CN117957017A - 包含重组重叠肽和天然蛋白质的疫苗制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于免疫和/或治疗受试者的包含多肽和天然蛋白质或它们的部分或者包含编码所述多肽和天然蛋白质或它们的部分的多肽的制剂、组合物和试剂盒，以及使用所述制剂、组合物和试剂盒的治疗方法，和制造所述制剂、组合物和试剂盒的方法。

Description

包含重组重叠肽和天然蛋白质的疫苗制剂
技术领域
本发明提供了用于免疫和/或治疗受试者的包含多肽和天然蛋白质或它们的部分或者包含编码所述多肽和天然蛋白质或它们的部分的多肽的制剂、组合物和试剂盒，以及使用所述制剂、组合物和试剂盒的治疗方法，和制造所述制剂、组合物和试剂盒的方法。
背景技术
当然，疫苗的效力在其有效缓解疾病的能力方面是关键的。疫苗可以是预防性的-预防疾病-或治疗性的-治疗现有疾病。在预防性疫苗的情况下，虽然希望更有效的疫苗是基本的，但是在一些情况下，疫苗有效减轻疾病的最小效力阈值是存在的。例如，在最近的研究中，示出了为了使疫苗有效地预防SARS-CoV-2流行，疫苗作为唯一干预的效力阈值是，它在预防感染方面必须至少有60％的有效性以使感染数的峰值降低99％(Bartsch等人，2020年)。相同的研究示出，为了消灭5％的群体已经暴露于病毒的活跃流行病，疫苗效力必须为至少60％，以假设100％覆盖率时将峰值降低85％，当覆盖率降至75％时疫苗效力上升至80％，并且当覆盖率降至60％时疫苗效力上升至100％。因此，显然加强疫苗效力不仅是期望的，而且是必需的，特别是在覆盖率不可能很高的流行病早期阶段的情况下。
在治疗性疫苗的情况下，例如癌症免疫治疗性疫苗技术，公认的是，单个最重要的因素是抗原的选择(Hollingsworth和Jansen，2019年)。然而，已经尝试了其他策略来加强此类疫苗的效力。例如通过将它们与检查点抑制剂、佐剂、细胞因子、化疗剂等组合。然而，这些策略仍然具有显著的障碍，需要克服这些障碍以安全地提高效力并向临床发展。
需要的是一种方法，该方法改善给定疫苗的效力而不引入进一步的显著技术障碍或损害患者安全性。令人惊讶地，申请人已经发现，与天然蛋白质序列或其部分或片段同时引入重组重叠肽疫苗导致受试者的免疫应答的量级增加，从而表明疫苗方案的效力增加。申请人已经发现，这对于疫苗联合治疗方法具有广泛的普遍适用性。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的制剂，所述制剂包含：多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自所述天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列；和所述天然蛋白质序列或其部分。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度介于2至31个氨基酸之间，任选地其中所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是外源蛋白酶切割位点，任选地是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。
在一些实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述制剂进一步包含佐剂，优选地是单磷酸酯脂质A(MPL)、montanide、基于明矾的佐剂、水包油剂或油包水剂，更优选地是单磷酸酯脂质A、montanide或基于明矾的佐剂。
在一些实施方案中，所述多肽的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间，并且所述天然蛋白质序列或其部分的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是冠状病毒的S蛋白质。在一些实施方案中，所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，任选地是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，所述冠状病毒是人冠状病毒。在一些实施方案中，所述多肽的所述两个或更多个肽片段中的至少两者包含源自S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含源自S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含源自受体结合结构域(RBD)的序列，任选地是S1亚基的受体结合基序(RBM)，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含受体结合结构域(RBD)，任选地是S1亚基的受体结合基序(RBM)。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段的至少一者包含源自S2亚基的HR2和/或HR1结构域的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含S2亚基的HR2和/或HR1结构域。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是存活蛋白(survivin)，其选自下列存活蛋白同工型中的任一者：同工型1、同工型2、同工型3、同工型4、同工型5、同工型6或同工型7。在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEG、
DHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIH、
ACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFF、
PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE、
FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK、
EHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLK、
QFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNK、
RERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAI和/或
KEFEETAEKVRRAIEQLAAMD
并且所述多肽引发免疫应答或具有免疫刺激性。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含与以下项具有至少90％同一性的序列
PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE和/或
FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK，
并且所述多肽引发免疫应答，任选地是T细胞应答。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是人乳头瘤病毒(HPV)的E6或E7蛋白质。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是：
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY
DFAFRDLCIV YRDGNPYAVC DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN
KPLCDLLIRC INCQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNIRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL；或
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA
HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE、
EQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK、
HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMG和/或
IRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。
在另一方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸和/或编码多肽的一种或多种多核苷酸，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自所述天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度介于2至31个氨基酸之间，任选地其中所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是外源蛋白酶切割位点，任选地是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。
在一些实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，制剂进一步包含佐剂，优选地是单磷酸酯脂质A(MPL)、montanide、基于明矾的佐剂、水包油剂或油包水剂，更优选地是单磷酸酯脂质A、montanide、基于明矾的佐剂。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是冠状病毒的S蛋白质。在一些实施方案中，所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，任选地是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，所述冠状病毒是人冠状病毒。在一些实施方案中，所述多肽的所述两个或更多个肽片段中的至少两者包含源自S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含源自S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含源自受体结合结构域(RBD)的序列，任选地是S1亚基的受体结合基序(RBM)，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含受体结合结构域(RBD)，任选地是S1亚基的受体结合基序(RBM)。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段的至少一者包含源自S2亚基的HR2和/或HR1结构域的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含S2亚基的HR2和/或HR1结构域。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是存活蛋白，其选自下列存活蛋白同工型中的任一者：同工型1、同工型2、同工型3、同工型4、同工型5、同工型6或同工型7。在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEG、
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PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE、
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QFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNK、
RERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAI和/或
KEFEETAEKVRRAIEQLAAMD
并且所述多肽引发免疫应答或具有免疫刺激性。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含与以下项具有至少90％同一性的序列
PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE和/或
FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK，
并且所述多肽引发免疫应答，任选地是T细胞应答。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是人乳头瘤病毒(HPV)的E6或E7蛋白质。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是：
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY
DFAFRDLCIV YRDGNPYAVC DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN
KPLCDLLIRC INCQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNIRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL；或
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA
HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP。
在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE、
EQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK、
HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMG和/或
IRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。
在本发明的另一方面，提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述方面中任一项所述的制剂。
本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的组合物，其中所述组合物包含根据前述方面所述的制剂，并且其中所述多肽与所述天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分和/或所述多肽的一种或多种多核苷酸共同施用。
本发明的另一方面提供了一种制备疫苗的方法，所述方法包括在体外的一个或多个细胞中表达编码根据任一前述方面所述的天然蛋白质序列或其部分和多肽的一种或多种多核苷酸，以及纯化所述天然蛋白质序列或其部分和多肽。在一些实施方案中，将所纯化的天然蛋白质序列或其部分和多肽组合成单一制剂。
一种用于免疫和/或治疗受试者的试剂盒，所述试剂盒包含根据上述方面中的任一项所述的天然蛋白质序列或其部分、或编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸、和根据上述方面所述的多肽，或编码多肽的一种或多种多核苷酸。
本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，所述方法包括：施用根据前述方面所述的天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸，以及施用根据前述方面所述的多肽，或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸。
在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸与所述多肽或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸同时、依次或分开施用。
附图说明
图1.构建的质粒pET30a的质粒图谱。
图2.电泳分析载体质粒pET30a，证明ROP基因成功插入到大肠杆菌(E.coli)中。
图3.SDS-PAGE分析：
(a)ROP-COVS的诱导率。泳道1是诱导之前；泳道2是用IPTG诱导至最终浓度为0.2mM之后4小时；泳道M是分子量标记(14.4kDa至94.0kDa)。ROP-COVS由IPTG有效诱导。
(b)ROP-COVS的纯化。泳道1是纯化之前的样品；通道2是流穿液；泳道3用48mM咪唑洗脱；泳道4用78mM咪唑洗脱；泳道5和6用105mM咪唑洗脱；泳道7用138mM咪唑洗脱；泳道M是分子量标记(14.4kDa至94.0kDa)。泳道6至8具有超过95％的纯度。
(c)ROP-COVS的重折叠。
图4.本发明的多肽的一个实施方案的说明性示意图。
图5.通过替代RBD-ACE2 ELISA中和测定得到的血清中和数据。
图6.通过替代RBD-ACE2 ELISA中和测定得到的纯化的IgG中和数据。
图7.SDS-Page和蛋白质印迹示出纯化的小鼠存活蛋白的检测。
图8.SDS-PAGE和蛋白质印迹示出纯化的小鼠ROP-存活蛋白的检测。
图9.示出小鼠血清的ELISA结果以用于检测与小鼠存活蛋白结合的抗体的图。
图10.示出小鼠血清的ELISA结果以用于检测与小鼠ROP-存活蛋白结合的抗体的图。
图11.示出ELISA形式的针对板结合的RBD的抗体滴定结果的图。
图12.示出使用来自三组再刺激的免疫小鼠的脾细胞的ELISPOT结果的图。
具体实施方式
提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的制剂，该制剂包含多肽和天然蛋白质序列或其部分，该制剂提供了疫苗制剂相较于单独的多肽或天然蛋白质或其部分的改善效力。“改善效力”意指当施用给受试者时，该制剂能够在所述受试者中更好地产生抗体和/或T细胞应答或产生更显著的抗体和/或T细胞应答，这可通过例如测量特异性抗体滴度和/或进行ELISpot测定以测量T细胞应答来测量。多肽包含源自天然蛋白质使用蛋白酶切割位点连接以形成重组重叠多肽的肽片段，该重组重叠多肽能够产生针对天然蛋白质序列的抗体，并且在一些情况下另外刺激CD4+和CD8+T细胞应答。
牛津大学创新、新闻与出版物，2020年5月28日，Oxford Vacmedix，“OxfordVacmedix宣布合作开发Covid-19疫苗和诊断测试(Oxford Vacmedix announcescollaboration to develop vaccine and diagnostic tests for Covid-19)”与OxfordVacmedix英国有限公司开展的新冠肺炎疫苗项目有关。
CN112618707、CN112480217、CN112220920、CN112226445和CN111671890都涉及本领域中与天然蛋白质相关的标准疫苗制剂。
Oncotarget，第8卷，2017年，Cai等人，“由交叉呈递重组重叠肽蛋白质产生的保护性细胞免疫(Protective cellular immunity generated by cross-presentingrecombinant overlapping peptide proteins)”，第76516-76524页，涉及重组重叠肽蛋白质的背景技术信息。
通过使用以下定义，可更好地理解本发明和本文所用的术语。
如本文所用，“重组”是指任何聚合物，任选地是多肽，其是非天然存在的或人工构建的，已经通过基因重组技术在细菌(例如但不限于大肠杆菌细菌)中制备。
如本文所用，“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸直链，其比如本文所用的“肽”或“肽片段”长。
