ES2350455T3 - Uso de estefina a como proteína de armazón. - Google Patents

Abstract

Uso de Estefina A como una proteína de armazón, en el que la Estefina A es una Estefina A humana, y en el que los aminoácidos 71 a 73 de Estefina A están sustituidos por una inserción peptídica heteróloga.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas de armazón para presentar péptidos tales como aptámeros peptídicos. En particular, la invención se refiere al uso de estefina A como proteína de armazón, y a polipéptidos de estefina A modificados para uso como proteínas de armazón.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El estudio de las interacciones proteicas es importante para una comprensión de los papeles biológicos de productos génicos in vivo. Existen numerosas formas de analizar

o diseccionar interacciones polipeptídicas, y una de las más poderosas es mediante el uso de aptámeros peptídicos y el estudio de su comportamiento. Los péptidos y aptámeros peptídicos se pueden usar libres en disolución. Sin embargo, cuando los péptidos pequeños no están constreñidos tenderán a formar estructuras que presentan una superficie de interacción limitada. Además, a menudo perderán entropía conformacional al asociarse con moléculas diana, reduciendo la energía libre de unión, y en consecuencia los péptidos libres a menudo no formarán complejos no covalentes apretados, lo que es un problema.

En lugar de ser usados en disolución libres, los péptidos de interés se pueden unir a soportes físicos, o se pueden presentar en el contexto de un polipéptido más grande. En la presente invención, es importante la presentación en el contexto de un polipéptido. Tal presentación a menudo es provocada usando proteínas de armazón.

En la técnica anterior se han producido y usado armazones proteicos manipulados mediante ingeniería, para el reconocimiento molecular. Por ejemplo, Skerra (2003 Curr Opin Chem Biol. vol. 7 páginas 683-93) escribe sobre armazones usados para la generación de proteínas receptoras artificiales con especificidades definidas. Según Skerra, los mejores armazones deberían de tener una arquitectura robusta, un tamaño pequeño, ser monoméricos, ser susceptibles a manipulación proteica mediante ingeniería (por ejemplo, proteínas de fusión), y tener un bajo grado de modificación posttraduccional. Además, los armazones más ventajosos deberían de ser fácilmente expresables en células hospedantes (habitualmente células procariotas en la técnica anterior), tener una región susceptible a la inserción o sustitución de aminoácidos para crear nuevos sitios de unión, y tal inserción/sustitución de sitios de unión no debería de afectar al plegamiento del armazón.

Los armazones usados más habitualmente se basan en las regiones marco de cadenas de inmunoglobulinas o de “anticuerpos”. En particular, en la técnica anterior se ha usado el marco de Ig y/o versiones acortadas o fusionadas de él para presentar y constreñir geométricamente a los péptidos. Sin embargo, los anticuerpos son grandes, e incluso los fragmentos recombinantes son de tamaño considerable (por ejemplo, los fragmentos Fab tienen alrededor de 450aa, e incluso los fragmentos scFv tienen alrededor de 270aa). Esto los hace difíciles de manipular in vitro e in vivo. Además, comprenden dos cadenas polipeptídicas diferentes que son inestables en el sentido de disociación, oligomerización e incluso agregación a gran escala, lo que representa problemas adicionales asociados con su uso.

Los armazones de la técnica anterior han incluido nucleasa estafilocócica inactivada, proteína fluorescente verde (GFP) y tiorredoxina A (TrxA), así como plegamientos proteicos aislados tales como el dominio Z de la proteína A estafilocócica, “aficuerpos”, anticalinas, y repeticiones de anquirina. Otras proteínas de armazón de la técnica anterior incluyen el dominio de fibronectina tipo III (“Fn3”), las proteínas de la familia de lipocalina, de las que derivan las anticalinas, la proteína de unión a bilina (BBP), y otras. Los armazones para aptámeros peptídicos se describen en in Borghouts et al, Expert Opin. Biol. Ther. (2005) 5(6): 783-797.

Esta tecnología se ha llevado a cabo de la forma más activa usando tiorredoxina bacteriana (TrxA) como armazón. Sin embargo, hay problemas asociados con TrxA. Por ejemplo, la TrxA de E. coli puede inhibir la apoptosis, lo que puede conducir a observaciones que llevan a confusión en ensayos a base de células. También, los dos restos de cisteína que delimitan a los péptidos insertados, y que forman un enlace de disulfuro reversible en TrxA, pueden conducir a incertidumbre con respecto al estado “correcto” para la presentación del péptido activo.

La presente invención procura superar el problema o problemas asociados con la técnica anterior.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en una comprensión detallada de la biología molecular de la proteína Estefina A (algunas veces denominada como “cistatina A”). Esta comprensión ha permitido la modificación de la proteína SteA de tipo salvaje en una forma que la hace adecuada para uso como una proteína de armazón. Las proteínas de armazón a base de Estefina A tienen varias ventajas con respecto a los armazones de la técnica anterior.

Según la presente invención, la Estefina A se ha hecho de forma ventajosa biológicamente neutra. Como se explica con más detalle a continuación, se han introducido mutaciones racionales en sitios en el polipéptido de Estefina A que destruyen sus interacciones y actividades biológicamente significativas. Además, se ha escogido un sitio de inserción y se ha demostrado experimentalmente que es capaz de aceptar y constreñir péptidos insertados tales como los aptámeros peptídicos usados en algunos de los ejemplos más abajo. Además, los inventores han seleccionado racionalmente dos superficies de Estefina A expuestas a disolventes discretas adicionales, que proporcionan ventajosamente la oportunidad de seleccionar parejas de unión peptídica con mayor avidez y/o mayor especificidad por el péptido diana.

De este modo, la invención proporciona el uso de Estefina A como proteína de armazón, y proporciona polipéptidos de Estefina A modificados que son útiles como proteínas de armazón. Preferentemente, la Estefina A es una Estefina A humana.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que los aminoácidos 71 a 73 de la Estefina A son sustituidos por una inserción peptídica heteróloga.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende una mutación V48D.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende una mutación G4W.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende además las mutaciones V48D y G4W.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende la secuencia mostrada como SEC ID nº: 1. Esta es la secuencia de armazón mutante triple preferida.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende la secuencia mostrada como SEC ID nº: 3 y la secuencia mostrada como SEC ID nº: 4. Estas son las secuencias STM preferidas a cada lado de la inserción peptídica heteróloga.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 1. Esta es la secuencia STM mutante triple preferida.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 3 y la secuencia mostrada como SEC ID nº: 4. Estas son las secuencias STM preferidas a cada lado de la inserción peptídica heteróloga.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 1, o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 2, en la que se inserta un péptido heterólogo en el sitio Leu73. Preferentemente, el péptido heterólogo insertado en el sitio Leu73 suprime el resto de aminoácido Leu73.

Preferentemente, el péptido heterólogo comprende 36 aminoácidos o menos, preferentemente 20 aminoácidos o menos, preferentemente 12 o menos.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1, o de SEC ID nº: 3 fusionada a una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada a SEC ID nº: 4.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1, en el que la secuencia nucleotídica comprende un sitio de restricción RsrII. Preferentemente, el sitio RsrII está en la localización en la secuencia codificante que

codifica GP en los restos de aminoácidos 72-73.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido de armazón como se describe anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para identificar un péptido diana capaz de unirse a una estructura de interés, que comprende proporcionar una proteína de armazón de estefina A que comprende un péptido diana; poner en contacto dicha proteína de armazón con dicha estructura de interés; y monitorizar la asociación entre el armazón y la estructura de interés, en el que la asociación de la proteína de armazón con la estructura de interés identifica el péptido diana como un péptido diana candidato capaz de unirse a dicha estructura.

También se describe aquí un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RLNKPLPSLPV (“Péptido A”). Preferentemente, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos RLNKPLPSLPV. También se describe el uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RLNKPLPSLPV en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de infección por levaduras. Tal péptido se denomina aquí como “péptido A”. Preferentemente, el péptido A consiste en la secuencia de aminoácidos RLNKPLPSLPV. El péptido A es útil en el desarrollo de tratamientos para infecciones de levaduras. Se cree que el péptido A trabaja evitando que la levadura sea resistente a una presión osmótica elevada. De este modo, en otro aspecto, la descripción se refiere al uso del péptido A en medicina. De este modo, en otro aspecto, la descripción se refiere al uso del péptido A en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de infección por levadura. En el prospecto, la descripción se refiere al uso de péptido A en el tratamiento de infección por levadura. En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para tratar una infección por levadura, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de péptido A. Preferentemente, la infección por levaduras es una infección por Candida albicans.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Armazón

Como es bien conocido en la técnica, el término “armazón” se refiere a una proteína que puede presentar péptidos diana a disolvente sin que se deforme su propia estructura por el péptido diana.

Con respecto a la presentación de péptido a disolvente, ésta se puede ensayar usando experimentos de inmunoprecipitación. Por ejemplo, una indicación de que un péptido está siendo presentado a un disolvente se puede obtener mediante su disponibilidad para un anticuerpo capaz de reconocerlo. De este modo, a fin de ensayar la capacidad de una proteína armazón para presentar un péptido a un disolvente, se expresaría el armazón que comprende el péptido y se usaría un anticuerpo que reconoce el péptido para intentar inmunoprecipitar la fusión de armazón-péptido. Si esta proteína se puede inmunoprecipitar o capturar en el anticuerpo, esto muestra que el péptido se presentaba al disolvente como se requiere por una proteína de armazón. Otra indicación, o indicación alternativa, de que un péptido está siendo presentado a un disolvente se puede obtener mediante estudios de fosforilación. Incorporando un sitio aceptor de fosfato en el péptido diana, y poniendo en contacto entonces la fusión de armazón-péptido con la cinasa cognada en condiciones que permitan la fosforilación, entonces se puede verificar la presentación del péptido a un disolvente. La fosforilación del péptido indica la correcta presentación al disolvente.

En cuanto a la resistencia de la proteína de armazón a ser deformada por el péptido diana que posee, ésta se puede ensayar usando técnicas tales como dicroísmo circular o estabilidad térmica. Específicamente, un análisis de dicroísmo circular de una proteína de armazón sin el péptido diana insertado en ella debería de ser sustancialmente el mismo que las características del dicroísmo circular de la misma proteína de armazón cuando posee un péptido diana. Esto proporciona una demostración de que la presencia del péptido diana en la proteína de armazón no ha comprometido ni deformado la estructura de la proteína de armazón que lo posee. Otra forma de ensayar esta resistencia a la deformación por el péptido diana es estudiar la estabilidad térmica de la proteína de armazón con y sin el péptido diana insertado. Por ejemplo, la proteína de armazón STM de la presente invención se puede calentar hasta 98ºC y aún volverá a ganar su conformación original al enfriarla nuevamente hasta la temperatura ambiente. Esta propiedad no se ve afectada por la inserción del péptido diana hasta una longitud de 20 aminoácidos. Con respecto a la estabilidad térmica, el punto de transición térmica para STM es aproximadamente 78ºC en comparación con el de SteA, que es 90,8ºC. Con un péptido invertido, el punto de transición térmica de STM es 75ºC. Esta es otra demostración de que una estructura de la proteína de armazón no se deforma por la inserción del péptido.

Una proteína de armazón debe de ser capaz de aceptar un inserto peptídico. Preferentemente, el inserto peptídico tiene 36 aminoácidos o menos, preferentemente 20 aminoácidos o menos. Preferentemente, el inserto peptídico diana tiene 12 aminoácidos o menos.

Una proteína de armazón debe tener estructura conocida. Por “estructura conocida” se quiere decir que se debe de conocer la estructura cristalina o una estructura en disolución (estructura de RMN).

Rasgos preferidos de proteínas de armazón según la presente invención

Preferentemente, una proteína de armazón constriñe el péptido diana. La presencia de un efecto de constricción en una proteína de armazón se puede demostrar comparando la afinidad de una entidad que se une al péptido diana cuando el péptido diana está en la proteína de armazón con la afinidad cuando el péptido no está en la proteína de armazón. Una diferencia en estas dos afinidades indica que la proteína de armazón está constriñendo el péptido para asumir una conformación tridimensional particular. Preferentemente, una proteína de armazón constriñe un péptido de forma que demuestra una afinidad de unión incrementada cuando está presente en el contexto de la proteína de armazón. En otras palabras, preferentemente, la proteína de armazón disminuye el coste entrópico de la unión, e incrementa así la afinidad medida cuando se compara con la unión de un péptido libre.

En algunas formas de realización, la constricción se puede proporcionar mediante una fusión N-terminal o C-terminal individual al péptido diana. Por ejemplo, un péptido se puede constreñir mediante fusión a STM 1-73, o mediante fusión a la parte C-terminal de STM. A pesar de realizaciones de la fusión individual N-o C-terminal del armazón, el significado de “constricción” no está alterado, y el hecho de que el péptido diana esté constreñido o no debería de ser juzgado como se explica aquí. Preferentemente, los péptidos diana se insertan en proteínas de armazón de la presente invención de forma que la secuencia de la proteína de armazón está presente tanto N-terminal como Cterminalmente en el péptido diana.

Preferentemente, una proteína de armazón proporciona al péptido diana una estabilidad incrementada in vivo. Este efecto se puede demostrar comparando la expresión del péptido diana en el contexto de la proteína de armazón con la expresión del péptido diana por sí mismo. Preferentemente, el péptido diana muestra una mayor estabilidad en el contexto de la proteína de armazón.

Una proteína de armazón es preferentemente neutra biológicamente. Por “neutra biológicamente” se quiere decir que se han abolidos las interacciones con otras proteínas conocidas. Además, preferentemente se eliminan cualquier capacidad de señalización que posea la proteína. De este modo, una proteína de armazón preferida según la presente invención es la proteína de armazón STM.

La neutralidad biológica es una ventaja de la presente invención, puesto que no existe en las proteínas de armazón de la técnica anterior. Por ejemplo, la tiorredoxina A actúa como un negativo dominante de las rutas redox naturales en las células. Además, se sabe que inhibe P53, y se sabe que inhibe las rutas de señalización de BCL6. Ventajosamente, las proteínas de armazón de la presente invención no interfieren con las rutas de señalización de origen natural.

Una proteína de armazón debería de ser pequeña. Por “pequeña” se quiere decir menos de 25 kDa, preferentemente menos de 13 kDa. Más preferentemente, una proteína de armazón debería de ser menor de 100aa (excluyendo el inserto del péptido diana).

Preferentemente, una proteína de armazón según la presente invención será conformacionalmente estable. Por “conformacionalmente estable” se quiere decir que no deberían tener lugar cambios conformacionales. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene región de bisagra. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene dominio PH. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene dominio SH3. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene dominio SH2. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene dominio “WW”. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene dominio “WD”. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene repeticiones HEAT. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene dominio rico en prolina. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene ninguna modificación posttraduccional en las células. Preferentemente, una proteína de armazón no tiene ningún otro dominio conocido que facilite cambios conformacionales.

Una proteína de armazón según la presente invención no tiene preferentemente dominios de interacción proteína-proteína. Se considerará que una proteína no tiene dominios de interacción proteína-proteína si estos han sido mutados para hacerlos no

funcionales.

Preferentemente, una proteína de armazón según la presente invención no tiene modificaciones post-traduccionales. De este modo, preferentemente, una proteína de armazón según la presente invención no tiene sitio de glicosilación. Esto es una ventaja con respecto a las proteínas de armazón de la técnica anterior, tal como distrofina, debido a que las modificaciones post-traduccionales pueden interferir con interacciones o ellas mismas crear interacciones espúreas.

Como se señala anteriormente, las proteínas de armazón no deberían de ser deformadas por el inserto peptídico. Con este criterio, la proteína fluorescente verde no se debería de considerar una proteína de armazón debido a que por lo menos un tercio de los péptidos diana insertados anulan la fluorescencia de la proteína fluorescente verde. Esto es una demostración de que el inserto del péptido diana está deformando la estructura de la proteína. Por lo tanto, no es una proteína de armazón según la presente invención puesto que una proteína de armazón no se debería de deformar preferentemente por el inserto del péptido diana.

La tiorredoxina A (TrxA) es una proteína de armazón de la técnica anterior. TrxA es pequeña y es estable. Sin embargo, la inserción de péptidos diana en TrxA tiene lugar entre dos restos de cisteína. Las proteínas de armazón según la presente invención evitan ventajosamente esta disposición, debido a que los restos de cisteína en TrxA pueden sufrir un enlazamiento de disulfuro reversible que puede alterar la conformación de la proteína de armazón y puede afectar la conformación del péptido diana presentado. De este modo, preferentemente, el sitio de inserción para el péptido diana no está entre dos restos de cisteína en la proteína de armazón.

Consideraciones de Diseño

Las proteínas de armazón tienen preferentemente uno o más de los siguientes rasgos:

1) el armazón debería de ser de estructura conocida, permitiendo una elección informada del sitio para la inserción o sustitución peptídica;

2) el armazón debería de ser suficientemente estable para constreñir el plegamiento de un amplio intervalo de péptidos;

3) el armazón debería de ser suficientemente flexible de forma que su plegamiento no se vea afectado por la inserción de una variedad de péptidos;

4) el armazón debería de ser biológicamente neutro, es decir, carecer de interacciones con proteínas celulares que pudiesen contribuir un fenotipo; y

5) de forma similar, el armazón debería de ser capaz de plegarse, preferentemente de forma idéntica tanto en entornos procariotas como eucariotas, de forma que los datos obtenidos en un sistema pueden informar experimentos realizados en el otro. La invención proporciona un armazón adecuado a los requisitos de la tecnología de aptámeros peptídicos. El armazón STM posee preferentemente los todos los cinco criterios definidos anteriormente: la estructura de Estefina A parental es conocida; el armazón manipulado mediante ingeniería es estable y tolera la inserción de por lo menos un péptido sin perder su estabilidad biofísica; es capaz de presentar un amplio intervalo de péptidos para interacción funcional; y no sólo se han manipulado todas las interacciones biológicas conocidas, sino que también se han anulado las interacciones entre STM y proteínas citoplásmicas desconocidas que aparentemente anclan SteA parental en el citoplasma de las células. Finalmente, y de forma crucial, el armazón STM está bien expresado y es capaz de presentar péptidos biológicamente activos en un intervalo de sistemas, desde la transcripción/traducción in vitro a células bacterianas, de levadura y de mamíferos. En la sección de ejemplos, se usó el péptido diana AU1 tag para ilustrar generalmente la invención para aptámeros peptídicos. El comportamiento exitoso de STM en tres montajes independientes (dos híbridos de levadura, interacción con una proteína cinasa e interacción con la maquinaria de importación nuclear en células humanas) indica que STM es capaz de presentar un amplio intervalo de secuencias peptídicas para interacción funcional.

