CN112912097A - 免疫原性蛋白和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗和预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病的蛋白和组合物。
Description
技术领域
本发明提供了用于治疗和预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病的蛋白和组合物。
背景技术
近年来，甚至在具有高疫苗覆盖率的国家中，也已经观察到由百日咳博德特氏菌引起的疾病的复发。尽管这种复发的确切原因不清楚，但潜在的原因包括免疫力减弱和循环毒株的流行病学变化。
腺苷酸环化酶是百日咳博德特氏菌的关键毒力因子，其破坏正常的细胞功能，并且对于定殖至关重要。腺苷酸环化酶在百日咳博德特氏菌的不同菌株之间广泛保守，实际上在1920年和2010年之间分离的临床菌株间仅观察到单核苷酸多态性(Bart等人，2014)。另外，已经在从百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的感染恢复的患者的血清样品中发现了针对腺苷酸环化酶的抗体。即使不清楚接种疫苗的儿童中的抗腺苷酸环化酶抗体的存在是否可归因于接种疫苗或先前未认识到的博德特氏菌感染(Farfel等人 1989,Arciniega等人 1991)，但其中全细胞和无细胞百日咳疫苗失败的患者具有最小的腺苷酸环化酶抗体应答(Cherry等人2004)。
在小鼠中，用抗腺苷酸环化酶抗体进行的被动免疫针对百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的致死性呼吸道攻击保护小鼠，达到类似于在使用全细胞百日咳疫苗接种疫苗后所见的水平的水平(Guiso等人1989)。另外，来自大肠杆菌的重组腺苷酸环化酶的活性形式针对小鼠肺部的百日咳博德特氏菌感染是保护性的(Cheung等人2006，Mac Donald-Fyall等人2004)。
尽管腺苷酸环化酶具有作为抗原的潜能，但其目前不是无细胞百日咳疫苗的组分，此外，腺苷酸环化酶是一种具有已知损害宿主免疫细胞的功能的酶促活性的溶血素。
因此，仍然需要针对博德特氏菌的感染的改进疫苗，并且本发明的目的是提供可用于开发此类疫苗的蛋白和免疫原性组合物。
发明概述
本发明总体涉及博德特氏菌属腺苷酸环化酶(CyaA或ACT)的新型片段。所述新型片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、15、16、17、18、19、20、21、22或23具有序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的第一个方面，提供了包含以下氨基酸序列或由其组成的多肽：
A-X-B
其中：X是由与SEQ ID NO:2、3、4、15、16或17具有同一性的序列组成的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列。具体地，序列同一性的水平为90%至100%。更具体地，序列同一性的水平为至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。又更具体地，与SEQ ID NO:2、3或4的序列同一性的水平为100%。具体地，A和B是任选的序列，其不是衍生自腺苷酸环化酶、特别是SEQ ID NO:1的腺苷酸环化酶或其三个或更多个连续氨基酸(例如4、5、6、7、8、9、10个连续氨基酸)的片段。如本文所用，在本发明的上下文中提及“不是衍生”意指任选的序列A和/或B不与作为SEQ ID NO:1提供的腺苷酸环化酶的天然存在的序列对应，源自作为SEQ IDNO:1提供的腺苷酸环化酶的天然存在的序列或以其他方式与作为SEQ ID NO:1提供的腺苷酸环化酶的天然存在的序列共有显著的序列同一性，例如小于50%、小于45%、小于40%、小于35%或小于30%序列同一性。
在一些实施方案中，不存在A和B。在此类实施方案中，第一个方面的多肽可以由与SEQ ID NO:2、3、4、15、16或17具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性或100%同一性的序列组成。
在一些实施方案中，存在A或B中的至少一个，例如存在单独的A，单独的B或A和B两者。在一些实施方案中，A和/或B是组氨酸标签，例如，A和/或B是Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更大。因此，在一些实施方案中，所述多肽由与SEQ ID NO:5、6、7、8、21、22或23具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的序列组成。具体地，所述多肽由与SEQ ID NO:23具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的序列组成。
具体地，在免疫后，第一个方面的多肽能够引发包含结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的腺苷酸环化酶蛋白的抗体的抗体应答。
在本发明的第二个方面，提供了编码根据第一个方面的多肽的核酸。
在本发明的第三个方面，提供了包含根据第二个方面的核酸的细菌。更具体地，提供了细菌，其包含根据第二个方面的核酸并且表达或能够表达根据第一个方面的多肽。
在本发明的第四个方面，提供了免疫原性组合物，其包含根据第一个方面的多肽或根据第二个方面的核酸。具体地，所述免疫原性组合物包含佐剂。又更具体地，所述免疫原性组合物包含二价金属盐。仍又更具体地，所述免疫原性组合物将包含二价金属盐，其中所述二价金属盐是钙盐，例如氯化钙。
在本发明的第五个方面，提供了根据第一个方面的多肽、根据第二个方面的核酸或根据第四个方面的免疫原性组合物，其用于疗法中。具体地，根据第一个方面的多肽、根据第二个方面的核酸或根据第四个方面的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由博德特氏菌属、例如百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染。
在本发明的第六个方面，提供了治疗或预防哺乳动物中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法，其包括施用有效量的根据第一个方面的多肽、根据第二个方面的核酸或根据第四个方面的免疫原性组合物。
附图简述
图1：百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的结构。突出显示的两个赖氨酸残基可以由共表达的蛋白酰基转移酶CyaC棕榈酰化。片段(1)：腺苷酸环化酶的AC结构域，从残基1至残基400 (SEQ ID NO:15)；片段(2)：腺苷酸环化酶的AC结构域，从残基1至残基400，指示在残基188和189之间的GS插入(SEQ ID NO:16)；片段(3)：腺苷酸环化酶的AC结构域，从残基360至残基493 (SEQ ID NO:17)；片段(4)：腺苷酸环化酶的RTX片段，从残基985至残基1681(SEQ ID NO:2)
图2：在pH 7.4下，多肽片段被充分吸附至Al(OH)3上。关键词：1、2 –单独的片段(NC，C)；3、4 – Al(OH)3中的片段(NC, C)；5,6 –像对于具有AL(OH)3的制剂一样处理的单独片段(NC,C)；NC –非离心；C –离心(上清液)。在具有Al(OH)3的制剂的上清液中没有片段(第3行和第4行)表明该片段被充分吸附。第5行和第6行表明在具有Al(OH)3的制剂的条件下多肽片段没有可见的降解。
图3：甚至在AS01存在的情况下，也检测到在wo/w EGTA的情况下折叠/未折叠构象的多肽片段。(1)观察到单独的片段的典型峰(Tm ~ 70℃)；(2)在AS01或AS01缓冲液存在的情况下，片段峰得到保留(有点较低的Tm)→AS01缓冲液对于片段不是最佳，但二级结构得到保留(折叠状态)；(3)在EGTA存在的情况下，甚至在AS01存在的情况下，也观察到片段峰的损失和典型Tm – 二级结构未保留；(4)当用Al(OH)3配制时，观察到片段峰的损失 – 多肽片段吸附在表面。
图4：多肽片段的纯化结果(实施例1)。
图5：腺苷酸环化酶毒素细胞毒性血清-中和测定的结果(实施例3)。
图6：提供实施例4中描述的免疫时间表的示意图。
图7：在用全长腺苷酸环化酶或RTX片段免疫后，在7PII(第28天)通过ELISA测量的个别血清抗体滴度(抗ACT IgG)。
图8：在7PII(第28天)通过ELISA测量的个别血清抗体滴度(抗ACT IgG)。
图9(a)和(b)：由不同疫苗诱导的针对百日咳博德特氏菌鼻内攻击的保护效力。如图9(a)中所示，PRN的量足够高，足以诱导完全保护。相对于未接种疫苗的组，所有研究的制剂以及Infanrix都降低CFU数。如图9(b)中所示，相对于未接种疫苗组，所有研究的制剂以及Infanrix 1/4 HD组(阳性对照)降低CFU数。在Infanrix 1/4 HD组(阳性对照)和DTPa 1/80HD(有/无片段RTX组)(其中GMR大于500)之间观察到高显著差异。
图10：在以下条件下的SEQ ID NO:21的表达：大肠杆菌菌株：B834(DE3)，IPTG浓度：1mM，诱导：16℃，过夜。(1)分子量标记；(2)未诱导；(3)诱导。
图11：SEQ ID NO:21的纯化。(1)分子量标记；(2) 5µg蛋白；(3) 2µg蛋白；(4) 1µg蛋白；(6)大肠杆菌裂解物1µl。
图12：在以下条件下的SEQ ID NO:22的表达：表达条件：大肠杆菌菌株：B834(DE3)，IPTG浓度：1mM，诱导：37℃，3h。(1)分子量标记；(2)未诱导；(3)诱导；(4)未诱导；(5)诱导。
图13：SEQ ID NO:22的纯化。(1)分子量标记；(2) 5µg蛋白；(3) 2µg蛋白；(4) 1µg蛋白；(5)大肠杆菌裂解物1µl。
详述
本发明尤其涉及用作抗原的腺苷酸环化酶的片段。腺苷酸环化酶是一种多功能蛋白，其具有1706个氨基酸的长度(Sebo等人, 2014)。其由N-末端酶促腺苷酸环化酶(AC)结构域(残基1-400)、疏水成孔结构域(残基500-700)、脂肪酰基-修饰的结构域(残基800-1000)、钙-结合毒素中重复(RTX)结构域(残基1000-1600)和C-末端未切割的分泌信号组成(图1)。C-末端的1300个残基也被称为溶血素(Hly)部分。Hly部分通过RTX结构域中的整联蛋白-结合区域结合宿主细胞上的补体受体3，并使得AC结构域能够易位至宿主细胞胞质溶胶中，导致不受调节的ATP至cAMP的转化。另外，成孔结构域可以寡聚化并在宿主细胞膜中形成小的阳离子-选择性孔，导致中度溶血。
