)を含む、機能的GM−CSFフラグメントである。GM−CSFの他の生物学的に活性なフラグメントは、配列番号1の残基18〜22、34〜41、38〜48、52〜61、94〜115、95〜111を含むポリペプチドである。
【0039】
あるいは、第1のポリペプチドドメインをコードするDNAは、Flt3リガンド(FL)(例えば、配列番号25を参照のこと)、CTLA−4、4−1BB、CD40リガンド、またはTNFレセプター配列(またはそのAPC結合フラグメント)、あるいはAPC結合ポリペプチド配列を含み得る。
【0040】
第2のポリペプチドドメインをコードするDNAは、Psudomonas内毒素A(ETA)のトランスロケーションドメイン配列(例えば、ETAのドメインII(dII)(例えば、配列番号3のおよそ253〜およそ364にわたる残基))のような、トランスロケーションドメイン配列をコードし得る。トランスロケーションドメインは、それが連結するタンパク質またはポリペプチドの、細胞のサイトゾルへのトランスロケーションを誘導するポリペプチドである。例えば、第2のDNAは、Diptheria、Clostridium(Botulinum(例えば、破傷風))、Bacillus anthracis(炭疽)、Yersinia、Vibrio cholerae(コレラ)またはBordetella pertussis毒素由来のペプチドをコードし得る。本発明は、特定の機構によって限定されないが、免疫原性組成物のトランスロケーションドメインをコードするDNAの存在は、エンドソーム/リソソーム画分からサイトゾルへの抗原のトランスロケーションを介して、その組成物によってコードされる抗原のMHCクラスI提示を増強する。好ましくは、毒素をコードする遺伝子の毒素ドメインは、変異または欠失されている。
【0041】
免疫原性組成物は、上記の第1、第2および第3のDNAを必ずしも含む必要はない。代替的実施形態において、第3のドメイン(免疫が所望される標的抗原)をコードするDNAは、HSP(例えば、配列番号9を参照のこと)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(例えば、配列番号25を参照のこと)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン(配列番号3を参照のこと)、またはAPC結合ポリペプチド(トランスロケーターポリペプチドをコードするDNAの非存在下にある)をコードするDNAに作動可能に連結され;別の実施形態において、キメラ核酸は、トランスロケーター(例えば、細胞質トランスロケーター)ポリペプチドをコードするDNAをさらにコードする。例えば、本発明のキメラ核酸は、E7−ETA、E7−HSP70、E7−GM−CSFまたはE7−FL(すなわち、E7−Flt−3リガンド)を含む融合ポリペプチドをコードし得る。本発明の免疫原性組成物は、免疫が要求される抗原をコードするDNAに作動可能に連結された、配列番号25(Flt−3リガンド)のおよそ1〜およそ189の残基をコードするDNAを含み得る。
【0042】
本発明のキメラ核酸はまた、E7−HSP70融合ポリペプチド、GM−ETA(dII)−E7融合ポリペプチド、またはETA(dII)−E7(すなわち、GM成分を含まない)を含む、免疫原性組成物をコードし得る。
【0043】
本発明はまた、DNAワクチンを提供する。DNAワクチン組成物は、(a)熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、あるいはプロフェッショナル抗原提示細胞に結合するポリペプチドをコードする、第1のDNA、および(b)抗原(例えば、MHCクラスI拘束抗原)をコードする、第2のDNAを含む、プラスミドまたは他の発現ベクターを含み得る。このワクチンは、細胞質トランスロケーターポリペプチドをコードするDNAを含む、第3のドメインを含み得る。これらのポリペプチドドメインコード配列(DNA)は、その第1、第2、そして適切な場合には、第3のDNAが、「インフレーム」(作動可能に連結される)になる様式で、発現(例えば、プラスミド)ベクターにクローニングされる。この発現(プラスミド)ベクターが取り込まれた細胞において転写および翻訳される場合、このベクターは、上記のドメイン(例えば、APC結合部分、細胞質トランスロケーター部分、およびクラスI拘束抗原エピトープ)を含む、キメラポリペプチドの産生を指向する。
【0044】
代替的な実施形態において、本発明のキメラ核酸(DNA)(ポリヌクレオチド)、発現カセットおよびポリペプチドは、単離されている。「単離されている」によって、例えば、目的の遺伝子配列にその生物の天然に存在するゲノム中で隣接する遺伝子を含まない、核酸分子を意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター;自律複製プラスミドまたはウイルス;あるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるcDNAあるいはゲノムまたはcDNAフラグメント)として存在する、組換えDNAが含まれる。この用語には、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAもまた含まれる。この用語は、天然に存在するゲノム中で天然においてそれに隣接する1以上の他の遺伝子によって隣接されている所定のDNA配列を含む、ゲノムDNAの大きいセグメント(例えば、コスミドクローンに存在するセグメント)を排除する。本明細書中の「単離された」の定義もまた参照のこと。
【0045】
核酸分子(またはポリヌクレオチド)は、RNAおよびDNA(cDNA、ゲノムDNA、合成(例えば、化学的に合成された)DNAを含む)の両方を含む。一本鎖の場合、この核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。従って、この用語には、例えば、ベクター、自律複製プラスミドまたはウイルス、あるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAのその天然の部位以外の部位に組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるcDNAあるいはゲノムまたはcDNAフラグメント)として存在する、組換えDNAが含まれる。この用語には、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAもまた含まれる。
【0046】
所定の参照配列(例えば、Mycobacterium tuberculosis HSP70(配列番号9)のカルボキシ末端部分、Flt−3リガンド(配列番号25)、GM−CSF(配列番号1)、Pseudomonas ETA dII(配列番号3)の細胞質トランスロケーションドメイン)のヌクレオチド配列を有する鎖、あるいは生物学的に等価な活性を有するに十分高い配列同一性を有するか、または参照配列を有するDNAの鎖またはその相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズする鎖を含む、免疫原性組成物(例えば、キメラポリペプチドまたは「融合タンパク質」)をコードするキメラ核酸(DNA)(本発明の発現カセット、ベクター、DNAワクチンにおけるコード配列を含む)は、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の範囲内の核酸は、参照配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ特定の生物学的活性(例えば、Pseudomonas ETA dIIの細胞質トランスロケーションドメイン)を有するポリペプチドをコードするDNAを含む。さらなる例としては、以下が挙げられる:その免疫原性組成物の第1のドメインをコードする第1のDNAによってコードされるポリペプチドの生物学的活性は、APCに結合し得、第2のDNAによってコードされるペプチドの生物学的活性は、細胞質トランスロケーションドメインであり得、そして第3のDNAによってコードされるペプチドの生物学的活性は、MHCクラスI分子に結合し得る。このDNAは、参照配列に対して、少なくとも約75%の同一性、約85%の同一性、約90%の同一性、約95%の同一性、または約99%の同一性、または100%の同一性を有し得る。
【0047】
配列同一性を計算するために、ヌクレオチドおよびアミノ酸の比較を、Lasergeneソフトウェアパッケージ(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)を使用して行う。使用したMegAlignモジュールは、Clustal V方法(Higginsら、1989、CABIOS5(2):151−153)であった。使用したパラメーターは、ギャップペナルティー10、ギャップ長ペナルティー10であった。
【0048】
あるいは、参照配列(上記)を有するDNAの鎖またはその相補体に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ特定の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする免疫原性組成物をコードするキメラ核酸(DNA)が、本発明の範囲内にある。ハイブリダイゼーションは、標準的な条件(例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1989)に記載のような技術)を使用して行う。「高いストリンジェンシー」とは、高温かつ低塩濃度によって特徴付けられる核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(すなわち、約0.1×SSCの塩濃度、65℃での洗浄条件)をいう。「低い」または「中程度の」ストリンジェンシーとは、低温かつ高塩濃度によって特徴付けられるDNAハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(すなわち、少なくとも1.0×SSCの塩濃度、60℃未満での洗浄条件)をいう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、約42℃かつ約50%ホルムアミドでのハイブリダイゼーション;約65℃、約2×SSCかつ1% SDSでの1回目の洗浄;その後の、約65℃かつ約0.1%×SSCでの2回目の洗浄、を含み得る。参照遺伝子または参照配列に約50%の配列同一性を有するDNA配列を検出するために適切な低いストリンジェンシー条件は、ホルムアミド非存在下での約42℃でのハイブリダイゼーション;約42℃、約6×SSCかつ約1% SDSでの1回目の洗浄;および約50℃、約6%×SSCかつ約1% SDSでの2回目の洗浄、によって検出する。
【0049】
本発明は、哺乳動物において抗原に対する細胞傷害性T細胞応答を誘導する方法を包含し、この方法は、この哺乳動物に、上記の免疫原性組成物をコードするキメラ核酸、またはキメラポリペプチドを投与することによる。1つの実施形態において、この組成物は、裸のDNAとして投与される。この組成物(例えば、DNA、ポリペプチド、ベクターなど)はまた、標的細胞によるDNAまたはポリペプチドの取り込みを増強する薬剤の存在下(例えば、リン脂質処方物(例えば、リポソーム))で投与され得る。
【0050】
この方法は、病原体による感染に対して哺乳動物をワクチン接種するために有用である。1つの実施形態において、本発明のキメラポリペプチド(およびそれらをコードするキメラ核酸)は、この病原体(例えば、ウイルスまたは細菌)由来の抗原を含む。この方法はまた、哺乳動物における癌の発生の予防または既存の癌の処置に有用である。特定の型の癌を発症する危険性がある哺乳動物は、公知の方法(例えば、遺伝子スクリーニング)を使用して同定される。癌を発症する危険性があるかまたは癌を罹患している個体は、その(例えば、第3の)DNAドメインの抗原ドメインが癌(腫瘍)関連抗原(例えば、子宮頸癌に関連するHPV E7)をコードする組成物を投与することによって、処置される(その状態が、「改善される」)。
【0051】
本発明はまた、哺乳動物に直接導入された場合に、その哺乳動物内でのコードされたポリペプチドの発現、および次いで、そのコードされたポリペプチドに特異的なCD8+免疫応答をインビボで誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、生きた脊椎動物細胞に導入された際に、この細胞が、このポリヌクレオチドによってコードされた翻訳産物を産生し得るような、必須の調節エレメント(例えば、転写または翻訳調節エレメント(例えば、プロモーター))を含む核酸であり得る。例えば、このポリヌクレオチドは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、あるいはそれらの組み合わせまたはフラグメントをコードする、ポリデオキシリボ核酸(DNA)であり得る。
【0052】
それに対する免疫応答が所望される抗原性ポリペプチドをコードするキメラ核酸(DNA)は、転写プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの場合において、このポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、その動物には通常には存在せず;これは、病理学的状態にある動物においてのみ存在する(例えば、ウイルスに関連する異種タンパク質)。他の場合、この抗原は、疾患状態または他の状態において誤調節されている自己ポリペプチド(例えば、腫瘍関連抗原)であり得る。キメラ核酸(例えば、DNAワクチン)によってコードされるこのポリペプチドは、インビボで合成され(すなわち、その動物自身の組織によって産生され);その発現されたキメラタンパク質は、その細胞によってプロセシングされ、そしてMHC分子(例えば、クラスI MHCポリペプチド)によって発現され得る。
【0053】
抗原含有ポリヌクレオチドをコードするキメラ核酸は、インビボ投与のための適切な構築物(例えば、ポリヌクレオチドワクチンに特別に最適化された発現ベクター)に連結され得る。このキメラポリペプチドコード配列は、調節エレメント(例えば、転写プロモーター、エンハンサー)、免疫原性エピトープ、および免疫増強遺伝子または免疫調節遺伝子(これらは、それら自身の調節エレメント(例えば、プロモーター、転写ターミネーター)を有し得る)をコードするさらなるコード配列(例えば、シストロン)に作動可能に連結され;この構築物はまた、細菌の複製起点および/または抗生物質耐性遺伝子を含み得る。このベクターはまた、ポリシストロニックのmRNAの発現のための内部リボソーム侵入部位(IRES)を含み得る。転写ターミネーターには、T7またはSP6プロモーターのような強力なRNAポリメラーゼプロモーターが含まれる。
【0054】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよびDNAワクチンは、コードされる抗原に対する保護免疫を誘発する。例えば、抗原E7をコードするDNA発現ベクターの注入は、腫瘍細胞の死または腫瘍細胞増殖の減少を生じる。腫瘍細胞に対する抗原特異的CTLは、ワクチン接種後に生成される。
【0055】
多くの利点は、本発明のキメラ核酸および発現系のインビボ投与ワクチン接種ストラテジーに関連する。多くの公知のDNAワクチンの欠点は、その限定された効力である。標準的なDNAワクチンとは対照的に、本発明のキメラ核酸(ポリヌクレオチド)およびワクチン接種方法は、強力な抗原特異的免疫療法を生じる。本発明のポリヌクレオチドおよびDNAワクチンは、従来のDNAワクチン(例えば、本発明のキメラ核酸(例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas内毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列(あるいは、APC結合ドメインまたは細胞質トランスロケーションドメイン))を含む、第1のポリペプチドドメイン;および抗原性ポリペプチドを含む、第2のポリペプチドドメイン、を含むキメラポリペプチドをコードする配列)を含まない配列)よりも、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍または少なくとも約40倍の、細胞性免疫応答(例えば、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答)を誘導し得る。
【0056】
ワクチンの効力は、本明細書中に記載のように、当該分野で公知の方法によって(例えば、ワクチン接種後に誘導されたCD8+T細胞前駆体を測定することによって、またはワクチン接種後の病原体(例えば、ウイルス)または腫瘍負荷の減少を測定することによって)決定され得る。本発明は、いかなる特定の作用機構によって限定されないが、DNAワクチンにコードされるポリペプチドは、MHCクラスI経路に入りそして細胞傷害性T細胞応答を惹起する能力を、有し得る。1つの実施形態において、詳細には、本発明のキメラ核酸(例えば、DNAワクチン)は、細胞質トランスロケーションポリペプチドドメイン(「細胞質トランスロケータードメイン」)をコードすることによって、免疫原を、MHCクラスI抗原プロセシング経路に指向するよう設計される。結果として、細胞性T細胞応答の誘発が、最適化される。
【0057】
DNAワクチンの他の利点としては、安全性および大規模生産の簡素化が挙げられる。本発明のワクチンは、家庭用動物または畜産動物、ならびにヒトへの投与に有用である。例えば、裸のプラスミドDNAは、安全であり、低い免疫原性を有し、そして繰り返し投与され得る。DNAワクチンは、高純度で大規模で容易に調製され、そしてタンパク質および他の生物学的ポリマーよりも高度に安定である。例えば、米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,910,488号を参照のこと。
【0058】
ワクチンレシピエントに導入される発現可能なDNAまたは転写されるRNAの量は、使用される転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強度に依存して変化し得る。さらに、免疫応答の大きさは、タンパク質発現のレベルおよび発現される遺伝子産物の免疫原性に依存し得る。一般的に、約1ng〜5mgの間、100ng〜2.5mgの間、または約1μg〜約750μgの間、または約10μg〜約300μgの間の範囲の有効用量であるDNAが、体の組織(例えば、筋肉組織または皮膚組織)に直接投与される。静脈内投与(IV)のための1投薬量のDNAは、約106〜1022コピーのDNA分子である。皮下注射(SC)、皮内導入、皮膚を通じた圧痕、および他の投与様式(例えば、腹腔内送達、静脈内送達、または吸入送達)がまた、適している。例えば、DNAは、例えば、「遺伝子銃」を用いて「バイオリスティック(biolistic)」によって投与され得る。ブースター予防接種が、同様の様式で投与され得る。例えば、米国特許第6,004,287号;同第5,753,477号;同第5,179,022号を参照のこと。
【0059】
DNAワクチンはまた、公知の方法(例えば、Panら、1995、Cancer Res.55(21):4776−4779およびPanら、1995、Nature Med.1(5):471−7に記載される方法)を用いてListeria monocytogenesワクチンの一部として送達されるために処方され得る。ポリヌクレオチド免疫原を用いた予防接種後、免疫応答はまた、対応するポリペプチド免疫原を投与することによってブーストされ得る。
【0060】
キメラ核酸、ベクターまたは他のポリヌクレオチドは、裸であり得、すなわち、レシピエントの免疫系に影響を与えるいずれかのタンパク質、アジュバント、または他の因子と結合していない。裸のDNAは、生理学的受容可能な溶液(例えば、滅菌生理食塩水、または滅菌緩衝化生理食塩水)中で投与される。
【0061】
あるいは、DNAは、リポソームと(例えば、レクチンリポソームまたはDNA−リポソーム混合物として)結合され得る。カルシウムイオンのようなDNAの細胞取り込みを補助する因子(すなわち、トランスフェクション促進因子)がまた、使用され得る。ポリヌクレオチドでコートされた微粒子(例えば、金の粒子)がまた、ワクチンを投与する手段として有用である。小粒子リポソームまたは脂質複合体エーロゾル化合物がまた、使用されて、本発明の核酸を送達し得る(例えば、米国特許第6,090,407号を参照のこと)。
【0062】
(免疫原性組成物の機能的成分):本発明のキメラ核酸は、2または3またはそれより多くの機能ドメインを有するキメラ遺伝子産物を産生するために発現され得る、連続的な核酸配列を含む:第1のポリペプチドドメインは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、またはAPC結合ドメインを含み;そして第2のポリペプチドドメインは、抗原性ポリペプチド(例えば、MHCクラスI制限エピトープ)を含む。キメラ核酸はさらに、細胞質トランスロケーションドメインをコードする配列を含み得る。このコードされる遺伝子産物は、強力な免疫応答(特に、細胞傷害性T細胞応答)を生成する。この応答は、キメラ遺伝子産物を投与するよりも強力であり、そして熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列、またはAPC結合部分を伴わない、抗原(例えば、MHCクラスI制限エピトープ)をコードするDNAワクチン;あるいは、1つの実施において、細胞質トランスロケーション部分を投与するよりも、強力である。
【0063】
(抗原特異的免疫応答の増強を与えるHSP70のドメイン):Mycobacterium tuberculosis HSP70のドメイン構造が、以下の実施例5に詳細に記載されるように決定された。少なくとも3つの機能ドメインが、同定された:ATPaseドメイン(配列番号9の残基1〜356を含む)、基質結合ドメイン(SD;配列番号の9残基357〜516を含む)、およびカルボキシ末端ドメイン(CD;配列番号9の残基517〜625を含む)(図16)。このHSP70の各ドメインの裸のDNAワクチンの能力に対する寄与が決定された。各ドメインをコードするDNAは、パピローマウイルス抗原E7をコードするDNAにインフレーム(すなわち、作動可能に)連結される。E7特異的CD8 T細胞免疫応答が、測定された。
【0064】
この結果は、DNAワクチン構築物に組み込まれた場合に、HSP70の細胞質ドメイン(CD)をコードするDNAが、ワクチンによってコードされる標的抗原に対する免疫を生成する際の、このDNAワクチンの能力を増加することを示す。さらに、この細胞質ドメインが、全長HSP70を含むDNA構築物における抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答の増強の大部分の原因である。
【0065】
(定義)
他に示されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に使用される場合、以下の用語は、他に具体化されない限り、それらに与えられた意味を有する。
【0066】
用語「抗原」または「免疫原」は、本明細書中に使用される場合、適切な量(「免疫学的有効量」)(すなわちこれは、細胞性および/または体液性免疫応答を誘発、増加、またはブーストし得る(これはまた、例えば、抑制誘導の場合には、免疫抑制であり得る))で、単独または別の物質と組合わせてか、もしくは結合させてか、もしくは融合されてか(これらは、一度にかまたは数回の間隔にわたって投与され得る)のいずれかで投与される(または核酸(例えば、DNAワクチン)を投与することによってインビボ発現される)場合に、「抗原性」または「免疫原性」である、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、化合物または組成物をいう。
【0067】
用語「発現カセット」は、本明細書中に使用される場合、ヌクレオチド配列と適合性である宿主中で、構造遺伝子の発現に影響を与え得るヌクレオチド配列(すなわち、タンパク質コード配列)をいう。発現カセットは、ポリペプチドコード配列と;および必要に応じて、他の配列(例えば、転写終了シグナル)と作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーター含む。発現をもたらす際に必要であるかまたは有用であるさらなる因子(例えば、エンハンサー)がまた、使用され得る。「作動可能に連結された」は、本明細書中に使用される場合、プロモーターがDNA配列の転写を媒介するような、このDNA配列から上流のプロモーターの連結をいう。従って、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のDNA」ベクターなどを含む。「ベクター」は、細胞を感染、トランスフェクト、一過性もしくは永久的に形質転換し得る核酸を含む。ベクターが裸の核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であり得ることが、認識される。このベクターは、必要に応じて、ウイルスまたは細菌の、核酸および/またはタンパク質、および/または膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど)を含む。ベクターは、DNAのフラグメントが結合され得、そして複製されるようになるレプリコン(例えば、RNAレプリコン(以下の実施例6を参照のこと)、バクテリオファージ)を含むが、これに限定されない。従って、ベクターは、RNA、自律性自己複製環状DNAもしくはRNA、または自律性自己複製線状DNAもしくはRNA(例えば、プラスミド、ウイルスなど(例えば、米国特許第5,217,879号を参照のこと))を含むが、これらに限定されず、そして発現プラスミドおよび非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主になると記載される場合、これらには、染色体外の環状DNAおよび線状DNAならびに宿主染色体に組込まれているDNAの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、このベクターは、有糸分裂の間に自律構造として細胞によって安定に複製され得るか、または宿主ゲノム中に組込まれるかのいずれかであり得る。
