JP2006056869A - 子宮頸癌抑制の融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】子宮頸癌抑制の融合蛋白は、ヒトパピロマウイルス16型のE7蛋白ペプチド配列、トランスロケーションのペプチド配列、及びカルボキシル基終端部フラグメント内のペプチドを包含する。本発明は更にE7ペプチドと結合された抗体組成物を提示する。トランスロケーションペプチド配列は緑膿菌外毒素の一部由来であると共に、該E7ペプチドの特定配列を示す。
【選択図】図2
Description
ヒトパピロマウイルス(human papillomavirus;HPV)16型のE7蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項2の発明は、請求項1記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、ヒトパピロマウイルス16型のE7蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列はSEQ.ID.NO.1であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項3の発明は、請求項1記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項4の発明は、請求項1記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項5の発明は、請求項4記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部がKDELのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項6の発明は、請求項5記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がSEQ.ID.NO.2であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項7の発明は、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、そのうち、該子宮頸癌抑制融合蛋白が、
ヒトパピロマウイルス(human papillomavirus;HPV)16型のE7蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項8の発明は、請求項7記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項9の発明は、請求項7記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、ヒトパピロマウイルス(human papillomavirus;HPV)16型のE7蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列がSEQ.ID.NO.1であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項10の発明は、請求項7記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項11の発明は、請求項10記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部がKDELのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項12の発明は、請求項11記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がSEQ.ID.NO.2であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項13の発明は、E7ペプチドと結合された抗体組成物において、E7ペプチドのヌクレオチド配列がSEQ.ID.NO.1であることを特徴とする、E7ペプチドと結合された抗体組成物としている。
米国バイオテクノロジー情報センター(NCBI)データベースよりHPV16 E7蛋白配列(NC 001526,SEQ.ID.NO.3)を探し出す。合計98個のアミノ酸で構成されている。
前述の特許文献1に記載の方法で、HPV16E7蛋白を大腸桿菌システムにより大量に表現させる。改質の重点は野生ウイルス株のヌクレオチドフラグメントに対して、それがもともと表現するアミノ酸に影響を与えず、有効に大腸桿菌宿主システム中で表現できる情況下で、単一ヌクレオチドの改質を行なう。改質後のヌクレオチド配列はSEQ.ID.NO.1である。
本実施例で合成するヌクレオチドフラグメントは、合計8対のプライマーを利用し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でヌクレオチドフラグメントの合成を行なう。全てのプライマー対野配列については表1を参照されたい。表中の下線を有する配列は特定のフラグメントとの相補の発生を表示する。
まず、DNA鋳型無しの重合方式で、ただF1及びR1プライマーを利用してヌクレオチドフラグメンテーションを行なう。そのうち、この二つのプライマーの3’端部分にはそれぞれ15個の塩基があり、これは相互に相補の結合を行なう設計とされ、更に重合酵素の読み書き及び補足により1本の二股のDNA型板重合産物とされる。第1次PCR完成後に、1μlの重合産物をとって第2次PCRの鋳型DNAとなし、同時にF1及びR2プライマーをそれぞれ4μlと、必要なdNTPs、反応試薬及びPfuポリメラーゼ等を加え、第2次PCRを開始する。続いて同じ方式で合計8次のPCRを行ない、改質後のヌクレオチド配列を合成する(SEQ.ID.NO.1)。
同様の方式で、一部が情報ペプチドとされるKDEL配列を重合により形成する。そのプライマー配列は表1中のK3FとK3Rである。合成されたKDELヌクレオチド配列はSEQ.ID.NO.2のようである。
