JP2011520786A - 修飾されたステフィンaスカフォールドタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)コドン4での変異であり、ステフィンAのグリシンまたはSTMのトリプトファンをステフィンAのためにトリプトファンまたはSTMのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
(ii)コドン46から54までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ1を含み、または拘束するもの、または
(iii)コドン67から84までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ2を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む。
(i)コドン4での変異であり、ステフィンAのグリシンまたはSTMのトリプトファンをステフィンAのためにトリプトファンまたはSTMのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
(ii)コドン46から54までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ1を含み、または拘束するもの、または
(iii)コドン67から84までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ2を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
(i)コドン4での変異であり、ステフィンAのグリシンまたはSTMのトリプトファンをステフィンAのためにトリプトファンまたはSTMのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
(ii)コドン46から54までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ1を含み、または拘束するもの、または
(iii)コドン67から84までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ2を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
位置4のタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンA、STM、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置46〜54、特に位置48/49/50におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンA、STM、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置67〜84、特に位置71/72/73におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンA、STM、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置67〜84、特に位置82/83におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンA、STM、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置4および/または位置48/49/50および/または位置71/72/73および/または位置82/83における単数または複数のペプチドのいかなる組み合わせ。
ステフィンAまたはSTMいずれかの最後の25個のアミノ酸残基または最後の15個のアミノ酸残基の除去または置換する終止コドンに続いて位置4および/または位置48/49/50および/または位置71/72/73および/または位置82/83における単数または複数のペプチドのいかなる組み合わせに基づく、いくつかの新しいスカフォールドを提供する。
本発明の他の形態は、所望の構造に結合することができる標的ペプチドの同定方法に関して、本明細書の前記修飾されたステフィンAまたはSTMタンパク質のスカフォールドタンパク質を提供することを含み、標的ペプチドを含む;前記スカフォールドタンパク質と前記所望の構造と接触する方法に関して;スカフォールドおよび所望の構造の間の関係を観測する方法に関してであって、スカフォールドタンパク質と所望の構造の関連は、標的ペプチドを前記構造に結合する標的ペプチドの候補として同定する。
“欠失”とは、それぞれ一つ以上のアミノ酸残基または核酸の欠乏による、アミノ酸または核酸の配列の変異を参照する。“挿入”または“付加”という用語は、アミノ酸または核酸の配列の変異であって、参照の配列と比較して、分子またはその代表に、それぞれ一つ以上のアミノ酸残基または核酸の付加の結果であり、自然起源の分子において見られるもの等を参照する。“置換”とは一つ以上のアミノ酸または核酸をそれぞれ異なったアミノ酸または核酸と置き換えることを参照する。
従来技術で良く知られているように、‘スカフォールド’の用語はそのものの構造を標的ペプチドによって変形することなく、標的ペプチドを溶媒に発現させるタンパク質を参照する。ペプチドを溶媒に発現するにあたって、これは免疫沈降実験を用いて試験することができる。例えば、ペプチドが溶媒に発現する表示はそれを認識できる抗体に対するその有効性から得ることができる。従って、スカフォールドタンパク質の溶媒に対するペプチドの発現性能を試験するため、ペプチドを含むスカフォールドを発現し、ペプチドを認識する抗体をスカフォールドペプチド融合の免疫沈降に使用されるであろう。このタンパク質が免疫沈降または抗体をキャプチャー(capture)することができるのであれば、これはペプチドがスカフォールドタンパク質に必要とされるため、溶媒に発現していることを示す。他のまたは別のペプチドが溶媒に発現していることはリン酸化反応の研究から得られる表示である。リン酸化受容体部位を標的ペプチド内に組み込み、その後類似のキナーゼとスカフォールドペプチド融合体がリン酸化反応の許容条件下において接触し、その後溶媒に対するペプチドの発現を検証した。ペプチドのリン酸化反応は溶媒に対して、あるべき発現を示した。形成された標的ペプチドによるスカフォールドタンパク質の抵抗に関して、これを円偏光二色または熱安定性の技術を用いて試験することができる。具体的には、スカフォールドタンパク質その物に標的ペプチドを挿入することのない円偏光二色解析は、標的ペプチドを形成するときの同じスカフォールドタンパク質と実質上同様な円偏光二色特徴である。これはスカフォールドタンパク質内の標的ペプチドの発現がスカフォールドタンパク質を産出するスカフォールドタンパク質の構造を危険にさらさないか、変形させないことの証明を提供する。標的ペプチドによる変形であるこの抵抗を試験する他の方法は、スカフォールドタンパク質と挿入物である標的ペプチドの有無の熱安定性を研究することである。
好ましくは、スカフォールドタンパク質が標的ペプチドを抑制していることである。スカフォールドタンパク質における抑制効果の存在は、標的ペプチドがスカフォールドタンパク質内のときの標的ペプチドの実態結合の親和力とペプチドがスカフォールドタンパク質内でないときの親和力を比較することによって証明することができる。これら二つの親和力の違いは、スカフォールドタンパク質がペプチドを抑制し、特定の三次元構造を仮定していることを示す。好ましくは、スカフォールドタンパク質はペプチドを抑制し、スカフォールドタンパク質の状況において発現しているとき、それが結合親和力の上昇を示していることである。言い換えれば、結合していないペプチドの結合と比較したとき、好ましくはスカフォールドタンパク質が結合のエントロピー消費を減少し、測定した親和性を上昇する。
設計の検討
1)既知の構造によって、ペプチド挿入部位または置換部位のインフォームドチョイスを考慮していることと、
2)広範囲のペプチドの折り畳みを制限するために十分に安定であることと、
3)生物物理学的に中性であって、例えば表現型に寄与する細胞内タンパク質の相互作用を欠失していることと、
4)原核性および真核性の環境の双方において、同様に、好ましくは完全に同じように、折り畳むことができ、1つの方法から得たデータが他の実験の実施を満たすことができる。
さらなる応用
標的ペプチド
ステフィンA
ステフィンA配列
ステフィンAおよびSTMの変異
位置4の変異
コドン46−54のいずれにおける変異
コドン67−54のいずれにおける変化
挿入物
変異の組み合わせ
固体相およびマイクロアレイ