Otras aplicaciones

El lector experto apreciará que el uso de aptámeros peptídicos en microchips es particularmente ventajoso cuando esos aptámeros peptídicos se presentan en la proteína de armazón según la presente invención. La tecnología de microchips de la técnica anterior se basa enormemente en anticuerpos. Sin embargo, los anticuerpos pueden perder especificidad cuando se unen al chip. Además, proteínas recombinantes usadas en microchips pueden proporcionar información de que están presentes proteínas, pero no pueden proporcionar información sobre a quién se unen. Por el contrario, usando aptámeros peptídicos presentados en proteínas de armazón según la presente invención se puede proporcionar ventajosamente una mayor información cuando se interroga un chip. Por ejemplo, con la observación de una pareja de unión, se deriva ventajosamente información contextual cuando se usa una proteína de armazón para presentar el aptámero. Esta ventaja se caracteriza como la diferencia entre una librería sin tratamiento y una librería informada. De este modo, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de proteínas de armazón para presentar péptidos en microchips.

Preferentemente, la proteína de armazón se basa en Estefina A. Más preferentemente, la proteína de armazón comprende STM.

Preferentemente, la proteína de armazón según la presente invención se basa en la secuencia de Estefina A. Por “se basa en la secuencia de Estefina A” se quiere decir que la proteína de armazón debería de poseer por lo menos 70% de la secuencia de aminoácidos de Estefina A, preferentemente 80%, preferentemente 85%, preferentemente 90%, preferentemente 95% o incluso más de la secuencia de Estefina A. Más preferentemente, la proteína de armazón tendrá la secuencia de Estefina A y comprenderá una o más de las mutaciones G4W, V48D, y Leu 73.

La capacidad de los aptámeros peptídicos para interrumpir interacciones proteína-proteína in vivo puede permitir la identificación rápida de nuevas pistas farmacéuticas. Además, mediante la presente invención se facilita ventajosamente el uso de molécula o moléculas farmacéuticas candidatas pequeñas para interrumpir la interacción proteína-proteína.

Se puede utilizar ventajosamente el uso de insertos peptídicos que comprenden sitios de modificación post-traduccional tales como un sitio o sitios de fosforilación. Esto es beneficioso al diseccionar interacciones que varían según el estado de fosforilación del péptido diana. Además, permite la identificación de aptámeros peptídicos candidatos que se unen de una manera dependiente de la fosforilación.

En algunas formas de realización, puede ser deseable introducir enlaces disulfuro en cualquier lado del inserto del péptido diana, por ejemplo manipulando mediante ingeniería un resto de cisteína a cada lado del inserto del péptido diana. Esto puede ser útil si el armazón está siendo usado exclusivamente en un experimento. A este respecto, se ha de señalar que las cistatinas de familia II usan un enlace de disulfuro para formar elementos de estructura secundaria que corresponden a la región preferida de inserción en STM, demostrando que STM también se puede usar para presentar péptidos estabilizados covalentemente si se requiere. En el contexto de la presente invención, esto se puede lograr, por ejemplo, mediante adición de una cisteína individual en el término C del polipéptido de armazón, o en el péptido diana tal como en el extremo C-terminal del péptido diana, y además de un segundo resto de cisteína insertado en una segunda localización tal como en el término N del armazón o en el extremo N-terminal del péptido diana, permitiendo así la reticulación entre los dos. Sin embargo, se prefiere evitar de esta manera la constricción covalente de péptidos. De este modo, en armazones preferidos de la presente invención, preferentemente el péptido diana no está flanqueado por restos de cisteína.

En conjunto, se apreciará que diferentes armazones pueden forzar una tendencia en los péptidos que presentan, de forma que el estudio de péptidos diana puede implicar ventajosamente péptidos y/o librerías presentados en más de un armazón, para maximizar la probabilidad de éxito.

Los armazones de la invención tales como STM permiten a los investigadores extender las observaciones in vitro al entorno intracelular, y viceversa, permitiendo asimismo la identificación o creación in vitro de herramientas que se pueden usar dentro de las células sin preocuparse sobre patrones de plegamiento o el estado de oxidación de los enlaces de disulfuro.

La facilidad de expresión de STM y de aptámeros peptídicos a base de STM en forma recombinante, y la longevidad de las proteínas a 4ºC, indican que los aptámeros peptídicos a base de STM son adecuados para aplicaciones de microchips de proteínas. También se observa que la termoestabilidad de STM permite la purificación fácil de aptámeros peptídicos a base de STM a partir de lisados de E. coli tratados térmicamente.

Los aptámeros peptídicos basados en armazones de la presente invención tales como STM son herramientas que se pueden usar para validar dianas farmacéuticas, que se pueden usar como componentes de ensayos de diagnóstico o de pronóstico, o incluso forman la base para compuestos conductores para el tratamiento de enfermedad humana. Los armazones de la invención, basados ventajosamente en una proteína humana de longitud completa, pueden ser útiles como terapéuticos biológicos y/o en terapia génica.

Péptido diana

La expresión “péptido diana”, como se usa aquí, se refiere a un péptido de interés. El péptido diana es preferentemente un péptido heterólogo. Por heterólogo se quiere decir un péptido que no está en su contexto habitual, preferentemente un péptido que tiene una secuencia no encontrada habitualmente en la secuencia de la proteína de armazón que lo posee, lo transporta o lo presenta. Si el péptido tiene una secuencia que aparece en cualquier otra parte en la secuencia de la proteína de armazón, entonces, para que sea “heterólogo”, esa secuencia estará fuera de contexto, es decir, no ocupa su posición (dirección) de origen natural en el polipéptido de la proteína de armazón. En este contexto, “posición” significa la posición en la cadena de aminoácidos lineal en lugar de la posición en el espacio tridimensional con relación a otros restos de aminoácidos. El péptido diana puede ser artificial, por ejemplo generado mediante la construcción de una librería de péptidos para la incorporación en la proteína de armazón. En estas realizaciones, el péptido o péptidos artificiales se consideran “heterólogos” para los fines de la invención.

Aptámeros peptídicos

Los aptámeros peptídicos son péptidos constreñidos y presentados por una proteína de armazón que se usan para estudiar la función proteica en células. Algunos son capaces de interrumpir las interacciones proteína-proteína, y algunos son capaces de constituir módulos de reconocimiento que permiten la creación de una herramienta molecular para el análisis intracelular de la función proteica.

La capacidad para diseñar o identificar pequeñas moléculas que se pueden unir específicamente y con afinidad elevada a una proteína dada es una etapa limitante de la velocidad en muchos experimentos, incluyendo el desarrollo de microchips de proteínas, el análisis de proteínas en el contexto de células vivas y la validación de dianas farmacéuticas candidatas. En la naturaleza, las interacciones proteína-proteína se pueden mediar por pequeñas superficies de proteínas plegadas. Esto ha conducido al uso de pequeñas superficies peptídicas presentadas en el contexto de una proteína estable, denominada armazón, como módulos de reconocimiento de proteínas. Tales reactivos, denominados aquí aptámeros peptídicos, se han usado para interrumpir la actividad proteica biológica en un intervalo de sistemas.

Los aptámeros peptídicos se suministran más fácilmente y son más estables en células que los péptidos libres, y su plegamiento constreñido da como resultado un menor coste entrópico de unión y por tanto una mayor afinidad por proteínas diana. La manipulación proteica de aptámeros peptídicos les permite proporcionar la funcionalidad de reconocimiento en el diseño de una herramienta molecular, aunque este potencial todavía se ha de hacer realidad completamente. La afinidad de aptámeros peptídicos por sus dianas está comprendida entre 10-6 y 5 x 10-9 M en comparación con Kd 10-7 a 10-11 M para interacciones anticuerpo/diana. No obstante, los aptámeros peptídicos son claramente capaces de interrumpir interacciones proteína-proteína in vivo. Se llevan a cabo cribados de aptámeros peptídicos en células de levadura o en células de mamífero, que los distinguen de los cribados de presentación de fagos de librerías peptídicas o de anticuerpos llevados a cabo frente a proteína expresada de forma procariota

potencialmente erróneamente plegada.

Aunque el armazón más ampliamente usado es la proteína de Escherichia coli tiorredoxina (TrxA), se ha usado un número de otras proteínas. El éxito de esta tecnología depende de la robustez del armazón, aunque un tercio de los péptidos puede desestabilizar GFP, mientras que muchos aptámeros peptídicos a base de TrxA no son expresados de forma estable en células humanas cultivadas, sugiriendo que este armazón tampoco puede que no sea suficientemente rígido para presentar péptidos sin que él mismo pierda parcialmente el plegamiento. Los péptidos sacados del contexto de un armazón y colocados en otro pierden frecuentemente la capacidad para interaccionar con sus proteínas diana, surgiendo la posibilidad de que los cribados para interactores constreñidos con una diana dada pueden fallar excepto que se use un armazón apropiado. Finalmente, las actividades biológicas de los armazones usados para presentar péptidos no se han caracterizado de forma rigurosa en la técnica anterior, conduciendo a problemas de que cualquier fenotipo observado cuando se expresa un aptámero peptídico podría ser debido, por lo menos en parte, a un efecto del armazón y no al péptido insertado.

Por lo tanto, se ha producido un armazón robusto, versátil, biológicamente neutro para la presentación de péptidos constreñidos. Se buscó una proteína que se pudiese expresar de forma estable en un abanico de sistemas experimentales a la vez que presentan péptidos que son capaces de interaccionar funcionalmente con un amplio abanico de dianas. Tal armazón mejora sustancialmente la tecnología de aptámeros peptídicos incrementando su robustez. Además, expandiendo el repertorio de armazones disponibles, la presente invención incrementa ventajosamente la probabilidad de que se obtendrán aciertos en los cribados frente a un mayor número de proteínas diana usando librerías en múltiples armazones en cribados simultáneos frente a cada diana.

Estefina A

Aquí, se describe el desarrollo de un armazón rigurosamente ensayado y biológicamente inerte para la presentación de péptidos constreñidos, basado en Estefina A (SteA) humana. SteA es el miembro fundador de la familia de cistatina de inhibidores de proteína de catepsinas cisteínicas, que son peptidasas lisosómicas de la familia de papaína. El subgrupo de estefinas de la familia de cistatinas son proteínas de un solo dominio relativamente pequeño (alrededor de 100 aminoácidos). No reciben ninguna modificación post-traduccional conocida, y carecen de enlaces de disulfuro, sugiriendo que serán capaces de plegarse idénticamente en un amplio abanico de entornos extra e intracelulares. La propia SteA es una proteína monómera, de una sola cadena, de un solo dominio, de 98 aminoácidos. La estructura de SteA se ha resuelto (Martin et al. 1995 J Mol Biol. vol 246 p. 331-43; Tate et al 1995 Biochemistry vol 34 p. 14637-48; Jenko et al 2003 J Mol Biol. vol 326 p. 875-85), facilitando la mutación racional de SteA en el armazón de STM. La única actividad biológica conocida de cistatinas es la inhibición de la actividad de catepsina, lo que permitió ensayar exhaustivamente la actividad biológica residual de nuestras proteínas manipuladas mediante ingeniería. De este modo, se describe que la manipulación proteica de SteA nativa puede producir variantes que son útiles como armazones de aptámeros peptídicos. Se demuestra que SteA se puede manipular para que pierda su actividad biológica in vitro y en el contexto celular, creando en una realización preferida una proteína artificial denominada STM (Mutante Triple de Estefina A). Los métodos biofísicos muestran que el armazón de STM con un péptido insertado retiene el plegamiento y la termoestabilidad de la proteína progenitora. Se demuestra que STM es capaz de acceder tanto al citoplasma como al núcleo de las células humanas, haciéndola una herramienta versátil para la exploración de la biología de proteínas humanas. El armazón manipulado presenta fácilmente péptidos para la interacción tanto in vitro como en células bacterianas, de levadura y de mamíferos. Finalmente, se demuestra que STM es capaz de presentar un abanico de péptidos diseñados que pueden interaccionar con éxito con una diana conocida. El aptámero peptídico de la técnica anterior ha estado obstaculizado por dificultades en la identificación de la actividad biológica en ensayos a base de células, provocado por lo menos en parte por un comportamiento por debajo del óptimo de los diversos armazones existentes. Se ha creado un armazón útil que será de gran beneficio para aquellos que busquen estudiar interacciones proteína-proteína in vitro e in vivo.

Secuencias de Estefina A

Un armazón “a base de” estefina A tiene una secuencia que deriva de estefina A. Preferentemente, la secuencia derivada de estefina A comprende la secuencia de tipo salvaje de estefina A, que comprende preferentemente una o más de las modificaciones (mutaciones) descritas aquí, preferentemente que comprende la secuencia de STM, preferentemente que comprende la secuencia de STM que posee un péptido diana insertado en el sitio Leu73.

Se pondrá de manifiesto para un experto en la materia que se pueden hacer modificaciones pequeñas a la secuencia del armazón sin apartarse de la invención. En particular, la invención se refiere a secuencias de aminoácidos y/o secuencias nucleotídicas que tienen por lo menos 60% de identidad con las secuencias correspondientes mostradas aquí, preferentemente por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 92%, preferentemente por lo menos 94%, preferentemente por lo menos 95%, preferentemente por lo menos 96%, preferentemente por lo menos 97%, preferentemente por lo menos 98%, preferentemente por lo menos 99% de identidad, o incluso más. En cada caso, las variaciones de secuencias se consideran “minoritarias” si no afectan de forma adversa la capacidad del armazón para presentar el péptido diana al disolvente, y no restauran o generan funciones biológicas tales como aquellas poseídas por estefina A de tipo salvaje pero que están abolidas en los mutantes G4W, Leu73 o V48D, y preferentemente no restauran ninguna función biológica abolida por el mutante triple de STM.

Adicionalmente, pequeñas modificaciones también pueden incluir pequeñas supresiones o adiciones a las secuencias de estefina A o derivadas de estefina A descritas aquí, tales como adición o supresión de 10 aminoácidos o menos al polipéptido derivado de estefina A. De este modo, la invención se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen una adición o supresión total con respecto a las secuencias de estefina A o de STM descritas aquí de 40 aminoácidos o menos, preferentemente 30 aminoácidos o menos, preferentemente 20 aminoácidos o menos, preferentemente 15 aminoácidos o menos, más preferentemente 10 aminoácidos o menos, preferentemente 9 aminoácidos o menos, preferentemente 8 aminoácidos o menos, preferentemente 7 aminoácidos o menos, preferentemente 6 aminoácidos o menos, preferentemente 5 aminoácidos o menos, preferentemente 4 aminoácidos o menos, preferentemente 3 aminoácidos o menos, preferentemente 2 aminoácidos o menos, preferentemente 1 aminoácido. La adición o supresión total es el factor importante, de forma que una diferencia de 9 o menos puede significar una supresión de 9 aminoácidos, o tres supresiones cada una de tres aminoácidos, dos adiciones de tres aminoácidos y una supresión de tres aminoácidos, etc. La invención también se refiere a las variantes de ácido nucleico correspondientes. En cada caso, las variaciones de secuencias se consideran modificaciones “minoritarias” si no afectan adversamente la capacidad del armazón para presentar el péptido diana al disolvente, y no restauran o generan funciones biológicas tales como aquellas poseídas por la estefina A de tipo salvaje pero que están abolidas en los mutantes G4W, Leu73 o V48D, preferentemente no restauran ninguna función biológica abolida por el mutante triple de STM.

Mutaciones de Estefina A

A continuación se discuten a su vez mutaciones preferidas de estefina A.

En el contexto de la discusión sobre sitios de mutación, “próximo a” significa en 7 aminoácidos, preferentemente en 5 aminoácidos, preferentemente en 3 aminoácidos, preferentemente en 2 aminoácidos, preferentemente en el aminoácido nombrado, o uno de los dos aminoácidos vecinos.

En el contexto de inserciones, se prefiere que, a nivel de ácido nucleico, se introduzca o introduzcan un sitio o sitios de restricción, preferentemente sitio o sitios de restricción únicos, para facilitar futuras inserciones. Esto se discute con cierto detalle en relación con el sitio Leu73. Estas enseñanzas y el conocimiento general común en la técnica de tecnología de ácidos nucleicos recombinantes permiten al trabajador experto introducir el sitio o sitios de restricción relevantes a la vez que preservar los rasgos clave del armazón. Por “único” se quiere decir único en la secuencia codificante de la proteína de armazón. Se pueden usar sitios no únicos, pero se prefieren los sitios únicos por la facilidad de inserción y manipulación de estos constructos. Cuando se usan dos o más sitios para por ejemplo facilitar la eliminación y sustitución de la secuencia que codifica el bucle Leu73-80 de SteA, preferentemente cada uno de los dos o más sitios es único. Sin embargo, si los dos o más sitios son idénticos, puede simplificar ventajosamente las operaciones de eliminación y sustitución, por ejemplo implicando un tratamiento con una sola enzima de restricción. Estas elecciones están dentro de la capacidad del experto en la materia que trabaja con la invención. En una realización preferida, se introducen dos sitios idénticos para la eliminación y sustitución del bucle Leu73-80. Preferentemente, los sitios de restricción usados en las secuencias que codifican las regiones Leu73, G4 y V48 son diferentes, de forma que se pueden realizar inserciones o modificaciones en cada una de estas tres localizaciones en la secuencia codificante usando una enzima de restricción diferente para facilidad de manipulación.

Mutación G4W

La expresión “mutación G4W” se usa aquí para describir una mutación alrededor de, preferentemente próxima a o preferentemente en, el sitio G4 de estefina A, o polipéptidos derivados de estefina A. En una realización amplia, la mutación G4W se refiere a una adición o adiciones o inserción o inserciones o sustitución o sustituciones en el resto o restos de aminoácidos del término amino de SteA. Preferentemente, tales mutaciones son próximas a Por 14, preferentemente próximas a G4. Preferentemente, tales mutaciones están próximas a, o preferentemente en, Pro14 de SteA humana. Preferentemente, tales mutaciones están próximas a, o preferentemente en, el resto G4 de SteA humana. La mutación G4W particularmente preferida es como se demuestra mediante la secuencia de STM. Lo más preferido es la sustitución de G4 con W. En una realización preferida, el sitio G4W se usa como un sitio de inserción secundario además del sitio Leu73, o incluso como un sitio de inserción terciario además de los sitios tanto Leu73 como V48D.

