JP6466328B2 - HPV/CyaAベースのキメラタンパク質並びにHPV感染及びHPV誘導性障害に対する免疫応答の誘導におけるその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、N末端からC末端に、(a)ボルデテラCyaAタンパク質のN末端部分、(b)異なるHPVに由来する抗原を含む異種ポリペプチド、及び(c)ボルデテラCyaAタンパク質のC末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。本発明はまた、このキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物、並びに該組成物の予防的及び/又は治療的使用もまた、本発明の一部である。
ボルデテラ型の、特に、百日咳菌(Bordetella pertussis)のアデニル酸シクラーゼ(CyaA)は、抗原などのポリペプチドを抗原提示細胞(APC)の細胞質に効率的に送達することができる組換えベクターとして広く記載されている[1][2][3]。さらに、組換えCyaAは、腫瘍を担持するマウスを治療するために効果的に使用されている[4][5][6]。
-コドン224の下流への新しいユニークな制限部位を有するマルチクローニング部位配列の挿入;
-コドン225〜234の欠失;並びに
-コドン236、238、及び239の改変;これらの修飾は、このCyaA-抗原ハイブリッドタンパク質をインサイチュAPCの細胞膜を越えて移行させるのに極めて重要であることが以前に示された、局所的な静電電荷(より低い酸性度)を増大させるために導入された。
-CyaAに挿入されるポリペプチドへの酸領域の組み入れを回避すべきである;並びに
-二次及び三次構造は、ポリペプチドが挿入されている酵素的アデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインの適切な内在化に干渉するので、これらの挿入物へのそのような構造の組み入れを回避すべきである。
-E7タンパク質全長を含有するCyaA-E7fullベクター
-酸性ドメインからaa 30〜42が欠失しているE7断片を含有するCyaA-E7Δ30-42ベクター
-E7上に存在するマウスH-2Db拘束性T細胞エピトープを含有するCyaA-E749-57ベクター。
-HPV16及び/又はHPV18 E7タンパク質を保有するCyaAベクターは、C57BL/6マウスで免疫応答を生じさせる;
-完全応答は、CD8+ T細胞エピトープのみを有するE749-57エピトープと比較して、そのCD8+ T細胞エピトープとCD4+ T細胞エピトープの両方を有する抗原で得られる;
-優れた効率は、CyaA-E7full又はCyaA-E749-57で処置したマウスと比較して、E7タンパク質が、その酸性領域を残基30から42まで欠失しているCyaA-E7Δ30-42ベクターで処置したマウスで得られる;
-これらのベクターで得られる免疫応答は、腫瘍病変の退縮を誘導することができる;
-処置された無腫瘍マウスにおけるTC-1細胞による新たな刺激が拒絶されるので、長期間持続する応答が得られる;並びに
-各々の抗原がそのエピトープに対する応答をそれぞれ維持する、二価療法を開発するための2つの組換えCyaAの同時注射が可能である。
本発明者らは、野生型CyaAのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインに欠失があり、その中に、サイズの大きい(最大441個のアミノ酸残基を有するが、それに限定されない、配列によって例示される)及び/又は酸性電荷とも表記される強い負の静電電荷(最大-46)を提示する抗原が挿入されている新しいCyaAベクターを開発した。これらのコンストラクトが特異的なCD8+及びCD4+ T細胞応答及び細胞傷害性を誘導する能力、並びにそれらが腫瘍拒絶を誘導する能力を試験した。驚くことに、これらの新しいCyaAベクターは、強い負の静電電荷を有する抗原の標的細胞への送達を可能にすることが示された。さらに、これらの新しいベクターに挿入されたとき、その酸性ドメインを有する抗原は、これらの酸性ドメインが除かれた同じ抗原と比較して、ストリンジェントな条件下で行われた細胞傷害性アッセイで、より効率的であった。
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227(すなわち、位置182と228の間)に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片が、
2)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387(すなわち、位置320と388の間)に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなる。
-CyaA由来タンパク質は、配列番号19に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1〜227からなる断片が、配列番号2の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる配列のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる、及び
-CyaA由来タンパク質は、配列番号20に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1〜183からなる断片が、配列番号2の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる配列のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる。
(a)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の最初の残基から始まり、配列番号4、6、もしくは8の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAタンパク質の断片が、
(b)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号4、6、もしくは8の最後の残基で終わる、それぞれ、配列番号4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAタンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
1)配列番号13に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号13は、配列番号4の残基1〜227からなる断片が配列番号4の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる;
2)配列番号14に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号14は、配列番号4の残基1〜183からなる断片が配列番号4の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる;
