ES2712647T3 - Proteínas quiméricas basadas en HPV/CyaA que comprenden un polipéptido heterólogo y sus usos en la inducción de respuestas inmunes contra infección por HPV y trastornos inducidos por HPV - Google Patents

Proteínas quiméricas basadas en HPV/CyaA que comprenden un polipéptido heterólogo y sus usos en la inducción de respuestas inmunes contra infección por HPV y trastornos inducidos por HPV Download PDF

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Abstract

Una proteína quimérica que comprende o que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal: (a) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO:2 y terminando con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos E7 de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO:2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCION
Protefnas quimericas basadas en HPV/CyaA que comprenden un polipeptido heterologo y sus usos en la induccion de respuestas inmunes contra infeccion por HPV y trastornos inducidos por HPV.
Campo de la invencion
La invencion se refiere a una protefna quimerica que consiste en, de N-terminal hacia C- terminal, (a) una parte N-terminal de una protefna CyaA de Bordetella (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV que se originan a partir de HPVs diferentes, y (c) una parte C-terminal de una protefna CyaA de Bordetella. La invencion tambien se refiere a un polinucleotido que codifica para una version de una CyaA de Bordetella que tiene delecion, asf como a un polinucleotido que codifica para esta protefna quimerica. Tambien son parte de la invencion una composicion que comprende al menos una protefna o protefnas quimericas de la invencion y los usos profilacticos y/o terapeuticos de dicha composicion.
Antecedentes de la invencion
La Adenilato Ciclasa (CyaA) de los tipos de Bordetella en particular de Bordetella pertussis, ha sido descrita exhaustivamente como un vector recombinante capaz de suministrar en forma eficiente polipeptidos, tal como antigenos, en el citosol de celulas presentadoras de antigeno (APC) [1], [2], [3]. Mas, las CyaAs recombinantes se han utilizado para tratar en forma eficaz ratones que portan tumores [4], [5], [6].
Varios autores han resaltado que la eficiencia del suministro de polipeptido, en particular suministro de antigeno, mediante CyaA (utilizada como un vector) puede ser afectada positiva o negativamente por la carga electrostatica del polipeptido insertado (antigeno) y su conformacion. En 1998, Karimova & al. [7] describieron que el suministro de epftopos de polipeptido de celula T CD8+, insertados en CyaA, hacia y dentro de celulas presentadoras de antigeno es dependiente de la carga electrostatica de los epftopos insertados: una CyaA recombinante que aloja al epftopo OVA fue capaz de translocarse en la APC y de inducir una respuesta CTL in vivo, mientras que la misma construccion con 4 restos glutamicos fusionados al epftopo OVA, ya no puede traslocarse, y no induce una respuesta de linfocito de celula T citotoxica (CTL) detectable in vivo. En 2012, Holubova et al. describieron diversas construcciones basadas en CyaA: ya sea protefnas CyaA con delecion dentro de sus N-terminales que comprenden el epftopo OVA SIINFEKL, o protefnas CyaA truncadas respecto a sus dominios N-terminales y que comprenden varios epftopos insertados en sitios diferentes [25].
Holubova et al. concluyen que sus experimentos proveen una prueba de concepto para la construccion de suministro de antigeno basada en CyaA que tiene el dominio AC completo remplazado por poliepftopo de CTL artificial grande. En 2001, Gmira et al. [8] desarrollaron un nuevo vector CyaA para facilitar la construccion de CyaAs recombinantes con polipeptidos o antfgenos exogenos insertados dentro de sus dominios catalfticos. Estas modificaciones son: - la insercion de una secuencia de sitio de clonacion multiple con nuevos sitios de restriccion unicos corriente abajo desde el codon 224;
- la delecion de los codones 225 a 234; y
- el cambio de los codones 236, 238 y 239; estas modificaciones se introdujeron para incrementar la carga electrostatica local (menos acido), lo cual previamente se demostro que es crftico para la translocacion de esta protefna hibrida CyaA-antfgeno a traves de la membrana celular de APC in situ.
La CyaA modificada tiene actividad invasiva similar que la CyaA de tipo silvestre.
Los autores analizaron 5 antfgenos, cuyo tamano varfa de 87 a 206 restos, con una carga electrostatica de -4 a 14, y mostraron que aquellos que tienen un valor acido perdieron su eficiencia de translocacion, lo que confirma los resultados previos de Karimova et al. Asimismo, estos analizaron CyaAs con antfgenos con puentes de disulfuro internos o estructuras complejas: ninguno fue capaz de translocacion en las celulas elegidas como blanco, lo que soporta la hipotesis de que los polipeptidos insertados en el dominio catalftico de CyaA se deben desdoblar para que sean translocalizados.
Tabla 1: extraida de [7] y [8]. La inserciones con carga acida no se translocan en el citosol de las APC. La carga acida se calcula del numero de restos de Lys y Arg menos el numero de restos de Asp y Glu.
Referencias rCyaA Nombre del Tamano del Carga electros
antigeno / origen antigeno (aa) tatica Actividad (+ o -) Gmira et al., CyaA Ninguno NA NA
2001 CyaA-Neuro Neurocalcina 6 de g
bovino
Referencias rCyaA Nombre del Tamano del Carga electros
antfgeno / origen antfgeno (aa) tatica Actividad (+ o -) , Restrictocina de
CyaA-Rest Aspergillus 148 5
Restrictus
CyaA-DHFR Dihidrofolato
reductasa de raton 7
CyaA-T at Tat-VIH 87 14 CyaA-Nef Nef-VIH 206 -4 -CyaA-Ova21 Epftopo clase I de Q Karimova et Ova 8 0
1998 aL' CyaA- Epftopo clase I de
Ova 4 acidos 12 -4
Ova21-4E glutamicos
Los antfgenos utilizados en el caso de pruebas de regresion de tumor tienen ya sea un tamano corto (OVA es de 8 restos de longitud) [4] o sus estructuras secundarias estan alteradas por reacomodos internos de segmentos de antfgeno y con un tamano maximo de 103 restos [5].
A partir de estos estudios, se sacaron las siguientes conclusiones para mejorar la eficiencia de vectorizacion utilizando el vector CyaA:
- Se debe evitar la inclusion de regiones acidas en un polipeptido que se va a insertar en CyaA; y
- Se debe evitar la inclusion de estructuras secundarias y terciarias en estos insertos porque dichas estructuras interfieren con la interiorizacion apropiada del dominio enzimatico de la adenilato ciclasa (AC) en el cual se ha insertado el polipeptido.
En vista de estas conclusiones, se construyeron dos CyaAs recombinantes, una que contiene el antfgeno E7 de HPV16 y la otra al antfgeno E7 de HPV18. Ademas, tambien se construye una CyaA recombinante bivalente en la cual los antfgenos E7 de HPV16 y HPV18 se han insertado juntos (patente EP1576967; Preville et al.). Sin embargo, no se reporta ninguna prueba con una CyaA recombinante en la cual se hayan insertado mas de 2 protefnas E7 de HPV en el mismo vector CyaA.
Por lo tanto, Preville et al., describen tres vectores CyaA recombinantes en los cuales se ha insertado el polipeptido E7 del tipo de HPV16 o variantes del mismo.
- el vector CyaA-E7fu l/ que contiene la longitud completa de la protefna E7,
- el vector CyaA-E7a30-42 , que contiene fragmentos de E7 eliminados del dominio acido desde los aa 30 a 42 - el vector CyaA-E749-57 , que contiene un epftopo de celula T restringido en H-2D de mundo presente en E7.
Estos vectores CyaA recombinantes se utilizan para inmunizar ratones y para detectar respuestas de CTL especfficas de E7. Para medir la respuesta inmune despues de la inmunizacion de los ratones, se efectuan pruebas de liberacion de cromo de CTL. En experimentos en animales in vivo, CyaA-E7a30-42 y CyaA-E7fu ll~ dieron las respuestas inmunes de CTL mas eficientes en comparacion con CyaA-E749.57 .
Tambien se evalua la capacidad de estos vectores CyaA recombinantes para inducir regresion de tumor. Si la tasa de regresion de tumor conferida por CyaA-E749-57 y CyaA- E7fuM no puede ser diferenciada en forma notable, CyaA-E7a30-42 es claramente superior en terminos de regresion de tumor e inhibicion de crecimiento. Por lo tanto, el epftopo de CTL individual que demostro previamente ser reconocido en ratones C57BL/6 ha probado ser eficiente, pero no da la respuesta inmune mas optima.
Despues se evalua la persistencia de la respuesta inmune. Se analizan esplenocitos provenientes de algunos ratones sobrevivientes despues de 3 meses respecto a su capacidad para lisar celulas TC-1 que expresan el antfgeno E7 y los otros animales sobrevivientes se vuelven a desafiar con celulas TC-1 en el dfa 100 despues de la vacunacion. Los animales vacunados con CyaA-E7fi30-42 despliegan un nivel alto de proteccion. Menos del 40% de los animales vacunados con CyaA-E749-57 fueron protegidos mientras que 90% a 100% de los animales vacunados con CyaA-E7fi30-42 y CyaA-E7full~ sobrevivieron.
De este trabajo se pueden extraer las siguientes ensenanzas:
- los vectores CyaA que portan las protefnas E7 de HPV16 y/o HPV18 llevan a una respuesta inmune en ratones C57BL/6;
- se obtiene una respuesta completa con un antfgeno que tiene sus epftopos tanto de celula T CDE8+ como de celula T CD4+ en comparacion con el epftopo E749-57 el cual tiene solamente un epftopo de celula T CD8+; - se obtiene una eficiencia superior en ratones tratados con el vector CyaA-E7fi30-42 en la cual la protefna E7 tiene su region acida eliminada desde los restos 30 a 42, en comparacion con ratones tratados con CyaA-E7full~ o CyaA-E749-57 ;
- la respuesta inmune obtenida con estos vectores es capaz de inducir regresion de lesiones de tumor,
- se obtiene una respuesta perdurable, debido a que se rechaza un nuevo desaffo con celulas TC-1, en ratones libres de tumor tratados; y
- es posible la co-inyeccion de dos CyaAs recombinantes con el fin de desarrollar una terapia bivalente, manteniendo cada antfgeno la respuesta contra sus epftopos respectivamente.
Por lo tanto, en la tecnica antecedente, tramos de aminoacido acidos incrustados en ciertos polipeptidos o antfgenos y polipeptidos o antfgenos cargados negativamente en su totalidad han demostrado alterar la eficiencia de un vector CyaA para translocar estos polipeptidos, a traves de la membrana celular de la APC en los animales vacunados. Esto lleva a respuestas inmunes celulares debiles o no protectoras contra dichos antfgenos.
Los inventores consideran que esto podrfa ser considerado como un obstaculo para el diseno de candidatos de farmaco, debido a que dichas secuencias de aminoacido acidas pueden contener epftopos CD4+ y/o epftopos CD8+ importantes, requeridos para inmunidad celular protectora.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de vectores mejorados que porten construcciones inmunogenicas que puedan ser utilizadas para inducir respuestas inmunes protectoras celulares fuertes y perdurables, en particular en regresion de tumores y en prevencion de tumor, contra polipeptidos y antfgenos que abarcan tramos de aminoacido acidos y contra polipeptidos o antfgenos cargados negativamente en su totalidad.
Breve descripcion de las figuras
Figuras 1A-1B: (Figura 1A) Mapa esquematico de pKTRACE5-HPV16E7fi30-42 en el cual se indican los sitios de restriccion y las secuencias insertadas relevantes para CyaA-HPV16E7fi30-42 ; (Figura 1B) Mapa esquematico de pKTRACE5- HPV18E7fi32-42 en el cual se indican los sitios de restriccion y las secuencias insertadas relevantes para CyaA-HPV18E7fi32-42 .
Figura 2: La protefna gtCyaA y los mutantes de gtCyaA disenados. Desde los aminoacidos (restos) 1 a 400, el dominio catalftico (AC); desde los aminoacidos 401 a 1706, el dominio hemolftico. Dentro del dominio catalftico, tres recuadros claros representan las tres regiones descritas como esenciales para la actividad de CyaA ([15], [16], [1]): el dominio I (aa 54-77) implicado en la interaccion con ATP, el dominio II (aa 184-198) implicado en la interaccion con Mg2+-ATP y el dominio III (aa 287-318) implicado en la interaccion con la Calmodulina (CaM). gtCyaAd93 corresponde a la secuencia gtCyaA con 93 aa (228320) eliminados. gtCyaAd203 corresponde a la secuencia gtCyaA con 203 aa (184-386) eliminados.
Figuras 3A-3B: (Figura 3A) Mapa esquematico del vector pGTPc608 que comprende al polinucleotido gtCyaAd93- pep216 y al gen optimizado cyaC bajo el promotor inducible IPTG; (Figura 3B) mapa esquematico del vector pGTPc608 que comprende el polinucleotido gtCyaAd203-pep216 y al gen cyaC optimizado bajo el promotor inducible IPTG.
Figura 4: Mapa grafico del plasmido CyaAd203- pep105. Pep105 se clona entre los sitios de restriccion EcoRI y Xmal.
Figura 5: Frecuencias de E749-57 de HPV16, E7a s 43-49 de HPV18 y OVA257-264 y de linfocitos T CD8+ especfficos y frecuencias de linfocitos T especfficos de E7 de HPV16 (#116-2/3) y E7 de HPV18 (#171-1/2/3), medidas siete dfas despues de la inmunizacion con placebo, ProCervix o CyaAd203-PEP105. Se muestra el numero de eventos por millon de esplenocitos totales. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular, de izquierda a derecha, con medio (control), peptidos restringidos de clase I del MHC de E749-57 de HPV16, E7AS43-49 de HPV18, OVA257-264, bancos de peptidos #116-2/3 y bancos de peptidos #171-1/2/3, durante 20 horas a 37°C, 5% de CO2.
Figura 6: Frecuencias de linfocitos T especfficos de GP33-4i de LCMV, OVA323-339, MOG35-55 y MAGEA3 medidas siete dfas despues de la inmunizacion con placebo, ProCervix o CyaAd203-PEP105; Se muestra el numero de eventos por millon de esplenocitos totales. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular, de izquierda a derecha, con medio (control), peptidos GP33-41 de LCMV, OVA323-339, MOG35-55, protefna Histag MAGE-A3, o se vuelven a estimular en presencia de la lfnea B16-GFP de celulas de tumor B16 y despues B16-MAGEA3-GFP utilizada como APC, todas las reestimulaciones durante 20 horas a 37°C, 5% de CO2.
Figuras 7A-7B: (Figura 7A) Alineacion de las secuencias de protefna E7 de HPV16, 18 y 45; recuadro negro: el motivo de union de pRB; recuadros grises: las cistefnas implicadas en el asa de dedo de zinc; la flecha negra resalta la region acida; (Figura 7B) Alineacion de las secuencias de protefna HPV31, 33, 52 y 58; recuadro negro: motivo LXCXE; recuadros verdes: cistefnas implicadas en el asa de dedo de zinc; recuadro de lfnea discontinua: para la secuencia de E7 de HPV52, posicion del epftopo auto-inmune.
Figuras 8A-8B: (Figura 8A) Antfgenos de vacunas candidatas trivalentes; (Figura 8B) secuencias de antfgenos re-entremezcladas de vacunas candidatas tetravalentes (N- ter: parte N-terminal de la protefna E7; C-ter: parte C- terminal de la protefna E7).
Figura 9: perfil de expresion de protefna despues de 3 horas de induccion con IPTG (I0: antes de la induccion; I3: despues de la induccion)
Figura 10: Frecuencias de linfocitos T CD8+ especfficos de E749-57 de HPV16 y E7a s 43-4 9 de HPV18 medidas siete dfas despues de la inmunizacion; los esplenocitos totales se vuelven a estimular con peptidos restringidos con clase I del MHC. Los resultados se expresan como numero de celulas que secretan IFN-y por millon de esplenocitos totales.
Figura 11: Frecuencias de linfocitos T secretores de IFN-y de E7 de HPV45 medidas siete dfas despues de la inmunizacion, los esplenocitos totales se vuelven a estimular con peptidos traslapantes de 15-meros que cubren la secuencia de peptido completa de E7 de HPV45 (subcombinado 1: #218-1, sub-combinado 2: #218-2, subcombinado 3: #218-3). Los resultados se expresan como numero de celulas que secretan IFN-y por millon de esplenocitos totales.
Figuras 12A-12B: Prueba de aniquilacion in vivo con candidatos trivalentes (Btpr_114, Btpr115 y BTpr_117); Figura 12A: porcentaje de aniquilacion in vivo de esplenocitos cargados con las genotecas #171-1 y #171-2 del peptido E7 de HPV18; Figura 12B: porcentaje de aniquilacion in vivo de esplenocitos cargados con la genoteca #218-3 del peptido E7 de HPV45.
Figuras 13A-13B: La vacunacion terapeutica utilizando vacunas candidatas de CyaA con coadyuvante poli- ICLC incrustando el antfgeno de E7 de HPV16 lleva a eliminacion de tumor solido inducido por TC-1; (Figura 13A) esquema de vacunacion: todos los ratones se inoculan en el flanco derecho en el dfa 0 con celulas de tumor TC-1; estos se tratan en el dfa 11. (Figuras 13B(a-g)) Monitoreo del crecimiento de tumor hasta el dfa 60.
Figuras 14: proteccion profilactica de ratones que eliminaron la lfnea de celula de tumor TC-1 contra el crecimiento de la lfnea celular LL2-HPV18 E7 o de la lfnea celular LL2-GFP (Figura 14A) Esquema de vacunacion: en el dfa 65, los ratones que han eliminado los tumores TC-1 se dividen en dos sub-grupos y se inoculan ya sea con la lfnea celular LL2-HPV18 E7 o con la lfnea celular LL2-GFP de control. (Figuras 14B(a-j)) Monitoreo del crecimiento de tumor hasta el dfa 110.
Figuras 15A-15C: Frecuencias de linfocitos T especfficos de E7 de HPV16 (Figura 15A), E7 de HPV18 (Figura 15B) y E7 de HPV52 (Figura 15C) medidas siete dfas despues de la inmunizacion - Los esplenocitos totales se volvieron a estimular con peptidos traslapantes de 15-meros que cubren las secuencias de la protefna E7 de HPV16 (Figura 15A), HPV18 (Figura 15B) y HPV52 (Figura 15C) . Los sub-combinados de peptidos se indican en los cuadrados. Los resultados se expresan como numero de celulas formadoras de mancha (sfc por sus siglas en ingles) de IFN-y por millon de esplenocitos totales. Las sfc de E7 de HPV18 son muy numerosas para contar (TNTC por sus siglas en ingles).