【0068】
用語「連結された」または「化学的に連結された」は、例えば、本発明の1つの実施形態におけるような(ここで、ERシャペロンポリペプチドは、抗原性ペプチドに化学的に連結される)2つの部分の任意の化学結合をいう。このような化学結合は、組換え産生された融合タンパク質またはインビボ産生された融合タンパク質のペプチド結合を含む。
【0069】
用語「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第2のポリペプチドまたはペプチドドメインと結合した、少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチドドメインを含む組成物をいう。例えば、1つの実施形態において、本発明は、融合タンパク質(キメラポリペプチド)をコードする単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供し、この融合タンパク質は、少なくとも2つのドメインを含み、第1のポリペプチドドメインは、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素A(ETA dII)の細胞質トランスロケーションドメイン、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列を含み、そして第2のポリペプチドドメインは、抗原性ポリペプチドを含む。さらなるドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖などを含み得る。「融合」は、ペプチド結合、化学連結、荷電相互作用(例えば、静電気的な誘引、例えば塩の架橋、H−結合など)などによって生成される結合であり得る。ポリペプチドが組換えである場合、「融合タンパク質」は、共通のメッセージから翻訳され得る。あるいは、このドメインの組成物は、任意の化学手段または静電気的な手段によって連結され得る。本発明のキメラ分子はまた、さらなる配列、例えば、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含み得る。あるいは、ペプチドは、簡単にキャリアへ連結されて、キメラポリペプチドの操作または同定/配置を容易にし得る。
【0070】
用語「抗原性」または「免疫原性」または「免疫原性組成物」は、単独でかまたは別の物質と組合せもしくは連結もしくは融合されてかのいずれかで、「免疫原性」である(すなわち、細胞性および/または体液性免疫応答を、誘発、増加、またはブーストし得る)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、化合物または組成物をいう。免疫原性組成物は、少なくとも約5アミノ酸、10アミノ酸長のペプチド、15アミノ酸長のフラグメント、20アミノ酸長またはこれより長いフラグメントのペプチドであり得る。免疫原は、「キャリア」ポリペプチドおよびハプテン(例えば、別の組成物に融合または連結(化学的かまたは別の方法で)された、融合タンパク質またはキャリアポリペプチド)を含み得る。免疫原は、免疫化ベクターに組換え発現され得、これは、プロモーターに作動可能に連結された免疫原のコード配列を含む単純な裸のDNA(例えば、単純な発現カセット)であり得る。免疫原は、抗体または(MHC分子のペプチド結合部位に結合する場合)Tリンパ球レセプター(TCR)が結合する、抗原決定基もしくはエピトープを含み;これらのエピトープは、代表的に3〜10アミノ酸長である。
【0071】
本明細書中に使用される場合、用語「単離された」は、分子または組成物(例えば、本発明のキメラ核酸またはポリペプチド)をいう場合、この分子または組成物が、少なくとも1つの他の化合物(例えば、タンパク質)、他の核酸(例えば、RNA)、または他の夾雑物(これは、インビボまたはその天然に存在する状態において、この分子または組成物が結合されている)から分離されることを意味する。従って、組成物は、この組成物がインビトロまたはインビボで組換え産生されたことに起因して、この組成物が「天然に」結合されているかまたは結合されている任意の他の成分(例えば、細胞抽出液の場合、細胞膜)から単離されている場合、単離されているとみなされる。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質状態であり得、そして乾燥もしくは水溶液中であり得る。純度および均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)または高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)のような分析的な化学手段を用いて決定され得る。従って、本発明の単離された組成物は、そのインサイチュ環境と通常関連する物質を含まない。たとえタンパク質が均質性のバンドまたは優性なバンドに単離されている場合でも、所望の組成物と共に同時精製される微量の夾雑物が存在し得る。
【0072】
HPV−16 E7ポリペプチドを含む、句「HPVポリペプチド」は、当該分野で周知のポリペプチドを記載する;例えば、HPV−16 E7に関して、例えば、GenBank登録番号AF125673(1999年6月1日)は、完全HPV−16ゲノムおよびHPV−16 E7タンパク質を記載することを参照のこと。
【0073】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、改変体が誘導されたポリペプチドに実質的に対応する構造および活性を有する「アナログ」または「保存的改変体」および「模倣物」または「ペプチド模倣物」もまた含む、本発明の組成物を含み、これには、例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列が挙げられる。
【0074】
用語「薬学的組成物」は、被験体における薬学的使用に適した組成物(例えば、ワクチン)をいう。本発明の薬学的組成物は、例えば、本発明の核酸、またはベクター、または細胞を含む薬理学的有効量の組成物ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む処方物である。
【0075】
用語「プロモーター」は、核酸の転写を指向する核酸制御配列の配列である。本明細書中に使用される場合、プロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列(例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメント)を含む。プロモーターまたは、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対ほどに配置され得る遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および成長状態下で活性である。「誘導可能な」プロモーターは、環境の調節または成長の調節下で活性である。「組織特異的」プロモーターは、ある生物の特定の組織型で活性であるが、同じ生物由来の他の組織型では活性でない。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列(例えば、プロモーター、転写因子結合部位の配列)と第2の核酸配列との間の機能的連結をいい、ここで、この発現制御配列は、第2の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【0076】
用語「組換え」は、合成されたかもしくは他の方法でインビトロで操作されたポリヌクレオチド(例えば、「組換えポリヌクレオチド」)、細胞もしくは他の生物系において遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド(「組換えタンパク質」)をいう。例えば、組換え核酸または組換えポリペプチドは、本明細書中に記載される場合、本発明の方法を実施するために使用され得る。「組換え手段」はまた、種々のコード領域もしくはコードドメインまたは異なる供給源からのプロモーター配列を有する核酸の、本発明の実施に使用されるベクターにおけるポリペプチドコード配列の発現(例えば、誘導可能な発現または構成的発現)のための発現カセットまたは発現ベクターへの連結を含む。
【0077】
用語「自己複製RNAレプリコン」は、異種RNAおよび異種タンパク質の発現を可能にするために操作されたRNAウイルス(例えば、αウイルスゲノムRNA(例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスなど))に基づく構築物をいう。これらの組換えベクターは、自己複製し(すなわち、これらは「レプリコン」である)、そして以下により詳細に記載されるように裸のRNAまたは裸のDNAとして細胞に導入され得る。1つの実施形態において、自己複製RNAレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター SINrep5(これは、米国特許第5,217,879号に詳細に記載される)を含む。
【0078】
用語「全身投与」は、組成物または薬物(例えば、本発明のDNAワクチンまたは本明細書中に記載されるキメラ核酸およびポリペプチド)の循環系への導入をもたらすような様式での、組成物または薬物の投与をいう。用語「局所投与」は、特定の解剖学的空間(例えば、腹腔内、髄腔内、硬膜下または特定の器官へのなど)への組成物または薬物の投与をいう。例えば、局所投与としては、肝臓への局所投与のための、組成物または薬物の肝臓動脈への投与が挙げられる。用語「局部投与」は、限定されるかまたは限局性の、解剖学的空間(例えば、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋内注射など)への組成物または薬物の投与をいう。当業者は、局部投与または局所投与がまた、循環系への組成物または化合物の侵入を引き起こし得ることを理解する。
【0079】
(核酸の作製および操作)
本発明の方法は、本明細書中に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸の投与を提供する。組換え融合タンパク質は、インビトロまたはインビボで合成され得る。これらの組成物をコードする核酸は、「裸のDNA」の形態であり得るか、またはこれらは、インビボまたはエキソビボ投与のために、プラスミド、ベクター、組換えウイルス(例えば、「レプリコン」)などに組み込まれ得る。本発明の核酸およびベクターは、インビトロまたはインビボで作製および発現され得、これらの遺伝子およびベクターを作製および発現する多様な手段が、使用され得る。当業者は、所望の遺伝子活性が、本発明を実施するために使用されるベクター内で遺伝子および核酸(例えば、プロモーター)の発現または活性を調節することによって得ることができることを、認識する。遺伝子の発現もしくは活性を増加または減少するために記載される公知の方法、またはこの遺伝子の組織特異性に関して記載される公知の方法のいずれかが、本発明のために使用され得る。本発明は、科学文献および特許文献に十分に記載される当該分野で公知の任意の方法またはプロトコールと組合わせて実施され得る。
【0080】
(一般的な技術)
本発明を実施するために使用され得る核酸配列(RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、組換えウイルス、またはこれらのハイブリッドに関わらず)が、種々の供給源から単離され、遺伝子操作され、増幅され、そして/または組換え発現され得る。任意の組換え発現系が使用され得、これには、細菌細胞に加えて、例えば、哺乳動物細胞発現系、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系、または植物細胞発現系が挙げられる。あるいは、これらの核酸は、例えば、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−418;Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440−3444;Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373−380;Blommers(1994)Biochemistry 33:7886−7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;米国特許第4,458,066号に記載されるような、インビトロで周知の化学合成技術によって合成され得る。次いで、二本鎖DNAフラグメントが、相補鎖を合成し、適切な条件下でこれらの鎖を一緒にアニーリングすることによってか、または適切なプライマー配列を用いてDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってかのいずれかで、得ることができる。
【0081】
核酸の操作のための技術(例えば、配列中に変異を発生させる技術、サブクローニングする技術、プローブを標識する技術、スクリーニングする技術、ハイブリダイゼーションする技術など)は、科学文献および特許文献に十分に記載されている(例えば、Sambrook編,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(第2版),第1〜3巻,Cold Spring Harbor Laboratory(1989);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel編,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1997);LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen編.Elsevier,N.Y.(1993)を参照のこと)。
【0082】
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチドなどは、当該分野で周知の任意の数の一般的な手段によって分析および定量され得る。これらの方法には、例えば、生化学的分析方法(NMR、分光測定、X線撮影、電気泳動、キャリラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、およびハイパーディフュージョン(hyperdiffusion)クロマトグラフィー)、種々の免疫学的方法(例えば、流体またはゲル沈殿反応、免疫拡散法、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動法(例えばSDS−PAGE)、RT−PCR、定量PCR、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射性同位元素標識法、シンチレーション計数法、およびアフィニティクロマトグラフィ法)が挙げられる。
【0083】
(核酸の増幅)
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して核酸を増幅し、以下に使用するための融合タンパク質をコードする配列を産生する:本発明を実施するため;インビボ投与後のワクチンのレベル(例えば、プラスミドまたはウイルスのレベル)をモニタリングするため;その存在および活性CTLの表現型を確認するためなど。当業者は、公知の配列(例えば、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas enotoxin A(ETA dII)の細胞質転座ドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)配列をコードする配列)を使用して、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計し得る。増幅方法はまた、当該分野で周知であり、これらには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR(PCR PROTOCOLS,A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,ed.Innis,Academic Press,N.Y.(1990)およびPCR STRATEGIES(1995),ed.Innis,Academic Press,Inc.,N.Y.,リガーゼ連鎖反応(LCR)(例えば、Wu(1989)Genomics 4:560;Landegren(1988)Science 241:1077;Barringer(1990)Gene 89:117を参照のこと);転写増幅(例えば、Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173を参照のこと);ならびに自己持続性配列複製(例えば、Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874を参照のこと);Qベータレプリカーゼ増幅(例えば、Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477−1491を参照のこと),自動Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ(例えば、Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10:257−271を参照のこと)ならびに他のRNAポリメラーゼ触媒技術(例えば、NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario);Berger(1987)Methods Enzymol.152:307−316;Sambrook;Ausubel;米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:564を参照のこと。
【0084】
(発現カセットのクローニングおよび構築)
発現カセット(プラスミド、組換えウイルス(例えば、以下に記載されるレプリコンのようなRNAウイルス)および本明細書中に記載される融合タンパク質をコードする他のベクター)を使用して、これらのポリペプチドをインビトロおよびインビボで発現させる。種々の従来の技術によって発現された組換え核酸は、科学文献および特許文献にいて十分に記載される。例えば、Roberts (1987)Nature 328:731;Schneider(1995)Protein Expr.Purif.6435:10;Sambrook,TijssenまたはAusubelを参照のこと。プラスミド、ベクターなどは、天然供給源から単離されるか、ATCCまたはGenBankライブラリのような供給源から入手されるか、または合成もしくは組換え方法によって調製される得る。
【0085】
本発明を実施するために使用される核酸は、安定的または過渡的に細胞(例えば、エピゾーム発現系)中で発現され得る。選択マーカーは、形質転換された細胞上での選択可能な表現型を与えるために取りこまれ得る。例えば、選択マーカーは、エピゾームの維持および複製のためにコードし得るので、宿主ゲノムへの取り込みは必要とされない。例えば、このマーカーは、抗生物質耐性(例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、G418、ベロマイシン、ハイグロマイシン)または除草剤耐性(例えば、クロロスルフロンまたはBasta)をコードし得、所望のDNA配列で形質転換されたこれらの細胞の選択を可能にする(例えば、Blondelet−Rouault(1997)Gene 190:315−317;Aubrecht(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:992−997を参照のこと)。
【0086】
(インビボ核酸投与)
1実施形態において、本発明のキメラ核酸を、インビトロ、エキソビボおよび/またはインビボで、細胞(例えば、ヒトの細胞または他の哺乳動物の細胞)にトランスフェトまたは感染させ得る発現カセット(例えば、プラスミドまたは他のベクター、ウイルス)にクローニングする。任意のアプローチとしては、以下を使用し得る:例えば、脂質またはリポゾームベースの遺伝子送達(例えば、Mannino(1988)BioTechniques 6:682−691;米国特許番号第5,279,833号を参照のこと)、レトロウイルスゲノムの一部として所望の外来性配列を用いた複製欠損レトロウイルスベクター(例えば、Miller(1990)Mol.Cell.Biol.10:4239;Kolberg(1992)J.NIH Res.4:43;Cornetta(1991)Hum.Gene Ther.2:215を参照のこと)。例えばまた、Zhang(1996)Cancer Metastasis Rev.15:385−401;Anderson,Science(1992)256:808−813;Nabel(1993)TIBTECH 11:211−217;Mitani(1993)TIBTECH 11:162−166;Mulligan(1993)Science,926−932;Dillon(1993)TIBTECH 11:167.175;Miller(1992)Nature 357:455−460を参照のこと。
【0087】
発現カセットはまた、ウイルスゲノムから誘導され得る。使用され得るベクターとしては、例えば、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、またはアレナウイルス科由来の、組換え改変されたエンベロープDNAおよびRNAウイルスまたは非エンベロープDNAおよびRNAウイルスが挙げられる。親のベクター特性の各々のアデノウイルスの利点を展開する、キメラベクターがまた使用され得る(例えば、Feng(1997)Nature Biotechnology 15:866−870を参照のこと)。腫瘍サプレッサ遺伝子を含むように、このようなウイルスゲノムを組換えDNA技術によって改変し、そして複製欠損、条件付き複製または複製成分になるように遺伝子操作し得る。このベクターは、複製欠損または条件複製であり得る。ベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロゲノムから誘導され得る。レトロウイルスとしては、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、シミアン免疫欠乏ウイルス(SIV)、ヒト免疫欠乏ウイルス(HIV)、およびそれらの組合せに基づくアデノウイルスを含み得る。例えば、Buchscher(1992)J.Virol.66(5)2731−2739;Johann(1992)J.Virol.66(5):1635−1640(1992);Sommerfelt(1990)Virol.176:58−59;Wilson(1989)J.Virol.63:2374−2378;Miller(1991)J.Virol.65:2220−2224を参照のこと。アデノ関連ウイルス(AAV)ベースのベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生、ならびにインビボおよびエキソビボ治療手順のために細胞を形質導入するために使用され得る。例えば、Okada(1996)Gene Ther.3:957−964;West(1987)Virology 160:38−47;Carter(1989)米国特許第4,797,368号;CarterらWO 93/24641(1993);Kotin(1994)Human Gene Therapy 5:793−801;Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.94:1351(AAVベクターの総説のため)を参照のこと。
【0088】
(自己複製RNAレプリコンを使用するインビボ投与)
上記の発現ベクターおよび組換えウイルスに加えて、自己複製RNAレプリコンを使用して、本発明のタンパク質発現核酸で細胞もしくは組織または全生物を感染し得る。従って、本発明はまた、RNAウイルス(例えば、アルファウイルスゲノムRNA(例えば、シンドビスウイルス;セムリキ森林ウイルス;ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスなど))を取り込み、このウイルスは、異種RNAおよびタンパク質の発現を可能にするように遺伝子操作される。異種配列の高レベルの発現(例えば、本発明の融合タンパク質)は、このウイルス構造遺伝子が同種コード遺伝子によって置換される場合に達成される。
【0089】