3)配列番号15に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号15は、配列番号6の残基1〜227からなる断片が配列番号6の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる;
4)配列番号16に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号16は、配列番号6の残基1〜183からなる断片が配列番号6の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる;
5)配列番号17に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号17は、配列番号8の残基1〜227からなる断片が配列番号8の残基321〜1705からなる断片に融合したものからなる;及び
6)配列番号18に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号18は、配列番号8の残基1〜183からなる断片が配列番号8の残基387〜1705からなる断片に融合したものからなる。
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列番号2との少なくとも95%の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを回収すること
を含む、方法に関する。
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列番号2との少なくとも95%の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;及び
(d)該発現したキメラタンパク質を回収すること
を含む、方法に関する。
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並びに
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される。
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなる断片;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
-キメラタンパク質Btpr_114及びBtpr_116において試験されたペプチド216(配列番号34)は、-16の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_115及びBtpr_117において試験されたペプチド217(配列番号36)は、-37の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_143及びBtpr_144において試験されたペプチド233(配列番号38)は、-13の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_145及びBtpr-146において試験されたペプチド234(配列番号40)は、-38の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_161及びBtpr_169において試験されたペプチド326(配列番号42)は、-11の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_162及びBtpr_170において試験されたペプチド327(配列番号46)は、-10の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_163及びBtpr_171において試験されたペプチド328(配列番号50)は、-18の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_164 and Btpr-172において試験されたペプチド329(配列番号54)は、-19の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_165及びBtpr_173において試験されたペプチド330(配列番号44)は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_166及びBtpr_174において試験されたペプチド331(配列番号48)は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_167及びBtpr_175において試験されたペプチド332(配列番号52)は、-45の静電電荷を有する;並びに
-キメラタンパク質Btpr_168及びBtpr_176において試験されたペプチド333(配列番号56)は、-46の静電電荷を有する。
(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95%の類似性を有する変異体;
(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び
(c)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95%の類似性を有する変異体
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321〜1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387〜1706からなる断片;
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片;
5)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387〜1706からなる断片;
6)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片;
7)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321〜1706からなる断片;並びに
8)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片
を含む又はこれらからなる。
-配列番号25の残基1〜29/配列番号25の残基43〜98;
-配列番号26の残基1〜31/配列番号26の残基43〜105;
-配列番号27の残基1〜28/配列番号27の残基42〜98;
-配列番号28の残基1〜29/配列番号28の残基43〜97;
-配列番号29の残基1〜32/配列番号29の残基44〜106;
-配列番号31の残基1〜29/配列番号31の残基45〜99;及び
-配列番号32の残基1〜29/配列番号32の残基44〜98。
-配列番号25の残基1〜34/配列番号25の残基35〜98;
-配列番号26の残基1〜42/配列番号26の残基43〜105;
-配列番号27の残基1〜32/配列番号27の残基33〜98;
-配列番号28の残基1〜31/配列番号28の残基32〜97;
-配列番号29の残基1〜37/配列番号29の残基38〜106;