Figuras 16A-16D: Frecuencias de linfocitos T especfficos de E7 de HPV16 (Figura 16A), E7 de HPV18 (Figura 16B), E7 de HPV33 (Figura 16C) y E7 de HPV52 (Figura 16D) secretores de IFN-y medidas siete dfas despues de la inmunizacion. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular con peptidos traslapantes de 15-meros que cubren secuencias de peptido completo de E7 de HPV16 (Figura 16A), h Pv 18 (Figura 16B), HPV33 (Figura 16C) y HPV52 (Figura 16D) (cada banco de peptido se subdivide en sub-combinados desde el N-terminal hacia el C-terminal de la protefna E7 (como se indica en las leyendas de los histogramas). Los resultados se expresan como numeros de celulas formadoras de manchas de IFN-y por millon de esplenocitos totales.
Figuras 17A-17B: Aniquilacion especffica de E7 de celulas cargadas respectivamente con genoteca de peptido E7 de HPV16 (Figura 17A) o genoteca de peptido E7 de HPV18 (Figura 17B) inducida por vacunas candidatas heptavalentes.
Descripcion detallada de la invencion
Los inventores de la presente invencion han desarrollado vectores CyaA nuevos los cuales tienen delecion en el dominio de adenilato ciclasa (AC) de la CyaA de tipo silvestre, y en los cuales se han insertado antfgenos de tamano grande (ilustrado con secuencias que tienen hasta 441 restos de aminoacido pero sin limitarse a lo mismo) y/o presentan cargas electrostaticas altamente negativas tambien designadas como cargas acidas (hasta - 46). Se analizo la capacidad de estas construcciones para inducir respuestas de celula T CD8+ y CD4+ y citotoxicidad asf como su capacidad para inducir rechazos de tumor. De manera sorpresiva, estos nuevos vectores CyaA han demostrado permitir el suministro de antfgenos con carga electrostatica negativa alta a las celulas diana. Asimismo, cuando se insertan en estos nuevos vectores, los antfgenos con sus dominios acidos son mas eficientes, en pruebas citotoxicas efectuadas bajo condiciones astringentes, en comparacion con los mismos antfgenos privados de estos dominios acidos.
La solicitud desvela un polinucleotido que codifica para una protefna derivada de CyaA, en la cual dicha protefna derivada de CyaA consiste en:
1) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2 (es decir, entre las posiciones 182 y 228), fusionado a
2) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 (es decir, entre las posiciones 320 y 388) y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoacido de la protefna CyaA de tipo silvestre de Bordetella pertussis. Una realizacion particular de un polinucleotido, que codifica para la CyaA como se indica en la SEQ ID NO: 2, es como se indica en la SEQ ID NO: 1. Otra realizacion particular de un polinucleotido, que codifica para la CyaA como se indica en la SEQ ID NO: 2, es una version modificada de la secuenciala SEQ ID NO: 1, mediante mutaciones de nucleotido silenciosas, es decir, mediante modificaciones que no dan como resultado un cambio al aminoacido de la SEQ ID NO: 2. Una version modificada particular de la SEQ ID NO: 1 es una secuencia, optimizada para expresion en E. coli, como se indica en la SEQ ID NO: 69.la SEQ ID NO: 69 es parte de la invencion. Dentro de la presente invencion, un polinucleotido que codifica para una protefna quimerica de CyaA de la invencion no codifica o no comprende un polinucleotido que codifique parala SEQ ID NO: 2. Asimismo, un polinucleotido que codifica para protefna derivada de CyaA de la invencion no comprende o no consiste en la SEQ ID NO: 1.
La protefna quimerica de CyaA resultante de la invencion que se puede obtener a partir de dicho polinucleotido de la invencion comprende o consiste en dos fragmentos, fusionados entre sf o recombinados, de la misma protefna CyaA de Bordetella. Mediante "fragmentos", se quiere decir un tramo o una concatenacion de restos de aminoacido consecutivos encontrados en la secuencia de la protefna CyaA de Bordetella de tipo silvestre.
El primer fragmento (la porcion N-terminal del polipeptido derivado de CyaA) comienza con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y termina con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2.
Este primer fragmento tiene un tamano que varfa de 183 a 227 restos, es decir, es de al menos 183 restos y es de cuando mucho 227 restos de longitud. Este fragmento puede ser de al menos 183, al menos 190, al menos 200, al menos 210 o al menos 220. En una realizacion particular, el tamano de este primer fragmento es de 183 restos o es de 227 restos.
Por lo tanto, este fragmento comienza con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y termina con un resto que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 y 227 de la SEQ ID NO: 2.
En otras palabras, este primer fragmento consiste en una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 1-183, 1-184, 1-185, 1-186, 1-187, 1-188, 1-189, 1-190, 1-191, 1-192, 1193, 1-194, 1-195, 1­ 196, 1-197, 1-198, 1-199, 1-200, 1201, 1-202, 1-203, 1-204, 1-205, 1-206, 1-207, 1-208, 1209, 1-210, 1-211, 1-212, 1-213, 1-214, 1-215, 1-216, 1217, 1-218, 1-219, 1-220, 1-221, 1-222, 1-223, 1-224, 1225, 1-226, y 1-227 de la SEQ ID NO: 2.
En una realizacion particular, este primer fragmento consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2 o de los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2.
En una realizacion particular, el polinucleotido que codifica para dicho primer fragmento comienza con el primer nucleotido de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69 y termina con un nucleotido localizado desde la posicion 549 hasta la posicion 681 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69, con la condicion que la longitud de dicho fragmento de nucleotido sea un multiplo de 3. Por lo tanto, el polinucleotido que codifica para este fragmento comprende o consiste en una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 1-549, 1­ 552, 1-555, 1558, 1-561, 1-564, 1-567, 1-570, 1-573, 1-576, 1-579, 1582, 1-585, 1-588, 1-591, 1-594, 1-597, 1-600, 1-603, 1606, 1-609, 1-612, 1-615, 1-618, 1-621, 1-624, 1-627, 1630, 1-633, 1-636, 1-639, 1-642, 1-645, 1-648, 1­ 651, 1654, 1-657, 1-660, 1-663, 1-666, 1-669, 1-672, 1-675, 1-678 y 1-681 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69.
El segundo fragmento (la porcion C-terminal del polipeptido derivado de CyaA) comienza con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y termina con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2. Este segundo fragmento tiene un tamano que varfa de 1320 a 1386 restos, es decir, es de al menos 1320 restos y es de cuando mucho 1386 restos de longitud. Este fragmento puede ser al menos 1320, al menos 1330, al menos 1340, al menos 1350, al menos 1360, al menos 1370 o al menos 1380. En una realizacion particular, el tamano de este segundo fragmento es de 1320 restos o es de 1386 restos.
Por lo tanto, este segundo fragmento comienza con un resto que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 y 387 de la SEQ ID NO: 2 y termina con el ultimo resto (es decir resto 1706) de la SEQ ID NO: 2.
En otras palabras, este segundo fragmento consiste en una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 321-1706, 322-1706, 323-1706, 324-1706, 325-1706, 326-1706, 327-1706, 328-1706, 329­ 1706, 330-1706, 331-1706, 332-1706, 333-1706, 334-1706, 335-1706, 336-1706, 337-1706, 338-1706, 339-1706, 340-1706, 341-1706, 342-1706, 343-1706, 344-1706, 345-1706, 346-1706, 347-1706, 348-1706, 349-1706, 350­ 1706, 351-1706, 352-1706, 353-1706, 354-1706, 355-1706, 356-1706, 357-1706, 358-1706, 359-1706, 360-1706, 361-1706, 362-1706, 363-1706, 364-1706, 365-1706, 366-1706, 367-1706, 368-1706, 369-1706, 370-1706, 3711706, 372-1706, 373-1706, 374-1706, 375-1706, 376-1706, 377-1706, 378-1706, 379-1706, 380-1706, 381-1706, 382-1706, 383-1706, 384-1706, 385-1706, 386-1706, y 3871706 de la SEQ ID NO: 2.
En una realizacion particular, este segundo fragmento consiste en los restos 321-1706 de la SEQ ID NO: 2 o en los restos 387-1076 de la SEQ ID NO: 2.
En una realizacion particular, el polinucleotido que codifica para dicho segundo fragmento comienza con un nucleotido localizado desde la posicion 961 hasta la posicion 1159 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69 y termina con el ultimo nucleotido (es decir, el nucleotido 5118) de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69, con la condicion que la longitud de dicho fragmento de nucleotido sea un multiplo de 3. Por lo tanto, el polinucleotido que codifica para este segundo fragmento consiste en una secuencia que se selecciona a partir de grupo que consiste en los restos 961-5118, 964-5118, 967-5118, 970-5118, 973-5118, 976-5118, 979-5118, 982-5118, 985-5118, 988­ 5118, 991-5118, 994-5118, 997-5118, 1000-5118, 1003-5118, 10065118, 1009-5118, 1012-5118, 1015-5118, 1018­ 5118, 10215118, 1024-5118, 1027-5118, 1030-5118, 1033-5118, 10365118, 1039-5118, 1042-5118, 1045-5118, 1048-5118, 10515118, 1054-5118, 1057-5118, 1060-5118, 1063-5118, 10665118, 1069-5118, 1072-5118, 1075­ 5118, 1078-5118, 10815118, 1084-5118, 1087-5118, 1090-5118, 1093-5118, 10965118, 1099-5118, 1102-5118, 1105-5118, 1108-5118, 11115118, 1114-5118, 1117-5118, 1120-5118, 1123-5118, 11265118, 1129-5118, 1132­ 5118, 1135-5118, 1138-5118, 11415118, 1144-5118, 1147-5118, 1150-5118, 1153-5118, 1156-5118 y 1159-5118 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69.
En una realizacion particular, la protefna derivada de CyaA consiste en un polipeptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 10;la s Eq ID NO: 10 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
En otra realizacion particular, la protefna derivada de CyaA consiste en un polipeptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 12;la s Eq ID NO: 12 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
Tambien se desvelan otras realizaciones particulares:
- la protefna derivada de CyaA consiste en un polipeptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 19, es decir, una secuencia que consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, y
- la protefna derivada de CyaA consiste en un polipeptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 20, es decir, una secuencia que consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
La expresion "fusionado(a) a" cuando se hace referencia a una protefna o un polipeptido significa que cada parte del peptido (por ejemplo varios fragmentos de CyaA, y opcionalmente un polipeptido heterologo) estan ligados covalentemente entre sf mediante un enlace peptfdico. El orden de estas diferentes partes de peptido se describe en la presente solicitud de N-terminal hacia C- terminal, es decir, el ultimo resto C-terminal de una parte esta ligado al primer resto N-terminal de la otra parte mediante un enlace peptfdico. La expresion "fusionado(a) a" cuando se hace referencia a un polinucleotido, significa que dos o mas partes del polinucleotido (por ejemplo, varios fragmentos de CyaA de nucleotido, y opcionalmente un nucleotido que codifica para un polipeptido heterologo) estan ligados covalentemente entre sf mediante un enlace tipo fosfodiester. El orden de estas diferentes partes de nucleotido se describe en la presente invencion como de 5' hacia 3', es decir, el ultimo nucleotido 3' de una parte esta ligado al primer nucleotido 5' de la otra parte mediante un enlace tipo fosfodiester. El polinucleotido que consiste en una fusion de secuencias de nucleotido se obtiene en particular como un polinucleotido recombinante, incluyendo mediante delecion de fragmentos de secuencia en la secuencia codificadora nativa de CyaA.
La protefna derivada de CyaA variante tal como se define en la reivindicacion 2 mantiene su capacidad para unirse a celulas diana y/o para translocar su dominio de adenilato ciclasa (AC) en el citosol de las celulas diana. En una realizacion particular, las celulas diana son celulas que expresan CD11b, es decir celulas que expresan al receptor CD11b/CD18 sobre sus superficies (CD11b+) . En particular, estas celulas son granulocitos/neutrofilos, macrofagos, celulas NK, subconjuntos de T CD8+, subconjuntos de celulas B, celulas dendrfticas tales como las celulas de Langerhans o celulas dendrfticas mieloides.
La capacidad de las protefnas quimericas de la invencion para unirse a las celulas diana se puede analizar en especial de conformidad con los metodos descritos en el documento EP03291486 o en la solicitud WO02/22169. Asimismo, se puede analizar la capacidad de la variante para translocar su dominio N-terminal en el citosol de las celulas diana aplicando el metodo descrito en la solicitud WO02/22169, o el metodo detallado en el ejemplo A con el peptido p105.
Las variantes de la secuencia de tipo silvestre de longitud completa de la protefna de CyaA de Bordetella pertussis son conocidas; la ilustracion de dichas variantes se provee mediante referencia a sus secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 4 (protefna CyaA de Bordetella hinzii),la SEQ ID NO: 6 (protefna CyaA de Bordetela parapertussis) yla SEQ ID NO: 8 (protefna CyaA de Bordetella bronchiseptica). La secuencia de nucleotido, que codifica parala SEQ ID NOs: 4, 6 y 8, es como se indica en la SEQ ID NOs: 3, 5 y 7 respectivamente o es una variante de la SEQ ID Nos: 3, 5 y 7 mediante mutaciones silenciosas. Dentro de la presente invencion, la protefna derivada de CyaA no comprende o no consiste en la SEQ ID NOs: 2, 4, 6 y 8. Asimismo, un polinucleotido que codifica para una protefna derivada de CyaA variante de la invencion no comprende o no consiste en la SEQ ID NOs: 3, 5 o 7.
En una realizacion particular de la invencion, un polinucleotido que codifica para una protefna derivada de CyaA variante, preferentemente como variante de una protefna derivada de CyaA de B. pertussis como se define en la reivindivacion 2, es un polinucleotido que codifica para un polipeptido que consiste en:
a) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 4, 6 u 8, la secuencia de dicho fragmento comienza con el primer resto de la SEQ ID NO: 4, 6 u 8 y termina con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 4, 6 u 8 fusionado a
b) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella como se indica respectivamente en la SEQ ID NO: 4, 6 u 8, la secuencia de dicho fragmento comienza con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 4, 6, u 8 y termina con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 4, 6 u 8.
Las definiciones dadas anteriormente para la protefna derivada de CyaA particular que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 2 se aplican de forma identica a la protefna derivada de CyaA variante que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 4 y 6.
Con respecto a la protefna derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 8, todas las definiciones se aplican en forma identica, excepto que el ultimo resto de la SEQ ID NO: 8 es el resto 1705 en lugar del resto 1706. Por lo tanto, para la protefna derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 8, todos los aspectos que se refieren al resto 1706 deben ser reemplazados por el resto 1705. En particular, el segundo fragmento tiene un tamano que varfa de 1319 a 1385 restos, y preferentemente es de 1319 restos o 1385 restos de longitud. Con respecto a un polinucleotido que codifica para la protefna derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 8, todas las definiciones y realizaciones que se refieren al nucleotido 5118 deben ser remplazados por el nucleotido 5115.
Los polinucleotidos particulares que codifican para las protefnas derivadas de CyaA de la invencion se seleccionan de entre un polinucleotido que comprende o consiste en:
1) un polinucleotido que codifica para el polipeptido como se indica en la SEQ ID NO: 13;la SEQ ID NO: 13 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 4 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 4;
2) un polinucleotido que codifica para el polipeptido en la SEQ ID NO: 14;la SEQ ID NO: 14 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 4 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 4;
3) un polinucleotido que codifica para el polipeptido como se indica en la SEQ ID NO: 15;la SEQ ID NO: 15 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 6 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 6;
4) un polinucleotido que codifica para el polipeptido como se indica en la SEQ ID NO: 16;la SEQ ID NO: 16 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 6 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 6;
5) un polinucleotido que codifica para el polipeptido como se indica en la SEQ ID NO: 17;la SEQ ID NO: 17 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; y
6) un polinucleotido que codifica para el polipeptido como se indica en la SEQ ID NO: 18;la SEQ ID NO: 18 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8.
El polinucleotido que codifica para la protefna derivada de CyaA de la invencion tambien se puede definir como una version, que tiene delecion, de la secuencia de nucleotido que codifica para CyaA de Bordetella de longitud completa, es decir, un polinucleotido que codifica para un polipeptido que consiste en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 hasta el grado en que este tenga delecion para un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido cuyo primer resto de aminoacido esta localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo ultimo resto de aminoacido esta localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. En una realizacion particular, dicho polinucleotido codifica para un polipeptido que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, el cual tiene delecion para un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido cuyo primer resto de aminoacido se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, y 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo ultimo resto de aminoacido se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385 o 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente.
Tambien es parte de la invencion un metodo para producir un polinucleotido que codifica para la protefna derivada de CyaA de la invencion que se describe en la presente solicitud. Este metodo comprende los pasos de (a) eliminar, de un polinucleotido que codifica para CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleotido de restos de nucleotido consecutivos en dichas secuencias, cuyos primeros tres nucleotidos codifican para un resto de aminoacido localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8, y cuyos ultimos tres nucleotidos codifican para un resto de aminoacido localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8; y (b) recuperar dicho polinucleotido.
De manera alternativa, el polinucleotido que codifica para la protefna derivada de CyaA se sintetiza qufmicamente, utilizando metodos convencionales, de conformidad con la secuencia de protefna derivada de CyaA que se busca, y tomando en consideracion opcionalmente la degeneracion del codigo genetico y/o la optimizacion de la expresion.
La invencion tambien esta dirigida a las protefnas derivadas de CyaA codificadas por los polinucleotidos de la invencion, descritos en la presente solicitud. Las protefnas derivadas de CyaA particulares consisten en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20.
Dentro del marco de la invencion, se utiliza un polinucleotido que codifica para una protefna derivada de CyaA, incluyendo una protefna derivada de CyaA variante, para producir un polinucleotido quimerico de la invencion que codifica para una protefna quimerica que consiste en dicha protefna derivada de CyaA o protefna derivada de CyaA variante, y un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, en el cual el polinucleotido codifica para dicho polipeptido heterologo sustituye el fragmento de nucleotido de CyaA eliminado.
Por consiguiente, la invencion se refiere a un polinucleotido quimerico, es decir, un polinucleotido que codifica para una protefna quimerica como se define en la presente solicitud, en la cual se aplican todas y cada una de las realizaciones descritas en la presente solicitud con relacion al polinucleotido que codifica para la protefna derivada de CyaA.
Por lo tanto, la memoria descriptiva desvela un metodo para producir un polinucleotido que codifica para una protefna quimerica, que comprende:
(a) eliminar, de un polinucleotido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8, un fragmento de nucleotido, cuyos primeros tres nucleotidos codifican para un resto de aminoacido localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, cuyos ultimos 3 nucleotidos codifican para un resto de aminoacido localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8;
(b) insertar, en el polinucleotido obtenido en (a) y en el sitio de fragmento de nucleotido eliminado, un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones; en el cual los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultaneamente; y
(c) recuperar dicho polinucleotido que codifica para una protefna quimerica.
La invencion tambien se refiere a un metodo para producir una protefna quimerica, que comprende:
(a) eliminar, a partir de un polinucleotido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleotido, cuyos primeros tres nucleotidos codifican para un resto de aminoacido localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, cuyos ultimos 3 nucleotidos codifican para un resto de aminoacido localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8;
(b) insertar, en el polinucleotido obtenido en (a) y en el sitio del fragmento de nucleotido eliminado, un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo; en el cual los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultaneamente;
(c) expresar, en una celula, el polinucleotido obtenido en (b); y
(d) recuperar dicha protefna quimerica expresada.