これらの組換えRNAは自己複製し(すなわち、このRNAは「レプリコン」である)、そして裸RNAまたはDNAとして細胞中に導入され得る。しかし、これらは、パッケージングし、そして感染性ウイルス粒子として細胞から放出するためにトランス相補体を必要とする。この欠損ヘルパーRNAは、複製に必要とされるcis−作用配列およびポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの発現を駆動するRNAプロモーターを含む。このレプリコンと欠損ヘルパーRNAの両方で同時形質転換した細胞において、このレプリコンRNAから翻訳されたウイルス非構造的タンパク質は、この欠損ヘルパーRNAの複製および転写によりビリオン構造タンパク質を産生することを可能にする。例えば、Bredenbeek(1993)J. Virol. 67:6439−6446を参照のこと。
【0090】
RNAレプリコンワクチンは、以下のアデノウイルスベクターから誘導され得る:例えば、Sindbisウイルス(トガウイルス科のファミリー)(例えば、Xiong(1989)Science 243:1188−1191を参照のこと)、セムリキ森林ウイルス(例えば、Ying(1999)Nat.Med.5:823−827を参照のこと)またはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスウイルス(例えば、Pushko(1997)Virology 239:389−401を参照のこと)ベクター。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてRNAまたはDNAのいずれかとして投与され得、次いでこれは、トランスフェクトされた細胞でまたはインビボでRNAレプリコンに転写される(例えば、Pushko(1997)Virology 239:389−401を参照のこと)。自己複製RNAは、多様な範囲の細胞型を感染し、そして目的の抗原の発現を高レベルで可能にする(例えば、Huang(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7:531−535を参照のこと)。さらに、自己複製RNAは、トランスフェクトされた細胞を結果として溶解する。なぜならば、ウイルスレプリコンは、感染した宿主細胞に対して毒性であるからである(例えば、Frolov(1996)J.Virol.70:1182−1190を参照のこと)。従って、これらのベクターは、宿主ゲノムへの裸DNAワクチンの取り込みに関する重要性を生じない。これは、強力に発癌性であるワクチン展開標的タンパク質(例えば、アデノウイルスE7タンパク質)にとって特に重要である。
【0091】
1実施形態において、この自己複製RNAレプリコンは、例えば、Bredenbeek(1993)J.Virol.67:643 9−6446に詳細に記載されているようなシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5を含む(例えばまた、Herrmann(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.253.524を参照のこと)。
【0092】
(薬学的組成物の処方物および投与)
本発明の種々の実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現カセット、細胞、および粒子を十分な量の薬理学的組成物として個体に投与して、個人における抗原特異的免疫応答(例えば、CTL応答)を生じさせる。
【0093】
核酸、ペプチドおよびポリペプチドのための薬学的に受容可能なキャリアおよび処方物は、当業者に公知であり、そして科学文献および特許文献において詳細に記載されている(例えば、the latest edition of Remington’s Pharmaceutical Science,Maack Publishing Company,Easton,PA(「Remington’s」);Banga;Putney(1998)Nat.Biotechnol.16:153−157;Patton(1998)Biotechniques 16:141−143;Edwards(1997)Science 276:1868−1871;米国特許第5,780,431号;同第5,770,700号;同第5,770,201号を参照のこと)。
【0094】
本発明の方法において使用される核酸およびポリペプチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、単独または薬学的組成物として送達され得る:例えば、全身的、局部的、または局所的;皮下、気管内(例えば、エアロゾルによる)または経粘膜(例えば、頬粘膜、膀胱粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜、鼻粘膜)のような、動脈内、くも膜下腔内(IT)、静脈内(IV)、非経口、胸膜内管腔、局所(topical)投与、経口投与、または局所(local)投与。組成物を送達するための実際の方法は、公知であるか、または当業者に公知であり、そして科学文献および特許文献(例えば、Remingtonの文献)に詳細に記載されている。
【0095】
この薬学的組成物は、任意のプロトコールによって、および種々の単位用量形態で投与され得、投与の方法および経路および頻度、他の薬物が投与されるかどうか、個人の応答などに依存する。代表的な核酸、ペプチドおよびポリペプチドの薬学的組成物の投薬は、当該分野で周知である。このような投薬は、代表的に本質において注意を要し、種々の因子に依存して調節される(例えば、開始応答(例えば、産生された抗原特異的なCTLの量、腫瘍収縮など)、特定の治療状況、患者の健康および耐性)。所望の応答を産生するのに適切な薬学的組成物の量は、「治療的有効量」として規定される。この投薬スケジュールおよびこの使用のための有効量(すなわち、「投薬レジメン」)は、種々の因子(例えば、免疫によって処置または予防される疾患または状態、患者の健康の一般的な状態、患者の身体状態、年齢、薬学的処方物および薬学的組成物の濃度など)に依存する。この投薬レジメンは、薬物動態学(すなわち、吸収、バイオアベイラビリティー、代謝、クリアランスなど(例えば、Remingtonを参照のこと))を考慮する。投薬は、例えば、症状の軽減または緩和をアッセイすることによって、または目的の基準(例えば、抗原特異的CTLの測定レベル)によって経験的に決定され得る。上記のように、単一または複数の投与は、必要とされる場合に用量および頻度に依存して投薬され得、そして患者に耐性である。薬学的組成物は、単独または他の治療学的処置と組合せて、あるいは予防免疫として投与され得る。
【0096】
(キット)
本発明は、上記のような本発明の薬学的組成物を含むキットを提供し、本発明の方法を実施する。代替の実施形態において、このキットは本発明の組換えまたは合成キメラポリペプチド;またはこれらをコードする核酸(例えば、裸DNAの形態(プラスミド)、ウイルス(例えば、アデノウイルス誘導「レプリコン」(シンドビスウイルスレプリコンを含む)などの形態)を含み得る。このキットは、方法(例えば、本発明を実施するために使用される組成物を投与する手段、注射する手段または本発明の核酸もしくはポリペプチドで細胞または患者または動物を感染させる手段、得られた免疫応答(CTL応答)をモニタリングする手段および組成物が投与された個体の反応を評価するする手段など)を教示する指示書を含み得る。
【0097】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、それに照らし合わせた種々の改変または変化は、当業者に示唆され、そして本出願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【0098】
(実施例)
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【0099】
(実施例1:抗原遺伝子のHSP70遺伝子への結合によるDNAワクチン能力の増強およびインビボでの腫瘍の処置)
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)応答を増強し、そしてインビボで腫瘍を処置するために有効であることを証明する。
【0100】
モデル抗原としてHPV−16 E7を使用する、本明細書中に記載されたデータは、熱ショックタンパク質、細胞質転座部分、クラスI MHCエピトープを有するキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNAワクチンより、エピトープに対して強力な免疫特異性が得られることを示す。裸DNAワクチンによって産生された抗原特異的免疫においてMycobacterium tuberculosis熱ショックタンパク質70(HSP70)に結合する効果を評価した。
【0101】
M.tuberculosisHSP70は、HPV−16 E7−発現DNAワクチンの能力を増強する。HPV−16 E7に融合されたHSP70を含むDNAワクチンは、強力なE7−特異的細胞免疫(E7−特異的CD8+T細胞前駆体頻度少なくとも30倍の増加)を惹起し、そして有意なCD8+T細胞依存性予防薬およびHPV−16 E7発現腫瘍細胞に対する治療効果を生じた。
【0102】
このデータは、HPS70が、こE7 DNAワクチンのCD8+T細胞応答を優先的に増強することを示した。フローサイトメトリーによって、検出可能なIFN−γ−発現CD4+T細胞を誘導しないこと、およびE7−特異的抗体を誘導しないことを実証した。E7−HSP70誘導遺伝子をコードしないDNAワクチンは、E7−特異的CD8+T細胞の頻度を野生型E7遺伝子を含む(HSP70遺伝子配列を含まない)ワクチンと比較して40倍増加した。より重要なことには、HSP70遺伝子配列の従来のDNAワクチン(例えば、抗原のみをコードするワクチン)への添加により、構築されたE7発現腫瘍に対して低い有効性のワクチンを有意な強度を有するワクチンに変換した。驚くべきことに、E7−HSP70融合ワクチンは、包括的に標的CD8+T細胞を標的し;免疫性効果および腔腫瘍効果は、完全にCD4非依存性であった。これらの結果は、HSP70の抗原遺伝子への融合が、CD8依存経路を経由してDNAワクチンの強度を穏やかに増強することを示す。
【0103】
ヒトパピローマウイルス(HIV)−誘導体化抗原を選択した。なぜならば、HPV、特にHPV−16は、最も頸部癌に関連するからである。このHPV発癌性タンパク質(E6およびE7)は、ほとんどのHPV−含有頚部癌における細胞の形質転換および同時発現の誘導および維持において重要である。E7および/またはE6タンパク質を標的するワクチンまたは免疫治療により、HPV−関連頚部悪性腫瘍を予防および処置し得る。このデータは、HSPコード配列に連結する抗原コードポリヌクレオチド(例えば、全長E7−コード配列)が、DNAワクチンの強度を増強することを示す。Mycobacterium tuberculosisi HSP70に融合された全長E7を含むDNAワクチンを有する、野生型HPV−16E7を含むDNAワクチンを、免疫応答性発生およびHPV−16 E7発現悪性腫瘍に対して動物を保護するための能力について評価した。E7をコードするDNAを、HSP70をコードするDNAに連結することにより、完全にCD4アームをバイパスする、E7−特異的CD8+T細胞の発現および活性を増加します。この増強したCD8応答は、結果として構築された腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じる。
【0104】
以下の材料および方法を使用して、以下に記載されるデータを得た。
【0105】
プラスミドDNA構築物および処方物:Mycobacterium tuberculosis HSP70をコードするDNAフラグメントは、当該分野で公知である(GENBANK寄託番号Z95324 AL123456;ヌクレオチド10633−12510コードHSP70)。
【0106】
(表1:HSP70のアミノ酸配列)
【0107】
【表1】
(Mycobacterium tuberculosisゲノムのヌクレオチド10633〜12510によってコードされる)。
【0108】
(表2:HSP70をコードするヌクレオチド配列)
【0109】
【表2】
GENBANK登録番号 Z95324 AL123456のヌクレオチド10633〜12510。
【0110】
HSP発現プラスミド(pcDNA3−HSP)の生成のために、HSP70−コードDNAを、pKS70からサイトメガロウイルスプロモーターの下流のpcDNA3.1(−)発現ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位にサブクローニングした。HPV−16E7発現プラスミド(pcDNA3−E7)の生成のために、増幅されたフラグメントのそれぞれ5’および3’末端でBamHIおよびHindIII制限部位を生成するように設計されたプラスミドを使用して、PCRによってE7 DNAを増幅した。増幅したE7 DNAを、次いで、pcDNA3.1の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位にクローニングした。E7−HSP70キメラ(pcDNA−E7−HSP70)の生成のために、増幅されたフラグメントの5’および3’末端の両方でBamHI制限部位を生成するように設計されたプライマーを使用して、E7 DNAをPCRによって増幅した。E7 DNAを、次いで、pcDNA3−HSPの5’末端にサブクローニングした。これらの構築物の精度を、DNA配列決定によって確認した。HSPE7またはE7−HSP70遺伝子挿入物を有するプラスミドDNA、および「空の」プラスミドベクターを、サブクローニングに有効なDH5(TM細胞;Life Technologies,USA)にトランスフェクトした。次いで、DNAを増幅し、そして二重CsCL精製(BioServe Biotechnologies,Laurel,Maryland)を使用して精製した。プラスミドDNAの完全性およびEscherichia coli DNAまたはRNAの非存在を、1%アガロースゲル電気泳動を使用して、各調製物について調べた。DNAの濃度は、260nmで測定した光学密度によって決定した。挿入されたE7フラグメントの存在は、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。小網およびカルレティキュラム(calreticulum)ポリペプチド(およびそれらをコードするポリヌクレオチド)は、免疫原性組成物のHSP成分に対して有用な代替物である。
【0111】
(表3:HPV16E7抗原のアミノ酸配列)
【0112】
【表3】
GENBANK登録番号AAD33353。
【0113】
(表4:HPV E7をコードするヌクレオチド配列)
【0114】
【表4】
GENBANK登録番号AF125673のヌクレオチド562〜858。
【0115】
DNAワクチン接種:遺伝子銃粒子媒介性DNAワクチン接種を、標準的なプロトコルに従って、ヘリウム駆動型遺伝子銃(BioRad,Hercules,CA)を使用して行った。簡単には、25mgの1.6μm金マイクロキャリア(Bio−rad,Hercules,CA)および100μlの0.05M スペルミジン(Sigma,St,Louis,MO)を合わせることによって、DNAコーティング金粒子を調製した。プラスミドDNA(50μg)および1.0M CaCl2(100μl)を、渦流により混合しながら、連続的にマイクロキャリアに添加した。この混合物を、室温(RT)で10分間沈殿させた。次いで、マイクロキャリア/DNA懸濁液を遠心分離し(10,000r.p.m.で5秒間)、そして新しい無水エタノールで3回洗浄し、その後、無水エタノール中のポリビニルピロリドン(0.1mg/ml)(Bio−rad,Hercules,CA)(3ml)中に再懸濁した。次いで、この溶液をチュービングに充填し、そして4分間静置した。エタノールを穏やかに除去し、そしてこのチューブを回転することによって、このチュービングの内面にこのマイクロキャリア/DNA懸濁液を均一に付着させた。次いで、このチューブを、0.4リットル/分の窒素ガス流で乾燥させた。次いで、マイクロキャリア/DNAでコーティングされた乾燥チュービングを、0.5インチの薬筒に切断し、そしてキャップ付きの乾燥ビン中で4℃で保存した。結果として、各薬筒は、1μgのプラスミドDNAおよび0.5mgの金を含んだ。DNAコーティング金粒子(1μg DNA/ビュレット)を、ヘリウム駆動型遺伝子銃(Bio−rad,Hercules,CA)を400p.s.i.の排出圧で使用して、マウスの剃毛した腹部領域に送達した。
【0116】
ELISPOTアッセイ:標準的なELISPOTアッセイを使用して、HPV−16E7特異的CD8+T細胞を検出した。96ウェル濾過プレート(Millipore,Bedford,MA)を、50μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中10μg/mlのラット抗マウスIFN−γ抗体(クローンR4−6A2、Pharmingen,San Diego,DA)でコーティングした。4℃で一晩インキュベートした後、このウェルを洗浄し、そして10%ウシ胎児血清を含む培養液でブロックした。ワクチン接種したマウス群の各々から新しく単離した、異なる濃度の脾細胞(1×106/ウェルから始めた)を、15U/mlのインターロイキン−2と共にウェルに添加した。細胞を、1μg/mlのE7特異的H−2DbCTLエピトープ(E7、残基49〜57;配列番号5)と共にかまたはE7特異的H−2DbCTLエピトープなしで、37℃で24時間インキュベートした。培養後、このプレートを洗浄し、次いでこの細胞を、50μlのPBS中5μg/mlのビオチン化IFN−γ抗体(クローンXMG1.2、Pharmingen)と共に、4℃で一晩インキュベートした。6回洗浄した後、50μlPBS中1.25μ/mlのアビジン−アルカリホスファターゼ(Sigma,St.Louis,MO)を添加し、そして室温で2時間インキュベートした。洗浄後、50μlのBCIP/NBT溶液(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を添加することによって、スポットを発色させ、そして室温で1時間インキュベートした。このスポットを解剖顕微鏡を使用して数えた。
【0117】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー:未処置の群のマウスまたはワクチン接種した群のマウス由来の脾細胞を、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(残基49〜57;配列番号5)、またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(残基30〜67;配列番号6)のいずれかと共にインキュベートした。タンパク質またはポリペプチドのどの残基がMHCクラスI抗原性エピトープを提示するかを決定する方法は、当該分野で周知である。E7ペプチドを、20時間、2μg/mlの濃度で添加した。E7特異的CD8+T細胞前駆体およびE7特異的CD4+Tヘルパー細胞応答を検出するために、それぞれ、CD8+CTLエピトープの残基49〜57および残基30〜67を使用した。GolgistopTM(Pharmigen,San Diego,CA)を6時間添加し、その後、培養液から細胞を収集した。次いで、細胞をFACSCAN緩衝液で1回洗浄し、そしてフィコエリトリン(PE)結合したモノクローナルラット抗マウスCD8またはCD4抗体(Pharmingen,San Diego,CA)で染色した。メーカーの使用説明書(Parmingen)に従って、Cytofix/CytopermTMキットを使用して、細胞を、細胞内サイトカイン染色に供した。FITC結合抗IFN−γまたは抗IL−4抗体、および免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体(ラットIgG1)は全てPharmingenから購入した。CELLQuestTMソフトウエアを備えるBecton−Dickenson FACScanTM(Becton Dickson Immunocytometry System,Mountain Veiw,CA)で分析を行った。
【0118】
サイトカインのELISA:脾細胞(4×106)を、最後のワクチン接種の2週間後に収集し、そして24ウェル組織培養プレート中で、全容量2mlのRPMI 1640中10μg/mlのE7タンパク質(10%(vol/vol)ウシ胎児血清、50ユニット/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM 非必須アミノ酸を補充)と共に72時間培養した。上清を収集し、そしてメーカーのプロトコルに従ってELISAキット(Endogen)を使用して、IFN−γおよびIL−4の存在についてアッセイした。
【0119】
抗E7 ELISA:血清中の抗HPV 16E7抗体を、標準的な直接ELISAによって決定した。96μウェルプレートを、10μ/mlの細菌由来HPV−16E7タンパク質(100μl)でコーティングし、そして4℃で一晩インキュベートした。次いで、このウェルを、20%ウシ胎児血清を含有するPBSでブロックした。免疫化後14日のマウスから血清を調製し、PBSで連続的に希釈し、ELISAウェルに添加し、そして37℃で2時間インキュベートした。0.05% Tween−20を含有するPBSで洗浄した後、このプレートを、1/2000希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed,San Francisco,CA)と共に室温で1時間インキュベートした。このプレートを6回洗浄し、TMB(Pierce,Rockford,IL)を用いて発色させ、そして1m H2SO4を用いてとめた。ELISAプレートを標準的なELISA読みとり器を用いて、450nmで読みとった。
【0120】
マウス腫瘍細胞株:マウス腫瘍細胞株TC−1を、標準的な組織培養方法を使用して増殖し、維持した。マウスにおける腫瘍細胞株の増殖および形質転換細胞による腫瘍の形成は、ヒト癌の当該分野で認められたモデルである。HPV−16 E6、E7およびras癌遺伝子を使用して、初代C57BL/6マウス肺上皮細胞を形質転換した。この細胞を、5% CO2、37℃で、RPMI 1640(10%(vol/vol)ウシ胎児血清、50ユニット/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM 非必須アミノ酸、および0.4mg/ml G418を補充)中で増殖させた。腫瘍チャレンジの日に、TC−1細胞をトリプシン処理によって収集し、1X Hanks緩衝化塩溶液で2回洗浄し、最後に、1X Hanks緩衝化塩溶液に再懸濁して、注射のために指示された濃度にした。
【0121】
マウス:6〜8週齢の雄性C57BL/6マウスを、National Cancer Institute(Frederick,Maryland)から購入した。
【0122】
インビボ腫瘍保護:マウス(5匹/群)を、遺伝子銃によって、2μgのHSP DNA、E7 DNA、E7−HSP70 DNA、または挿入物を有さない空のプラスミドでワクチン接種した。1週間後、このマウスを初めのワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス(5匹/群)を、1回ワクチン接種した(さらなるブースターなし)。最後のワクチン接種の1週間後、マウスの右脚に、5×104細胞/マウスのTC−1腫瘍細胞を皮下にチャレンジし、次いで1週間に2回モニタリングした。
【0123】
インビボ腫瘍処置:腫瘍細胞およびDNAワクチンを、上記のように調製した。マウスの右脚に、2×104細胞/マウスのTC−1腫瘍細胞を皮下にチャレンジした。TC−1腫瘍細胞を用いてチャレンジした3日後に、マウスに、2μgのHSP DNA、E7 DNA、E7−HSP70 DNA、または挿入物を有さない空のプラスミドを、遺伝子銃で与えた。1週間後、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス(5匹/群)を、1回ワクチン接種し、腫瘍チャレンジ後にさらにブーストしなかった。マウスを1週間に2回モニタリングした。
【0124】
インビボ抗体枯渇:インビボ抗体枯渇を、標準的な方法を使用して行った。C57BL/6マウスに、遺伝子銃によって2μgのE7−HSP70 DNAをワクチン接種し、1週間後にブーストし、そして5×104細胞/マウスのTC−1腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの1週間前に枯渇を開始した。CD−4特異的モノクローナル抗体(例えば、MAb GK1.5)を、CD4枯渇のために使用し、CD8特異的抗体(例えば、MAb2.43)を、CD8枯渇のために使用し、そしてNK細胞に結合する抗体(例えば、MAb PK136)を、NK1.1枯渇のために使用した。フローサイトメトリー分析によって、これらの適切なリンパ球サブセットの95%より多くが枯渇され、他のサブセットは正常なレベルであることが示された。枯渇は、腫瘍チャレンジの40日後に終結した。
