CN111560054A - 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法 - Google Patents

抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111560054A
CN111560054A CN202010550481.9A CN202010550481A CN111560054A CN 111560054 A CN111560054 A CN 111560054A CN 202010550481 A CN202010550481 A CN 202010550481A CN 111560054 A CN111560054 A CN 111560054A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
novel coronavirus
region
seq
infection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010550481.9A
Other languages
English (en)
Inventor
冷国庆
张琪
郝淮杰
苏宏健
田辉
王丽莉
杨文龙
余荣熹
冷宁
王艳
张凤莲
景文岩
黄天一
高云龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Jixianglong Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Harbin Jixianglong Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Jixianglong Biological Technology Co ltd filed Critical Harbin Jixianglong Biological Technology Co ltd
Priority to CN202010550481.9A priority Critical patent/CN111560054A/zh
Publication of CN111560054A publication Critical patent/CN111560054A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法。属于生物医药技术领域。筛选方法包括获得新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白基因序列；确定新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白区域的HR1区域和HR2区域；选取HR2区域30～36个氨基酸组成的天然肽段作为抑制新型冠状病毒感染的多肽；在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸‑赖氨酸或谷氨酸‑精氨酸对形成多肽链内盐桥。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明公开了抑制新型冠状病毒感染的多肽，能与HR1P形成稳定的6‑HB螺旋结构，具有抑制新型冠状病毒感染侵入细胞的能力。

Description

抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法。
背景技术
冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，与人和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸系统、消化系统和神经系统疾病。
新型冠状病毒SARS-CoV-2成为继HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV后感染人类的第7种冠状病毒。作为新突发传染病，针对新型冠状病毒肺炎，临床上尚无特异性治疗的药物，目前主要采用对症治疗的方法，并在此基础上积极防治并发症，及时进行器官功能的支持。
S蛋白是冠状病毒重要的结构蛋白，以三聚体的形式在病毒表面形成特殊的花冠结构，并在宿主细胞蛋白酶的作用下被裂解为S1和S2部分。其中，S1主要功能是与宿主细胞表面受体结合，S2亚基介导病毒-细胞以及细胞-细胞膜融合。S2亚基分为FP(融合肽)、HR1(七肽重复区1)和HR2(七肽重复区2)三个主要区域。S1和受体结合后，S2蛋白发生构象改变，将FP插入到宿主细胞膜中，而后三条HR1与三条HR2形成发卡结构，最终形成六螺旋结构(6-HB)将病毒的包膜与宿主细胞膜拉近，导致膜融合，最终将病毒的基因组释放到宿主细胞中。
在冠状病毒入侵细胞过程中，六螺旋结构(6-HB)的形成是必需的步骤，是目前阻断病毒入侵的一个重要的药物开发靶点，因此可以设计一些多肽或者小分子物质作用于6-HB形成区域、阻断病毒包膜与细胞膜融合。
综上，如何提供一种抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的多肽及其筛选方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
抑制新型冠状病毒感染的多肽，所述多肽为新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白区域的HR2区域中30～36个氨基酸组成的天然肽段，或
在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸-赖氨酸或谷氨酸-精氨酸对形成多肽链内盐桥。
优选的，所述天然肽段的氨基酸序列为如下任意一种：
多肽1：DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL；SEQ ID NO.1；
多肽2：ASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL；SEQ ID NO.2。
优选的，在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计的多肽的氨基酸序列为如下任意一种：
多肽3：ASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEE；SEQ ID NO.3；
多肽4：ASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQER；SEQ ID NO.4；
多肽5：DISGINASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEE；SEQ ID NO.5；
多肽6：DISGINASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQER；SEQ ID NO.6；
多肽7：GINASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEEGKK；SEQ ID NO.7；
多肽8：GINASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQERGKE；SEQ ID NO.8；
多肽9：ASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEEGKKEQY；SEQ ID NO.9；
多肽10：ASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQERGKEEQY；SEQ ID NO.10。
抑制新型冠状病毒感染的多肽在制备抑制新型冠状病毒感染药物中的应用。