Mutación V48D

La expresión “mutación V48D” se usa aquí para describir la mutación alrededor de, preferentemente próxima a o preferentemente en, el sitio VAG de SteA. El sitio VAG es el resto 48-50 del sitio QVVAG, que está en los restos 46-50 de SteA humana.

Preferentemente, ésta se refiere a una adición o adiciones o inserción o inserciones o sustitución o sustituciones alrededor de, preferentemente próximas a o preferentemente en los restos 48, 49, 50 del sitio VAG de SteA humana. Preferentemente, ésta se refiere a adiciones a o inserciones en el sitio VAG (restos 48, 49, 50 de estefina A humana), preferentemente próximas a o más preferentemente en el resto V de esta secuencia. La mutación V48D particularmente preferida es como se demuestra mediante la secuencia de STM. Lo más preferido es la sustitución de V48 con D.

En una realización preferida, el sitio V48D se usa como un sitio de inserción secundario además del sitio Leu73.

Mutación Leu73

El sitio Leu73 representa el sitio de inserción preferido para péptidos diana según la presente invención. Éste se escogió debido a que representa un bucle expuesto a disolvente de la proteína Estefina A, y por lo tanto es susceptible a la presentación de péptidos diana de una manera accesible a disolventes. Preferentemente, esta propiedad es conservada por mutaciones en este sitio.

La expresión “mutación Leu73” se usa aquí para describir una mutación alrededor de o preferentemente próxima a o preferentemente en el bucle L73-L80 de SteA humana.

La expresión se puede referir a una adición o adiciones a o inserción o inserciones en, o sustitución de Leu80 de estefina A humana. Preferentemente, la expresión se refiere a una adición o adiciones o inserción o inserciones en, o sustitución de Leu73 de estefina A humana.

En una realización, la mutación Leu73 puede comprender la sustitución de todo el bucle entre L73 y L80 con cualquier secuencia peptídica, preferentemente con un intervalo de secuencias peptídicas diana diferentes (preferentemente sólo una por molécula de armazón de estefina), es decir, una librería.

A nivel de ácido nucleico, las mutaciones preferidas son aquellas que dan como resultado un sitio de restricción para la inserción en el bucle Leu73-Leu80, y más preferentemente dos sitios de restricción para la sustitución de la secuencia que codifica este bucle. Se prefieren particularmente los sitios de restricción que son únicos para la secuencia codificante del armazón de estefina A. Lo más preferido es el sitio de restricción RsrII.

En una realización muy preferida, la mutación Leu73 corresponde a la mostrada en la proteína de STM, y preferentemente la secuencia de ácido nucleico de RsrII correspondiente está presente en el ácido nucleico que la codifica. De este modo, en una realización preferida, la secuencia de aminoácidos KSL de SteA en los restos 71-73 (es decir, Leu73) se sustituye por la secuencia de aminoácidos NGP en la misma dirección (restos 71-73) como en la secuencia de STM. La secuencia de STM no está preferentemente expandida con relación a la secuencia de SteA, sino que preferentemente permanece en 98 aminoácidos.

Se observará que, en estas realizaciones, la inserción del péptido usando el sitio RsrII conduce a que se introduzcan dos aminoácidos extra (es decir, la secuencia nucleotídica del sitio RsrII codifica GP). Esto es debido a que, tras la ligación, el sitio RsrII se duplicará. Las referencias a un “único” sitio RsrII aquí se refiere a ácido nucleico que codifica el armazón sin el inserto peptídico. De este modo, para evitar dudas, las referencias a la longitud del inserto peptídico se refieren a la secuencia de aminoácidos heteróloga de interés, y no incluye los dos aminoácidos extra (GP) introducidos por el sitio RsrII. De este modo, la introducción de un péptido 20mérico conduce a una fusión de armazón-péptido de 120aa (98aa (armazón) + 20aa (péptido diana) + 2aa (GP) = 120aa). Preferentemente, el péptido diana se introduce en este sitio así: *NGPX-XGP**, en el que “*” y “**” = resto de las secuencias del armazón, y “X-X” = péptido diana. Preferentemente, X-X comprende 20 aminoácidos o menos, preferentemente 12 aminoácidos o menos.

Mutaciones de combinación

Preferentemente, una proteína de armazón según la presente invención se basa en Estefina A y comprende por lo menos una de las mutaciones descritas anteriormente. Preferentemente, la proteína de armazón comprende la mutación Leu73. Preferentemente, la proteína de armazón comprende el péptido diana insertado en el sitio de Leu73.

Preferentemente, la proteína de armazón comprende por lo menos dos mutaciones como se describe anteriormente. Cuando una proteína de armazón de la presente invención comprende sólo dos mutaciones, preferentemente éstas no son sólo las mutaciones G4W y Leu73. Cuando la proteína de armazón de la presente invención comprende sólo dos mutaciones, preferentemente estas mutaciones son las mutaciones V48D y Leu73.

Preferentemente, una proteína de armazón según la presente invención posee las tres mutaciones descritas anteriormente. Por lo tanto, preferentemente, una proteína de armazón según la presente invención tiene las mutaciones G4W, V48D y Leu73 combinadas.

Con respecto a la mutación G4W, ésta es particularmente ventajosa para uso potenciando la avidez y/o especificidad de entidades que se unen al péptido diana insertado en el sitio Leu73 y/o el sitio V48 en la proteína de armazón.

Con respecto a la mutación V48D, ésta representa otro bucle expuesto a disolvente en la estructura de Estefina A. Esto es particularmente ventajoso para uso en la potenciación la avidez y/o especificidad de entidades que se unen al péptido diana insertado en el sitio Leu73 y/o en el sitio G4W en la proteína de armazón. De este modo, la invención abarca el uso de V48D como un sitio de inserción secundario o terciario en una proteína de armazón basada en Estefina A.

Los péptidos diana se pueden insertar ventajosamente en cualquiera de los tres sitios de mutación preferidos G4W y/o V48D y/o Leu73. Preferentemente, se insertan en V48D y/o Leu73. Preferentemente, se insertan en Leu73.

En la realización altamente preferida, las proteínas de armazón a base de Estefina A permiten el uso de tres superficies en total. Éstas son las superficies definidas por el bucle de Leu73, el bucle de V48D y el bucle de G4W. Estos bucles se muestran en forma tridimensional en la figura 1b. La mayoría de las proteínas de armazón de la técnica anterior usan sólo una única superficie, y por lo tanto es una ventaja de la presente invención el hecho de que se puedan usar múltiples superficies en una única proteína de armazón. Una proteína de la técnica anterior que permite que se usen múltiples superficies está compuesta de repeticiones del dominio de distrofina. Sin embargo, esto no se puede usar en las células de mamífero puesto que una proteína estructural de mamífero es aquella que tiene tantas proteínas parientes y parejas que es improbable que sea biológicamente neutra.

Fase sólida y microchips

Como se señala anteriormente, la invención encuentra aplicación en microchips. En realizaciones de fase sólida tales como realizaciones de microchips, la proteína de armazón está manipulada preferentemente para facilitar su asociación o unión al sustrato en fase sólida para el ensayo. Preferentemente, esto se realiza pegándolo a un revestimiento de oro, o mediante asociación con biotina. A fin de manipular el armazón para pegarlo a un revestimiento de oro, preferentemente se introduce uno o más restos de Cys en el término C o N de la proteína de armazón. A fin de manipular el armazón para la inmovilización mediante unión a biotina, preferentemente se introduce en dicho armazón un dominio de unión a biotina de ocho aminoácidos (“estreptag”). La inmovilización se puede realizar mediante uno o más de estos o cualesquiera otros medios adecuados. Preferentemente, la proteína de armazón de la invención está inmovilizada. Preferentemente, la proteína de armazón de la invención se manipula para inmovilización. Preferentemente, se llevan a cabo ensayos de interacción según la presente invención usando la proteína de armazón inmovilizada.

Otras ventajas de la invención

Las proteínas de armazón a base de Estefina A son superiores para usar péptidos, debido a que se pueden usar in vivo. Además, empleando sistemas recombinantes, son más baratas que el trabajo con péptidos sintéticos. Además, la construcción de librerías es más barata que el uso de librerías sintéticas por la misma razón, y también debido a que se pueden diseñar racionalmente usando manipulación de ácidos nucleicos. Esto reduce la dependencia de química complicada para la síntesis peptídica.

Las proteínas de armazón a base de Estefina A son superiores a la técnica anterior tales como la presentación de fagos, puesto que son internas a la célula, mientras que la presentación de fagos descansa en la interacción extracelular. Además, las proteínas de armazón de la presente invención se pueden usar para trabajar sobre dianas nativas en lugar de dianas recombinantes. Esto tiene una ventaja adicional de manera que permite el examen de proteínas modificadas post-traduccionalmente que se fosforilarán o glicosilarán correctamente o se modificarán post-traduccionalmente de otro modo in vivo pero que probablemente no se formarían correctamente si se producen in vitro.

Una ventaja adicional de las proteínas de armazón según la presente invención es que permiten la interrogación del espectro de origen natural de variantes de corte y empalme y variantes de modificación post-traduccional que se producen in vivo sin tener que fabricar individualmente cada una de ellas y conjuntarlas o compartimentalizarlas de otro modo para el análisis.

Una aplicación adicional de la invención está en el uso de microbastidores como una lectura para la interacción con proteínas de armazón a base de Estefina A. Además, las proteínas de armazón de la presente invención son particularmente adecuadas para uso con lecturas de tipo transistor de película delgada.

La presente invención se describirá ahora a título de ejemplo, en la que se hará referencia a las siguientes figuras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1, Panel A. Muestra representaciones de la estructura molecular de Estefina

A. Panel A: un alineamiento de los miembros de la familia de Estefina a lo largo de la evolución identifica regiones de conservación elevada y mala conservación que pueden corresponder a regiones estructural y funcionalmente importantes. Se muestran en dorado restos de aminoácidos adicionales presentes en los miembros de la familia. Los restos conservados que se sabe que son importantes para interacciones proteína-proteína que se han alterado están resaltados en rojo, mientras que el sitio de la inserción peptídica se muestra en azul. Las secuencias de NCBI NP_00524 (cistatina A humana), NP_000091 (cistatina B humana), P01034 (precursor de cistatina C humana), NP001891 (precursor de cistatina D humana), NP_001314 (precursor de cistatina M humana), así como las secuencias para la cistatina A de pollo (NP990831), rata (XP213617) y bovina (P80416) se alinearon usando ClustalW del suite GCG. Panel B: una representación de la estructura en disolución de RMN de Estefina A, creada usando un software de Cn3D y coordenadas de PDB 1DVD (Martin et al. 1995 “The three-dimensional solution structure of human stefin A”. J Mol Biol. vol 246 p. 331-43). Las regiones que se mutaron para producir STM se destacan en amarillo.

Figura 2. Muestra las transferencias que demuestran que STM recombinante retiene características de la proteína de tipo salvaje, y pueden presentar péptidos a disolvente. Panel A: Estefina A de tipo salvaje, la variante de STM, y STM con un péptido de 6 aminoácidos (DTYRYI) insertado permanecen solubles tras una incubación de 20 minutos a 75ºC. Además, la forma dimérica cambiada de dominio de SteA de tipo salvaje cuya formación es promovida por tratamiento térmico está ausente de las formas de STM. Panel B: STM que posee la etiqueta epitópica AU1 se puede agotar cuantitativa y específicamente de lisados de E. coli con un anticuerpo anti-AU1.

Figura 3. Muestra gráficas que ilustran la caracterización bioquímica y biofísica de STM. Esto muestra que el plegamiento de STM es casi paralelo al de SteA. Panel A. Cromatografía de filtración en gel de STM recombinante (líneas continuas) y SteA (líneas discontinuas) con (rojo) y sin (azul) tratamiento térmico previo que se hicieron fluir sobre una columna de filtración en gel. SteA de tipo salvaje eluye en dos picos, indicando las formas monómera y cambiada de dominio dímera promovida térmicamente, mientras que STM eluye como un monómero incluso después del tratamiento térmico. Panel B: el dicroísmo circular indica la naturaleza altamente estructurada de SteA, y en particular la proporción elevada de SteA que está compuesta de una lámina beta. Panel C: los elementos de plegamiento de STM detectados por CD son idénticos a los de SteA tipo salvaje, indicando que las dos proteínas variantes se pliegan de forma sustancialmente similares, o incluso idénticas.

La figura 4 muestra gráficas y transferencias que muestran que STM (a diferencia de SteA) ya no es capaz de unirse a sus parejas primitivas, las catepsinas, o papaína. Panel A: se incubaron cantidades iguales de SteA o STM recombinante purificada con un inserto de AU1 (indicado por la flecha) con perlas de papaína-agarosa. Las proteínas que se unen a las perlas se separaron mediante SDS-PAGE, y las variantes de SteA se detectaron con un anticuerpo anti-SteA. Una proteína que reacciona de forma cruzada que se origina en las perlas muestra una carga igual de las líneas. SteA es capaz de unirse a las perlas. Por el contrario, STM no se copurifica con las perlas, como se muestra mediante las líneas vacías duplicadas. Panel B: la capacidad de SteA para inhibir la actividad de proteasa de catepsina B disminuye a medida que se diluye SteA. Incluso los niveles más elevados de STM/AU1 no tienen efecto. Panel C: muestra el mismo efecto que el panel B, pero usando catepsina H como la proteasa que se puede inhibir de una manera dependiente de la concentración mediante SteA, pero cuya actividad no se ve afectada por incluso niveles elevados de STM/AU1.

La figura 5 muestra fotomicrografías de células. STM puede presentar péptidos biológicamente funcionales en el contexto de células de mamífero. STM fusionado a GFP se localiza a través del citoplasma y el núcleo de células U2OS (columna de la izquierda). Sin embargo, una vez se inserta un (columna central) o dos (columna de la derecha) péptidos NLS en el sitio aceptor de péptidos manipulado en STM, la fusión de aptámero peptídico-GFP se localiza exclusivamente en el núcleo. Las células se contratiñeron con DAPI (fila superior) para revelar el núcleo, y con el colorante de membrana PKH26 para mostrar la membrana plasmática (segunda fila). Las fusiones STM-GFP sin y con los péptidos NLS se muestran en la tercera fila de fotos, y las tres imágenes están superpuestas en la fila final.

La figura 6 muestra fotografías de parches de células desarrolladas. Péptidos que interaccionan con CDK2 se pueden mover desde tiorredoxina a STM. Se barajaron catorce aptámeros peptídicos identificados en un cribado de aptámeros peptídicos constreñidos por tiorredoxina (Trx) que se pudieron unir a CDK2 desde Trx hasta STM. De estos, sólo dos (Pep2 y Pep6) todavía pudieron reconocer CDK2. Pep11 se muestra como un ejemplo de un péptido que se une a CDK2 cuando es presentado por Trx, pero no por STM.

La figura 7 muestra un diagrama (7A), una fotografía de parches celulares (7B), una fotografía de una transferencia (7C) y fotografías de tres transferencias (7D).

La figura 8 muestra fotografías de ensayos de cinasas.

La figura 9 muestra identificación de un aptámero peptídico que provoca osmosensibilidad.

A. Se expresaron aptámeros peptídicos que interaccionan con el dominio Sho1 SH3 bajo el control del promotor GaII en la cepa de levadura TMY182 (antecedente W303 Δssk2Δssk22), en la que la osmorresistencia depende de la integridad del brazo Sho1 de la ruta HOG, en presencia de NaCl 1M. Cuando la expresión de los aptámeros peptídicos es inducida por galactosa en el medio, las células de levadura que expresan AptA fueron osmóticamente sensibles, mientras que aquellas que expresan otros aptámeros peptídicos fueron viables.

B. Transferencia Western de lisado de levadura con un anticuerpo que reconoce Hog1 activo fosforilado confirma que AptA da como resultado una letalidad osmótica inhibiendo la activación de Hog1.

La figura 10 muestra el conjunto de especificidad amplia de proteoma de 28 dominios SH3 de levadura.

El genoma de levadura codifica 25 proteínas que entre ellas comprenden 28 dominios SH3. Cada dominio, o combinación de dominios, se clonó como un cebo de dos híbridos de levadura, se ensayó mediante emparejamiento de interacción para determinar su capacidad para reconocer AptA. La sustitución de las dos prolíneas en el motivo PxxP de AptA con restos de alanina para crear AptA* abolió la unión a Sho1 SH3, indicando que AptA es un ligando SH3 de buena fe. El dominio SH3 de Bud14 es un cebo autoactivante, dando lugar a un color azul incluso cuando se empareja con un plásmido víctima vacío. 05 y 32 son dos aptámeros peptídicos que se aislaron del cribado pero que no inhibieron la señalización. AptA* es la versión mutante de AptA, en la que los dos restos de prolina del motivo PxxP se han cambiado por alaninas (PP/AA). STM es el armazón vacío.

La figura 11 muestra la reatadura membránica de Pbs2 por AptA reconstituyen la ruta de señalización.

Panel A: esquema de la estrategia para reatar Pbs2 alterado por la unión de SH3 a Sho1 mediante fusión a AptA. La mutación de prolinas 96 y 99 de Pbs2 a alaninas anula la capacidad de Pbs2 para unirse a Sho1-SH3 [19]. La fusión de AptA a Pbs2 debería de crear proteínas quiméricas que tienen las funciones de Pbs2 (interacción con Ste11, Hog1, etc.) y la capacidad para unirse una vez más a Sho1. Por el contrario, la fusión del mutante Pbs2 a STM no debería de crear una quimera funcional. Panel B. Ensayo de mancha de levadura que muestra que Pbs2(AA) recombinante-Apt funciona de manera similar a Pbs2 de tipo salvaje, y permite la señalización. Como antes, la levadura que expresa AptA son osmóticamente sensibles. Este experimento indica que AptA es capaz de reclutar Pbs2 (P96A/P99A) para el receptor Sho1, y confirma que el fenotipo osmosensible de AptA es debido a la interacción con Sho1.