実施例1で重合反応完成後に獲得されたE7産物を、5%ポリアクリルアミド寒天ゲルを利用し分離し、並びに産物分子量を根拠とし標的産物を純化抽出する。pET或いはpPE(△III)担体を取り(非特許文献1)、制限酵素を利用して二つの担体及び純化後のE7フラグメントを同時に処理し、更に同様に5%ポリアクリルアミド寒天ゲルを利用し分離純化を行ない、0.3kbのE7配列を含有するフラグメントを取り、T4リガーゼを利用し、E7フラグメントと担体でフラグメント長さ7.84kbで、緑膿桿菌外毒素Aを含有し酵素毒性を有さない部分のPE(△III)遺伝子、及びE7遺伝子を含有する融合蛋白PE(△III)−E7のペプチドpPE(△III)−E7、及びフラグメント長さが3.83kbで、E7とpET23aを含有するpE7ペプチドを構築する。
K3−F K3−Rプライマーにより製造されたPCR DNAを制限酵素を利用して切断及び純化した後、pET23aのSall−Xhol位置に接合してフラグメント長さが3.78kbでn’−KDELRDELKDEL 多型ポリペプチド遺伝子を含有するpKDEL3ペプチドを得る。
同様の方式で、制限酵素Sall及びPst1でpKDEL3ペプチド中でフラグメント長さ1.47kbでKDEL含有配列を切断後に制限酵素Xho11及びPst1で切断した6.5kbのPE(△III)−E7ペプチドDNAに接合し、8.0kbサイズの融合蛋白PE(△III)−E7−KDEL3遺伝子を含有するペプチドpPE(DIII)−E7−K3を完成する。上述のペプチド構築フローについては図1を参照されたい。
上述の構築完成したペプチドを大腸桿菌JM108菌株中にトランスフォームして保存する。
上述の構築完成したペプチドをBL21(DE3)pLys菌株中にトランスフォームし、続いて大腸桿菌を200μg/mlの抗生物質アンピシリン(ampicillin)を含有する200mlの培養液中で培養し、菌液濃度OD550に0.3を達成させる。続いて1mM IPTG(イソプロピルチオ−β−D−ガラクトサイド,Promege,USA)を加え、続けて2時間培養し、生長した細胞を遠心分離で収集する。冷凍解凍反復操作の方式で目標蛋白質を付帯する細胞の細胞膜構造をばらばらにし、この時、溶解液10ml(0.3mg/ml溶菌酵素、1mMのPMSF及び0.06mg/mlのDNaseIを含有する)を加え、室温下で20分置き、続いて1mlの10%Triton X−100を加え、室温下で10分置き、その後、12000xgで10分間遠心分離して蛋白質を収集する。さらに1Mと2Mの尿素で洗浄する。最後に収集した蛋白質封入体(inclusion body)を8mlの8M尿素中に溶かす。
続いて市販のpET His−Tag純化システム(Novagen,USA)で、実験説明書に照らして以下の実験を行なう。8M尿素に溶かした蛋白質封入体を先に4ml NTA−Ni2+ で取り付け完成した寒天樹脂カラム中に注入する。更に、カラム中に接着した蛋白質を異なるpH(8.0、7.0、6.5、5.4、及び3.5)のバッファ液(6M 尿素、0.3m NaCl、20mMリン酸塩バッファ液及び20mM り−を含有)を注いで収集する。最後にSDS−PAGEで蛋白質純度を分析並びに定量する。この蛋白質のアミノ酸配列はSEQ.ID.NO.4である。
HPV16−E6、E7及びras癌発生遺伝子を、C57BL/6品系のマウスの主要肺部上皮細胞の癌化に用いる。この癌化細胞株は即ちTC−1であり、周知の方式を利用してTC−1細胞株を維持と生産する。この細胞株をRPMI 1640中で培養し、同時に10%(v/v)胎牛血清、50単位/mlのペニシリン或いはストレプトマイシン、L−gurutaminn 2mM、ピルビン酸ナトリウム1mM、2mMの非必須アミノ酸、及び0.4mg/mlのG418を加え、培養条件として、摂氏37度、培養箱中を5%のCO2 に維持する。
腫瘤細胞株を使用する当日、トリプシンで培養した細胞を処理並びに収集し、1X HBSSバッファ液で細胞を2回洗浄し、最後に1X HBSSバッファ液で細胞を使用したい濃度に希釈する。
試験を行なう蛋白質サンプル:E7、PE(△III)、PE(△III)−E7、PE(△III)−E7−KDEL3を1:10の比例でリン酸塩バッファ液中に希釈し、濃度を0.1mg/mlとし、まず摂氏37度で2時間培養し、使用前に更に10% ISA206補助剤(Sepec,France)と振動方式で混合し、四種類の異なるワクチンを形成する。それぞれ含有抗原量0.1mgの上述のワクチンを取り、同時にマウスのワクチン接種を進行し、並びに2週間後に一度のワクチン接種を追加して行ない、最後の接種の一週間後に、5×104 TC−1腫瘤細胞を免疫マウスの右腿皮下位置に注射して腫瘤生長を誘発し、同時に一組のワクチン未接種のマウスにも注射し、腫瘤の自然生長の情況を観察する。腫瘤生長誘発実験を行なって60日後、毎週或いは隔週で腫瘤生長の目測と触診を行なう。
結果は図2に示されるようであり、PE(△III)−E7−KDEL3融合蛋白(■)免疫を受けた後のマウスは腫瘤生長誘発試験期間にあって、この試験グループに参加したマウスはいずれも腫瘤発生が100%なく、且つ60日観察を続けてもいずれも同様の現象を呈した。反対に、E7、PE(△III)、PE(△III)−E7等の融合蛋白を受け、融合蛋白注射を受けなかったマウスグループは、腫瘤生長誘発試験期間の後、腫瘤発生無しの記録は最長でただ20日であった。結果から分かるように、PE(△III)及びKDEL3配列とE7抗原フラグメントの融合蛋白は、TC−1細胞株マウス癌化誘発試験モデル中で有効に腫瘤生長抑制の免疫効果を発揮した。
上述のワクチンで免疫したマウスを一週間後に犠牲試験に使用した後、その脾臓マクロファージ細胞を取り、異なるワクチン処理に属するマクロファージ細胞約3.5×105 を含む細胞液と、MHC クラスI抗原決定位置を含有するE7ペプチド(第46−57個のアミノ酸位置)1μg/mlを、一緒に16時間培養し、更にCD8+ 細胞表面標識と細胞内サイトカインIFN−γの結合染色反応及びフローサイトメーター(FACScan)を使用した試験方法については、非特許文献2を参照されたい。
本実施例中、最初にPE(△III)−E7−KDEL3融合蛋白のE7特定免疫の誘発に対する影響力を確認する。図3に示されるように、PE(△III)−E7−KDEL3融合蛋白を注射したグループにあって、IFN−γで製造したE7特定性を具えたCD8+ T細胞前躯物質は、どのグループよりも高いことが分かった(ブランクグループ10.1±1.4、E7グループ14.0±2.1、PE(△III)グループ12.0±2.1、PE(△III)−E7グループ36.0±2.8、PE(△III)−E7−KDEL3グループ564.0±28.0,p<0.01,AVONA)。結果からPE(△III)−E7−KDEL3グループはE7グループに較べ、40倍のE7特定性を具えたCD8+ T細胞前躯物質を誘発しうることが分かる。
実施例5の動物免疫方法のように、0.1mgのE7、PE(△III)、PE(△III)−E7、PE(△III)−E7−KDEL3融合蛋白でマウスに免疫し、並びに一週間後と二週間後に一度ワクチンを追加補強する。最後の免疫から7日後にマウス血清を収集する。
96孔トレイの各孔中を100μlのHPV16−E7(0.5μg/ml)融合蛋白で多い、摂氏4度下で培養隔液し、更に20%胎牛血清を含有するPBSで培養孔中を覆う。マウス血清をPBSで連続希釈し、続いて培養孔中に加え、摂氏37度で2時間培養する。更に0.05%Tween20のPBSで培養孔を洗浄した後、1:2000のペロキシダーゼ結合ラビットアンチマウスIgG抗体(Zymed,San Francisco,CA)を培養孔内に加え、更に室温下で1時間培養する。その後、培養トレイを洗浄し、並びに1−Step Turbo TMB−ELISA(Pierce,Rockford,IL)を加えて色を展開させ、最後に1MのH2 SO4 で反応を終了する。ELISA判読機を利用し、450nmの吸収スペクトル下で結果の判読を行なう。
本実施例中、更に実験でPE(△III)−E7−KDEL3が向上できるアンチE7抗体の力価を求める。図4に示されるように、免疫後のマウスが生産するアンチE7抗体の、血清中で測定されうる数値を、1:100希釈倍数でみると、ブランクグループは0.629±0.093、E7グループは0.882±0.886、PE(△III)グループは0.69±0.06、PE(△III)−E7グループは0.93±0.06、そしてPE(△III)−E7−KDEL3グループは3.593±0.54(p<0.01,AVONA)であり、明らかに、PE(△III)KDEL/E7融合蛋白で免疫したマウスは、他のグループより高いアンチE7抗体を発生することが分かる。
我々の実験結果は、PE(△III)−E7−KDEL3融合蛋白の有するE7特定性の免疫反応を十分に表示し、それはE7特定性CD8+ Tリンパ細胞及びE7特定性抗体の増加を包含する。
得られたデータはいずれも平均値及び標準誤差値(Mean±SEM)で表示される。実験グループの間の比較データは、Statistical Package for
Social Sciences,SPSS 9.0(SPSS Inc,Chicago,IL)を利用してANOVA変異数分析を行なったもので、誤差率が0.05より低ければ、そのデータが顕著な差異性を有することを表示する。
Claims (13)
- 子宮頸癌抑制の融合蛋白において、
ヒトパピロマウイルス(human papillomavirus;HPV)16型のE7蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。 - 請求項1記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、ヒトパピロマウイルス16型のE7蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列はSEQ.ID.NO.1であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
- 請求項1記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
- 請求項1記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
- 請求項4記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部がKDELのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
- 請求項5記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がSEQ.ID.NO.2であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
- 子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、そのうち、該子宮頸癌抑制融合蛋白が、
ヒトパピロマウイルス(human papillomavirus;HPV)16型のE7蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。 - 請求項7記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
- 請求項7記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、ヒトパピロマウイルス(human papillomavirus;HPV)16型のE7蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列がSEQ.ID.NO.1であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
- 請求項7記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
- 請求項10記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部がKDELのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
- 請求項11記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がSEQ.ID.NO.2であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
- E7ペプチドと結合された抗体組成物において、E7ペプチドのヌクレオチド配列がSEQ.ID.NO.1であることを特徴とする、E7ペプチドと結合された抗体組成物。
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