抑制新型冠状病毒感染的多肽的筛选方法，包括在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸-赖氨酸或谷氨酸-精氨酸对形成多肽链内盐桥，可增加多肽自身的螺旋度，进而增加多肽的稳定性、亲水性、可溶性和抑制活性。
优选的，具体操作为：利用Coiled-coil程序，定位所述天然肽段中氨基酸的螺旋位置为“a”位点到“g”位点，并在“a”和“d”位点外进行氨基酸定点突变成谷氨酸，精氨酸或赖氨酸，使之形成谷氨酸-精氨酸或谷氨酸-赖氨酸对，且每对氨基酸之间的距离相差3或4个氨基酸。
优选的，具体包括如下步骤：
(1)获得新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白基因序列Genebank:YP_009724390.1；
(2)对新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白功能域进行预测，分析其二级结构，确定信号肽裂解位点、折叠情况、跨膜区；
(3)根据已经报道的SARS-CoV功能区的氨基酸残基的位置，对信号肽、S1蛋白、S2蛋白(包括HR1功能区及HR2功能区)的氨基酸序列进行定位，从而确定新型冠状病毒的S蛋白区域的HR1区域和HR2区域；
所述HR1区域的氨基酸序列为：TQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL；SEQ ID NO.11；
所述HR2区域的氨基酸序列为：PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWSEQ ID NO.12；
(4)选取HR2区域30～36个氨基酸组成的天然肽段作为抑制新型冠状病毒感染的多肽；
选择30～36个氨基酸这个长度主要是考虑到形成a螺旋的可能性，以及形成6-HB。
由于新型冠状病毒SARS-CoV-2的S2亚单位具有形成二聚体或者三聚体的趋势，我们利用Antheprot软件分析发现新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白有两处区域形成卷曲螺旋，即aa950-992和aa1168-1203区域。初步推测，这两个区域分别位于新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的HR1区域和HR2区域。由于S蛋白在形成三聚体过程中，HR2区域位于卷曲螺旋的外围，因此HR2区域适宜作为膜融合多肽抑制剂，多肽1和多肽2即为其中的两个优选多肽。
(5)在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸-赖氨酸或谷氨酸-精氨酸对形成多肽链内盐桥。
优选的，所述步骤(2)利用Antheprot 6.9.3软件进行预测。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明公开了抑制新型冠状病毒感染的多肽，能与HR1P形成稳定的6-HB螺旋结构，具有抑制新型冠状病毒感染侵入细胞的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1中新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白HR2卷曲螺旋区域；
图2附图为本发明实施例1中多肽1～多肽10形成卷曲螺旋能力评估，其中(1)为多肽1，(2)为多肽2，(3)为多肽3，(4)为多肽4，(5)为多肽5，(6)为多肽6，(7)为多肽7，(8)为多肽8，(9)为多肽9，(10)为多肽10；
图3附图为本发明实施例2中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；
图4附图为本发明实施例2中分子筛高效液相色谱结果图；
图5附图为本发明实施例2中圆二色谱检测多肽1和多肽5与HR1P孵育后的多肽二级结构图；
图6附图为本发明实施例2中Tm值检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的HR1P以及多肽1～多肽10均采用固相合成技术进行生产(哈尔滨吉象隆生物技术有限公司)，HPLC检测纯度>95％。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1抑制新型冠状病毒感染的多肽的筛选及鉴定
(1)从NCBI网站上下载新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白基因序列(Genebank:YP_009724390.1)。
(2)将新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白基因序列录入Antheprot 6.9.3软件，对其功能域进行预测，分析蛋白的二级结构，确定信号肽裂解位点、折叠情况、跨膜区。
(3)根据上述分析并结合序列同源比对找到SARS-CoV-2的S蛋白区域的HR1区域和HR2区域。
所述HR1区域的氨基酸序列为：TQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL；SEQ ID NO.11；
所述HR2区域的氨基酸序列为：PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWSEQ ID NO.12；
(4)选取HR2区域30～36个氨基酸组成的天然肽段作为抑制新型冠状病毒感染的多肽，即多肽1与多肽2。
多肽1：DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL；SEQ ID NO.1；
多肽2：ASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL；SEQ ID NO.2。
卷曲螺旋区域一般由7个氨基酸为单位组成，以a、b、c、d、e、f、g位点标示。HR2区域的氨基酸亲水性如表1所示：
表1 HR2区域的氨基酸亲水性
Figure BDA0002542316740000061
从上表可以发现在HR2区域的卷曲螺旋部位的a和d位点上为疏水性氨基酸。
利用Coiled-coil程序，定位多肽1和多肽2中氨基酸的螺旋位置(“a”到“g”位点)，并在“a”和“d”位点外进行氨基酸定点突变成谷氨酸，精氨酸或赖氨酸，使之形成谷氨酸-精氨酸或谷氨酸-赖氨酸对，且每对氨基酸之间的距离相差3或4个氨基酸，使之在空间上能形成盐桥。从多肽1和多肽2进行突变获得多肽3～多肽10作为优选多肽抑制剂。
多肽3：ASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEE；SEQ ID NO.3；
多肽4：ASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQER；SEQ ID NO.4；
多肽5：DISGINASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEE；SEQ ID NO.5；
多肽6：DISGINASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQER；SEQ ID NO.6；
多肽7：GINASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEEGKK；SEQ ID NO.7；
多肽8：GINASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQERGKE；SEQ ID NO.8；
多肽9：ASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEEGKKEQY；SEQ ID NO.9；
多肽10：ASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQERGKEEQY；SEQ ID NO.10。