La figura 12 muestra AptA evita el ensamblaje normal del complejo de señalización de Sho1.

A. Se incubó lisado de células de levadura con perlas de GST-Sho1 SH3 y se hicieron pasar sobre una columna de glutationa-agarosa. Tras un lavado intenso, las proteínas unidas a las perlas se eluyeron con glutationa reducida. La transferencia western muestra una cantidad reducida de Hog1 asociada con el complejo de interacción Sho1-SH3 en presencia de AptA, indicando que su interacción física estaba perturbada por AptA pero no por el aptámero peptídico de control.

B. Esquema modelo que resume este trabajo y sus implicaciones.

La figura 13 muestra la expresión y purificación de aptámeros peptídicos de STM. Se expresaron aptámeros peptídicos recombinantes de GST-STM o –STM en células BL21 DES3 pLys, seguido de una cromatografía de afinidad sobre perlas de glutationa. Los aptámeros peptídicos con insertos de diferentes longitudes (Apt05: 12 restos de aminoácidos; Apt206: 26 restos; Apt201: 40 restos) se sometieron a SDS-PAGE y se visualizaron con tinción de Coomasie. Líneas 1-3: 0,01% de entrada de fracción soluble del lisado celular total (1: GST-STM, 2: GST-Apt05, 3: GST-Apt 206). Líneas 4-7: fracciones de perlas de glutationa con proteínas unidas (4: GSTSTM, 5: GST-Apt05, 6:GST-Apt206, 7: GST-Apt201). Líneas 8-10: aptámeros peptídicos de STM escindidos de la fusión con GST mediante la proteasa PreScission. (8: STM; 9:Apt05; 10: Apt206; 11:Apt201).

La figura 14 muestra una fusión de AptA a Ste11 no confiere osmorresistencia.

Panel A: Los constructos expresados fueron STM o AptA solos, o una fusión de Ste11 de STM, que no debería de interferir con la función de Ste11, o de AptA, que debería dirigir Ste11 constitutivamente a Sho1. Panel B: presentación esquemática de las placas mostradas en los paneles C-F. Panel C: placa de control para mostrar que la expresión inducida por galactosa de AptA, o la fusión AptA-Ste11, no es en sí misma tóxica para la levadura. Panel D: como el panel C, excepto que el medio se suplementó con NaCl 1M para inducir la respuesta de choque osmótico. En presencia de NaCl 1M, las células que expresan AptA, o una fusión de AptA a Ste11, son incapaces de crecer. Las células que expresan STM, o STM fusionado a Ste11, son resistentes al estrés osmótico. Paneles E y

F: placa de control que contiene glucosa, que reprime la expresión de las proteínas de fusión mostradas en el Panel A, para mostrar que la incapacidad para crecer en concentración elevada de sal depende de la expresión de AptA, o Ste11-AptA. Panel G: transferencia western que muestra que Hog1 MAPK no es fosforilada cuando las células expresan AptA o la fusión AptA-Ste11. La incapacidad de Ste11-Apt para restaurar la activación de Hog1 indica que AptA todavía es funcional en esta quimera, pero Ste11 no lo es.

EJEMPLOS

Los ejemplos hacen uso de las siguientes técnicas y procedimientos:

Plásmidos y manipulación de ADN

pcDNA3SteA posee el marco de lectura abierto de SteA bajo el control del promotor de citomegalovirus (J.P. Waltho, University of Sheffield, UK). pcDNA3.1 HisA y pcDNA3.1 His/Myc B para la construcción de proteínas marcadas con hexahistidina en células de mamífero se adquirieron de Invitrogen (Paisley, UK), pGILDA de Origene (Rockville, Maryland, USA). pET30a(+), para la expresión de proteínas marcadas con hexahistidina en bacterias, se adquirió de Novagen (Nottingham, UK) y pGFP2-C2 de Perkin Elmer (Boston, MA, USA). Los plásmidos de dos híbridos de levadura (incluyendo pEG202, pJG4-5 y pJM-1) y las cepas proceden de Molecular Sciences Institute, Berkeley, California, USA. pRS306 GFP-Sho1p procede de Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA. Las manipulaciones del ADN se llevaron a cabo como se describe por Sambrook y Russell (2001 “Molecular Cloning, a Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), usando enzimas obtenidas de NEB (MA, USA). Los oligonucleótidos procedían de Sigma-Genosys (Pampisford, UK), y se dan en el listado de secuencias. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Multisite (Stratagene, Cedar Creek, Texas, USA). Todas las manipulaciones del ADN se confirmaron mediante secuenciación.

Plásmidos para la expresión en células de mamífero

El marco de lectura abierto de SteA se amplificó mediante PCR usando los cebadores P1 y P2 (listado de secuencias) a partir de pcDNA3SteA, y se clonó entre los sitios EcoRI y EcoRV de pcDNA3.1 HisA, creando SteA peDNA3.1 HisA. Se introdujo un sitio RsrII en este constructo mediante mutagénesis dirigida al sitio usando el oligonucleótido P3, creando RS pcDNA3.1 HisA, en el que los codones 71 a 73 del ORF están alterados, cambiando la secuencia proteica de KSL a NGP. El ORF de RS se amplificó mediante PCR usando los cebadores P4 y P5 y RS pJG4-5 (véase más abajo) como molde, y se clonó entre los sitios EcoRI y XbaI de pcDNA3.1 His/Myc B creando RS pcDNA3.1 His/Myc B. El marco de lectura abierto de DS se amplificó mediante PCR a partir de DS pJG4-5 (véase más abajo) usando los cebadores P6 y P7, cambiando la codificación del codón 4 de glicina a triptófano. El producto de la PCR se clonó EcoRI -XbaI en pcDNA3.1 His/Myc B para crear STM pcDNA3.1 His/Myc B. El marco de lectura abierto de DS se amplificó separadamente mediante PCR a partir de DS pJG4-5 usando los cebadores P8 y P9 que introdujeron tanto la tercera mutación G4W como un NLS N-terminal, clonándose el producto de la PCR EcoRI – XbaI para crear NLS STM pcDNA3.1 His/Myc B. STM se subclonó EcoRI -EcoRI a partir de STM pJG4-5 en pGFP2-C2 para crear STM pGFP2-C2. Este se convirtió en STM 1xNLS pGFP2-C2 insertando un casete de ADNds creado hibridando oligonucleótidos P10 y P11 que codifican el SV40 T NLS (PKKKRKV) flanqueado por sitios de restricción AvaII en el sitio RsrII del marco de lectura abierto de STM. La ligación concatamérica de dos casetes en el sitio RstII creó STM 2xNLS pGFP2-C2.

Plásmidos para la expresión en Saccharomyces cerevisiae

RS se amplificó mediante PCR a partir de RS pcDNA3.1 HisA usando los cebadores P12 y P13, y se clonó EcoRI -EcoRI en pJG4-5 (Gyuris et al, 1993) en el marco con el dominio de activación B42 para crear RS pJG4-5. Se sugiere que el uso del dominio de activación transcripcional relativamente débil en este plásmido permitirá la selección de aptámeros peptídicos con una afinidad elevada por sus proteínas diana. La mutagénesis dirigida al sitio de RS que usa el oligonucleótido P14 introdujo la mutación V48D, creando DS pJG4-5. El oligonucleótido P15 alteró el codón 4 para codificar triptófano, creando STM pJG4-5. STM pJG4-5 se alteró subsiguientemente mediante mutagénesis dirigida al sitio de forma que la secuencia que rodea al sitio RsrII se emparejó con la de TrxA, usando el cebador P26. Todas las manipulaciones subsiguientes descritas usaron esta forma alterada de STM. STM se subclonó a partir de STM pJG4-5 en pGILDA usando los sitios de flanqueo EcoRI para crear STM pGILDA. Los oligonucleótidos que codifican las secuencias peptídicas de los 14 interactores de CDK2 identificados por Colas (1996 Nature vol. 380 p. 548-50) se clonaron en STM pJG4-5 para ensayos de interacción de dos híbridos de levadura. El dominio SH3 de Sho1p se amplificó mediante PCR a partir de pRS306 GFP-Sho1p usando los cebadores P24 y P25. El producto de PCR digerido se clonó en pEG202 digerido con EcoRI/NotI, para obtener pEG202-Sho1-SH3.

Plásmidos para la expresión en Escherichia coli

El ORF SteA se amplificó mediante PCR usando los cebadores P16 y P17 y SteA pcDNA3.1 HisA como molde, y se clonó usando EcoRI -XhoI en pET30a(+) para crear SteA pET30a(+). La mutagénesis dirigida al sitio con los oligonucleótidos descritos en la sección previa se usó para crear RS pET30a(+) y STM pET30a(+). Un casete oligonucleotídico bicatenario flanqueado por salientes de AvaII que codifican la etiqueta epitópica de AU1 DTYRYI se obtuvo hibridando los oligonucleótidos P18 y P19. El inserto de ADNds AU1 se ligó en el sitio RsrII de STM pET30a(+) para crear STM AU1 pET30a(+).

Construcción de aptámeros peptídicos de STM: preparación de librería de ADN

El oligonucleótido monocatenario degenerado P21 para el cribado de SH3 de dos híbridos de levadura se hizo bicatenario mediante PCR usando P20 para cebar la reacción, y los casetes digeridos con AvaII se ligaron en el sitio RsrII de STM pJG4-5 siguiendo los métodos de Colas (1996 Nature vol. 380 p. 548-50) y Geyer, C.R. (2000 Current Protocols in Molecular Biology F.M. Ausubel et al, Eds. 24.4.1-24.4.25.).

La ligación ocasional de los oligonucleótidos entre sí así como al vector conduce a la expresión de múltiples péptidos en un armazón. El ADN ligado se usó para transformar E. coli XL10 Gold Cells (Stratagene), a partir del cual se aisló ADN midiprep (Qiagen) y se transformó en levadura. La calidad de las librerías se ensayó secuenciando plásmidos aislados de 30 clones separados ya sea antes o durante cribados subsiguientes.

Preparación de librerías de levadura

Todos los métodos de levaduras fueron como se describen en Rose et al (Eds). (1990 Methods in Yeast Genetics: a Lab course manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). La transformación del AND de librería en levadura dio como resultado aproximadamente 5000 colonias por µg. La levadura transformada se recuperó y se hizo crecer en medio selectivo durante cuatro horas a 30ºC con agitación (250 rpm). Las células se recuperaron mediante centrifugación a 1000 x g, se lavaron en agua ultrapura y se resuspendieron en glicerol al 25% para ser congeladas en alícuotas a -80ºC. El número de unidades formadoras de colonias por alícuota se determinó mediante dilución en serie de una alícuota descongelada en placas selectivas.

Expresión y detección de proteínas en levadura

Células procedentes de cultivos durante toda la noche de colonias de levadura individuales que poseen pJG4-5-STM se hicieron crecer en 10 ml de medio que contiene la fuente de carbono apropiada (glucosa o galactosa al 2% v/v) para la represión o expresión proteica, respectivamente. Las células se recuperaron mediante centrifugación como antes, se lavaron en agua ultrapura y se resuspendieron en 1 ml de tampón de extracción de proteína (50 mM de Tris.Cl pH 7,4, 2 mM de EDTA, 100 mM de NaCl con inhibidores de proteasa completos [Roche]). La lisis se realizó sometiendo a vórtex vigoroso durante 10 minutos a 4ºC con perlas de vidrio de 400/600 micrómetros (Sigma). Las perlas y el desecho celular se peletizaron mediante centrifugación durante 1 minuto a

13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415, y se usaron 10 µl del sobrenadante para el análisis mediante SDS-PAGE y de inmunotransferencia.

Producción de SteA y proteínas recombinantes variantes de SteA en E. coli

pET30a(+) SteA y variantes de SteA transformadas en células BL21 (DE3) de E. coli se hicieron crecer a A600 = 0,6 en caldo 2xTY, y la expresión proteica se indujo con 0,4 mM de IPTG durante 2 horas. Las células se cosecharon y se resuspendieron en reactivo de extracción de proteínas Bugbuster (Novagen) suplementado con 15 mM de imidazol. Las células se lisaron mediante ultrasonidos usando un aparato de ultrasonidos VibraCell (Sonics and Materials Inc) a 80V durante 3 x 30 segundos. Se purificaron proteínas marcadas con seis His usando columnas Ni-NTA (Qiagen) y se eluyeron con 500 mM de imidazol en TBS 300 (Disolución Salina Tamponada con Tris suplementada con 300 mM de NaCl). Las proteínas se dializaron entonces en 1xTBS toda la noche a 4ºC.

Ensayo de termoestabilidad

SteA recombinante y las variantes se incubaron a 75ºC y en hielo durante 20 minutos, y la proteína desnaturalizada se peletizó mediante centrifugación durante 1 minuto a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415. Las proteínas solubles tratadas térmicamente y no tratadas se separaron mediante electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida con SDS, y se visualizaron mediante tinción con Coomassie.

Inmunoprecipitación de STM AU1

Las preparaciones de proteína SteA se preaclararon mediante incubación de 100 ng de SteA recombinante o de variante de SteA con 20 µl de perlas de Proteína A/G Sephadex (Amersham Pharmacia) en 500 µl 1xTBS con 1 mg/ml de BSA durante 1 hora a 4ºC. Las perlas se recuperaron mediante centrifugación y se desecharon, y el sobrenadante preaclarado se conservó. Para la inmunoprecipitación, 0,1, 1 ó 10 µg de anticuerpo anti-AU1 (Babco) se unieron a 20 µl de perlas de Proteína A/G (Sigma) en 500 µl de 1xTBS con 1 mg/ml de BSA durante 1 hora a 4ºC. Las perlas se lavaron durante 3 x 1 minuto con 1 ml de 1xTBS con 1 mg/ml de BSA, y se recuperaron mediante centrifugación a 1,8K rpm para eliminar el anticuerpo en exceso. El sobrenadante preaclarado se añadió a las perlas anti-AU1 y se incubó durante 90 minutos a 4ºC. Las perlas se recuperaron y se lavaron como antes. Se añadió tampón de muestra (Laemmli, 1970), las muestras se pusieron a hervir durante 3 minutos, y se analizaron mediante 12% de SDS-PAGE y transferencia Western con un anticuerpo monoclonal anti-steA C5/2 (Maryland Biosciences).

Filtración en gel

Se hicieron fluir 25 µl de SteA recombinante o variante de SteA purificada de aproximadamente 2,5 mg/ml a lo largo de una columna de filtración en gel Superose 12, a un caudal de 0,04 ml/min. usando un Akta Prime (Pharmacia). Los volúmenes de elución de las variantes de SteA se compararon con patrones de calibración cargados a una concentración de 0,5 mg/ml.

Dicroísmo circular

Alícuotas de péptido que contiene STM o de SteA recombinante, o de variante de SteA se purificaron mediante cromatografía en NiNTA y se dializaron en 25 mM de tampón de fosfato potásico toda la noche a 4ºC. La materia en partículas insoluble se eliminó con un filtro de 25 µm. El análisis de dicroísmo circular se llevó a cabo usando un sistema Jasco J8-10 a una A280 = 0,2 usando una cubeta de cuarzo de 150 µl con una longitud de recorrido de 0,5 mm. Se recogieron espectros de plegamiento desde 190 nm hasta 250 nm, mientras que la presencia de la lámina beta a lo largo de un intervalo de temperaturas se monitorizó a 215 nm. Se tomaron 10 espectros para cada variante de SteA y condición, se promediaron, y después los espectros para el tampón solo se restaron para producir las curvas finales.

Expresión y detección inmunofluorescente de SteA y variantes en células de mamíferos

Células de osteosarcoma humano U2OS (ATCC HTB-96) que se hicieron crecer sobre cubreobjetos a una densidad de 5 x 104 células por cápsula de 6 pocillos se transfectaron con 1 µg de ADN plasmídico y 3 µl de Genejuice (Novagen). 48 horas después de la transfección, los cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS, y las células se fijaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% (BDH, Poole, Dorset) recientemente preparado en 1xPBS. Después de 3 lavados con 1xPBS, las células se permeabilizaron en 1xPBS y 0,1% de Triton-X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se incubaron en disolución de bloqueo (4,5 ml de PBS, 500 µl de suero fetal de ternera [HyClone, Cramlington, Northumberland], 50 mg de seroalbúmina bovina y 0,1% de Triton-X-100) durante 30 minutos, y después el anticuerpo anti-Estefina A (1:100 en disolución de bloqueo) toda la noche a 4ºC. Las células se lavaron 3 x 5 minutos con PBS, se incubaron en un anticuerpo secundario Alexa 488 nm anti-ratón

1:200 (Molecular Probes, Inc) en disolución de bloqueo durante 1 hora, y después se lavaron durante 3 x 5 minutos en PBS. Los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos usando Vectashield con DAPI (Vector Laboratories). Para variantes expresadas mediante pGFP2-C2, las células se transfectaron como antes, pero después de 24 horas las células se lavaron tres veces con 1xPBS, después se incubaron durante 4 minutos a temperatura ambiente en tinción de membrana fluorescente PKH26 (Sigma) diluida 1:250 en PBS. Las células se lavaron 3 x 5 minutos en PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% recientemente preparado en 1xPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 x 5 minutos con PBS, y finalmente los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos usando Vectashield que contiene DAPI (Vector Laboratories). Todos los portaobjetos se analizaron subsiguientemente mediante microscopía confocal usando el software Zeiss LSM 510 Metaconfocal y Zeiss.

Cribado para aptámeros peptídicos que se unen a un dominio SH3 de levadura

Los casetes oligonucleotídicos degenerados se obtuvieron hibridando y amplificando P20 y P21 que codifica una librería sesgada diseñada alrededor de la secuencia rica en prolina Pbs2p (NKPLPPLPLV) que interacciona con el dominio SH3 de Sho1p. La traducción del casete da X(L/V/P/A)N(K/R)PLP(P/S/A)LP(L/V/P/A)X. Al nivel de ADN, este oligonucleótido debería de dar lugar a una librería con una complejidad teórica de 98.304.