发明人现在已经成功地鉴定了全长腺苷酸环化酶(SEQ ID NO:1)的片段，其保留免疫原性，同时避免与全长蛋白相关的毒性、诸如溶血。
含有负责保护的表位的腺苷酸环化酶的片段作为本文的SEQ ID NO:2、3、4、15、16、17、18、19、20、21、22或23提供。
SEQ ID NO:2的氨基酸序列是696个氨基酸片段，其等同于SEQ ID NO:1中给出的野生型腺苷酸环化酶序列的残基985至残基1681的氨基酸。SEQ ID NO:3和4分别包含一个或两个额外的甘氨酸残基。SEQ ID NO:23包括N-末端甲硫氨酸残基。
SEQ ID NO:15的氨基酸序列是等同于SEQ ID NO:1中给出的野生型腺苷酸环化酶序列的残基1至残基400的氨基酸的氨基酸片段(与SEQ ID NO:1的位置1对应的甲硫氨酸残基未显示于SEQ ID NO:15中，但在本发明的一些实施方案中，可以作为N末端序列‘A’被包括。
SEQ ID NO:16的氨基酸序列是等同于SEQ ID NO:1中给出的野生型腺苷酸环化酶序列的残基1至残基400的氨基酸的氨基酸片段，其进一步包含在SEQ ID NO:1的残基188和189之间的GS插入(与SEQ ID NO:1的位置1对应的甲硫氨酸残基未显示于SEQ ID NO:16中，但在本发明的一些实施方案中，可以作为N末端序列‘A’被包括)。
SEQ ID NO:17的氨基酸序列是等同于SEQ ID NO:1中给出的野生型腺苷酸环化酶序列的残基360至残基493的氨基酸的氨基酸片段(在本发明的一些实施方案中，甲硫氨酸残基可以作为N末端序列‘A’包括)。
因此，根据本发明，提供了包含以下氨基酸序列的多肽：
A-X-B
其中：X是由与SEQ ID NO:2、3、4、15、16或17具有至少90%同一性的序列组成的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列，且其中A和B不是衍生自腺苷酸环化酶或其片段。
在涉及RTX片段的实施方案中，具体地，X是具有来自SEQ ID NO:1的不超过698个连续氨基酸的氨基酸序列。更具体地，X是具有来自SEQ ID NO:1的691至698个连续氨基酸的氨基酸序列。又更具体地，X是具有来自SEQ ID NO:1的至少691至不超过698个连续氨基酸的氨基酸序列。仍又更具体地，此类RTX片段与SEQ ID NO:2、3或4具有至少90%同一性、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。
在涉及AC结构域片段的实施方案中，具体地，X是具有来自SEQ ID NO:1的不超过400个连续氨基酸的氨基酸序列。更具体地，X是具有来自SEQ ID NO:1的少于400个连续氨基酸的氨基酸序列。仍又更具体地，X与SEQ ID NO:15、16或17具有至少90%同一性、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%%、至少99%或100%同一性。
序列同一性使用逐对比对算法进行确定，每个从N-末端向C-末端移动x个氨基酸的窗口(使得对于延伸至p个氨基酸的比对，当p>x时，存在p-x+1 个此类窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；且如果x·y不是整数，则将其四舍五入至(rounded up to)最近的整数。优选的成对比对算法是 Needleman-Wunsch整体比对算法[1]，使用默认参数(例如使用缺口开放罚分＝10.0，且使用缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。该算法以EMBOSS软件包中的needle工具方便地执行[2]。关于本发明的序列，这些是腺苷酸环化酶的片段，应当相对于并沿着较长序列的整个(即全长)长度，例如全长或野生型序列，计算序列同一性。
为了避免疑问，特别地从本发明的范围排除百日咳博德特氏菌的全长、天然、腺苷酸环化酶的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1。
–A-或–B-的氨基酸序列将通常是短的(例如20个或更少氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括促进克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Gly n ，其中n = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和组氨酸标签(即His n ，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员将是显而易见的。有用的接头是GSGS (SEQ ID NO:9)、GSGGGG (SEQ ID NO:10)或GSGSGGGG(SEQ ID NO:11)，其中Gly-Ser二肽由BamHI限制性位点形成，因此有助于克隆和操作，且(Gly)4四肽是典型的多甘氨酸接头。其他合适的接头包括Leu-Glu二肽或Gly-Ser。接头可以含有至少一个甘氨酸残基以促进结构柔性，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个甘氨酸残基。此类甘氨酸可以被排列为在Gly-Gly二肽序列或更长的寡-Gly序列(即Glyn，其中n= 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)中包括至少两个连续的甘氨酸。
-A-是任选的N-末端氨基酸序列。这通常是短的(例如，40个或更少氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括引导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即His n ，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。在一些实施方案中，-A-是来自NspA(脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白)的异源信号肽。所述信号肽可以包括来自NspA的一个或两个额外的氨基酸以优化信号肽切割。其他合适的N-末端氨基酸序列对本领域技术人员将是显而易见的。如果X缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，则-A-优选是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，例如Met-Ala-Ser或单个Met残基。在新生的多肽中，-A-部分可以提供多肽的N-末端甲硫氨酸(细菌中的甲酰基-甲硫氨酸，fMet)。例如，当X是SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、15、16或17时，在某些实施方案中，设想-A-可以提供或可以是这种N-末端甲硫氨酸(例如，作为SEQ ID NO:18、19、20、21或22)。然而，可以从新生的-A-部分的N-末端切割一个或多个氨基酸，使得本发明的成熟多肽中的-A-部分不必包括N-末端甲硫氨酸。
-B-是任选的C-末端氨基酸序列。这通常是短的(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括引导蛋白运输的前导序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即His n ，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或增强多肽稳定性的序列。适合用于本发明中的具体His标签包括GGHHHHHH (SEQ IDNO:12)、GHHHHHH (SEQ ID NO:13)、HHHHHH (SEQ ID NO:14)等。其他合适的C-末端氨基酸序列对本领域技术人员将是显而易见的，诸如谷胱甘肽-S-转移酶，硫氧还蛋白，金黄色葡萄球菌蛋白A的14kDa片段，生物素化肽，麦芽糖-结合蛋白，肠激酶标记等。
包括-A-和/或-B-的本发明的多肽片段包括SEQ ID NO:5、6、7、8、18、19、20、21、22或23。合适的包括-A-和/或–B-的片段或多肽可以由与SEQ ID NO:5、6、7、8、18、19、20、21、22或23的序列具有至少90%序列同一性、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多肽组成。
如上所讨论，本发明的多肽可以在-N和/或-C末端包含额外的多肽序列，其不是衍生自SEQ ID NO:1的腺苷酸环化酶。因此，对不是衍生自腺苷酸环化酶的此类多肽序列的提及可以理解为意指额外的多肽序列不包含SEQ ID NO:1的三个或更多个、例如四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个连续氨基酸的连续序列。
“表位”是多肽的一部分，其被免疫系统识别并引发免疫应答。因此，本发明的多肽包含表位，当施用于受试者时，所述表位将引发抗体应答，所述抗体应答包含结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野生型腺苷酸环化酶蛋白的抗体。因此，本发明的多肽能够与SEQ IDNO:1竞争结合针对SEQ ID NO:1产生的抗体。
可以使用标准免疫方法容易地生成针对本发明的多肽的抗体，并且可以使用标准测定法、诸如ELISA测定法评价这些抗体结合SEQ ID NO:1的野生型腺苷酸环化酶蛋白的能力。类似地，可以使用本领域中已知的竞争测定技术(包括平衡方法，诸如ELISA，动力学方法，诸如BIACORE®和通过流式细胞术方法)容易地确定多肽与针对野生型腺苷酸环化酶蛋白产生的抗体竞争的能力。与SEQ ID NO:1的野生型腺苷酸环化酶蛋白竞争结合抗体的多肽将引起与不存在多肽时相比，观察到的野生型蛋白与抗体的总结合的减少。通常，与对于具有SEQ ID NO:1的蛋白观察到的抗体结合相比，在本发明的多肽存在的情况下，这种结合减少为10%或更大，20%或更大，30%或更大，40%或更大，60%或更大，例如结合减少70%或更大。还可以在本领域中已知的动物模型中证实本发明的多肽诱导针对百日咳博德特氏菌的菌株的保护的能力。
与SEQ ID NO:1相比，本发明的多肽可以包括至少一个，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个保守氨基酸替换，即用具有相关侧链的另一个氨基酸替换一个氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性氨基酸，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳香族氨基酸。通常，这些家族内的单一氨基酸的取代对生物活性不具有主要影响。