El metodo para producir la protefna quimerica de la invencion tambien puede comprender el paso de combinar en una construccion de polinucleotido quimerico el polinucleotido obtenido en el paso (b) y un polinucleotido que codifica para la protefna CyaA. El polinucleotido obtenido en el paso (b) y un polinucleotido que codifica para la protefna CyaA se puede combinar en una construccion en tal forma que despues de dicha combinacion, el polinucleotido quimerico obtenido comprende o contiene, del extremo 5' hacia el extremo 3', la construccion de polinucleotido del paso (b) seguido por una construccion de polinucleotido que codifica para una protefna CyaA de una cepa de Bordetella, en particular de una cepa de Bordetella pertussis.
Dentro de la presente invencion, cuando se hace referencia a los "primeros tres nucleotidos" o a los" ultimos tres nucleotidos", se entiende que estos tres nucleotidos se refieren a un codon que corresponde, de conformidad con el codigo genetico, a un resto de aminoacido identificado por su posicion en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8. Por lo tanto, el tamano de la delecion del nucleotido del polinucleotido es un multiplo de 3. Asimismo, ademas de ser un multiplo de 3 en tamano, la delecion de nucleotido del polinucleotido esta en marco, es decir, la delecion retira los restos de aminoacidos buscados sin modificar el marco de lectura, y sin modificar los restos que rodean (corriente arriba y corriente abajo) la delecion.
El orden de los pasos de delecion y del paso de insercion es indiferente y ambos pasos se pueden efectuar simultaneamente.
El paso de delecion se puede implementar antes del paso de insercion. Por lo tanto, una vez que se ha efectuado la delecion del fragmento, el polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo se inserta en el sitio del fragmento de nucleotido eliminado. Con "en el sitio del fragmento de nucleotido eliminado" se quiere decir que el polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo se inserta entre el lado N-terminal de CyaA (correspondientes al primer fragmento de CyaA) y el lado C-terminal de CyaA (correspondiente al segundo fragmento de CyaA). El sitio de insercion se puede identificar facilmente, debido a que la secuencia tanto del lado N-terminal como del lado C- terminal de CyaA son identicas a la secuencia de la parte N-terminal y parte C-terminal de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o variantes de conformidad con la invencion.
El paso de insercion se puede implementar antes del paso de delecion. Una vez que el fragmento que se va a eliminar ha sido identificado, el polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo se inserta ya sea corriente arriba (en 5' ) de los tres nucleotidos (codon) que codifican para el primer resto del fragmento que se va a eliminar, o corriente abajo (en 3' ) de los ultimos tres nucleotidos (codon) que codifican para el ultimo resto del fragmento que se va a eliminar. Una vez que se ha hecho la insercion del polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo, el fragmento que se va a eliminar se corta del polinucleotido que codifica para la molecula de CyaA/polipeptido heterologo.
Tanto los pasos de delecion como de insercion se pueden llevar a cabo de forma simultanea, es decir, en un solo paso de reaccion, utilizando enzimas de restriccion apropiadas.
En el metodo, el paso de delecion comprende eliminar, de un polinucleotido que codifica para una CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleotido que codifica para los restos 228 a 320 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleotido que codifica para los restos 184 a 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleotido que codifica para los restos 228 a 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleotido que codifica para los restos 184 a 320 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o variantes de conformidad con la invencion.
El paso de delecion puede comprender eliminar, de un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 ola SEQ ID NO: 69, un fragmento de nucleotido que consiste en los nucleotidos 682 a 960 de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 ola SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleotido que consiste en los nucleotidos 550 a 1158 de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 ola SEQ ID NO: 69, o un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 ola SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleotido que consiste en los nucleotidos 682 a 1158 de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 ola SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleotido que consiste en los nucleotidos 550 a 960 de la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 ola SEQ ID NO: 69.
Para efectuar la delecion del fragmento, el experto en la tecnica posiblemente necesite efectuar una delecion mas grande en el polinucleotido que codifica para CyaA y despues compensar cuando clone el polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo para lograr la delecion antes descrita como un resultado final.
De manera alternativa, el polinucleotido quimerico que codifica para la protefna quimerica de la invencion se sintetiza qufmicamente, utilizando metodos convencionales, de conformidad con la secuencia de protefna quimerica buscada, y opcionalmente tomando en consideracion la degeneracion del codigo genetico y/o la optimizacion de la expresion. Por lo tanto, dicho polinucleotido sintetizado qufmicamente se expresa en una celula y la protefna quimerica expresada de este modo se recupera.
La invencion tambien se refiere a un polinucleotido que codifica para una protefna quimerica, dicho polinucleotido consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteina derivada de CyaA, con respecto al fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2, se aplican en forma identica a estos fragmentos en el contexto del polinucleotido que codifica para una protema quimerica.
En una realizacion particular, dicho polinucleotido que codifica para una protema quimerica se selecciona a partir del grupo que consiste en:
1) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
2) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8;
3) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3' , (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
4) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3' , (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8;
5) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
6) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3' , (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8;
7) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3' , (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones, y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6; y
8) un polinucleotido que consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones y (c) un polinucleotido que codifica para un fragmento de polipeptido que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8.
En una realizacion particular de cualquier polinucleotido que codifica para una protema quimerica como se define en la presente solicitud, el polinucleotido de (a) esta fusionado al polinucleotido de (b) el cual por sf mismo esta fusionado al polinucleotido de (c).
Dentro de la presente invencion, el polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo tiene un tamano que es un multiplo de 3, con el fin de mantener el marco de lectura del polinucleotido de (c) (por ejemplo, el marco de lectura del fragmento de la protema CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2 o variante de la misma).
En una realizacion particular de la invencion, el polinucleotido quimerico tambien comprende, en su extremo 3' un polinucleotido que codifica para la protema CyaA de una cepa de Bordetella en particular de una cepa de Bordetella pertussis.
Utilizando el metodo descrito en la presente solicitud se puede obtener o es obtenible un polinucleotido que codifica para una protema quimerica.
La invencion tambien esta dirigida a un vector de acido nucleico, tal como un plasmido, que comprende un polinucleotido como el definido en la presente solicitud, es decir, cualquiera de un polinucleotido que codifica para una protema derivada de CyaA incluyendo una protema derivada de CyaA variante, o un polinucleotido que codifica para una protema quimerica. En una realizacion particular, el vector es un vector de expresion, es decir, un vector que comprende, ademas de los elementos explfcitamente mencionados, todos los elementos necesarios para controlar la expresion del polinucleotido de la invencion (secuencia de control de expresion), y particularmente los elementos reguladores de la transcripcion.
"Elemento regulador de la transcripcion" define cualesquiera regiones de ADN implicadas en la regulacion de la transcripcion del polinucleotido y abarca un promotor, tal como un promotor inducible mediante IPTG, por ejemplo el promotor lac, tac o T7, o un promotor inducible por cambio de temperatura, por ejemplo el promotor pR o pL de fago lambda, elementos incrementadores o reguladores que actuan en cis. Estos elementos, y en particular el promotor, se eligen dependiendo de la naturaleza de las celulas que se van a transfectar con el vector de acido nucleico. La determinacion del promotor apropiado, de conformidad con el nivel de expresion buscado o con la celula transfectada, forma parte del conocimiento del experto en la tecnica. En una realizacion particular, dicho vector es un plasmido. Los ejemplos de plasmidos convencionales apropiados para la preparacion del vector de la invencion son pUC o pBR322.
Dicho vector de acido nucleico puede comprender la secuencia que codifica para CyaC de una cepa de Bordetella, tal como el gen de CyaC de B. pertussis como se indica en la s Eq ID NO: 21. En otra realizacion, dicho vector de acido nucleico tambien comprende una version de la secuencia que codifica para CyaC de una cepa de Bordetella la cual esta optimizada para una mejor expresion en un tipo celular particular, en particular optimizada para una mejor expresion en E. coli. Una version optimizada de la secuencia de CyaC para E. coli es como se indica en la SEQ ID NO: 22.
Los plasmidos particulares que se pueden utilizar para producir una protefna quimerica como se define en la invencion son aquellos descritos en la seccion de materiales y metodos, y cuyas secuencias se indican en la SEQ ID NOs: 59, 62, 65 y 68. El polinucleotido que codifica para el polipeptido heterologo contenido en estos cuatro plasmidos se puede eliminar y remplazar con un polinucleotido que codifique para un polipeptido heterologo como se describe en la presente solicitud. Por lo tanto, partiendo del plasmido de la SEQ ID NO: 59, la secuencia contenida entre los nucleotidos 904 y 1731 se elimina y remplaza con un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plasmido de la SEQ ID NO: 62, la secuencia obtenida entre los nucleotidos 772 y 1599 se retira y es remplazada con un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plasmido de la s Eq ID NO: 65, la secuencia contenida entre los nucleotidos 904 y 1836 se retira y es remplazada con un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plasmido de la SEQ ID NO: 68, la secuencia contenida entre los nucleotidos 772 y 1704 se retira y es remplazada por un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo como se describe en la presente solicitud.
Vale la pena mencionar que, cuando el vector nucleico contiene varios polinucleotidos, el(los) elemento(s) regulador(es) de la transcripcion puede(n) ser unico(s) para todos los polinucleotidos o ser compartido(s) por algunos de ellos o en contraste cada polinucleotido puede estar asociado con uno o mas elementos reguladores de transcripcion particulares. En el ultimo caso, los diversos elementos reguladores de transcripcion pueden ser similares o diferentes.
La invencion tambien esta dirigida a una celula (preferentemente aislada) o a un cultivo celular que comprende un polinucleotido como el definido en la presente solicitud, es decir, cualquiera de un polinucleotido que codifica una protefna quimerica, o que comprende un vector como el definido en la presente solicitud. En una realizacion particular, dicha celula o cultivo celular se transfecta con un vector de la invencion.
Dicha celula puede ser una celula procariota o un cultivo celular hecho a partir de celulas procariotas. En una realizacion particular, dicha celula es apropiada para expresar y/o para producir protefna(s) recombinante(s). En una realizacion particular, dicha celula o cultivo celular es una bacteria o un cultivo bacteriano. En una realizacion preferida, dicha celula o cultivo celular es un cultivo de cepa de E. coli, tal como la cepa BL21, BLR, TG1 o HMS174.
Por lo tanto, la celula o cultivo celular de la invencion expresa el polinucleotido de la invencion, es decir, ya sea un polinucleotido que codifica una protefna quimerica, y cuando sea apropiado, simultaneamente el gen cyaC o una version optimizada del gen cyaC.
El termino "CyaA" o "protefna derivada de CyaA" o "protefna quimerica" abarca, y preferentemente es, una version modificada posterior a la traduccion de la protefna CyaA de Bordetella. Por lo tanto, en una realizacion particular, dicha "protefna derivada de CyaA" o "protefna quimerica" de la invencion es modificada mediante acilacion posterior a la traduccion de al menos uno de sus restos, en particular al menos uno de los dos, preferentemente los dos restos lisina correspondientes a los restos localizados en las posiciones 860 y 983 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. pertussis, B. hinzii o B. parapertussis o correspondientes a los restos localizados en las posiciones 859 y 982 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. bronchiseptica. Con "acilacion", se quiere decir en la presente solicitud modificacion con palmitoilo, es decir, adicion de palmitato y/o grupo(s) palmitoleato en el resto o restos de CyaA, de la protefna derivada de CyaA o de la protefna quimerica de la invencion. Por lo tanto, dicha "protefna derivada de CyaA" o "protefna quimerica" lleva un grupo palmitoilo en algunos de estos restos, preferentemente en uno de los dos, o los dos restos lisina correspondientes a los restos 860 y 983 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B.pertussis, B. hinzii o B. parapertussis o correspondientes a los restos localizados en las posiciones 859 y 982 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. bronchiseptica. Con "correspondiente a", se quiere decir que el resto o restos que esta(n) modificado(s) posterior a la traduccion en la protefna derivada de CyaA o protefna quimerica de la invencion es(son) aquellos cuya posicion coincide con las lisinas 860 y 983 en la secuencia de CyaA de B. pertussis, B. hinzii o B. parapertussis (SEQ ID NO: 2, 4 y 6 respectivamente) o las lisinas 859 y 982 en la secuencia de CyaA de B. bronchiseptica (SEQ ID NO: 8). La identificacion de estos restos lisina en las protefnas de la invencion puede ser efectuada por el experto de la tecnica, alineando y comprando la secuencia de las protefnas de la invencion con la secuencia como se define en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.
El procedimiento de modificacion con palmitoilo es mediado por el gen cyaC de una especie de Bordetella, preferentemente de la secuencia que codifica para CyaC de Bordetella pertussis, cuya secuencia natural se indica en la SEQ ID NO: 21. Una version de la secuencia que codifica para CyaC, optimizada para produccion en E. coli, se indica en la SEQ ID NO: 22. Esta modificacion o modificaciones posteriores a la traduccion se puede(n) obtener mediante co-expresion del polinucleotido que codifica para la protefna CyaA, el polinucleotido que codifica para la protefna derivada de CyaA de la invencion o el polinucleotido que codifica para la protefna quimerica de la invencion, y del gen cyaC.
En una realizacion particular, la construccion de polinucleotido de la invencion que expresa las protefnas CyaC y CyaA comprende del extremo 5' hacia el extremo 3' , el polinucleotido o gen cyaA, que consiste en manera conveniente de una secuencia optimizada para expresion en una celula hospedadora determinada, por ejemplo E. coli y el polinucleotido o gen cyaC, que consiste en manera conveniente de una secuencia optimizada para expresion en una celula hospedadora determinada, por ejemplo E. coli. Este orden de la insercion de los polinucleotidos en la construccion favorece la expresion de las protefnas CyaA y CyaC en cantidades respectivas y conformacion apropiada para incrementar la eficiencia de expresion de la version de CyaA modificada despues de la traduccion.
De acuerdo con la invencion, excepto por la delecion del fragmento [cuyo primer resto de aminoacido esta localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo ultimo resto de aminoacido esta localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente] efectuada en la protefna CyaA de Bordetella de tipo silvestre descrita en la presente solicitud, la protefna derivada de CyaA de la invencion o la parte de CyaA de la protefna quimerica no experimenta ninguna otra variacion (adicion, delecion y/o sustitucion) en comparacion conla SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.
Como un aspecto interesante, la protefna derivada de CyaA asf como la protefna quimerica de la invencion son no citotoxicas es decir, su actividad enzimatica ha sido inactivada despues de la delecion del fragmento cuyo primer resto de aminoacido esta localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo ultimo resto de aminoacido esta localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. Por lo tanto, no se ha efectuado insercion, delecion o sustitucion. En particular, cuando los restos 188 y 189 de CyaA todavfa siguen presentes en las protefnas de la invencion, no se inserta dipeptido (tal como el dipeptido LQ o GS) entre los restos 188 y 189.
La invencion tambien esta dirigida a una protefna quimerica la cual es codificada por un polinucleotido de la invencion, expresada a partir de un vector de la invencion o que se produce mediante un cultivo celular de la invencion.
Una protefna quimerica de la invencion consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando en un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipeptido heterologo tal como se define en las reivindicaciones y (c) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando en el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2.
Por lo tanto, la invencion tambien esta dirigida a una protefna quimerica que comprende o consiste en:
1) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo tal como se define por las reivindicaciones y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
2) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo tal como se define por las reivindicaciones y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
3) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo tal como se define por las reivindicaciones y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6; y
4) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo tal como se define por las reivindicaciones y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8.
En una realizacion particular de las protefnas quimericas como se definen en la presente solicitud, el fragmento de (a) esta fusionado al polipeptido heterologo tal como se define por las reivindicaciones de (b) el cual por sf mismo esta fusionado al fragmento de (c).
Con "quimerico", se quiere decir que la protefna consiste en, como se define en la presente solicitud, de fragmentos que se originan a partir de una CyaA de Bordetella, y un polipeptido el cual no se origina a partir de una CyaA de Bordetella.
En una realizacion particular, el polipeptido heterologo, preferentemente en combinacion con los intervalos de tamano definidos anteriormente, tiene una carga electrostatica negativa, es decir, el polipeptido heterologo es acido. En otra realizacion, un fragmento del polipeptido heterologo tiene una carga electrostatica que es negativa, es decir, este fragmento de dicho polipeptido heterologo es acido. Un fragmento del polipeptido heterologo se define como una concatenacion de restos de aminoacido consecutivos, cuyo tamano es de l0% hasta 40%, preferentemente 15% a 30%, del tamano del polipeptido heterologo completo.
En particular, la carga electrostatica se define como el numero de restos lisina y arginina menos el numero de restos de acido aspartico y acido glutamico contenidos en el polipeptido heterologo. En una realizacion, la carga electrostatica del polipeptido heterologo es igual a -1 o es menos de -1, y en particular es igual o a menor que -2, -3, -4, -5, -10, -15, -20, -30, -40, -45 o -50. En una realizacion particular, preferentemente en combinacion con uno de los valores de la oracion anterior, la carga electrostatica del polipeptido heterologo no es menor de -55, -60, -70 o -80. En otras palabras, la carga electrostatica del polipeptido heterologo esta en el intervalo de -55 a -1, -50 a -2, o -40 a -3. Como comparacion, el epftopo OVA clasico (SIINFEKL) tiene una carga electrostatica de 0.
Los ejemplos de varios polipeptidos heterologos, analizados dentro de las protefnas quimericas de la invencion, se reportan en la presente solicitud:
- peptido 216 (SEQ ID NO: 34), analizado en las protefnas quimericas Btpr_114 y Btpr_116, tiene una carga electrostatica de -16;
- peptido 217 (SEQ ID NO: 36), analizado en las protefnas quimericas Btpr_115 y Btpr_117, tiene una carga electrostatica de -37;
- peptido 233 (SEQ ID NO: 38), analizado en las protefnas quimericas Btpr_143 y Btpr_144, tiene una carga melectrostatica de -13;
- peptido 234 (SEQ ID NO: 40), analizado en las protefnas quimericas Btpr_145 y Btpr_146, tiene una carga melectrostatica de -38;
- peptido 326(SEQ ID NO: 42), analizado en las protefnas quimericas Btpr_161 y Btpr_169, tiene una carga electrostatica de -11;
- peptido 327 (SEQ ID NO: 46), analizado en las protefnas quimericas Btpr_162 y Btpr_170, tiene una carga electrostatica de -10;
- peptido 328 (SEQ ID NO: 50), analizado en las protefnas quimericas Btpr_163 y Btpr_1171, tiene una carga electrostatica de -18;
- peptido 329 (SEQ ID NO: 54), analizado en las protefnas quimericas Btpr_164 y Btpr_172, tiene una carga electrostatica de -19;
- peptido 330 (SEQ ID NO: 44), analizado en las protefnas quimericas Btpr_165 y Btpr_173, tiene una carga electrostatica de -30;
- peptido 331 (SEQ ID NO: 48), analizado en las protefnas quimericas Btpr_166 y Btpr_174, tiene una carga electrostatica de -30;
- peptido 332 (SEQ ID NO: 52), analizado en las protefnas quimericas Btpr_167 y Btpr_175, tiene una carga electrostatica de -45; y
- peptido 333 (SEQ ID NO: 56), analizado en las protefnas quimericas Btpr_168 y Btpr_176, tiene una carga electrostatica de -46.