El casete se ligó en STM pJG4-5, y se hizo crecer en células XL10 Gold cells (Stratagene). Se usó ADN midi-prepped (Qiagen) para crear una librería de levadura de 6 x 104 células en EGY48, cubriendo teóricamente el 60% de las secuencias codificadas por la librería. Estas células se equipararon con células EGY42 que poseen pEG202-Sho1SH3, obtenido como se describe anteriormente. Se seleccionaron interactores sobre placas –UHTL/X-Gal/Gal-Raff durante 4 días, se rociaron y los plásmidos se rescataron en células KC8 de E. coli. Los plásmidos se transformaron nuevamente en EGY48 para confirmar la interacción con el dominio SH3 de Sho1p en EGY42 usando una matriz de emparejamiento de interacción.

Ensayo de unión a papaína

Perlas de agarosa que poseen papaína carboximetilada (Calbiochem) se lavaron tres veces en EB (tampón de equilibrio: 50 mM de fosfato de sodio pH 6,5, 0,5 M de NaCl, 0,1% de sulfobetaínas no detergentes). Las perlas se bloquearon con 1 mg/ml de BSA en EB durante 30 minutos a 4ºC, y se lavaron tres veces más en EB. 300 µg de SteA recombinante o STM AU1 en tampón 1xTBS se diluyeron en EB para producir un volumen total de 500 µl, y se incubaron con las perlas durante 90 minutos a 4ºC. Las perlas se lavaron entonces tres veces en EB y se resuspendieron en 50 µl de tampón de muestra para análisis mediante 12% de SDS-gel de PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-SteA (C5/2, Maryland Biosciences).

Ensayos de actividad de catepsina B y catepsina H

La actividad de catepsina B recombinante (Innozyme) se midió usando el kit de ensayo de actividad de catepsina B (Innozyme). Se midió la actividad inhibidora de SteA y las variantes titulándolas en esta reacción. Los ensayos se llevaron a cabo de otro modo exactamente como se describe por el fabricante. Se usaron las mismas condiciones para medir la actividad inhibidora de SteA y variantes frente a Catepsina H hepática humana (Calbiochem) con hidrocloruro de L-arginina-7-amido-4-metilcumarina (Sigma) como sustrato. La fluorescencia se midió usando un lector de placas Fusion Alpha (Perkin Elmer).

Ejemplo 1: Uso de Estefina A como una proteína de armazón.

La figura 1 muestra la estructura de aminoácidos primaria de partes de Estefina A y sus homólogos. La figura 1b muestra la estructura tridimensional de Estefina A. La figura 1b también muestra los tres sitios en los que Estefina A está mutada a fin de facilitar su uso como la proteína de armazón. Estos son G4W, V48D y Leu 73, que se muestran como “sitio para la inserción peptídica” en la figura 1b.

Un polipéptido de Estefina A para uso como una proteína de armazón se produce mutando la secuencia de Estefina A como se describe. La proteína resultante a base de Estefina A pero que posee esas tres mutaciones se denomina STM. La secuencia de STM se da en el listado de secuencias adjunto.

La figura 2a muestra la estabilidad térmica de STM. Como se puede observar a partir de la figura 2a, STM es estable hasta 70ºC, momento en el que comienza a perder el plegamiento. La falta de plegamientos completa a 98ºC, pero STM se vuelve a plegar en su forma correcta al enfriar hasta 25ºC incluso aunque posea una inserción de un péptido diana de 20 aminoácidos.

La figura 2b demuestra que la proteína de armazón STM presenta el péptido diana a disolvente. Esto se demuestra mediante experimento de inmunoprecipitación que demuestra que el anticuerpo anti-peptídico (anti-AU1) puede acceder al péptido diana cuando se inserta en el armazón de STM para la expresión.

Ejemplo 2: STM es biológicamente neutro.

Se sabe que la Estefina A forma dímeros. El uso de Estefina A como proteína de armazón anula ventajosamente la dimerización. Como se puede observar a partir de la figura 3, la proteína de armazón de STM ha anulado la dimerización, y se muestra que es monomérica.

Es la mutación V48D la responsable de abolir la dimerización. En algunas realizaciones, puede ser ventajoso retener la capacidad de dimerización. Por ejemplo, puede ser útil ser capaz de someter al sistema a choque térmico e inducir la dimerización de la proteína de armazón según la invención. En esta realización, el aminoácido V48 no debería de estar mutado. De este modo, en esta realización, la invención se referiría a un mutante doble Leu73 y G4W. Esta proteína de armazón todavía permitiría ventajosamente un enfoque de superficie dual y ofrece el beneficio adicional de una dimerización inducible por calor. Una aplicación de tal proteína de armazón sería en la investigación del modo de acción en una ruta de señalización. Por ejemplo, insertando dos péptidos diana diferentes en dos moléculas de proteínas de armazón separadas, éstas se podrían juntar convenientemente sometiendo a la célula que las contiene a choque térmico, dando como resultado la dimerización y asociación de los dos péptidos diana. Esto puede tener la ventaja adicional de juntar proteínas celulares que están unidas a los péptidos.

La neutralidad biológica es una ventaja de la presente invención puesto que no existe en las proteínas de armazón de la técnica anterior. Un aspecto de la neutralización biológica de Estefina A según la presente invención es abolir la unión de papaína a Estefina A. La papaína es un miembro fundador de la familia de catepsina. Como se puede ver a partir de la figura 4, la proteína de armazón a base de Estefina A, STM, no interfiere con la actividad de catepsina.

La Estefina A tiene una secuencia de anclaje citoplásmico/exportación nuclear. De este modo, la Estefina A no puede acceder habitualmente al núcleo. Esta propiedad biológica de la Estefina A se ha abolido en las proteínas de armazón basadas en Estefina A según la presente invención, tales como STM. Esto se demuestra en la Figura 5, que muestra que STM puede ir al núcleo cuando posee una señal de localización nuclear, mientras que la Estefina A no puede.

Ejemplo 3: Demostración del uso de Estefina A como proteína de armazón

Existe en la técnica un número de aptámeros peptídicos conocidos que se unen a CDK2. Se sabe que algunos de estos aptámeros peptídicos inhiben la actividad de CDK2. A fin de demostrar la utilidad de la invención, algunos de estos aptámeros se han comparado en el montaje de una proteína de armazón a base de Estefina A según la invención, y en el montaje de la proteína de armazón de la técnica anterior tal como tiorredoxina A.

Considerando la Figura 6, se puede ver que los resultados logrados con Estefina A pueden ser diferentes de los logrados con el armazón de la técnica anterior tiorredoxina

A. Esto demuestra que se puede explorar el espacio peptídico tridimensional usando armazones a base de Estefina A, que no se pueden explorar usando armazones a base de TrxA.

Ejemplo 4: Producción de proteína de armazón

Aquí, se describe un enfoque racional al diseño de un nuevo armazón de aptámero peptídico. Se esquematizan las cualidades que necesitaría poseer un armazón ideal para que fuese ampliamente útil para estudios in vitro e in vivo, y aplicar estos criterios al diseño de un nuevo armazón, siendo el ejemplo preferido STM.

Partiendo del inhibidor de proteasa intracelular estable pequeño Estefina A, se ha manipulado un armazón biológicamente neutro que retiene la conformación estable de la proteína progenitora. Se muestra que STM es capaz de presentar péptidos que se unen a dianas de interés, tanto en el contexto de interactores conocidos como en un cribado de librería. Las herramientas moleculares basadas en nuestro armazón encuentran aplicación en un amplio abanico de estudios de rutas biológicas, y en la validación de dianas farmacéuticas.

Estefina A humana como la proteína progenitora para un nuevo armazón

Se seleccionó un panel de 8 proteínas candidatas (TBP de Sulfolobus solfataricus; la proteína fluorescente roja de Discosoma spp., dsRED2 y la proteína fluorescente verde humanizada procedente de Renilla reniformis; Gcn4p de Saccharomyces cerevisiae y Estefina A de H. sapiens) o dominios de proteínas (núcleo de Gcn4p, que comprende la cremallera de leucina y la región de unión a ADN; y las repeticiones de enrollamiento helicoidales triples procedentes de utrofina y distrofina humanas). Se clonaron en vectores de expresión y se expresaron en células de cultivo tisular bajo en control del promotor de CMV. De estos candidatos, sólo la Estefina A (SteA) humana fue tanto fácilmente detectable mediante transferencia Western como careció de toxicidad en células humanas, sugiriendo que puede ser manipulada para que sea un buen armazón. SteA es una proteína monómera de un solo dominio de 98 aminoácidos que no recibe ninguna modificación post-traduccional conocida y carece de enlaces de disulfuro. SteA muestra una termoestabilidad notable, con una transición reversible observada a 90,8ºC y una entalpía de plegamiento de 490 kJ/mol, todos rasgos importantes de un armazón a base de SteA.

Elección de sitio para la inserción peptídica

Se alinearon las secuencias proteicas de SteA humana, SteB, precursor de cistatina C, precursor de cistatina D, precursor de cistatina M, así como cistatina de rata, bovina y de pollo usando Clustal W del suite GCG, y después se ajustó manualmente el alineamiento para tener en cuenta rasgos topológicos (Figura 1A). Es improbable que las regiones pobremente conservadas contribuyan al plegamiento proteico, mientras que los dominios muy conservados pueden mediar interacciones biológicas. Se han identificado estructuras de SteA (Figura 1B) cuyos restos están implicados en la unión de proteasas diana, y cuyos restos constituyen el núcleo hidrófobo de la SteA. El resto de leucina en la posición 73 media parte de la interacción entre SteA con sus proteasas diana. Diversos miembros de la familia de cistatina tienen inserciones próximas a esta región (Figura 1A). Específicamente, las inserciones son cortas o faltan en miembros de la familia I (de la cual la Estefina A humana es un miembro) pero están presentes en cistatina A de pollo (miembro de la familia II) así como, por ejemplo, cistatina M, indicando que SteA puede aceptar la inserción de péptidos en este punto. La estructura de cistatina A de pollo sugiere que es probable que péptidos insertados aquí estén bien constreñidos, aunque capaces de adoptar un abanico de conformaciones incluyendo la hélice α y la hebra β,y que Leu73 y los restos que lo rodean no desempeñan ningún papel en el plegamiento estructural de SteA. De este modo, se razonó que la introducción de un péptido en este punto debería de permitir la constricción de la secuencia insertada sin interrumpir el plegamiento del armazón, y asegurar la presentación del péptido al disolvente. Se introdujo un sitio de endonucleasa de restricción RsrII en el marco de lectura abierto de SteA en los codones correspondientes a los restos 72, 73 y 74, para permitir la inserción subsiguiente en el marco de lectura abierto (ORF) de oligonucleótidos que codifican péptidos para ser constreñidos por el armazón. Se refiere a la proteína codificada por el ORF mutante como RS (RsrII SteA). También se deseó eliminar interacciones proteína-proteína conocidas. La glicina 4 (destacada en la Figura 1), un determinante estructural de la unión de Estefina A a proteasas diana, se mutó en triptófano, y la valina 48 se mutó en

5

10

15

20

25

30

35

40

-29

aspartato. Este último cambio debería de tanto disminuir las interacciones con proteasas diana como reducir la propensión del armazón a dimerizarse a través del intercambio de dominio. Se denomina a la proteína manipulada con todas estas mutaciones como STM (Mutante Triple de Estafina A; véase el listado de secuencias). En la Figura 1C se muestra una ilustración de la secuencia de la proteína mutada con una secuencia modelo (el péptido AU1, véase más abajo) alineada con estefina A humana.

Ejemplo 5: Expresión de armazones de SteA en células de mamíferos.

La Estefina A de tipo salvaje es predominantemente citoplásmica, lo que podría alimentar la utilidad del nuevo armazón. La localización citoplásmica puede ser el resultado de la exclusión nuclear (por tamaño o por exportación nuclear activa) o anclaje citoplásmico, donde la proteína está físicamente restringida a un local citoplásmico en virtud de interacciones fuertes. La inspección de la secuencia de SteA no identificó ninguna homología con secuencias de exportación nuclear conocidas. Se cuestionó si las mutaciones, provocando pérdida de interacciones proteína-proteína, afectaron a esta localización. Cuando se transfectaron en células de osteosarcoma U20S, RS también se localiza predominantemente en el citoplasma, como se muestra en la siguiente tabla:

Tabla: Localización subcelular de proteínas de variantes de SteA. Los porcentajes se dan para el número de células que expresan proteínas de variantes de SteA que muestran la localización enunciada.

Disponibilidad citoplásmica o nuclear limitada

Nuclear/citoplásmica igual Nuclear

RS

33% 67% 0%

STM

20% 80% 0%

NLS-STM

5% 0% 95%

La manipulación adicional a STM condujo a la localización nuclear y citoplásmica (véase la tabla), indicando que, si hay una señal de exportación nuclear no identificada en SteA, se ha deshabilitado por la manipulación. La adición de un único NLS de SV40 largo T (PKKKRKV) al término amino de STM dio como resultado la localización nuclear completa de STM (véase la tabla), pero no de la proteína RS. Juntos, estos datos indican que (i) la proteína de SteA pequeña no está excluida del núcleo por límites de exclusión de tamaño impuestos por el complejo de poro nuclear; (ii) que la exportación nuclear activa es improbable que esté funcionando, y por lo tanto que (iii) la localización citoplásmica predominante de SteA esté mediada por lo menos en parte por interacciones citoplásmicas que se han abolido en STM. De este modo, STM se puede expresar de forma estable en células humanas y se han abolido las interacciones normales de SteA.

Ejemplo 6: Los armazones a base de SteA son estables

Se deseó averiguar si se podrían insertar péptidos en STM sin afectar a su capacidad como proteína. Se modeló un aptámero peptídico insertando la etiqueta epitópica “AU1” de seis restos (DTYRYI) en el bucle manipulado. Se deseó retener la termoestabilidad de SteA pero abolir su dimerización mediante intercambio de dominio, lo que se potencia mediante calentamiento. Se incubó SteA recombinante, STM y STM AU1 a 75ºC o en hielo durante 20 minutos, y se eliminó mediante centrifugación cualquier

proteína desnaturalizada.

Esencialmente se recuperó toda la SteA calentada y la proteína de STM manipulada, indicando que STM ha retenido la termoestabilidad de SteA (Figura 2, Panel A), y que STM es capaz de presentar por lo menos un péptido sin que se vea afectado adversamente el plegamiento del armazón, satisfaciendo por lo menos parcialmente el segundo criterio. La forma dímera de SteA de tipo salvaje se puede observar en la muestra no calentada (Figura 2A, panel izquierdo, asterisco), aumentando significativamente tras el tratamiento térmico (Figura 2A, panel derecho). Como se esperaba, esta forma dímera se abolió completamente tanto en STM como en STM AU1 (Figura 2A).

También nos preguntamos si el péptido AU1 en STM estaba disponible para la interacción. Un anticuerpo anti-AU1 fue capaz de inmunoprecipitar específicamente STM AU1 recombinante de lisados celulares (Figura 2B). Un nivel saturante de anticuerpo antiAU1 pudo inmunoprecipitar todo el STM de entrada (compárense las líneas 6 y 7), indicando que todo el STM AU1 detectable estaba presentando el epítopo AU1 insertado para interacción. La capacidad de STM para presentar secuencias epitópicas lineales que se pueden reconocer específicamente por un anticuerpo cognado es un rasgo clave de un armazón según la presente invención.

Ejemplo 7: Caracterización biofísica de mutantes de Estefina A

Para confirmar que el armazón manipulado estaba correctamente plegado, se usó cromatografía de filtración en gel para averiguar si se pudo detectar cualquier STM desnaturalizado o dimerizado en su forma nativa. STM AU1 recombinante migró próximo a su tamaño predicho, y de forma similar a SteA de tipo salvaje (Figura 3, panel A). Cuando las preparaciones proteicas se calentaron hasta 65ºC antes de la filtración en gel, una proporción de SteA migró como dímero. De forma importante, como se predijo, STM AU1 no lo hizo. También se confirmó que STM y SteA poseen patrones de plegamiento similares mediante dicroísmo circular (CD), que permite la determinación del contenido helicoidal α y de lámina β de un polipéptido plegado. Los espectros de CD de SteA nativa a 25ºC y 50ºC y de STM AU1 nativo a 25ºC y 50ºC (Figura 3B) son todos muy similares y difieren significativamente de los espectros de control del STM AU1 desnaturalizado obtenido a 97ºC. El punto de inflexión inferior común a 216 nm (que es característico de la lámina β; SteA tiene 5 hebras β antiparalelas) y la similitud global de las curvas proporcionan pruebas de que STM/AU1 está correctamente plegado, indicando además que es probable que STM funcione bien como un armazón de aptámero peptídico.

Ejemplo 8: Ensayos de neutralidad

Efectos de proteasas

Las estefinas de tipo salvaje son inhibidores de la actividad de proteasas de la familia de catepsinas, de la cual la papaína es el miembro fundador. Para confirmar que los mutantes manipulados carecieron de actividad biológica, nos preguntamos si STM se podría unir a papaína, o inhibir la actividad de catepsina. La papaína inmovilizada fue capaz de purificar por afinidad SteA, pero no STM, de una manera dependiente de la concentración (Figura 4A). Además, la actividad de catepsina B (Figura 4B) y de catepsina H (Figura 4C) fue inhibida por la adición de SteA, mientras que concentraciones incluso elevadas de STM no inhibieron esta actividad (Figura 4).

Importación nuclear

Se extendieron los experimentos a células humanas, preguntándonos por la interacción con la maquinaria de importación nuclear. Se insertaron una o dos secuencias de NLS contiguas en el sitio de inserción peptídica manipulado del armazón (en contraste con el experimento descrito en el Ejemplo 5, en el que NLS se sustituyó en el término amino). Mientras que STM-GFP se localiza a lo largo de la célula (Tabla en Ejemplo 5 y Figura 5), se puede observar una localización nuclear clara y exclusiva para las variantes de NLS STM tanto individuales como dobles. Esto es una prueba clara de que STM puede presentar péptidos de 6 ó 14 restos de longitud que se pueden unir a la maquinaria de importación nuclear en células humanas.