-配列番号31の残基1〜31/配列番号31の残基32〜99;及び
-配列番号32の残基1〜31/配列番号32の残基32〜98。
1) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基321〜1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が異なる;又は
2) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基387〜1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が異なる。
(I.材料及び方法)
(マウス)
6週齢の雌C57BL/6マウス(H-2b)をJanvier Laboratoriesから購入した。マウスを、病原体が存在しない条件下で、水及び餌を自由に摂取できる状態で飼育した。動物及びその世話が関係する手順は、国内外の法律及び政策を順守し、地方倫理委員会によって審査されるGenticel社の指針に適合させた。
TC-1(組織培養番号1)腫瘍細胞[19]は、HPV16 E6及びE7腫瘍遺伝子並びに活性化ヒトc-Ha-Ras腫瘍遺伝子によるC57BL/6初代マウス肺細胞の形質転換によって調製された。この研究で使用される細胞は、ATCCから入手された。TC1細胞を各実験の前に解凍し、その後、注射前に少なくとも10日間、インビトロで培養し、拡大した。
第0日目に、C57BL/6マウスに、TC-1細胞(100μLの1×PBSに希釈したマウス1匹当たり1×106個の細胞)を右脇腹の皮下経路から注射した。一部の実験では、第65日目に、マウスに、100μLの1×PBSに希釈したLL2-GFP又はLL2-HPV18 E7-GFP細胞を左脇腹の皮下経路から注射した。
(組換えCyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(C18-1)の構築及び精製)
構築及び精製は、EP1 576 967 B1号で既に記載された。ProCervixと命名された二価組成物を作製するために、CyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)(図1A)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(C18-1)(図1B)の2つの最終バルクをGenticelにおいて1:1の比で混合し、その後、これを分注して-80℃で保存した。
野生型CyaA(CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1)のDNA配列を大腸菌での発現用に最適化し、合成した(GeneCust)。最適化されたDNA配列をgtCyaAと命名する。この配列は、CyaA-触媒ドメインへの抗原性配列の挿入を容易にするために付加された以下のユニークな制限部位を保有している:
全ての抗原は、DNA 2.0.(USA)又はGenecust(Germany)によって合成され、クローニングは、Solvias, Switzerlandによって行われた。gtCyaAd93-pep216-CyaACopt及びgtCyaAd203- pep216-CyaACoptの模式的表示を図3A及び3Bに示す。
CyaAd203-PEP105optタンパク質は、抗原性挿入物としてポリペプチド105(PEP105)を含有する、203aaが欠失したアデニル酸シクラーゼ配列によって構成されている。最適化されたCyaA配列を、以前に記載されている通りに、NdeI制限部位及びBamHI制限部位で、pKTRACEプラスミドにクローニングした。Pep105抗原を合成し、EcoRI制限部位とXmaI制限部位の間にクローニングした。精製プロトコルは、EP1 576 967 B1号に既に記載された。pKTRACE CyaAd203-pep105optの模式的表示を図4に示す。
第11日目に、腫瘍測定後、検出可能な固形腫瘍を有するマウスに、耳真皮への皮内(id)注射によって、ワクチン接種した(両耳に注射した)。
ポリ-ICLC(TLR3アゴニスト)は、Oncovir(Inc, WA, US)によって、1mLの2mg/mLの乳白色の滅菌溶液を含むバイアル中に提供された。ポリ-ICLCをもとの容器に入れたままにして、+4℃で保存した。注射用のポリ-ICLCは、0.9%塩化ナトリウム溶液中の1.5mg/mLのポリ-L-リジン及び5mg/mLのカルボキシメチルセルロースナトリウムで安定化され、水酸化ナトリウムでpH 7.6〜7.8に調整された2mg/mLのポリ-ICを含む。
様々なパラメータを考慮に入れて、マウスにおける腫瘍発生を評価した:
・腫瘍サイズ:腫瘍を、腫瘍細胞接種5日後から始めて60日まで、週に2回、キャリパーを用いて手作業で測定した。その後、腫瘍体積を次のように計算した:体積=(長さ×幅2)/2。
・マウス生存:倫理的な理由で、異常に重大な(限界サイズ: 2000mm3)及び/もしくは壊死性の腫瘍を発生させるか、又は腫瘍誘導性運動障害を有するマウスを安楽死させた。
・無腫瘍マウスの数:この情報は、治療的ワクチン接種がいつ完全な腫瘍退縮(触診可能な腫瘍の不在)を誘導したのかを示す。
CD8+ T細胞の細胞傷害性をインビボで測定する方法は、広く記載されている[22、23]。簡潔に述べると、未感作マウス由来の同系脾細胞を異なる濃度のCFSE(カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル、Molecular Probes Invitrogen)で標識し、インビトロで関連ペプチドでパルスするか、又はパルスしないでおく。ペプチドパルスされた標的細胞集団とペプチドパルスされていない標的細胞集団の両方を同系のワクチン接種宿主に静脈内養子移植し、ペプチドパルスされた標的の損失を、脾臓へのフローサイトメトリー(BD FACSCanto II)によって測定した。殺傷のパーセンテージを、パルスされた標的細胞対パルスされていない細胞のパーセンテージの比の低下から推定し、初期比によって補正した(下記参照)。細胞調製物を注射前にフローサイトメトリーによって解析し、異なる標的細胞のCFSE標識をモニタリングし、インビボ殺傷パーセンテージの計算用の参照値(各々の細胞集団の実際のパーセンテージ)を得た。その後、3つの標的細胞集団を、1:1:1の比で、各々のワクチン接種マウスに静脈内注射した。インビボ殺傷のパーセンテージは、以下の式を用いて、別所に記載されている通りに算出される[24]:
IFN-γを産生する特異的CD8+ T細胞の頻度を、H-2b拘束性ペプチド(HPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49)又はHPV45 E7タンパク質のペプチド列のいずれかによる脾細胞のエクスビボ再刺激によって評価した。これを、IFN-γ ELISpotアッセイを行うことによって達成した:
・ELISpotアッセイをプールされたマウス脾細胞に対して行った。