相对于SEQ ID NO:1的片段，本发明的多肽可以具有至少一个，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个单一氨基酸缺失。
相对于SEQ ID NO:1的等同序列，所述多肽还可以包括至少一个，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个插入。例如，涉及腺苷酸环化酶的AC结构域的片段的某些实施方案将包含修饰以敲除或降低该结构域的功能或活性，例如钙调蛋白活性(Ladant D,Glaser P, Ullmann A. J. Biol. Chem. 1992, 267:2244-50)。包含插入的本发明的片段和多肽的具体实例包括SEQ ID NO:16、19和21。相对于SEQ ID NO:1，这些序列在残基188和189之间包含GS(甘氨酸-丝氨酸)插入。可以通过本领域中已知的测定，例如，如Fiser等人JBiol Chem. 2007 Feb 2;282(5):2808-20中所公开，测定AC结构域的活性或功能。
可以以技术人员已知的许多方式来制备本发明的多肽，例如，通过化学合成(全部或部分)，通过使用蛋白酶消化更长的多肽，通过从RNA翻译，通过从细胞培养物(例如从重组表达)、从生物本身(例如在细菌培养后或直接从患者)纯化等。具体地，可以使用生物合成，例如所述多肽可以通过翻译产生。这可以在体外或体内实施。多肽可以在C-末端和/或N-末端具有共价修饰。多肽可采取各种形式(例如天然的、融合体、糖基化、非糖基化、脂化(lipidated)、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、颗粒、变性的等)。
多肽优选以纯化或基本纯化形式(即基本不含其他肽(例如，不含天然存在的多肽)，特别是不含其他博德特氏菌或宿主细胞多肽)提供，并且通常至少约50%纯(以重量计)，且通常至少约90%纯，例如至少约91%纯(以重量计)，至少约92%纯(以重量计)，至少约93%纯(以重量计)，至少约94%纯(以重量计)，至少约95%纯(以重量计)，至少约96%纯(以重量计)，至少约97%纯(以重量计)，至少约98%纯(以重量计)，至少约99%纯(以重量计)，至少约99.5%纯(以重量计)，至少约99.9%纯(以重量计)，即组合物的少于约50%，且更优选少于约10%(例如5%或更少)由其他表达的肽构成。
多肽可以附接至固体支持物。多肽可以包含可检测标记物(例如放射性或荧光标记物或生物素标记物)。多肽可以是天然或非天然糖基化的(即，所述多肽所具有的糖基化模式不同于在相应的天然存在的多肽中发现的糖基化模式)。
本发明还提供了用于产生本发明的多肽的方法，其包括在诱导多肽表达的条件下培养本发明的细菌。尽管多肽的表达可以在博德特氏菌细菌中发生，但本发明可使用异源宿主用于表达。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。它将通常是大肠杆菌，但其他合适的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。
本发明还提供了用于产生本发明的多肽的方法，其中所述多肽使用化学方式部分或全部合成。
本发明还提供了包含至少一种本发明的多肽的组合物。
核酸
本发明还提供了核酸，其包含编码本发明的多肽或杂合多肽的核苷酸序列。
例如，本发明提供了核酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。为了避免疑问，编码全长腺苷酸环化酶(例如SEQ ID NO:1)的核酸序列不是本发明的一部分，并且被排除在外。本发明还提供了核酸，其包含与此类核苷酸序列具有序列同一性的核苷酸序列。此类核酸包括使用替代密码子来编码相同氨基酸的那些。具体而言，核酸可以含有经优化用于在特定微生物、例如大肠杆菌中表达的替代密码子。
本发明还提供了可以与这些核酸杂交的核酸。杂交反应可以在不同的“严格性”的条件下进行。增加杂交反应的严格性的条件是本领域中广泛已知和公开的。相关条件的实例包括(以严格性递增的顺序)：孵育温度为25℃、37℃、50℃、55℃和68℃；缓冲液浓度为10x SSC、6 x SSC、1 x SSC、0.1 x SSC(其中SSC是0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸盐缓冲液)及使用其他缓冲液系统的其等同物；甲酰胺浓度为0%、25%、50%和75%；孵育时间为5分钟至24小时；1、2或更多个洗涤步骤；洗涤孵育时间为1、2或15分钟；和6 x SSC、1 x SSC、0.1 xSSC或去离子水的洗涤溶液。杂交技术及其优化是本领域中众所周知的[例如参见参考文献3和32，等]。
本发明包括核酸，其包含与这些序列互补的序列(例如用于反义或探测，或用作引物)。
根据本发明的核酸可以采用各种形式(例如，单链的、双链的、载体、引物、探针、标记的等)。本发明的核酸可以是环状或支链的，但通常将是线性的。除非另有指明或要求，否则利用核酸的本发明的任何实施方案可以利用双链形式和构成双链形式的两种互补单链形式中的每一个。引物和探针通常是单链的，反义核酸也是如此。
本发明的核酸优选以纯化或基本纯化形式(即基本不含其他核酸(例如，不含天然存在的核酸)，特别是不含其他博德特氏菌或宿主细胞核酸)提供，通常为至少约50%纯(以重量计)，且通常至少约90%纯。
可以许多方式制备本发明的核酸，例如，通过完全或部分化学合成(例如，DNA的亚磷酰胺合成)，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸，通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)，来自基因组或cDNA文库等。
本发明的核酸可以附接至固体支持物(例如珠粒、板、滤膜、薄膜、载片、微阵列支持物、树脂等)。本发明的核酸可以进行标记，例如，用放射性或荧光标记物或生物素标记物进行标记。在将核酸用于检测技术中的情况下，例如，在核酸是引物或作为探针的情况下，这是特别有用的。
本发明的核酸可以是载体的一部分，即，经设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是，例如，经设计用于分离、传播和复制插入的核苷酸的“克隆载体”，经设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，经设计用于导致产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或包含多于一种类型的载体的属性的“穿梭载体”。优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括可以是或已经是外源核酸的受体的个别细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或故意的突变和/或改变，后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA互补序列方面)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的核酸转染或感染的细胞。
可以使用本发明的核酸，例如：以在体外或体内产生多肽；作为用于检测生物样品中的核酸的杂交探针；以生成核酸的额外拷贝；以生成核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链的寡核苷酸。
本发明提供了包含本发明的核苷酸序列的载体(例如克隆或表达载体)以及用此类载体转化的细菌和其他宿主细胞。
免疫原性组合物
本发明的多肽可用作免疫原性组合物中的活性成分。术语“免疫原性组合物”广泛地指可以施用以引发针对组合物中存在的抗原的免疫应答、诸如抗体或细胞免疫应答的任何组合物。因此，本发明的组合物是免疫原性的。当免疫原性组合物预防、改善、减轻或消除受试者的疾病时，则此类组合物可以称为疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但将通常是预防性的。如在本发明的上下文中使用的术语“预防感染”意指受试者的免疫系统已经被引发(例如通过接种疫苗)以触发免疫应答并排斥感染。因此，对于本领域技术人员将清楚的是，接种疫苗的受试者因此可以被感染，但与对照受试者相比更好地能够排斥感染。在某些实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。术语“抗原”是指当施用于受试者时，引发针对该物质的免疫应答的物质。在本发明的上下文中，本发明的多肽是抗原。优选地，所述抗原是使用重组DNA技术制备或制造的重组抗原。具体地，当施用于受试者时，免疫原性组合物引发针对博德特氏菌和更具体地针对SEQ ID NO:1的片段的免疫应答。具体地，针对博德特氏菌的免疫应答是保护性的，即，其可以预防或减少由博德特氏菌、具体地百日咳博德特氏菌引起的感染、疾病或定殖。组合物因此可以是药学上可接受的。它们将通常包含除了所述抗原以外的组分，例如它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。组合物将通常以水性形式施用于哺乳动物。然而，在施用前，该组合物可能已经呈非水性形式。例如，尽管一些疫苗以水性形式制备，然后也以水性形式填装和分销和施用，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重构成水性形式。因此，本发明的组合物可以是干燥的，诸如冻干制剂。
所述组合物可包含防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选的是，疫苗应当基本不含(即少于5μg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为了控制涨度，优选包含生理盐，诸如钠盐。可使用氯化钠(NaCl)，其可以以1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl存在。可存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
本发明的免疫原性组合物可以包含二价金属盐，更特别是钙盐，仍更特别是氯化钙。Ca2+的存在可能对于维持本发明的多肽片段的构象有用。
组合物将通常具有200 mOsm/kg至400 mOsm/kg，优选240-360 mOsm/kg的摩尔渗透压浓度(osmolality)，且将更优选落在290-310 mOsm/kg的范围内。在一些实施方案中，所述组合物可以是高渗的，例如具有约700mOsm/Kg的摩尔渗透压浓度。