Dicho polipeptido mheterologo comprende o consiste en al menos 3 antfgenos de HPV, comprendiendo cada antfgeno uno o varios epftopos como se define en la presente solicitud. Dentro de la presente invencion, un antfgeno se define como un polipeptido que es capaz de provocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune de celula T contra uno o varios epftopos contenidos en este polipeptido (polipeptido inmunogenico). Un antfgeno es cualquiera de un polipeptido antigenico de longitud completa de origen celular o viral, un fragmento de este polipeptido antigenico de longitud completa capaz de provocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune de celula T, contra un determinante antigenico contenido en este fragmento, o un polipeptido sintetico, no natural que porta al epftopo o epftopos que consisten en varfas partes del polipeptido antigenico fusionadas entre sf o un polipeptido sintetico, no natural que consiste en una o varias partes de varios polipeptidos antigenicos fusionadas entre sf, con la condicion que el polipeptido sintetico sea capaz de provocar una respuesta de celula inmune T, contra un determinante antigenico contenido en este polipeptido sintetico.
Por lo tanto, dicho polipeptido heterologo lleva, comprende o consiste en al menos un epftopo o epftopos, preferentemente al menos un epftopo o epftopos CD8+ y/o al menos un epftopo o epftopos CD4+. Con la expresion m"al menos" se quiere decir uno o una pluralidad de epftopos. Un epftopo se define en la presente solicitud como cualquier secuencia de aminoacido implicada en la provocacion o induccion de una respuesta inmune mediada por celula, especialmente una respuesta inmune de celula T, y puede ser lineal o conformacional. Por consiguiente, los epftopos descritos en la presente solicitud incluyen aquellos que son procesados por las APC (celulas presentadoras de antfgeno) en un hospedador, especialmente epftopos T reconocidos en asociacion con el MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I, tal como los epftopos cuyas celulas diana son linfocitos T CD8+, o epftopos T reconocidos en asociacion con moleculas del MHC clase II tal como aquellos cuyas celulas diana son linfocitos T CD4+. Los epftopos dentro de la presente invencion preferentemente tienen un tamano que varia de 9 a 17, preferentemente 9 a 12 restos. Los epftopos descritos en la presente solicitud incluyen tambien epftopo(s) B implicado(s) en la respuesta humoral.
Se ha desvelado un polipeptido heterologo que comprende varios antigenos con varios origenes. Este polipeptido heterologo porta antigenos que incluyen epftopos de celula T restringidos por la clase I de MHC (respuesta CD8) y clase II de MHC (respuesta CD4) de humano y de murido: GFP11 ,MOG35-55, OVA257-2 64 , IE191-110, CLA4, HA512-520, OVA323-339, MELAN-A26-35, HA307-319, LCMV GP33-41, MAGEA3m-180, MAGEA3244-285, fragmento de E7 de HPV16 y fragmento de E7 de HPV18. La secuencia de aminoacido de este antigeno es como se indica en la SEQ ID NO: 24, y es parte de la presente invencion.
El polipeptido heterologo de la invencion comprende varios antigenos, estos antigenos estan ya sea fusionados, estan separados por enlazadores peptidicos o al menos dos de dichos antigenos estan fusionados mientras que al menos dos de dichos antigenos estan separados por un enlazador. Dicho enlazador peptidico puede tener un tamano que vana de 2 a 10 restos. Los enlazadores se pueden agregar a antigenos separados y/o para mejorar la respuesta inmune.
El polipeptido heterologo comprende o consiste en al menos tres antigenos, siendo dichos tres antigenos los antigenos E7, que se originan cada uno de un tipo de HPV diferente.. En una realizacion particular, dicho polipeptido heterologo comprende o consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 antigenos que se originan a partir de HPV. En una realizacion preferida, dicho polipeptido heterologo comprende al menos 3 antigenos de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV. En una realizacion particular, dicho antigeno o antigenos de HPV comprenden o consisten en al menos un epitope o epitopes, preferentemente al menos un epftopo o epftopos de CD8+ y/o al menos un epftopo o epftopos de Cd4+.
Por lo tanto, la invencion esta dirigida a una protema quimerica que consiste en, de N- terminal hacia C-terminal:
(a) un fragmento de la protema CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2;
(b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antigenos E7 de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV;
(c) un fragmento de la protema CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteina derivada de CyaA, referentes al fragmento de la protema CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la protema CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO: 2, se aplican en forma identica a estos fragmentos en el contexto del polinucleotido que codifica para una protema quimerica.
En una realizacion particular, la protema quimerica de la invencion consiste en,
1) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antigenos E7 de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 24 o 6;
2) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antigenos E7 de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; 3) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antigenos E7 de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
4) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antigenos E7 de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; 5) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antigenos E7 de HPV, originandose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
6) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; 7) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6; y
8) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8.
La expresion "tipo de HPV" abarca cualquier tipo de HPV especialmente los tipos de HPV que se seleccionan dentro de los generos Alfa-papilomavirus, Beta- papilomavirus, Gama-papilomavirus, Delta-papilomavirus, Epsilonpapilomavirus, Zeta-papilomavirus, Theta- papilomavirus, Iota-papilomavirus, Kappa-papilomavirus, Lambdapapilomavirus, Mu-papilomavirus, Nu-papilomavirus Xi-papilomavirus, Omicron-papilomavirus y Pi-papilomavirus. En una realizacion particular, se prefieren los papilomavirus que tienen un tropismo humano, tal como los tipos del genero Alfa-papilomavirus, Beta-papilomavirus, Gamma- papilomavirus, Mu-papilomavirus o Nu-papilomavirus. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en los antfgenos de los tipos de HPV del genero alfa-papilomavirus, especialmente un tipo de las especies 7 y 9 de HPV del genero alfa-papilomavirus [17]. Por lo tanto, el polipeptido heterologo comprende o consiste en los antfgenos de las especies de tipo altamente oncogenicas de HPV, tales como HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 o HPV58.
En una realizacion particular de una protefna quimerica que comprende antfgeno o antfgenos o epftopo o epftopos de HPV, dicho antfgeno o antfgenos, contenidos en el polipeptido heterologo se selecciona(n) a partir de las protefnas E7 de HPV.
En una realizacion particular, dicho antigeno, contenido en el polipeptido heterologo, es la proteina E7 de un tipo de HPV o dichos antfgenos, contenidos en el polipeptido heterologo, son las protefnas E7 de tipos diferentes de HPV, o cualquier fragmento antigenico de esta protefna E7 (tambien llamado fragmento de E7). En una realizacion preferida, la protefna E7 o fragmento de la misma es del tipo de HPV16 (SEQ ID NO: 25), el tipo de HPV18 (SEQ ID NO: 26), el tipo de HPV31 (SEQ ID NO: 27), el tipo de HPV33 (SEQ ID NO: 28), el tipo de HPV45 (SEQ ID NO: 29), el tipo de HpV52 (SEQ ID No: 30) o el tipo de HPV58 (SEQ iD NO: 32). Para eliminar un epftopo auto-inmune naturalmente humano identificado por los inventores en la protefna E7 del tipo de HPV52 (indicado en la SEQ ID NO: 30), el resto de aminoacido en las posiciones 84 y 86 ha sido sustituido (M->L en la posicion 84 y L->M en la posicion 86); esta secuencia modificada de la protefna E7 de tipo HPV52 es como se indica en la SEQ ID NO: 31.
Con "parte N-terminal de E7" se quiere decir un fragmento cuya secuencia es al menos el primer 25%, el primer 30%, el primer 35%, el primer 40% de la protefna E7 y es cuando mucho el primer 50% de la longitud en restos de aminoacido de la protefna E7 comenzando desde el primer resto de aminoacido N-terminal. Por consiguiente, con "el primer 25%", se quiere decir un polipeptido cuya secuencia comienza en el resto 1 de la protefna E7 y termina en el resto que corresponda al 25% del tamano de la protefna E7 de longitud completa. En una realizacion particular, un fragmento que consiste en la parte N-terminal de la protefna E7 consiste en una secuencia que varfa desde el primer 28% hasta el primer 31% de la protefna E7. En otra realizacion, un fragmento que consiste en la parte N-terminal de la protefna E7 consiste en una secuencia que varfa desde el primer 31% hasta el primer 41% de la protefna E7. Las realizaciones particulares son un fragmento que consisten en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 1 a 28 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 32. Otras realizaciones son un fragmento que consiste en los restos 1 a 34 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 1 a 42 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 1 a 37 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ iD NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 32.
Con "parte C-terminal de E7", se quiere decir un fragmento cuya secuencia es al menos el ultimo 25%, el ultimo 30%, el ultimo 40%, el ultimo 50%, el ultimo 60% de la longitud en restos de aminoacido de la protefna E7 comenzando desde el ultimo resto de aminoacido y es cuando mucho el ultimo 70% o el ultimo 80% de la protefna E7. Con "el ultimo 25%" se quiere decir un polipeptido cuya secuencia termina en el ultimo resto de la protefna E7 y comienza en el resto que corresponde a 25% del tamano de la protefna E7 de longitud completa. En una realizacion particular, un fragmento que consiste en la parte C- terminal de la protefna E7 consiste en una secuencia que varfa desde el ultimo 55% hasta el ultimo 61% de la protefna E7. En otra realizacion, un fragmento que consiste en la parte C-terminal de la protefna E7 consiste en una secuencia que varfa desde el ultimo 60% hasta el ultimo 70% de la protefna E7. Las realizaciones particulares son un fragmento que consiste en los restos 43 a 98 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 42 a 98 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 43 a 97 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 44 a 106 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 45 a 99 de la SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 44 a 98 de la SEQ ID NO: 32. Otras realizaciones son un fragmento que consiste en los restos 35 a 98 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 33 a 98 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 32 a 97 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 38 a 106 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 32 a 99 de la SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 32 a 98 de la SEQ ID NO: 32.
En una realizacion particular, dicho polipeptido heterologo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 del mismo tipo de HPV. En una realizacion particular, cuando dicho polipeptido heterologo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal de la protefna E7 del mismo tipo de HPV (no fusionado), la suma del tamano de la parte N-terminal y del tamano de la parte C-terminal no excede el tamano de la protefna E7 de longitud completa.
En otra realizacion, dicho polipeptido heterologo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV y, opcionalmente, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV. Estos fragmentos N-terminales y C-terminales se pueden agrupar respectivamente en los polipeptidos. Asimismo, estos se pueden invertir con respecto a su posicion en la protefna E7 nativa, estando los fragmentos C-terminales localizados corriente arriba del extremo N-terminal. Por lo tanto, una protefna quimerica de la invencion comprende un polipeptido heterologo que comprende o consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (i) la parte C-terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, y (ii) la parte N- terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
El termino "opcionalmente" en la definicion anterior se refiere a la presencia de la cuarta valencia de HPV. Por consiguiente, la protefna quimerica comprende tanto la parte C-terminal como la parte N-terminal de las protefnas E7 de un primer, un segundo y un tercer HPV como se definieron anteriormente, y opcionalmente la parte C- terminal y la parte N-terminal de una cuarta protefna E7 de un HPV diferente.
En una realizacion particular, los fragmentos de E7 diferentes estan ya sea fusionados o estan separados por enlazadores peptfdicos o al menos dos de los fragmentos de E7 estan fusionados mientras que al menos dos de los fragmentos de E7 estan separados por un enlazador peptfdico. En una realizacion particular, dicho enlazador peptfdico tiene un tamano que varfa de 2 a 10 restos. En una realizacion particular, dicho enlazador es el dipeptido AS. Los enlazadores se pueden agregar para separar cada fragmento o algunos fragmentos, y/o para mejorar la respuesta inmune. En una realizacion particular, se agrega un dipeptido AS inmediatamente corriente arriba hacia la parte C-terminal de un fragmento de E7 de HPV. En una realizacion particular, un dipeptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal de un fragmento de E7 de tipo de HPV18, y en particular solo corriente arriba de este fragmento.
Una protefna quimerica particular de la invencion consiste en un polipeptido heterologo que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C- terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV.
Otra protefna quimerica particular de la invencion consiste en un polipeptido heterologo que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
En la realizacion particular de una protefna quimerica descrita en la presente solicitud, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HVP18 y HPV45. En una realizacion particular, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HVP18 y HPV45, y un dipeptido AS esta agregado inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal del fragmento de E7 de tipo HPV18. En otra realizacion, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV52 y HPV58. En otra realizacion, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HVP33 y HPV52. En otra realizacion, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58. En otra realizacion, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45. En otra realizacion, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58. En otra realizacion, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18 HPV33 y HPV45 y un dipeptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal de el fragmento de E7 de tipo hPv18. En otra realizacion, dichos primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58, y un dipeptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal del fragmento de E7 de tipo de HPV18.
La memoria descriptiva desvela la parte N-terminal de la protefna E7 de un tipo de HPV consiste en una secuencia que varfa desde el primer 28% hasta el primer 31% de la protefna E7 y la parte C-terminal de la protefna E7 de dicho mismo tipo de HPV consiste en una secuencia que varfa desde el ultimo 55% hasta el ultimo 61% de la protefna E7. Los ejemplos de pares de parte N- terminal/parte C-terminal de la protefna E7 del mismo tipo de HPV, cualquiera que sea su acomodo dentro de dicho polipeptido heterologo, y en particular de conformidad con el acomodo descrito en la presente solicitud son los siguientes:
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 25 / restos 43 a 98 de la SEQ ID NO: 25;
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 26 / restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26;
- restos 1 a 28 de la SEQ ID NO: 27 / restos 42 a 98 de la SEQ ID NO: 27;
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 28 / restos 43 a 97 de la SEQ ID NO: 28;
- restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 29 / restos 44 a 106 de la SEQ ID NO: 29;
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 31 / restos 45 a 99 de la SEQ ID NO: 31;
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 32 / restos 44 a 98 de la SEQ ID NO: 32;
La memoria descriptiva desvela la parte N-terminal de la protefna E7 de un tipo de HPV consiste en una secuencia que varfa desde el primer 31% hasta el primer 41% de la protefna E7 y la parte C-terminal de la protefna E7 consiste en una secuencia que varfa desde el ultimo 60% hasta el ultimo 70% de la protefna E7. En una realizacion particular, la suma del tamano de la parte N-terminal de la protefna E7 y el tamano de la parte C-terminal es cuando mucho 100% del tamano de la protefna E7. En tal caso, la protefna E7 (en dos fragmentos), puede estar contenida en el polipeptido heterologo. Los ejemplos de pares de parte N-terminal/parte C-terminal de la protefna E7 del mismo tipo de HPV, cualquiera que sea su acomodo de dicho polipeptido heterologo, y en particular de conformidad con el acomodo descrito en la presente solicitud, son los siguientes:
- restos 1 a 34 de la SEQ ID NO: 25 / restos 35 a 98 de la SEQ ID NO: 25;
- restos 1 a 42 de la SEQ ID NO: 26 / restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26;
- restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 27 / restos 33 a 98 de la SEQ ID NO: 27;
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 28 / restos 32 a 97 de la SEQ ID NO: 28;
- restos 1 a 37 de la SEQ ID NO: 29 / restos 38 a 106 de la SEQ ID NO: 29;
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 31 / restos 32 a 99 de la SEQ ID NO: 31; y
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 32 / restos 32 a 98 de la SEQ ID NO: 32;
En una realizacion particular de una protefna quimerica, cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18 y HPV45, el polipeptido heterologo consiste ya sea de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 34 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 33) o la secuencia indicada como se indica en la SEQ ID NO: 36 (codificada por un nucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 35).
En una realizacion particular de una protefna quimerica, cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV52 y HPV58, el polipeptido heterologo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 41) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 44 (codificada por un nucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 43).
En una realizacion particular de una protefna quimerica cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33 y HPV52, el polipeptido heterologo consiste ya sea de la secuencia que se indica en la SEQ ID NO: 46 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 45) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 48 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 47).
En una realizacion particular de una protefna quimerica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58, el polipeptido heterologo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 38 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 37) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 40 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 39).
En una realizacion particular de una protefna quimerica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45, el polipeptido heterologo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 50 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 49) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 52 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 51).
En una realizacion particular de una protefna quimerica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58, el polipeptido heterologo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 54 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 53) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 56 (codificada por un polinucleotido como se indica en la SEQ ID NO: 55).
La memoria descriptiva desvela un polipeptido, que comprende o que consiste en, de N-terminal hacia C- terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N- terminal de la protefna E7 de dicho cuarto tipo de HPV. Las definiciones provistas en la presente solicitud para un polipeptido heterologo contenido en una protefna quimerica de la invencion se aplican en forma identica al polipeptido como tal, en particular con respecto a las definiciones de la parte N-terminal de la protefna E7 de un tipo de HPV, de la parte C-terminal de la protefna E7 de un tipo de HPV, la presencia opcional de un enlazador, en particular el dipeptido AS, la naturaleza de los tipos de HPV, los fragmentos particulares de las protefnas E7 de la SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 31 y 32. Las definiciones provistas en la presente solicitud para una composicion que comprende protefna o protefnas quimericas de la invencion se aplican de forma identica a los polipeptidos como tal, en particular con respecto a combinaciones generales o especfficas de dicho primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV y, cuando sea aplicable, de dicho septimo tipo de HPV.
En una realizacion particular, dicho polipeptido consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 o 56. La invencion tambien esta dirigida a los polinucleotidos que codifican para estos polipeptidos, en particular los polinucleotidos como se indican en la SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 y 55, asf como un vector que comprende dichos polinucleotidos y una celula o cultivo celular que comprende estos polinucleotidos o un vector que comprende dichos polinucleotidos; todos como se definieron en la presente solicitud.
A pesar de su tamano (mas de 200 restos), su complejidad (presencia de varios restos cistefna) y su carga electrostatica negativa, se ha demostrado de manera sorpresiva que dicho polipeptido es translocado en forma eficiente en el citosol de celulas presentadoras de antfgeno, lo que permite obtener respuestas inmunes de celula T fuertes y grandes.
En una realizacion particular, la invencion esta dirigida a una protefna quimerica que consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58 o en la SEQ ID NO: 61. Estas protefnas quimericas son codificadas respectivamente por un polinucleotido cuya secuencia es como se indica en la SEQ ID NO: 57 o en la SEQ ID NO: 60. En una realizacion particular, la protefna quimerica de la SEQ ID NO: 58 ola SEQ ID NO: 61 se expresa a partir de los plasmidos cuya secuencia esla SEQ ID NO: 59 ola SEQ ID NO: 62 respectivamente.