・HPV16 E749-57ペプチド(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・OVA257-264(H-2b拘束性非関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・HPV18 E7AS43-49(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり0.25×106細胞
・HPV45 E7ペプチド列を含むウェル1つ当たり1×106細胞。
・#116-2/3ペプチド列(5μg/ml):#116-2及び#116-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・#171ペプチド列(3μg/ml):#171-1、#171-2、及び#171-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチド
・1μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチド
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
・10μg/mlで使用される、Genticelで生産されたHis-タグ化MAGEA3(TAA_002_MAGE-3)タンパク質
・脾細胞: B16-GFP細胞(MAGEA3を発現するもの又は発現しないもの)を19:1の比で共培養した(950000個の脾細胞:50000個のB16細胞)。
(A.モデル抗原に対する免疫応答を誘導する本発明の新しいベクターの能力の確認)
大きくかつ複数のエピトープを有する抗原を送達するその能力における本発明の新しいベクターの効率性を確認するために、441個のアミノ酸(配列番号24)を有するモデル抗原を設計した。
図5は、HPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、及びOVA257-264クラスI拘束性エピトープ、並びにHPV16 E7(#116-2/3)及びHPV18 E7(#171-1/2/3) 15-merペプチド列による再刺激の後に得られた結果を示している。以下の結論を引き出すことができる:
-ポリ-ICLC免疫増強プラセボによってワクチン接種したマウスの群では、抗原特異的免疫応答が検出されなかった。
-ポリ-ICLC免疫増強ProCervixワクチン接種でワクチン接種したマウスの群に関しては、再刺激がどのようなものであれ、予想通りの結果が得られた:
-HPV16E749-57及びHPV18E7AS43-49クラスI拘束性エピトープによるインビトロ再刺激は、明瞭なHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答を誘導した;
-OVA257-264再刺激では特異的応答が全く得られなかった;
-ペプチド列(#116-2/3及び#171-1/2/3)で得られたHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答の強度は、MHCクラスI拘束性ペプチド(HPV16E749-57、HPV18 E7AS43-49)で得られた応答のレベルと近かった。
-ポリ-ICLC免疫増強CyaAd203-PEP105optでワクチン接種したマウスに関して、HPV16 E7ペプチド列とHPV18 E7ペプチド列の両方(#116-2/3及び#171-1/2/3)並びにProCervixについて試験した全てのMHCクラスI拘束性エピトープ: HPV16E749-57、HPV18E7AS43-49による、また同じく、OVA257-264ペプチドによる、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答の検出。
図6は、異なるタイプのエクスビボ再刺激後に得られた結果を示している:
-OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチド
-MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-His-タグ化MAGEA3タンパク質
-B16-MAGEA3-GFP腫瘍細胞をAPCとして用いて、MAGE-A3タンパク質の内因性プロセッシングから生じるMHCクラスI拘束性エピトープの提示を介して、抗原特異的CD8+ T細胞を刺激した。MAGE-A3タンパク質を発現していないB16-GFP細胞もMAGEA3免疫応答特異性の陰性対照として試験した。
浸潤性細胞癌(ICC)を有する女性及びHPVに感染しているが、正常な細胞学的所見を有する女性におけるその罹患率に基づいて、7つの最もリスクの高いHPV型(16、18、45、31、33、52、及び58)由来の7つのE7配列: HPV16 E7変異体(gi_30172006;配列番号25)、HPV18 E7変異体(gi_167996747;配列番号26)、HPV31 E7変異体(gi_148727610;配列番号27)、HPV33 E7変異体(gi_257472286;配列番号28)、HPV45 E7変異体(gi_549287;配列番号29)、HPV52 E7変異体(gi_237861305;配列番号30)、及びHPV58変異体(gi_19111001;配列番号32)を選択した[9][10]。
三価Pep216及びPep217抗原並びに四価Pep233及びPep234抗原のDNAを合成し、新しいgtCyaAd93及びgtCyaAd203ベクターにクローニングした。対照として、各々のE7タンパク質を個別にgtCyaAd93に挿入し、HPV31、33、45、52、及び58のE7配列に問題があるかどうかを調べた。というのは、これらの配列は、CyaAタンパク質に挿入されたことがこれまで一度もなかったからである。
本発明者らは、四価候補で得られた結果が、CyaA中のE7ポリペプチド配列の数によるものであるのか、それともCyaA中のE7ポリペプチド配列の特定のアセンブリによるものであるかどうかをさらに調べた。その目的のために、様々なコンストラクトを試験した(表5)。
本発明者らは、プレ-MCBレベルで得られた結果が、gtCyaAd93ベクター中の四価コンストラクトに特に焦点を当てて確認されるかどうかをさらに調べた。
1.全体的な生産性及び純度は、Btpr_175を除いて、試験した全てのコンストラクトについて改善された。
2.生産性及び発現プロファイルは、gtCyaAd93よりもgtCyaAd203による組換えタンパク質で常に劣っている。
3. gtCyaAd93ベクターは、gtCyaAd203ベクターよりも良好な収率及び純度での4つのHPV抗原を含む組換えタンパク質の生産を可能にする。
4.これらの結果は、プレ-MCBで行われた観察を裏付けるものである。
(E.1 BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117の免疫原性)
BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117キメラタンパク質の免疫原性をさらに調べた。マウスに、それぞれ、プラセボ又はProCervix(CyaA-HPV16 E7+CyaA-HPV18 E7から構成される陽性対照)又はBtpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)のいずれかを皮内ワクチン接種した。全ての群をポリIC-LCで免疫増強した。ワクチン接種の7日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を、以前に同定されたMHCクラスI拘束性ペプチドで再刺激した。結果を図10に示した。