Ejemplo 9: Interactores de aptámeros peptídicos con una diana definida

El primer cribado de aptámeros peptídicos identificó 14 secuencias peptídicas que, en el contexto del ahora tradicional armazón de tiorredoxina de E. coli, se unieron todas a CDK2 humana. Se deseó averiguar si STM fue capaz de presentar cualquiera de los mismos péptidos para interacción. Las matrices de interacción incluyen un conjunto de controles estándar que nos permiten hacer comparaciones entre experimentos. Estos son el receptor de andrógenos, un activador transcripcional natural que controla la actividad del gen informador y el comportamiento en placa; el par que interactúa naturalmente de CDK4 y ciclina D, que controla el emparejamiento de levadura y las interacciones de dos híbridos; y el par que interactúa débilmente de CDK4 y 10T3, un aptámero peptídico que se identificó como un interactor específico con ciclina D que fracasa a la hora de producir un fenotipo robusto en células. De los 14 péptidos ensayados que interactúan con CDK2, sólo dos (Pep2 y Pep6; Figura 6) fueron capaces de reconocer CDK2 cuando fueron presentados por STM. De estos, Pep2 tuvo una afinidad aparentemente mayor en este ensayo por CDK2 en el contexto de STM, puesto que estas células desarrollaron un color azul de manera más rápida que aquellas que expresan Pep2 en tiorredoxina. Esto pudo ser debido simplemente a una mayor estabilidad del aptámero peptídico basado en STM,

o pudo ser debido a una conformación alterada del péptido en STM. Por el contrario, Pep6 en STM muestra claramente una afinidad por CDK2 mucho menor que en TrxA. Ninguno de los aptámeros peptídicos en STM ganó afinidad por CDK4. Estos datos sugieren que STM será capaz de presentar un abanico diferente de péptidos para interacción que la tiorredoxina, aunque habrá cierto solapamiento.

Ejemplo 10: Identificación de un péptido diana capaz de unirse a una estructura de interés

Finalmente, se deseó completar la validación del nuevo armazón mostrando que es capaz de presentar péptidos constreñidos que se podrían unir a una estructura definida de interés, en este caso una proteína diana en un formato de librería. El dominio SH3 se ha estudiado ampliamente y se sabe que se une a motivos PxxP de proteínas parejas. Se cribó una librería de aptámeros peptídicos degenerada, con un tamaño teórico de 38.400 secuencias peptídicas diferentes, para buscar aquellos que se unen al dominio SH3 de Sho1p. En este cribado se identificaron catorce péptidos constreñidos diferentes, algunos

5

10

15

20

25

30 -32

de ellos múltiples veces; véase la tabla a continuación:

Tabla: Aptámeros peptídicos en STM que interaccionan con el dominio SH3 de Sho1p de levadura. La secuencia de Pbs2p de tipo salvaje que interacciona de forma natural con este dominio SH3 es “NKPLPPLPLV”, y el péptido de librería se diseñó como “gpX(L/V/P/A) N(K/R)PLP(P/S/A)LP(L/V/P/A)Xgp”, en la que los restos en minúsculas están contribuidos por los sitios RsrII/AvaII usados para clonar oligonucleótidos que codifican el péptido, y X es cualquier aminoácido.

Secuencia Veces identificada

01:

GPVPNKPLPALPVIGPGVNKPLPALPAHGPIRNKPLPSLPASGP 3

02:

GPVLNKPLPSLPVMGPTPNKPLPPLPAAGP 4

03:

GPDLNKPLPALPVHGP 1

04:

GPYLNRPLPSLPAYGPWVNRPLPSLPLSGP 3

05:

GPNLNKPLPALPVLGP 1

06:

GPVVNKPLPSLPVKGPDVNKPLPSLPAVGP 1

07:

GPPNVKPLPALPLMGPLLNKPLPALPLDGP 1

08:

GPDPNRPLPSLPVTGPYLNKPLPALPVSGP 1

09:

GPMLNKPLPSLPVGGPGLNKPLPSLPAAGP 3

10:

GPILNKPLPALPLRGPDPNRPLPALPVTGP 2

11:

GPFPNKPLPALPLTGPVLNRPLPPLPRNGP 3

13:

GPYLNKPLPSLPLCGPSVNRPLPALPDVGP 2

17:

GPEPNKPLPALPLTGPVLNRPLPPLPRNGP 2

20:

GPRMNKPLPSLPLGGPAMNKPLPALPLQGP 1

Estos

datos indican que STM puede funcionar como un armazón para la

Ejemplo 11: Uso del aptámero peptídico para interrumpir la interacción dominio-ligando

presentación de péptidos que oscilan desde 12 hasta 36 restos de longitud, añadiendo mayor anchura a sus aplicaciones futuras.

Se deseó usar aptámeros peptídicos para cartografiar interacciones del dominio SH3. Haciendo referencia a la figura 7, como un primer modelo, se eligió el dominio SH3 del osmosensor de levadura putativo Sho1p (amarillo). Se puede esperar que los aptámeros peptídicos que se unen al dominio SH3 interfieran con la señalización en células de levadura. Por ejemplo, la interacción de un aptámero peptídico (rojo) con el dominio SH3 en levadura puede prevenir la asociación con la cinasa de MAP cinasa Pbs2p, que ella misma también sirve como un armazón de especificidad que dirige señales desde MAPKKK Ste11 a MAPK Hog1.

Aptámero peptídico provoca osmosensibilidad en levadura en germinación.

La señalización a través de la ruta Hog1 es necesaria para que las células de levadura crezcan en medio de osmolaridad elevada que contiene NaCl 1M o sorbitol 1M. PepA, 32, 34, 124 y 201 se aislaron todos del cribado de dos híbridos de levadura en busca de aptámeros peptídicos que se unirían al dominio SH3 de Sho1p. De estos, sólo PepA es capaz de conferir osmosensiblidad a células de levadura cuando su expresión es inducida en medio suplementado con galactosa. Las células que se hacen crecer en glucosa no expresan los aptámeros peptídicos, y son osmorresistentes. Véase la figura 7B.

La activación de Hog1 está dificultada en levaduras que expresan pepA.

El mecanismo más probable para que PepA confiera osmosensibilidad a levadura es interrumpiendo la señalización de Sho1p, vía Pbs2 a Hog1. Para cuestionarse si esto estaba pasando, se usó el anticuerpo anti-fosfotirosina para monitorizar la activación de Hog1p. Cuando las células se hacen crecer en medio de osmolaridad elevada, Hog1p se fosforila (control, -y + galactosa). La expresión de un aptámero peptídico que no confiere osmosensibilidad no afecta a la fosforilación de Hog1 (Pep32), mientras que la inducción de PepA por galactosa anula casi completamente la fosforilación y activación de Hog1 en células, explicando su sensibilidad a hiperosmolaridad. Véase la figura 7C.

PepA interrumpe la asociación física entre Sho1p y el complejo Pbs2/Hog1.

PepA muestra identidad significativa tanto con Las17 (un organizador del citoesqueleto de actina implicado en interacciones con Sho1) como Pbs2, la MAPKK y la proteína de armazón que fosforila y activa Hog1p. En principio, podría interferir por lo tanto con la señalización vía cualquier brazo del esquema modelo mostrado. Sin embargo, los abatimientos de GST que usan el Sho1 SH3 muestran una interacción entre Sho1 y Hog1, excepto que PepA esté presente, sugiriendo que PepA interrumpe ciertamente la interacción entre Sho1 y Pbs2. Véase la figura 7D.

De este modo, se muestra que las proteínas de armazón de la presente invención presentan péptidos en la conformación biológica correcta.

Ejemplo 12: Presentación de péptido diana a disolvente

Como ensayo adicional de la función de los armazones de la presente invención, se deseó saber si un armazón según la presente invención podría presentar un péptido a disolvente en una forma que se pudiese fosforilar mediante una proteína cinasa. En este ejemplo, el armazón es STM.

Los oligonucleótidos que codifican el sitio de fosforilación de PKA/PKB de c-Raf se clonaron en el sitio RsrII de STM (Figura 8a). El aptámero peptídico resultante, denominado aquí STM-pRaf, se expresó bien tanto en células de levadura como en células humanas, y se pudo detectar usando un anticuerpo específico para c-Raf fosforilado en el sitio PKA/PKB.

Con respecto a la figura 8, el Panel a muestra oligonucleótidos que codifican el sitio de fosforilación de PKA/PKB de c-Raf que se clonaron en el sitio RsrII de STM, para crear STMpRAF. La serina fosforilada está subrayada. Panel b: se usó un anticuerpo que reconoce c-Raf fosforilada para sondar transferencia Western de lisados de células completas (WCL) e inmunoprecipitados (IP) anti-myc de células de levadura (y) o humanas (h) que expresan STMpRaf marcado con myc. El tratamiento de la proteína inmunoprecipitada con 100 unidades de λ fosfatasa hace que la señal desaparezca. Panel

c: el tratamiento con λ fosfatasa provoca específicamente la desfosforilación de STMpRaf,

en lugar de la degradación de la proteína STMpRaf.

La inmunoprecipitación de STMpRaf marcada con myc confirmó la identidad de la banda como STM-pRaf, en lugar de c-Raf contaminante. Para confirmar que la señal generada por el anticuerpo anti-cRaf fue debida a fosforilación de la proteína, en lugar de a la deformación del péptido inducida por el armazón, los inmunoprecipitados se trataron con λ fosfatasa. La señal se perdió tras la desfosforilación, y las transferencias Western anti-myc confirmaron que esto no fue debido a la degradación proteica, y que el péptido c-Raf estaba siendo presentado de hecho por STM para la fosforilación mediante proteína cinasas cognadas dentro de células de levadura y humanas.

De este modo, los armazones de la presente invención presentan ventajosamente péptidos en una forma en la que son reconocidos por sus parejas de señalización cognadas.

Ejemplo 13: Redirigiendo una red de señalización usando un ligando del dominio SH3 artificial.

Este ejemplo demuestra el uso de aptámeros peptídicos según la presente invención como módulos de señalización artificial.

Repaso

Los microchips de expresión génica ampliamente genómicos identifican genes cuya expresión alterada se correlaciona con la enfermedad, pero no aquellos de estos productos génicos son dianas farmacéuticas candidatas. Mientras que ARNi puede permitir la validación de un subconjunto de estos, las técnicas de “supresión” ignoran las contribuciones de interacciones proteína-proteína específicas. La disponibilidad fácil de proteínas manipuladas, tales como aptámeros peptídicos, que pueden competir directamente por interacciones proteína-proteína en células facilitaría enormemente la validación de dianas farmacéuticas. Aquí, se describe una tecnología robusta y muy específica para mostrar cómo aptámeros peptídicos se pueden usar para diseccionar interacciones proteicas en células. Se descubre un papel previamente no identificado para una proteína esencial en una ruta no esencial, indicando que esta tecnología puede suplementar de forma útil ARNi en esfuerzos de validación de dianas farmacéuticas.

INTRODUCCIÓN

La secuenciación del genoma humano y el uso subsiguiente de cribados amplios para genomas (ya sea usando ARNi o microchips) ha conducido a la asociación de muchos productos génicos con diversas enfermedades. Un reto importante es determinar cuáles de estos productos génicos son dianas farmacéuticas válidas. En el caso de proteínas que funcionan en las células, esto requiere una comprensión del comportamiento de la proteína tanto en la situación patológica como en la sana. Una solución a este problema sería idear una herramienta molecular que se pudiese adaptar al estudio de cada proteína en el contexto celular. Se propone que se pueden crear herramientas de proteínas manipuladas usando aptámeros peptídicos como dominios de reconocimiento únicos. Los aptámeros peptídicos se seleccionan en cribados de dos híbridos de levadura para unirse a una proteína de interés. Una proporción de los ligantes son capaces de competir in vivo por interacciones proteína-proteína, conduciendo a fenotipos medibles. Cuando el fenotipo es el inverso de un fenotipo de enfermedad, el aptámero peptídico tiene tanto validada la diana farmacéutica como proporciona la base para la identificación farmacéutica, ya sea mediante el descubrimiento farmacéutico a base de estructuras a partir de un cocristal, o mediante cribado de desplazamiento farmacéutico. Además, cada aptámero peptídico podría ser el dominio de reconocimiento para una proteína manipulada; esto sería muy útil cuando el propio aptámero peptídico no conduzca a un fenotipo cuando se expresa en células. Cada dominio de reconocimiento se fusionaría genéticamente con uno de varios rectos efectores, tales como GFP o el resto catalítico de una enzima, tal como una proteasa, o una ubiquitina ligasa. Mientras esta última puede eliminar toda junta una proteína diana como se ha demostrado para proteínas de la caja F manipuladas, las fusiones a GFP podrían permitir la monitorización de un tráfico intracelular de proteínas, con el potencial añadido de monitorizar interacciones proteína-proteína específicas en células mediante FRET. Más allá de la biología celular, las fusiones de un aptámero peptídico a GST permitirían la integración de información ganada usando técnicas de biología celular con el análisis bioquímico y estructural de cualquier proteína dada. Aunque los aptámeros peptídicos representan una fuente útil de restos de reconocimiento, también pueden ser útiles tecnologías alternativas (basadas en nucleasa estafilocócica o GFP, o aficuerpos denominados, monocuerpos, anticalinas, o proteínas de repetición de anquirina diseñadas).

El progreso hacia estas metas ha estado impedido parcialmente por la necesidad de demostrar especificidad in vivo. Recientemente, ha habido cierto interés en diseñar interruptores moleculares que vuelven a manipular sucesos de transducción de señales, o buscan crear rutas de señalización de novo. Hasta la fecha, tales estudios han usado típicamente dominios proteicos procedentes de proteínas naturales. Aquí se usan aptámeros peptídicos para mostrar que el módulo seleccionador de diana artificial se puede usar para desconectar y reconectar una ruta específica. Esto sienta un nuevo estándar para definir la especificidad de acción de un aptámero peptídico. Cuando se conoce una diana del aptámero peptídico, la purificación de la proteína diana a partir de células que expresan el aptámero peptídico o un control negativo debería de permitir la identificación de proteínas que compiten a partir del complejo mediante el aptámero peptídico. Aquí, se muestra por primera vez que este concepto se puede llevar a cabo en la práctica. Se describe la primera aplicación del armazón de STM al análisis in vivo de una cascada de transducción de señales en levadura, a saber, la ruta de resistencia osmótica HOG (Glicerol Hiper-Osmolaridad). Se demuestra que un aptámero peptídico, AptA, seleccionado por su capacidad para unirse al dominio SH3 de la proteína osmosensible Sho1, puede inhibir la función de Sho1. Se muestra que esto se logra imitando la interacción natural con Pbs2, una cinasa de MAP cinasas que interacciona normalmente con el dominio SH3 de Sho1. Se demuestra la especificidad de la interacción mostrando primero que AptA no se une a cualquiera de los otros 27 dominios SH3 en células de levadura, y en segundo lugar que una fusión a AptA puede restaurar la función a una Pbs2 mutante que de otro modo no se puede unir a Sho1. Además de demostrar que los aptámeros peptídicos tienen las características requeridas de especificidad y flexibilidad para formar la base de una herramienta molecular, la caracterización de AptA conduce a implicar al homólogo de WASp Las17 en la implicación de la ruta osmosensible que no ha surgido del cribado genético exhaustivo. De este modo, la invención proporciona el uso de un polipéptido WASP, preferentemente Las17, en la modulación de una ruta de señalización de MAP cinasa, en particular la ruta de MAP cinasa de Hog. La invención también se refiere al uso de AptA en el tratamiento del síndrome de Wiskott-Aldrich. Los resultados también sugieren que la interacción entre Sho1 y Ste11 no es suficiente para la señalización en ausencia de Pbs2, como se ha propuesto previamente.

RESULTADOS

La proteína transmembránica de levadura Sho1 ha demostrado ser importante en la regulación de la señalización de estrés osmótico a través de su interacción, mediada por el dominio SH3, con la MAPKK Pbs2. Se predice que los aptámeros peptídicos que se unen al dominio SH3 de Sho1 pueden inhibir la respuesta a estrés osmótico. Los estudios in vitro que usan péptidos libres han demostrado que los ligandos de SH3 comprenden hélices de poliprolina tipo II de mano derecha, cuya unión a un intervalo de dominios de SH3 puede ser promiscua. Este estudio se diseñó también por lo tanto para ensayar la capacidad del armazón recientemente diseñado (en este ejemplo, STM) para presentar péptidos con un grado elevado de especificidad.

Para dirigir eficientemente aptámeros peptídicos al dominio SH3 de Sho1, se usó como molde una secuencia rica en prolina procedente de Pbs2 MAPKK, que ya se sabe que es un ligando de Sho1-SH3 para diseñar una librería peptídica pequeña, degenerada. La secuencia rica en prolina de Pbs2 larga de 10 restos “VNKPLPPLPV” (con las dos prolinas clave subrayadas) se aleatorizó parcialmente (Tabla I). Las prolinas de anclaje se retuvieron, para asegurar la unión al dominio SH3, mientras que se añadió un resto extra a un extremo de la secuencia de Pbs2 para crear una librería de péptidos de 12mer. El resto de lisina cargado positivamente se dejó variar a arginina, que se encuentra ampliamente en péptidos que se unen al dominio SH3. Se dejó que otras posiciones variaran basándose en estudios de mutagénesis de Pbs2, y los restos añadidos a cada extremo del 10mer derivado de Pbs2 se dejaron variar completamente en libertad. Para comparación, en la Tabla I también se dan las secuencias de otros péptidos que interaccionan con SH3. Los oligonucleótidos que codifican estos péptidos se ligaron en el marco de lectura abierto de STM, un armazón preferido según la presente invención, para crear una librería en la que la complejidad peptídica teórica fue 6 x 104. El cribado de esta librería permitió la identificación de veintiocho aptámeros peptídicos como ligadores de Sho1-SH3 (véase anteriormente y la Tabla II). De estos, sólo dos (Apt03 y 05) fueron el péptido 12mer esperado constreñido en el armazón. Otros tres fueron péptidos 11mer, en los que el oligonucleótido codificó un codón de parada en el marco (AptA, Apt32, y Apt124), mientras que otros tres no estuvieron constreñidos como resultado del desplazamiento del marco en los oligonucleótidos codificantes, alterando el marco de lectura hasta que se encontró un codón de parada fuera del marco en el ORF de STM (Apt34, 40 y 94). De forma interesante, los aptámeros peptídicos se expresaron igualmente bien independientemente del tamaño del inserto (Figura 13). La elevada proporción de péptidos no constreñidos o constreñidos largos, menos buenos seleccionados en el cribado fue sorprendente, dado que el control de calidad de la librería mostró que 27 de 33 oligonucleótidos para los cuales se determinó la secuencia codificaron péptidos constreñidos de la longitud esperada. La presión de selección en este cribado es consistente con la observación previa de que los dominios SH3 ejercen una fuerte preferencia por péptidos que no están rígidamente estructurados, y sugiere que los dominios SH3 pueden interaccionar normalmente con tramos no constreñidos tales como bisagras flexibles en proteínas parejas.