图1为新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白HR2卷曲螺旋区域，显示有两个卷曲螺旋；
图2为多肽1～多肽10形成卷曲螺旋能力评估，是预测多肽1～多肽10形成a卷曲螺旋的概率，包括总体概率，二聚体概率，三聚体概率。
从上面的分析结果可以看出，我们可以基于新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白快速设计膜融合多肽抑制剂多肽1和多肽2，并在此基础上进行多肽氨基酸的定点突变获得优选的多肽抑制剂多肽3～多肽10。
实施例2抑制新型冠状病毒感染的多肽活性评价
以多肽1和多肽5为代表，检测其与新型冠状病毒SARS-CoV-2的HR1区域(HR1P)之间的相互作用，评价其活性。多肽1为野生型多肽，多肽5为突变多肽。通过比较多肽1和多肽5，可以评价突变多肽的性能。
(一)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
将HR1P分别与多肽1、多肽5混合(终浓度各35μM)，以HR1P、多肽1和多肽5为对照，在37℃条件下孵育30min，然后分别加入5×上样缓冲液(pH 8.3)，在质量浓度18％的非变性胶中室温125V恒压电泳2h，并进行考马斯亮蓝染色。
用非变性凝胶电泳分别检测多肽1和多肽5与HR1P的结合能力，结果如图3所示，由图3结果可知，多肽1和多肽5与HR1P的混合物均能形成一条新的条带，推测HR1P分别与多肽1和多肽5形成了复合物。
(二)分子筛高效液相色谱
在AKTA FPLC蛋白纯化系统上使用Superdex 75色谱柱进行分子筛高效液相色谱层析，将HR1P(50μM)与多肽5(50μM)混合，室温孵育30min以上备用。HR1P(50μM)与多肽5(50μM)溶液作为对照。使用pH 7.2的PBS作为流动相，平衡层析柱，至电导及pH值无变化。样品12000rpm离心10min，取100μL样品上样环中，设置流速为0.8mL/min，记录280nm的紫外吸光值、电导及pH值。
pH值为7.2，电导值是15μs/cm。
高效液相色谱检测结果如图4所示，结果表明，采用分子筛高效液相色谱检测多肽5与HR1P混合物时，在23min前处出现一个新的峰，提示两者的混合产生了较单独的多肽更大的复合物。
(三)园二色谱测定多肽二级结构
HR1P及多肽1、多肽5使用50mM的pH 7.2的PBS稀释至终浓度为10μM备用，然后准备HR1P分别与多肽1和多肽5等比例混合物，并在室温孵育30min后稀释至10μM备用。在0.1cm的石英样品杯中加入pH 7.2的PBS缓冲液做空白对照，使用分光偏振仪测定圆二色谱。
检测条件为：检测温度4℃，带宽5.0nm，解析度0.1nm，光径0.1cm，反应时间4.0s，扫描速度50nm/min，波长范围从190nm到280nm。最后将CD信号根据样品的氨基酸的摩尔浓度转换为摩尔椭偏率(molar ellipticity,[θ])，并使用[θ]值为-33,000作为100％α-螺旋参考值，以所获得的[θ]计算样品中α-螺旋的百分率。
采用圆二色谱检测HR1P与多肽1和多肽5相互作用形成的螺旋结构，结果如图5所示。图5结果表明，HR1P单独在溶液中无明显的二级结构。多肽1和多肽5单独存在于溶液中，可形成较少的螺旋结构，但当多肽1或多肽5与HR1P等浓度混合时，可形成螺旋结构，且多肽5与HR1P形成的螺旋结构更多。
(四)热变形分析(Tm值)
分别准备HR1P与多肽1和多肽5的等比例混合物，室温孵育30min，用分光偏振仪上检测222nm的吸光度，以5℃/min的温度梯度变化监测多肽的热稳定性，温度范围为4～99℃。使用软件对溶解曲线进行平滑化处理，并计算热解离转变的中点温度，即Tm值。
结果如图6所示，多肽1和多肽5与HR1P形成复合物的Tm值均在87℃左右。
本发明公开的抑制新型冠状病毒感染的多肽能与HR1P形成稳定的6-HB螺旋结构，具有抑制新型冠状病毒感染侵入细胞的能力。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司
<120> 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp
20 25 30
Leu Gln Glu Leu
35
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val
1 5 10 15
Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ser Val Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ile Arg Arg Leu Asn Glu Glu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Glu Leu Lys Lys Leu Gln Glu Glu
20 25 30
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Glu Arg Leu Asn Glu Arg
1 5 10 15
Ala Lys Glu Leu Asn Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gln Glu Arg
20 25 30
<210> 5
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Arg Arg Leu Asn Glu Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Leu Gln Glu Glu
35
<210> 6
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Glu Arg Leu Asn Glu Arg Ala Lys Glu Leu Asn Glu Arg Leu Arg Glu
20 25 30
Leu Gln Glu Arg
35
<210> 7
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Ile Asn Ala Ser Val Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ile Arg Arg Leu
1 5 10 15
Asn Glu Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Glu Leu Lys Lys Leu Gln Glu
20 25 30
Glu Gly Lys Lys
35
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Glu Arg Leu
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Lys Glu Leu Asn Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gln Glu
20 25 30
Arg Gly Lys Glu
35
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ser Val Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ile Arg Arg Leu Asn Glu Glu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Glu Leu Lys Lys Leu Gln Glu Glu Gly Lys
20 25 30
Lys Glu Gln Tyr
35
<210> 10
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Glu Arg Leu Asn Glu Arg