组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris 缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。通常将包括在5-20mM范围内的缓冲剂。
组合物的pH将通常为5.0至8.1，且更通常6.0至8.0，例如6.5至7.5，或7.0至7.8。
所述组合物优选是无菌的。所述组合物优选是无热原的，例如每剂量含有<1 EU(内毒素单位，标准量度)，且优选每剂量<0.1 EU。所述组合物优选不含谷蛋白。
所述组合物可包含用于单次免疫的材料，或者可包含用于多次免疫的材料(即‘多剂量’试剂盒)。多剂量配置优选包含防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或除此以外)，所述组合物可盛放在具有用于移取材料的无菌接头的容器中。
人疫苗通常以约0.5ml的剂量体积施用，尽管可以向儿童施用一半剂量(即约0.25ml)。
本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。优选地，所述免疫调节剂中的一种或多种包括一种或多种佐剂。所述佐剂可以包括TH1佐剂和/或TH2佐剂，进一步讨论如下。
可用于本发明的组合物中的佐剂包括含有矿物质的组合物，诸如铝盐和钙盐。本发明的组合物可以包括无机盐，诸如氢氧化物(例如羟基氧化物)，磷酸盐(例如羟基磷酸盐，正磷酸盐)，硫酸盐等[例如参见参考文献4的第8章和第9章]，或不同矿物质化合物的混合物，其中所述化合物采用任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形等)。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒。
称为“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝盐(aluminum oxyhydroxide salts)，其通常至少为部分结晶的。可以通过红外(IR)光谱，特别是通过在1070cm-1处的吸收带和在3090-3100cm-1处的强肩的存在，将可以通过式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其他铝化合物(诸如氢氧化铝Al(OH)3)区别开[参考文献4的第9章]。氢氧化铝佐剂的结晶度由半高处的衍射带的宽度(WHH)反映，其中结晶较差的颗粒由于较小的结晶大小而显示较大的线变宽。表面积随WHH增加而增加，并且已经看到具有更高WHH值的佐剂具有更大的抗原吸附能力。纤维形态(例如，如透射电子显微图中所见)对于氢氧化铝佐剂是典型的。氢氧化铝佐剂的pI通常是约11，即佐剂本身在生理pH下具有表面正电荷。已经报道，pH7.4时氢氧化铝佐剂的吸附能力为1.8-2.6 mg蛋白/mg Al+++。
称为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸盐(即羟基磷酸铝硫酸盐)。它们可通过沉淀获得，且沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。羟基磷酸盐通常具有0.3至1.2的PO4/Al摩尔比。羟基磷酸盐可以通过羟基基团的存在与严格的AlPO4区别开。例如，在3164cm-1处的IR谱带(例如，当加热至200ºC时)表明结构羟基的存在[参考文献4的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比将通常为0.3至1.2，优选0.8至1.2，并且更优选0.95+0.1。磷酸铝通常将是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84至0.92的无定形的羟基磷酸铝，其以0.6mg Al3+/ml包括。磷酸铝将通常是颗粒(例如透射电子显微图中所见的板状形态)。在任何抗原吸附后，颗粒的典型直径在0.5-20μm的范围(例如约5-10μm)。对于磷酸铝佐剂，已经报道在pH7.4的0.7-1.5 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根对羟基的取代程度负相关，且这种取代程度可取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而不同。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更酸性PZC)或通过添加缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝将通常具有4.0至7.0，更优选5.0至6.5，例如约5.7的PZC。
用于制备本发明的组合物的铝盐悬浮液可含有缓冲剂(例如，磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)，但这不总是必要的。所述悬浮液优选无菌且无热原的。悬浮液可包括游离的水性磷酸根离子，例如以1.0至20mM、优选5至15 mM、且更优选约10 mM的浓度存在。所述悬浮液还可以包含氯化钠。
在一个实施方案中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物。在这种情况下，可以存在比氢氧化铝更多的磷酸铝，例如重量比为至少2:1，例如，≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。
施用于患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选的范围是0.3-1mg/ml。优选<0.85mg/剂量的最大值。
本发明的多肽可以被吸附至铝佐剂、诸如Al(OH)3。
适用作本发明中的佐剂的油乳液组合物包括角鲨烯-水乳液，诸如MF59 [参考文献4的第10章；还参见参考文献5](5%角鲨烯、0.5% Tween 80和0.5% Span 85，使用微流化器配制为亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
AS01是佐剂系统，其含有MPL(3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A)、QS21((皂树(Quillaja saponaria Molina)，级分21) Antigenics，New York，NY，USA)和脂质体。AS01B是含有MPL、QS21和脂质体(50 µg MPL和50 µg QS21)的佐剂系统。AS01E是含有MPL、QS21和脂质体(25 µg MPL和25 µg QS21)的佐剂系统。在一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS01。在另一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS01B或AS01E。在一个具体实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含AS01E。
皂苷制剂也可以用作本发明中的佐剂。皂苷是在许多植物物种的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树的树皮的皂苷。也可商业获得来自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)的皂苷。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂诸如QS21，以及脂质制剂，诸如ISCOM。QS21作为Stimulon™销售。
已使用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，所述皂苷为QS21。产生QS21的方法公开于参考文献6中。皂苷制剂也可包含甾醇，诸如胆固醇[7]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成被称为免疫刺激性复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献4的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。优选地，ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献7-9中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含额外的去污剂[10]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可见于参考文献11和12中。
适用于本发明中的其他佐剂包括细菌或微生物衍生物，诸如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物和细菌外膜囊泡(OMV)。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式公开于参考文献13中。3dMPL的此类“小颗粒”小到足以通过0.22μm膜无菌过滤[13]。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，诸如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物，例如RC-529 [14,15]。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A的衍生物，诸如OM-174。例如参考文献16和17中描述了OM-174。参考文献18-20中描述了适合用作佐剂的脂质体制剂的实例。
在某些实施方案中，组合物中的抗原和佐剂在递送给患者时处于混合物中。在某些实施方案中，所述佐剂和抗原可以分开保持在包装或分配的疫苗中，以备用于在使用时最终配制。所述抗原可以呈水性或冻干形式，使得最终通过在施用前混合两种组分来制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比可以变化(例如在5∶1和1∶5之间)，但通常为约1∶1。
本发明还可以包含以上鉴定的佐剂中的一种或多种的方面的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明中：(1)皂苷和水包油乳剂[21]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[22]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21) + 3dMPL + IL-12 (任选地 + 甾醇)[23]；(5) 3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[24]。