En una realizacion particular, la invencion tambien esta dirigida a una protefna quimerica de la invencion que consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 64 o en la SEQ ID NO: 67. Estas protefnas quimericas son codificadas respectivamente por un polinucleotido cuya secuencia es como se indica en la SEQ ID NO: 63 o en la SEQ ID NO: 66. En una realizacion particular, la protefna quimerica de la SEQ ID NO: 64 ola SEQ ID NO: 67 son expresadas a partir de plasmidos cuyas secuencias sonla SEQ ID NO: 65 yla SEQ ID NO: 68 respectivamente.
Por lo tanto, se puede expresar cualquier protefna quimerica de la invencion que comprende un polipeptido heterologo que comprende o consiste en al menos tres antfgenos E7 de HPV, como se describe en la presente solicitud, utilizando los plasmidos de la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 62,la SEQ ID NO: 65 yla SEQ ID NO: 68, como vectores de expresion. En este orden, el polinucleotido contenido entre los nucleotidos 904 y 1731 de la SEQ ID NO: 59 es eliminado, y remplazado por un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo de la invencion, lo que permite que se exprese una protefna quimerica de la invencion que comprende este polipeptido heterologo. De manera similar, el polinucleotido contenido entre los nucleotidos 772 y 1599 de la SEQ ID NO: 62 es eliminado, y remplazado por un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo de la invencion, lo que permite expresar una protefna quimerica de la invencion que comprende este polipeptido heterologo. De manera similar, el polinucleotido contenido entre los nucleotidos 904 y 1836 de la SEQ ID NO: 65 es eliminado, y remplazado con un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo de la invencion, lo que permite expresar una protefna quimerica de la invencion que comprende este polipeptido heterologo. De manera similar, el polinucleotido contenido entre los nucleotidos 772 y 1704 de la SEQ ID NO: 68 es eliminado, y remplazado por un polinucleotido que codifica para un polipeptido heterologo de la invencion, que permite expresar una protefna quimerica de la invencion que comprende este polipeptido heterologo.
La invencion tambien esta dirigida a una composicion que comprende al menos una, preferentemente una o dos, protefna(s) quimerica(s) de la invencion, en particular al menos dos, preferentemente dos protefnas quimericas diferentes de la invencion.
En una realizacion particular, cuando la composicion comprende mas de una protefna quimerica diferente, preferentemente dos protefnas quimericas diferentes, las secuencias de las porciones de CyaA (o fragmentos) de dichas protefnas quimericas son las mismas o son diferentes, mientras que las secuencias de los polipeptidos heterologos son diferentes. En una realizacion particular, las diferentes protefnas quimericas, preferentemente dos protefnas quimericas diferentes se seleccionan a partir de las protefnas quimericas diferentes como se describe en la presente solicitud. En una realizacion particular, las dos protefnas quimericas diferentes son cualquiera de:
1 ) 2 protefnas quimericas que consisten en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo de HPV diferente; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, con la condicion que los polipeptidos heterologos de estas dos protefnas quimericas difieran en sus secuencias y en los tipos de HPV; o
2) 2 protefnas quimericas que consisten en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo de HPV diferente; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, con la condicion que los polipeptidos heterologos de estas dos protefnas quimericas difieran en sus secuencias y en los tipos de HPV.
Las secuencias de las porciones de CyaA (o fragmentos) de dichas protefnas quimericas diferentes, preferentemente 2 protefnas quimericas diferentes pueden ser diferentes y la secuencia del polipeptido heterologo puede ser diferente. Las diferentes protefnas quimericas, preferentemente 2 tipos diferentes de protefnas quimericas se pueden seleccionar a partir de las protefnas quimericas diferentes como se describen en la presente solicitud. En una realizacion particular, al menos una, preferentemente una, de las protefnas quimericas diferentes, preferentemente 2 protefnas quimericas diferentes consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos de HPV, originandose cada antfgeno E7 de HPV a partir de un tipo de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, y al menos una, preferentemente una, de las protefnas quimericas diferentes, preferentemente 2 protefnas quimericas, diferentes, comprende o consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV, en el cual dicho polipeptido heterologo difiere en su secuencia y tipos de HPV del polipeptido heterologo de la otra al menos una protefna quimerica; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
En una composicion que comprende mas de una protefna quimerica, diferente, preferentemente 2 tipos diferentes de protefnas quimericas, los polipeptidos heterologos son como se definen en las reivindicaciones. En una realizacion particular, cada polipeptido heterologo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV y, opcionalmente, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, en el cual cada polipeptido heterologo tiene una secuencia que es diferente del otro u otros polipeptidos heterologos.
En una realizacion particular, la composicion comprende 2 tipos de protefnas quimericas, el polipeptido heterologo del primer tipo de protefna quimerica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la
presente solicitud de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, y el polipeptido heterologo del segundo tipo de protefna quimerica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un quinto tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un sexto tipo de HPV, en la cual el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, y sexto tipos de HPV son tipos de HPV diferentes.
En una realizacion particular, el primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV (a) se eligen de entre HPV16, HPV18, HPV45, HPV31, HPV52, y HPV58 o (b) se eligen de entre HPV16, HPV18 y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52.
En una realizacion particular, el primer, segundo y tercer tipos de HPV son HPV16, HPV18 y HPV45. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36. En una realizacion particular, dicha protefna quimerica consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67. A estas realizaciones particulares, se puede asociar un cuarto subtipo de HPV, el cual se elige entre HPV33 o HPV58.
En una realizacion particular, independientemente o en combinacion con la realizacion referente al primer, segundo y tercer tipos de HPV, el cuarto y quinto sexto tipos de HPV son HPV31, HPV52 y HPV58. En una realizacion particular el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42 o 44.
En una realizacion particular, independientemente o en combinacion con la realizacion referente al primer, segundo y tercer tipos de HPV, el cuarto, quinto y sexto tipos de HPV son HPV31, HPV33 y HPV52. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 46 o 48. En una realizacion particular, dicha protefna quimerica consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67, en los cuales la secuencia como se indica en la SEQ ID No: 34 o 36 ha sido remplazada con la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42, 44, 46 o 48.
La invencion se refiere en una realizacion particular, a la combinacion de los antfgenos antes recitados de los subtipos de HPV especificados, cuando estos antfgenos son provistos en las protefnas quimericas en un orden correspondiente al orden o cita especificada anteriormente de los subtipos de HPV o de manera alternativa en cualquier otro orden de presentacion de los antfgenos en las protefnas quimericas que pudiera corresponder a cualquier combinacion del primero, segundo, tercero, y opcionalmente cuarto HPV entre aquellos citados y en particular entre los grupos de HPV16, HPV18 y HPV45 o HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33 y HPV52.
En una realizacion particular, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV son (a) HPV16, HPV18, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 respectivamente o (b) HPV16, HPV18, y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52 respectivamente.
En una realizacion particular, las dos protefnas quimericas diferentes comprenden los antfgenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45 para la primera protefna quimerica y de los HPV31, HPV52, HPV58 para la segunda protefna quimerica. En otra realizacion particular, las dos protefnas quimericas diferentes comprenden los antfgenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45 para la primera protefna quimerica y de los HPV31, HPV33, HPV52 para la segunda protefna quimerica. En una realizacion preferida, pero no necesariamente, los antfgenos de HPV asf definidos se insertan en las protefnas quimericas en el orden especificado.
En una realizacion particular, la composicion comprende 2 tipos diferentes de protefnas quimericas, el polipeptido heterologo del primer tipo de protefna quimerica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV y un fragmento N-terminal, un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, y el polipeptido heterologo del segundo tipo de protefna quimerica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la protefna E7 de un quinto tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de E7 de un sexto tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la siguiente solicitud de la protefna E7 de un septimo tipo de HPV, en los cuales, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, y septimo tipos de HPV son tipos de HPV diferentes.
En una realizacion particular, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y septimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste en (a) HPV31, HPV33, HPV52, HPV58, HPV16, HPV18 y HPV45, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52, (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52 y (f) HPV16, HPV18, HPV45, HPV33, HPV31, HPV52 y HPV58.
En una realizacion particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV16, HPV18 HPV33 y HPV45. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 50 o 52. En una realizacion particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo que comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 54 o 56. En una realizacion particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV31, HPV33, HPV52, y HPV58 . En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 40 o 42. En una realizacion particular, dicha primera protefna quimerica consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67, en la cual la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36 ha sido remplazada por la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 40, 42, 50, 52, 54 o 56.
En una realizacion particular, independientemente o en combinacion con la realizacion que se refiere a los HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58 como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y septimo tipos de HPV son respectivamente HPV16, HPV18 y HPV45. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36. En una realizacion particular, dicha segunda protefna quimerica consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67.
En una realizacion particular, independientemente o en combinacion con la realizacion que se refiere a los HPV16, HPV18, HPV33, y HPV45 o el HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 respectivamente, como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y septimo tipos de HPV son respectivamente HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33, HPV52. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42 o 44. En una realizacion particular, independientemente o en combinacion con la realizacion que se refiere a los HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45 o el HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 respectivamente, como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y septimo tipos de HPV son respectivamente HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33 y HPV52. En una realizacion particular, el polipeptido heterologo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 46 o 48. En una realizacion particular, dicha segunda protefna quimerica consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67, en la cual la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36 ha sido remplazada por la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42, 44, 46 o 48.
En una realizacion particular, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y septimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste en (a) HPV31, HPV33, HPV52, HPV58, HPV16 HPV18 y HPV45 respectivamente, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 respectivamente, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33 respectivamente, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52 respectivamente y (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52 respectivamente.
La invencion se refiere en una realizacion particular, a la combinacion de los antfgenos antes recitados de los subtipos de HPV especificados, cuando estos antfgenos estan provistos en las protefnas quimericas en un orden correspondiente al orden o cita antes especificado de los subtipos de HPV o de manera alternativa en cualquier otro orden de presentacion de los antfgenos en las protefnas quimericas que pudiera corresponder a cualquier combinacion del primero, segundo, tercero y cuando este presente el cuarto HPV entre aquellos citados y en particular entre los grupos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45 o el grupo de HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 o el grupo de HPV31, HPV52 y HPV58 o el grupo de HPV31, HPV33 y HPV52.
En una realizacion particular, las dos protefnas quimericas diferentes comprenden los antfgenos como los descritos en la presente invencion de los HPV16, HPV18, HPV45, HPV58 para la primera protefna quimerica y de los HPV31, HPV33, HPV52 para la segunda protefna quimerica. En otra realizacion particular, las dos protefnas quimericas diferentes comprenden los antfgenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45, HPV33 para la primera protefna quimerica y de los HPV31, HPV52, HPV58 para la segunda protefna quimerica. En otra realizacion particular las dos protefnas quimericas diferentes comprenden los antfgenos como los descritos en la presente invencion de los HPV31, HPV33, HPV52, HPV58 para la primera protefna quimerica y de los HPV16, HPV18, HPV45 para la segunda protefna quimerica. En una realizacion preferida, pero no necesariamente, los antfgenos de HPV definidos de esta manera se insertan en las protefnas quimericas en el orden especificado.
La composicion tambien puede comprender un vehfculo farmaceutico apropiado, el cual se selecciona por ejemplo a partir de agentes amortiguadores, solucion salina, solucion salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, agua, etanol y similares y combinaciones de los mismos.
En una realizacion particular, la composicion, con o sin vehfculo farmaceutico apropiado, tambien comprende al menos un coadyuvante, preferentemente un coadyuvante, y/o un agente tensoactivo y/o sustancias inmunomoduladoras (tal como citocinas o quimiocinas) y/o factores de crecimiento tal como GM-CSF. En la tecnica se conocen diversos coadyuvantes e incluyen coadyuvante completo de Freund (CFA), coadyuvante incompleto de Freund (IFA), ISA de montanuro (coadyuvante sepico incompleto), peptidos de muramilo tales como dipeptido de muramilo (MDP) MDP-Lys (L18) (Na-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil- Neesteoroil-L-lisina), sulfato de zinc, hidroxido de hierro coloidal, fosfato de calcio o cloruro de calcio, oligodesoxinucleotidos de CpG (CPG ODN) tales como CPG ODN 1826 y CPG ODN 2007, MF59 el cual es una emulsion aceite en agua estabilizada con detergente que contiene 5% de escualeno (p/v), 0.5% de Tween® 80 (p/v) y 0.5% de Span (p/v) en agua, ligandos de TLR4 (tales como MPL, GLA) ligandos de TLR3 (tales como Poli-IC, Poli-ICLC llamado Hiltonol®), polisacaridos (tal como Inulina) y liposomas (tal como los liposomas cationicos, ISCOMs).
Al menos un coadyuvante se puede elegir entre moleculas que tienen la capacidad de activar la respuesta inmune de celula T. Los coadyuvantes preferidos son aquellos que ligan o son agonistas para TLR (receptor tipo Toll) 3, 4, 7, 8 y/o 9 en celulas del sistema inmune (tales como APC). En una realizacion particular, el coadyuvante es un ligando de TLR, en particular un ligando de TLR que se selecciona a partir del grupo que consiste en ligandos de TLR de la clase 3, tal como poli-ICLC, ligandos de TLR de la clase 4, tal como MPL, ligandos de TLR de la clase 9, tal como CpG, y ligandos de TLR de las clases 7/8, tal como Imiquimod. Los ejemplos de coadyuvantes son Imiquimod y Poli-ICLC. Un farmaco comercialmente disponible basado en Imiquimod es Aldara™ (vendido como una crema que contiene 5% de Imiquimod) Poli-ICLC se puede adquirir de Oncovir Inc, (WA, EE.UU.) como Hiltonol®.
La protefna o protefnas quimericas o composiciones definidas en la presente solicitud se pueden inyectar en un paciente a traves de vfas diferentes: inyeccion subcutanea (s.c), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.), o intravenosa (i.v.), administracion por via oral y administracion a las mucosas, especialmente administracion o inhalacion intranasal. En una realizacion particular, la protefna o protefnas quimericas o composiciones definidas en la presente solicitud se administra(n) por via intradermica.
Asimismo, la protefna o protefnas quimericas o la composicion como se definen en la presente solicitud se pueden combinar o mezclar con al menos un inmuno- potenciador, tal como al menos un coadyuvante, preferentemente un coadyuvante, y/o un agente tensoactivo y/o sustancias inmunomoduladoras. Con "combinar", se quiere decir que la protefna o protefnas quimericas o la composicion como se define en la presente solicitud y el inmunopotenciador se ponen ambos en contacto con el hospedador, al mismo tiempo o en tiempos diferentes y/o mediante el mismo modo o modos diferentes de administracion, preferentemente en el mismo sitio de contacto. En contraste, "mezclar" significa que la protefna o protefnas quimericas o la composicion como se define en la presente solicitud y el inmunopotenciador estan en la misma formulacion cuando se administran.
La protefna o protefnas quimericas o composiciones definas en la presente solicitud pueden estar en forma solida (capsula, polvo, tableta, pfldora, supositorio, tableta de liberacion rapida, tableta gastro- resistente, tableta de liberacion retardada), una forma en polvo, preferentemente despues de liofilizacion (forma liofilizada o en forma de polvo liofilizado) la cual necesita ser reconstituida por ejemplo con diluyente o diluyentes antes de la inyeccion, o en una forma lfquida, tal como una solucion inyectable o suspension inyectable.
La cantidad de proteina o protefnas quimericas que se va administrar (dosis) depende del individuo a ser tratado, incluyendo considerar la condicion del paciente, el estado del sistema inmune del individuo, la via de administracion y el peso del hospedador. Las dosis convencionales vanan de 1 a 2400 pg, 100 a 2000 pg, 200 a 1000 pg, 500 a 1000 pg. Una dosis particular se selecciona a partir del grupo que consiste en 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 o 2400 pg ± 10%. En otra realizacion, las dosis convencionales vanan de 1 a 100 pg, 1 a 50 pg y 1 a 10 pg de polipeptido o polipeptidos portados por el vector. La dosis total para el tratamiento completo con el ingrediente activo de la invencion varfa desde 200 hasta 2400 pg, 300 a 2000 pg, 400 a 1000 pg, 500 a 800 pg. Estos ejemplos pueden ser modificados por un experto en la tecnica, dependiendo de las circunstancias.
La invencion tambien esta dirigida a una protefna quimerica de la invencion o una composicion de la invencion, para uso como un medicamento. En una realizacion particular, la protefna quimerica de la invencion o la composicion de la invencion es para uso en la profilaxis o tratamiento de una infeccion por HPV. En una realizacion particular, la protefna quimerica de la invencion o la composicion de la invencion es para uso en la induccion de una respuesta inmune profilactica o de una respuesta inmune terapeutica.
La invencion se refiere a un metodo para el tratamiento terapeutico de un animal o un paciente humano que se presenta con una infeccion con un patogeno o que se sospecha tiene una infeccion por patogenos que comprende (a) la administracion de una protefna quimerica o una composicion de la invencion en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas multiples, y (b) el seguimiento de la condicion de dicho animal o paciente humano.
La invencion se refiere a un metodo para el tratamiento terapeutico de un animal o un paciente humano que se presenta con trastornos de tumor que comprende (a) la administracion de una protefna quimerica o una composicion de la invencion en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas multiples, y (b) el seguimiento de la condicion de dicho animal o paciente humano.
La invencion se refiere a un metodo para prevenir una infeccion por patogeno de un animal o un paciente humano que comprende (a) la administracion de una protefna quimerica o una composicion de la invencion en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas multiples y (b) el seguimiento de la condicion de dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas multiples.
La invencion se refiere a un metodo para prevenir la aparicion o desarrollo de trastornos de tumor en un animal o un paciente humano que comprende (a) la administracion de una protefna quimerica o una composicion de la invencion en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas multiples, y (b) el seguimiento de la condicion de dicho animal o paciente humano.
Un tratamiento terapeutico esta dirigido a mejorar la condicion clfnica de un animal o paciente humano en necesidad de lo mismo, que ha sido diagnosticado como infectado o se sospecha que esta infectado por un patogeno o que padece de un estado patologico. En una realizacion particular, este tratamiento esta dirigido a la eliminacion del agente u organismo causante de la enfermedad, o a disminuir la abundancia de dicho agente u organismo. En una situacion de infeccion viral, el tratamiento puede dar como resultado un decremento significativo de la carga viral en los tejidos elegidos como blanco del hospedador que sea menor de lo que se pueda detectar cuando se midio. En caso de trastornos tumorales, el tratamiento puede dar como resultado una disminucion del tamano o del desarrollo del tumor o tumores, o la erradicacion de las celulas de tumor, o la reduccion del numero de celulas de tumor a un nivel que sea menor que lo que se puede detectar cuando se midio. El tratamiento terapeutico tambien esta dirigido a mejorar la condicion clfnica del animal o paciente humano, eliminando o disminuyendo los sfntomas asociados con la infeccion por patogeno o los trastornos de tumor, y preferentemente esta dirigido a restaurar la salud.