【0125】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種はE7特異的CD8+T細胞媒介性免疫応答を増大する:CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍エフェクターの中で最も重要な成分の1つである。E7−HSP70 DNAワクチンによって生成したE7特異的CD8+T細胞前駆体の頻度を決定するために、酵素結合イムノスポット(ELISPOT)アッセイおよび細胞内サイトカイン染色を使用した。ELISPOTアッセイおよび細胞内サイトカイン染色の両方は、単一の細胞レベルでのIFN−γ産生を測定するために使用される高感度の機能的アッセイであり、従ってこれは、抗原特異的CD8+T細胞を定量するために用いられ得る。図1Aに示されるように、E7 DNAワクチン接種マウス由来の脾細胞106個あたり、わずか14個のE7(49〜57)特異的IFN−γスポット形成CD8+T細胞のみが検出されたことと比較して、E7−HSP70 DNAワクチン接種マウス由来の脾細胞106個あたり、この免疫優性Db制限E7(49〜57;配列番号5)ペプチドに対して特異的な435個のIFN−γスポット形成CD8+T細胞が検出された。pcDNA−3ベクターのみによって生成されたバックグラウンド(3スポット/106の脾細胞)を差し引くと、E7 DNAワクチンおよびE7−HSP70 DNAについて、それぞれ、11個および432個のE7(49〜57)特異的IFN−γスポット形成CD8+T細胞が生成された。同様に、E7(49〜57)特異的CD8+T細胞前駆体の量はまた、CD8および細胞内IFN−γの二重染色を使用して、フローサイトメトリー分析により決定し得る。このアッセイからの値(図1B)は、図1Aに示されるELISPOTの結果と密接に相関した。図1Bに示すように、E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、最大数のE7特異的IFN−γ+CD8+T細胞前駆体を生成し(フローサイトメトリー分析によると約726/106脾細胞)、一方、E7 DNAをワクチン接種したマウスは、ベクター−ワクチン接種したコントロール以上のシグナルを示さなかった。これらのデータは、HSP70またはそのフラグメントをコードするDNAに作動可能に連結されたE7のMHCクラスI制限エピトープが、E7特異的CD8+T細胞前駆体の頻度を少なくとも30倍増加することを示す。
【0126】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種はE7特異的CD4+T細胞媒介性免疫応答を増大しない:E7−HSP70 DNAワクチンにより生成されるE7特異的CD4+T前駆細胞およびサイトカインプロフィールを決定するために、免疫化マウス由来の脾細胞上のCD4表面マーカーおよび細胞内IFN−γまたはIL−4の二重染色を行い、続いて、フローサイトメトリー分析を行った。免疫化マウス由来の脾細胞を、E7ペプチド(残基30〜67;配列番号6)と共に、インビトロで一晩培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。E7ペプチド(残基30〜67;配列番号6)は、HPV−16のE7オープンリーディングフレーム中の大きいTヘルパーエピトープを含む。IFN−γ分泌CD4+T細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析した。図2に示すように、E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAまたはベクターのみをワクチン接種したマウスと比較して、類似の数のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を産生した。HSP70プラスミドと混合したE7 DNAをワクチン接種したマウスは、わずかに多くのCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成したが、ワクチン接種した各群の間のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞数の統計的に有意な差違はなかった。
【0127】
E7特異的CD4+T細胞を検出するCD4染色 対 細胞内IFN−γ染色の能力に対する陽性コントロールとして、Sig/E7/LAMP−1(これは、MHCクラスII分画にE7を標的化する)を発現するDNAワクチンをワクチン接種したマウスの分析は、E7 DNAまたはコントロールプラスミドをワクチン接種したマウスと比較して、3倍のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞の増加を示した。様々なDNAワクチンをワクチン接種したマウスにおけるIL−4分泌E7特異的CD4+T細胞もまた分析した。E7−HSP70 DNA、HSP70 DNAと混合したE7 DNA、野生型E7 DNA、空のプラスミドDNAを接種されたマウスにおいても、ワクチン接種していないマウスにおいても、有意なCD4+IL−4二重陽性細胞は同定され得なかった。MICK−2 IL−4分泌細胞(Pharmingen,San Diego,CA)を陽性コントロールとして使用して、この研究についての首尾良い細胞質内IL−4染色を確認した。これらのデータは、熱ショックタンパク質の全てかまたは一部をコードするDNAを含む本発明のDNAワクチンが、CD4+免疫応答と独立して、そのワクチンによってコードされるエピトープに対するCD8+免疫応答を引き起こすことを示す。
【0128】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種はE7特異的抗体を生成しない:ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV 16E7抗体の量を、最後のワクチン接種の2週間後に、直接酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって決定した。抗E7抗体は、ワクチン接種した群のいずれのマウスの血清においても検出され得なかった(図3)。市販の抗E7モノクローナル抗体(Zymed,San Francisco,CA)、およびSig/E7/LAMP−1キメラを含むワクチンウイルスをワクチン接種したマウス由来の血清を陽性コントロールとして使用して、この研究のために首尾良い抗E7 ELISAを保証した。この結果は、E7 DNAまたはE7−HSP70 DNAワクチンのいずれかによる見かけのE7特異的CD4刺激が全くないことと一致した。
【0129】
E7−HSP70融合体DNAのワクチン接種は腫瘍の増殖に対する保護を増大する:E7−HSP70 DNA構築物のワクチン接種がE7発現腫瘍からマウスを保護するか否かを決定するために、異なる用量のDNAワクチンを使用して2つのインビボ腫瘍保護実験を行った。第1の実験について、マウスに、2μgの裸のDNA/マウスを遺伝子銃でワクチン接種し、そして1週間後に同じ用量の裸のDNAをブーストした。第2の実験について、マウスに、2μgの裸のDNA/マウスを遺伝子銃でワクチン接種し、さらなるブーストはしなかった。次いで、最後のワクチン接種の7日後に、このマウスの右脚に、5×104TC−1/マウスを皮下にチャレンジした。ワクチン接種とブースターを受けたマウスについて、E7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたマウスの100%は、TC−1チャレンジの60日後において腫瘍を有さないままであり、一方、E7DNA(HSPコードDNAなし)ワクチン接種を受けたマウスの40%のみが、腫瘍を有さないままであった。逆に、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミドまたはHSP DNAを受けたマウスの全ては、腫瘍チャレンジの15日以内に腫瘍増殖を発症した(図4A)。ブースターなしで一回のワクチン接種を受けたマウスについて、E7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたマウスの100%は、TC−1チャレンジの60日後も腫瘍を有さないままであり、一方、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミド、HSP70 DNAまたはE7 DNAを受けたマウスの全ては、腫瘍チャレンジの15日以内に腫瘍増殖を発症した(図4B)。
【0130】
E7−HSP70 DNAによって生成される抗腫瘍効果が長く継続するか否かを決定するために、これらの腫瘍を有さない動物の右脚に、5×104TC−1細胞/マウスを皮下に再チャレンジした。腫瘍の再チャレンジの30日後まで、腫瘍増殖は観察されなかった(図4A〜B)。要約すると、これらの結果は、HSPポリペプチドをコードするDNA(例えば、E7−HSP70融合体DNA)に作動可能に連結されたMHCクラスI制限抗原性エピトープをコードするDNA構築物は、クラスI制限エピトープを発現する腫瘍(例えば、TC−1腫瘍)の増殖に対する抗腫瘍免疫性を有意に増大することを示す。抗腫瘍効果は、よりストリンジェントな条件下(ブースターワクチンが投与されない)で試験される場合でさえも観察された。E7−HSP70 DNA構築物によって生成される抗腫瘍免疫性は、長く継続した。
【0131】
(樹立されたE7発現腫瘍を有する、E7−HSP70融合DNA欠損(cure)マウスによる治療ワクチン接種):樹立されたTC−1腫瘍を根絶する際のDNAワクチンの効力を試験するために、インビボ腫瘍処置実験を、種々の用量のDNAワクチンを使用して実施した。TC−1細胞を、まず、2×104細胞/マウスの用量でC57BL/6マウスに右脚に皮下注射した。3日後、各マウスを、コントロールプラスミドDNA、HSP70 DNA、野生型E7 DNA、またはE7−HSP70DNAのいずれか2μgを用いて、遺伝子銃を介して皮内処置した。第1の実験について、マウスに、初回免疫(priming)の7日後に、同じワクチン用量で追加免疫(booster)した。第2の実験について、マウスに、初回刺激後にさらなる追加免疫を与えなかった。図5Aに示されるように、追加免疫DNAワクチン接種を受けたマウスについて、TC−1腫瘍は、このE7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたマウスの80%から排除されたが、ワクチン接種しなかったマウスおよび空のプラスミド、HSP70 DNAもしくはE7 DNAを受けたマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後20日以内に、腫瘍増殖を発症した。追加免疫を伴わず1回ワクチン接種を受けたマウスについて、E7−HSP70 DNAワクチン接種を受けたものの60%が、TC−1チャレンジの70日後に腫瘍を有さないままであったが、ワクチン接種しなかったマウスおよび空のプラスミド、HSP70 DNAもしくはE7 DNAを受けたマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後20日以内に、腫瘍増殖を発症した(図5B)。要約すれば、これらの結果は、(HSPポリペプチドをコードするDNAの非存在下での)野生型E7 DNAでのワクチン接種は、マウスにおける以前に接種されたE7発現腫瘍を根絶しなかったが、HSPポリペプチドをコードするDNAと作動可能に連結されたE7をコードするDNA(例えば、E7−HSP70 DNA)でのワクチン接種は、樹立されたE7発現腫瘍を根絶したことを示した。これらのデータは、E7−HSP70 DNAが抗腫瘍免疫を有意に増強すること、およびDNAワクチン構築物中のHSPポリペプチドをコードするDNAの存在が、このDNAワクチンにより生じる抗腫瘍免疫を、従来のDNAワクチン(すなわち、HSPポリペプチドをコードするDNAを含まないワクチン)により生じる免疫のレベルと比較して増強することを、示した。
【0132】
(HSP70をコードする配列への抗原性エピトープをコードするDNAの融合は、抗腫瘍免疫の生成に必要である):HSP70へのE7の融合が抗腫瘍免疫に必要であったか否かを決定するために、E7−HSP70 DNAを、HSP70 DNAと混合されたE7−DNAと比較し、そしてその抗腫瘍免疫を生じる能力を測定した。E7 DNAおよびHSP70 DNAの両方を同じ細胞へ送達するのを確実にするため、このE7 DNAを、弾丸(bullet)調製前にHSP70 DNAと混合した。従って、単一の弾丸が、E7 DNAおよびHSP70 DNAの両方を含む。免疫学的アッセイおよび腫瘍防御実験(ワクチン追加免疫なし)を、上記のように実行した。このデータは、E7−HSP70 DNAのみがE7特異的CD8+ T細胞媒介性免疫応答を増強することを示した。HSP70 DNAをE7 DNAと混合すると、CD8+ T細胞媒介性免疫応答を増強しなかった。腫瘍防御実験について、E7−HSP70 DNAでワクチン接種したマウスのすべてが、腫瘍チャレンジの60日後に腫瘍を有さないままであった。対照的に、ワクチン接種していないマウスまたはHSP70 DNAと混合したE7 DNAでワクチン接種したマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後15日以内に腫瘍増殖を発症した(図6)。HSP70 DNAへのE7 DNAの融合は、抗腫瘍免疫の生成に必須であった。これらの結果は、MHCクラスI拘束抗原性エピトープをコードするDNAを、APC結合エピトープをコードするDNAおよび/または細胞質トランスロケーションポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結しなければならないことを示す。
【0133】
(CD8+T細胞(CD4+ T細胞またはNK細胞ではない)は、HSP70に融合されたE7を用いるDNAワクチンにより生じる抗腫瘍効果に必須である):E7陽性腫瘍細胞の拒絶に重要であるリンパ球のサブセットを決定するために、インビボ抗体枯渇(depletion)実験を実施した。この抗体枯渇は、腫瘍チャレンジの1週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジの40日後に終了した。図7に示されるように、すべてのナイーブマウスおよびCD8+T細胞を枯渇されたマウスすべては、腫瘍チャレンジ後14日以内に腫瘍を増殖した。対照的に、非枯渇マウスのすべておよびCD4+T細胞枯渇マウスまたはNK1.1細胞枯渇マウスのすべてが、腫瘍チャレンジ50日後に腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、DNAワクチンが、CD4非依存性様式でCD8+T細胞を活性化したこと、およびこれらのCD8+T細胞が、E7−HSP70 DNAワクチンにより生じる抗腫瘍免疫に必須であることを、示す。
【0134】
(CD8+T細胞を刺激する際のHSPの役割):本発明は、いかなる特定の機構によっても制限されないが、本発明のキメラ核酸およびDNAワクチンのHSP70ドメインが、抗原に対する「シャペロン」として作用し得、例えば、このHSP70ドメインがCD8+T細胞の誘導を最適にするように適切な細胞型にその抗原ペプチドを移動するためのシャペロニンであり得る。銃式DNA送達は、皮膚前駆体中にDNAを直接導入する。E7−HSP70 DNAでトランスフェクトした樹状細胞(DC)は、HSP70を発現した。HSP70は、タンパク質のフォールディング、輸送および分解において複数の役割を果す、細胞質ゾルHSPである。これは、MHCクラスI拘束抗原のプロセシングに関与する。従って、このDNAワクチンによりコードされるHSP融合産物を、プロテアソームプロセシングのためにより効率的に標的化し得る。
【0135】
CD8+T細胞は、遺伝子銃媒介性E7−HSP70 DNAワクチン接種において重要な役割を果たし得る。本明細書中に記載されるデータは、CD8+T細胞が、抗腫瘍免疫のエフェクター段階において必要であることを示した。対照的に、CD4+細胞の枯渇またはNK1.1+細胞の枯渇は、E7−HSP70 DNAにより生じる抗腫瘍免疫を減少しなかった。この知見は、タンパク質ベースのHSPワクチンを使用するアプローチと対照的である。このタンパク質ベースのHSPワクチンを使用するアプローチは、CD4+ T細胞およびCD8+T細胞ならびにNK細胞が、腫瘍細胞由来のgp96調製物を使用する抗腫瘍免疫のエフェクター段階において必要であることを示した。
【0136】
プロフェッショナルAPCにより取り込まれるHSP複合体は、MHC−I抗原提示経路へとHSP結合ペプチドを導入することに関与し得る。活性化されたB細胞および単核細胞のみが、HSP70を取り込み得るが、活性化T細胞は、HSP70を輸送しないかもしれない。HSPのレセプター媒介性取り込みがHSP/ペプチド複合体タンパク質ワクチンにとって重要であるが、遺伝子銃媒介性E7−HSP70 DNAワクチンにおける役割を果す見込みがない。このDNAワクチンによりコードされる組換えE7−HSP融合遺伝子は、遺伝子銃を介してDCに直接送達され、レセプター媒介性エンドサイトーシスの必要性を回避した。APCの交差初回免疫(cross−priming)もまた生じ得る。なぜなら、E7−HSP70が他の細胞型(例えば、ケラチノサイト(これもまた遺伝子銃ワクチン接種によりトランスフェクトされた))から放出され得、次いでレセプター媒介性エンドサイトーシスを介してDCに侵入し得るからである。
【0137】
HSP70へのE7の融合が必要なことは、おそらくHSP70 T細胞エピトープの付加が原因で、E7がより免疫原性になることを示唆する。HSP70 DNAによるワクチン接種は、(病原体への先の曝露に起因して)個体に存在し得るHSP70反応性T細胞のプールを拡大する。これらのHSP70反応性T細胞は、結合体化ペプチドに対して反応する強力なヘルパー効果を発揮し得;これは、ELISPOTアッセイにより検出されそして細胞内サイトカイン染色により検出された、E7特異的CD8+T細胞前駆体頻度分布の増加をもたらす機構であり得た。この増加は、E7−HSP70融合遺伝子によりワクチン接種したマウスにおいて観察されたが、HSP70プラスミドと混合したE7プラスミドによりワクチン接種したマウスにおいては観察されなかった。
【0138】
HSPは、抗原非依存性機構を介して、インビボおよびインビトロでT細胞を直接活性化し得る。抗原ペプチドの非存在下で、HSPは、抗原特異的CTLクローンのTNF−αおよびIFN−γの選択を誘導し得る。ヒトHSP−60は、先天免疫系に対する危険シグナルとして作用し得、そしてTヘルパー1(TH1)炎症誘発(proinflammatory)応答を誘導し得る。しかし、E7特異的CD4+T細胞の数の有意な増加は、HSP70 DNA単独でワクチン接種したマウスでもHSP70プラスミドと混合したE7プラスミドでワクチン接種したマウスでも観察されなかった。このDNAワクチンのHSP成分により刺激したγδ T細胞もまた、E7−HSP70 DNAワクチンにより生じる抗腫瘍効果に関与し得る。
【0139】
E7−HSP70は、増強されたMHCクラスI提示を通じて強力なCD8+ T細胞応答を生じるが、MHCクラスII提示経路に抗原を標的化する他の構築物は、増強されたCD4+ T細胞応答を提供し得る。MHCクラスI拘束経路およびMHCクラスII拘束経路を直接増強するワクチンの投与を、同時投与し得る。例えば、E7のMHCクラスII提示経路を増強するためのLAMP−1エンドソーム/リソソーム標的化シグナルを第2のDNAがコードするDNA構築物(例えば、キメラSig/E7/LAMP−1 DNAワクチン)を、抗原特異的CD4+T細胞を刺激するために、本発明の核酸およびワクチンと同時投与し得る。MHCクラスII標的化ワクチン(例えば、Sig/E7/LAMP−1)と組み合わせた、本明細書中に記載されるE7−HSP70ワクチンは、相乗様式で免疫系の複数のアーム(arm)を活性化し得、有意に増強されたCD4+ T細胞応答およびCD8+ T細胞応答ならびに強力な抗腫瘍効果をもたらし得る。
【0140】
これらの結果は、本発明の例示的キメラ核酸(HSP70およびHPV−16 E7融合タンパク質をコードする、DNA融合構築物)は、バリスティック(ballistics)により投与されるDNAワクチンの形態で、抗原E7単独をコードするDNAワクチンよりも強力な、E7特異的CD8+ T細胞媒介性免疫応答およびHPV−16 E7発現マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果を生じ得ることを示す。従って、これらのデータは、抗原遺伝子(またはそのフラグメント)へのHSP70配列の融合(および、本明細書中に記載されるような、カルボキシ末端HSPドメインの融合)が、DNAワクチンの効力を大いに増強することを示す。このストラテジーは、病理(例えば、感染性疾患)の予防および処置、ならびに腫瘍および癌の系(特に既知の腫瘍特異的抗原を有する系)に対して、適用可能である。
【0141】
(実施例2:GM−CSFおよびPseudomonas外毒素AのトランスロケーションドメインをコードするDNA配列を抗原遺伝子に連結することによるDNAワクチン効力の増強)
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、インビボで抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強するためおよび腫瘍を処置するために有効であることを示す研究を記載する。
【0142】
免疫原性「融合タンパク質」組成物をコードするキメラ核酸を構築した。そのDNAは、抗原をコードする配列に(作動可能に連結された)GM−CSF(またはそのフラグメント)ドメインをコードした。本発明はいかなる特定の機構によっても限定されないが、生じる融合タンパク質は、その中に含まれる抗原の、GM−CSFレセプターを発現する細胞(例えば、プロフェッショナルAPCおよびその前駆体)への標的化を増強し得た。ETAポリペプチド(例えば、Pseudomonas外毒素AのドメインII(ETA(dII))(配列番号3)をコードするDNAの存在は、MHCクラスI提示を増強するように、エンドソーム区画/リソソーム区画から細胞質への抗原のトランスロケーションを媒介し得る。
【0143】
DNAキメラ(GM−ETA(dII)−E7)を、GM−CSFおよびETA(dII)をコードするDNA配列を、モデル抗原E7の遺伝子に融合することによって作製した。ヒト癌の当該分野で認識されるマウスモデルを、その構築物により惹起される免疫原性および抗腫瘍活性を評価するために使用した。GM−ETA(dII)−E7キメラDNAワクチンを使用するマウスの免疫は、筋肉内注射もしくは皮内注射を介して、E7発現マウス腫瘍細胞株(TC−1)に対する、E7特異的なCD8+ T細胞免疫応答およびCD4+ T細胞免疫応答ならびに有効な抗腫瘍防御および処置を増強した。この劇的な抗腫瘍効果は、他の構築物(特に、GM−E7、ETA(dII)−E7、またはGM−ETA(dII))をコードするDNAワクチンにおいては観察されなかった。本明細書中に記載されるDNAワクチン接種ストラテジーは、癌および病原性微生物による感染についての抗原特異的免疫療法に有用である。
【0144】
(外因性抗原のMHCクラスI提示の改善は、Pseudomonas外毒素AのドメインII(ETA(dII))を使用して試験され得るDNAワクチン効力を増強するためのストラテジーである):ETAは、タンパク質合成をブロックする、細菌Pseudomonas aeruginosa由来の毒素である。ドメインIIすなわちETA(dII)は、エンドソーム区画/リソソーム区画から細胞質へのトランスロケーションを可能にし、これは、外因性抗原のMHCクラスI提示の増強をもたらす。ドメインIはLDL結合を担い、そしてドメインIIIはADP−リボシルトランスフェラーゼと結合する毒性能力を有し、ETAのこれら望ましくない部分は置換もしくは欠失される。下記のデータは、DNAキメラ(GM−ETA(dII)−E7)を使用して生成された。HPV−16 E7を、モデル抗原として使用した。なぜなら、これは、HPV関連悪性疾患において広範に発現されそして十分に特徴付けられている、臨床的に関連する腫瘍形成タンパク質であるからである。GM−CSF DNAは、種々のAPCに取り込まれ得、樹状細胞(DC)成熟の増強を誘導する。抗原と連結することにより、GM−CSFはまた、GM−CSFレセプター(GM−CSF−R)を発現する細胞(例えば、プロフェッショナルAPCおよびその前駆体)へのその抗原の標的化を増強し得る。DNA形態である抗原と連結したETA(dII)は、エンドソーム区画/リソソーム区画から細胞質へと抗原をトランスロケートでき得、増強したMHCクラスI提示を生じ得る。GM−ETA(dII)−E7の例に従って設計されたキメラDNA構築物によるワクチン接種は、MHCクラスI拘束経路およびMHCクラスII拘束経路の両方の活性化に必要な能力提供し、増強されたE7特異的免疫応答および抗腫瘍効果を生じる。
【0145】
以下の材料および方法を、下記のデータを生成するために使用した。
【0146】
(プラスミドDNA構築物および調製):マウスGM−CSFをコードするDNAフラグメントを、5’末端プライマー
【0147】
【化1】
(配列番号11)および3’末端プライマー(EcoRI)
【0148】
【化2】
(配列番号12)を用いるPCRにより得た。GM−CSFを形質導入したB−16黒色腫細胞から生成したcDNAを、PCRのために鋳型として使用した。
【0149】
(表5;マウスGM−CSFのアミノ酸配列)
【0150】
【表5】
(配列番号1);GENBANK登録番号X02333。
【0151】
(表6:マウスGM−CSFのcDNA配列)
【0152】
【表6】
(配列番号2);GENBANK登録番号X05906;「atg」開始部位に下線を付す。
【0153】