本発明のさらなる利点
図2を参照とし、ステフィンAの三次元構造および本発明の新しいスカフォールドタンパク質の産出のため、ステフィンA内の三箇所に変異を作ったことを示す。これらの部位は:ステフィンAについてはG4またはSTMについてはW4の部位;ループ1を拘束するコドン46から54までを含むいずれのコドン;特にコドン48−50;いずれのコドン;ループ2に拘束するコドン67から84を含有するいずれのコドン、特に70−73の変異。修飾されたステフィンAまたはSTMポリペプチドのスカフォールドタンパク質としての使用は記載のようにステフィンAの配列を変異によって作成した。ステフィンAを基にして得られたタンパク質であるが、特異的な変異性の変化は上の本明細書に開示の既知の配列を有する。
実施例2
実施例3
実施例4
実施例5
実施例6
実施例7
実施例8
実施例9
実施例10
実施例11
実施例12
実施例13
実施例14
実施例15
実施例16
Claims (20)
- 修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
(i)コドン4での変異であり、ステフィンAのグリシンまたはSTMのトリプトファンをステフィンAのためにトリプトファンまたはSTMのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
(ii)コドン46から54までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ1を含み、または拘束するもの、または
(iii)コドン67から84までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ2を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。 - 位置4での変異性の変化は、ステフィンAについてはG4Rであり、およびSTMについてはW4Rである、請求項1に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 変異性の変化はコドン46から54まで(包括的)の任意の変化であり、ステフィンAについては48−VAG−50であり、およびSTMについては48−LAS−50である、請求項1に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 変異は48−LXS−50であり、式中、Xは任意のアミノ酸である、請求項3に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 変異性の変化はコドン67から84まで(包括的)の任意の変化であり、ステフィンAについては71−KSL−73であり、およびSTMについては71−NPG−73である、請求項1に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 変異は71−NxP−73であり、式中、Xは任意のアミノ酸である、請求項5に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- ステフィンAまたはSTMの残基73または84のいずれかで終結する、先行する請求項のいずれか一項に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 終結性残基73または84には、ステフィンAまたはSTMのいずれかの最後の25個のアミノ酸残基または最後の15個のアミノ酸残基を除去または置換する終止コドンが続く、請求項7に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- ペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドはステフィンAまたはSTMのいずれかの残基73または84と終結性終止コドンとの間に挿入される、請求項7または8に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- ペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドは20個のアミノ酸またはそれよりも少数を含む、請求項9に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 変異性の変化とは別に、タンパク質の残部は、ステフィンAまたはSTMのいずれかと似ている、先行する請求項のいずれか一項に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質であって、二つの変異性の変化または次の
(i)コドン4での変異であり、ステフィンAのグリシンまたはSTMのトリプトファンを別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、および/または
(ii)コドン46から54までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ1を含み、または拘束するもの、および/または
(iii)コドン67から84までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化の異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ2を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する2つの異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。 - さらに、請求項2から11までに記載の特色の任意の一つまたはそれよりも多くを含む、請求項14に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質であって、三つの変異性の変化または次の
(i)コドン4での変異であり、ステフィンAのグリシンまたはSTMのトリプトファンを別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、および
(ii)コドン46から54までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ1を含み、または拘束するもの、および
(iii)コドン67から84までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ2を含み、または拘束するもの
で挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。 - さらに、請求項2から11までに記載の特色の任意の一つまたはそれよりも多くを含む、請求項14に記載の修飾されたステフィンAポリペプチドまたは修飾されたSTMタンパク質。
- 配列番号9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24および25のいずれか一つに記載するようなアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- いずれか一つのアミノ酸配列はさらに、それに挿入されるペプチドをコード化する一つまたはそれよりも多くの異種のオリゴヌクレオチドを含む、請求項19に記載のポリペプチド。
- 任意の一つまたはそれよりも多くの変異性の変化の部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドの、スカフォールドタンパク質としての使用。
- 診断、治療、バイオマーカー、バイオマーカーに結合し、およびそれを特異的に検出するための薬剤、合理化された薬物設計の鋳型、創薬のための標的または試薬、抗体の代替物およびリサーチツールを含む群より選ばれる薬剤としての用途のための先行する請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 興味ある構造を結合することが可能な標的ペプチドを識別するための方法であって、次の
(i)標的ペプチドを含む請求項1から17までのいずれか一項に規定されたような修飾されたステフィンAまたはSTMタンパク質を提供すること、
(ii)前記スカフォールドタンパク質を興味のある前記構造と接触させること、および
(iii)スカフォールドと興味ある構造との間の関連を監視することであり、スカフォールドタンパク質の興味ある構造との関連は、標的ペプチドを、前記構造と結合することが可能な候補標的ペプチドとして識別するものを含む、方法。
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