Un tratamiento profilactico de un animal o un paciente humano esta dirigido a prevenir la infeccion por patogeno de dicho animal o un paciente humano, o prevenir la aparicion o desarrollo de trastornos tumorales neoplasicos, o prevenir la ocurrencia de un estado patologico en dicho animal o paciente humano. El tratamiento profilactico abarca vacunacion.
Los tratamientos terapeuticos y profilacticos, utilizando una protefna quimerica o una composicion de la invencion, se basan en la provocacion de una respuesta inmune eficiente, preferentemente una respuesta inmune celular, contra el epftopo o epftopos contenidos en el polipeptido heterologo en el hospedador.
Por lo tanto, la invencion tambien esta dirigida al uso de una protefna quimerica o una composicion de la invencion para inducir o provocar una respuesta inmune, preferentemente una respuesta inmune celular (tal como una respuesta de CTL) contra el epftopo o epftopos contenidos en el polipeptido heterologo, en el hospedador al cual se administra dicha protefna quimerica o composicion.
La divulgacion se refiere a una protefna quimerica o composicion de la invencion para uso (i) en el tratamiento inmunoterapeutico de la(s) primera(s) condicion o condiciones patologica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamffero provocando una respuesta inmune de celula T contra un primer grupo de epftopos contenidos en el polipeptido heterologo y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) condicion o condiciones patologica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamffero provocando una respuesta inmune de memoria de celula T contra un segundo grupo de epftopos de contenidos en dicho polipeptido heterologo, dichas respuestas inmunes se obtienen despues de la administracion de dicha protefna quimerica o dicha composicion en dicho hospedador, en la cual dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) condicion o condiciones patologica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epftopos no esta contenido en dicho polipeptido heterologo.
En efecto, los inventores han demostrado que la protefna quimerica de la invencion permite evitar la competencia que existe entre epftopos diferentes, ya sea con respecto al acceso a la APC, procesamiento y presentacion por parte de la APC y disponibilidad de citocinas. Por lo tanto, utilizando la protefna quimerica de la invencion es posible inducir una respuesta inmune contra el primer grupo de epftopos dentro de un tratamiento terapeutico e inducir tambien una respuesta inmune inducida contra el segundo grupo de epftopos dentro de un tratamiento profilactico. Por lo tanto, la protefna quimerica de la invencion es eficiente para provocar una respuesta inmune de celula T dentro de un tratamiento inmunoterapeutico de la(s) primera(s) condicion o condiciones patologica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador y de provocar una respuesta inmune de memoria de celula T dentro de la profilaxis contra el riesgo de la(s) segunda(s) condicion o condiciones patologica(s) determinada(s) en el mismo hospedador.
Ejemplos
I. Materiales y metodo
Ratones
Se adquieren ratones de genero femenino (H-2) C57BL/6 de seis semanas de edad de Janvier Laboratories. Los ratones se alojan bajo condiciones libres de patogenos con agua y comida ad libitum. Los procedimientos que implican animales y su cuidado se ajustan a las pautas de Genticel que cumplen con las leyes y polfticas nacionales e internacionales y que son revisadas por el comite de etica local.
Para algunos de los tipos de HPV utilizados en la presente invencion, tambien se pueden utilizar de manera conveniente otros ratones, los cuales tienen un fondo genetico diferente. Dichos ratones se pueden adquirir de Janvier laboratorios e incluyen DBA/2JRi (H2Kd/H2Dd), o CBA/JRi (H2Kk/H2Dk) SJL/JRi (H2Ks/H2Ds) y FVB/NRi (H2Kq/H2Dq).
Otros ratones tales como los ratones humanizados que tienen un HLA en particular un haplotipo HLA-A2 tambien son de interes para determinar la respuesta inmune provocada por las construcciones de la invencion. Los ratones transgenicos HLA-A2.1 se pueden comprar de TACONIC (E.U.A.) para probar la inmunogenicidad de los candidatos de vacuna descritos contra cada E7 proveniente de los tipos de HPV seleccionados en ratones que expresan el haplotipo HLA-A2.1.
Estos ratones se utilizan para analizar la inmunogenicidad de las vacunas candidatas descritas contra cada E7 proveniente de los tipos de HPV seleccionados.
Lfneas de celulas de tumor
Se preparan celulas de tumor TC-1 (cultivo de tejido numero uno) [19] mediante transformacion de celulas de pulmon de raton primarias C57BL/6 con los oncogenes E6 y E7 de HPV16 y el oncogen c-Ha-Ras activado de humano. Las celulas utilizadas en este estudio se obtienen del ATCC. Las celulas TC1 se descongelan antes de cada experimento y despues se cultivan y expanden in vitro durante al menos 10 dfas antes de la inyeccion.
El carcinoma de pulmon de Lewis (LL2) es una linea celular establecida a partir del pulmon de un raton C57BL/6 que porta un tumor que resulta de una implantacion de carcinoma de pulmon de Lewis primario (13). Esta linea es ampliamente utilizada como un modelo para metastasis y es util para estudiar los mecanismos de terapia para cancer (14). La linea de celula de tumor LL2 se adquiere del ATCC (CRL-1642).
Estas celulas se transducen con vectores lentivirales que portan los genes de E7 de HPV18 y GFP o solamente el gen de GFP de conformidad con el protocolo del fabricante (Vectalys, Labege, Francia). Se seleccionan 3 clones tomando como base la expresion de MHC clase I, GFP, y E7. Se selecciona un clon despues de seleccion profilactica in vivo de conformidad con su perfil de crecimiento y su capacidad para ser elegida como blanco por parte de linfocitos CD8+ T citotoxicos especfficos de E7 de HPV18; se efectua un experimento de velocidad de toma para el numero optimo de inoculacion de celulas. Los estudios de seleccion in vivo, velocidad de toma y tiempo ideal de tratamiento fueron realizados por Oncodesign (Dijon, Francia). Las celulas LL2 se descongelan antes de cada experimento y despues se cultivan y expanden in vitro durante al menos 10 dfas antes de la inyeccion.
Las celulas B16-IRES-GFP-OVA (B16-GFP) y B16- MAGEA3-IRES-GFP-OVA (B16-MAGEA3-GFP) se utilizan para volver a estimular ex vivo los esplenocitos obtenidos a partir de los ratones tratados. Las celulas B16-MAGEA3 son celulas de tumor singeneicas B16-F10 transducidas por Vectalys con para expresar la protefna MAGE-A3. La expresion de GFP normalmente esta vinculada en la expresion de la protefna MAGE-A3.
Inoculacion de celulas de tumor
En el dfa 0, los ratones C57BL/6 se inyectan con celulas TC-1 (1 x106 celulas por raton diluidas en 100 pi de PBS 1 X por via subcutanea en el flanco derecho. En algunos experimentos los ratones se inyectan en el dfa 65 con celulas LL2-GFP o LL2-HPV18 E7-GFP diluidas en 100 pi de PbS 1 X por via subcutanea en el flanco izquierdo.
Vacuna
Construccion y purificacion de CyaA-HPV16 E7fl3Q-4? (C16-1) y CyaA-HPV18 E7fn?-42 (C18-1) recombinantes La construccion y purificacion ya fueron descritas en el documento EP1 576 967 B1. Las dos masas finales de CyaA-HPV16 E7&30-42 (C16-1) (Figura 1A) y CyaA-HPV18 E7&32-42 (C18-1) (Figura 1B) se mezclan en Genticel a una relacion 1:1 para producir la composicion bivalente llamada ProCervix la cual despues se almacena a -80°C en alfcuotas.
Construccion y purificacion de vacunas basadas en gtCyaAd93 y gtCyaAd203
La secuencia de ADN de CyaA de tipo silvestre (CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1) se optimiza y sintetiza (GeneCust) para la expresion en E. coli. La secuencia de ADN optimizada se nombra gtCyaA. Esta secuencia porta los siguientes sitios de restriccion unicos que se agregan para facilitar la insercion de la secuencia antigenica en el dominio catalftico de CyaA: Nde I (CATATG) , BamH I (GGATCC), EcoR I (GAATTC), EcoR V (GATATC), Pci I (ACATGT), Bcl I (TGATCA), Age I (ACCGGT) , Xma I (CCCGGG), Nco I (CCATGG).
La gtCyaA se inserta despues en el plasmido pGTPc608 que contiene un promotor inducible pTAC (plasmido provisto por GTP Technology, Labege, Francia).
Se analizan dos mutantes por delecion: una delecion de 93 aminoacidos desde la posicion 228 hasta la posicion 320 de CyaA de B. pertussis y una delecion de 203 aminoacidos desde la posicion 184 hasta la posicion 386 de CyaA de B. pertussis. La primera delecion de 93 restos elimina el dominio que interactua con calmodulina (dominio III). La segunda delecion de 203 restos elimina los dominios II y III.
Las deleciones de 93 y 203 aminoacidos en gtCyaA se generan mientras se estan insertando los antfgenos.
La purificacion de cada protefna expresada se logra utilizando procedimientos de cromatograffa; en particular se efectuan tecnicas de cromatograffa de afinidad por intercambio ionico y cromatograffa de intercambio hidrofobico. Construccion y purificacion de gtCyaAd93-pep216- CyaCopt y gtCyaAd203-pep216-CyaCopt
Todos los antfgenos fueron sintetizados por DNA 2.0. (E.U.A.) o Genecust (Alemania) y la clonacion fue realizada por Solvfas, Suiza. Una representacion esquematica de gtCyaAd93-pep216-CyaACopt y gtCyaAd203- pep216-CyaACopt se da en las Figuras 3A y 3B.
Las cepas bacterianas BLR se someten a electroporacion con cada plasmido respectivamente. Las bacterias transfectadas se hacen crecer en medio clasico y las producciones se inducen por adicion de IPTG.
La purificacion de cada protefna expresada se logra utilizando procedimientos de cromatograffa; en particular se efectuan tecnicas de cromatograffa de afinidad por intercambio ionico y cromatograffa de intercambio hidrofobico.
Construccion de CyaAd203-pep105
La protema CyaAd2 03-PEP105opt esta constituida por una secuencia de adenilato ciclasa con 203 aminoacidos eliminados, que contiene, como un inserto antigenico, el polipeptido 105 (PEP105). La secuencia optimizada de CyaA se clona en el plasmido pKTRACE como se describio previamente en los sitios de restriccion Ndel y BamHI. Se sintetiza el antfgeno Pep105 y se clona entre los sitios de restriccion EcoRI y Xmal. El protocolo de purificacion ya fue descrito en el documento EP1 576 967 B1. Una representacion esquematica de pKTRACE CyaAd203-pep105opt se da en la Figura 4.
El polipeptido pep105 (SEQ ID NO: 24) comprende de N-terminal hacia C-terminal los siguientes antfgenos. Algunos antfgenos estan fusionados mientras que otros estan separados mediante enlazador. Un enlazador particular (dipeptido AS) se introduce antes de la secuencia GVNHQHl para generar un epttopo restringido por MHC clase I fuerte de murido (restringido con H-2 ) para calibracion de la respuesta inmune (en negritas):
- sitios de restriccion: MGIR
- GFP11: SRDHMVLHEYVNAAGIT
- enlazador: GSDR
- MOG35-55 : MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
- OVA257-264 (peptido restringido con MHC clase I proveniente de la protema ovoalbumina): SIINFEKL
- IE191-110: v r v d m v r h r ik e h m lk k y t q
- CLA4-TCR H-2Kd HA512-520 : IYSTVASSL
- enlazador: SGEK
- OVA323-339 (peptido restringido con MHC clase II): ISQAVHAAHAEINEAGR
- MELAN-A26-35 : ELAGIGILTV
- HA307-319 : PKYVKQNTLKLAT
- GP33-41 restringido con LCMV H2-Db: KAVYNFATC
- sitios de restriccion: SG
- MAGEA311-180:RKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQ
y f f p v if s k a s s s lq lv f g ie lm e v d p ig h ly if a t
- MAGEA3244-285 : KLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVK
- sitios de restriccion: TG
- HPV16E7 (secuencia truncada): MHGDTPTLHEYMLDLQP e t t d ly c y e q ln g p a g q a e p d r a h y n iv t f c c k c d s t lr lc v q s t h v d ir t le d llm g t lg iv c p ic s q k p - HPV18E7 (secuencia truncada): MHGPKATLQDIVLHLEP q n e ip v d llc h e q ls a s g v n h q h lp a r r a e p q r h t m lc m c c k c e a r ie lv v e s s a d d lr
a f q q lf ln t ls f v c p w c a s q q
- sitios de restriccion: LKGP
Administracion de la vacuna
En el dfa 11, despues de medir el tumor, los ratones con tumores solidos detectables se vacunaron mediante inyeccion intradermica (i.d.) en la dermis de las orejas (ambas orejas se inyectaron).
Moleculas de coadyuvante
Poli-ICLC (agonista de TLR3) fue provisto por Oncovir (Inc, WA, EE.UU.) en viales que contienen 1 ml de solucion esteril opalescente a 2 mg/ml. El poli-ICLC se deja en el recipiente original y se almacena a 4°C. Poli- ICLC para inyeccion contiene 2 mg/ml de poli-IC estabilizado con 1.5 mg/ml de poli-L-Lisina y 5 mg/ml de carboximetilcelulosa de sodio en solucion al 0.9% de cloruro de sodio y se ajusta a pH 7.6-7.8 con hidroxido de sodio.
Medicion de tumor
Se toman en cuenta diferentes parametros para evaluar el desarrollo de tumor en los ratones:
o Tamano del tumor: Los tumores se miden manualmente utilizando un calibrador dos veces por semana comenzando 5 dfas despues de la inoculacion de celulas de tumor y hasta el dfa 60. El volumen del tumor se calcula despues de la siguiente manera: volumen = longitud x anchura2 )/2.
o Supervivencia de los ratones: por razones eticas se sacrifican los ratones que desarrollan tumores anormalmente importantes (lfmite de tamano: 2000 mm3) y/o necroticos, o con disminucion en la movilidad inducida por tumor.
o Numero de ratones sin tumores: Esta informacion indica cuando la vacunacion terapeutica ha inducido una regresion completa del tumor (ausencia de tumor palpable).
Medicion de respuestas citotoxicas de memoria de celula T CD8
El metodo para medir la citotoxicidad de celulas T CD8+ in vivo ha sido descrito exhaustivamente [22, 23]. Brevemente, los esplenocitos singeneicos provenientes de ratones sin tratamiento se marcan con concentraciones diferentes de CFSE (ester succinimidflico de carboxifluorescefna, Molecular Probes Invitrogen) y ya sea que se pulsen in vitro con los peptidos relevantes o se dejen sin pulsar. Las poblaciones de celulas diana tanto pulsadas con peptido como sin pulsar se transfieren adoptivamente por via intravenosa en los hospedadors vacunados singeneicos y se mide la perdida de objetivos pulsados con peptido mediante citometrfa de flujo (BD FACSCanto II) en el bazo. El porcentaje de aniquilacion se calcula a partir de la reduccion en la relacion del porcentaje de celulas diana pulsadas a celulas no pulsadas, se corrige utilizando la relacion inicial (vease mas adelante). Las preparaciones celulares se analizan mediante citometrfa de flujo antes de la inyeccion para monitorear el marcado con CFSE de las diferentes celulas diana y obtener valores de referencia (porcentaje real de cada poblacion celular) para el calculo del porcentaje de aniquilacion in vivo. Las tres poblaciones de celulas diana se inyectan despues por via intravenosa a una relacion 1:1:1 a cada uno de los ratones vacunados. El porcentaje de aniquilacion in vivo se calcula como se describe en alguna otra parte con la siguiente formula [24]:
PORCENTAJE DE ANIQUILACION = 100- ([% de peptido pulsado en los vacunados/% de no pulsados en los vacunados)/(% de peptido pulsado antes de la inyeccion/% de no pulsados antes de la inyeccion)] x 100)
Prueba ELISpot de IFN-y (inmunomancha ligada a enzima)
Las frecuencias de celulas T CD8+ especfficas productoras de IFN-y se evaluan mediante una reestimulacion ex vivo de los esplenocitos con cualquiera de peptidos restringidos con H-2 (HPV16E749-57 y HPV18E7a s 43 -49 ) o banco de peptido de la protefna E7 de HPV45. Esto se logra efectuando una prueba ELISpot de IFN-y:
o La prueba ELISpot se efectua en esplenocitos combinados de ratones.
Brevemente, los esplenocitos totales obtenidos a partir de ratones vacunados se dejan sin estimular o se reestimulan durante 20 horas a 37oC, 5% de CO2 con 1 pg/ml de cada peptido como se describe a continuacion:
o 1x106 celulas/cavidad con el peptido HPV16E749-57 (epftopo relevante restringido con H-2 )
o 1x106 celulas/cavidad con 0 VA257-264 (epftopob irrelevante restringido con H-2 )
o 0.25x106 celulas/cavidad con HPV18 E7AS43-49b(epftopo relevante restringido con H-2 )
o 1x106 celulas/cavidad con el banco de peptido de E7 de HPV45.
Para el experimento con la CyaAd203-PEP105opt, se utilizan estimulaciones antigenicas adicionales:
o banco de peptidos #116-2/3 (5 pg/ml): combinado de #116-2 y #116-3 (1x106 celulas por cavidad) o banco de peptidos #171 (3 pg/ml): combinado de #171-1, #171-2 y #171-3 (1x106 celulas por cavidad) o -OVA323-339, peptido restringido con MHC-clase II, utilizado a 10 pg/ml (1x106 celulas por cavidad)
o -LCMV GP33-4i, peptido restringido con MHC-clase I utilizado a 1 pg/ml (1x106celulas por cavidad)
o -MOG35-55, peptido restringido con MHC-clase II, utilizado a 10 pg/ml (1x106celulas por cavidad)
o -protefna MAGEA3 (TAA 002_MAGE-3) marcado con histidina producido en Genticel, utilizada a 10 pp/ml. o -Esplenocitos: las celulas B16-GFP (que expresan o no a MAGEA3) se co-cultivan a una relacion de 19:1 (950000 esplenocitos: 50000 celulas B16).
La secrecion de IFN-y se monitorea mediante una ELISpot basada en emparedado que se revela mediante BCIP/NBT utilizando estreptavidina-AKP. Los datos se analizan en un aparato Bioreader 5000-Pro S (Biosys).
II. Resultados
A. Confirmacion de la capacidad de los nuevos vectores de la invencion para inducir respuesta inmune
contra un antfgeno modelo
Con el fin de confirmar la eficiencia de los nuevos vectores de la invencion en sus capacidades para suministrar antfgenos grandes y multi-epitopicos, se disena un antfgeno modelo con 441 aminoacidos (SEQ ID NO:24).
Los ratones se vacunan con la protefna CyaAd203- pep105opt, en el dfa 0 y se sacrifican en el dfa 7, se recolectan los bazos y se afslan los esplenocitos. Utilizando estas celulas, se miden las respuestas mediadas por celula T utilizando pruebas ELISpot de IFN-y e IL-2. Los ratones vacunados con ProCervix se utilizan como controles positivos para induccion de respuestas de celula T especfficas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 y como control negativo para los otros antfgenos los cuales son solamente suministrados por la protefna CyaAd203-PEP105opt. Todas las vacunas se coadyuvan mediante co-inyeccion de Poli-ICLC.