可以各种形式制备本发明的组合物。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾-冷冻干燥组合物)。所述组合物可以制备用于局部施用，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末剂。可将所述组合物制备为使用细粉或喷雾进行肺部施用，例如作为吸入剂。可将所述组合物制备用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如作为滴剂。所述组合物可以呈试剂盒形式，设计使得在临施用于患者之前重构组合的组合物。此类试剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。
当组合物在使用前临时制备(例如，当组分以冻干形式呈现时)且作为试剂盒呈现时，该试剂盒可包括两个小瓶，或者其可包括一个已填充(ready-filled)的注射器和一个小瓶，其中注射器的内容物用于在注射前重新活化小瓶的内容物。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原，以及如所需的任何其他组分。“免疫有效量”意指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医疗情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽的范围内。
治疗方法和疫苗的施用
本发明还提供了用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法，其包括施用有效量的如上所述的多肽、核酸或免疫原性组合物的步骤。所述免疫应答优选是保护性的，并且优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以产生加强应答。
本发明还提供了上述多肽、核酸或免疫原性组合物，其用作药物，例如，用于在哺乳动物中产生免疫应答。
本发明还提供了上述多肽、核酸或免疫原性组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的用途。
通过经由这些用途和方法在哺乳动物中产生免疫应答，可以针对由博德特氏菌属、特别是百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染、例如针对百日咳保护哺乳动物。
本发明还提供了用本发明的免疫原性组合物预填充的递送装置。
所述哺乳动物优选是人。所述人可以是儿童、少年或成人。所述儿童可小于一岁，例如0至60日龄、0至8周、例如7周龄、二至十八个月龄、例如二、三、四、五、六、十五、十六、十七、十八个月龄的新生儿。本发明的免疫原性组合物可以用作加强疫苗，例如，在四至六岁(美国时间表)施用。在英国，百日咳疫苗在2、3和4个月时给予，其中学龄前加强在3岁4个月。
本发明的组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙)完成。在一些实施方案中，可以使用粘膜施用。
剂量可通过单剂量时间表或多剂量时间表施用。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径(例如肠胃外引发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等)给予。多个剂量将通常间隔至少1周 (例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16 周等)进行施用。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人两者。因此，人患者可以小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。用于接受疫苗的优选患者是青少年(例如13-20岁)，孕妇，和老年人(例如>50岁，>60岁，且优选>65岁)。然而，所述疫苗并非仅适合用于这些组，并且可以更通常在群体中使用。
与其他抗原组合
本发明的多肽可以与其他抗原组合使用。因此，本发明提供了包含以下的组合的免疫原性组合物：
(1)如上所讨论的本发明的多肽；和
(2)一种或多种选自以下的抗原：白喉类毒素；破伤风类毒素；一种或多种百日咳抗原；乙型肝炎病毒表面抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒抗原；来自流感嗜血杆菌的血清群B的荚膜糖抗原的缀合物；一种或多种RSV抗原。
白喉类毒素可以通过处理(例如使用甲醛)来自白喉棒状杆菌的白喉毒素而获得。白喉类毒素更详细地公开于例如参考文献25的第13章中。
破伤风类毒素可以通过处理(例如使用甲醛)来自破伤风梭菌的破伤风毒素而获得。破伤风类毒素更详细地公开于参考文献25的第27章中。
疫苗中的百日咳抗原是细胞的(全细胞，Pw)或无细胞的(Pa)。本发明可以使用任一种百日咳抗原。充分记录了细胞百日咳抗原的制备(例如参见参考文献25的第21章)，例如，其可以通过热灭活百日咳博德特氏菌的I期培养物而获得。无细胞百日咳抗原包含特定纯化的百日咳博德特氏菌抗原，其从天然细菌纯化或在重组宿主中表达后纯化。通常使用多于一种无细胞抗原，并且因此组合物可以包括以下众所周知和充分表征的百日咳博德特氏菌抗原中的一种、两种或三种：(1)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或‘PT’)，包括基因脱毒的百日咳类毒素；(2)丝状血凝素(‘FHA’)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为‘69千道尔顿外膜蛋白’)。FHA和百日咳杆菌粘附素可以在根据本发明使用之前用甲醛处理。PT可以通过用甲醛和/或戊二醛处理来脱毒，但作为该化学脱毒程序的替代方案，其可以是突变PT，其中已经通过诱变降低酶促活性[26]。可以使用的另外的无细胞百日咳抗原包括菌毛 (例如凝集原2和3)。
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒的衣壳的主要组分。其可以通过在酵母、诸如酿酒酵母中重组表达而方便地产生。
灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原从在细胞培养物上生长的病毒制备，且然后被灭活(例如，使用甲醛)。因为脊髓灰质炎可以由三种类型的脊髓灰质炎病毒之一引起，如参考文献25的第24章中所解释，因此组合物可以包括三种脊髓灰质炎病毒抗原：1型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney毒株)，2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1毒株)，和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett毒株)。
当组合物包括组分(2)中的白喉类毒素、破伤风类毒素或无细胞百日咳抗原之一时，则其将通常包括它们中的所有三种，即组分(2)将包括D-T-Pa组合。
当组合物包括组分(2)中的白喉类毒素、破伤风类毒素或细胞百日咳抗原之一时，则其将通常包括它们中的所有三种，即组分(2)将包括D-T-Pw组合。
本发明的具体实施方案– AC结构域片段
在本发明的实施方案中，提供了包含以下氨基酸序列或由其组成的多肽：
A-X-B
其中：X是由与SEQ ID NO:15、16或17具有同一性的序列组成的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列。具体地，序列同一性的水平为90%至100%。更具体地，序列同一性的水平为至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。又更具体地，序列同一性的水平为100%。具体地，A和B是任选的序列，其不是衍生自腺苷酸环化酶、特别是SEQ ID NO:1的腺苷酸环化酶或其三个或更多个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，所述新型片段包含与SEQ IDNO:15、16、17、18、19、20、21或22具有序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案1. 包含以下氨基酸序列的多肽：
A-X-B
其中：X是由与SEQ ID NO:15、16或17具有至少99%同一性的序列组成的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列，且其中，当存在时，A和B不是衍生自腺苷酸环化酶或其片段。
实施方案2. 实施方案1的多肽，其由与SEQ ID NO:15、16、17、18、19或20具有至少99%同一性的序列组成。
实施方案3. 实施方案2的多肽，其由与SEQ ID NO:15、16、17、18、19或20具有100%同一性的序列组成。
实施方案4. 实施方案1的多肽，其中A和/或B是组氨酸标签。
实施方案5. 实施方案4的多肽，其由与SEQ ID NO:21或22具有至少99%同一性的序列组成。
实施方案6. 实施方案5的多肽，其由与SEQ ID NO:21或22具有100%同一性的序列组成。
实施方案7. 实施方案1至6中任一项的多肽，其能够引发抗体应答，所述抗体应答包含结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的腺苷酸环化酶蛋白的抗体，例如，如通过腺苷酸环化酶毒素中和测定法所测量，特别是如实施例中所述。
实施方案8. 核酸，其编码根据实施方案1至7中任一项所述的多肽。
实施方案9. 细菌，其包含实施方案8的核酸和/或表达根据实施方案1至7中任一项所述的多肽。
实施方案10. 免疫原性组合物，其包含根据实施方案1至7中任一项所述的多肽或根据权利要求8所述的核酸。
实施方案11. 根据实施方案10所述的免疫原性组合物，其包含佐剂。
实施方案12. 根据实施方案1至7中任一项所述的多肽、根据实施方案8所述的核酸或根据实施方案10至13所述的免疫原性组合物，其用于疗法中。
实施方案13. 根据实施方案1至7中任一项所述的多肽、根据实施方案8所述的核酸或根据实施方案10至13所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染。
实施方案14. 治疗哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法，其包括施用有效量的根据实施方案1至7中任一项所述的多肽、根据实施方案8所述的核酸或根据实施方案10至13所述的免疫原性组合物。