如本文所用，“肽”是指通过肽键连接的多于一个氨基酸的直链，其比如本文所用的“多肽”短。
如本文所用，“肽片段”是指氨基酸链(“肽”)，其是较大多肽的片段。换句话说，如果是相同的较大多肽的片段，则两个或更多个肽片段可一起形成较大多肽的一级序列的全部或部分。在这种情况下，较大的多肽可以是本发明的重组多肽。
如本文所用，“蛋白质”是指主要由一种或多种肽和/或多肽(通常但非必需地具有多于100个氨基酸)组成的分子实体，并且其已经折叠成或呈现为3维构象。
如本文所用，“疫苗”是指能够在受试者中生成针对靶标的保护性免疫记忆的物质，其中所述受试者是动物和任选地是人。所述保护性免疫记忆可相当于完全免疫和/或与所述靶标相关的疾病的严重性或症状的降低。
如本文所用，“冠状病毒”是指冠状病毒(Coronaviridae)科成员，由国际病毒分类学委员会工作组冠状病毒研究组定义，并在国际病毒分类学委员会冠状病毒研究组(2020)https://dx.doi.org/10.1038％2Fs41564-020-0695-z中使用。
如本文所用，“β冠状病毒”是指β冠状病毒(Betacoronavirus)属成员，由国际病毒分类学委员会工作组冠状病毒研究组定义，并在国际病毒分类学委员会冠状病毒研究组(2020)https://dx.doi.org/10.1038％2Fs41564-020-0695-z中使用。在β冠状病毒属的亚种中有SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV。
如本文所用，“严重急性呼吸综合征相关冠状病毒”是指严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus)种成员，由国际病毒分类学委员会工作组冠状病毒研究组定义，并在国际病毒分类学委员会冠状病毒研究组(2020)https://dx.doi.org/10.1038％2Fs41564-020-0695-z中使用。在严重急性呼吸综合征相关冠状病毒种中分组的其他亚种是SARS-CoV、SARS-CoV-2、SARSr-CoV BtKY72、SARSr-CoV RaTG13、SARS-CoV PC4-227、SARS-CoVGZ-02、Bat SARS CoVRf1/2004、CivetSARS CoVSz3/2003。
如本文所用，“表位”是指肽片段、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质或其他物质的一部分，其通过受体结合相互作用被适应性免疫系统，并且特别是抗体、B细胞和/或T细胞识别。
如本文所用，“LRMK”是指Leu-Arg-Met-Lys氨基酸序列，其是尤其被组织蛋白酶S识别的切割位点。在一些实施方案中，提供了可切割接头，并且在一些进一步的实施方案中，该接头是LRMK。
如本文所用，“外源”意指人工引入的。它也可意指至少在现在人工引入的位置上不存在于天然序列，例如野生型(包括任何变体)中。例如，多肽可包含在天然蛋白质中连续的两个序列，并且其被外源蛋白酶切割位点分开，即不存在于连续天然序列中的切割位点。又如，在多肽的情况下，该多肽包含含有源自SARS-CoV-2S蛋白质的序列的肽片段并且在每个肽片段之间包含外源蛋白酶切割位点，外源蛋白酶切割位点是人工引入的切割位点，或者不是在SARS-CoV-2S蛋白质中在其现在所处的S蛋白质氨基酸序列内的位置天然发现的切割位点。
如本文所用，“重叠”是指在两个不同的氨基酸序列或肽或肽片段中相同或基本上相同的氨基酸序列的一部分或“子序列”，优选地，使得一个氨基酸序列或肽或肽片段的C末端的子序列与另一个氨基酸序列或肽或肽片段的N末端的子序列相同或基本上相似，和/或反之亦然。重叠可以或可以不反映在编码所述氨基酸序列的多核苷酸序列中。因此，本领域技术人员清楚“重叠的肽片段”意指“具有至少一个重叠的肽片段”。
如本文所用，“同一性”是两个序列之间的相似性程度，换句话说，是两个序列在残基方面彼此匹配的程度，如通过比较两个或更多个多肽或多核苷酸序列所确定的。同一性可使用两个序列的相似性程度来确定，以提供两个序列匹配程度的量度。本领域技术人员熟知许多用于比较多肽或多核苷酸序列的程序，例如(但不限于)各种BLAST和CLUSTAL程序。同一性百分比可用于定量序列同一性。为了计算百分比同一性，将两个序列(多肽或核苷酸)进行最佳比对(即，定位成使得两个序列在每个对应位置具有最高数量的相同残基，并因此具有最高百分比同一性)，并将每个位置的氨基酸或核酸残基与该位置的对应氨基酸或核酸进行比较。在一些情况下，最佳序列比对可通过在序列中插入空间以使其最佳地适合第二序列来实现。相同氨基酸残基或核苷酸的数量提供了百分比同一性，例如，如果10个残基长的序列的9个残基在被比较的两个序列之间是相同的，则百分比同一性是90％。同一性百分比通常沿着被比较的两个序列的全长计算。
如本文中肽、多肽和/或蛋白质的上下文中使用的“变体”是指具有与野生型肽、多肽和/或蛋白质具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性，任选地60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、91％至100％、92％至100％、93％至100％、94％至100％、95％至100％、96％至100％、97％至100％、98％至100％同一性的氨基酸序列的肽、多肽和/或蛋白质。当变体与野生型不同时，这可能是由于序列内氨基酸的取代，以及/或者由于从序列的一端或两端，或甚至在序列内添加或缺失氨基酸。“变体”也可用于病毒的上下文中(本文中为“病毒变体”)是指在其基因组序列中具有一个或多个突变的病毒。
如本文所用，“广泛作用”是指有效针对多种不同病毒种、亚种和/或病毒变体的疫苗、治疗剂或抗体。作为说明性示例，广泛作用的冠状病毒疫苗可有效预防跨亚种的感染，例如可预防SARS-CoV-2和SARS-CoV的感染；在另一个说明性示例中，广泛作用的冠状病毒疫苗可有效预防跨物种感染，例如可预防SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS、HKU1和OC43等的感染。
“源自”在本文中和全文中意指“与一部分相同或基本上相似”。具有源自蛋白质的序列的肽片段是含有与所述蛋白质的氨基酸序列的连续部分相同或基本上相似的氨基酸序列的肽片段。本文中和全文中的“基本上相似”意指氨基酸序列与参考蛋白质序列、参考SEQ ID NO或其连续部分或子序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性，任选地具有70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、91％至100％、92％至100％、93％至100％、94％至100％、95％至100％、96％至100％、97％至100％、98％至100％同一性，如从上下文中将显而易见的。在一些实施方案中，“至少”在本文中和全文中意指所叙述的百分比高达并包括100％。例如，“至少75％”在一些实施方案中可意指“75％至100％”。通常，具有源自蛋白质的序列的肽片段的核酸序列与冠状病毒蛋白质核酸序列的差异程度大于来自蛋白质氨基酸序列的肽片段的氨基酸序列。这是由于多肽的制备和表达的优化，例如密码子优化的原因。为了避免疑义，它是肽片段的氨基酸序列，源自蛋白质的氨基酸序列，因为其与蛋白质的氨基酸序列的连续部分具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。由于氨基酸遗传密码的固有冗余性，核酸序列可有较大程度的差异，并且可具有较低的序列同一性。在上述“源自”的定义中，所指的蛋白质可以是天然蛋白质序列，任选地是野生型天然蛋白质序列。
在一些实施方案中，“至少”在本文中和全文中意指所叙述的肽片段数量，其高达且包括存在于多肽中的肽片段总数。例如，在具有14个肽片段的多肽中，“至少两个肽片段”在一些实施方案中将意指“两个至14个肽片段”，或其间的任何数量。
“重叠序列”是存在于本发明的多肽的两个或更多个肽片段中的氨基酸序列的一部分或子序列。在一些实施方案中，一个肽片段的C末端包含与另一个肽片段的N末端的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。这意味着在存在重叠序列的情况下，必须存在至少两个肽片段上相同的肽片段的至少一部分。在一些实施方案中，重叠序列的长度为2至40个氨基酸，因此肽片段的每个重叠部分为2至40个氨基酸。在一些实施方案中，重叠序列的长度为2至31个氨基酸。在其他实施方案中，重叠序列的长度为4至30个氨基酸。在其他实施方案中，重叠序列的长度为6至20个氨基酸。在优选的实施方案中，重叠序列的长度为8至17个氨基酸。在一些实施方案中，重叠序列的长度为8、9、10或11个氨基酸。在一些实施方案中，重叠序列的长度为12个氨基酸。在其他实施方案中，重叠序列的长度为13个氨基酸、14个氨基酸、15、16或17个氨基酸。在最优选的实施方案中，重叠序列的长度为至少8个氨基酸以用于生成细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)(CD8+T细胞)应答以及/或者长度为至少12个氨基酸以用于生成T辅助细胞(CD4+T细胞)应答。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含肽片段，这些肽片段包含与多肽内的一个其他肽片段的序列重叠的序列，例如，通过其N末端序列或其C末端序列。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含肽片段，这些肽片段包含与多肽内的两个其他肽片段的序列重叠的序列，例如，通过其N末端序列和其C末端序列。在一些实施方案中，本发明的多肽另外包含一个或多个肽片段，该一个或多个肽片段包含不与包含在多肽内的任何其他肽片段的序列重叠的序列。
任一个肽片段的长度可为2至55个氨基酸，更优选地为8至50个氨基酸，更优选地为12至45个氨基酸，更优选地为20至40个氨基酸。在优选的实施方案中，每个肽片段的长度为25至40个氨基酸，更优选的长度为28至38个氨基酸，甚至更优选的长度为29至37个氨基酸。在优选的实施方案中，每个肽片段的长度为29、30、31、32、33、34、35、36或37个氨基酸。
在本发明的所有实施方案中，肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。“线性相邻”在此处意指在二级结构或氨基酸序列方面是直接连续的肽片段。因此，一个或多个蛋白酶切割位点序列将每个肽片段分开。肽片段通过一个或多个蛋白酶切割位点序列连接。在本发明的一个实施方案中，两个或更多个肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。在另一个实施方案中，三个或更多个肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。在另一个实施方案中，4至30、5至20个肽片段，更优选地10至15、11至14、12或13个肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。
其中剂量以“μg.kg-1”表示，旨在表示每公斤受试者质量中微克的试剂质量。因此，本领域技术人员清楚该mg.kg-1意指每千克受试者质量中毫克的试剂质量。试剂可以是本文所列的任何试剂，即多肽或天然蛋白质序列或其部分。所述治疗性和/或预防性多肽和/或其天然肽序列或片段可提供给哺乳动物受试者，优选地是人。此外，编码任何上述的多核苷酸也被设想用于施用给哺乳动物受试者，优选地是人。
在第一方面，本发明提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的制剂，该制剂包含：多肽，该多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自该天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于该两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列；和天然蛋白质序列或其部分。在一些实施方案中，该制剂另选地或另外地用于对受试者接种疫苗，并且是疫苗制剂。多肽的第一序列和第二序列以及任何其他序列可以是如上所述的天然蛋白质序列的全部或部分的变体。与野生型序列相比，天然蛋白质本身可以被轻微修饰，例如以改善其免疫原性。技术人员将理解，在一些实施方案中，可提供其部分，而不是提供完整的天然蛋白质序列。其这种部分可包含已知的抗原性部分，或另外的功能相关部分，这意味着已知所提供的部分在天然蛋白质序列的功能中起关键作用，或另外可以是天然蛋白质序列的免疫识别的关键。因此，天然蛋白质序列的部分可包含已知的表位，以用于生成针对天然蛋白质序列的免疫应答。不希望受理论束缚，ROP刺激了强T细胞应答，包括CD4+和CD8+T细胞应答，并且CD4+帮助刺激抗体的发育。T细胞和B细胞之间的相互作用刺激了强B细胞应答，因为从T细胞释放的细胞因子以非线性方式刺激了B细胞应答。通过将免疫系统暴露于两种抗原性蛋白，由于免疫系统的多个途径的不同但同时的激活而发生应答的放大。
为了说明第一方面，制剂可包含多肽，该多肽包含两个或更多个肽片段，每个肽片段包含源自天然蛋白质序列的序列，其中天然蛋白质序列是SARS-CoV-2冠状病毒的刺突(或“S”)蛋白质。因此，制剂包含具有两个或更多个肽片段的多肽，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自天然蛋白质序列的第二序列，其各自被蛋白酶切割位点序列分开。制剂另外包含天然蛋白质序列或其部分。在该说明中，这意味着除了上文概述的多肽之外，制剂另外包含刺突蛋白质或其部分。作为进一步说明，其部分可以是，例如，刺突蛋白质的受体结合基序，已知其在冠状病毒进入宿主细胞中起关键作用。
技术人员将理解，这种制剂可以多种方式施用。最常见的施用途径是通过注射，尽管也设想经口递送和鼻喷雾递送。当注射时，递送可以是皮下、静脉内、肌内、腹膜内或皮内。
在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。作为说明性示例，多肽可包含源自天然蛋白质序列的两个肽片段，其中第一肽片段包含氨基酸残基1至10，并且第二肽片段包含氨基酸残基5至15，因此多肽具有包含序列5至10的重叠序列，这些序列存在于两个片段中。包含这些重叠序列的多肽可称为重组重叠多肽(ROP)。ROP已经示出提供了优于常规疫苗的优点(参见Cai等人，2017年，WO2007125371和WO2016095812)。
多肽包含至少两个或更多个肽片段。在一些实施方案中，多肽可包含三个或更多个肽片段、四个或更多个肽片段、五个或更多个肽片段、六个或更多个肽片段、七个或更多个肽片段、八个或更多个肽片段、九个或更多个肽片段、十个或更多个肽片段、十一个或更多个肽片段、或十二个或更多个肽片段。在一些实施方案中，多肽可包含多于十二个肽片段。应当理解，在存在三个或更多个肽片段的情况下，这些片段中的每一者将具有作为天然蛋白质序列的变体或源自天然蛋白质序列的氨基酸序列。序列在肽片段之间可以是相同的，或者在每个肽片段之间可以是不同的。作为说明性示例，第一肽片段可具有包含来自例如存活蛋白同工型1的残基1至10的第一序列，第二肽片段可具有包含残基11至20的第二序列，并且第三肽片段可具有包含残基11至20的第一序列。
在一些实施方案中，多肽可包含多个重叠序列。作为说明性示例，第一肽片段可包含残基1至10，第二肽片段可包含残基5至15，并且第三肽片段可包含残基11至20。因此，在说明性示例中，在多肽中存在两个重叠序列，具体地，在第一肽片段和第二肽片段中的残基5至10，和在第二肽片段和第三肽片段中的残基11至15。此外，或另选地，可存在一个或多个重叠序列，但不是所有的肽片段都需要含有重叠序列。作为说明性示例，第一肽片段和第二肽片段可含有由残基5至10限定的重叠序列，但第三肽片段可包含残基16至25，因此不与任一个重叠。在一些实施方案中，多肽可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或多个重叠序列。
可存在任何数量的重叠，并且这仅受多肽的肽片段的数量和大小的限制。
在一些实施方案中，多肽可包含具有与野生型天然蛋白质序列(例如，上文所列的同工型中的任一者，或它们的同源物)具有部分序列同一性的序列的肽片段。作为说明性示例，至少一个肽片段可包含与天然蛋白质序列的相关部分具有至少99％同一性的序列。另选地，至少一个肽片段可包含与天然蛋白质序列的相关部分具有至少98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％同一性的序列。“相关部分”意指所讨论的肽片段所基于的天然蛋白质序列的残基的连续串。作为说明性示例，如果肽片段包含与天然蛋白质序列的残基1至10具有至少90％同一性的序列，则10个残基中的9个将与天然蛋白质序列的残基1至10相同，并且一个将不同。本领域技术人员将理解，任何残基可互换，只要百分比同一性是完整的。本领域技术人员将进一步理解，较低百分比同一性是可接受的，只要保持关键残基。
该两个或更多个肽片段中的每一者可以是任何氨基酸长度。该两个或更多个肽片段中的每一者的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、2627、28、29、30、31、32、33、34、35个或多个氨基酸。肽片段之间的重叠(即重叠序列)可受到肽片段长度的限制，并且这些重叠序列的长度可为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或多个氨基酸。在一些实施方案中，该一个或多个重叠序列的长度介于2至31个氨基酸之间，任选地其中该一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。
多肽的该两个或更多个肽片段可包含覆盖蛋白质的整个序列的一个或多个序列。作为说明性示例，当天然蛋白质序列具有142个氨基酸的序列时，多肽可包含两个肽片段，第一肽片段具有源自天然蛋白质序列的残基1至71的序列，第二片段具有源自天然蛋白质序列的残基72至142的序列。本领域技术人员将理解，可使用任何数量的片段来覆盖多肽所基于的整个天然蛋白质序列。作为进一步说明性示例，多肽可包含三个多肽片段，第一肽片段具有源自天然蛋白质序列的残基1至71的第一序列，第二肽片段具有源自天然蛋白质序列的残基72至142的第二序列，并且第三肽片段具有源自天然蛋白质序列的残基50至120的第三序列。
这种多肽可包含任何数量的重叠序列，它可包含任何长度的肽片段，并且多肽序列可以是任何长度，只要肽片段源自如上文概述的天然蛋白质序列或其变体。多肽的每个肽片段可以是源自天然蛋白质序列的不同序列。
在一些实施方案中，本发明的多肽和/或天然蛋白质序列或其部分是免疫刺激性的。在一些实施方案中，本发明的多肽的肽片段中的一个或多个肽片段是免疫刺激性的。在一些实施方案中，本发明的多肽的肽片段中包含的序列中的一个或多个序列是免疫刺激性的。本文所指的“免疫刺激性的”意指当施用给受试者时会刺激、激发、引起和/或产生免疫应答。在优选的实施方案中，所述免疫应答包括适应性免疫应答。在一些实施方案中，所述适应性免疫应答包括上次针对多肽和/或针对其中包含的一种或多种肽片段和/或序列的抗体。在其他实施方案中，所述适应性免疫应答包括CD8+和/或CD4+T细胞的激活和/或增殖。在一些实施方案中，所述适应性免疫应答包括生成针对多肽和/或针对其中包含的一种或多种肽片段和/或序列的抗体，并且进一步包括CD8+和/或CD4+T细胞的激活和/或增殖。
一个或多个蛋白酶切割位点序列位于本发明的多肽的两个或更多个肽片段中的每一者之间。在优选的实施方案中，该一个或多个蛋白酶切割位点序列是在施用多肽的靶标或宿主或受试者或患者中存在的蛋白酶的切割位点序列，使得多肽可在宿主内被切割成其肽片段。在一些实施方案中，该一个或多个蛋白酶切割位点序列是外源蛋白酶切割位点，任选地是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。所述蛋白酶可在细胞外，或更优选地在细胞内起作用。所述蛋白酶可以是与多肽或其编码多核苷酸组合递送的非宿主蛋白酶。更优选地，所述蛋白酶是宿主蛋白酶。作为说明性示例，多肽可包含六个肽片段，每个肽片段由一个或多个蛋白酶切割位点分开，其中该一个或多个蛋白酶切割位点包含四个组织蛋白酶S切割位点，优选地是LRMK蛋白酶切割位点。