A.1.Induccion de respuestas de IFN-v especfficas de E7 de HPV16, E7 de HPV18 y OVA?57-2b4
La Figura 5 ilustra los resultados obtenidos despues de re-estimulacion con los peptidos restringidos con la clase I HPV16 E749-57 , HPV18 E7a s 43 -49 y OVA257-264 y con bancos de peptidos de 15-meros de E7 de HPV16 (#116-2/3) y E7 de HPV18 (#171-1/2/3). Se pueden sacar las siguientes conclusiones:
- No se detectan respuestas inmunes especfficas de antfgenos en el grupo de ratones vacunados con Placebo coadyuvado con Poli-ICLC.
- Respecto al grupo de ratones vacunados con la vacuna Procervix coadyuvada con Poli-ICLC, cualquiera que sea la re-estimulacion, se obtienen los resultados esperados:
- la re-estimulacion in vitro con peptidos restringidos con la clase I HPV16E749 -57 y HPV18E7a s 43 -49 induce respuestas claras de IFN-y especfficas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18;
- no hay respuesta especffica obtenida con la reestimulacion con OVA257-264 ;
- la intensidad de las respuestas de IFN-y especfficas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 obtenidas con los bancos de peptidos (#116-2/3 y #171-1/2/3) son cercanas al nivel de las respuestas obtenidas con los peptidos restringidos con MHC-clase I (HPV16E749-57 , HPV18 E7a s 43 -4 9 ).
- Con respecto a los ratones vacunados con la protefna CyaAd203-PEP105opt coadyuvada con Poli-ICLC, la deteccion de respuestas de IFN-y especfficas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 con los bancos de peptido tanto de E7 de HPV16 como de E7 de HPV18 (#116-2/3 y #171-1/2/3) y todos los y todos los peptidos restringidos con MHC clase I analizados para Procervix: HPV16E749 -57 , HPV18E7a s 43 -49 y tambien con el peptido OVA257-264 .
Estos resultados muestran que la re-estimulacion ex vivo con todos estos peptidos diferentes fue capaz de reestimular las celulas T especfficas de antfgeno E7 de HPV18, E7 de HPV16 y OVA257-264 provocado por la vacunacion intradermica de CyaAd203-PEP105opt.
A.2. Induccion de respuestas de IFN-y mediadas por celulas T especfficas para los antfgenos OVA323-339. LCMV GP33-41, MOG35-55 y MAGEA3
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos despues de diferentes tipos de re-estimulacion ex vivo:
- OVA323-339, peptido restringido con MHC-clase II
- LCMV GP33-4i, peptido restringido con MHC-clase I
- MOG35-55, peptido restringido con MHC-clase II
- protefna MAGEA3 marcada con Histidina.
- Se utilizan celulas de tumor B16-MAGEA3-GFP como APC para estimular las celulas T CD8+ especfficas de antfgeno a traves de la presentacion de epftopos restringidos con MHC-clase I que resultan del procesamiento endogeno de la protefna MAGE-A3. Las celulas B16-GFP que no expresan la protefna MAGE-A3 se analizan tambien como un control negativo para la especificidad de la respuesta inmune de MAGEA3.
Se puede observar que para todos los grupos, la protefna MAGE-3 marcada con histidina induce la misma respuesta no especffica.
Para los ratones vacunados con placebo coadyuvado con poli-ICLC o Procervix coadyuvado con poli-ICLC, no se detectan respuestas inmunes hacia estos antfgenos.
Para los ratones vacunados con la protefna CyaAd203-PEP105opt coadyuvada con poli-ICLC, las celulas T secretoras de IFN-y especfficas de antfgeno se detectan despues de re-estimulacion con los peptidos OVA323-339, GP33-42 y MOG35-55, pero tambien despues de re-estimulacion con celulas B16-GFP y B16-MAGEA3-GFP.
Estos resultados muestran que la vacunacion con CyaAd203-PEP105opt provoca celulas T especfficas de antfgeno OVA323-339 restringido con 1-Ab, LCMV GP33-42 y MOG35-55 restringidos con H-2D y GFP11.
Tomados juntos, estos resultados resaltan la eficiencia exquisita de vectores de vacuna basadas en CyaA para aumentar tanto celulas T CD4+ como celulas T CD8 especfficas de antfgeno fuertes en un modo multi-epitopico. Por desgracia, las respuestas especfficas de MAGEA3 no se pudieron medir correctamente ya que se obtienen frecuencias similares de celulas T secretoras de IFN-y despues de re-estimulacion ex vivo con ambas lfneas celulares: B16-GFP o B16-MAGEA3-GFP. Debido a que la protefna CyaAd203-PEP105opt incrusta el antfgeno de GFP11, la inmunizacion con este vector de vacuna induce respuestas de celula T especfficas de GFP las cuales enmascaran la respuesta de celula T especffica de MAGEA3.
Este estudio resalta por primera vez la capacidad de un vector de vacuna de CyaA con 203 restos eliminados para inducir, en el mismo raton vacunado, respuestas de celula T especfficas de antfgeno contra varios epftopos de celula T no relacionados. Ademas, estos resultados tambien muestran la capacidad exquisita de este vector de vacuna de CyaA con 203 restos eliminados para inducir respuestas de celula T tanto CD4+ como CD8+ (respuestas especfficas detectadas contra peptidos restringidos tanto por MHC I como por MHC II).
B. Diseno de antiaenos de HPV
Se seleccionan siete secuencias de E7 a partir de los 7 tipos de HPV de mas alto riesgo (16, 18, 45, 31, 33, 52 y 58) tomando como base su prevalencia en mujeres con carcinoma de celula invasivo (ICC) y en mujeres infectadas por HPV pero con citologfa normal [9], [10]: variante de E7 de HPV16 (gi_30172006;la SeQ ID NO:25), variante de E7 de HPV18 (gi 167996747;la SEQ ID NO:26), variante de E7 de HPV31 (gi_148727610;la SEQ ID NO:27), variante de E7 de HPV33 (gi_257472286;la SEQ ID NO:28), variante de E7 de HPV45 (gi_549287;la SEQ ID NO:29), variante de E7 de HPV52 (gi_237861305;la SEQ ID NO:30) y variante de HPV58 (gi_191 11001;la SEQ ID NO:32).
E7 esta constituida dos dominios funcionales separados por una region acida. Estos dominios han sido descritos exhaustivamente [11-13]. La parte N-terminal de la protefna contiene el motivo de union a pRB (LXCXE) y la parte C-terminal de la protefna contiene el asa de dedo de zinc. La alineacion de las protefnas E7 de HPV16, 18 y 45 se provee en la Figura 7A, y la alineacion de las protefnas E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 se provee en la Figura 7B.
Se elaboran dos antfgenos recombinantes mediante fusion en cada una de las tres secuencias de E7 de HPV 16, 18 y 45 respectivamente (con o sin las regiones acidas). Ademas, se elaboran dos antfgenos recombinantes mediante fusion de cuatro secuencias de E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 respectivamente (con o sin las regiones acidas). La presencia o no de la region acida de cada E7 sigue el fundamento expuesto en el documento WO 2005089792, que sigue las reglas dictadas por la literatura. En efecto, las secuencias acidas en CyaA han sido descritas como perjudiciales para la translocacion normal del dominio catalftico de CyaA en el citosol [8]. Por lo tanto, en este caso las secuencias con y sin esta region permiten analizar la capacidad de los nuevos vectores de la invencion (gtCyaAd93 y gtCyaAd203) para suministrar estos antfgenos al citosol de las APCs.
Los antfgenos elaborados a partir de las secuencias de E7 de HPV 16, 18 y 45 se han disenado para generar vacunas con vector de CyaA trivalentes candidatas. Estas secuencias tienen ya sea eliminada la region acida o no tienen delecion (longitud completa) y las secuencias de E7 se han dividido e invertido para obtener el acomodo representado en la Figura 8a . Las secuencias de los dos antfgenos candidatos trivalentes se modificaron adicionalmente para introducir un epftopo de murido de celula T fuerte descrito en el documento WO 2005089792. Este epftopo se genera mediante insercion de un dipeptido de Alanina-Serina (AS) al inicio de la secuencia GVNHQHL de E7 de HPV 18, la cual esta en la parte C-terminal de la protefna, flanqueando la region acida.
Los antfgenos elaborados a partir de las secuencias de E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 se han disenado para generar vacunas con vector de CyaA tetravalentes candidatas. Al igual que para los antfgenos trivalentes, estas secuencias tienen eliminada la region acida o no tienen delecion, y las secuencias de E7 se han dividido e invertido para obtener el acomodo representado en la Figura 8B.
Para cada candidato, se realiza una busqueda respecto a la presencia de epftopo(s) que pudiera(n) inducir una respuesta contra protefnas de humano. De manera sorpresiva, la secuencia de tipo silvestre de E7 de HPV52 contiene en forma natural una secuencia que podrfa ser un epftopo autoinmune, un epftopo B*2705 (9-meros, MHC I). La secuencia de este epftopo es 100% identica a una secuencia de ITPR3 de humano (receptor de inositol 1,4,5-tri-fosfato, tipo 3). Para evitar este epftopo, la secuencia de E7 de HPV52 se modifica tomando como base la homologfa de secuencia con las protefnas E7 de los tipos de HPV 31, 33 y 58, para reemplazar una metionina por una leucina en la posicion 84 y una leucina por una metionina en la posicion 86 de la SEQ ID NO: 30 (la secuencia modificada es LRTLQQLLM). La secuencia de la protefna E7 de longitud completa modificada de HPV52 es como se indica en la SEQ ID NO: 31. Por lo tanto, la novedad de las secuencias de los antigenos tetravalentes se deriva del acomodo de la parte C-terminal y N-terminal de las protefnas E7, y de la presencia de las dos modificaciones efectuadas en la secuencia de E7 de HPV52.
La carga electrostatica de estos antfgenos particulares se calcula como se explico anteriormente. Estos antfgenos tienen una carga acida inferior a -6 y portan respectivamente 21 cistefnas en los antfgenos trivalentes y 28 cistefnas en los antfgenos tetravalentes. Las caracterfsticas de estos antfgenos se presentan en forma resumida en la Tabla 2.
Tabla 2 Caracterfsticas de diversos antfgenos de HPV
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Figure imgf000030_0003
( )
C. Deleciones grandes dentro del dominio catalftico de CyaA permiten la insercion de antfgenos grandes y complejos
Se sintetiza el ADN de los antfgenos trivalentes Pep216 y Pep217 y de los antfgenos tetravalentes Pep233 y Pep234 y se clona en los nuevos vectores gtCyaAd93 y gtCyaAd203. Como controles, cada protefna E7 se inserta individualmente en gtCyaAd93, para ver si la secuencia de E7 de HPV31, 33, 45, 52 y 58 es problematica ya que nunca antes se habfan insertado en una protefna CyaA.
Tabla 3 Caracterfsticas de las protefnas quimericas de la invencion (La secuencia de BTpr 114 es como se indica en la SEQ ID NO: 58; la secuencia de BTpr 116 es como se indica en la SEQ ID NO: 61; la secuencia de BTpr 115 es como se indica en la SEQ ID NO: 64; la secuencia de BTpr 117 es como se indica en la SEQ ID NO: 67; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 131 es como se indica en la SEQ ID NO: 70; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 132 es como se indica en la SEQ ID NO: 71; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 133 es como se indica en la SEQ ID NO: 73; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 134 es como se indica en la SEQ ID NO:74; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 120 es como se indica en la SEQ ID NO: 72).
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p g
Se evalua la produccion y las caracterfsticas analfticas de estos antfgenos monovalentes, trivalentes y tetravalentes. Por lo tanto, se efectuan Pre-bancos de celula maestra (pre-MCB) para cada construccion y se analizan respecto a induccion de las protefnas de interes con IPTG (Figura 9). Los candidatos monovalentes y trivalentes tienen un perfil normal despues de induccion en analisis en gel de SDS-PAGE mientras que los candidatos tetravalentes muestran una banda debil en el tamano esperado.
Este perfil se confirma para cada molecula ermentada en fermentador de 5 litros. Las caracterfsticas e las protefnas quimericas producidas se presentan en orma resumida en la Tabla 4.
Tabla 4: Produccion y caracterfsticas analfticas de protefnas quimericas monovalentes, trivalentes y tetravalentes Actividad enzimatica
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p
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p
Desde un punto de vista de produccion, cuaiquiera que sea la delecion, las gtCyaAs con los antfgenos monovalentes y trivalentes dan rendimiento y pureza aceptables (>90%), mientras que los candidatos tetravalentes tienen una pureza reducida (11% de la protefna de interes).
Considerando la pureza general cuando se comparan los candidatos que llevan la dimension de 93 restos contra los candidatos con 203 restos eliminados, parece ser que estos ultimos tienen un rendimiento inferior al de las construcciones de gtCyaAd93 (Btpr114 y Btpr_115). Esta diferencia es bastante sorpresiva ya que se esperarfa que la gtCyaA mas corta fuera mas facil de producir.
Ambos vectores con sus antfgenos no tienen actividad enzimatica lo que resalta que la delecion es suficiente para desintoxicar los vectores.
D. La produccion de GtCyaAs con al menos 4 E7 es dependiente de la secuencia
Se investiga tambien si los resultados obtenidos con los candidatos tetravalentes se deben al numero de secuencias de polipeptido E7 en la CyaA o a un ensamblado particular de las secuencias del polipeptido E7 en CyaA. Para dicho proposito, se analizan diversas construcciones (Tabla 5).
Tabla 5: Protefnas quimericas con antfgenos de HPV trivalentes y tetravalentes
C
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p , , , g p
Se efectuaron pruebas de induccion de Pre-MCB y de manera sorpresiva el numero de secuencias de E7 en CyaA no es el lfmite. Mas bien es la naturaleza de la secuencia total del antfgeno. Asimismo, Btpr_161, 162, 169 y 170 muestran rendimientos de protefna de interes mas bajos cuando se comparan con los antfgenos de longitud completa (BTpr_165, 166, 173 y 174) (Tabla 6).
Tabla 6: Resumen de los resultados de induccion con pre-MCB
C
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A partir de los experimentos anteriores, se puede concluir que gtCyaAd93 y gtCyaAd203 aceptan la secuencia de polipeptido equivalente que corresponde a al menos 4 protemas E7. Sin embargo, la secuencia y el acomodo de los fragmentos de E7 elegidos pueden tener un impacto sobre el rendimiento y pureza y por lo tanto tiene mas o menos potencial de industrializacion favorable.
Confirmacion de resultados observados con el pre-MCB
Los inventores investigaron adicionalmente si los resultados obtenidos en el nivel pre-MCB son confirmados con un enfoque particular sobre construcciones tetravalentes en el vector gtCyaAd93. Las protemas que tienen un mejor perfil de expresion que BTpr_143 o equivalente a BTpr_115 son analizadas a una escala de 5 litros. La siguiente tabla presenta en forma resumida los resultados obtenidos.
Tabla 7: Resumen de la induccion pre-MCB y resultados de produccion a escala de 5 litros
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A partir del experimento anterior, se concluye que:
1. La productividad y pureza total ha sido mejorada para todas las construcciones analizadas excepto para Btpr_175.
2. Los perfiles de productividad y expresion siempre son inferiores en protefnas recombinantes con gtCyaAd203 que con gtCyaAd93.
3. El vector gtCyaAd93 permite la produccion de protefnas recombinantes que contienen 4 antfgenos de HPV con un mejor rendimiento y pureza que el vector gtCyaAd203.
4. Estos resultados confirman las observaciones hechas en el pre-MCB.
E. gtCyaAd93 y gtCyaAd203 que contienen antfgenos grandes son inmunogenicos
E.1 Inmunogenicidad de BTpr 114, BTpr 115, BTpr 116 y BTpr 117
La inmunogenicidad de las protefnas quimericas BTpr_114, BTpr_115, BTpr_116 y BTpr_117, se investigo adicionalmente. Los ratones fueron vacunados por via intradermica ya sea con el placebo o con ProCervix (control positivo compuesto de CyaA-HPV16 E7 CyaA-HPV18 E7) o con Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93- pep217-CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) respectivamente. Todos los grupos se coadyuvan con poli-IC-LC. Los ratones se sacrifican 7 despues de la vacunacion y los esplenocitos son re-estimulados con peptidos restringidos con MHC clase I anteriormente identificados. Los resultados se presentan en la Figura 10.
La Figura 10 muestra que:
- la inmunizacion con 10 pg de ProCervix induce un nivel esperado de respuesta de IFN-y especffica de E749-57 de HPV16 y E7As43-49 de HPV18.
- las respuestas especfficas de antfgeno obtenidas con vacunas trivalentes candidatas son equivalentes a la obtenida con ProCervix.
- no se observan diferencias entre candidatos trivalentes, en la frecuencia de respuestas de celula T especfficas. - la respuesta mas baja contra el antfgeno de HPV16 se debe al hecho que el epftopo de HPV16 es mas debil que el epftopo de HPV 18 al cual los ratones C56LB/6 son muy sensibles.
Estas observaciones permiten concluir que gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt y gtCyaAd203-PEP217-CyaCopt coadyuvados con poli-ICLC son tan eficientes como ProCervix coadyuvado con poli-ICLC en la induccion de respuestas de IFN-y especfficas de de HPV16 E749-57 y de HPV18 E7AS43-49 en ratones despues de inmunizacion transdermica.
Debido a que no se identifico ningun peptido restringido con MHC-l para El de HPV45 en los ratones en el momento del experimento, los esplenocitos son reestimulados con una genoteca de peptido de E7 de HPV45 divida en tres sub-combinados (#218-1, #218-2 y #218-3). Este experimento es la primera re-estimulacion, conocida por los inventores, hecha con una genoteca de peptido en lugar de con un peptido que corresponde a un epftopo conocido. La Figura 11 muestra que la re-estimulacion in vitro restimulation con el sub-combinado de peptido #218-3, pero no los sub-combinados #218-1 y #218-2, es capaz de reestimular celulas T inducidas por vacunacion con gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd93- PEP217-CyaC0pt y gtCyaAd203-PEP217-CyaCopt. La secuencia de peptido responsable para esta respuesta inmune es IELTVESSAEDLRTL.
De manera sorpresiva, se observo una respuesta similar con el grupo vacunado con ProCervix, el cual no porta la secuencia de E7 de HPV45. Este resultado se puede explicar mediante una reactividad cruzada entre los epftopos presentes en el combinado #218-3 y las secuencias de E7 de HPV16 o de E7 de HPV18 contenidas en la vacuna ProCervix.
Juntos, estos resultados muestran que los antfgenos con una estructura compleja (21 cistefnas) y cargas acidas son suministrados correctamente por gtCyaAd93 y gtCyaAd203 y procesados por celulas Presentadoras de Antfgeno (APC). Esto es inesperado tomando en consideracion los resultados ensenados en Preville et al. [5], Karimova et al.