实施方案15. 预防哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法，其包括施用有效量的根据实施方案1至7中任一项所述的多肽、根据实施方案8所述的核酸或根据实施方案10至13所述的免疫原性组合物。
实施方案16. 根据实施方案1至7中任一项所述的多肽、根据实施方案8所述的核酸或根据实施方案10至13所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法中，所述方法包括施用有效量的所述多肽、核酸或免疫原性组合物。
本发明的具体实施方案– RTX片段
在本发明的一些实施方案中，提供了包含以下氨基酸序列或由其组成的多肽：
A-X-B
其中：X是由与SEQ ID NO:2、3或4具有同一性的序列组成的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列。具体地，序列同一性的水平为90%至100%。更具体地，序列同一性的水平为至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。又更具体地，序列同一性的水平为100%。具体地，A和B是任选的序列，其不是衍生自腺苷酸环化酶、特别是SEQ ID NO:1的腺苷酸环化酶或其三个或更多个连续氨基酸的片段。
具体地，当与SEQ ID NO:1相比时，本发明的片段包含至少20个氨基酸、例如至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸或至少25个氨基酸的在C-末端的截短。具体地，当与SEQ ID NO:1相比时，本发明的片段包含至少25个氨基酸的在C-末端的截短。
在一些实施方案中，所述新型片段由与SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7具有序列同一性的氨基酸序列组成。
实施方案17. 分离的多肽，其由氨基酸序列A-X-B组成，其中：A是N末端甲硫氨酸残基，X是选自SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列，且其中不存在B。
实施方案18. 分离的多肽，其与SEQ ID NO:23具有至少95%的序列同一性。
实施方案19. 分离的多肽，其由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。
实施方案20：分离的多肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
实施方案21. 实施方案17至20中任一项的分离的多肽，其用于预防或减少由博德特氏菌属、特别是百日咳博德特氏菌引起的感染或定殖。
实施方案22. 免疫原性组合物，其包含：(i)实施方案17至20中任一项的分离的多肽，(ii)白喉类毒素，(iii)破伤风类毒素，(iv)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或‘PT’)，特别是基因脱毒的百日咳类毒素(PTg)，(v)丝状血凝素(‘FHA’)和(vi)百日咳杆菌粘附素。
实施方案23：免疫原性组合物，其包含：(i)实施方案17至20中任一项的分离的多肽，(ii)白喉类毒素，(iii)破伤风类毒素，(iv)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或‘PT’)，特别是基因脱毒的百日咳类毒素(PTg)，(v)丝状血凝素(‘FHA’)，(vi)百日咳杆菌粘附素，和(vii)灭活的脊髓灰质炎病毒(“IPV”)。
实施方案24. 免疫原性组合物，其包含：(i)实施方案17至20中任一项的分离的多肽，(ii)白喉类毒素，(iii)破伤风类毒素，(iv)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或‘PT’)，特别是基因脱毒的百日咳类毒素(PTg)，(v)丝状血凝素(‘FHA’)，(vi)百日咳杆菌粘附素，(vii)灭活的脊髓灰质炎病毒(“IPV”)，和(viii)Hib缀合物。
实施方案25. 免疫原性组合物，其包含：(i)实施方案17至20中任一项的分离的多肽，(ii)白喉类毒素，(iii)破伤风类毒素，(iv)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或‘PT’)，特别是基因脱毒的百日咳类毒素(PTg)，(v)丝状血凝素(‘FHA’)，(vi)百日咳杆菌粘附素，(vii)灭活的脊髓灰质炎病毒(“IPV”)，(viii)Hib缀合物，和(ix)乙型肝炎表面抗原。
实施方案26. 实施方案22至25中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂，例如AS01，铝盐佐剂和/或TLR激动剂，例如TLR7激动剂。
实施方案27. 实施方案26的免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝盐佐剂，其选自氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝硫酸盐。
实施方案28. 实施方案22至27中任一项的免疫原性组合物，其中所述分离的多肽由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。
实施方案29. 治疗哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法，其包括施用有效量的根据实施方案17至20中任一项所述的多肽或根据实施方案22至28中任一项所述的免疫原性组合物。
实施方案30. 预防哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法，其包括施用有效量的根据实施方案17至20中任一项所述的多肽或根据实施方案22至28中任一项所述的免疫原性组合物。
实施方案31. 根据实施方案17至20中任一项所述的多肽，其用于治疗或预防哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法中，所述方法包括施用有效量的实施方案22至28中任一项的多肽或免疫原性组合物。
通用
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。此类技术在文献中已详细解释，参见例如参考文献27-34等。
上文使用“GI”编号。GI编号，或“GenInfo标识符”，是当将序列添加至其数据库时连续分配至由NCBI处理的每个序列记录的一系列数字。GI编号与序列记录的登录号没有任何相似性。当更新序列(例如，用于校正，或添加更多注释或信息)时，则其接收新的GI编号。因此，与给定GI编号相关的序列从不改变。
当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位。此类表位可以凭经验确定(例如，使用PEPSCAN [35,36]或类似方法)，或可以预测它们(例如，使用Jameson-Wolf抗原性指数[37]、基于矩阵的方法[38]、MAPITOPE[39]、TEPITOPE[40,41]、神经网络[42]、OptiMer & EpiMer[43,44]、ADEPT[45]、Tsites[46]、亲水性[47]、抗原性指数[48]或参考文献49-53中公开的方法等)。表位是由抗体或T-细胞受体的抗原结合位点识别且与之结合的抗原的部分，并且它们也可以被称作“抗原决定簇”。
术语“包含”涵盖“包括”，例如“包含”X的组合物可以包括额外的事物，例如X + Y。单词“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含” Y的组合物可以完全不含Y。在一些实施方式中，术语“包含”是指包括指示的活性剂、诸如所述的多肽，以及包括其他活性剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂、润肤剂、稳定剂等，如医药工业中已知的。在一些实施方式中，术语“基本上由…组成”是指其唯一的活性成分是指示的一种或多种活性成分、例如抗原的组合物，然而，可以包括其他化合物，其用于制剂的稳定、保存等，但不直接参与指示的活性成分的治疗效果。过渡短语“基本上由…组成”的使用意指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤，以及不实质上影响要求保护的发明的基本和新型特征的那些材料或步骤。参见In re Herz，537 F.2d 549，551-52，190 USPQ 461，463(CCPA 1976)(原文中的重点)；还参见MPEP § 2111.03。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由…组成”并不预期解释为等同于“包含”。除非另有明确说明，否则术语“由…组成”及其变化意指限于”。在某些领域中，可以使用术语“包含由…组成的活性成分”代替“基本上由…组成”。
与数值x相关的术语“约”意指，例如，x±10%, x±5%, x±4%, x±3%, x±2%, x±1%。
当方法将施用步骤称为例如(a)、(b)、(c)等时，这些步骤预期是依次的，即步骤(c)在步骤(b)之后，所述步骤(b)之前为步骤(a)。抗体一般对于其靶标是特异性的，即，它们对靶标具有的亲和力将高于无关的对照蛋白，诸如牛血清白蛋白。因此，除非特别说明，否则包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以以任何顺序混合组分。在存在三种组分的情况下，可以将两种组分与彼此组合，且然后可以将该组合与第三种组分组合，等等。
抗体将通常对于其靶标是特异性的。因此，它们对靶标具有的亲和力将高于无关的对照蛋白，诸如牛血清白蛋白。
提到两种氨基酸序列之间的百分比序列同一性意指，当比对时，在两种序列的比较中相同的氨基酸的百分比。该比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域已知的软件程序(例如参考文献54的7.7.18部分中所述的那些程序)来确定。优选的比对通过Smith-Waterman同源性搜索算法确定，其使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚分为12且缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。参考文献55中公开了Smith-Waterman同源性搜索算法。然而，关于片段，序列同一性将通过参考最长序列来测量。通过非限制性解释的方式，尽管长10个氨基酸的片段的序列可能与长100个氨基酸的全长序列的一部分相同，但基于最长序列的长度的序列同一性将是10% (不是当参考最短序列计算时的100%)。