在实施方案中，该两个或更多个肽片段包含至少一个肽片段，该至少一个肽片段包含天然蛋白质序列的一个或多个线性抗体表位，并且包含位于每个肽片段之间的蛋白酶切割位点序列。位于每个肽片段之间的外源切割位点是有用的，因为它允许肽片段以所需方式释放。在一些实施方案中，外源蛋白酶切割位点序列是用于细胞内蛋白酶的，从而允许肽片段在细胞内从多肽释放。在一些实施方案中，至少一个线性抗体表位是中和表位。在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段包含重叠的氨基酸序列。这可允许例如当一个或多个线性抗体表位序列完全包含在一个肽片段中时，其他肽片段包含所述线性抗体表位的部分序列。在一些实施方案中，至少一个肽片段包含天然蛋白质序列的一个或多个CD4+和/或CD8+T细胞表位。肽片段可仅包含一个表位(无论是线性抗体表位还是CD4+或CD8+T细胞表位)。同样，肽片段可包含两个表位的一些或全部，例如线性抗体表位的一些或全部以及T细胞表位的一些或全部。肽片段可不包含表位。
CD8+T细胞(也称为“细胞毒性T淋巴细胞”、“CTL”)靶向并裂解患病和/或受感染的细胞。传统上，MHC I类分子被理解为呈递细胞内起源的片段，用于CD8+T细胞识别和激活；例如，癌细胞可能在MHC I类细胞上呈递异常表达的细胞内蛋白的蛋白酶体消化的片段化产物。CD4+T细胞有助于其他免疫细胞的激活和扩增，包括T细胞和B细胞。传统上，MHC II类分子被理解为向CD4+T细胞呈递细胞通过抗原呈递细胞内化的细胞外来源的片段以进行呈递。最近，除了这些传统途径之外，交叉呈递已被证明是可发生的，由此内化的细胞外片段可被呈递到MHC I类分子上。在一些实施方案中，多肽的至少一个肽片段包含天然蛋白质序列的一个或多个CD4+T细胞表位和/或一个或多个CD8+T细胞表位。
本发明的肽片段已被蛋白酶切割，可被加工并例如通过MHC I类和II类分子呈递给免疫系统的细胞。源自本发明的肽片段的氨基酸序列分别通过MHC I类和II类分子呈递刺激CD8+和CD4+T细胞。
在一些实施方案中，本发明的多肽在刺激T细胞应答方面非常有效。在一些实施方案中，多肽刺激CD8+T细胞应答。在一些实施方案中，多肽刺激CD4+T细胞应答。在一些实施方案中，本发明的多肽刺激CD8+和CD4+T细胞应答。在一些实施方案中，多肽的该两个或更多个片段包含至少一个含有T细胞表位的片段。
在一些实施方案中，多肽和天然蛋白质序列两者均刺激CD4+和CD8+T细胞应答。本发明的多肽包含重叠的肽片段，其进一步增强T细胞应答(Zhang等人，2009年)。此外，使用重叠肽更全面地代表了潜在T细胞表位的范围。
群体中T细胞受体和MHC所有组成成分的遗传变异意味着在呈递给和/或被CD4+和/或CD8+T细胞识别的序列中可能存在群体范围的变异。本发明的多个重叠肽片段通过平铺或提供一个或多个表位的更大覆盖的能力以及通过提供免疫识别的另选选择来补偿这种变化，从而减少了对HLA分型的任何需要。
在一些实施方案中，多肽和/或天然蛋白质序列或其部分作为编码所述多肽的多核苷酸(DNA、RNA或两者的混合物)提供。为了避免疑义，多肽和天然蛋白质序列或其部分可在单个多核苷酸或不同多核苷酸上提供。在本发明的任何方法中，可使用这种多核苷酸代替多肽和/或天然蛋白质序列或其部分。例如，编码多肽的多核苷酸可与编码天然蛋白质序列的多核苷酸共同施用给受试者，并且一旦施用，将引起本发明的多肽和天然蛋白质序列的表达，使得多肽和天然蛋白质序列两者均有效地施用给受试者。
在一些实施方案中，该制剂进一步包含药学上可接受的载体。在制剂的情况下，多肽和天然蛋白质序列或其部分在相同容积的药学上可接受的载体中混合。然而，在本发明的一些方面，多肽和天然蛋白质序列或其部分以分开容积的药学上可接受的载体提供，并且旨在同时、分开或顺序施用。当多肽和天然蛋白质序列或其部分以分开容积提供时，应当理解，以上制剂中描述的任何实施方案同样适用于其分开容积中的每种组分。此外，为了避免疑义，分开容积可另选地或另外地包括编码多肽和/或天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸。
本发明的多肽和天然蛋白质和/或本发明的多核苷酸可通过递送载体施用给受试者。在一个实施方案中，药学上可接受的递送载体是病毒载体，例如但不限于腺病毒、腺相关病毒、MVA、HSV。在另一个实施方案中，药学上可接受的递送媒介物是细菌载体，例如但不限于利斯特氏菌(Listeria)属、沙门氏菌(Salmonella)属。在另一个实施方案中，药学上可接受的递送媒介物是质粒、纳米颗粒、脂质颗粒、聚合物颗粒或病毒样颗粒。
在一个实施方案中，组合物或药物组合物任选地包含一种或多种药学上可接受的载体(或赋形剂)。用于本文所述的药物组合物的不同形式的此类合适的赋形剂的示例可在以下中找到：“药用赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)”，第2版，1994年，由A Wade和PJ Weller编辑。组合物或药物组合物可包含一种或多种另外的组分。在一个实施方案中，载体适于可注射递送。在另一个实施方案中，载体适于肺部递送。在另一个实施方案中，载体适于口服递送。
在一些实施方案中，制剂进一步包含佐剂，优选地是单磷酸酯脂质A(MPL)、montanide、基于明矾的佐剂、水包油剂或油包水剂，更优选地是单磷酸酯脂质A、montanide、基于明矾的佐剂。
在一些实施方案中，该多肽的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间，并且天然蛋白质序列或其部分的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间。在上下文中，浓度有时被称为剂量浓度或简称为“剂量”，并且每个术语可互换使用。在实际应用中，该单位意指基于受试者的体重(以kg计)调节施用给受试者的多肽或天然蛋白质序列或其部分的量(以μg计)。例如，如果受试者体重为100kg，则提供给该受试者的多肽和/或天然蛋白质序列或其部分的量将介于1000μg至1000000μg之间。
在一些实施方案中，该天然蛋白质序列是冠状病毒的S蛋白质。在一些实施方案中，该冠状病毒是β冠状病毒，任选地是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，任选地是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，该冠状病毒是人冠状病毒。在一些实施方案中，该多肽的该两个或更多个肽片段中的至少两者包含源自S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列，并且/或者其中该天然蛋白质序列的该部分包含源自S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列。
在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段中的至少一者包含源自受体结合结构域(RBD)的序列，任选地是S1亚基的受体结合基序(RBM)，并且/或者其中该天然蛋白质序列的该部分包含受体结合结构域(RBD)，任选地是S1亚基的受体结合基序(RBM)。
在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段的至少一者包含源自S2亚基的HR2和/或HR1结构域的序列，并且/或者其中该天然蛋白质序列的该部分包含S2亚基的HR2和/或HR1结构域。
在本发明的一个实施方案中，多肽包含两个或更多个肽片段，其中至少一者(任选地多于一者)包含源自严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(任选地SARS-CoV-2)的S蛋白质的序列。在本发明的一个实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者(任选地多于一者)包含源自S1亚基的序列。在一个实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者(任选地多于一者)包含源自S1亚基的RBD的序列。在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者(任选地多于一者)包含源自RBD的受体结合基序(“RBM”)的序列。在本发明的另一个优选实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者(任选地多于一者)包含源自S2亚基的序列。在实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者(任选地多于一者)包含源自S2亚基的七残基重复2(“HR2”)结构域的序列。在另一个实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者(任选地多于一者)包含源自S2亚基的七残基重复1(“HR1”)结构域的序列。技术人员将理解，“源自”具有上文概述的含义。
应当理解，存在严重急性呼吸综合征相关冠状病毒亚种诸如SARS-CoV-2(例如B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.427、B.1.429)的多种病毒变体和/或毒株，并且新的病毒变体将继续出现。本发明的肽片段可源自任何或多种此类病毒变体株。肽片段的氨基酸序列可容易地调整以代表新的突变和变体，以便对接受本发明的融合蛋白的受试者提供针对出现的病毒变体株的免疫保护。
RBD是S蛋白质的S1亚基的结构域，其与宿主受体结合。SARS-CoV-2的RBD与至少人和蝙蝠的血管紧张素转化酶2(ACE2)强烈结合(Tai,W.等人，2020年)。SARS-CoV的RBD结合ACE2。MERS-CoV的RBD结合二肽基肽酶4(DPP4)。SARS-CoV-2的RBD可表示为SEQ ID NO:15或16的氨基酸序列，并且在一些实施方案中，RBD包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基318质541(Yi,C.等人，2020年)。在其他实施方案中，RBD可包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基319至529、331至524或336至516(Shang,J.等人，2020年；Tai,W.等人，2020年；Lan,J.等人，2020年)。SARS-CoV的RBD可包含SARS-CoV S蛋白质的残基306至527和/或318至510；MER-CoV S的RBD可包含MERS-CoV S蛋白质的残基377至588(Yi,C.等人，2020年；Tai,W.等人，2020年)。本领域技术人员将理解，如残基数量所定义的RBD的边界可略微变化并且如上所见。因此，RBD可包含具有以上定义的残基的氨基酸序列或其变体。
RBM是S蛋白质的S1亚基的基序，并且在RBD内，其与宿主受体结合。SARS-CoV-2的RBM可表示为SEQ ID NO:17，并且在一些实施方案中，SARS-CoV-2的RBM包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基438至506(Lan,J.等人，2020年)。本领域技术人员将理解，如残基数量所定义的RBM的边界可略微变化。因此，RBM可包含具有以上定义的残基的氨基酸序列或其变体。
HR1是七肽重复序列，其与HR2七肽重复序列形成6-螺旋束(6HB)，该6HB使病毒包膜与宿主细胞膜紧密接近以进行融合。HR1可表示为SEQ ID NO:35，并且在一些实施方案中包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基910至988。在其他实施方案中，HR1可包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基912至984或920至970(Xia,S.等人，2020年)。SARS-CoV的HR1可包含SARS-CoV S蛋白质的残基902至952。本领域技术人员将理解，由残基编号定义的HR1的边界可略微变化。因此，HR1可包含具有以上定义的残基的氨基酸序列或其变体。
HR2是七肽重复序列，其与HR2七肽重复序列形成6-螺旋束(6HB)，该6HB使病毒包膜与宿主细胞膜紧密接近以进行融合。HR2可表示为SEQ ID NO:19，并且在一些实施方案中包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基1159至1211。在其他实施方案中，HR2可包含SARS-CoV-2S蛋白质的残基1163至1202(Xia,S.等人，2020年)。SARS-CoV的HR2可包含SARS-CoV S蛋白质的残基1145至1184。本领域技术人员将理解，由残基编号定义的HR2的边界可略微变化。因此，HR2可包含具有以上定义的残基的氨基酸序列或其变体。
HR1和HR2区是冠状病毒S蛋白质的S2亚基的关键功能区，是病毒包膜与宿主细胞膜融合所必需的。与关键功能区结合或接近的抗体，即针对关键功能区的抗体，能够立体地或以其他方式阻断、干扰或阻止所述区的病毒功能。通过提供HR1和/或HR2的一个或多个序列，本发明的多肽刺激生成针对HR1和/或HR2的中和/或广泛作用的抗体，这些抗体排除病毒进入宿主细胞。这不同于HR1和/或HR2(无论是天然形式还是钉合形式)的分离的氨基酸序列通过直接将所述HR1和/或HR2序列与冠状病毒自身的HR1和/或HR2结合来直接抑制冠状病毒进入以及随后排除冠状病毒相关HR1-HR2 6HB的形成的任何用途，如例如CN111560054和CN111732637中所述。
RBD和RBM是冠状病毒S蛋白质的S1亚基的关键功能区，是冠状病毒-宿主受体结合所必需的。与关键功能区结合并且针对关键功能区的抗体，能够立体地或以其他方式阻断、干扰或阻止所述区的病毒功能。通过提供RBD的一个或多个序列，任选地进一步提供RBM，本发明的多肽刺激生成针对RBD和任选地RBM的中和/或广泛作用的抗体，这些抗体排除病毒S1与宿主受体的结合。
在一些实施方案中，当天然蛋白质序列是刺突蛋白质或其部分的序列时，本发明的该两个或更多个肽片段可包含如下详述的序列SEQ ID NO 1至12中的任一者或其变体。在另一个实施方案中，本发明的该三个或更多个肽片段的任一者可包含如下详述的序列SEQ ID NO:1至12中的任一者或其变体。在另一个实施方案中，多肽包含如下详述的序列SEQ ID NO 1至12中的一者或多者、两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或更多者、十者或更多者、十一者或更多者、或十二者，或其变体：
PF1(30aa)：SVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNV
(SEQ ID NO:1)
PF2(30aa)：GVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQI
(SEQ ID NO:2)
PF3(30aa)：YADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKL
(SEQ ID NO:3)
PF4(30aa)：APGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNN
(SEQ ID NO:4)
PF5(30aa)：PDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRL
(SEQ ID NO:5)
PF6(30aa)：LDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDIST
(SEQ ID NO:6)
PF7(30aa)：FRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEG
(SEQ ID NO:7)
PF8(30aa)：EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT
(SEQ ID NO:8)
PF9(31aa)：FNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFE
(SEQ ID NO:9)
PF10(36aa)：DISGINASVVNIQKEIDRLNVAKNLNESLIDLQELG
(SEQ ID NO:10)
PF11(30aa)：EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKW
(SEQ ID NO:11)
PF12(30aa)：IDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIV
(SEQ ID NO:12)
在这种实施方案中，天然蛋白质序列是SARS-Cov-2的S蛋白质，并且具有如下的氨基酸序列(Uniprot登录号P0DTC2)：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
(SEQ ID NO:13)
在一些实施方案中，天然蛋白质序列的部分是具有下列序列的SARS-CoV-2的S蛋白质的S1亚基：
SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，天然蛋白质序列的部分是RBD，并且具有如下氨基酸序列或其变体：
CPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFE
(SEQ ID NO:15)
或
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKK
(SEQ ID NO:16)
或
ITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
(SEQ ID NO:50)
在一些实施方案中，天然蛋白质序列的部分是RBM，具有如下氨基酸序列或其变体：
SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ
(SEQ ID NO:17)
或
QTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ
(SEQ ID NO:51)
SEQ ID NO:10至12包含源自SARS-CoV-2的S蛋白质的S2亚基的序列。在一些实施方案中，天然蛋白质序列的部分是S2亚基，具有如下氨基酸序列或其变体：
SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
(SEQ ID NO:18)
SEQ ID NO:18由SEQ ID NO:13的残基686至1273组成。
SEQ ID NO:10至12包含至少部分地源自SARS-CoV-2的S蛋白质的S2亚基的HR2区的序列。在一些实施方案中，天然蛋白质序列的部分是HR2区，具有如下氨基酸序列或其变体：
HTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK
(SEQ ID NO:19)
在一些实施方案中，多肽包含肽片段，这些肽片段至少部分地源自SARS-CoV-2的S蛋白质的S2亚基的HR1区的序列。在一些实施方案中，天然蛋白质序列的部分是HR1区，具有如下氨基酸序列或其变体：
GVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVE
(SEQ ID NO:20)
SEQ ID NO:20由SEQ ID NO:13的残基910至988组成。
在一些实施方案中，该天然蛋白质序列是存活蛋白，选自下列存活蛋白同工型中的任一者：
(142aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAEAGFIHCPTEN EPDLAQCFFCFKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVKKQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK KKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD
(SEQ ID NO:21)
这涉及存活蛋白同工型1(Uniprot标识符O15392-1)，但是在一些实施方案中，序列可源自存活蛋白同工型2(Uniprot标识符O15392-2，SEQ ID NO:22)、3(Uniprot标识符O15392-3，SEQ ID NO:23)、4(Uniprot标识符O15392-4，SEQ ID NO:24)、5(Uniprot标识符O15392-5，SEQ ID NO:25)、6(Uniprot标识符O15392-6，SEQ ID NO:26)或7(Uniprot标识符O15392-7，SEQ ID NO:27)中的一者或多者或作为其的变体。
(165aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN
EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIGPGTVA YACNTSTLGG RGGRITREEH
KKHSSGCAFL SVKKQFEELT LGEFLKLDRE RAKNKIAKET NNKKKEFEET
AKKVRRAIEQ LAAMD
(SEQ ID NO:22)
(137aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN
EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPMQRKPTI RRKNLRKLRR KCAVPSSSWL
PWIEASGRSC LVPEWLHHFQ GLFPGATSLP VGPLAMS
(SEQ ID NO:23)
(120aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN
EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE
FLKLDRERAK NKIERALLAE
(SEQ ID NO:24)
(117aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN
EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGEFLKLVRETLPPPRSFIR
(SEQ ID NO:25)
(78aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN
EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPMRELC
(SEQ ID NO:26)
(74aa)
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAEAGFIHCPTEN
EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPM
(SEQ ID NO:27)
本领域技术人员将理解，可为上述肽中的每一者提供核酸序列(DNA或RNA，或两者的混合物)，并且这对于本领域技术人员来说是常规的。例如，编码SEQ ID NO:21的DNA序列如下。
(426bp)
ATGGGCGCCCCCACCCTGCCCCCCGCCTGGCAGCCCTTCCTGAAGGACCACAGGATCAGCACCTTCAAGAACTGGCCCTTCCTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCCGAGAGGATGGCCGAGGCCGGCTTCATCCACTGCCCCACCGAGAACGAGCCCGACCTGGCCCAGTGCTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAGGGCTGGGAGCCCGACGACGACCCCATCGAGGAGCACAAGAAGCACAGCAGCGGCTGCGCCTTCCTGAGCGTGAAGAAGCAGTTCGAGGAGCTGACCCTGGGCGAGTTCCTGAAGCTGGACAGGGAGAGGGCCAAGAACAAGATCGCCAAGGAGACCAACAACAAGAAGAAGGAGTTCGAGGAGACCGCCAAGAAGGTGAGGAGGGCCATCGAGCAGCTGGCCGCCATGGAC
(SEQ ID NO:28)
在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
(30aa)
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEG
(SEQ ID NO:29)
(30aa)
DHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIH
(SEQ ID NO:30)
(28aa)
ACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFF
(SEQ ID NO:31)
(29aa)
PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE
(SEQ ID NO:32)
(30aa)
FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK
(SEQ ID NO:33)
(28aa)
EHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLK
(SEQ ID NO:34)
(29aa)
QFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNK
(SEQ ID NO:35)
(30aa)
RERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAI
(SEQ ID NO:36)
(21aa)
KEFEETAEKVRRAIEQLAAMD
(SEQ ID NO:37)
并且该多肽引发了免疫应答或具有免疫刺激性。
在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段包含与SEQ ID NO 32和/或SEQ ID NO33具有至少90％同一性的序列。
并且该多肽引发了免疫应答，任选地是T细胞应答。
在一些实施方案中，该天然蛋白质序列是人乳头瘤病毒(HPV)的E6或E7蛋白质。
在一些实施方案中，天然蛋白质序列是：
(158aa)
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL
(SEQ ID NO:38)
或
(98aa)
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRA HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
(SEQ ID NO:39)
SEQ ID NO:38是人乳头瘤病毒16的E6肽(Uniprot标识符：P03126)。SEQ ID NO:39是人乳头瘤病毒16的E7肽(Uniprot标识符：P03129)。
在一些实施方案中，该两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
(35aa)
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE
(SEQ ID NO:40)
(35aa)
EQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK
(SEQ ID NO:41)
(35aa)
HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMG
(SEQ ID NO:42)
(23aa)
IRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
(SEQ ID NO:43)
在另一方面，本发明提供了编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸和/或编码包含两个或更多个肽片段的多肽的一种或多种多核苷酸，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自该天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于该两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列。换句话说，第一方面的多肽和/或天然蛋白质可作为编码所述多肽和/或天然蛋白质的一种或多种多核苷酸提供。因此，第一方面的任何实施方案同样适用于该方面，并且对于本领域技术人员来说，推导SEQ ID NO:1至27和29至43中的任一者所需的多核苷酸的编码序列将是常规的，如以上用SEQ ID NO:28所示。
在本发明的另一方面，提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用根据前述方面中任一项所述的制剂。在一些实施方案中，多肽和天然蛋白质序列或其部分同时、分开或顺序地施用给受试者。
本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的组合物，其中该组合物包含根据前述方面所述的制剂的多肽和天然蛋白质序列或其片段，并且其中多肽与天然蛋白质序列或其部分，或编码天然蛋白质序列或其部分和/或多肽的一种或多种多核苷酸共同施用。
本发明的另一方面提供了一种制备疫苗的方法，该方法包括在体外的一个或多个细胞中表达编码根据任一前述方面所述的天然蛋白质序列或其部分和多肽的一种或多种多核苷酸，以及纯化该天然蛋白质序列或其部分和多肽。在一些实施方案中，将所纯化的天然蛋白质序列或其部分和多肽组合成单一制剂。
本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的试剂盒，该试剂盒包含根据上述方面中的任一项所述的天然蛋白质序列或其部分，或编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸，和根据上述方面所述的多肽，或编码多肽的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含药学上可接受的载体。
本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，该方法包括：施用根据前述方面中任一项所述的天然蛋白质序列或其部分，或编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸，以及施用根据前述方面中任一项所述的多肽，或编码多肽的一种或多种多核苷酸。
在一些实施方案中，其中天然蛋白质序列或其部分，或编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸与多肽或编码多肽的一种或多种多核苷酸同时、依次或分开施用。
应当理解，这种方法还提供了一种用于根据该方法使用的组合物，所述组合物包含如上所述的多肽、天然蛋白质或其部分、和/或编码多肽的该一种或多种多核苷酸、和/或编码天然蛋白质或其部分的该一种或多种多核苷酸。
本领域技术人员将理解，在某些实施方案中，天然蛋白质序列不是来自冠状病毒，特别是它不是RBD、RBM以及/或者S1和/或S2肽序列。应当理解，尽管某些实施方案可能涉及冠状病毒、HPV和/或存活蛋白，但本发明可广泛应用于期望产生免疫原性应答的任何数量的天然蛋白质序列。已经理解本公开的技术人员将能够获得合适的ROP，并将其与其所基于的天然蛋白质或其部分组合，以便产生根据本发明的高度免疫原性疫苗制剂。
实施例1-将针对SARS-CoV-2蛋白质产生的ROP与天然刺突蛋白质序列的一部分组合
针对SARS-CoV-2蛋白质结构域设计了多肽疫苗(“ROP-COVS”)，这些蛋白质结构域最积极地参与病毒进入宿主细胞。它具有下列氨基酸序列：MHHHHHHSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVLRMKGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQILRMKYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLLRMKAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLRMKPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLLRMKLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTLRMKFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGLRMKEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTLRMKFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELRMKDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGLRMKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWLRMKIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIV
(SEQ ID NO:44)
ROP-COVS是包含12个肽片段(“PF”)的重组多肽，每个肽片段通过组织蛋白酶S的LRMK切割序列与下一个连接，使得PF可在被组织蛋白酶S消化后在细胞内释放。根据ROP中的连续氨基酸位置，每个PF被编号为1至12，其中PF1是最接近N末端的OSP，并且PF12是最接近C末端的PF。Pf的序列如下：
PF1(30aa)：SVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNV(SEQ ID NO:1)
PF2(30aa)：GVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQI(SEQ ID NO:2)
PF3(30aa)：YADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKL(SEQ ID NO:3)
PF4(30aa)：APGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNN(SEQ ID NO:4)
PF5(30aa)：PDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRL(SEQ ID NO:5)
PF6(30aa)：LDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDIST(SEQ ID NO:6)
PF7(30aa)：FRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEG(SEQ ID NO:7)
PF8(30aa)：EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT(SEQ ID NO:8)
PF9(31aa)：FNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFE(SEQ ID NO:9)
PF10(36aa)：DISGINASVVNIQKEIDRLNVAKNLNESLIDLQELG(SEQ ID NO:10)
PF11(30aa)：EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKW(SEQ ID NO:11)
PF12(30aa)：IDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIV(SEQ ID NO:12)
每个PF与至少一个其他共享其序列的一部分(也称为“重叠”)。例如，PF2的氨基酸1至15包含PF1的氨基酸16至30，即所谓的重叠；PF3的氨基酸1至15包含PF2的氨基酸16至30，即另一个所谓的重叠。
1.基因序列设计
选择PF1至9以平铺SARS-CoV-2S1受体结合结构域(“RBD”)(SEQ ID NO:15或16)，并包含许多完整或部分抗体和RBD的T细胞表位。选择PF10至12以平铺SARS-CoV-2S2 HR2区(SEQ ID NO:19)的C末端和S2的近侧区(SEQ ID NO:18的氨基酸483至543)，并包含完整或部分抗体及其T细胞表位。每个PF或“肽片段”通过LRMK序列与下一个连接。图4中示意性地示出了所得设计的ROP-COVS。加入N末端His6标签用于ROP-COVS的纯化。
编码所得His标记的ROP-COVS蛋白质的大肠杆菌密码子优化的基因序列如SEQ IDNO:45所示。
CATATGCATCACCACCATCATCATAGCGTCCTGTACAACAGCGCGAGCTTTTCCACCTTCAAATGCTACGGCGTTAGTCCGACCAAACTGAACGATCTGTGCTTCACCAACGTCCTGCGTATGAAAGGCGTTAGTCCGACCAAACTGAACGATCTGTGCTTCACCAACGTCTACGCA
GATAGCTTCGTAATTCGCGGCGACGAAGTTCGTCAAATCCTGCGCATGAAATACGCCGA
TAGCTTCGTAATTCGCGGCGACGAAGTTCGTCAAATTGCACCGGGTCAAACCGGTAAAA
TTGCGGATTACAACTACAAACTGCTGCGCATGAAAGCACCGGGTCAGACCGGCAAAATT
GCGGATTACAACTACAAACTGCCGGACGATTTCACCGGTTGCGTTATTGCCTGGAACAG
CAACAACCTGCGTATGAAACCGGACGATTTCACCGGTTGCGTTATTGCCTGGAACAGCA
ACAACCTGGATAGCAAAGTCGGCGGCAACTACAACTACCTGTATCGTCTGCTGCGCATG
AAACTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTATAACTACCTGTATCGTCTGTTCCGCAAAAG
CAACCTGAAACCGTTCGAACGCGATATTTCCACCCTGCGCATGAAATTCCGCAAAAGCA
ACCTGAAACCGTTCGAGCGCGATATCAGCACCGAAATTTATCAGGCCGGTTCTACCCCG
TGTAACGGCGTTGAAGGTCTGCGCATGAAAGAAATCTACCAGGCAGGTTCTACCCCGTG
TAACGGCGTTGAAGGTTTCAACTGCTACTTTCCGCTGCAGAGTTACGGTTTTCAGCCGA
CCCTGCGCATGAAATTCAACTGCTACTTTCCGCTGCAGAGCTACGGTTTTCAACCGACC
AACGGCGTAGGTTATCAACCGTATCGCGTTGTCGTTCTGAGCTTCGAACTGCGCATGAA
AGACATCAGCGGTATTAACGCGAGCGTCGTCAACATCCAGAAAGAGATCGACCGTCTGA
ACGAAGTCGCGAAAAACCTGAACGAGAGCCTGATTGATCTGCAAGAACTGGGTCTGCGC
ATGAAAGAAATCGACCGTCTGAACGAAGTCGCGAAAAACCTGAACGAAAGCCTGATCGA
TCTGCAGGAACTGGGCAAATACGAGCAGTACATCAAATGGCTGCGCATGAAAATCGATC
TGCAGGAACTGGGCAAATACGAGCAGTACATCAAATGGCCGTGGTACATCTGGCTGGGT
TTTATTGCCGGTCTGATCGCGATTGTGTAATGAAAGCTT
(SEQ ID NO:45)
该基因序列通过克隆扩增在DH5α大肠杆菌中进行克隆，通过菌落PCR进行鉴定并插入到pET30a载体中(形成质粒Y0028023-1，图1)。
2.蛋白质生产
2.1表达
将质粒Y0028023-1转化到BL21(DE3)大肠杆菌中。电泳分析证实ROP-COVS基因成功插入(图2)。使用含有50mL的LB培养基(含有50μg/mL硫酸卡那霉素)的烧瓶(250mL)进行培养。以1:500的比例接种该菌株。将细菌在37℃下旋转振荡(150rpm)培养过夜。将细胞培养物以1:100的比例转移到1.2L 2YT培养基(含有50μg/mL硫酸卡那霉素)中。一旦OD600值达到0.8，就加入IPTG至最终浓度0.2mM以诱导ROP-COVS的表达。将细菌在37℃下以200rpm的旋转振荡进行培养。
通过4500rpm离心30分钟收获细菌。SDS-PAGE用于分析诱导率，并证明在4小时温育之后成功诱导(图3A)。
2.2包涵体的收集
将收获的湿细菌重悬，并用0.9％NaCl洗涤一次，洗涤比为10mL/g，并且离心条件为4500rpm，4℃，30分钟。在洗涤之后，用10mL/g的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，300mMNaCl，20mM咪唑，1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF，pH 8.0)溶解湿细菌，并通过超声处理裂解沉淀60个循环(3秒开和5秒关)。
在裂解之后，通过SDS-PAGE分析可溶性和不溶性级分，这表明靶蛋白ROP-COVS在细胞中以包涵体的形式表达。通过9500rpm离心30分钟收集包涵体。弃去上清液。然后用洗涤缓冲液1(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，1％Triton X-100，2mM EDTA，5mM DTT，pH 8.0)洗涤包涵体两次，并用洗涤缓冲液2(20mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤包涵体一次。
2.3纯化
将包涵体溶解在缓冲液A(20mM Tris-HCl、300mM NaCl、8M尿素，pH 8.0)中，并在4℃下用磁力混合过夜。将悬浮液离心(18000rpm，30分钟，4℃)以除去未溶解的级分。将上清液上样到用缓冲液A预平衡的Ni-NTA柱(Smart-Lifesciences)中。用在含有300mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中的0mM至300mM咪唑梯度洗脱含有靶蛋白质的级分。SDS-PAGE用于分析纯化结果(图3B)。
2.4重折叠
收集纯度超过95％的级分(图3B泳道6至8中的那些)。透析用于重折叠：将级分首先透析至重折叠缓冲液1(1×PBS，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-精氨酸，1M尿素，5％甘油，0.5％十二烷基肌氨酸钠，pH 7,4)，然后透析至重折叠缓冲液2(1×PBS，5％甘油)。SDS-PAGE用于分析重折叠结果(图3C)。
2.5SARS-CoV-2RBM的产生
在一些实施方案中，RBM与ROP-COVS共同施用。根据标准方法从大肠杆菌表达SARS-CoV-2RBM(SEQ ID NO:17)，并根据标准方法通过亲和层析纯化。
3.接种疫苗以及免疫应答的证实
3.1BALB/c小鼠的准备
从常州卡文斯有限公司(Changzhou Cavens Co.,Ltd)购买40只小鼠(SPF级，5至6周，雌性)。为了使它们适应新的环境，在接种疫苗之前给小鼠喂食一周。
3.2接种疫苗
RBM与ROP-COVS共同施用。将小鼠分成三组，并根据下表2接种。在第0天、第14天和第21天给小鼠接种疫苗。每只小鼠皮下注射100μL抗原(或S蛋白作为对照(SEQ ID NO:13))和MPL的总混合物。按照说明书的要求，遵循MPL的剂量。
在第24天，在最后一次接种疫苗之后3天，处死所有小鼠。
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表1.ROP-COV接种疫苗方案2
3.3替代中和测定(ELISA)
按照3.3的要求从根据上述方案接种的小鼠中提取并分离小鼠血清。根据以下方案进行基于Ig竞争hACE2-RBD结合相互作用的基于ELISA的替代中和测定：
1.用20μg/mL RBD涂布的板(100μL/孔)在4℃下温育过夜。
2.用PBST洗涤板。用2.5％BSA封闭板(200μL/孔)在37℃下温育1小时。
3.用PBST洗涤板。将小鼠血清稀释至1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600。将不同稀释度的血清加入到板(50μL/孔)中。然后将20μg/mL ACE2-hFc加入到板(50μL/孔)中。将板在37℃下温育30分钟。
4.用PBST洗涤板。加入100μL/孔的抗hFc抗体(HRP缀合的)。将板在室温下温育30分钟。
5.用PBST洗涤板。加入100μL/孔TMB底物，并使其静置5分钟至10分钟。
6.向板中加入50μL/孔的15％H2SO4。在450nm处读取OD值。
另选的基于ELISA的替代中和试验也是合适的，例如如以下中所述：Tan,C.W.等人，2020年。
结果如图5所示。用ROP-COVS接种疫苗比用S蛋白质接种疫苗刺激了更高的中和抗体滴度(通过较低的吸光度示出)。用ROP-COVS和RBM两者接种疫苗产生了最高的中和抗体滴度。数据示出，天然序列的一部分和基于所述天然序列的ROP的组合产生了比单独的ROP或单独的天然蛋白质更大的对hACE2-RBD结合相互作用的抑制。这意味着通过组合方法产生的抗体或者具有更高的亲和力或者产生了更多的亲和力，在这种情况下，全长刺突蛋白质用作对照。令人惊讶的是，RBM加ROP产生了比单独刺突蛋白质更强的免疫应答，因为刺突蛋白质含有更长的氨基酸序列，其中潜在地具有更多的表位以刺激免疫应答。然而，高度免疫原性ROP结构加上刺突蛋白质的一部分的组合似乎产生了比单独的任一种高得多的抗体滴度。
根据标准方案，使用从小鼠血清纯化的IgG重复该替代中和测定。结果如图6所示。在100μg/mL和更低的浓度下，响应ROP-COVS的中和滴度高于响应S蛋白质的中和滴度。用ROP-COVS和RBM的组合接种疫苗再次刺激了在所有IgG浓度下的最高中和抗体滴度。
3.4中和测定
根据方案1和/或2对小鼠进行接种，并按照3.3的要求提取并分离血清。根据标准方案，例如Nie,J.等人或Schmidt F等人所述，用假型或嵌合SARS-CoV-2病毒颗粒进行中和测定。更优选地，中和测定使用具有复制能力的SARS-CoV-2在BSL-3上使用如Amanat,F.等人所述的标准方案进行。
结果证明，用ROP-COVS以及用ROP-COVS+RBM的组合接种的小鼠产生的抗体阻断了病毒进入和/或复制。结果证明，ROP-COVS+RBM的组合比单独的ROP-COVS更有效地生成了中和抗体。
3.5 T细胞应答的ELISPOT分析
从处死的小鼠(已经根据方案1和/或2进行接种)中提取脾，并通过筛网拉紧，加载到鼠脾细胞分离培养基(Solarbio)中，并在1000g下离心22分钟，然后将分层的淋巴细胞转移到含有细胞培养基的新管中。用RPMI 1640洗涤细胞两次。在ELISPOT测定中，每孔2.5×105个脾细胞用于刺激。按照生产商的说明书的要求，使用微珠试剂盒(美天旎，德国(Miltenyi,Germany))通过阴性或阳性选择来纯化CD4+或CD8+T细胞。使用ELISPOT试剂盒(Mabtech，瑞典)进行测定。
简言之，在抗-5IFN-γ-Ab预涂布的板(密理博(Millipore))中，用5μg/孔SARS-CoV-2S蛋白质或ROP-COVS再刺激脾细胞过夜。弃去细胞，并加入生物素化的抗IFN-γ抗体，在室温下温育两小时，随后在室温下与碱性磷酸酶(ALP)偶联的链霉亲和素再温育一小时。在显色之后，通过用自来水洗涤板来停止反应，并将板风干。用ELISPOT读数器(CTL)对斑点进行计数。结果证明，ROP-COVS可刺激显著的CD4+和CD8+T细胞应答。
3.6临床前试验
体内临床前试验可按照标准方案进行(参见例如-Fontela,C.等人)。测量中和抗体滴度和ELISpot测定PMBC T细胞应答。结果证明，单独用ROP-COVS接种疫苗或与RBM组合产生了保护性抗SARS-CoV-2免疫应答。
实施例2-将存活蛋白-ROP与天然肽存活蛋白组合
材料和方法
为了验证将上述天然蛋白质序列与多肽组合的方法，使用了小鼠存活蛋白和重组重叠肽(ROP)的小鼠模型，该ROP具有产生针对小鼠存活蛋白的免疫应答的能力。应当理解，下列序列包括His标签，但这是任选的，并且可被除去或用另一种标签替换。
1.序列：
本文使用的小鼠存活蛋白序列如下：
小鼠存活蛋白：
MHHHHHHGAP ALPQIWQLYL KNYRIATFKN WPFLEDCACT PERMAEAGFI HCPTENEPDLAQCFFCFKEL EGWEPDDNPI EEHRKHSPGC AFLTVKKQME ELTVSEFLKL DRQRAKNKIA KETNNKQKEFEETAKTTRQS IEQLAA(SEQ ID NO:46)
ROP的序列如下：
小鼠ROP-存活蛋白：
MHHHHHHGAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDLRMKNYRIATFKNWPFLEDCACTP
ERMAEAGFIHLRMKCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCLRMKCPTENEPDLAQC
FFCFKELEGWEPDDNPIELRMKFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKLRMKEHRK
HSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLDLRMKKQMEELTVSEFLKLDRQRAKNKIAKETNNK
LRMKRQRAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAA
(SEQ ID NO:47)
2.动物
雌性C57BL/6小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司(Changzhou KavinsExperimental Animal Co.LTD)。这些动物没有特定的病原体，并且到达后大约6周至7周龄。在接收时，将动物打开包装并放入笼中。对每只动物进行健康检查，包括对皮毛、四肢和五窍的评估。还检查每只动物的姿势或运动的任何异常征象。将动物圈养在透明的聚碳酸酯塑料笼(260mm×160mm×120mm)中；每笼2只至5只动物。垫料是玉米穗轴垫料(辐射过的，山东古德韦生物技术有限公司，中国(Shandong Goodway Biotechnology Co.,Ltd.,China))，每周更换一次。以每小时15次至25次换气的速率向室内提供HEPA过滤空气。温度保持在20℃至26℃(68°F至79°F)。照明是荧光灯，光照12小时(08:00至20:00)和黑暗12小时。动物可自由摄取啮齿动物食物(舒克贝塔有限公司，中国(Shuck Beta Co.,Ltd.,China))。来自市政供水的水通过反渗透或高压灭菌器过滤。
3.表达/纯化
当OD600达到0.5至0.8时，用0.2mM IPTG诱导N末端His-标记的ROP-存活蛋白或存活蛋白蛋白质的表达。在15℃下进行诱导16小时。
为了制备细菌裂解物，将细菌悬浮于20mM PB(pH7.2，含有300mM NaCl、20mM咪唑、1％Triton X-100、1mM DTT和1mMPMSF)中，并超声处理。用20mM PB(pH7.2，含有300mMNaCl、1％Triton X-100、2mM EDTA和5mM DTT)洗涤包涵体(IB)。最后，将清洗后的IB用20mMPB(pH7.2，含有300mM NaCl、8M尿素和20mM咪唑)溶解。在15,000rpm下离心1小时之后，将上清液上样到Ni2+-次氮基三乙酸酯(Ni-NTA)琼脂糖柱上，用含有50mM咪唑的缓冲液A洗涤，并用含有100mM咪唑的缓冲液A洗脱。在4℃下进行重折叠。首先将洗脱的蛋白质缓冲液换成含有4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-精氨酸、1M尿素和5％甘油的1×PBS(pH7.4)，然后通过透析换成PBS。在重折叠之后，将蛋白质溶液通过0.22μm过滤器过滤并储存在-80℃下。
4.接种疫苗
根据体重将小鼠随机分成4组，并接种三次，如下表所示：
5.ELISA
在4℃下，将纯化的小鼠存活蛋白或小鼠ROP-存活蛋白(4μg/mL)在PBS中在平底96孔微量滴定板(Corning-Costar)上涂布过夜。在室温下用5％BSA封闭孔1小时。然后与小鼠血清(在PBS中以1:10000稀释)在室温下温育1小时。通过使用HRP偶联的抗小鼠IgG二抗检测结合。在洗涤之后，通过加入100μL的TMB底物溶液使板显色。停止反应，并使用分光计测量450nm处的吸光度。
结果
小鼠存活蛋白和小鼠ROP-存活蛋白的纯化
如图7所示，纯化小鼠存活蛋白，并使用小鼠抗His抗体检测。在SDS-PAGE中，泳道1示出了在适当分子量(约66kDa)下指示BSA对照的线，并且泳道2和3示出了在适当分子量(约16kDa)下指示小鼠存活蛋白的条带。蛋白质印迹示出了使用小鼠抗His抗体可检测His-标记的小鼠存活蛋白。
同样，图8示出了小鼠ROP-存活蛋白被纯化并使用小鼠抗His抗体可检测。在SDS-PAGE(左手侧)中，泳道1示出了在合适分子量(约66kDa)下指示BSA对照的线，并且泳道2和3示出了在适当分子量(约33kDa)下指示小鼠ROP-存活蛋白的条带。蛋白质印迹示出了使用小鼠抗His抗体可检测His-标记的小鼠ROP-存活蛋白。
针对小鼠存活蛋白产生的抗体的检测
图9示出了单独施用小鼠ROP-存活蛋白和如上所述与小鼠存活蛋白组合施用在小鼠血清中产生了与小鼠存活蛋白涂布的板结合的高得多水平的抗体。ELISA结果示出，与仅MPL和PBS组相比，小鼠ROP-存活蛋白和小鼠ROP-存活蛋白加小鼠存活蛋白免疫组中的吸光度均显著更高，这表明针对单独的ROP-存活蛋白和与小鼠存活蛋白组合产生了免疫应答(P＜0.0001，单因素方差分析和事后检验)。
值得注意的是，小鼠ROP-存活蛋白与小鼠存活蛋白的共同施用在来自用这两种组合处理的小鼠血清中产生了与用单独的ROP-存活蛋白处理的那些相比显著更高的吸光度(P＜0.01，单因素方差分析和事后检验)。这表明组合治疗在促进免疫应答方面比单独的ROP-存活蛋白更有效。
针对小鼠存活蛋白产生的抗体的检测
图10示出了单独施用小鼠ROP-存活蛋白和如上所述与小鼠存活蛋白组合施用在小鼠血清中产生了与小鼠ROP-存活蛋白涂布的板结合的高得多水平的抗体。ELISA结果示出，与仅MPL和PBS组相比，小鼠ROP-存活蛋白和小鼠ROP-存活蛋白加小鼠存活蛋白免疫组中的吸光度均显著更高，这表明针对单独的ROP-存活蛋白和与小鼠存活蛋白组合产生了免疫应答(P＜0.0001，单因素方差分析和事后检验)。
与针对小鼠存活蛋白涂布的板的ELISA一样，似乎值得注意的是，小鼠ROP-存活蛋白与小鼠存活蛋白的共同施用在来自用这两种组合处理的小鼠血清中产生了与用单独的ROP-存活蛋白处理的那些相比显著更高的吸光度(P＜0.001，单因素方差分析和事后检验)。这表明组合处理似乎提供了对小鼠存活蛋白和小鼠ROP-存活蛋白蛋白质两者的增强的抗体应答。
实施例3-将HPV16 E7-ROP与天然E7肽组合
材料和方法
为了验证如上所述的天然蛋白质序列与多肽组合的方法，使用了使用来自HPV16的E7肽和源自HPV16 E7的重组重叠肽(ROP)的小鼠模型，该ROP具有产生针对HPV16 E7的免疫应答的能力。尽管下文的ROP是His标记的，但是应当理解，可生成没有所述His标记的ROP。
6.序列：
His标记的HPV16E7蛋白质
MHHHHHHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO:48)
His标记的HPV16E7-ROP
MHHHHHHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEELRMKEQLNDSSEE
EDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKLRMKHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHV
DIRTLEDLLMGLRMKIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
(SEQ ID NO:49)
7.动物
雌性C57BL/6小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。这些动物没有特定的病原体，并且到达后大约6周至7周龄。在接收时，将动物打开包装并放入笼中。对每只动物进行健康检查，包括对皮毛、四肢和五窍的评估。还检查每只动物的姿势或运动的任何异常征象。将动物圈养在透明的聚碳酸酯塑料笼(260mm×160mm×120mm)中；每笼2只至5只动物。垫料是玉米穗轴垫料(辐射过的，山东古德韦生物技术有限公司，中国)，每周更换一次。以每小时15次至25次换气的速率向室内提供HEPA过滤空气。温度保持在20℃至26℃(68°F至79°F)。照明是荧光灯，光照12小时(08:00至20:00)和黑暗12小时。动物可自由摄取啮齿动物食物(舒克贝塔有限公司，中国)。来自市政供水的水通过反渗透或高压灭菌器过滤。
8.表达/纯化
当OD600达到0.5至0.8时，用0.2mM IPTG诱导N末端His-标记的ROP-HPV16E7或HPV16E7蛋白质的表达。在15℃下进行诱导16小时。
为了制备细菌裂解物，将细菌悬浮于20mM PB(pH7.2，含有300mM NaCl、20mM咪唑、1％Triton X-100、1mM DTT和1mMPMSF)中，并超声处理。用20mM PB(pH7.2，含有300mMNaCl、1％Triton X-100、2mM EDTA和5mM DTT)洗涤包涵体(IB)。最后，将清洗后的IB用20mMPB(pH7.2，含有300mM NaCl、8M尿素和20mM咪唑)溶解。在15,000rpm下离心1小时之后，将上清液上样到Ni2+-次氮基三乙酸酯(Ni-NTA)琼脂糖柱上，用含有50mM咪唑的缓冲液A洗涤，并用含有100mM咪唑的缓冲液A洗脱。在4℃下进行重折叠。首先将洗脱的蛋白质缓冲液换成含有4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-精氨酸、1M尿素和5％甘油的1×PBS(pH7.4)，然后通过透析换成PBS。在重折叠之后，将蛋白质溶液通过0.22μm过滤器过滤并储存在-80℃下。
9.接种疫苗
根据体重将小鼠随机分成4组，并接种三次，如下表所示：
10.ELISA
在4℃下，将纯化的HPV16E7或ROP-HPV16E7(4μg/mL)在PBS中在平底96孔微量滴定板(Corning-Costar)上涂布过夜。在室温下用5％BSA封闭孔1小时。然后与小鼠血清(在PBS中以1:10000稀释)在室温下温育1小时。通过使用HRP偶联的抗小鼠IgG二抗检测结合。在洗涤之后，通过加入100μL的TMB底物溶液使板显色。停止反应，并使用分光计测量450nm处的吸光度。
结果
结果将示出成功纯化了HPV16E7和ROP-HPV16E7，并可使用抗His抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹(BSA作为对照)进行特异性检测。
此外，结果将示出ROP-HPV16E7和HPV16E7的组合在产生使用上文概述的ELISA在小鼠血清中检测的抗体应答方面比从单独使用ROP-HPV16E7免疫的小鼠中产生的抗体应答更有效。
实施例4-针对SARS-CoV-2疫苗制剂的抗体产生的ELISA测量
免疫
将每个免疫组(如下)的10只小鼠在第0天、第14天、第21天和第28天通过皮下注射进行免疫，如下：
组1-ROP-COVS100μg
组2-RBM 50μg
组3-ROP 50μg+RBM 50μg
组4-PBS(阴性对照)
在第35天，对小鼠放血以准备进行血清的ELISA测试，从而确定响应于上述接种疫苗方案的抗体生成。
在该测定中用于免疫的RBM对应于SEQ ID NO:51。在该试验中用于免疫的ROP对应于SEQ ID NO:44
抗体的ELISA测量
将用每孔100μL的2μg/mL的RBD(SEQ.ID NO:50)溶液涂布的96孔板在4℃下过夜。然后用PBS洗涤板，然后用200μL/孔的2.5％(w/v)BSA溶液在37℃下温育1小时。再次用PBS洗涤平板，然后将100μL以不同血清滴度稀释的小鼠血清加入到每个孔中，并在37℃下温育1小时。在加入山羊抗小鼠HRP抗体之前，在PBS中以1:20000洗涤板，每孔50μL，在室温下温育30分钟。
在加入100μL的TMB显色溶液之前，洗涤板，然后按照制造商的说明书温育5分钟至10分钟。在光谱仪上测定OD450nm处的吸光度之前，向每孔中加入50μL终止液。
图11示出了ELISA的结果。该图示出了每个免疫组的不同血清稀释液在450nm处的吸光度。很明显，与单独的RBM或ROP相比，在用RBM和ROP两者免疫的组中存在更多的吸光度。如预期的，阴性对照组中几乎不存在吸光度。ROP和RBM之间的协同作用通过以下事实示出，即50μg RBM和50μg ROP产生了比单独50μgRBM或单独100μg ROP更大的吸光度，其中差异对于4种稀释滴度是统计学显著的(p＜0.05)。另外，该组合组耐稀释，其中在1:102400、1:409600和1:1638400的稀释下具有比其他三组显著更大的吸光度。这表明通过组合方法产生的抗体应答涉及更高亲和力的抗体或其更大的丰度。协同作用被证明为较低剂量(50μg)的ROP与50μg的RBM组合的应答产生了大于100μg的ROP的应答，并且这不能仅通过累加效应来解释。
实施例5-再刺激来自用存活蛋白疫苗制剂免疫的小鼠的脾细胞
根据下表，根据标准方案从皮下免疫的小鼠中分离脾细胞，每周一次，持续3周的时间：
组 编号 试验制品和剂量
ROP+存活蛋白 10 100μg mROP-存活蛋白+100μg m存活蛋白+MPL
ROP疫苗 10 100μg mROP-存活蛋白+MPL
存活蛋白疫苗 10 100μg m存活蛋白+MPL
PBS 10 PBS
在ELISPOT测定中，用5μg/孔的ROP、存活蛋白或PHA的PBS对每组的脾细胞(2×105个细胞/孔)进行再刺激。阴性对照是加入相同的PBS缓冲液但没有刺激剂。结果示于图12中。
结果示出，ROP-存活蛋白加存活蛋白组的脾细胞在用ROP-存活蛋白(p＜0.001)和存活蛋白(p＜0.01)再刺激后产生了比仅接种存活蛋白组更大的应答。这表明ROP-存活蛋白加存活蛋白接种的小鼠在用基于存活蛋白的抗原攻击时产生了比用任一种单独的疫苗免疫的小鼠更大的免疫应答。ROP与存活蛋白组合产生了强T细胞应答，这部分解释了组合方法相对于单独的天然蛋白质或单独的ROP的协同效应。ROP T细胞应答在组合方法中放大了对天然蛋白质的抗体应答，从而产生了超过或高于任一单独的抗原的效果。
参考文献
Bartsch SM,O'Shea KJ,Ferguson MC,et al.Vaccine Efficacy Needed for aCOVID-19 Coronavirus Vaccine to Prevent or Stop an Epidemic as the SoleIntervention.Am J Prev Med.2020；59(4):493-503.doi:10.1016/j.amepre.2020.06.011
Cai,L.,Zhang,J.,Zhu,R.,Shi,W.,Xia,X.,Edwards,M.,Finch,W.,Coombs,A.,Gao,J.,Chen,K.,Owen,S.,Jiang,S.,&Lu,W.(2017).Protective cellular immunitygenerated by cross-presenting recombinant overlapping peptideproteins.Oncotarget,8(44),76516–76524.https://doi.org/10.18632/ oncotarget.20407Hollingsworth,R.E.,Jansen,K.Turning the corner on therapeuticcancer vaccines.npj Vaccines 4,7(2019).https://doi.org/10.1038/s41541-019- 0103-y
Zhang H,Hong H,Li D,Ma S,Di Y,Stoten A,Haig N,Di Gleria K,Yu Z,Xu XN,
McMichael A,Jiang S.(2009)Comparing pooled peptides with intactprotein for accessing cross-presentation pathways for protective CD8+and CD4+T cells.The Journal of Biological Chemistry.284(14)9184–9191.https://doi.org/ 10.1074/jbc.m809456200
序列表
<110> 牛津疫苗医学公司
<120> 疫苗制剂
<130> P000306WO
<150> GB2106713.7
<151> 2021-05-11
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第一肽片段
<400> 1
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第二肽片段
<400> 2
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第三肽片段
<400> 3
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
1 5 10 15
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
20 25 30
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第四肽片段
<400> 4
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
1 5 10 15
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
20 25 30
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第五肽片段
<400> 5
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
1 5 10 15
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
20 25 30
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第六肽片段
<400> 6
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
1 5 10 15
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第七肽片段
<400> 7
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第八肽片段
<400> 8
Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe
1 5 10 15
Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
20 25 30
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第九肽片段
<400> 9
Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn
1 5 10 15
Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
20 25 30
<210> 10
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第十肽片段
<400> 10
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Asn Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
20 25 30
Gln Glu Leu Gly
35
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第十一肽片段
<400> 11
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp
20 25 30
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明多肽的第十二肽片段
<400> 12
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
1 5 10 15
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val
20 25 30
<210> 13
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 13
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 14
<211> 673
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 14
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
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595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg
<210> 15
<211> 181
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 15
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
1 5 10 15
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
20 25 30
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
35 40 45
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
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Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
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Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
100 105 110
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
115 120 125
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
130 135 140
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
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Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
165 170 175
Val Leu Ser Phe Glu
180
<210> 16
<211> 211
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 16
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
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Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
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145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys
210
<210> 17
<211> 69
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 17
Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser
20 25 30
Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
35 40 45
Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn
50 55 60
Gly Val Gly Tyr Gln
65
<210> 18
<211> 588
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 18
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
20 25 30
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
35 40 45
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
50 55 60
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
65 70 75 80
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
100 105 110
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
130 135 140
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
165 170 175
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
210 215 220
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
225 230 235 240
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
245 250 255
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
275 280 285
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
290 295 300
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
325 330 335
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
340 345 350
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
355 360 365
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
370 375 380
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
385 390 395 400
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
405 410 415
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
420 425 430
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
435 440 445
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
450 455 460
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
465 470 475 480
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
485 490 495
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
500 505 510
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
515 520 525
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met
530 535 540
Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
545 550 555 560
Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser
565 570 575
Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
580 585
<210> 19
<211> 53
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 19
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala
1 5 10 15
Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala
20 25 30
Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
35 40 45
Glu Gln Tyr Ile Lys
50
<210> 20
<211> 79
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 20
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
1 5 10 15
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
35 40 45
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
50 55 60
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
65 70 75
<210> 21
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 22
<211> 165
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr
85 90 95
Arg Glu Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val
100 105 110
Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp
115 120 125
Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys
130 135 140
Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln
145 150 155 160
Leu Ala Ala Met Asp
165
<210> 23
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Met Gln Arg Lys Pro Thr Ile
65 70 75 80
Arg Arg Lys Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg Lys Cys Ala Val Pro Ser
85 90 95
Ser Ser Trp Leu Pro Trp Ile Glu Ala Ser Gly Arg Ser Cys Leu Val
100 105 110
Pro Glu Trp Leu His His Phe Gln Gly Leu Phe Pro Gly Ala Thr Ser
115 120 125
Leu Pro Val Gly Pro Leu Ala Met Ser
130 135
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Glu Arg Ala Leu Leu Ala Glu
115 120
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Val Arg Glu Thr Leu Pro Pro Pro
100 105 110
Arg Ser Phe Ile Arg
115
<210> 26
<211> 78
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Met Arg Glu Leu Cys
65 70 75
<210> 27
<211> 74
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Met
65 70
<210> 28
<211> 426
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
atgggcgccc ccaccctgcc ccccgcctgg cagcccttcc tgaaggacca caggatcagc 60
accttcaaga actggccctt cctggagggc tgcgcctgca cccccgagag gatggccgag 120
gccggcttca tccactgccc caccgagaac gagcccgacc tggcccagtg cttcttctgc 180
ttcaaggagc tggagggctg ggagcccgac gacgacccca tcgaggagca caagaagcac 240
agcagcggct gcgccttcct gagcgtgaag aagcagttcg aggagctgac cctgggcgag 300
ttcctgaagc tggacaggga gagggccaag aacaagatcg ccaaggagac caacaacaag 360
aagaaggagt tcgaggagac cgccaagaag gtgaggaggg ccatcgagca gctggccgcc 420
atggac 426
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自本发明多肽的存活蛋白片段
<400> 29
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly
20 25 30
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据发明2的存活蛋白片段
<400> 30
Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys
1 5 10 15
Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His
20 25 30
<210> 31
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的存活蛋白片段
<400> 31
Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro
1 5 10 15
Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe
20 25
<210> 32
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 存活蛋白片段5
<400> 32
Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys
1 5 10 15
Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu
20 25
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的存活蛋白片段5
<400> 33
Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu
1 5 10 15
His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys
20 25 30
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的存活蛋白片段6
<400> 34
Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys
1 5 10 15
Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys
20 25
<210> 35
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的存活蛋白片段7
<400> 35
Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu
1 5 10 15
Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys
20 25
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的存活蛋白片段8
<400> 36
Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys
1 5 10 15
Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile
20 25 30
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的存活蛋白片段9
<400> 37
Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln
1 5 10 15
Leu Ala Ala Met Asp
20
<210> 38
<211> 158
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 38
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 39
<211> 98
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 39
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据本发明的HPV16肽片段
<400> 40
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明的HPV16肽片段2
<400> 41
Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
20 25 30
Cys Cys Lys
35
<210> 42
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明的HPV肽片段3
<400> 42
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg
1 5 10 15
Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu
20 25 30
Leu Met Gly
35
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 本发明的HPV肽片段4
<400> 43
Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
20
<210> 44
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组重叠蛋白冠状病毒
<400> 44
Met His His His His His His Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe
1 5 10 15
Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu
20 25 30
Cys Phe Thr Asn Val Leu Arg Met Lys Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
35 40 45
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
50 55 60
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Leu Arg Met Lys Tyr Ala Asp Ser Phe
65 70 75 80
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
85 90 95
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Leu Arg Met Lys Ala Pro Gly
100 105 110
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
115 120 125
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Arg Met Lys Pro
130 135 140
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
145 150 155 160
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Leu Arg Met
165 170 175
Lys Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
180 185 190
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Leu
195 200 205
Arg Met Lys Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
210 215 220
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
225 230 235 240
Gly Leu Arg Met Lys Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
245 250 255
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
260 265 270
Gln Pro Thr Leu Arg Met Lys Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
275 280 285
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
290 295 300
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Arg Met Lys Asp Ile Ser Gly Ile Asn
305 310 315 320
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val
325 330 335
Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Leu
340 345 350
Arg Met Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn
355 360 365
Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile
370 375 380
Lys Trp Leu Arg Met Lys Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu
385 390 395 400
Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly
405 410 415
Leu Ile Ala Ile Val
420
<210> 45
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> His-标签的ROP-COVS的密码子优化序列
<400> 45
catatgcatc accaccatca tcatagcgtc ctgtacaaca gcgcgagctt ttccaccttc 60
aaatgctacg gcgttagtcc gaccaaactg aacgatctgt gcttcaccaa cgtcctgcgt 120
atgaaaggcg ttagtccgac caaactgaac gatctgtgct tcaccaacgt ctacgcagat 180
agcttcgtaa ttcgcggcga cgaagttcgt caaatcctgc gcatgaaata cgccgatagc 240
ttcgtaattc gcggcgacga agttcgtcaa attgcaccgg gtcaaaccgg taaaattgcg 300
gattacaact acaaactgct gcgcatgaaa gcaccgggtc agaccggcaa aattgcggat 360
tacaactaca aactgccgga cgatttcacc ggttgcgtta ttgcctggaa cagcaacaac 420
ctgcgtatga aaccggacga tttcaccggt tgcgttattg cctggaacag caacaacctg 480
gatagcaaag tcggcggcaa ctacaactac ctgtatcgtc tgctgcgcat gaaactggat 540
agcaaagtgg gcggcaacta taactacctg tatcgtctgt tccgcaaaag caacctgaaa 600
ccgttcgaac gcgatatttc caccctgcgc atgaaattcc gcaaaagcaa cctgaaaccg 660
ttcgagcgcg atatcagcac cgaaatttat caggccggtt ctaccccgtg taacggcgtt 720
gaaggtctgc gcatgaaaga aatctaccag gcaggttcta ccccgtgtaa cggcgttgaa 780
ggtttcaact gctactttcc gctgcagagt tacggttttc agccgaccct gcgcatgaaa 840
ttcaactgct actttccgct gcagagctac ggttttcaac cgaccaacgg cgtaggttat 900
caaccgtatc gcgttgtcgt tctgagcttc gaactgcgca tgaaagacat cagcggtatt 960
aacgcgagcg tcgtcaacat ccagaaagag atcgaccgtc tgaacgaagt cgcgaaaaac 1020
ctgaacgaga gcctgattga tctgcaagaa ctgggtctgc gcatgaaaga aatcgaccgt 1080
ctgaacgaag tcgcgaaaaa cctgaacgaa agcctgatcg atctgcagga actgggcaaa 1140
tacgagcagt acatcaaatg gctgcgcatg aaaatcgatc tgcaggaact gggcaaatac 1200
gagcagtaca tcaaatggcc gtggtacatc tggctgggtt ttattgccgg tctgatcgcg 1260
attgtgtaat gaaagctt 1278
<210> 46
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带His标签的小鼠存活蛋白
<400> 46
Met His His His His His His Gly Ala Pro Ala Leu Pro Gln Ile Trp
1 5 10 15
Gln Leu Tyr Leu Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro
20 25 30
Phe Leu Glu Asp Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly
35 40 45
Phe Ile His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe
50 55 60
Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile
65 70 75 80
Glu Glu His Arg Lys His Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys
85 90 95
Lys Gln Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg
100 105 110
Gln Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Gln Lys
115 120 125
Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Thr Thr Arg Gln Ser Ile Glu Gln Leu
130 135 140
Ala Ala
145
<210> 47
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠存活蛋白重组重叠肽
<400> 47
Met His His His His His His Gly Ala Pro Ala Leu Pro Gln Ile Trp
1 5 10 15
Gln Leu Tyr Leu Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro
20 25 30
Phe Leu Glu Asp Leu Arg Met Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys
35 40 45
Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala
50 55 60
Glu Ala Gly Phe Ile His Leu Arg Met Lys Cys Ala Cys Thr Pro Glu
65 70 75 80
Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro
85 90 95
Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Leu Arg Met Lys Cys Pro Thr Glu
100 105 110
Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu
115 120 125
Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Leu Arg Met Lys Phe Lys
130 135 140
Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Glu His Arg
145 150 155 160
Lys His Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Leu Arg Met Lys
165 170 175
Glu His Arg Lys His Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Lys
180 185 190
Gln Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Leu Arg
195 200 205
Met Lys Lys Gln Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu
210 215 220
Asp Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys
225 230 235 240
Leu Arg Met Lys Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr
245 250 255
Asn Asn Lys Gln Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Thr Thr Arg Gln
260 265 270
Ser Ile Glu Gln Leu Ala Ala
275
<210> 48
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> His标签的HPV16 E7蛋白
<400> 48
Met His His His His His His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr
1 5 10 15
Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln
20 25 30
Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly
35 40 45
Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys
50 55 60
Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp
65 70 75 80
Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys
85 90 95
Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
100
<210> 49
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HPV 16 E7重组重叠肽
<400> 49
Met His His His His His His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr
1 5 10 15
Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln
20 25 30
Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Leu Arg Met Lys Glu Gln Leu Asn
35 40 45
Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala
50 55 60
Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Leu
65 70 75 80
Arg Met Lys His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser
85 90 95
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
100 105 110
Glu Asp Leu Leu Met Gly Leu Arg Met Lys Ile Arg Thr Leu Glu Asp
115 120 125
Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys
130 135 140
Pro
145
<210> 50
<211> 193
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 50
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
20 25 30
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
85 90 95
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
115 120 125
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
165 170 175
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
180 185 190
Val
<210> 51
<211> 93
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 51
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
1 5 10 15
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
20 25 30
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
35 40 45
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
50 55 60
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
65 70 75 80
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
85 90

Claims (28)

1.一种用于免疫和/或治疗受试者的制剂，所述制剂包含：
(i)多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自所述天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列；和
(ii)所述天然蛋白质序列或其部分。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的制剂，其中所述一个或多个重叠序列的长度介于2至31个氨基酸之间，任选地其中所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是外源蛋白酶切割位点，任选地是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，其中所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制剂，所述制剂进一步包含药学上可接受的载体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制剂，所述制剂进一步包含佐剂，优选地是单磷酸酯脂质A(MPL)、montanide、基于明矾的佐剂、水包油剂或油包水剂，更优选地是单磷酸酯脂质A、montanide、基于明矾的佐剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述多肽的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间，并且所述天然蛋白质序列或其部分的浓度为10μg.kg-1至10000μg.kg-1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述天然蛋白质序列是冠状病毒的S蛋白质。
10.根据权利要求9所述的制剂，其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，任选地是SARS-CoV-2。
11.根据权利要求9或10所述的制剂，其中所述冠状病毒是人冠状病毒。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的制剂，其中所述多肽的所述两个或更多个肽片段中的至少两者包含源自所述S蛋白质的S1和/或S2亚基的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含源自所述S蛋白质的所述S1和/或S2亚基的序列。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的制剂，其中所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含源自受体结合结构域(RBD)的序列，任选地是所述S1亚基的受体结合基序(RBM)，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含所述受体结合结构域(RBD)，任选地是所述S1亚基的所述受体结合基序(RBM)。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的制剂，其中所述两个或更多个肽片段的至少一者包含源自所述S2亚基的HR2和/或HR1结构域的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含所述S2亚基的所述HR2和/或HR1结构域。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述天然蛋白质序列是存活蛋白，其选自下列存活蛋白同工型中的任一者：
同工型1
同工型2
同工型3
同工型4
同工型5
同工型6
同工型7。
16.根据权利要求15所述的制剂，其中所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEG、
DHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIH、
ACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFF、
PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE、
FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK、
EHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLK、
QFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNK、
RERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAI和/或
KEFEETAEKVRRAIEQLAAMD
并且其中所述多肽引发免疫应答或具有免疫刺激性。
17.根据权利要求15或16所述的制剂，其中所述两个或更多个肽片段包含与以下项具有至少90％同一性的序列
PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE和/或
FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK，
并且
其中所述多肽引发免疫应答，任选地是T细胞应答。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述天然蛋白质序列是人乳头瘤病毒(HPV)的E6或E7蛋白质。
19.根据权利要求18所述的制剂，其中所述天然蛋白质序列是：
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY
DFAFRDLCIV YRDGNPYAVC DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN
KPLCDLLIRC INCQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNIRGRWT GRCMSCCRSS
RTRRETQL；或
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA
HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP。
20.根据权利要求18或19所述的制剂，其中所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE、
EQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK、
HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMG和/或
IRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。
21.一种用于免疫和/或治疗受试者的制剂，所述制剂包含：编码根据权利要求1至20中任一项所述的天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸和/或编码所述的多肽的一种或多种多核苷酸。
22.一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用根据权利要求1至21中任一项所述的制剂。
23.一种用于免疫和/或治疗受试者的组合物，其中所述组合物包含根据权利要求1至21中任一项所述的制剂，
其中所述多肽与所述天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分和/或所述多肽的所述一种或多种多核苷酸共同施用。
24.一种制造疫苗的方法，所述方法包括：
在体外的一个或多个细胞中表达编码根据权利要求1至20中任一项所述的天然蛋白质序列或其部分和多肽的一种或多种多核苷酸，以及
纯化所述天然蛋白质序列或其部分和所述多肽。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所纯化的天然蛋白质序列或其部分和所述多肽被组合到单一制剂中。
26.一种用于免疫和/或治疗受试者的试剂盒，所述试剂盒包含：
根据权利要求1至20中任一项所述的天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸，和
根据权利要求1至20中任一项所述的多肽，或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸。
27.一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，所述方法包括：施用根据权利要求1至20中任一项所述的天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸，以及
施用根据权利要求1至20中任一项所述的多肽，或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述天然蛋白质序列或其部分、或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸与所述多肽或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸同时、依次或分开施用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0608368D0 (en) 2006-04-28 2006-06-07 Isis Innovation Process for making Oligopeptides
CN105753989A (zh) 2014-12-15 2016-07-13 牛津疫苗医学生物科技（英国）有限公司 人工多抗原融合蛋白及其制备和应用
IL260296B2 (en) * 2016-01-04 2024-01-01 Cour Pharmaceuticals Dev Company Inc Particles thermalize fusion proteins containing associated epitopes
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CN112226445B (zh) 2020-10-20 2021-05-11 成都欧林生物科技股份有限公司 编码SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的核酸及其的应用
CN112220920B (zh) 2020-10-30 2023-06-13 上海泽润生物科技有限公司 一种重组新型冠状病毒疫苗组合物
CN112480217B (zh) 2020-11-30 2022-04-08 广州阿格纳生物医药制造有限公司 基于SARS-CoV-2的S抗原蛋白的疫苗和组合物

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