Identificación de un aptámero peptídico que confiere osmosensibilidad

Los aptámeros peptídicos que interaccionan con Sho1 se ensayaron para determinar su capacidad para bloquear la osmorresistencia en células de levadura que descansan en la ramificación Sho1 de la maquinaria osmosensible [Posas F, Saito H. 1997. Osmotic activation of the HOG MAPK pathway via Ste11p MAPKKK: scaffold role of Pbs2p MAPKK. Science. 276: 1702-5]. Sólo uno de los veintiocho ligantes de Sho1-SH3, un aptámero peptídico denominado AptA, provocó osmosensibilidad cuando las células se colocaron en placas en medio que contiene NaCl 1M (Figura 9, panel A). AptA, pero no los aptámeros peptídicos de control tales como Apt32, también evitó la fosforilación de tirosina activante de Hog1 en medio de osmolaridad elevada (Figura 9, panel B). Otros aptámeros peptídicos, incluyendo Apt32, no inhiben similarmente la osmorresistencia (Figura 9, panel A). Ninguno de estos aptámeros peptídicos afectó al crecimiento de levaduras en medio de osmolaridad normal. Esta observación confirma que los aptámeros peptídicos son capaces de inhibir interacciones proteína-proteína en células eucariotas.

AptA muestra una elevada especificidad por el dominio SH3 de Sho1

Fue importante demostrar que AptA actúa a nivel de Sho1 SH3, como muchos ligandos PxxP reaccionan de forma cruzada con más de un dominio SH3 in vitro, aunque parece que la especificidad se mantiene in vivo. Por ejemplo, de los 28 dominios SH3 en el proteoma de levadura, Pbs2 interacciona sólo con el de Sho1. Además, cuando la secuencia central PLPPLP de Pbs2 se cambió a PLPALP o PLPSLP, se observó un incremento de la promiscuidad. Debido a que AptA contiene una PLPSLP central, estos datos sugieren que AptA se puede unir a múltiples dominios SH3 en levadura. Se llevó a cabo una matriz de interacción Y2H sistemática entre AptA y los 28 dominios SH3 de levadura. La matriz de SH3 proteómica muestra que AptA es muy específica para Sho1 SH3, mientras que otros aptámeros peptídicos aislados en el cribado inicial muestran cierto grado de reactividad cruzada (Figura 10). Por ejemplo, tanto AptA como Pep05, que contiene una leucina en posición -5, son muy específicos para Sho1 SH3. Por el contrario, Pep32, que tiene una prolina en lugar de una leucina en la posición -5, muestra una afinidad débil por otros dos dominios SH3 de levadura (Lsb1 y Cdc25). La elevada especificidad de AptA por el dominio SH3 de Sho1 indica que el fenotipo osmosensible dependiente de AptA depende de Sho1 y es específico.

De forma intrigante, una búsqueda BLAST de AptA frente al genoma de levadura reveló una homología significativa con el homólogo de levadura de la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich humano, Las17, implicada en el ensamblaje y regulación del citoesqueleto de actina. Se ha demostrado que Las17 interacciona físicamente con el dominio Sho1-SH3, pero no se ha colocado en la ruta de HOG. Para examinar si AptA puede ejercer su efecto interrumpiendo una interacción Las17p-Sho1, se cuestionó si la sobreexpresión de Las17 podría superar los efectos de la expresión de AptA. Sorprendentemente, células de levadura Δssk2/Δssk22 de control, que sobreexpresan Las17 sola, no fueron viables en presencia de estrés osmótico. Por el contrario, la levadura de tipo salvaje que sobreexpresa Las17 fue viable. Esto sugiere que Las17 interacciona funcionalmente con la ruta de Sho1. La osmosensibilidad de las células Δssk2/Δssk22 GAL1/10::LAS17 puede estar provocada por una capacidad de Las17 sobreexpresada, como AptA, para competir con Pbs2 endógena por la unión a Sho1-SH3. Una posibilidad alternativa es que Las17 puede ser un regulador negativo del osmosensor Sho1. Finalmente, es posible que Las17 sea necesaria de forma temprana en la respuesta para el ensamblaje del complejo Sho1/Pbs2. De este modo, los datos son consistentes con la hipótesis de que AptA inhibe interacciones mediadas por PxxP entre Pbs2 y el dominio SH3 de Sho1, pero quizás también entre Las17 y Sho1. Más abajo se volverá a esta cuestión.

Sondeo de los determinantes de secuencia de la función AptA

AptA y Apt32 difieren sólo en tres restos en el bucle variable, en las posiciones -6, -5 y +4 (Tabla II). Se ha demostrado que los restos fuera del motivo rico en prolina central desempeñan papeles importantes en la determinación de la especificidad y/o fortaleza de la unión de péptidos ricos en prolina a los dominios SH3. Se mutaron tres restos únicos de Apt32 a los restos correspondientes de AptA (Tabla III). El análisis de las 6 posibles combinaciones de mutaciones reveló que un resto de leucina en la posición -5 en AptA es el único determinante de la actividad inhibidora en el ensayo de osmorresistencia. Cuando la posición -5 en Apt32 es sustituida por leucina, el aptámero peptídico se convierte en inhibidor (número mutante 2, Tabla III). La adición a esta leucina de los otros restos de Apt32 no evitó la inhibición de la señalización de Sho1 por AptA, indicando que los restos en las posiciones -6 y +4 no son cruciales para la actividad. Schreiber y colegas han establecido previamente la base estructural para el papel de las cadenas laterales de restos a la hora de determinar la afinidad y especificidad de la interacción con el dominio PPII/SH3. Los datos indican que, mientras que la identidad del resto en -6 puede contribuir a la especificidad en otras interacciones de la hélice de poliprolina II/dominio SH3, en el caso de la interacción Pbs2/Sho1 SH3 es la posición -5 la que probablemente desempeñe un papel clave. Esto es lo inverso de la situación estudiada por Feng et al [Feng S, Kasahara C, Rickles RJ, Schreiber SL. 1995. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 12408-15], y sugiere que los detalles mecanísticos de las interacciones PPII/dominio SH3 pueden diferir, a pesar del alto grado de conservación de secuencias. Esto es consistente con la observación de que el dominio SH3 de Src selecciona restos específicos en posiciones -7 y -6, mientras que Fyn SH3 selecciona en -6 y -5. De hecho, no se observó selección en la posición -6, puesto que el Sho1 SH3 aceptó los siguientes dipéptidos en la posición -5 y

6: RL (AptA); LP (Pep32); SV (Apt34); VE (Apt40); PA (Apt94); RG (Apt124); DL (Apt03) y NL (Apt05), siendo la única conservación la aparición de un resto de leucina en la misma posición en los 3 péptidos AptA, Apt03 y Apt05) y un resto de arginina en los otros 2 (AptA y Apt124).

Se observó que otros péptidos que contienen una leucina en -5 (tales como Apt03 y 05) no fueron inhibidores. A diferencia de AptA, estos dos aptámeros peptídicos están constreñidos. Para ensayar la idea de que la constricción evita que la hélice PPII de aptámeros peptídicos tales como Apt03 y 05 interaccionen de forma productiva con Sho1 SH3, se sustituyó el codón de parada C-terminal de AptA por codones que codifican cada resto de aminoácidos en turno para obtener AptA un aptámero peptídico de longitud completa constreñido en STM. Después de volver a constreñir, sólo uno de los siete restos de aminoácidos P, V, C, D, H, F y W en +5 permiten la unión a Sho1 SH3 en el contexto de una proteína constreñida (Tabla IV). Esto contrasta con los hallazgos de Feng et al [Feng S, Chen JK, Yu H, Simon JA, Schreiber SL. 1994. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266: 1241-7] y Rickles et al [Rickles RJ, Botfield MC, Zhou XM, Henry PA, Brugge JS, Zoller MJ. 1995. Phage display selection of ligand residues important for Src homology 3 domain binding specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 10909-13], quienes encontraron que, en el contexto de un péptido libre, esta posición tendió hacia restos alifáticos (A, S, P, V, L, R o Y; resumido en la Tabla I). Además, ninguna de las variantes AptA constreñidas muestra la capacidad para inhibir la activación de Pbs2-Hog1 (Tabla IV). Estos datos nuevamente son consistentes con la idea de que la hélice de PPII necesita estar conformacionalmente no constreñida para que se produzca una unión fuerte. Indican además que, en el contexto de STM, la presencia de uno de los 7 restos permisivos en la posición +5 permite la formación de una hélice de prolina tipo II de mano izquierda o permite la interacción en una superficie sobre Sho1 distinta del dominio SH3.

Restauración de las rutas de señalización mediante módulos de aptámeros peptídicos

Las rutas de señalización celular son retransmitidas mediante módulos de dominios que conectan componentes de señalización. Por ejemplo, la señal de estrés osmótico sentida por Sho1 es transmitida por el reclutamiento de Pbs2 vía el motivo de PxxP al dominio SH3. Pbs2 sirve tanto como un armazón, que recluta la MAPKKK Ste11 para Sho1, como un transmisor de la señal, siendo la MAPKK la que activa Hog1 MAPK. La prueba de que Pbs2 funciona como un armazón es que la mutación del motivo PxxP de Pbs2 para crear pbs2 AxxA conduce a las células a activar la ruta de MAPK de emparejamiento (que comparte Ste11 con la ruta de osmosensibilización) en medio de molaridad elevada. El modelo es que la activación de Ste11, ya sea mediante estrés osmótico o feromona de emparejamiento, tiene el potencial para activar HOG o la ruta de emparejamiento, y se confiere especificidad de señalización por el armazón apropiado, Pbs2 en la ruta de HOG y Ste5 en la ruta de emparejamiento. La explicación más simple para el efecto de AptA fue que compite por el reclutamiento de Pbs2 para Sho1, evitando la unión y activación de Pbs2 que contiene PxxP. Si esto fuera cierto, y el modelo de armazón simple correcto, entonces 1) las células que expresan AptA pueden activar la cascada de emparejamiento en respuesta a choque osmótico, y 2) puede ser posible esquivar el reclutamiento de Pbs2 para Sho1 amarrando Ste11 directamente a Sho1, si Ste11 y Pbs2 están unidos constitutivamente entre sí. Sin embargo, no fue posible demostrar la activación de las MAP cinasas de emparejamiento, Fus3 o Kss1, en células que expresan AptA. Además, la dirección de Ste11 hacia Sho1 usando una fusión de AptA a Ste11 fue incapaz de restaurar la activación de Hog1 en células que expresan el mutante AxxA pbs2: Δssk2/Δssk2/Δpbs22 de levadura que expresa pbs2 AxxA y la fusión Ste11-AptA fueron inviables en placas de osmolaridad elevada (Figura 14A), y Hog1 no fue activado en estas células (Figura 14C). Esto sugiere que la quimera Ste11-AptA no fue capaz de ser activada con el tratamiento con NaCl, o que esta fusión no pudo formar un complejo funcional con Pbs2 MAPKK. Una explicación alternativa, descubierta por la implicación de Las17 en la ruta, es que la fusión Ste11-AptA puede restaurar el complejo Pbs2/Sho1, pero no es capaz de sustituir la interacción con Las17. Después se cuestionó si AptA podría restaurar la señalización de Sho1 para pbs2 AxxA que era defectuoso para la unión a Sho1. De hecho, la fusión de AptA al mutante doble de AxxA de Pbs2 restauró la señalización, y las células de levadura se rescataron del estrés osmótico (Figura 11). Este resultado es consistente con que AptA sea capaz de mediar la interacción entre el mutante de AxxA Pbs2 y Sho1-SH3. Por el contrario, la introducción de la mutación de AxxA en AptA abolió su interacción con Sho1-SH3 (Figura 10, “A*”), indicando fuertemente que AptA se une al dominio SH3 de Sho1 en estos experimentos. Estos datos demuestran además que cualquier papel desempeñado por Las17 tendrá que ser aguas arriba de la formación de la interacción Pbs2/Sho1, muy probablemente en la membrana plasmática, ya que la fusión AptA-pbs2AxxA es suficiente para restaurar la sección citoplásmica de la ruta de transducción de señales.

Finalmente, a fin de confirmar el mecanismo de acción de AptA, se cuestionó si la expresión de AptA podría interrumpir la formación de un complejo de señalización en células estresadas osmóticamente. En estas condiciones, el complejo entre Sho1 y Pbs2 recluta Hog1. En consecuencia, se incubaron lisados de células completas procedentes de células de levadura estresadas que expresan AptA o STM (armazón vacío) con GST-Sho1 SH3 purificado. En presencia de AptA, el nivel de Hog1 en el retraimiento de Sho1-SH3 se disminuyó (Figura 12). Estas observaciones son consistentes con un mecanismo de acción de AptA en el que la perturbación de la interacción Pbs2-Sho1 por AptA disminuye el reclutamiento de Hog1 para el complejo.

En suma, los experimentos muestran que una ruta de señalización se puede desconectar y reconectar mediante módulos de aptámeros peptídicos. Además, los hallazgos también sugieren la importancia de una interacción directa entre Sho1 y Pbs2 en la ruta de HOG que no se puede sustituir de manera simple por la interacción entre Sho1 y Ste11. Sin embargo, Zarrinpar et al [Zarrinpar A, Bhattacharyya RP, Nittler MP, Lim WA. 2004. Sho1 and Pbs2 act as coscaffolds linking components in the yeast high osmolarity MAP kinase pathway. Mol Cell. 14: 825-32] han mostrado recientemente que la interacción entre Sho1 y Ste11 puede permitir que se produzca la transducción de señales en ausencia de Pbs2, aunque por la ruta de emparejamiento en lugar de la osmosensibilización. De este modo, los datos presentes y los de Zarrinpar et al apoyan un modelo en el que, para que se produzca la transducción de señales, se requiere una orientación muy precisa de Sho1 y Ste11 con relación entre sí y probablemente con la cinasa accesoria Ste20.

DISCUSIÓN

Los aptámeros peptídicos encuentran aplicación como herramientas para estudiar proteínas en el contexto intracelular, en salud y en enfermedades. Para satisfacerlo, este potencial requiere un armazón robusto y biológicamente neutro, y la habilidad de ser capaz de demostrar inequívocamente que cualquier fenotipo observado en células que expresan un aptámero peptídico está provocado por su efecto sobre la proteína diana. Los objetivos de este estudio fueron demostrar la utilidad de nuestro armazón preferido, STM, para la presentación de aptámeros peptídicos muy específicos que podrían interferir con la función proteica en las células. Se deseó en primer lugar cuestionar si se podrían crear librerías funcionales de aptámeros peptídicos que comprenden péptidos de hélice de poliprolina II que se han identificado mediante presentación de fagos por unirse a dominios SH3. Esto se diseñó para probar la habilidad del armazón a péptidos presentes con la especificidad necesaria para discriminar entre dominios SH3 próximamente relacionados, y permitió explorar los determinantes de la especificidad y afinidad para la interacción del dominio SH3/PxxP en el contexto de una proteína de longitud completa. En segundo lugar, se deseó cuestionar hasta qué grado un aptámero peptídico permitiría explorar una biología de la proteína en el contexto celular.

Aptámeros peptídicos para explorar interacciones PxxP/dominio SH3:

Estudios previos de los dominios SH3 mostraron que reconocen péptidos ligandos que contienen un motivo PxxP (en el que x es cualquier resto) que pueden formar una hélice de poliprolina de tipo II de mano izquierda. Estos estudios, que usaron típicamente presentación de fagos de librerías de péptidos libres de 10-12 restos de longitud, definieron tanto el motivo de consenso del ligando como los restos importantes para determinar la especificidad de unión y la afinidad de unión. Usando el sistema de numeración de Yu et al [Yu H, Chen JK, Feng S, Dalgarno DC, Brauer AW, Schreiber SL. 1994. Structural basis for the binding of proline-rich peptides to SH3 domains. Cell. 76: 933-45], en el que a la primera prolina del motivo PxxP se le da el número “0”, el resto precedente es “-1” y el resto siguiente es “+1”, se demostró que un resto de arginina o un resto de lisina en la posición -2 fue importante, y que la identidad del resto en la posición 5 es crucial para determinar la afinidad y especificidad. El análisis estructural mostró que los restos en las posiciones -1 y 0 se ajustan en un bolsillo del dominio SH3, los restos en +2 y +3 en otro. Es probable que un tercer bolsillo, que está menos bien conservado entre los dominios SH3, determine la especificidad y afinidad de unión, y forma contacto con los restos en -6, -5, -4 y -3. Usando una librería de péptidos anclados a prolina de 12 restos de longitud, presentados y en teoría constreñidos por la proteína de armazón preferida, STM, se encontró una fuerte presión de selección frente a los péptidos constreñidos. Los ligantes comprendieron péptidos presentados en el término carboxi de una proteína de armazón prematuramente truncada, o péptidos con una longitud mayor de 24 restos que se puede suponer razonablemente que estén menos bien constreñidos que el 12mer original. Ambas clases de péptidos son el resultado de sucesos raros. Los péptidos multiméricos resultan de la autoligación de los oligonucleótidos codificantes antes de su ligación en el plásmido del hospedante. Los péptidos truncados son el resultado de la presencia de un codón de parada en los oligonucleótidos codificantes, o la falta de síntesis de los oligonucleótidos usados para codificar la librería peptídica. Nuestros oligonucleótidos de la librería se construyeron usando el codón “NNK”, en el que N es cualquier nucleótido, y K es G o T. Esta librería codifica todos los aminoácidos posibles usando 30 codones codificantes (uno de cada para F, I, M, Y, H, Q, N, K, D, E y C; dos de cada para V, S, P. T, A; y 3 de cada para L y R) y sólo un codón de parada. En otras palabras, la probabilidad de un codón de parada en el marco en cualquier posición dada es 1/31, y la probabilidad de obtener un codón de parada al final de la región codificante del péptido es 0,0312 = 5 x 10-8. Los datos son consistentes con un modelo en el que el armazón es capaz de constreñir conformacionalmente un péptido 12mérico para evitar la formación de una hélice de poliprolina II, para evitar la adopción por esta hélice de una conformación extendida que permitiría que todas las cadenas laterales de los restos hagan contactos apropiados con el dominio SH3 diana. Esto explicaría por qué los aptámeros peptídicos tales como Apt32 son capaces de unirse al SH3 de Sho1, pero no suficientemente fuerte para inhibir la unión. Por lo tanto, los datos proporcionan un fuerte apoyo para la hipótesis de que la interacción de ligandos ricos en prolina con los dominios SH3 requiere que el ligando esté relativamente no constreñido.