用于实施本发明的模式
实施例1 –多肽的制备
表达质粒和重组菌株
使用NdeI/XhoI限制性位点，通过标准程序的方式，将编码目标蛋白和C-末端的His标签的基因克隆至pET24b(+)表达载体(Novagen)中。根据标准方法，用CaCl2-处理的细胞，通过用适当的重组表达载体转化大肠杆菌B834(DE3)菌株来生成最终构建体(HanahanD. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (编), DNA cloning.IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。
宿主菌株
B834(DE3)：蛋白酶缺陷和甲硫氨酸营养缺陷型菌株。具有名称(DE3)的菌株对于含有IPTG可诱导的T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶源性的。λ DE3溶源体被设计用于从pET载体表达蛋白。该菌株也是lon和ompT蛋白酶缺陷的。
基因型：B834::DE3菌株，F– ompT hsdSB(rB – mB–) gal dcm met (DE3)
RTX片段(SEQ ID NO:8)
如下所述制备与野生型腺苷酸环化酶的残基985至残基1681对应的重组RTX片段。该蛋白被his-标记(GGHHHHHH)并被分泌。该序列含有来自NspA(脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白)的异源信号肽。包括来自该NspA的两个额外的氨基酸以优化信号肽切割。
重组蛋白– RTX片段的表达
从琼脂板剥离大肠杆菌转化体，并用于接种用1% (w/v)葡萄糖和卡那霉素(50 µg/ml)补充的LBT培养液，以获得0.1-0.2之间的620nm处的光密度(O.D620nm)。将培养物在37℃下以250 rpm的搅拌速度孵育过夜。将过夜培养物在含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中稀释至1:20，并在37℃、250 rpm下生长，直至O.D.620nm达到0.5-0.8。
在约0.5-0.8的O.D620nm处，通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白表达，并在37℃、250 rpm下孵育3h。在3h后评估O.D620nm，并将培养物以14 000 rpm离心15分钟。将沉淀分别在-20℃下冷冻。
多肽片段 – RTX片段的纯化
将细菌沉淀重悬浮于具有蛋白酶抑制剂(无EDTA的完全制剂) (Roche AppliedScience, Indianapolis, IN)的裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.3、300mM NaCl，10%甘油，2mM CaCl2、2mM三(2-羧乙基)膦)) (TCEP) (Sigma, St. Louis, MO)中。将细菌在1200PSI通过French Press裂解(3次)，并通过在4℃下以15 000 g离心60 min来沉淀。将硫酸铵(最终18%)添加至上清液中，并在室温下摇动20 min。将溶液在室温下以15 000g离心15min。使用AKTA™ Avant纯化系统将上清液加载至在缓冲液A (20 mM HEPES pH 7.6，500mM NaCl，20mM咪唑，10%甘油，2mM CaCl2，2mM TCEP)中预平衡的5ml His trap HPl (GEHealthcare, Piscataway, NJ)上。然后将柱通过5个柱体积(CV)的缓冲液A洗涤，随后用6CV的缓冲液A洗涤。蛋白使用3CV的缓冲液B (20 mM HEPES pH 7.6、500 mM NaCl、500mM咪唑、10%甘油、2mM CaCl2、2mM TCEP)洗脱。将含有目标蛋白的级分合并在一起，并加载至SUPERDEX TM 200 26/60 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)上。将蛋白用1.5 CV的缓冲液C B (20 mM HEPES pH 7.6、150 mM NaCl、500mM咪唑、5%甘油、2mM CaCl2、1mM TCEP)洗脱。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评价蛋白的纯度。选择含有抗原的级分，并根据通过SDS-PAGE的纯度合并在一起。最后，将蛋白无菌过滤并储存在-80℃。使用RC DC™ (还原剂和去污剂相容)蛋白测定法(Biorad, Hercules, CA)测定蛋白浓度(图4)。
重组蛋白– AC结构域片段的表达
从琼脂板剥离大肠杆菌转化体，并用于接种用1% (w/v)葡萄糖和卡那霉素(50 µg/ml)补充的LBT培养液，以获得0.1-0.2之间的O.D.620nm。将培养物在37℃下以250 rpm的搅拌速度孵育过夜。将过夜培养物在含有卡那霉素(50 µg/ml)的LBT培养基中稀释至1:20，并在37℃、250 rpm下生长，直至O.D.620nm达到0.5-0.8。在约0.5-0.8的O.D620nm，i)通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白表达，并在37℃、250 rpm下孵育3h，ii)将培养物冷却，然后通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导重组蛋白的表达，并在16℃、250rpm下孵育过夜。
在3h /过夜诱导(约16小时)后，评估O.D620nm，将培养物以14 000 rpm离心15分钟，并将沉淀分别冷冻在-20℃。
在以下条件下的SEQ ID NO:21的表达显示于图10中：大肠杆菌菌株：B834(DE3)，IPTG浓度：1mM，诱导：16℃，过夜。(1)分子量标记；(2)未诱导；(3)诱导。在以下条件下的SEQID NO:22的表达显示于图12中：表达条件：大肠杆菌菌株：B834(DE3)，IPTG浓度：1mM，诱导：37℃，3h。(1)分子量标记；(2)未诱导；(3)诱导；(4)未诱导；(5)诱导。
多肽片段– AC结构域片段的纯化
将细菌沉淀重悬浮于具有蛋白酶抑制剂(无EDTA的完全制剂) (Roche AppliedScience, Indianapolis, IN)和125单位/ml的benzonase (Sigma, St. Louis, MO)的裂解缓冲液(20mM HEPES pH 7.6、500mM NaCl、10%甘油、20mM咪唑、5mM MgCl2 (Sigma, St.Louis, MO))中。将细菌通过French Press以1200 PSI裂解(3次)，并通过在4℃下以15000g离心30 min来沉淀。将上清液使用AKTA™ Avant纯化系统加载至在缓冲液A (20 mMHEPES pH 7.6、500 mM NaCl、20mM咪唑、10%甘油)中预平衡的5ml His trap HP (GEHealthcare, Piscataway, NJ)上。然后通过10个柱体积(CV)的缓冲液A洗涤柱。使用3CV缓冲液B(20 mM HEPES pH 7.6、500 mM NaCl、500mM咪唑、10%甘油)洗脱蛋白。将含有目标蛋白的级分合并在一起并加载至SUPERDEX TM 75 26/60 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)上。用1.5CV的缓冲液C B(20 mM HEPES pH 7.6、150 mM NaCl、5%甘油)洗脱蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评价蛋白的纯度。选择含有抗原的级分，并基于通过SDS-PAGE的纯度合并在一起。最后，将蛋白无菌过滤并储存在-80℃。使用RC DC™(还原剂和去污剂相容)蛋白测定法(Biorad, Hercules, CA)测定蛋白浓度。SEQ ID NO:21的纯化结果提供于图11中。SEQ ID NO:22的纯化结果提供于图13中。
实施例2 –用Al(OH)3或AS01配制RTX多肽
制备六种制剂：
[NB：RTX是指RTX多肽片段]
每种制剂含有以下组成部分：
为了制备2000uL制剂1-4，将制剂缓冲液(150mM NaCl、1mM TCEP、20mM HEPES、5%甘油、2mM CaCl2、563mM NaCl)中的RTX多肽片段与CaCl2和PBS (pH7.4)混合并在室温下搅拌5至30分钟。将EGTA(也称为依他酸(Egtazic acid)或亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸)添加至制剂3和4中，至5mM的最终浓度。在最后的步骤中，添加AS01佐剂并将制剂在室温下再搅拌5至30分钟。为了制备200uL的制剂5和6，将制剂缓冲液中的RTX多肽片段与CaCl2和PBS混合。在最后步骤中添加Al(OH)3，然后在室温下搅拌60至120分钟。
多肽片段在Al(OH)3上的吸附
在具有Al(OH)3的制剂的上清液中不存在多肽片段表明该多肽片段被良好地吸附(图2)。这些结果在NanoDSF和UPLC-SEC中得到证实。
AS01与多肽片段和/或EGTA的相容性
保留AS01粒径，并且在所有条件下都不存在溶血。
在AS01和/或EGTA存在的情况下的多肽片段的构象
在AS01或AS01缓冲液存在的情况下，片段峰(NanoDSF)被保留。该数据证实腺苷酸环化酶片段的二级结构得到保留(折叠状态)。在EGTA存在的情况下，存在片段峰的损失，并且甚至在AS01存在的情况下也观察到典型的Tm。该数据表明，在没有Ca++存在的情况下，片段的二级结构不被保留。当用Al(OH)3配制时，观察到片段峰的损失，因为多肽片段被吸附在表面。
结果提供于图3中。
实施例3-评估折叠/未折叠状态下RTX片段的免疫原性
在第1天、第14天和第28天，对15只雌性小鼠(6周龄的BALB/cOlaHsd)的6个组，用50μL的每种疫苗制剂肌肉内免疫，如表1中所示。在第28天(14PII)进行部分采血，并且在第42天(14PIII)进行最后采血。表1：
腺苷酸环化酶毒素血清-中和测定
如Eby等人(Clinical and Vaccine Immunology, January 2017 Volume 24Issue 1, pages 1-10)中所述，进行腺苷酸环化酶毒素细胞毒性中和测定，但对ACT的浓度进行小修改：
表2