増幅産物を、その後pSP73ベクター(Promega)のBglII部位およびEcoRI部位にクローニングして、pSP73−GMを生成した。同じストラテジーを、ヒトGM−CSF(GENBANK登録番号M11220)を使用して、NA構築物を作製するために使用した。あるいは、第1のDNAは、Flt−3リガンド(FL)、CTLA−4、4−1BB、CD40リガンド、またはTNFレセプターのすべてはまたAPC結合フラグメントをコードする。これらのタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、当業者に容易に利用可能である。所定のポリペプチドまたはタンパク質が抗原提示細胞(APC)(例えば、マクロファージまたはDC)に結合するか否かを決定することはまた、当該分野で公知である。例えば、そのポリペプチド(ならびにAPCに結合しないことが公知であるコントロールポリペプチド)を、検出可能なマーカーで標識し、そしてAPCとともにインキュベートする。その細胞を洗浄した後、(コントロールと比較した)APC上またはAPC中の標識の検出は、そのポリペプチドがAPC結合ドメインまたはAPC結合配列を有することを示す。
【0154】
ETAのドメインIIを含むDNAフラグメントを、5’末端プライマー
【0155】
【化3】
(配列番号13)および3’末端プライマー
【0156】
【化4】
(配列番号14)を用いるPCRにより生成した。
【0157】
(表7:ETAのアミノ酸配列)
【0158】
【表7】
(配列番号3);GENBANK登録番号K01397 M23348;残基1〜25=シグナルペプチド;成熟ペプチドの開始は下線を付した「A」;トランスロケーションドメインは残基247〜417に広がる。
【0159】
(表8:ETAをコードするcDNA)
【0160】
【表8】
(配列番号4);GENBANK登録番号K01397 M23348。
【0161】
増幅された生成物を、引き続いてpSP73−GMのEcoRIおよびBamHI部位へクローニングし、pSP73−GM−ETA(dII)を生成する。HPV−16 E7を含むDNAフラグメントを、5’末端プライマー(5’−GGGAGGATCCTCATGCATGGAGATACACCT−3’(配列番号15))および3’末端プライマー(5’−GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG−3’(配列番号16))を用いてPCRによって合成した。プラスミドpCMVneoBamHI−E7を、このPCR反応についてテンプレートとして使用した。増幅された生成物を、さらにpSP73−GM−ETA(dII)のBamHIおよびHindIII部位へクローニングし、pSP73−GM−ETA(dII)−E7を生成した。GM−ETA(dII)−E7の配列を、DNA配列決定によって確認した。pcDNA3.1−GM−ETA(dII)−E7を、BglIIおよびHindII制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって得、そして単離されたGM−ETA(dII)−E7フラグメントをサイトメガロウイルスプロモーターの下流のpcDNA3.1(−)発現ベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−GM−ETA(dII)を、BglIIおよびBamHI制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA (dII)−E7の消化によって生成し、そして単離されたGM−ETA (dII)フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のBamHIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−ETA(dII)−E7を、EcoRIおよびHindIII制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって得、そして単離されたETA(dII)−E7フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のEcoRIおよびHindIIIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−GMを、pBglIIおよびBamHI制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって生成し、そして単離されたマウスGM−CSFフラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のBamHIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−ETA(dII)を、EcoRIおよびBamHI制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって得、そして単離されたETA(dII)フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のEcoRIおよびBamHIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−E7を、BamHIおよびHindIII制限酵素を用いるpSP73−GM−ETA(dII)−E7の消化によって生成し、そして単離されたE7フラグメントをpcDNA3.1(−)の特有のBamHIおよびHindIIIクローニング部位へクローニングした。pcDNA3.1−GM−E7の生成について、このE7フラグメントを、5’末端プライマー(5’−CCCAGATCTAATCATGCATG−3’(配列番号17))および3’末端プライマー(5’−GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG−3’(配列番号18))を用いてPCRによって合成した。増幅されたE7生成物を、BglIIIおよびHindIIIで消化し、そしてさらにpSP73−GMのBamHIおよびHindIII部位へクローニングした。GM−E7フラグメントを、BglIIおよびHindIIIでの消化によってpSP73−GM−E7から単離し、そしてpcDNA3.1(−)の特有のBamHIおよびHindII部位へクローニングした。
【0162】
これらの構築物の正確さを、DNA配列決定によって確認した。GM、ETA(dII)、E7、GM−ETA(dII)、ETA(DII)−E7、GM−E7またはGM−ETA(DII)−E7遺伝子挿入部分を有するプラスミドDNAおよび「空」のプラスミドベクターを、サブクローニング有効DH5(TM細胞(Life Technologies、USA))にトランスフェクトした。ついでこのDNAを増幅し、そして二重CsCl精製(BioServe Biotechnologies、Laurel、Maryland)を使用して精製した。プラスミドDNAの完全性およびEscherichia coli DNAまたはRNAの非存在を、1%アガロースゲル電気泳動を使用して各調製物について調べた。DNA濃度を、260nmでの吸光度測定によって決定した。挿入したE7フラグメントの存在を、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。
【0163】
(DNAワクチン接種):遺伝子銃粒子媒介DNAワクチン接種を、標準的プロトコールに従ってそして上に記載のようにヘリウム打ち込み遺伝子銃(Bio−Rad、Hercules、CA)を使用して実施した。
【0164】
(細胞形質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー):ナイーブまたはワクチン接種された群のマウス由来の脾細胞を、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(残基49〜57;配列番号5)またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(残基30〜67)と共にインキュベートした。E7ペプチドを、20時間2μg/mlの濃度で添加した。E7特異的CD8+T細胞前駆体およびE7特異的CD4+Tヘルパー細胞応答を検出するように、CD8+CTLエピトープ残基49〜57および残基30から67をそれぞれ使用した。Golgistop(Pharmigens、San Diego、CA)を培養物から細胞を収穫する6時間前に添加した。次いで、細胞をFACSCAN緩衝液中で1回洗浄し、そしてフィコエリトリン(PE)結合体化モノクローナルラット抗マウスCD8またはCD4抗体(Pharmingen、San Diego、CA)で染色した。細胞を、メーカー(Pharmingen)の指示に従ってCytofix/Cytopermキットを使用して細胞内のサイトカイン染色に共した。FITC結合体化抗IFN−γまたは抗IL−4抗体および免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体(ラットIgG1)は、Pharmingenからすべて購入した。分析をCELLQuestソフトウェアを用いるBecton−Dickenson FACScanで行った(Becton Dickson Immunocytometry System、Mountain View、CA)。
【0165】
(マウスおよびマウス腫瘍細胞):マウスならびに腫瘍細胞(TC−1細胞など)の生成および維持は、上の実施例1に記載した。
【0166】
(インビボ腫瘍保護):腫瘍保護実験のため、マウス(グループあたり5匹)を、遺伝子銃を介してGM、ETA(dII)、E7、GM−ETA(dII)、ETA(DII)−E7、GM−E7またはGM−ETA(DII)−E7遺伝子挿入部分および「空」プラスミドベクターを有する2μgのプラスミドDNAでワクチン接種した。1週間後、マウスを最初のワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス(グループあたり5匹)を、1回ワクチン接種した(さらなるブースト無しに)。最後のワクチン接種1週間後、マウスを右脚に皮下的に5×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞でチャレンジし、週2回モニターした。
【0167】
(インビボ抗体枯渇):インビボ抗体枯渇の方法を、上に記載している。簡単には、C57BL/6マウスを、遺伝子銃を介して2μgGM−ETADII−E7 DNAでワクチン接種し、1週間後ブーストし、そして5×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞でチャレンジした。枯渇を、腫瘍チャレンジの1週間前に開始した。MAb GK1.5をCD4枯渇について使用し、MAb2.43をCD8枯渇について使用し、そしてMAb PK136をNK1.1枯渇について使用した。フローサイトメトリー分析は、適切なリンパ球サブセットの95%より多くを、通常レベルの他のサブセットで枯渇することを示した。枯渇を腫瘍チャレンジ後40日で終了した。
【0168】
(GM−ETA(dII)−E7融合DNAワクチンの生成および特徴づけ):GM−ETA(dII)−E7、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)、およびE7の構築物を示す略図を図8に示す。
【0169】
(GM−ETA (dII)−E7融合DNAでのワクチン接種は、E7特異的CD8+T細胞媒介免疫応答を高める):CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍エフェクターの間で最も重大な成分の1つである。GM−ETA(DII)−E7 DNAワクチンで生成されるE7特異的CD8+T細胞前駆体頻度を決定するように、細胞内サイトカイン染色を使用した。E7(49−57)特異的CD8+T細胞前駆体の量を、CD8および細胞内IFN−γに対する二重染色を使用するフローサイトメトリー分析によって決定した。このアッセイからの値は、示されるELISPOT結果に近く相関した。図9に示すように、GM−ETA(dII)−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、フローサイトメトリー分析により最も高い数のE7特異的IFN−γ+CD8+T細胞前駆体を生成した。一方、E7、GM−CSF、ETA(dII)、GM−ETA(dII)、GM−E7、またはETA−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、ベクターワクチン接種コントロールより大きくシグナルを示さなかった。
【0170】
(GM−ETA(dII)−E7融合DNAのワクチン接種もまた、E7特異的CD4+T細胞媒介免疫応答を高める):E7特異的CD4+T細胞前駆体細胞およびGM−ETA(dII)−E7 DNAワクチンによって生成されるサイトカインプロファイルを決定するように、二重染色を、免疫化マウス由来の脾細胞上のCD4表面カーカーおよび細胞内IFN−γに対して実施し、引き続きフローサイトメトリーを実施した。免疫化マウス由来の脾臓細胞をE7ペプチド(配列番号7の残基30から67)と共にインビトロで一晩培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方に対して染色した。E7ペプチド(配列番号7の残基30から67)は、HPV−16のE7オープンリーディングフレームタンパク質におけるメジャーTヘルパーエピトープを含む。タンパク質またはペプチドのポリペプチド配列内のTヘルパー細胞エピトープを決定する方法は、当該分野で周知である。
【0171】
IFN−γ分泌CD4+T細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用して分析した。図10に示すように、GM−ETA(dII)−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、E7 DNA、GM−CSF、ETA(dII)、GM−ETA(dII)、ETA−E7 DNAまたはベクター単独でワクチン接種されたマウスと比較してより多くの数のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成した。GM−ETA(dII)−E7 DNAでワクチン接種されたマウスは、類似のレベルのE7特異的CD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成した。これらの結果は、GM−CSFが、ワクチン接種されたマウスにおいてIFN−γ分泌E7特異的CD4+T細胞を高める際に重要な役割を果たすことを示す。これらの結果はまた、標的抗原をコードするDNAに作動可能に連結されたGM−CSFコード配列を含むDNAワクチンが、抗原コード配列単独を含むワクチンより強力であることを示す。
【0172】
(GM−ETA(dII)−E7融合DNAを有するワクチン接種は、TC−1腫瘍の成長に対するマウスの保護を高める):GM−ETA(dII)−E7 DNA構築物でのワクチン接種が、E7発現腫瘍に対してマウスを保護するかどうかを決定するように、インビボ腫瘍保護実験を、種々のDNAワクチンを使用して行った。マウスを、遺伝子銃を介して2μgの裸のDNA/マウスでワクチン接種し、そして1週間後同じ用量でブーストした。次いでこのマウスを、最後のワクチン接種7日後に右脚に皮下に5×104TC−1/マウスでチャレンジした。GM−ETA(dII)−E7 DNAワクチン接種を受けた100%のこれらのマウスのすべては、TC−1チャレンジ後30日無腫瘍を維持したが、ワクチン接種されていないマウスおよびE7、GM−CSF、ETA(dII)、GM−ETA(dII)、GM−E7、ETA−E7 DNAまたは空のプラスミドを受けたマウスは、腫瘍チャレンジ後15日以内に腫瘍増殖を起こした(図11)。GM−ETA(dII)−E7 DNAによって生じた抗腫瘍効果が、長く持続するかどうかを決定するために、これらの無腫瘍動物を、5×104TC−1細胞/マウスで左脚の皮下に再チャレンジした。腫瘍増殖は、腫瘍再チャレンジ後30日まで観察されなかった。これらの結果は、GM−ETA(dII)−E7融合DNAが、有意にTC−1腫瘍の増殖に対する抗腫瘍免疫性を高め、そしてGM−ETA(DII)−E7 DNAによって生じた抗腫免疫性が、長く持続することを示した。
【0173】
(CD8+T細胞は、GM−ETA(dII)−E7 DNAワクチンによって生じる抗腫瘍効果について必須である):E7陽性腫瘍細胞の拒絶に重要なリンパ球のサブセットを決定するために、インビボ抗体枯渇実験を行った。抗体枯渇は、腫瘍チャレンジ1週間前に始め、そして腫瘍チャレンジ後図12に示す日で終了した。図12に示すように、すべてのナイーブマウスおよびすべてのCD8+T細胞の枯渇マウスは、腫瘍チャレンジ後14日以内に腫瘍を増殖した。対照的に、すべての非枯渇マウスおよびすべてのCD4+T細胞またはNK1.1細胞の枯渇マウスは、腫瘍チャレンジ後無腫瘍日を維持した。これらの結果は、CD8+T細胞が、GM−ETAdII−E7 DNAワクチンによって生じる抗腫瘍免疫性について必須であることを示す。
【0174】
本明細書中で記載されるデータは、本発明のキメラ核酸(DNA構築物(APC結合ドメイン、細胞質トランスロケーションドメイン、および抗原エピトープを有するキメラポリペプチドをコードする))が、コードされる抗原エピトープに特異的な強力な免疫応答を誘導することを示す。マウス腫瘍において、この結果は、生成されるキメラにおいてGM−CSF(GM)遺伝子、ETA(dII)遺伝子、およびHPV−16 E7遺伝子の融合物が、E7特異的CD8+およびCD4+T細胞媒介免疫応答およびHPV−16 E7発現マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果高めることを示した。
【0175】
GM−ETA(dII)−E7キメラを使用するマウスの免疫化は、筋肉内注射又は皮内注射を介するE7発現マウス腫瘍細胞株(TC−1)に対するE7特異的免疫応答ならびに効果的抗腫瘍保護および処置を媒介し得た。この劇的な抗腫瘍効果は、他の構築物(特に、GM−E7、ETA(dII)−E7、またはGM−ETA(dII))をコードするDNAワクチンにおいては観察されなかった。さらに、他の構築物を受けたマウスよりもより多くのCD8+およびCD4+T細胞応答をGM−ETA(dII)−E7を受けたマウスにおいて観察した。これらの結果は、GM−ETA(dII)−E7キメラDNAが、選択された抗原(例えば、癌免疫治療における腫瘍抗原、または病原体に関連する病理学を処置または予防するための病原体に対する抗原)に対する細胞媒介応答を高める新規の戦略を表わすことを示した。この結果はまた、ワクチンの成分が、効果のあるE7特異的免疫応答および抗腫瘍効果の発生において重要であることを示す。
【0176】
この結果は、GM−CSF遺伝子が、GM−ETA(dII)−E7およびETA(dII)−E7 DNA構築物の比較によって示されるように、GM−ETA(dII)−E7融合タンパク質において重要な成分であることを示した。ETA(dII)−E7構築物は、GM−ETA(dII)−E7のGM−CSF成分が欠けていた。このことが、高められたE7特異的CD8+またはCD4+T細胞媒介免疫応答および抗腫瘍効果の不足を説明し得る。
【0177】
GM−CSFは、顆粒球およびAPCの生成を誘導し、そして樹状細胞(DC)に対して免疫刺激性シグナルとして作用する。さらに、GM−CSFはプロフェッショナルAPCを標的としそしてその分化を促進する。これは、APCが、GM−CSFレセプターを有しているからである。本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、GM−ETA(dII)−E7融合タンパク質は、MHCならびにDCおよび他のAPC上の同時刺激分子発現において、GM−CSFドメインに起因する変化を誘導し得る。その結果、ETA(dII)−E7において観察されない体液性および細胞媒介免疫応答を高める。これらの観察は、樹状細胞上のGM−CSFドメインの免疫促進効果が、免疫応答の発生およびGM−ETA(dII)−E7融合タンパク質の抗腫瘍効果に対して重大な成分であることを示した。
【0178】
本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、本発明の抗原特異的免疫治療アプローチは、DCの表面分子を標的にし得る。このことが、抗原をプロセシングおよび表示のためにDCへ方向付け得る。免疫原性組成物のAPC結合成分として使用し得る他のポリペプチドとして、Flt−3リガンド(FL)、CD40リガンド、TNFα、および41BBが挙げられる。このようなポリペプチドをコードするDNAは、本発明の免疫原性組成物またはDNAワクチンの第1のDNA成分として有用である。Flt3リガンド(Flt3−lまたはFL)は、インビボで樹状細胞の機能および量を増大し得る。Flt3(fms様チロシンキナーゼ3)は、当該分野で公知のマウスチロシンキナーゼレセプターであり、そしてFlt3を使用して対応するリガンド、Flt3−Lを同定し、引き続きクローニングした(Hannumら、1994、Nature.368:643−648;Maraskovskyら、J.of Experimental Med.,(1996)184:1953−1962;199638)。CD40リガンド(CD154)もまた、有用である;DCに対する効果のためワクチン潜在性を高め得る。TNF−αは、ワクチン潜在性を高めるための別のストラテジーを示す;TNF−αは、リンパ様の組織へのDCの移動ならびにランゲルハンス細胞の分化および発生を促進し得る。ワクチン潜在性を高める別のストラテジーは、4−1BBL(4−1BB(CD137)に結合する腫瘍壊死因子ファミリーのサイトカイン)の使用である。4−1BBとの相互作用に続くDC上の4−1BBL発現は、CD28レセプターを介するシグナル送達に依存せずに増殖開始のためT細胞へ第2の同時刺激シグナルを提供する。ワクチン性剤性を高めるこれらのストラテジーは、GM−ETA(dII)−E7中のGM−CSFと類似の様式でDC表面分子を使用し、DCに対する抗原の標的化、その後のDC分化の誘導ならびに抗原プロセシングおよび表示の増進を可能にする。
【0179】
Diptheria、Clostridium、Botulinum(テタヌス)、Bacillus、Yersinia、Vibrio cholerae(コレラ)またはBordetella pertussis毒素は、治療適用を有し得る細菌由来分子を示す。このような分子は、本発明のDNAワクチンにコードされる融合ポリペプチドにおけるETAドメインの分子と同様の様式で機能し得る。これらのドメインは、エンドソーム/リソソーム区画から細胞質への抗原のトランスロケーションを介するMHCクラスI表示の増進を生じ得る(特に、毒素をコードする遺伝子の毒性ドメインが、変異されるかまたは欠失される場合)。
【0180】
所定のポリペプチドまたはタンパク質フラグメントが、細胞質トランスロケート活性を有しており、従って本発明の融合タンパク質の中のドメインとして本発明の範囲内に入るかどうかの決定は、以下のように決定した。炭疽毒素致死因子(LF)を、外来タンパク質を真核生物細胞のサイトゾルへトランスロケートするように示した。これはDiphteria毒素の機構に似ている。Yersiniae細胞毒YopEおよびYopHは、トランスロケーションドメインとして有用であり、そして宿主細胞膜を横切りマクロファージのサイトゾルへの抗原の内面化に有用である。Bordetella pertussisアデニル化毒素(CyaA)は、細胞膜を介してサイトゾルへ直接トランスロケートし、従ってMHCクラスI抗原ハンドリングを高める。従って、本発明の融合タンパク質およびワクチン(例えば、GM−ETA(dII)−E7融合タンパク質におけるETA(dII)ドメイン)によって使用されるワクチン潜在性を高めるためのストラテジーは、これらの細菌毒のトランスロケーションドメインの生物学的機構と同様であり得る。これらのドメインは、抗原がエンドソーム/リソソーム区画からサイトゾルへ逃げることを可能にし得、MHCクラスI表示の増進を生じる。
【0181】
(実施例3:Pseudomonas外毒素AのトランスロケーションドメインをコードするDNAの抗原遺伝子との連結によるDNAワクチン潜在性の増進)
次の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を高めるおよびインビボで腫瘍を処置するために有効であることを示す研究を記載する。
【0182】
本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、ETAドメインおよびHPV−16 E7抗原を含む融合タンパク質をコードするDNAワクチンは、特に遺伝子銃で皮内に投与された核酸についてETAコード配列を有しないワクチンよりも多くの数の抗原提示細胞(APC)に対してE7の分布を導き得る。ポリペプチドドメインETA(dII)は、他の細胞による取り込みのためタンパク質を放出し得る。
【0183】
免疫学的アッセイは、ETA(dII)へ融合されたE7を用いるワクチン接種が、E7特異的CD4または抗体の優位な増加を伴わずにE7特異的CD8+T細胞前駆体頻度または抗体増進において30倍の増加を導くことを示した。インビトロの研究は、ETA(dII)−E7 DNAでトランスフェクトされた細胞が、野生型E7 DNAでトランスフェクトされた細胞よりも有効な様式でMHCクラスI経路を介してE7抗原を与えることを示した。さらに、ETA融合タンパク質でパルスされた骨髄由来樹状細胞は、野生型E7タンパク質でパルスされた樹状細胞よりも有効な様式でMHCクラスI経路を介してE7抗原を与えた。CD8+T細胞媒介免疫性の驚くほどの増進は、効力ある皮下腫瘍保護および肺転移の処置を導いた。これらのデータは、本発明の組成物および方法が、発現された抗原の広がりの増加によって抗原特異的DNAワクチン潜在性を高め得ることを示唆する。例えば、ETA抗原融合タンパク質またはキメラをコードするDNAワクチンの投与は、融合タンパク質(抗原を含むがETAドメインを欠いているポリペプチドをコードする同様のDNAワクチンに関連する)において発現される抗原の細胞内広がりを増加し得る。
【0184】
(実施例4:抗原コード配列のFL(Flt−3リガンド)配列への連結によるDNAワクチン効力の増強)
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強し、インビボでの腫瘍の処置に効果的であることを示す研究を記載する。
【0185】
Flt3−リガンド(FL)は、専門的な抗原提示細胞(特に樹状細胞)の産生において重要なサイトカインである。本発明は任意の特定の機構によって限定されないが、Flt3リガンドドメインが、免疫が望ましい抗原に連結する組換え分子(FLおよび抗原を含む融合タンパク質)が、抗原をAPC(例えば、樹状細胞)に標的化し得る。
【0186】
抗原としてHPV−16 E7を使用して、裸のDNAワクチンによって産生される抗原特異的な免疫の効力に対する、Flt3−リガンド(FL)抗原構築物(図19)の効果を評価した。配列番号25の残基1〜189は、FL由来であり、残基190−287は、E7由来である(配列番号25の288位の「Z」は、終止を示す)。FL−E7融合ポリペプチドをコードするDNA構築物を、遺伝子銃によって皮内に投与した。キメラFL/E7融合遺伝子を含むワクチンは、FLコード配列の非存在下で、野生型E7遺伝子を含むワクチンと比較してE7特異的CD+8T細胞の頻度を劇的に増加することが見出された。
【0187】
インビトロ研究は、FL/E7 DNAをトランスフェクトされた細胞が、野生型E7 DNAをトランスフェクトされた細胞よりも効率的な様式で、MHCクラスI経路を介するE7抗原を提示したことを示した。さらに、FL/E7融合タンパク質をパルスされた骨髄由来樹状細胞は、野生型E7タンパク質をパルスされた樹状細胞よりも効率的な様式で、MHCクラスI経路を介するE7抗原を提示した。より重要なことには、この融合は、あまり効率的ではないワクチンを、樹立されたE7発現転移性腫瘍に対して有意な効力を有するワクチンに変換した。興味深いことに、FL/E7融合ワクチンは、主に、CD8+T細胞を標的とし、そして抗腫瘍効果は、完全にCD4非依存性であった。これらのデータは、抗原をコードするものへのFlt3−リガンドDNAの融合がCD8依存性経路を介するDNAワクチンの効力を増強することを示した。
【0188】
(実施例5:抗原特異的免疫応答の増強を与えるHSP70のドメイン)
以下の実施例は、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメントを含む第1ポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする本発明のキメラ核酸が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強し、インビボでの腫瘍の処置に効果的であることを示す研究を記載する。
【0189】
Mycobacterium tuberculosis HSP70のドメイン構造を決定した。少なくとも3つの機能的ドメインを同定した:ATPaseドメイン(配列番号9の残基1〜356を含む)、基質結合ドメイン(SD;配列番号9の残基357〜516を含む)、およびカルボキシ末端ドメイン(CD;配列番号9の残基517〜625を含む)(図16)。裸のDNAワクチンの効力に対するこのHSP70の各ドメインの寄与を決定した。各ドメインをコードするDNAは、インフレームで、すなわち作動可能に、パピローマウイルス抗原E7をコードするDNAに連結された。E7特異的CD8T細胞免疫応答を測定した。
【0190】
標準的な遺伝子銃DNA送達法を使用して、(i)HSP70遺伝子;(ii)野生型HPV−16 E7遺伝子;(iii)HSP70のATPaseドメインに融合したHPV−16 E7遺伝子(E7−ATP);(iv)HSP70の基質結合ドメイン(SD)に融合したHPV−16 E7遺伝子(E7−SD);または(v)HSP70の細胞質ドメイン(CD)に融合したHPV−16 E7遺伝子(E7−CD)を含むDNAワクチンで、C57BL/6マウスを皮内的にワクチン接種した。キメラE7/熱ショックタンパク質構築物のすべてを、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、pcDNA3.1(−)発現ベクターの複数クローニング部位にクローン化した(図17)。インビボ抗腫瘍免疫応答を、E7特異的CD8+T細胞媒介免疫を評価するために、E7特異的MHCクラスIペプチド(RAHYNIVTF;配列番号7のアミノ酸49〜57)を使用して細胞内サイトカイン染色によって分析した。
【0191】
図18Aは、E7特異的CD8+T細胞前駆体頻度を示す代表的なFASCANである。ワクチン接種されたマウス由来の脾細胞を、一晩、E7ペプチド(配列番号7のアミノ酸49〜57)でインビトロで培養し、そしてCD8発現と細胞内IFN−γとの両方について染色した。種々のDNA構築物(E7−HSP70、E7−ATP、E7−SD、E7−CD、またはE7のみ)で免疫されたマウスにおけるIFN−γ分泌CD8+T細胞前駆体の数を、フローサイトメトリーを使用して分析した。E7−HSP70 DNAをワクチン接種されたマウスが、最も多い数のE7特異的CD8+前駆体を生成した。E7−CDは、二番目に多い量のE7特異的CD8+前駆体を生成し、E7−HSP70のみに匹敵し得た(E7−SD、E7−ATP、および野生型E7より大きい)。
【0192】
IFN−γ−産生E7特異的CD8+T細胞の平均数は、図18Bに示される。細胞の数は、E7抗原ペプチド(配列番号7の残基49〜57)の存在下(黒塗り棒)および非存在下(白抜き棒)でフローサイトメトリーによって決定した。データは、3×105個の脾細胞当たりのCD8+IFN−γ+細胞の平均数±SEMとして表した。結果は、DNAワクチン構築物に組み込まれる場合、HSP70の細胞質ドメインをコードするDNAは、DNAワクチンによってコードされる標的抗原に対して免疫を生成する際におけるそのDNAワクチンの効力を増加することを示す。さらに、全長HSP70を含むDNAワクチンにおける抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答の増強の大部分を説明する。
【0193】
例えば、全長HSP70に融合されたE7を用いるワクチン接種は、E7特異的CD8+T細胞前駆体頻度において30倍増加を導いた(3×105個の脾細胞当たり約365個)(図18A〜B)。HSP70のATPドメインに融合したE7でのワクチン接種は、わずかに増加したE7特異的CD8+T細胞前駆体頻度を生成した(3×105個の脾細胞当たり約58個)。同様に、HSP70のSDドメインに融合したE7でのワクチン接種は、3×105個の脾細胞当たり約85個のE7特異的CD8+T細胞前駆体を生成した。対照的に、HSP70のCDドメインに融合したE7でのワクチン接種は、3×105個の脾細胞当たり約296個のE7特異的CD8+T細胞前駆体(全長HSP70に融合されたE7をワクチン接種されたマウスから得られる量に類似する量)を生成する。これらの結果は、HSP70のCDドメインが、DNAワクチンにおける増強された抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答の大部分を与えることを示す。
【0194】
これらのデータは、全長HSP70またはHSP70のCDドメイン(HSP70の他の部分をコードするDNAの非存在下)の、抗原ペプチド(例えば、HPV−16E7)への融合をコードするDNAは、抗原に対する抗原特異的CD8+T細胞免疫応答を非常に増強することを示す。免疫応答の増強は、CTL応答を刺激する際に重要であると考えられたATPaseドメインの領域(例えば、配列番号9の残基161〜370)においてより多くのN末端配列を欠く構築物において観測された。このデータは、HSPのCDドメインをコードする構築物を含むDNAワクチンが、他のHSP配列の不在下でさえ、DNAワクチンによってコードされる標的抗原に対する抗原特異的MHCクラスI制限CD8+T細胞免疫応答を増強したことを示す。
【0195】
(実施例6:本発明の融合タンパク質を発現する自己複製RNAウイルスの投与が、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答の生成を増強する)
1つの実施形態において、本発明は、本発明のキメラタンパク質(熱ショックポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインおよび少なくとも1つの抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインを含むタンパク質)を発現し得る自己複製RNAレプリコンを提供する。以下の実施例は、本発明の方法を使用して、これらの構築物が、インビボで抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強するのに効果的であることを示す研究を記載する。モデル系として、HPV−16 E7およびMycobacterium tuberculosis HSP70を含む融合タンパク質を、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター、SINrep5においてインビボで発現させた。このベクターにより作り出される抗原特異的免疫の効力を決定した。これらの結果はまた、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター中インビボで発現される熱ショックポリペプチドおよび抗原性ペプチドを含む融合タンパク質が、インビボで抗原特異的CTL応答を増強するのに効果的であることを示す。
【0196】
これらの実験は、E7/HSP70融合遺伝子を含むRNAレプリコンワクチンがワクチン接種されたマウスにおける野生型E7遺伝子を含むワクチンよりも有意に高いE7特異的T細胞媒介免疫応答を産生することを示した。さらに、インビトロ研究は、E7/HSP70 RNAレプリコントランスフェクトアポトーシス細胞由来のE7抗原が、骨髄由来樹状細胞により取り込まれ得、そして野生型E7 RNAレプリコントランスフェクトアポトーシス細胞よりも効率的にMHCクラスI経路を介して提示され得ることを示した。より重要なことには、HSP70のE7への融合は、あまり効果的でないワクチンをE7発現腫瘍に対して有意な効力を有するワクチンに変換した。この抗腫瘍効果は、NK細胞およびCD8+T細胞に依存した。これらの結果は、HSP70の抗原遺伝子への融合が、自己複製RNAワクチンの効力を大きく増強したことを示した。これらの結果は、E7をHSP70に連結するシンドビスRNAワクチンが、完全にCD4アームを迂回して、E7特異的CD8+T細胞およびNK細胞の増殖および活性化を劇的に増加し、そしてE7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じたことを示した。
【0197】
抗腫瘍効果を促進するためのシンドビスRNAワクチンの機構がさらに調査された。シンドビスE7/HSP70 RNAワクチンが宿主細胞のアポトーシス死を誘導し得、そして樹状細胞がこれらの細胞に食作用することを促進し得、E7特異的CD8+T細胞の増殖および活性化を劇的に増加し得る。この増強されたCD8応答は、E7発現腫瘍細胞株に対する強力な抗腫瘍性免疫を生じる。
【0198】
HPV−16 E7を、ワクチン開発に対するモデル抗原として選択した。なぜなら、HPV、特にHPV−16は、上記のように、大部分の頚部癌と関連するからである。
【0199】
(プラスミドDNA構築物および調製):ベクターpcDNA3−HSP70、pcDNA3−E7、およびpcDNA3−E7/HSP70が、Chen(2000)上記によって記載されるように作製された。シンドビスウイルスRNAレプリコンベクター、SINrep5は、Bredenbeek(1993)J.Virol.67:6439−6446によって記載されている。ベクターSINrep5−HSP70、SINrep5−E7、およびSINrep5−E7/HSP70は、pcDNA3−HSP70、pcDNA3−E7、およびpcDNA3−E7/HSP70をそれぞれ、Xba IおよびPme I制限酵素で切断することによって、Mycobacterium tuberculosis HSP70、HPV−16 E7およびキメラE7/HSP70を単離することによって作製された。消化された産物を、ゲルを使用して単離した。これらの単離されたDNAフラグメントは、さらに、SINrep5ベクターの対応するXabIおよびPml I部位にクローン化して、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、およびSINrep5−E7/HSP70構築物を作製した。これらの構築物の正確さを、DNA配列決定によって確認した。
【0200】
(インビトロRNA調製):SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70およびSINrep5からのRNA転写物の作製は、Mandl(1998)Nature Med 4:1438−1440によって記載されるプロトコルを使用して実行された。SpeIを使用して、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70およびSINrep5からのRNAレプリコンの合成のためのDNA鋳型を線形化した。RNAワクチンを、インビトロで転写し、そして販売業者のマニュアルに従って標準的なインビトロ転写キット(Life Technologies,Rockville,MD)からのSP6 RNAポリメラーゼおよびキャッピングアナログを使用してキャッピングした。合成の後に、DNAを、DNase Iで消化することによって枯渇した。合成されたRNAを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを使用して定量化し、分析した(例えば、Mandl(1998)上記を参照のこと)。精製されたRNAを、アリコートに分割して、動物のワクチン化のためおよびBHK21細胞株のトランスフェクションのために使用した。転写物のタンパク質発現を、エレクトロポレーションを使用して、RNAのBHK21細胞へのトランスフェクションによって評価した。
【0201】
(細胞株):乳児のハムスター腎臓(BHK21)細胞を、ATCC(Rockville、MD)から得、そして5%FBS、10%トリプトースホスフェートブロス、2mMグルタミン、および抗生物質で増殖させた。細胞を37℃で加湿された5%CO2雰囲気下で維持し、そして二日毎に継代させた。TC−1細胞の産生および維持を、Lin(1996)Cancer Res.56:21−26によって記載されるように行った。腫瘍チャレンジの日に、TC−1細胞を、トリプシン処理によって収穫し、1×Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、最後に、1×HBSS中で再懸濁して注射のために設計した濃度に再懸濁した。
【0202】
(SINrep5 RNAワクチンのE7タンパク質発現についてのELISA):SINrep5−E7およびSINrep5−E7/HSP70 RNAからのE7タンパク質の発現を、間接的なELISA法によって決定した。E7タンパク質の量を、SIN5rep−E7またはSINrep5−E7/HSP70トランスフェクトBHK21細胞からの細胞溶解物を使用して決定した。簡単に言うと、1000万個のBHK21細胞が、Liljestrom(1991)J.Virol.65:4107−4113によって記載されるように、エレクトロポレーションを介してそれぞれ、4μgのSINrep5、SINrep5−E7、SINrep5−HSP70またはSINrep5−E7/HSP70のRNA転写物をトランスフェクトされた。トランスフェクトされたBHK21細胞を、エレクトロポレーションの16〜20時間後に回収した。96マイクロウェルプレートを、最終容積100μlで種々のSINrep5 RNAをトランスフェクトされたコートされたBHK21細胞溶解物であり、4℃で一晩インキュベートした。細菌由来HPV−16 E7タンパク質を、ポジティブコントロールとして使用した。次いで、ウェルを20%ウシ胎仔血清を含むPBSでブロックした。希釈した抗E7Ab(Zymed、San Francisco、CA)を、ELISAウェルに加え、そして37℃で2時間インキュベートした。0.05%Tween−20を含むPBSで洗浄した後に、プレートを、1時間室温(RT)で、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed、San Francisco、CA)の1/2000希釈物とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、1−StepTM Turbo TMB−ELISA(Pierce,Rockford,IL)で展開し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、450nmで標準的なELISAリーダーで読んだ。次いで、細胞溶解物のE7タンパク質の量を、標準化されたE7タンパク質と比較することによって、計算し、決定した。
【0203】
(マウス):National Cancer Institute(Frederick,MD)からの6〜8週齢の雌性C57BL/6マウスを購入し、そしてJohns Hopkins Hospital(Baltimore,MD)の腫瘍学動物施設で飼育した。全ての動物の手順を、許可されたプロトコルに従い、実験動物の適切な使用および注意についての推奨に従って行った。
【0204】
(RNAワクチン接種):全てのSINrep5 RNAワクチンを、上記のようにインビトロ転写を使用して作製した。RNA濃度を、260nmで測定した光学密度によって決定した。RNA転写物の完全性および量を、さらに、変性ゲル電気泳動を使用してチェックした。マウスに、筋肉内で、SINrep5−E7/HSP70(これは、0.1、1および10μgの量で投与される)を除いて、10μgの種々のSINrep5 RNAを右後肢にワクチン接種した。
【0205】
(E7抗体についてのELISA):血清中の抗HPV16E7抗体を、Wu(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11671−1165によって記載されるように直接的なELISAによって決定した。96マイクロウェルプレートを、100μlの5μ/ml細菌由来HPV−16 E7タンパク質でコートし、そして4℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを20%ウシ胎仔血清を含むPBSでブロックした。血清を、免疫の14日後にマウスから調製し、連続的にPBSで希釈し、ELISAウェルに加え、そして37℃で2時間インキュベートした。0.05%Tween−20を含むPBSで洗浄した後に、プレートを、1時間室温(RT)で、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed、San Francisco、CA)の1/2000希釈物とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、1−StepTM Turbo TMB−ELISA(Pierce,Rockford,IL)で展開し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、450nmで標準的なELISAリーダーで読んだ。
【0206】
(INF−γについての酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)):脾細胞を、ワクチン接種の2週間後に収穫し、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49〜57)(Feltkamp(1993)Eur.J.Immunol.23:2242−2249を参照のこと)またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(例えば、Tindle(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5887−5891を参照のこと)とともに、24ウェル組織培養プレート中の10%(容積/容積)ウシ胎仔血清、50単位/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補充した総容積2mlのRPMI 1640中で6日間、培養した。上清を集め、製造業者のプロトコルに従って、ELISAキット(Endogen、Woburn、MA)を使用してIFN−γの存在についてアッセイした。
【0207】
(細胞傷害性Tリンパ球(CTL)アッセイ):CTLアッセイを、Corr(1999)J.Immunol.163:4721−4727によって記載されるように、96ウェル丸底プレートで行った。細胞溶解を、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の定量的測定によって決定した(例えば、Corr(1999)上記を参照のこと)。脾細胞を、RNAワクチン接種の2週間後に集め、そしてE7ペプチド(aa49〜57)とともに、24ウェル組織培養プレート中の10%(容積/容積)ウシ胎仔血清、50単位/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補充した総容積2mlのRPMI 1640中で6日間、エフェクター細胞として培養した。TC−1腫瘍細胞を標的細胞として使用した。TC−1細胞を種々のエフェクター/標的(E/T)比で脾細胞とともに混合した。5時間37℃でのインキュベーションの後に、50μlの培養培地を、CytoToxTMアッセイキット(Promega、Madison、WI)の製造業者のプロトコルに従って、培養培地におけるLDHの量を評価するために回収した。溶解の割合を、以下の式から計算した:100×(A−B)/(C−D)。ここで、Aは、実験エフェクターシグナル値の読みであり、Bは、エフェクター自発バックグラウンドシグナル値であり、Cは、標的細胞からの最大シグナル値であり、Dは、標的自発バックグラウンドシグナル値である。
【0208】
(細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析):ネイティブまたはワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、E7特異的CD4+Tヘルパー細胞前駆体を検出するために、MHCクラスIIペプチド(Tindle(1999)上記)を含むE7ペプチド(aa30〜67)とともにインキュベーションした。E7ペプチドを、20時間10μg/mlの濃度で加えた。GolgitopTM(PharMingen、San Diego、CA)を、培養物からの細胞を収集する6時間前に加えた。次いで、細胞を、FACScanTM緩衝液中で1回洗浄し、そしてフィコエリトリン(PE)結合モノクローナルラット抗マウスCD4抗体(PharMingen、San Diego、CA)で染色した。細胞を、製造業者(PharMingen)の指示に従って、Cytofix/CytopermTM キットを使用する細胞内サイトカイン染色に供した。FITC結合抗IFN−γ抗体および免疫グロブリンアイソタイプ制御抗体(rat IgG1)を、すべてPharMingenから購入した。分析を、CELLQuestTMソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry System,Mountain View,CA)を用いて、Becton Dickinson FACScanTMで行った。
【0209】
(インビボ腫瘍保護実験):腫瘍保護実験のために、異なった用量のSINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70および空のSINrep5 RNAワクチンを使用して、マウス(1群当り5匹)を筋肉内注射(IM)して免疫した。免疫14日後、マウスを尻尾の静脈における1×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞を使用して、静脈内注射(IV)した。3週間後、マウスを安楽死させた。各マウスにおける肺重量および肺小結節の数を、ブラインド様式の実験によって評価および計測した。
【0210】
(インビボ抗体枯渇実験):インビボ抗体枯渇のための手順は、例えば、Lin(1996)前出;Wu(1995)J.Exp.Med.182:1415−1421によって以前に記載されている。簡潔には、マウスを1μgの自己複製するSINrep5−E7/HSP70RNAを使用して筋肉内にワクチン接種し、そして、尻尾の静脈注射を介して1×104細胞/マウスTC−1腫瘍細胞を使用してチャレンジさせた。枯渇を腫瘍チャレンジの前1週間で開始した。MAbGK1.5(Dialynas(1983)J.Immunol.131:2445)をCD4枯渇のために使用し、MAb2.43 Sarimiento(1980)J.Immunol.125:2665)をCD8枯渇のために使用し、そして、MAb PK136(Koo(1986)J.Immunol.137:3742)をNK1.1枯渇のために使用した。フローサイトメトリー分析は、95%を超える適切なリンパ球サブセットが、他のサブセットの正常なレベルを有して枯渇される。腫瘍チャレンジ後21日目に枯渇が終了し得る。
【0211】
(細胞表面マーカー染色およびフローサイトメトリー分析):ネイティブなまたはワクチン接種されたマウスの群から取り出された脾細胞を、Ji(1999)Human Gene Therapy 10:2727−2740に記載されるような細胞表面マーカー染色を使用してすぐに処置した。次いで細胞を、FACSCANTM緩衝液およびPE結合体化モノクローナルラット抗マウス−NK1.1抗体およびFITC結合体化モノクローナルラット抗マウスCD3抗体(Pharmigen,San Diego,CA)を使用して1回洗浄した。NK細胞の集団を、抗NK1.1抗体を用いて染色し、そして抗CD3抗体を用いて染色されていなかった。種々の自己複製するRNAワクチンで免疫化したマウスのNK細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【0212】
(骨髄由来の樹状細胞(DC)の産生および培養):DCを、Lu(2000)J.Exp.Med.191:541−550によって記載されるようにGMC−SFの存在中で、骨骨髄細胞の培養によって生成した。簡単には、骨髄は、マウスの頚骨から選択される。赤血球が溶解され、そして、残りの細胞を、ナイロンメッシュを通して、骨および残渣の小さな部分を枯渇し得る。この細胞を回収し、そして、1×106細胞/mlをRMPI1640中(5%FCS、2mMβ−メルカプトエタノール、1%非必須アミノ酸、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Life Technologies,Pockville,MD)および100U/ml GM−CSF(PharMingen,San Diego,CA)で充填した)の24ウェルプレートにプレートした。培地のツーハイブリッドシステムを2日毎に交換し、そして、非粘着性細胞を7日目に収穫した。回収された細胞をフローサイトメトリー分析(FACS)によってDCマーカーについて特徴付けた。
【0213】
(E7−特異的CD8+T細胞株の産生):E7−特異的CD8+細胞株の産生を、Sig/E7/LAMP−1ワクシニアの腹腔内注射によって、雌マウスC57BL/6(H−2b)マウスを免疫することによって行なった。脾細胞を8日目に収穫した。最初のインビトロ刺激のために、6日間、20U/mlの濃度のIL−2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49−57)を使用してパルスした。E7特異的CTL細胞株の増殖を24ウェルプレート中でE7特異的なCTLを含む1×106脾細胞を3×106の照射された脾細胞と混合(2ml/ウェル)することによって、そして、20U/mlの濃度のIL−2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49−57)と共にそれらをパルスすることによって行なった。この手順を6日毎に反復した。E7 CTL株をCTLアッセイによって特徴付けた。フローサイトメトリーを行なって、CD8マーカーの発現を実証した。
【0214】
(インビトロ細胞死分析):以前に記述されるように、1000万個のBHK21細胞を4μgのSINrep5、SINrep5−E7、SINrep5−HSP70またはSINrep5−E7/HSP70 RNA転写産物とトランスフェクトした。ネイティブなBHK21細胞またはSINrep5 RNAなしでエレクトロポレーションしたBHK21細胞をコントロールとして使用した。BHK21細胞を回収し、そして、24時間毎に、72時間まで評価した。アポトーシスのおよび壊死のBHK21細胞の割合を、製造業者のプロトコルに従って、アネキシンVアポトーシス検出キット(PharMingen,San Diego,CA)を使用して分析し、フローサイトメトリーを後に続けた。
【0215】
(標的細胞としてアポトーシス細胞を用いてパルス化されたDCを使用するCTLアッセイ):標的細胞としてアポトーシス細胞でパルス化されたDCを使用するCTLアッセイが、改変を用いて、Albert(1998)Nature392:86−89;Albert(1998)J.Exp.Med.188:1359−1368によって記載されるプロトコルと同様のプロトコルを使用して行なわれる。簡潔には、1000万個のBHK21細胞を、エレクトロポレーションを介して、4μgの種々の自己複製SINrep5 RNAとトランスフェクトした。BHK21細胞をエレクトロポレーション後16〜20時間で回収した。SINrep5−E7、またはSINrep5−E7/HSP70 RNA転写産物でトランスフェクトされたBHK21細胞におけるE7タンパク質発現のレベルは、ELISAによって決定される場合、類似していた。次いで、3×105トランスフェクトされたBHK21細胞を、48時間、37℃で、1×105の骨髄由来DCと同時インキュベートした。次いで、これらの調製されたDCを標的細胞として使用し、そして、Db制限されたE7特異的CD8+T細胞をエフェクター細胞として使用した。CTLアッセイを、最終容量200μlで、種々の比率(1:1、3:1、9:1、および27:1)で共に混合したエフェクター細胞および標的細胞(ウェル当り1×104)を用いて行なった。37℃で5時間インキュベートした後、50μlの培養培地を回収して、上記のように、培養培地中のLDHの量を評価した。トランスフェクトされていないBHK21細胞、トランスフェクトされたBHK21細胞単独、未処理のDC単独、およびCD8+T細胞株単独と同時インキュベートすることは、ネガティブコントロールとして含まれる。
【0216】
(自己複製するRNA構築物の構築および特徴付け):プラスミドDNA構築物の作製および引き続く自己複製するSINrep5 RNA構築物の調製を上記のように行なった。SINrep5ベクターは、SindibisウイルスRNAレプリカーゼおよびSP6プロモーターをコードする遺伝子を含む(例えば、Bredenbeek(1993)前出)。SINrep5、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70 DNA構築物を図20Aに示す。さらに、SP6RNAポリメラーゼを使用するこれらのDNA構築物由来のRNA転写産物の概略図である。メチル化されたM7G「キャップ」は、mRNAの5’末端に位置し、自己複製(レプリカーゼ)についての原因のある配列、目的の遺伝子(すなわち、MHCクラスIペプチドエピトープ、E7、HSP70、E7/HSP70など)、およびポリアデニル化末端(AAAA)が後に続く。ELISAを行なって、種々の自己複製RNA構築物でトランスフェクトされたBHK細胞による、E7タンパク質の発現を実証する。SINrep5−E7およびSINrep5−E7/HSP70は、類似の量のE7タンパク質を発現した。
【0217】
(自己複製するSINrep5−E7/HSP70 RNAを用いるワクチン接種は、E7特異的細胞障害性免疫応答を増強する):CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍免疫性を誘導するための最も重要なエフェクターの1つである。SINrep5−E7/HSP70 RNAワクチンによって産生されるE7特異的なCD8+T細胞反応の量を決定するために、CTLアッセイが使用される。マウスを、筋肉内注射を介して、種々のSINrep5自己複製RNAワクチンで免疫した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。細胞障害性アッセイを行なうために、種々の自己複製SINrep5 RNAワクチンからの脾細胞を、エフェクター細胞として、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49−57)を使用して6日間培養した。TC−1腫瘍細胞は標的細胞として存在する。TC−1細胞を、種々のE/T(エフェクター/標的率)で脾細胞と混合した。細胞融解をLDHの定量的な測定によって、決定した。本明細書中にも示されているCTLアッセイは、2つの行なわれた実験の1つの代表的な実験である。
【0218】
自己複製RNA E7/HSP70ワクチンは、他のRNAワクチンと比較する場合、特異的な溶解の有意により高い割合を生じた(*:P<0.001、一方向のANOVA)。自己複製SINrep5−E7/HSP70は、他のSINrep5 RNAワクチン(P<0.001、一方向のANOVA)でワクチン接種されたマウスと比較して特定の溶解の有意により高い割合を生成した。SINrep5−E7/HSP70 RNAの特定の溶解を生成する能力は、自己複製SINrep5−E7RNA(32.7%対8.8%、E/T率45/1、P<0.001)の溶解性の約4倍であることが見出されている。
【0219】
(自己スプライシングSINrep5−E7/HSP70 RNAを用いるワクチン接種は、高レベルのINF−γを分泌するためのE7特異的CD8+を増強する):自己複製するSINrep5−E7/HSP70 RNAによって産生されるE7特異的なCD8+T細胞の免疫学的応答の程度を決定するために、ELISAが使用し、培養された脾細胞の上清におけるINF−γの濃度を検出する。マウスを、筋肉内注射を介して、種々のSINrep5自己複製RNAワクチンで免疫した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。種々の自己複製RNAワクチンからの脾細胞を、6日間、MHCクラスIエピトープを含む(かまたはいずれのペプチドも使用しない)E7ペプチド(aa49−57)を使用してインビトロで培養した。ネガティブコントロールとして、ELISAをまた、ペプチドなしで行なった。培養培地における上清を回収し、ELISAを使用して、INF−γ濃度を検出する。
【0220】
E7ペプチド(aa49−57)を使用して刺激された自己複製E7/HSP70 RNA群由来の脾細胞は、他のRNAワクチン(P<0.001、一方向ANOVA)と比較して、最も高い濃度のINF−γを分泌した。これらの結果はまた、HSP70のE7への融合が、INF−γ−分泌E7特異的CD8+T細胞活性を有意に増強する。従って、CD8+T細胞は、E7のMHCクラスIによって誘導され得る。注意:E7ペプチド(aa49−57)を用いて刺激した、自己複製E7/HSP70 RNA群から、群脾細胞は、他のRNAワクチン(*:P<0.001、一方向ANOVA)と比較して、最も高いINF−γの濃度を分泌した。
【0221】
(自己複製SINrep5−E7/HSP RNAを用いるワクチン接種は、有意なE7特異的CD4+T細胞媒介免疫応答を生成しない):これらのRNAワクチンのそれぞれによるE7特異的CD4+T前駆体細胞およびサイトカインプロフィールの生成を調べるために、当業者らは、免疫されたマウスから得られた脾細胞上のCD4表面マーカーおよび細胞内IFN−γについての二重染色を行ない、フローサイトメトリー分析を続けた。この脾細胞をE7ペプチド(aa30−67)を使用して一晩中インビトロで培養し、そして、CD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。E7ペプチド(aa30〜67)は、HPV−16のE7オープンリーディングフレームタンパク質における主なTヘルパーエピトープを含む(例えば、Tindle(1991)前出)IFN−γ分泌CD4+T細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して分析される。
【0222】
SINrep5−E7/HSP70 RNAを使用してワクチン接種したマウスは、SINrep5−E7 RNA(15/3×105脾細胞対12/3×105脾細胞、p>0.05)または他のRNA群を用いてワクチン接種したマウスと比較した類似した多数のCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を作製した。空のプラスミド、E7、HSP70、またはE7/HSP70 RNAを使用してワクチン接種したネイティブなマウスを染色するフローサイトメトリーを使用して観察される多数のE7特異的なCD4+IFN−γ+細胞における有意な差異はない。ワクチン接種したSig/E7/Lami−1 DNAマウス(Ji(1999)前出)由来の脾細胞は、細胞内IFN−γ、この研究のために細胞内IFN染色のためのポシティブコントロールとして使用され得る。
【0223】
ワクチン接種されたマウスの血清における抗HPV16E7抗体の質を、種々の希釈(1:000、1:500、1:1000)でのワクチン接種後2週間で、直接酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して決定した。SINrep5−E7/HSP70は、他のRNAワクチン構築物によって産生される抗体に比較してワクチン接種されたマウスの血清におけるE7特異的抗体のより高い力価を生じなかった。
【0224】
(TC−1腫瘍の増殖に対する自己複製SINrep5−E/HSP70 RNAを使用するワクチン接種):自己複製SINrep5−E7/HSP70 RNAを使用するワクチン接種が、E7発現腫瘍に対して、マウスを保護するか否か決定するために、インビボ腫瘍保護実験は、右後脚において筋肉内投与された、SINrep5−E7/HSP70RNAの異なった用量を使用して行なった。マウスを同様に、10μgの自己複製SINrep5、SINrep5−HSP70、およびSINrep5−E7RNAでワクチン接種される。異なった用量の自己複製SINrep5−E7/HSP70RNA(0.1μg、1μgおよび10μgを含む)はまたマウスに注射された。ワクチン接種1週間後、マウスを、2×104細胞/マウスの用量で、静脈内尻尾静脈注射を介して、TC−1腫瘍細胞でチャレンジさせた。マウスを1週間に2回モニターし、そして、腫瘍チャレンジ後、21日目に屠殺した。この肺小結節を、腫瘍チャレンジ21日後に評価した。空のSINrep5(10μg)、SINrep5−HSP70(10μg)、SINrep5−E7(10μg)およびSINrep5−E7/HSP70 RNA(0.1μg、1μg、または10μg)を使用してワクチン接種した後、35日後に肺をマウスから解剖した。肺小結節の平均数は、HPV−16E7発現腫瘍増殖を制御する際に、種々の自己複製RNAワクチンの効果の測定として使用した。
【0225】
自己複製E7/HSP70RNAワクチン(0.1μg、1μg、および10μg)でワクチン接種したマウスの平均肺小結節を、他のRNAワクチン(P<0.001、1方向ANOVA)を使用してワクチン接種したマウスと比較すると、非常に低かった。これらの結果は、自己複製RNA SINrep5−E7/HSP70ワクチンが、0.1μgの低用量でさえ、静脈内腫瘍チャレンジからマウスを保護することを実証したが、インサートなしで10μgのSINrep5からのRNAでワクチン接種したが、10μgのSINrep5−E7、または10μgのSINprep5−HSP70は、TC−1腫瘍チャレンジから多数の肺小結節を発症する。
【0226】
(CD8+T細胞およびNK細胞は、SINrep5−E7/HSP70 RNAワクチンを用いるワクチン接種によって抗腫瘍効果が産生されるのに重要である):E7発現腫瘍細胞に対する保護のために重要であるリンパ球のタイプを決定するために、インビボ抗体枯渇(CD8+T細胞およびNK細胞の)実験を行なった(自己複製RNAワクチンで免疫したマウスの脾細胞由来のNK細胞の割合は、免疫しないものよりも高く、そして、種々の自己複製RNAワクチンの間のNK細胞の割合の間には有意な差異はみなれなかった)。この抗体枯渇は、腫瘍チャレンジの前1週間で始まり、腫瘍チャレンジ後の21日目に終了する。
【0227】
CD8+T細胞およびNK1.1細胞が枯渇したマウスの平均肺小結節は、非枯渇群のそれよりも有意に大きかった。さらに、NK1.1細胞の枯渇は、CD8+枯渇マウス由来の肺小結節腫瘍のより高い平均数を生じた。
【0228】
比較すると、CD4+Tが枯渇したマウス由来の平均肺小結節は、非枯渇のマウスから得られた結果と類似し、CD4+T細胞が、この効果を生成する際に重要でないことを示す。これらの結果は、CD8+T細胞が、SINrep5−E7/HSP70 RNAワクチンによって産出された抗原特異的抗癌免疫に必須であること、NK細胞(ここで、E7/HSP70 RNAワクチンに制限されない)が、同様に重要な役割を果たしていることを示唆する。
【0229】
NK細胞の効果がE7/HSP70ワクチンに限定され得るか否か、またはそれが使用されるベクターの結果であるか否かがまた調べられた。CD3(−)、NK1.1(+)細胞のフローサイトメトリー分析は、それらの存在が天然のマウスに比較した全ての構築物(E7/HSP70、E7、HSP70、およびコントロールプラスミド)におけるそれらの存在が顕著な増加するか否かを開示し、NK細胞が、E7/HSP70ワクチンに制限されない抗腫瘍効果の重要なエフェクターであることを示す。
【0230】
(自己複製RNAワクチン誘導アポトーシス):種々のプラスミドSINrep5RNAワクチンからインビトロでのRNA転写は、エレクトロポレ−ションを介して、BHK21細胞へトランスフェクトされる。RNAおよび不要なBHK21を有さないエレクトロポレ−ションされたBHK21細胞は、コントロールとして使用される。アポトーシスおよび壊死BHK21細胞は、アネキシンV−FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)によって染色され、フローサイトメトリー分析が後に続く。
【0231】
アポトーシス性BHK21細胞の割合は、SINrep5 RNAワクチンで24時間〜72時間(代表的には、SIN5−E7/HSP70 70.3±3.6%で24時間、49.3±4.2%で48時間、18.0±3.1%で72時間、P<0.001、一方向ANOVA)トランスフェクトされた場合、統計学的減少を開示した。SINrep5RNAワクチンでトランスフェクトされたBHK21細胞は、他の2つのコントロール群と比較して24、48または72時間後により高い割合を生じた。統計学的な差異は、種々のSINrep5 RNAのアポトーシスの割合において見出されなかった。
【0232】
(SINrep5−E7/Hsp70 RNAを使用してトランスフェクトした細胞でパルス化した樹状細胞におけるMHCクラスI経路を介してE7の増強された提示):増強されたインビボにおけるE7特異的CD8+T細胞免疫応答についての推定機構は、種々のE7構築物を発現する細胞からアポトーシス性体の取り込みによってMHCクラスI経路を通る、E7の提示であり、また「交差プライミング」ともいう。関連プライミング実験は、種々の自己複製RNAとトランスフェクトされたBHK21細胞からアポトーシス体でパルス化した樹状細胞におけるE7を提示するMHCクラスIを特徴付けるために行なわれる。以前に記載されるように、BHK21細胞は、異なったE7含有自己複製RNAでトランスフェクトした細胞における安定して高いトランスフェクション効率および類似のE7発現を有することが示されている。トランスフェクトされたBHK21細胞は、骨髄由来のDCと同時インキュベートされる。DCは、標的細胞として使用されるが、E7特異的CD8+T細胞は、エフェクター細胞として機能する。種々のE/T比率を有するCTLアッセイが行なわれる。
【0233】
SINrep5−E7/HSP70 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞と同時インキュベートしたDC標的細胞は、SINrep5−E7(P<0.001)でトランスフェクトしたBHK21細胞で同時インキュベートしたDCと比較して、有意により高い割合の特異的な溶解を生じた。これらの結果は、樹状細胞が、E7/HSP70融合タンパク質を含むアポトーシス体を用いてパルス化した樹状細胞が、野生型E7タンパク質を含むアポトーシス体でパルス化された樹状細胞よりもより効率的にMHCクラスI経路を介して、E7抗原を提示することを示唆する。従って、HSP70のE7への融合は、E7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強する;および、本発明は、いずれの特定の機構によっても制限されないが、その増強は「交差プライミング」を介して起こるようである。
【0234】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それにも関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が行なわれ得る。従って、他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【0235】
種々の図中の同様の参照記号は、同様のエレメントを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1Aは、ELISPOTアッセイの結果を示す棒グラフである。IFN−γ産生E7特異的CD8+T細胞前駆体の数を、ELISPOTアッセイを使用して決定した。スポットの数は、各ワクチン接種をした群における3回の標準誤差の平均である。E7−HSP70 DNAでワクチン接種したマウスは、最も高いIFN−γ+スポット数を生じた。示されたデータは、E7特異的スポット形成細胞を表す(E7 CTLペプチドの非存在下で検出されるスポット数を減算している)。図1Bは、フローサイトメトリー分析の結果を示す図である。ワクチン接種したマウス由来の脾臓を、一晩E7ペプチド(残基49−57;RAHYNIVTF;配列番号5)と共にインビトロで培養し、そしてCD8および細胞内IFN−γの両方について染色した。種々の組換えDNAワクチンで免疫化したマウス中のIFN−γ分泌CD8+T細胞前駆体の数を標準的なフローサイトメトリーにより分析した。E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、最も高いIFN−γ+CD8+二重陽性T細胞を生じた。3×105の脾細胞中のCD8+IFN−γ+二重陽性T細胞の数を、上段右角に示す。図1A〜Bに示されるデータは、E7−HSP70 DNAワクチンで免疫化したC57BL/6マウス中のE7特異的CD8+T細胞前駆体の頻度を示す。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、HSP70 DNA (E7+HSP)と混合した、空のプラスミド、(pcDNA3)、HSP70 DNA(HSP)、E7 DNA(E7)、E7−HSP70 DNA(E7/HSP)もしくはE7 DNAで免疫化するか、またはワクチンを受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、2μgのDNA/マウスを2回与えた。脾細胞を、最後のDNAワクチン接種の10日後に収集した。
【図2】
図2は、種々の組換えDNAワクチンを接種したマウス中のIFN−γ分泌E7特異的CD4+細胞のフローサイトメトリー分析の図である。C57BL/6マウスを、図1A〜1Bに記載されるように免疫化した。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、一晩E7ペプチド(残基30〜67;DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRL;配列番号6)と共にインビトロで培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。IFN−γ分泌CD4+T細胞の数を、フローサイトメトリーにより分析した。E7−HSP70 DNAをワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAをワクチン接種したマウスと比較して、匹敵するCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生成する。3×105の脾細胞中のCD4+IFN−γ+二重陽性T細胞の数は、上段右角に示される。
【図3】
図3は、種々の組換えDNAワクチンで免疫化したC57BL/6マウスにおけるE7−特異抗体応答を示す棒グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、コントロールプラスミド(挿入なし)、野生型HSP70、野生型E7またはE7−HSP70 DNAで免疫化した。ワクチン接種の14日後に、免疫化したマウスから血清サンプルを得た。E7−特異的抗体の応答を、血清の連続希釈物を使用して、ELISAにより検出した。1:80希釈からの結果を示し、これは、450nmSEにおける平均吸光度(O.D.)を示す。
【図4】
図4Aおよび4Bは、E7−HSP70 DNAを用いるワクチン接種が、TC−1腫瘍の増殖に対してマウスを保護することを示す線グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、空のプラスミド(pcDNA3)、HSP70 DNA(HSP)、E7 DNA(E7)、またはE7−HSP70 DNA(E7/HSP)で免疫化した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスあたり5×104のTC−1細胞を用いて、マウスを右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、1週間に2回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。TC−1チャレンジの60日後、腫瘍を有さないマウスを、マウスあたり5×104のTC−1細胞を、マウスを右脚において皮下に再チャレンジした。図4Aに示したデータを作成するために、各マウスに2μgのDNAワクチンを受けさせた。1週間後、このマウスを、1回目のワクチン接種と同じ型かつ同じ量のDNAを再ワクチン接種させた。図4Bに示したデータを作成するために、各マウスを、さらなるブースターなしで、2μgのDNAワクチンの1回の注射のみを受けさせた。