1 5 10 15
Ala Lys Glu Leu Asn Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gln Glu Arg Gly Lys
20 25 30
Glu Glu Gln Tyr
35
<210> 11
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe
1 5 10 15
Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser
20 25 30
Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu
35 40 45
Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser
50 55 60
Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu
65 70
<210> 12
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val
1 5 10 15
Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu
20 25 30
Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr
35 40 45
Ile Lys Trp
50

Claims (8)

1.抑制新型冠状病毒感染的多肽，其特征在于，所述多肽为新型冠状病毒S蛋白区域的HR2区域中30～36个氨基酸组成的天然肽段，或
在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸-赖氨酸或谷氨酸-精氨酸对形成多肽链内盐桥。
2.如权利要求1所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽，其特征在于，所述天然肽段的氨基酸序列为如下任意一种：
多肽1：DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL；SEQ ID NO.1；
多肽2：ASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL；SEQ ID NO.2。
3.如权利要求1所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽，其特征在于，在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计的多肽的氨基酸序列为如下任意一种：
多肽3：ASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEE；SEQ ID NO.3；
多肽4：ASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQER；SEQ ID NO.4；
多肽5：DISGINASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEE；SEQ ID NO.5；
多肽6：DISGINASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQER；SEQ ID NO.6；
多肽7：GINASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEEGKK；SEQ ID NO.7；
多肽8：GINASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQERGKE；SEQ ID NO.8；
多肽9：ASVEKIQKEIRRLNEEAKKLNEELKKLQEEGKKEQY；SEQ ID NO.9；
多肽10：ASVVNIQKEIERLNERAKELNERLRELQERGKEEQY；SEQ ID NO.10。
4.权利要求1～3任一所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽在制备抑制新型冠状病毒感染药物中的应用。
5.权利要求1所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽的筛选方法，其特征在于，包括在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸-赖氨酸或谷氨酸-精氨酸对形成多肽链内盐桥，增加多肽的稳定性、可溶性和抑制活性。
6.如权利要求5所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽的筛选方法，其特征在于，具体操作为：利用Coiled-coil程序，定位所述天然肽段中氨基酸的螺旋位置为“a”位点到“g”位点，并在“a”和“d”位点外进行氨基酸定点突变成谷氨酸，精氨酸或赖氨酸，使之形成谷氨酸-精氨酸或谷氨酸-赖氨酸对，且每对氨基酸之间的距离相差3或4个氨基酸。
7.如权利要求5所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)获得新型冠状病毒的S蛋白基因序列Genebank:YP_009724390.1；
(2)对新型冠状病毒的S蛋白功能域进行预测，分析其二级结构，确定信号肽裂解位点、折叠情况、跨膜区；
(3)根据已经报道的SARS-CoV功能区的氨基酸残基的位置，对信号肽、S1蛋白、S2蛋白的氨基酸序列进行定位，从而确定新型冠状病毒的S蛋白区域的HR1区域和HR2区域；
所述HR1区域的氨基酸序列为：TQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNT LVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL；SEQ ID NO.11；
所述HR2区域的氨基酸序列为：PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKW；SEQ ID NO.12；
(4)选取HR2区域30～36个氨基酸组成的天然肽段作为抑制新型冠状病毒感染的多肽；
(5)在所述天然肽段的基础上通过定点突变设计谷氨酸-赖氨酸或谷氨酸-精氨酸对形成多肽链内盐桥。
8.如权利要求7所述的抑制新型冠状病毒感染的多肽的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)利用Antheprot 6.9.3软件进行预测。
CN202010550481.9A 2020-06-16 2020-06-16 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法 Pending CN111560054A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010550481.9A CN111560054A (zh) 2020-06-16 2020-06-16 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010550481.9A CN111560054A (zh) 2020-06-16 2020-06-16 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111560054A true CN111560054A (zh) 2020-08-21

Family