-10μgのProCervixによる免疫は、予想されたレベルのHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的IFN-γ応答を誘導した。
-三価候補ワクチンで得られる抗原特異的応答は、ProCervixで得られるものと同等であった。
-三価候補間で、特異的T細胞応答の頻度に差は認められなかった。
-HPV16抗原に対するより低い応答は、HPV16エピトープがHPV18エピトープ(該エピトープ対して、C56LB/6マウスは非常に感受性がある)よりも弱いという事実によるものである。
Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173、及びBTpr_175に存する新しいリードの免疫原性をC57BL/6マウスでさらに調べた。
-10μgの各々のリードによる免疫は、特異的IFN-γ応答を誘導した。
-gtCyaAd93及びgtCyaAd203は、抗原を抗原提示細胞に正確に送達した。
-HPV16、18、33、及び52 E7タンパク質に対する特異的免疫応答が測定された。
2つの三価リードの六価混合物の免疫応答をC57BL/6マウスで評価した。これらのリードは、それぞれ、HPV 16-18-45 E7タンパク質及びHPV 31-52-58 E7タンパク質を含むBTpr_114及びBTpr_165であった。先に記載されたものと同じプロトコルを使用した。実験の時点では、HPV52 E7についてマウスで同定されたMHCI拘束性ペプチドが知られていないので、脾細胞を、3つのサブプール(221-1、221-2、及び221-3)に分けられたHPV52 E7-ペプチドライブラリーで再刺激した。HPV16E7及びHPV18E7再刺激のために、3つサブプール(それぞれ、116-1、116-II、116-III、並びに171-I、171-II、及び171-3)に分けられたペプチドライブラリーも使用した。
-10μgの六価混合物による免疫は、IFN-γ ELISpotによって測定される、HPV16 E7、HPV18 E7、及びHPV52 T細胞応答を誘導した。
-そのそれぞれの抗原を有する各々のgtCyaAd93は、それらを抗原提示細胞(APC)に送達すること、及び測定可能なHPV型に対する抗原特異的T細胞応答を促進することができた。
-三価成分のみと六価候補ワクチンの間で、E7特異的T細胞応答の頻度に差は認められなかった(データは示さない)。
生産性及び純度の結果に基づいて、2つの七価組合せ: Btpr_165+Btpr_163及びBtpr_166+Btpr_164をC57BL/6マウスで試験した。マウスを、10μgの各々の七価候補ワクチンで、それぞれ、皮内免疫した。
-HPV16 E7について:#116-2j(c+d)ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方の七価候補ワクチン又はHPV16E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
-HPV18 E7について:#171-I及び#171-IIペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方の七価候補ワクチン及びHPV18E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発されるT細胞を再刺激することができた。
-HPV33 E7について:
・Btpr_166及びBtpr_164から構成された七価候補ワクチンについて、#220-2ペプチドサブプールよるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
・Btpr_165及びBtpr_163から構成された七価候補ワクチンについて、#220-1、#220-2、及び#220-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
-HPV52 E7について: #221-2及び#221-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方の七価候補ワクチン又はHPV52 E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する組換えgtCyaAd93を良好な生産性で生産及び精製することができる;
-組換えgtCyaAd203タンパク質も生産及び精製することができるが、生産性は同じ抗原を含むgtCyaAd93ベクターよりも劣る。
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する2つの組換えgtCyaAd93は、その抗原をAPCに正確に送達することができる。
-特異的な免疫応答が、各々の免疫原性HPV型に対してC57BL/6マウスで測定される。
-組換えgtCyaAd93を用いたE7タンパク質の設計は、例えば、HPV33 E7に関して示されているような、E7抗原に対する免疫応答に影響を及ぼし得る。
-複雑な構造(21個のシステイン)及び酸性電荷を有する抗原は、gtCyaAd93によって正確に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプロセッシングされる。これは、Gmiraらの文献(2001)及びFayolleらの文献(1998)の結果を考慮すると、予想外のことである。
(F.1 三価候補ワクチンのCD8媒介性細胞傷害効率)
細胞傷害性誘導における三価候補の効率を比較するために、アジュバントを用いて及びアジュバントを用いずに、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マウス由来の脾細胞を収集し、それぞれ、HPV16、HPV18、及びHPV45 E7タンパク質由来のペプチドライブラリーをローディングした。
-全長抗原は、CD8+ Tリンパ球による殺傷応答に有利に働くエピトープ(ヘルパーT細胞エピトープ)を有する可能性が高い;及び
-gtCyaAベクターは、酸性領域を有する抗原の送達を可能にする。
E7特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導するその能力における七価候補ワクチンの効率を比較するために、アジュバントを用いて、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マウス由来の脾細胞を収集し、それぞれ、HPV16及びHPV18 E7タンパク質由来のペプチドライブラリーをローディングした。
本発明者らは、TC-1腫瘍細胞モデルを用いて、4つの三価候補Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の治療効率をさらに検討した。