【図5】
図5Aおよび図5Bは、E7−HSP70 DNAを用いるワクチン接種が、既存のTC−1腫瘍細胞を根絶することを示す線グラフである。各マウスを、初めに、2×104TC−1細胞を用いて皮下にチャレンジし、続いて、遺伝子銃を使用して、空のプラスミド(pcDNA3)、HSP70 DNA(HSP)、E7 DNA(E7)、またはE7−HSP70 DNA(E7/HSP)をDNAワクチン接種させた。このマウスを、1週間に2回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。図5Aに示したデータを作製するために、各マウスに、腫瘍チャレンジの3日後および10日後に2μgのDNAワクチンを受けさせ、そして図5Bのために、各マウスに、腫瘍チャレンジの3日後のみに2μgのDNAワクチンを受けさせた。ならなるブースターは与えなかった。
【図6】
図6は、E7−HSP70 DNAにより生成された抗腫瘍免疫性が、E7遺伝子配列へのHSP70 DNA配列の融合を必要とすることを示す、線グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、HSP70 DNA(E7+HSP)と混合したE7−HSP70 DNA(E7/HSP)もしくはE7 DNAで免疫化したか、またはワクチンを受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、1匹のマウスあたり2μgのDNAを1回だけ与えた。そのワクチン接種の1週間後、マウスを、1匹のマウスあたり5×104のTC−1細胞で、右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、1週間に2回、触診法および視診により腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図7】
図7は、E7−HSP70 DNAワクチンの効力に対するリンパ球サブセット抑制の効果を示す、直線グラフである。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して2μgのE7−HSP70 DNAで免疫化し、そして1週間後、2μgのE7−HSP70 DNAでチャレンジした。最後のワクチン接種の2週間後、マウスを、1匹のマウスあたり5×104のTC−1細胞を用いて、右脚において皮下にチャレンジした。細胞抑制は、腫瘍チャレンジの1週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジ後40日続いた。MAb GK1.5をCD4抑制のために使用し、MAb 2.43をCD8抑制のために使用し、そしてMAb PK136をNK1.1抑制のために使用した。フローサイトメトリー分析は、95%を越える適切なリンパ球サブセットが他のサブセットの正常なレベルで抑制されたことを明らかにした。このマウスを、一週間に2回、触診法および視診により腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図8】
図8は、GM−ETA(dII)−E7、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)、E7の構築物の図である。
【図9】
図9は、GM−ETA(DII)−E7 DNAワクチンで免疫化したC57BL/6マウスにおけるE7−特異的CD8+T細胞前駆体を決定するために行った、細胞内サイトカイン染色を示すフローサイトメトリー分析の図である。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して皮内に、GM、ETA(dII)、E7、GM−ETA(dII)、ETA(DII)−E7、GM−E7またはGM−ETA(DII)−E7遺伝子挿入物を有するプラスミドDNAまたは「空の」プラスミドベクターで免疫化したか、またはワクチン接種を受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、1匹のマウスあたり2μgのDNAを2回与えた。最後のDNAワクチン接種の10日後に脾臓を収集した。ワクチン接種したマウス由来の非細胞を、E7ペプチド(残基49〜57;配列番号5)と共に一晩インビトロで培養し、そしてCD8および細胞内IFN−γの両方について染色した。種々の組換えDNAワクチンで免疫化したマウスにおけるIFN−γ分泌CD8+T細胞前駆体の数を、フローサイトメトリーにより分析した。GM−ETA(DII)−E7 DNAをワクチン接種したマウスは、最も高いIFN−γ+CD8+二重陽性T細胞を生じた。
【図10】
図10は、種々の組換えDNAワクチンをワクチン接種したマウスにおけるIFN−γ分泌E7−特異的CD4+細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。C57BL/6マウスを、図2について上記するように免疫化した。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、一晩、E7ペプチド(残基30−67;配列番号6)と共にインビトロで培養し、そしてCD4および細胞内IFN−γの両方について染色した。IFN−γ分泌CD4+T細胞の数を、フローサイトメトリーにより分析した。GM−ETA(DII)−E7 DNAをワクチン接種したマウスは、GM−E7 DNAをワクチン接種したマウスと比較して匹敵するCD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生じた。GM−ETA(dII)−E7をワクチン接種したマウスは、空のプラスミド(pcDNA3)、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)またはE7 DNAで免疫化したマウスよりも多数のE7特異的CD4+IFN−γ+二重陽性細胞を生じた。
【図11】
図11は、GM−ETA(DII)−E7 DNAでのワクチン接種が、TC−1腫瘍に対してマウスを防護することを示す線図である。C57BL/6マウスを、遺伝子銃を使用して、1匹のマウスあたり2μgの空のプラスミド(pcDNA3)、GM−ETA(dII)、ETA(dII)−E7、GM−E7、GM−CSF、ETA(dII)、E7 DNAまたはGM−ETA(dII)−E7 DNAで免疫化した。1週間後、このマウスを、1回目のワクチン接種と同じ型かつ同じ量のDNAを再ワクチン接種させた。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを、1匹のマウスあたり5×104TC−1細胞を用いて、右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、1週間に2回、腫瘍増殖の証拠について、触診法および視診によりモニターした。TC−1チャレンジの60日後、腫瘍を有さないマウスを、1匹のマウスあたり5×104TC−1細胞を用いて、右脚において皮下に再チャレンジした。
【図12】
図12は、GM−ETAdII−E7 DNAワクチンの効力に対するリンパ球サブセットの抑制の効果を示す、線図である。C57BL/6 マウスを、遺伝子銃を使用して2μgのGM−ETAdII−E7 DNAで免疫化し、そして1週間後、2μgのGM−ETAdII−E7 DNAをブーストした。最後のワクチン接種の2週間後、マウスを、1匹のマウスあたり、5×104のTC−1細胞を、右脚において皮下に再チャレンジした。抑制は、腫瘍のチャレンジの1週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジ後、示された日数続いた。MAb GK1.5(Dialynasら,1983,J.Immunol.131:2445−2451)を、CD4について使用し、MAb2.43(Sarmientoら,1980,J.Immunol.125:2665−2672)をCD8抑制について使用し、そしてMAb PK136(Kooら,1986,J.Immunol.137:3742−3747)をNK1.1抑制について使用した。フローサイトメトリー分析は、適切なリンパ球サブセットの95%以上が、他のサブセットの正常なレベルに枯渇したことを明らかにした。マウスを、1週間に2回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図13】
図13は、E7−HSP70免疫原性構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である。
【図14】
図14は、GM−ETA(dII)−E7免疫原構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である。この構築物のGM−CSF部分、ETA(dII)、およびE7部分を、ブラケットで示す。
【図15】
図15は、ETAのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である(シグナル配列なし)。免疫原構築物を作成する際に使用される残基247−417(および対応するヌクレオチド配列)に、ブラケットを付す。
【図16】
図16は、全長Mycobacterium tuberculosisHSP7Oタンパク質(配列番号9)のドメイン構造を示す図である。ATPaseドメイン(残基1−356)に下線を付し;基質結合ドメイン(SD;残基357−516)は斜体であり、そしてC末端ドメイン(CD:残基517−625)は太字である。
【図17】
図17は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるプラスミド構築物の図である。キメラE7/熱ショックタンパク質構築物のすべて(E7−HSP7O、E7−ATP、E7−SD、E7−CDおよびE7)を、サイトメガロウイルスプロモーターの下流の、発現ベクターのマルチプルクローニング部位へクローン化した。
【図18】
図18Aは、Hspフラグメント−抗原キメラ(E7−HSP7O、E7−ATP、E7−SD、E7−CDおよびE7)をコードする核酸構築物を含む組換えDNAワクチンで免疫化したマウス中のIFN−γ E7−特異的CD8+細胞のフローサイトメトリー分析の図である。図18Bは、IFN−γ産生E7−特異的CD8+T細胞の平均の数を示す棒グラフである。
【図19】
図19は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるプラスミド構築物の図である。
【図20】
図20Aは、SlNrep5、SINrep5−HSP70、SINrep5−E7、SINrep5−E7/HSP70 DNA構築物の概略図を示す。図20Bは、上記の実施例6に詳細に記載されるSP6 RANポリメラーゼを使用するこれらのDNA構築物に由来するRNA転写物の概略図を示す。
Claims (58)
- キメラポリペプチドをコードする核酸であって、該キメラポリペプチドが、以下:
熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の配列を含む、第1のポリペプチドドメイン、および
抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメイン、
を含む、核酸。 - 前記第1のポリペプチドドメインをコードする核酸が、前記第2のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して5’側にある、請求項1に記載の核酸。
- 前記第2のポリペプチドドメインをコードする核酸が、前記第1のポリペプチドドメインをコードする前記核酸に対して5’側にある、請求項1に記載の核酸。
- 前記熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメントが、シャペロン活性を有する、請求項1に記載の核酸。
- 前記熱ショックタンパク質(HSP)が、熱ショックタンパク質70(HSP 70)を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記熱ショックタンパク質70(HSP 70)が、Mycobacterium tuberculosis由来である、請求項1に記載の核酸。
- 前記熱ショックタンパク質(HSP)が、配列番号9の残基312〜625により示されるような配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記熱ショックタンパク質(HSP)が、配列番号9の残基約517〜残基約625によって示されるような配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記Flt−3リガンドポリペプチドが、配列番号25の残基約1〜残基約189によって示されるような配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)が、配列番号3の残基約247〜残基約417によって示されるような配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記Pseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)が、配列番号3の残基約253〜残基約364によって示されるような配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記GM−CSF配列が、ジスルフィド架橋を含むGM−CSFフラグメントである、請求項1に記載の核酸。
- 前記GM−CSFフラグメントが、配列番号1の残基約18〜残基約22、または残基約34〜残基約41、または残基約38〜残基約48、または残基約52〜残基約61、または残基約94〜残基約115、または残基約95〜残基約111によって示されるような配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記抗原性ポリペプチドが、MHCクラスI結合ペプチドエピトープを含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記MHCクラスI結合ペプチドエピトープが、約8アミノ酸残基と約11アミノ酸残基との間の長さである、請求項14に記載の核酸。
- 前記抗原性ポリペプチドがウイルス由来である、請求項1に記載の核酸。
- 前記ウイルスがヒトパポバウイルスである、請求項16に記載の核酸。
- 前記ウイルスがヒトパピローマウイルス(HPV)である、請求項16に記載の核酸。
- 前記ウイルスがヒトパピローマウイルス−16(HPV−16)である、請求項18に記載の核酸。
- 前記抗原性ポリペプチドが、ヒトパピローマウイルスE6ポリペプチドまたはヒトパピローマウイルスE7ポリペプチドを含む、請求項18に記載の核酸。
- 前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、背急行16に記載の核酸。
- 前記抗原性ポリペプチドが、腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドである、請求項1に記載の核酸。
- 前記腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドが、腫瘍細胞の表面上で発現される抗原を含む、請求項22に記載の核酸。
- 前記腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドが、変異体p53、MAGE−1またはMAGE−3である、請求項22に記載の核酸。
- 前記抗原性ポリペプチドが病原体由来である、請求項1に記載の核酸。
- 前記病原体が、マラリア、HIV−1、ウシウイルス性下痢症ウイルス、サイトメガロウイルス、脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項25に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドが、細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインを含む第3のポリペプチドドメインをさらに含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインが、Pseudomonas外毒素A(ETA)の細胞質トランスロケーションドメインを含む、請求項27に記載の核酸。
- 前記Pseudomonas外毒素A(ETA)の細胞質トランスロケーションドメインが、配列番号3の残基約253〜残基約364によって示されるような配列を含む、請求項28に記載の核酸。
- 前記細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインが、Diptheria、Clostridium、Botulinum、Bacillus、Yersinia、Vibrio cholerae、またはBordetella pertussis由来の毒素の細胞質トランスロケーションドメインを含む、請求項27に記載の核酸。
- 前記第3のポリペプチドドメインをコードする核酸が、前記第1もしくは第2のドメインをコードする核酸に対して5’側にあるか、または該第1もしくは第2のドメインをコードする核酸の間に位置するか、または該第1もしくは第2のドメインをコードする核酸に対して3’側に位置する、請求項27に記載の核酸。
- 調節核酸配列をさらに含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記調節核酸配列が、転写調節配列を含む、請求項32に記載の核酸。
- キメラポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットであって、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)を含む、第1のポリペプチドドメインと;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む、発現カセット。
- 発現ベクターまたはプラスミドを含む、請求項34に記載の発現カセット。
- 自己複製RNAレプリコンを含む、請求項34に記載の発現カセット。
- 前記自己複製RNAレプリコンがシンドビスウイルス自己複製RNAベクターを含む、請求項36に記載の発現カセット。
- 前記自己複製RNAレプリコンがシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5を含む、請求項37に記載の発現カセット。
- キメラポリペプチドをコードする核酸を含む形質転換細胞であって、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)を含む、第1のポリペプチドドメインと;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む、形質転換細胞。
- キメラポリペプチドであって、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)を含む、第1のポリペプチドドメインと;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む、キメラポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドドメインが、前記第2のポリペプチドドメインに非共有結合している、請求項40に記載のキメラポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドドメインが、前記第2のポリペプチドドメインに共有結合している、請求項40に記載のキメラポリペプチド。
- 前記キメラポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項42に記載のキメラポリペプチド。
- 薬学的組成物であって、以下:
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、および
薬学的に受容可能な賦形剤、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む、薬学的組成物。 - 前記組成物が、リポソームを形成するようにリン脂質を用いて処方されている、請求項44に記載の薬学的組成物。
- DNAワクチンであって、以下:
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、ならびに
薬学的に受容可能な賦形剤、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む、DNAワクチン。 - キメラポリペプチドをコードする核酸を含むかまたはキメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む、粒子であって、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含む、粒子。
- 前記粒子が、粒子ボンバードメントに適した材料を含む、請求項47に記載の粒子。
- 前記材料が金を含む、請求項48に記載の粒子。
- 免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、有効量の組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、以下:
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、あるいは
該核酸、該ベクター、該キメラポリペプチドもしくはこれらの組み合わせを含む、DNAワクチン、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含み、
ここで、該有効量での該組成物の投与が、免疫応答を誘導する、方法。 - 誘導される前記免疫応答が、細胞傷害性T細胞応答を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記キメラポリペプチドをコードする前記核酸またはベクターが、裸のDNAとして投与される、請求項50に記載の方法。
- 前記裸のDNAが、遺伝子銃またはその等価物によって投与される、請求項52に記載の方法。
- 前記組成物がリポソーム処方物として投与される、請求項50に記載の方法。
- 前記組成物が皮内投与される、請求項50に記載の方法。
- 病原体による感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、該方法が、有効量の組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、以下:
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、あるいは
該核酸、該ベクター、該キメラポリペプチドもしくはこれらの組み合わせを含む、DNAワクチン、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;病原体由来の抗原性ポリペプチドを含む第2のポリペプチドドメインとを含み、
ここで、該有効量での該組成物の投与が、該病原体に対する免疫応答を誘導する、方法。 - 腫瘍抗原に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、該方法が、有効量の組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、以下:
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターまたは
キメラポリペプチド、あるいは
該核酸、該ベクター、該キメラポリペプチドもしくはこれらの組み合わせを含む、DNAワクチン、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;腫瘍抗原を含む第2のポリペプチドドメインとを含み、
ここで、該組成物の投与が、該腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導する、方法。 - 抗原に対して哺乳動物にワクチン接種するための薬学的処方物を調製するための、組成物の使用であって、該薬学的処方物が、以下:
キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、キメラポリペプチド、またはこれらの組み合わせ、および
薬学的に受容可能な賦形剤、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質(HSP)のカルボキシ末端フラグメント、Flt−3リガンド(FL)、またはPseudomonas外毒素Aの細胞質トランスロケーションドメイン(ETA dII)と;腫瘍抗原を含む第2のポリペプチドドメインとを含む、使用。
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