[7] y Gmira et al. [8].
Ademas, la delecion efectuada en el dominio catalftico de CyaA podrfa proveer una ventaja con relacion al polipeptido heterologo suministrado, reduciendo el nivel de respuestas de celula T especfficas de CyaA y respuestas de celula B especfficas de CyaA (dicha delecion resulta en la reduccion en numero principalmente de epftopos restringidos por MHC clase I y clase II de CyaA)
E.2 Inmunogenicidad de nuevos lfderes que consisten en Btpr 163, BTpr 164, BTpr 165, BTpr 166, BTpr 167, BTpr 168, BTpr173 y BTpr175
La inmunogenicidad de los nuevos lfderes que consisten en Btpr_163, BTpr_164, BTpr_165, BTpr_166, BTpr_167, BTpr_168, BTpr_173 y BTpr_175, se analiza adicionalmente en ratones C57BL/6.
Los ratones son vacunados por via intradermica ya sea con el placebo o con cada lfder, respectivamente. Todos los grupos se coadyuvan con poli-ICLC.
Los ratones se sacrifican 7 dfas despues de la vacunacion y los esplenocitos son re-estimulados con genotecas de peptido de cada antfgeno de E7 analizado. Todos los lfderes analizados son inmunogenicos.
La inmunogenicidad contra HPV31, 45 y 58 no se analiza en ratones C57BL/6 debido a que las herramientas no estan adaptadas (el fondo genetico de los ratones no es apropiado). La inmunogenicidad contra esta protefnas E7 se analiza en otras cepas de ratones como se describe en Materiales y Metodos.
Tabla 8: Inmunogenicidad de lfderes analizados en ratones C57BL/6
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Figure imgf000035_0001
Estos resultados muestran que:
- La inmunizacion con 10 |jg de cada Ifder induce una respuesta de IFN-y especffica.
- gtCyaAd93 y gtCyaAd203 suministran correctamente los antfgenos a las celulas presentadoras de antfgeno. - Se miden respuestas inmunes especfficas contra protefnas E7 de HPV16, 18, 33 y 52.
Estos resultados permiten la investigacion adicional de la respuesta inmune contra mezclas hexavalentes y heptavalentes.
E.3 Inmunogenicidad de una vacuna hexavalente candidato
La respuesta inmune de una mezcla hexavalente de dos lfderes trivalentes, se evalua en ratones C57BL/6.
Estos lfderes son BTpr_114 y BTpr_165 que contienen respectivamente protefnas E7 de HPV 16-18-45, y protefnas E7 de HPV 31-52-58. Se utiliza el mismo protocolo que el descrito anteriormente. Debido a que no hay un peptido restringido con MHCI conocido identificado para E7 de HPV52 en los ratones al momento del experimento, se reestimulan los esplenocitos con una genoteca de peptido de E7 de HPV52 dividida en tres sub-combinados (221-1, 221-2 y 221-3).
Para re-estimulaciones con HPV16E7 y HPV18E7, tambien se utilizan genotecas de peptido divididas en 3 subcombinados (116-1, 116-11, 116-111 y 171-1, 171-11 y 171-3 respectivamente).
Los resultados se muestran en la Figura 15.
Estos resultados confirman que:
- La inmunizacion con 10 jg de la mezcla hexavalente induce respuestas de celula T para E7 de HPV16, E7 de HPV18 y HPV52 como se mide mediante ELISpot de IFN-y.
- Cada gtCyaAd93 con sus antfgenos respectivos es capaz de suministrarlos a la celula presentadora de antfgeno (APC) y promover respuestas de celula T especfficas de antfgeno contra tipos de HPV medibles.
- No se observan diferencias entre componentes trivalentes solos en la frecuencia de respuestas de celula T especfficas de E7 y la vacuna hexavalente candidato, (datos no mostrados)
Estas observaciones permiten concluir que Btpr_1 14 y Btpr_165 coadyuvados con poli-ICLC son eficientes para inducir respuestas de celula T especfficas de E7 de HPV16, E7 de HPV18E7 y E7 de HPV52 en ratones C57BL/6 despues de inmunizacion intradermica.
E.4 Inmunogenicidad de dos vacunas heptavalentes candidato
Tomando como base los resultados de productividad y pureza, se analizan dos combinaciones heptavalentes en ratones C57BL/6: Btpr_165+Btpr_163 y Btpr_166 Btpr_164. Los ratones se inmunizan por via intradermica con 10 jg de cada vacuna heptavalente candidato, respectivamente.
Tal como se muestra en la Figuras 16A-16D, estos resultados indican que para:
- E7 de HPV16: la re-estimulacion in vitro con sub-combinado de peptidos #116-2j (c+d), es capaz de re estimular celulas T inducidas por vacunacion con ambas vacunas heptavalentes candidato o sus componentes solos que alojan E7 de HPV16.
- E7 de HPV18: la re-estimulacion in vitro con sub-combinados de peptidos #171-1 y #171-11 son capaces de reestimular celulas T inducidas mediante vacunacion con ambas vacunas heptavalentes candidato y sus componentes solos que albergan E7 de HPV18.
- E7 de HPV33:
o Para la vacuna heptavalente candidato compuesta de Btpr_166 y Btpr_164, la re-estimulacion in vitro con el sub-combinado de peptido #220-2, es capaz de re-estimular celulas T inducidas mediante vacunacion, o Para la vacuna heptavalente candidato compuesta de Btpr_165 y Btpr_163, la re-estimulacion in vitro con los sub-combinados de peptido #220-1, #220-2 y #220-3 son capaces de re-estimular celulas T inducidas mediante vacunacion.
- E7 de HPV52: la re-estimulacion in vitro con el sub-combinado de peptidos #221-2 y #221-3 es capaz de reestimular celulas T inducidas mediante vacunacion con ambas vacunas heptavalentes candidato o sus componentes solos que alojan E7 de HPV52.
Juntos, estos resultados de produccion e inmunogenicidad indican que:
- Se puede producir y purificar gtCyaAd93 recombinante con 3 y 4 protefnas E7 de HPV con una buena productividad;
- Tambien se pueden producir y purificar protefnas gtCyaAd203 recombinantes pero con una productividad que es inferior con respecto a los vectores gtCyaAd93 que contienen los mismos antfgenos.
- Dos gtCyaAd93 recombinantes con 3 y 4 protefnas E7 de HPV pueden suministrar correctamente sus antfgenos a las APCs.
- Se mide una respuesta inmune especffica contra cada tipo de HPV inmunogenico en ratones C57BL/6
- El diseno de las protefnas E7 con un gtCyaAd93 recombinante puede tener un impacto en la respuesta inmune contra antfgenos E7 por ejemplo como se ilustro con E7 de HPV33.
- Los antfgenos con una estructura compleja (21 cistefnas) y cargas acidas son suministrados correctamente mediante gtCyaAd93 y procesados por celulas Presentadoras de Antfgeno (APC). Esto es inesperado tomando en consideracion los resultados de Gmira et al. 2001, y Fayolle et al., 1998.
F. Eficiencia citotoxica de los candidatos
F.1 Eficiencia citotoxica mediada por CD8 de las vacunas trivalentes candidato
Con el fin de comparar la eficiencia de los candidatos trivalentes en la induccion de citotoxicidad, se efectuaron pruebas de aniquilacion in vivo con y sin coadyuvante. Se recolectan esplenocitos provenientes de ratones no afectados por tratamiento y se cargan con genotecas de peptido provenientes de protefnas E7 de HPV16, HPV18 y HPV45, respectivamente.
Se vacunan 4 grupos de ratones con un placebo, con gtCyaAd93-pep216-CyaCopt, con gtCyaAd93-pep217-CyaCopt y con gtCyaAd203-pep217-CyaCopt en presencia o no de poli- IC-LC, respectivamente.
En presencia de coadyuvante, no se observa ninguna diferencia entre candidatos (datos no mostrados). En la Figura 12A (cargando con genotecas #171-1 y #171-2), el porcentaje de aniquilacion es superior en los ratones vacunados con la protefna quimerica que contiene los antfgenos de longitud completa (pep217) en comparacion con ratones vacunados con la protefna quimerica que contienen el antfgeno eliminado pep216. De manera similar, en la Figura 12B (cargando con la genoteca de peptido #218-3), el porcentaje de aniquilacion es superior en los ratones vacunados con la protefna quimerica que contiene pep217 mientras que no se observa aniquilacion alguna en los ratones vacunados con la protefna quimerica que contiene pep216 cuando se compara con el placebo. Sin el coadyuvante poli-LCLC, las gtCyaAs que albergan los antfgenos de longitud completa son mas eficientes para aniquilar sus celulas diana en comparacion con los antfgenos eliminados para este dominio acido. Esto es inesperado ya que los antfgenos de longitud completa contienen los dominios acidos de E7 y de conformidad con la ensenanza de la literatura deberfan ser menos eficientes que los antfgenos eliminados para este dominio acido. Estos resultados indican que
- los antfgenos de longitud completa probablemente tienen epftopos (epftopos de celula T auxiliar) que favorecen la respuesta de aniquilacion mediante linfocitos T CD8 ; y
- los vectores gtCyaA permiten el suministro de antfgenos con regiones acidas
F.2 eficiencia citotoxica mediada por CD8 de las vacunas heptavalentes candidato
Con el fin de comparar la eficiencia de las vacunas heptavalentes candidato respecto a su capacidad de inducir linfocitos T citotoxicos especfficos de E7 (CTL), se efectuaron pruebas de aniquilacion in vivo con coadyuvante. Se recolectan esplenocitos provenientes de ratones no afectados por tratamiento y se cargan con genotecas de peptido provenientes de protefnas E7 de HPV16 y HPV18, respectivamente.
Se vacunan 3 grupos de ratones con un placebo, con BTpr165 BTpr163 y BTpr166 BTpr164 en presencia de Poli-ICLC, respectivamente.
No se observa aniquilacion especffica de E7 en el grupo con placebo. Ambas vacunas heptavalentes candidato inducen aniquilacion especffica de E7 de celulas cargadas respectivamente con la genoteca de peptido E7 de HPV16 E7 (Figura 17-A) o la genoteca de peptido E7 de HPV18 E7 (Figura 17-B).
Estos resultados indican que ambos candidatos heptavalentes inducen CTL especfficos de E7 de HPV16 y HPV18 funcionales.
G. Pruebas de rearesion de tumor en ratones que portan tumores TC-1
Se investiga adicionalmente la eficiencia terapeutica de los cuatro candidatos trivalentes Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93-pep217- CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) utilizando el modelo de celulas de tumor TC-1.
Todos los ratones fueron inoculados con celulas TC-1 (que expresan el antfgeno E7 de HPV16) en el dfa 0. El grupo 1 se deja sin tratamiento. El grupo 2 se trata con PBS y Poli-ICLC, el grupo 3 se trata con ProCervix coadyuvado con Poli-ICLC, el grupo 4 se trata con gtCyaAd93-pep216 coadyuvado con Poli-ICLC, el grupo 5 con gtCyaAd203-pep216 coadyuvado con poli-IC-LC, el grupo 6 con gtCyaAd93-pep217 coadyuvado con Poli-ICLC y el grupo 7 con gtCyaAd203-pep217 coadyuvado con Poli-ICLC. Cada grupo esta compuesto de 10 ratones.
Las Figuras 13A-13B(a-g) muestran que todos los ratones desarrollan tumores. Sin embargo, los ratones vacunados con una vacuna candidato de CyaA que incorpora el antfgeno E7 de HPV16 y coadyuvada con Poli-ICLC muestran una tasa de eliminacion del tumor mas fuerte en el dfa 65: 9 de 10 ratones tratados con ProCervix Poli-ICLC eliminaron los tumores (grupo 3) (Figura 13Bc); 9 de 10 ratones tratados con gtCyaAd93-pep216 Poli-ICLC presentaron regresion de tumores (grupo 4) (Figura 13Bd); 8 de 10 ratones vacunados con gtCyaAd203-pep216 Poli-ICLC presentaron regresion de tumores (grupo 5) (Figura 13Be); 9 de 10 ratones tratados con gtCyaAd93-pep217 Poli-ICLC presentaron regresion de tumores (grupo 6) (Figura 13Bf); 9 de 10 ratones vacunados con gtCyaAd203-pep217 Poli-ICLC presentaron regresion de tumores (grupo 7) (Figura 13Bg). 0 de 10 y 1 de 10 ratones no tratados o tratados con el placebo Poli-ICLC presentaron regresion de tumores respectivamente (grupo 1 (Figura 13Ba) y grupo 2 (Figura 13Bb) ). Por lo tanto, unicamente los ratones que fueron vacunados con una vacuna candidato que contiene el antfgeno E7 de HPV16 fueron capaces de presentar regresion de tumores de manera significativa. Entre las cuatro vacunas candidato, no se observa diferencia en su capacidad para presentar regresion de tumores.
Estos resultados muestran que la administracion de las protefnas quimericas de la invencion, tales como Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93- pep217-CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) permite presentar regresion de tumores que provocan trastornos oncogenicos de manera eficiente.
H. Efecto terapeutico y profilactico de los candidatos trivalentes
Se evaluo adicionalmente la capacidad de los ratones vacunados de ser protegidos contra el desarrollo y crecimiento de un tumor, despues de la erradicacion de un primer tumor que expresa un antfgeno diferente. Se inoculan celulas de tumor LL2 que expresan antfgeno E7 de HPV18 y la lfnea celular de control LL2-GFP en el flanco de los ratones vacunados supervivientes, los cuales previamente habfan presentado regresion de tumor de los tumores injertados de TC-1 (que expresan el antfgeno E7 de HPV16).
Cada grupo de ratones supervivientes fue dividido en dos sub-grupos que fueron inoculados ya sea con celulas LL2-HPV18 E7 o celulas LL2-GFP. Los resultados se muestran en las Figuras 14A-14B(a-j).
Los ratones vacunados con una vacuna candidato de gtCyaA que incorporan el antfgeno E7 de HPV18 y coadyuvados con Poli-ICLC muestran un fuerte efecto protector contra el crecimiento de la lfnea celular de LL2-HPV18 E7 (ningun raton desarrollo tumor en los grupos 3b (Figura 14Bb), 4b(Figura 14Bd), 5b(Figura 14Bf), 6b (Figura 14Bh) y 7b (Figura 14Bj)) pero no contra el crecimiento de la lfnea celular LL2-GFP (todos los ratones desarrollaron tumores en los grupos 3a (Figura 14Ba), 4a (Figura 14Bc), 5a (Figura 14Be), 6a (Figura 14Bg)y 7a (Figura 14Bi)).
Juntos, estos resultados destacan que los ratones vacunados con los candidatos trivalentes, los cuales eliminaron los tumores de TC-1, tambien estan protegidos contra los tumores de LL2-HPV18E7 e indica que dichos ratones vacunados, los cuales desarrollaron una respuesta de celula T especffica de antfgeno curativa en contra del antfgeno E7 de HPV16, tambien desarrollaron una respuesta de celula T especffica de antfgeno protectora contra el antfgeno E7 de HPV18
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una protefna quimerica que comprende o que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal:
(a) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO:2 y terminando con un resto localizado desde la posicion 183 hasta la posicion 227 de la SEQ ID NO:2;
(b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y
(c) un fragmento de la protefna CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posicion 321 hasta la posicion 387 de la SEQ ID NO:2 y terminando con el ultimo resto de la SEQ ID NO:2.
2. Una protefna quimerica que se selecciona a partir del grupo que consiste en:
1) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
2) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO:8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO:8;
3) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
4) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO:8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO:8;
5) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
6) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO:8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO:8;
7) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6; y
8) una protefna que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO:8, (b) un polipeptido heterologo que comprende al menos 3 antfgenos E7 de HPV, originandose cada antfgeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO:8.
3. La protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque dicho polipeptido heterologo comprende o consiste en, de N-terminal hacia C terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, la parte C- terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N- terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
4. La protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dichos tipos de HPV, preferentemente dichos primero, segundo, tercero y, opcionalmente cuarto, tipos de HPV se seleccionan de entre los tipos de HPV16, HVP18, HPV31, HPV33, HPV45, HPV52 y HPV58.
5. La protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho polipeptido heterologo comprende o consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 o 56.
6. La protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, cuya secuencia es como se indica en la SeQ ID NO: 58, 61, 64 o 67.
7. Un polinucleotido que codifica para la protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que preferentemente comprende o consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 57, 60, 63 o 66.
8. Un vector, preferentemente un plasmido, que comprende un polinucleotido de conformidad con la reivindicacion 7 y secuencias de control de expresion, y opcionalmente comprende tambien la secuencia que codifica para el nucleotido cyaC de una cepa de Bordetella, y que preferentemente consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 59, 62, 65 o 68.
9. Un cultivo celular, preferentemente un cultivo de cepa de E. coli, que comprende un polinucleotido de conformidad con la reivindicacion 7 o un vector de conformidad con la reivindicacion 8.
10. Una composicion que comprende al menos una protefna o protefnas quimericas, preferentemente dos protefnas quimericas diferentes, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehfculo farmaceutico apropiado, y opcionalmente al menos un coadyuvante.
11. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 6, que comprende (a) una protefna quimerica, cuyo polipeptido heterologo comprende o consiste en, de N-terminal hacia C terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, la parte C- terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV and la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV, y (b) una protefna quimerica, cuyo polipeptido heterologo comprende o consiste en, de N-terminal hacia C terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, la parte C- terminal de la protefna E7 de un quinto tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un sexto tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho cuarto tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho quinto tipo de HPV y la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho sexto tipo, caracterizada porque dichos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV se eligen (a) de entre HPV16, HPV18, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 o (b) se eligen de entre HPV16, HPV18 y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52.
12. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 10, que comprende (a) una protefna quimerica, cuyo polipeptido heterologo comprende o consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un primer tipo de HPV, la parte C- terminal de la protefna E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un tercer tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un cuarto tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho tercer tipo de HPV y la parte N- terminal de la protefna E7 de dicho cuarto tipo de HPV, y (b) una proteina quimerica, cuyo polipeptido heterologo comprende o consiste en, de N-terminal hacia C terminal, la parte C-terminal de la protefna E7 de un quinto tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteina E7 de un sexto tipo de HPV, la parte C-terminal de la protefna E7 de un septimo tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho quinto tipo de HPV, la parte N-terminal de la protefna E7 de dicho sexto tipo de HPV y la parte N-terminal de la protefna E7 de dichos septimo tipo, caracterizada porque el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y septimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste en (a) HPV31 , HPV33, HPV52, HPV58, HPV16, HPV18 y HPV45, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52, (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52, y (f) HPV16, HPV18, HPV45, HPV33, HPV31, HPV52 y HPV58.
13. Una protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para uso como un medicamento.
14. Una protefna quimerica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para uso en la profilaxis o tratamiento de una infeccion por HPV.
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