異なる抗原を発現する第一の腫瘍の根絶の後に、ワクチン接種マウスが、腫瘍の発生及び成長から防御されることができるかどうかをさらに評価した。HPV18 E7抗原を発現するLL2腫瘍細胞及び対照細胞株LL2-GFPを、(HPV16 E7抗原を発現する)TC-1移植腫瘍を事前に完全に退縮させた、生き残ったワクチン接種マウスの脇腹に接種した。
Claims (34)
- N末端からC末端に、
(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する変異体;
(b)各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、少なくとも3つのHPV E7抗原を含む異種ポリペプチド;及び
(c)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する変異体
:からなるキメラタンパク質であって、
該キメラタンパク質における断片(a)及び断片(c)の変異体が、その表面上にCD11b受容体を発現する標的細胞を結合し、かつそのアデニル酸シクラーゼドメインを該標的細胞の細胞質に移行させる能力を保持している、前記キメラタンパク質。 - 1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなる断片からなるタンパク質;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片からなるタンパク質;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなる断片からなるタンパク質;
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片からなるタンパク質;
5)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなる断片からなるタンパク質;
6)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片からなるタンパク質;
7)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が、異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなる断片からなるタンパク質;並びに
8)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV E7抗原を含み、各々のHPV E7抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片からなるタンパク質
:からなる群から選択される、請求項1記載のキメラタンパク質。 - 前記異種ポリペプチドが、HPV型のE7タンパク質の少なくとも3つの断片を含み又は該断片からなり、これらの断片のうちの少なくとも3つが異なるHPV型のE7タンパク質に由来する、請求項1又は2記載のキメラタンパク質。
- 前記異種ポリペプチドが、前記E7タンパク質の少なくとも4つの断片を含み又は該断片からなり、これらの断片のうちの少なくとも3つが異なるHPV型のE7タンパク質に由来し、これらの断片のうちの少なくとも2つが1つのHPV型の同じE7タンパク質に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- 前記異種ポリペプチドが、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなる、請求項1〜4のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- 前記異種ポリペプチドが、続くC末端部分として、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、及び続くN末端部分として、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分をさらに含む、請求項5記載のキメラタンパク質。
- 前記HPV型が、HPV16、HVP18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、及びHPV58型の中から選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- 前記第四のHPV型が、HPV16、HVP18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、及びHPV58型の中から選択される、請求項7記載のキメラタンパク質。
- 前記異種ポリペプチドが、配列番号34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、もしくは56に示される配列を含む又はこれからなる、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- その配列が、配列番号58、61、64、又は67に示されている通りである、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載のキメラタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
- 配列番号57、60、63、もしくは66に示される配列を含む又はこれからなる、請求項11記載のポリヌクレオチド。
- 請求項11又は12記載のポリヌクレオチド及び発現制御配列を含む、ベクター。
- ボルデテラ株のcyaCヌクレオチドコード配列をさらに含む、請求項13記載のベクター。
- 配列番号59、62、65、又は68に示される配列からなる、請求項13記載のベクター。
- 請求項11又は12記載のポリヌクレオチド又は請求項13〜15のいずれか一項記載のベクターを含む、細胞培養物。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラタンパク質、及び好適な医薬ビヒクルを含む、組成物。
- 少なくとも1つのアジュバントを含む、請求項17記載の組成物。
- (a)その異種ポリペプチドが、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、及び該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質、並びに(b)その異種ポリペプチドが、N末端からC末端に、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第五のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第六のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第五のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、及び該第六の型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質を含み、ここで、該第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型が、(a)HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58の中から選択されるか、又は(b)HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、及びHPV52の中から選択される、請求項17又は18記載の組成物。