在每种剂量下，在有和没有Ca++的AS01E(含有MPL、QS21和脂质体(25 µg MPL和25µg QS21)的佐剂系统)佐剂化的制剂之间观察到等效性。然而，当与每种剂量下的其他制剂相比时，对用AL(OH)3佐剂化的制剂的应答较低(图5)。
实施例4 – RTX片段与DTaP疫苗的组合
在该研究中评估的所有无细胞百日咳(称为Pa或aP)疫苗都来自GlaxoSmithKlineBiologicals (GSK, Rixensart, Belgium)。在四个组中使用的不同百日咳博德特氏菌抗原组分/剂的量显示于下表3中：
*HD=人剂量；SC=皮下。
动物模型
所有实验和测定都根据欧洲指令2010/63/EU和GlaxoSmithKline Biologicals关于动物的关怀、福利和治疗的政策，在GSK实验室(Rixensart, Belgium)进行。动物可自由得到水和维持饮食。与实验室动物护理评价和认证协会(AAALAC)全球富集计划(globalenrichment program)一致，环境包括筑巢材料(Envirodry)，并应用社会圈养。
体内小鼠百日咳博德特氏菌肺清除测定基于对接种疫苗的小鼠进行标准亚致死性鼻内攻击后博德特氏菌菌株的肺部侵入的分析[20]。向18或20只BALB/c OlaHsd小鼠(雌性，6周龄)的组以3-周间隔给予两剂疫苗。在第28天收集血液样品。在加强后一周(第29天)，在用异氟烷(2.5%)的轻度麻醉下，通过向左鼻孔中滴注50 µl细菌悬液(等同于总共近似5 × 106个集落形成单位[CFU])来攻击小鼠。对于鼻内攻击模型，将如上所述在Bordet-Gengou琼脂板(BGA)和Stainer-Scholte液体培养基中生长的百日咳博德特氏菌的细菌悬浮液在Stainer-Scholte培养基中稀释，以提供近似1 × 108 CFU/ml的攻击接种物，用于亚致死性攻击。使用微量移液器将50 µl的细菌悬浮液的等分试样缓慢施用入鼻孔，以被动物的呼吸立即吸入。在亚致死攻击之后，在暴露后2小时、2天、5天和8天(指定的第29天+2小时，D31，D34和D37)通过麻醉处死三或五只感染的小鼠。
移取肺，并用组织研磨机在2 ml酪蛋白氨基酸(1%)缓冲盐水中匀浆。将匀浆的10倍系列稀释物铺板在BGA上，并在36-37℃下孵育4-6天，然后计数CFU。对每个时间点，计算每个肺的CFU的log10加权平均数(CFUw/肺)和标准偏差。免疫程序示意图提供于图6中。
百日咳博德特氏菌抗原的血清学分析：
百日咳类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)和腺苷酸环化酶(ACT)
在第二次免疫后7天(第28天-攻击前一天)单独地收集来自所有小鼠的血清，并根据以下方案测试抗PT、抗FHA和抗PRN IgG抗体的存在：
PT、PRN和FHA血清学方案
将96-孔板用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(50mM)中的FHA (2 µg/ml)、PT(2 µg/ml)或PRN(3 µg/ml)包被，并在4℃下孵育过夜。在用PBS-BSA 1%缓冲液进行饱和步骤之后，将小鼠血清在PBS-BSA 0.2% Tween 0.05%中1/100稀释，并在来自板的孔中系列稀释(12次稀释，步骤½)。添加与过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG (1/3000最终稀释度)。在添加过氧化物酶底物(OPDA)之后观察比色反应，并用1M HCl终止，然后通过分光光度法(波长：490-620nm)读取。对于测试的每种血清和在每个板上添加的标准品，将4-参数逻辑曲线拟合至OD和稀释度之间的关系(Softmaxpro)。这允许推导以STD滴度表示的每个样品滴度。
ACT血清学方案
将96-孔板用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(50mM)中的ACT (0.3μg/ml)包被，并在4℃下孵育过夜。在用缓冲液TR020(饱和缓冲液ELISA - NBC血清4% V/V)进行饱和步骤之后，将小鼠血清在TR020中以1/100稀释，并在来自板的孔中系列稀释(12次稀释液，步骤½)。添加与过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG(1/1000最终稀释度)。在添加过氧化物酶底物(OPDA)之后观察比色反应，并用HCl 1M终止，然后通过分光光度法(波长：490-620nm)读取。对于测试的每种血清和在每个板上添加的标准品，将4-参数逻辑曲线拟合至OD和稀释度之间的关系(Softmaxpro)。这允许推导以STD滴度表示的每个样品滴度。
腺苷酸环化酶毒素血清-中和测定
毒素中和测定基于ACT对J774.A1巨噬细胞样细胞的细胞毒性。将D-MEM中的J774.A1细胞(50 µl中250,000个细胞)接种于96-孔板的每个孔中，并在37℃与5% CO2下放置过夜，以允许附着。第二天，将mAb 3D1 (Kerafast)和收集的血清的合并物在D-MEM中系列稀释，并与ACT混合，然后以0.8或2或3 µg/ml的最终ACT浓度转移至细胞。在37℃下孵育2h后，使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo)来通过比色法测定细胞活力，所述比色法基于活细胞中脱氢酶对水溶性四唑翁盐(WST-8)的还原，生成黄色甲臜染料。对于在每个板上测试的每种标准品(mAb 3D1)和合并血清，将4-参数对数曲线拟合至OD和稀释液之间的关系(Softmaxpro)。滴度按照从每个板的标准品的“中点”推导的“中点”表示。
统计方法
假定集落形成单位(CFU)的数目的平均值分布是对数正态的。统计方法是使用异质方差模型对具有2个因素(组和天)的log10值进行方差分析(ANOVA)，即对于因素组合的不同水平未假定相同的方差。模型中不包括制剂和剂量之间的相互作用(假设：非显著相互作用)。作为探索性分析，将不进行任何调整。该模型用于估计几何平均值及其95%CI，以及几何平均值比及其95% CI。
假定IgG滴度的分布为对数正态的。统计方法是根据抗原对具有1个因素(组)的log10值进行方差分析(ANOVA)。该模型用于估计几何平均值及其95% CI，以及几何平均值比及其95%CI。
在所有条件下都检测到抗PRN抗体，证实接种疫苗成功。如所预期，在接受1/80HD的小鼠中的抗PRN抗体的水平低于接受¼ HD的小鼠中的抗PRN抗体的水平。
如图7中所示，用RTX片段进行免疫能够诱导抗ACT IgG的水平，达到与使用非脱毒的全长腺苷酸环化酶获得的那些相似的水平。
在第28天通过ELISA测量个体的抗体滴度(抗ACT IgG)(图8)。RTX片段诱导高水平的抗ACT IgG。
由不同疫苗诱导的针对百日咳博德特氏菌鼻内攻击的保护效力显示于图9(a)和9(b)中。
研究的制剂，包括Infanrix 1/4 HD组(阳性对照)，相对于未接种疫苗组降低了CFU数。在Infanrix 1/4 HD组(阳性对照)和DTPa 1/80HD(有/无RTX片段)之间观察到高显著性差异。然而，尽管在使用的实验模型中，RTX片段是明显免疫原性的，相对于未接种疫苗组降低CFU数，并且能够诱导抗体，但当RTX片段与DTPa组合时，与单独的DTPa (1/80HD)相比，未观察到保护效力的可辨别的提高。因此，从减少定殖的角度来看，RTX片段可用于包括在DTPa疫苗中。
Claims (17)
1.包含以下氨基酸序列的多肽：
A-X-B
其中：‘X’是由与SEQ ID NO:2、3或4具有至少99%同一性的序列组成的氨基酸序列；‘A’是任选的N末端氨基酸序列；‘B’是任选的C末端氨基酸序列，且其中‘A’和‘B’不是衍生自腺苷酸环化酶或其片段。
2.权利要求1的多肽，其中‘A’是N末端甲硫氨酸残基，‘X’是选自SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列，且其中不存在‘B’。
3.权利要求1的多肽，其由与SEQ ID NO:23具有99%同一性的序列组成。
4.权利要求1的多肽，其中‘A’和/或‘B’是组氨酸标签。
5.权利要求4的多肽，其由与SEQ ID NO:5、6、7或8具有至少99%同一性的序列组成。
6.权利要求5的多肽，其由与SEQ ID NO:5、6、7或8具有100%同一性的序列组成。
7.权利要求1至6中任一项的多肽，其能够引发抗体应答，所述抗体应答包含结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的腺苷酸环化酶蛋白的抗体，例如，如通过腺苷酸环化酶毒素中和测定法所测量。
8.核酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的多肽。
9.细菌，其包含权利要求8的核酸和/或表达根据权利要求1至7中任一项所述的多肽。
10.免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的多肽或根据权利要求8所述的核酸。
11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其包含佐剂。
12.权利要求10或11的免疫原性组合物，其包含二价金属盐。
13.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述二价金属盐是钙盐，例如氯化钙。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽、根据权利要求8所述的核酸或根据权利要求10至13所述的免疫原性组合物，其用于疗法中。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽、根据权利要求8所述的核酸或根据权利要求10至13所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染。
16.治疗或预防哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法，其包括施用有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的多肽、根据权利要求8所述的核酸或根据权利要求10至13所述的免疫原性组合物。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽、根据权利要求8所述的核酸或根据权利要求10至13中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防哺乳动物、例如人中由百日咳博德特氏菌引起的疾病和/或感染的方法中。
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