ID=72075325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010550481.9A Pending CN111560054A (zh) 2020-06-16 2020-06-16 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111560054A (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112079901A (zh) * 2020-09-04 2020-12-15 华中科技大学 拮抗多肽及其用于制备抗新型冠状病毒药物的应用
CN112552379A (zh) * 2020-12-28 2021-03-26 中国人民解放军海军军医大学 合成肽在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
CN113773370A (zh) * 2021-10-15 2021-12-10 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 一种抗病毒的多肽及其应用
CN113817026A (zh) * 2021-09-16 2021-12-21 中国人民解放军海军军医大学 靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用
CN113943375A (zh) * 2021-10-01 2022-01-18 中国科学院昆明动物研究所 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
CN114249799A (zh) * 2020-09-21 2022-03-29 北京化工大学 一种抗冠状病毒多肽及其应用
WO2022090679A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Oxford Vacmedix UK Limited Coronavirus polypeptide
CN114437184A (zh) * 2021-08-16 2022-05-06 中国科学院微生物研究所 一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用
WO2022079001A3 (en) * 2020-10-14 2022-05-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Sars-cov-2 antigens, diagnostic and therapeutic uses
WO2022238689A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Oxford Vacmedix UK Limited Vaccine formulation comprising recombinant overlapping peptides and native prtoeins
WO2023108666A1 (zh) * 2021-12-19 2023-06-22 中国人民解放军总医院 一类靶向covid-19病毒s蛋白的超高亲和力小蛋白及用途
WO2023123722A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 中国科学院微生物研究所 一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111228464A (zh) * 2020-02-28 2020-06-05 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 广谱抗冠状病毒的多肽及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111228464A (zh) * 2020-02-28 2020-06-05 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 广谱抗冠状病毒的多肽及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUAI XIA等: "A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike", 《SCIENCE ADVANCES》 *
SHUAI XIA等: "Fusion mechanism of 2019-nCoV and fusion inhibitors targeting HR1 domain in spike protein", 《CELLULAR & MOLECULAR IMMUNOLOGY》 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112079901B (zh) * 2020-09-04 2021-11-19 华中科技大学 拮抗多肽及其用于制备抗新型冠状病毒药物的应用
CN112079901A (zh) * 2020-09-04 2020-12-15 华中科技大学 拮抗多肽及其用于制备抗新型冠状病毒药物的应用
CN114249799A (zh) * 2020-09-21 2022-03-29 北京化工大学 一种抗冠状病毒多肽及其应用
CN114249799B (zh) * 2020-09-21 2023-08-29 北京化工大学 一种抗冠状病毒多肽及其应用
WO2022079001A3 (en) * 2020-10-14 2022-05-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Sars-cov-2 antigens, diagnostic and therapeutic uses
WO2022090679A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Oxford Vacmedix UK Limited Coronavirus polypeptide
CN112552379A (zh) * 2020-12-28 2021-03-26 中国人民解放军海军军医大学 合成肽在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
CN112552379B (zh) * 2020-12-28 2023-05-02 中国人民解放军海军军医大学 合成肽在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
WO2022238689A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Oxford Vacmedix UK Limited Vaccine formulation comprising recombinant overlapping peptides and native prtoeins
CN115925825A (zh) * 2021-08-16 2023-04-07 中国科学院微生物研究所 一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用
CN114437184A (zh) * 2021-08-16 2022-05-06 中国科学院微生物研究所 一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用
CN115925825B (zh) * 2021-08-16 2023-07-04 中国科学院微生物研究所 一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用
WO2023020298A1 (zh) * 2021-08-16 2023-02-23 中国科学院微生物研究所 一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用