Aptámeros peptídicos como herramientas para diseccionar una red de interacción proteína-proteína:

La señalización celular está regulada por interacciones proteína-proteína. Para mantener la fidelidad de cada ruta de señalización, las interacciones entre las proteínas de señalización tienen que estar muy reguladas. Además de los “miembros centrales” de cada ruta lineal, también pueden estar implicadas espacial y dinámicamente muchas otras proteínas, tales como proteínas de armazón o proteínas transportadoras intracelulares, para asegurar la especificidad de la transducción de señales. Por lo tanto, una disección detallada de la red de interacciones proteína-proteína nos ayudará a entender cómo se regula el comportamiento celular.

Se ha demostrado que un aptámero peptídico puede ser una herramienta útil para emplear estudios de genética de levaduras hasta una comprensión de interacciones proteína-proteína específicas. Por ejemplo, se demuestra que AptA puede tanto desconectar una ruta de señalización, como reconectar una ruta disfuncional dirigiendo Pbs2 mutante nuevamente a Sho1 (Figuras 9 y 11). Es interesante que las fusiones de AptA a Ste11 no restauraron la transducción de señales en células que expresan Pbs2 mutante (Figura 14), como otros han identificado una región de Sho1 que no era necesaria para la interacción con Pbs2, pero se requería para mantener la especificidad de la señalización, sugiriendo que puede interaccionar con Ste11. Los datos sugieren que esta región de Sho1 interacciona sólo indirectamente con Ste11, quizás vía Ste20, o que AptA inhibe más de una interacción proteína-proteína en el dominio SH3 de Sho1 en células. El candidato más fuerte para una segunda interacción de sitio implica Las17, que los datos sugieren que podría desempeñar un papel clave transmitiendo la señal de estrés osmótico, posiblemente vía el citoesqueleto. La hipótesis de que AptA también afecta a la función de Las17, puesto que la sobreexpresión de la propia Las17 confiere osmosensibilidad, está apoyada por el hecho de que este fenotipo es consistente con la hipótesis.

Se observa que Las17 no se aisló en cribados para genes que confieren osmosensibilidad. Esto destaca una ventaja de que los agentes que interfieren con la función proteica en el contexto celular tienen cribados sobregenéticos, es decir, que se pueden identificar fenotipos condicionales para genes esenciales, y que una función de una proteína (tal como la osmosensibilización) se puede aislar de otras (tales como mantenimiento de la integridad del citoesqueleto) si el agente interfiere con sólo una de las varias interacciones proteína-proteína.

Puesto que un aptámero peptídico muestra su efecto a nivel proteico, debería de ser posible usar un aptámero peptídico para identificar la interacción proteica de una proteína diana. Como prueba de concepto, se usó una estrategia de retirada de GST como ensayo preliminar de la capacidad para examinar la capacidad del aptámero peptídico para interrumpir un complejo proteico. La expresión de un aptámero peptídico que se propone para prevenir la formación del complejo HOG1/Pbs2/Ste11 en la membrana plasmática condujo de hecho a una disminución en la presencia de la proteína Hog1 en el dominio citoplásmico de Sho1p (Figura 12). Por tanto, estos datos confirman el potencial del uso de aptámeros peptídicos para diseccionar redes de interacciones proteína-proteína físicas. Combinado con su especificidad muy elevada, demostrada aquí incluso para la interacción potencialmente promiscua entre un dominio SH3 y una librería peptídica de poliprolina II degenerada, este trabajo sugiere que los aptámeros peptídicos pueden formar ventajosamente la base para una herramienta para la disección de la función proteica en el contexto de redes celulares según la presente invención.

SIGNIFICANCIA

Los microchips de expresión han dejado al descubierto muchos productos génicos que son expresados diferencialmente en una enfermedad. Una proteína que es expresada de forma única, o algunas veces simplemente sobreexpresada en un marco de enfermedad, es una diana terapéutica potencial. ARNi es actualmente una técnica de elección para la validación de tales dianas farmacéuticas candidatas. Sin embargo, las proteínas participan en múltiples conjuntos de interacciones en células. En la práctica, esto da lugar a la posibilidad de que técnicas de “supresión” tales como ARNi pueden afectar a más de una ruta, conduciendo a resultados equivocados. Esto significa que muchas dianas terapéuticas válidas se pueden perder erróneamente cuando el fenotipo de ARNi no se empareja con las expectativas. Lo que falta claramente en la técnica anterior es la capacidad para diseccionar parejas de proteínas en el contexto de células vivas.

Se muestra aquí que aptámeros peptídicos proporcionan ventajosamente una solución a este problema, puesto que a su vez tienen el potencial para responder a cuestiones sutiles sobre cada una de interacciones de proteínas en células. Primero, se demuestra que los aptámeros peptídicos son capaces de una especificidad exquisita, mostrando que 3 aptámeros peptídicos relacionados pueden distinguir entre 28 dominios SH3 estrechamente relacionados. En segundo lugar, también se encuentra que las afinidades de unión de aptámeros peptídicos pueden ser tales que compitan in vivo por interacciones proteína-proteína. De este modo, se identificó un inhibidor de una ruta de sensibilización a estrés en levadura que previno la transmisión de señales a un complejo efector, y se mostró que este inhibidor también evitó el ensamblaje de este complejo. En tercer lugar, los datos sugieren también que los aptámeros peptídicos pueden permitir la puesta al descubierto de una función no esencial de una proteína (tal como la generación

o transmisión de una señal de estrés) desde interacciones esenciales (tales como la regulación de la integridad citoesquelética) que son necesarias para la viabilidad celular. La invención también encuentra aplicación en el contexto de células humanas.

MATERIALES Y MÉTODOS (Ejemplo 13)

Cribado del dominio SH3 de Sho1

Este cribado se describió previamente en [Woodman R, Yeh JT-H, Laurenson S, Ko Ferrigno P. 2005. Design and validation of a neutral protein scaffold for the presentation of peptide aptamers J Mol Biol. 352: 1118-33]. De forma breve, se construyó una minilibrería a base de Pbs2 ligando el oligonucleótido degenerado “NNK SYG AAT AAG CCC CTA CCC BCT CTA CCC SYG NNK” (N = A, T, C o G; K = G o T; S = C o G; Y = C o T; B = C, G o T) en el vector pJG4.5 STM digerido con RsrII. Este casete oligonucleotídico parcialmente aleatorizado codifica la secuencia peptídica X(L/V/P/A)N (K/R)PLP (P/S/A)LP (L/V/P/A)X, en la que X es cualquier aminoácido. La complejidad teórica de la librería a nivel proteico es 38.400. El cribado de la librería y la confirmación del éxito se describe en Woodman et al (ibid).

Ensayo de resistencia osmótica de levaduras

Se transformaron células de levadura con diversos constructos de aptámeros peptídicos de Sho1-SH3. Para ensayos de manchas, se colocaron 10000 células de cada

5

10

15

20

25

-44

transformante sobre placas selectivas con o sin NaCl 1M, suplementado con glucosa o galactosa/rafinosa. Las células de levadura también se dividieron directamente en rallas sobre placas con o sin NaCl 1M. El crecimiento celular se registró 3-5 días después.

Preparación de lisados de células de levadura y transferencia Western

Células de levadura se lisaron con tampón de muestreo 1xSDS y se sometieron vigorosamente a vórtex con perlas de vidrio de 80 µl durante 1 minuto. Las muestras se incubaron en un bloque térmico de 95ºC durante 5 minutos, y después se enfriaron rápidamente en hielo. Las muestras se hicieron girar entonces brevemente, y los sobrenadantes se recogieron en tubos de centrifugadora de 1,5 ml límpidos y se almacenaron a 4ºC. Las transferencias Western se llevaron a cabo según protocolos estándar y se sondaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-Hog1 Y-118 (Santa Cruz)

o NEB anti-fosfo p38 (clon 28B10). Para detectar Hog1 activo fosforilado.

Clonación de 27 dominios SH3 de levadura

Los 27 dominios SH3 de levadura putativos se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico de levadura y se clonaron en sitios EcoRI y XhoI del vector pEG202 de levadura. Las secuencias de los cebadores oligonucleotídicos para PCR están disponibles en PKF según pedido. Cada dominio SH3 se seleccionó según la definición dada en la base de datos de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Tabla I

imagen1 A. Diseño semi-racional de la librería de aptámeros peptídicos

B.

Alineamiento con hélices PPII previamente identificadas Nombre Secuencia Fuente

RLP2

RALPPLPRY 20

VSL12

VSLARRPLPPLP 21

PBS2

VNKPLPPLPV

AptA

GPRLNKPLPSLPV Este estudio

Apt32

GPLPNKPLPSLPL Este estudio

Src C+5-1

PPVPSL 23

Src C+5-2

PPVPSL

Src C=5-3

PPLPARPHP AN

Src C+5-4

PPLPTLLPS “

Src C+5-5

PPLPTPPLH “

Lyn C+5-1

PPLPLPPRL, 23

Lyn C+5-2

PPLPLPPRT “

Lyn C+5-3

PPLPLPPRH

5

10

15

-45 Nombre Secuencia Fuente

Lyn C+5-4 PPLPLPPPH “ Fyn C+5-1 PPLPLPPLT 23 Fyn C+5-2 PPLPSAPRV “ Fyn C+5-3 PPLPVLSEP “ Fyn C+5-4 PPLPTSTQP “ Fyn C+5-5 PPLPHLPDS “ Fyn C+5-6 PPLPSYTSH “ Fyn C+5-7 PPLPVATHP “ Fyn C+5-8 PPLPSSLSR “ Fyn C+5-9 PPLPAPHAR “ Fyn C+5-10 PPLPTVASP “

Tabla II. Ligantes del dominio Sho1-SH3 procedentes del cribado. Se describen catorce ligantes, que comprenden secuencias peptídicas constreñidas por STM (véase más abajo). Las secuencias peptídicas dadas aquí son para aquellos aptámeros peptídicos que están truncados en el término C, ya sea mediante un codón de parada codificado por el oligonucleótido de la librería, o uno que esté presente en un marco de lectura alternativo de STM al que accede mediante un desplazamiento del marco codificado por oligonucleótido.

AptA: GPRLNKPLPSLPV*

032: GPLPNKPLPSLPL*

034: GPSVNKPLPSLPSLPVYGP*

040: GPVENKPLPALPAVGP*

094: GPANKPLPALPALGSAVE*

124: GPRGNKPLPALPL*

Tabla III. Combinaciones de mutaciones de Apt32 a AptA Los tres restos que varían entre AptA (inhibidor) y Apt32 (neutro) están subrayados. En negrita se destacan 6 combinaciones de mutaciones obtenidas para sustituir restos en Apt32 con aquellos encontrados en la posición correspondiente en AptA

Secuencia Osmosensibilidad

AptA: RLNKPLPSLPV* +

Apt32: LPNKPLPSLPL*

#1: RPNKPLPSLPL*

#2: LLNKPLPSLPL* +

#03: LPNKPLPSLPV*

#23: LLNKPLPSLPV*+

#13: RPNKPLPSLPV*

#12: RLNKPLPSLPL* +

Tabla IV Sustitución del codón de parada de AptA por 20 aminoácidos

Secuencias Unión de Sho1-SH3 Osmosensibilidad

RLNKPLPSLPV* + + RLNKPLPSLPVA -RLNKPLPSLPVC + RLNKPLPSLPVD -RLNKPLPSLPVE -RLNKPLPSLPVF +

RLNKPLPSLPVG -RLNKPLPSLPVH + RLNKPLPSLPVI -RLNKPLPSLPVK + RLNKPLPSLPVL -RLNKPLPSLPVM -RLNKPLPSLPVN + RLNKPLPSLPVP + RLNKPLPSLPVQ -RLNKPLPSLPVR -RLNKPLPSLPVS -RLNKPLPSLPVT -RLNKPLPSLPVV + RLNKPLPSLPVW + RLNKPLPSLPVY -RLNKPLPSLPVG*a + +

*

= codón de parada

a.

constructo RLNKPLPSLPVG* es un aptámero peptídico de control que muestra que la pérdida de efecto inhibidor es debido a la constricción en lugar de a la adición de un resto extra después de la posición V+4.

Listado de secuencias

SEC ID nº 1 Secuencia de aminoácidos del mutante triple STM

imagen2

SEC ID nº 2 Secuencia de estefina A de tipo salvaje (CysA de H sapiens)

imagen2

SEC ID nº 3 STM hasta Leu73, sin Leu73/NGP

imagen2

SEC ID nº 4 STM desde Leu73 hasta el final, sin Leu 73/NG P PGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF SEC ID nº 4 STM que comprende el epítopo AU1 del péptido diana

imagen2

PCR: P1 EcoRl 5’-CCGGAATTCCCATGATACCTGGAGGC-3’ P2 EcoRV 5’-ATCTCAAAAGCCCGTCAGCTCG -3’ P4 EcoRI 5’-GGAATTCCACCATGATACCTGGAGGCTTATCT-3’ P5 Xbal 5’-GCTCTAGAGCAAAGCCCGTCAGCTCGTCAT-3’ P6 EcoRl 5’-GGAATTCCACCATGATACCTTGGCTTATCTGAGGCCAAACC-3’ P7 Xbal 5’-GCTCTAGAGCAAAGCCCGTCAGCTCGTCAT-3’ P8 EcoRl 5’

GGAATTCACCATGCCAAAAAAGAAGAAAGGTAGATATACCTTGGGGC

-3’ P9 Xbal 5’-GCTCTAGAGCAAAGCCCGTCAGCTCGTCAT-3’ P12 Eco RI 5’-CCGGAATTCATGATACCTGGAGGCTTATC-3’ P13 EcoRl 5’-CCGGAATTCCTAAAAGCCCGTCAGCTCGTC-3’ P16 Eco RI 5’-CCGGAATTCATGATACCTGGAGGCTTATC-3’ P17 Xhol 5’-CCGCTCGAGCTAAAAGCCCGTCAGCTCG-3’ Mutagénesis dirigida al sitio: P3 KSUNG 5’-CTTGAAAGTATTCAACGGACCGCCCGGACAAAATGAGG-3’

P P14 V48D 5’-CAGTATAAAACTCAAGTTGATGCTGGAACAAATTAC-3’ P15 G4W 5’-GGCCTCAGATAAGCCCCAAGGTATCAT-3’ Insertos: P10 NLS 5’

directo GACTGACTGGTCCGCCAAAGAAGAAGAGAAAGGTAGGTCCTCAGT CAGT-CAG-3’ P11 NLS 5’-CTGACTGACTGAGGACC-3’

inverso Insertos: P18 AU1 5’-GTCCGGACACCTACCGCTACATCG-3’

directo P19 AU1 5’-GTCCGATGTAGCGGTAGGTGTCCG-3’ inverso

Cribado del dominio SH3;

P20 Amplific 5’-CTGACTGACTGAGGACC-3’ ador;

P21 Inserto 5’de GACTGACTGGTCCGNNKSYGAATARGCCCCTACCCBCTCTACCCSY librería GNN-KGGTCCTCAGTCAGTCAG-3’ (N es cualquier nucleótido, K = G o

T, R = A o G, S = C o G, Y= Co T yB= C, G o T)

P22 Cebo de 5’-CGAATTCCCGGGTGATATCGGTGATGATAATTTCATTTAC-3’

SH3 directo

P23 Cebo de 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACGATGCATTTCTTCTGGACCATC-3’ SH3 inverso

P24 Unificad 5’-GAAAGTATTCAACGGTCCGCCCGGACAAAATG-3’. or Péptido A: RLNKPLPSLPV

Claims (14)

1. Reivindicaciones

   1.

   Uso de Estefina A como una proteína de armazón, en el que la Estefina A es una Estefina A humana, y en el que los aminoácidos 71 a 73 de Estefina A están sustituidos por una inserción peptídica heteróloga.

2. 2.

   Uso según la reivindicación 1, en el que la proteína de armazón comprende una mutación V48D, en la que V48 está sustituido con D.

3. 3.

   Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína de armazón comprende una mutación G4W en la que G4 está sustituido con W.

4. 4.

   Uso según la reivindicación 1, en el que la proteína de armazón comprende además las mutaciones V48D y G4W, en las que V48 está sustituido con D y en la que G4 está sustituido con W.

5. 5.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de armazón comprende la secuencia MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVF y la secuencia PGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF.

6. 6.

   Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVF fusionada a una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada a la secuencia de aminoácidos PGQN EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF.

7. 7. Polipéptido que comprende

   (i)

   la secuencia de aminoácidos MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF; o

   (ii)

   la secuencia de aminoácidos MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFKSLPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF,

   en el que los aminoácidos 71 a 73 están sustituidos por un péptido heterólogo.

8. 8.

   Polipéptido según la reivindicación 7, en el que dicho péptido heterólogo comprende 20 aminoácidos o menos.

9. 9.

   Polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicho polipéptido heterólogo comprende 12 aminoácidos o menos.

10. 10.

    Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de armazón o polipéptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. 11.

    Polipéptido que comprende la secuencia MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF.

12. 12.

    Ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDELTGF.

13. 13.

    Ácido nucleico aislado según la reivindicación 12, en el que la secuencia nucleotídica comprende un sitio de restricción RsrII.

14. 14.

    Método para identificar un péptido diana capaz de unirse a una estructura de interés, que comprende

    (i)

    proporcionar una proteína de armazón de estefina A que comprende un péptido diana que sustituye a los aminoácidos 71 a 73 de estefina A;

    (ii)

    poner en contacto dicha proteína de armazón con dicha estructura de interés; y

    (iii) monitorizar la asociación entre el armazón y la estructura de interés;

    en el que la asociación de la proteína de armazón con la estructura de interés identifica el péptido diana como un péptido diana candidato capaz de unirse a dicha estructura.