- (a)その異種ポリペプチドが、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、及び該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質、並びに(b)その異種ポリペプチドが、N末端からC末端に、第五のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第六のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第七のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第五のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第六のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、及び第七の型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質を含み、ここで、該第一、第二、第三、第四、第五、第六、及び第七のHPV型が、(a)HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18、及びHPV45、(b)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52、及びHPV33、(d)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58、及びHPV52、(e)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33、及びHPV52、並びに(f)HPV16、HPV18、HPV45、HPV33、HPV31、HPV52、及びHPV58からなる群から選択される、請求項17又は18記載の組成物。
- 薬剤として使用するための、請求項1〜10のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項17〜20のいずれか一項記載の組成物。
- 病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項1〜10のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項17〜20のいずれか一項記載の組成物。
- (i)前記異種ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態に対する予防において使用するための、請求項1〜10のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項17〜20のいずれか一項記載の組成物であって、該免疫応答が該キメラタンパク質又は該組成物の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該異種ポリペプチドに含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態に対する予防が観察されない、前記キメラタンパク質又は組成物。
- 薬剤として使用するための、請求項1〜2のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- 病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項1〜2のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
- (i)前記異種ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態に対する予防において使用するための、請求項1〜2のいずれか一項記載のキメラタンパク質であって、該免疫応答が該キメラタンパク質の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該異種ポリペプチドに含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態に対する予防が観察されない、前記キメラタンパク質。
- 薬剤として使用するための、請求項9又は10記載のキメラタンパク質。
- 病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項9又は10記載のキメラタンパク質。
- (i)前記異種ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態に対する予防において使用するための、請求項9又は10記載のキメラタンパク質であって、該免疫応答が該キメラタンパク質の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該異種ポリペプチドに含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態に対する予防が観察されない、前記キメラタンパク質。
- (a)配列番号34又は配列番号36に示される配列からなる異種ポリペプチドを含むキメラタンパク質、及び(b)配列番号46又は配列番号48に示される配列からなる異種ポリペプチドを含むキメラタンパク質である、請求項17又は18記載の2つのキメラタンパク質を含む組成物。
- 前記2つのキメラタンパク質が、(a)配列番号58、61、64又は67を含む又はこれからなるキメラタンパク質、及び(b)配列番号58、61、64又は67を含む又はこれからなるキメラタンパク質であって、ここで、配列番号34の配列は、配列番号58又は61において、配列番号46の配列によって置き換えられており、かつ配列番号36の配列は、配列番号64又は67において、配列番号48の配列によって置き換えられている、請求項17又は18記載の組成物。
- 病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項30記載の組成物。
- 病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項31記載の組成物。
- (i)前記異種ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態に対する予防において使用するための、請求項30又は31記載の組成物であって、該免疫応答が該組成物の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該異種ポリペプチドに含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態に対する予防が観察されない、前記組成物。
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