CN113817026A (zh) * 2021-09-16 2021-12-21 中国人民解放军海军军医大学 靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用
CN113943375A (zh) * 2021-10-01 2022-01-18 中国科学院昆明动物研究所 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
WO2023051850A1 (zh) * 2021-10-01 2023-04-06 中国科学院昆明动物研究所 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
CN113773370B (zh) * 2021-10-15 2022-07-22 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 一种抗病毒的多肽及其应用
CN113773370A (zh) * 2021-10-15 2021-12-10 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 一种抗病毒的多肽及其应用
WO2023108666A1 (zh) * 2021-12-19 2023-06-22 中国人民解放军总医院 一类靶向covid-19病毒s蛋白的超高亲和力小蛋白及用途
WO2023123722A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 中国科学院微生物研究所 一种抗冠状病毒的多肽、其衍生物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111560054A (zh) 抑制新型冠状病毒感染的多肽及其筛选方法
Nicklin et al. Proteolytic processing in the replication of polio and related viruses
Groft et al. Recognition of eIF4G by rotavirus NSP3 reveals a basis for mRNA circularization
Liu et al. Polyprotein processing in Southampton virus: identification of 3C-like protease cleavage sites by in vitro mutagenesis
Speir et al. Enhanced local symmetry interactions globally stabilize a mutant virus capsid that maintains infectivity and capsid dynamics
CN107847581A (zh) 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
US5149783A (en) Expression of the virally coded protease p2a of hrv2
Lu et al. Intracellular andin Vitro-Translated 27-kDa Proteins Contain the 3C-like Proteinase Activity of the Coronavirus MHV-A59
Bovee et al. Direct Cleavage of eIF4G by Poliovirus 2A Protease Is Inefficientin Vitro
Baker et al. Inherent structural disorder and dimerisation of murine norovirus NS1-2 protein
JP2011520786A (ja) 修飾されたステフィンａスカフォールドタンパク質
Someya et al. Complete nucleotide sequence of the Chiba virus genome and functional expression of the 3C-like protease in Escherichia coli
US20140134647A1 (en) Novel crystal structure and ligand binding sites of trail receptor
Pretel et al. The non-structural NS1 protein unique to respiratory syncytial virus: a two-state folding monomer in quasi-equilibrium with a stable spherical oligomer
Blankenship et al. Thermodynamics of a designed protein catenane
Xu et al. The receptor binding protein P2 of PRD1, a virus targeting antibiotic-resistant bacteria, has a novel fold suggesting multiple functions
JP2010517945A (ja) 均一インビトロｆｅｃアッセイ及び成分
ACETO et al. Identification of an N-capping box that affects the α6-helix propensity in glutathione S-transferase superfamily proteins: a role for an invariant aspartic residue
Durie et al. Structural insights into the interaction of papain-like protease 2 from the alphacoronavirus porcine epidemic diarrhea virus and ubiquitin
Sommergruber et al. Mutational analyses support a model for the HRV2 2A proteinase
Lee et al. Solution structure of the 2A protease from a common cold agent, human rhinovirus C2, strain W12
EP0586065A2 (en) Antigenic peptides for grouping hepatitis C virus, kit comprising the same and methods for its grouping using the same
US5912167A (en) Autocatalytic cleavage site and use thereof in a protein expression vector
US20230265142A1 (en) Synthetic foldable proteins generated from peptide segments of folding nuclei of reference proteins
Ling et al. Purification and characterization of recombinant human respiratory syncytial virus nonstructural protein NS1

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination