JP7070914B2 - 抗体-多糖結合体及びそれを用いた高感度免疫測定方法 - Google Patents
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Description
本明細書において、「抗体」とは、天然抗体及び人工抗体の双方を含む。ここで、「天然抗体」とは、いずれかの脊椎動物が産生する抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体をいう。また、「人工抗体」とは、人工的に構築された抗体をいい、例えば、前記天然抗体のアミノ酸配列に適当な変異を導入した抗体その他、通常、自然界には存在しない構造を含むように改変を行った抗体をいう。
単鎖抗体は、天然のもの、例えば、ラクダ科の動物が産生する一本鎖抗体(以下、シングルドメイン抗体、「VHH抗体」又は「VHH」ということがある。図1参照。Zhang L., et al., 1993, Nature, 362:446-448)と遺伝子組換えによってつくられた非天然のものとに大別される。非天然の単鎖抗体は、この抗原結合部位を構成する2つの可変領域断片(重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL))を柔軟なリンカーで結んで作製された組換え抗体断片であり、例えば、一本鎖Fv(scFv:single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook, 1994 - 1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)等を挙げることができる。これらの単鎖抗体は、比較的容易に微生物で発現させることができる。
また、VHH抗体の末端に基材に特異的に結合するペプチド(以下、「基材特異的結合ペプチド」という。)を融合させ、この基材特異的結合ペプチドを介することにより、VHHの配向を制御しながら固相化する方法(以下、「従来技術3」という。非特許文献8参照)などが知られている。
また、目的物質を結合するための足場として多糖を利用し、固相表面-(化学結合)-多糖-(化学結合)-目的物質(タンパク質、核酸など)という構成とすることで分子を検出するシステムが提案されている(以下、「従来技術5」という。特許文献2参照。)
従来技術5は、目的物質を結合するための足場として、直鎖多糖であるデキストラン、分岐鎖多糖であるグリコーゲン及びアミロペクチンという多糖を利用し、検出感度の低下を抑制するという点では優れた発明である。
しかし、化学結合に適した固相表面を用意しなければならないこと、化学結合を二度行うため、手間がかかるという問題がある。また、標的認識を行なうことができる接触面が少ないという問題がある(図1(C)参照)。
さらに、常温保存が可能で、製品のロット差が少ない、高感度サンドイッチELISA法用の試薬に対する強い社会的要請があった。
すなわち、本発明の一態様は、水溶性多糖類、低分子抗体分子、並びに前記水溶性多糖類及び前記低分子抗体分子とをつなぐリンカーと、を含む免疫測定用抗体-多糖結合体であって、前記リンカーは、前記低分子抗体分子のアミノ酸残基と反応する反応性官能基と、クッションタンパク質とを含むことを特徴とする、免疫測定用抗体-多糖結合体である。
ここで、前記反応性官能基は、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ピリジルジスルフィド基、イミドエステル基、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、ヒドラジド基及びエポキシ基からなる群から選ばれるいずれかであることが、抗体又は抗体複合体との結合安定性の点から好ましく、これらの中でも、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基及びピリジルジスルフィド基は、中性付近の条件下でスルフヒドリル基と特異的に反応するため、特に好ましい。
また、水溶性多糖類の側鎖に導入する反応性官能基の量や構造を制御することで、結合されうる抗体分子の数や抗体同士の間隔を自在に設計することができる。そして、これによって、前記抗体-多糖結合体において誘起されうるアビディティー効果を制御することが可能となる。
さらに水溶性多糖類を使用していることから、水溶性多糖が有する分子シャペロン効果によって、抗原親和性を損なうことなく抗体の構造を安定化することができる。またこれとともに、多糖の有する親水性により非特異吸着を抑制することができ、抗原検出感度を増強することができる。
本発明は、上述したように、(a)複数の側鎖を有する水溶性多糖類と、(b)低分子抗体分子とが、(c)前記側鎖と前記低分子抗体分子とをつなぐためのリンカーを介して結合された免疫測定用抗体-多糖結合体である(図3、工程1及び2参照)。
(a-1)水溶性多糖類
前記水溶性多糖類(図中、「PS」と示す)は、後述する免疫測定用基材等の固相表面(図中、「SP」と示す)上に、前記抗体等(図中、「VH」と示す)を固定するための足場として機能する(図3、工程3及び4参照)。すなわち、前記抗体等は、前記固相表面上に直接固定されないため、上述したようなコンフォメーションの変化が起きることを防止することができ、それによって抗原(図中、「AG」と示す)との結合能の低下をも避けることができるようになる。
また、複合多糖としては、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の2つの糖がβ1-4、β1-3結合で連結したヒアルロン酸、及びβ-D-マンヌロン酸とα-L-グルロン酸がβ1-4結合したアルギン酸塩、並びにこれらのナトリウム塩又はカリウム塩; D-ガラクトースを構成糖とするカラギーナン、主鎖に2個のグルコース、1個のグルクロン酸及び1個のラムノースの4つの糖が結合したジェランガム、グルコサミンがβ1-4結合したキトサン塩、-アセチル-D-グルコサミンが長く結合したキチンを水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ水溶液で部分的に脱アセチル化した水溶化キチン等を、挙げることができる。上記多糖類の側鎖の化学修飾が容易であるためである。
上記の水溶性多糖類には複数の側鎖が存在するが、これら複数の側鎖は前記多糖類の構成糖類の側鎖である。そして、少なくとも一つの側鎖の官能基に、後述する低分子抗体分子がリンカーを介して共有結合によって結合される。その際、先ず、前記水溶性多糖類の側鎖の官能基にリンカーを結合させ、次いで、前記リンカーと前記低分子抗体分子との間に共有結合を形成させ、免疫測定用抗体-多糖結合体を調製する(図4A及びB参照)。
本明細書中で、「リンカー」とは、上記水溶性多糖類と、後述する低分子抗体とを連結させる機能を有する連結基であって、少なくとも、前記低分子抗体分子のアミノ酸残基と反応する反応性官能基と、クッションタンパク質とを含んで構成される。この連結基は、低分子抗体とは、そのアミノ酸残基と上記クッションタンパク質を介して結合され、そして、上述した多糖の側鎖とは、結合し得る反応性官能基を介して連結される(図4B参照)。
ここで、前記反応性官能基は、システイン側鎖中に存在するスルフヒドリル基、ポリペプチドのN末端やリジン残基の側鎖中に存在する第一級アミン、並びにポリペプチド基のC末端上、アスパラギン酸側鎖中及びグルタミン酸側鎖中に存在するカルボキシル基と反応する官能基等を挙げることができる。
多糖類そのものには無論のこと、スルフヒドリル基はないため、これらの反応性官能基が含まれることが、抗体等に含まれるスルフヒドリル基とリンカーとを中性付近のpHの溶液中で安定に結合させることができる点で好ましい。
本明細書中、「クッションタンパク質」とは、前記リンカーに含まれ、低分子抗体と結合するタンパク質である。本来、クッションタンパク質は、生体高分子と固相表面との間に生じる直接的な相互作用の影響を緩和することを目的として用いられるものである。具体的には、例えば、固相(親水性ポリスチレン)上にポリスチレンタグを付けたクッションタンパク質をコートし、標的タンパク質をフレキシブルリンカーを介して連結するために使用される。いわば、クッションタンパク質が、固相と直接結合して、標的タンパク質を結合させるための足場として機能する。
前記リンカーには、少なくとも1分子のクッションタンパク質が含まれていればよい。クッションタンパク質を2分子以上含む場合には、それらは同一のタンパク質であってもよく、異なるタンパク質であってもよい。
具体的には、例えば、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体、ジェラチン等を挙げることができる。これらのタンパク質は、熱安定性が高く構造変化が起こりにくいため、好適に使用することができる。
また、低分子抗体と前記リンカーに含まれるクッションタンパク質とは、ペプチド結合により直接結合されていてもよいし、間接的に結合されていてもよい。例えば、低分子抗体とクッションタンパク質との間に、タンパク質精製用のタグ配列や特定の認識配列等の遺伝子組換えの際に必要なペプチド配列等を挟んでいてもよい。また、2分子以上のクッションタンパク質が結合されている場合には、それらの間にも上記のようなタグ配列やペプチド配列が含まれていてもよい。
本明細書中において、「低分子抗体分子」とは、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)が部分的に欠損している抗体断片をいい、VH及びVLのいずれか、または両方を含んでいることが好ましい(図1参照)。VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および/または挿入を含むことができる。なお、上記可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
上記低分子抗体は、例えば、パパイン、ペプシン、あるいはプラスミン等の酵素で抗体を処理して抗体断片を生成させて入手することができる。
先ず、プルランの側鎖に結合させるリンカーは、リンカーの反応性官能基と、それと結合させる抗体等のアミノ酸残基との関係から、任意に組み合わせて公知の方法により調製することができる。
所望のVHH抗体、例えば、抗ヒトサバイビンVHH抗体と、ステフィンA変異体とで構成される抗体複合体(以下、「VHH-STM複合体」ということがある。)を使用した場合を例に挙げて説明する。VHH-STM複合体のアミノ酸配列(配列番号1)をコードする遺伝子を合成する。この合成は、DNAの合成を受託する企業に依頼して行うことができる。
以下のようにして、形質転換用の発現ベクターを調製する。発現ベクターとして、複数の発現ベクターに、例えば、下記表2に示す4種類のシグナル配列を組み込んだものを使用することができる。3種類の発現ベクター(pBIC、pBICm及びpBICs)に、以下の表2に示す4種のシグナル配列を1つそれぞれ組み込むと、12種類の発現ベクターを調製することができる。
形質転換は、市販のキット(例えば、BIC System(タカラバイオ(株)製))等を使用し、このキットに添付のマニュアルに従って行うことができる。すなわち、上記の発現ベクターと上記PCR産物とを混合したDNA溶液を、所望のバクテリアを含む溶液に加えて、適当なプレート培地に播種し、約28~35℃にて、一晩培養することにより、これらの菌の形質転換体を単一コロニーとして得ることができる。所望のバクテリアとしては、例えば、ブレビバシラス・コシネンシス(Brevibacillus choshinensis)等を挙げることができる。また、適当なプレート培地としては、例えば、MTNmプレート培地(10 g/L グルコース、10 g/L ファイトンペプトン、5 g/L エルリッヒ カツオエキス、2 g/L 酵母エキス B2、10 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MnSO4・4H2O、1 mg/L ZnSO4・7H2O、50 μg/mL ネオマイシン)等を挙げることができる。
上記のようにして形質転換させた単一コロニーの菌を、適当な培地に懸濁して約30~33 ℃にて、1.5~2.5日間培養し、培養上清を回収し、形質転換された菌が産生したタンパク質の精製を行う。精製して得られたサンプルを、常法に従ってSDS-PAGE分析に供し、タンパク質の発現を確認する。
適当な培地としては、例えば、2SYN培地(20 g/L グルコース、40 g/L バクトソイトン(Bacto Soytone)、5 g/L バクト・イースト・エキストラクト(Bacto Yeast Extract)、0.15 g/L CaCl2・2H2O、50μg/mL ネオマイシン)等を挙げることができる。形質転換体が産生したタンパク質の精製は、市販のキット(例えば、His Spin Trap キット(GE Healthcare社製))を用いて、このキットに添付されたマニュアルに従って行うようにしてもよい。
上記培養上清からVHH-STM複合体を調製し、保存する。先ず、得られた培養上清を、例えば、Amicon Ultra-15 (MWCO=3, Merck Millipore社製)にアプライし、次いで結合バッファー(例えば、約15~25 mM リン酸ナトリウム [pH 約7.4]、約450~550 mM NaCl又は5~15 mM Tris-HCl [pH 約8.0]、約450~550 mM NaCl)でバッファー交換を行う。
先ず、約9.5~10 mgのプルランを、チューブに入れた約900~1,000μLのDMSOに溶解させ、その後、約18~20μLの1~2 MのCDI/DMSO溶液をここに添加する。約45~55℃で30~50分間インキュベートした後、約45~55μLのエチレンジアミンを加えて、約45~55℃で約40~45時間、再びインキュベートする。インキュベート終了後、室温まで冷却し、約0.5~1.5 mLの2-プロパノールを加えて、15分間氷冷する。
以上のようにして調製した約120~145μLのアミノ化プルラン溶液/重水(約6~8mg/mL)に、約800~900μLの蒸留水、約300~400μLの0.1~0.3M ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH 約8.4)、及び約60~80μLの約0.1~0.3M N-スクシンイミジル ヨードアセテート/DMSO溶液を加えて、室温で約0.5~2時間撹拌する。
上記のNMR測定用溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL(NMWL:100,000)に移して、約12,000~16,000×gで、約20~26℃で約8~12分間遠心分離して濃縮する。膜透過液を廃棄した後、得られた濃縮液を約1,500~2,500×gで、約20~26℃で約1.5~2.5分間遠心分離し、得られたヨードアセチル化プルラン/重水溶液(約70~80 mg)に、約350~450μLの蒸留水、約160~180μLの約0.1~0.3 Mのホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH 約8.4)、及び約30~40μLの約0.05~0.15 MのL-システイン溶液を加えて、室温で約1.5~3時間撹拌する。
次いで、約40~60 mM ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液、約140~150μLの約4~6 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(pH 約8.4)に、上記のようにして調製した約18~22μLのVHH-STM複合体溶液と、約0.5~2.0μLのヨードアセチル化プルラン溶液とを加えて、約0~6℃で約10~14時間撹拌する。撹拌終了後に得られた反応溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL(NMWL:100,000)に移して、約12,000~16,000×gで、約0~6℃で約8~12分間遠心分離する。膜透過液を廃棄した後、得られた濃縮液に、約300~500μLのホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH 約8.4)を加えて、約12,000~16,000×gで、約20~26℃で約8~12分間遠心分離を行う。この操作を再度繰り返し、得られた濃縮液を、約1,500~2,500×gで、約0~6℃で約1.5~2.5分間遠心分離し、VHH抗体-プルラン結合体を得ることができる。
例えば、上記のようにして調製した、免疫測定用抗体-多糖結合体を用いて、サンドイッチELISA法を行うことができる。先ず、抗体-多糖結合体を所定の濃度のバッファーに溶解し、抗体-多糖結合体溶液を調製する。これを、96穴マイクロプレートに入れ、所定の条件下で、抗体-多糖結合体を固相に吸着させる。ここに、スキムミルク等のブロッキング剤を加え固相のブロッキングを行う。洗浄用のバッファーで数回洗浄し、溶液を除いたあと、所定の濃度の目的のタンパク質溶液を加え、所定の時間静置する(図2、工程3参照)。
(製造例)VHH抗体及びステフィンA変異体を含む抗体複合体用VHHの製造
(1)インサート遺伝子の構築
抗ヒトサバイビンVHH抗体及びステフィンA変異体からなる抗体複合体(以下、VHH-STM複合体という)のアミノ酸配列(配列番号1)をコードする遺伝子は、ユーロフィンジェノミクス(株)に委託して合成した(図4参照)。
PCRプログラムは、(a)98 ℃(10秒)、(b)55 ℃(15秒)、(c)68 ℃(30秒)とし、ステップ(a)~(c)を30サイクル行った。
pBIC1用フォワードプライマー:5’-AACGTGGTATCGGCTGAGGTTCAGCTTGTGGAGTC-3’
pBIC2及びpBIC4用フォワードプライマー:5’-CCCATGGCTTTCGCTGAGGTTCAGCTTGTGGAGTC-3’
pBIC3用フォワードプライマー:5’-AGTTCCGCATTCGCTGAGGTTCAGCTTGTGGAGTC-3’
pBIC1~4共通リバースプライマー:5’-CATCCTGTTAAGCTTAGCAATGGTGATGGTGATGAT- 3’
発現ベクターとしては、3種類の発現ベクター(pBIC、pBICm及びpBICs)に、以下の表4に示す4種のシグナル配列を1つそれぞれ組み込んだ12種類の発現ベクター(タカラバイオ(株)製)を使用して調製した。
形質転換には、BIC System(タカラバイオ(株)製)を使用し、このキットに添付のマニュアルに従って行った。即ち、上記12種類の発現ベクターと上記PCR産物を混合したDNA溶液を、解凍後に集菌したブレビバシラス・コシネンシス(Brevibacillus choshinensis) HPD31-SP3に加え、MTNmプレート培地(10 g/L グルコース、10 g/L ファイトンペプトン、5 g/L エルリッヒ カツオエキス、2 g/L 酵母エキス B2、10 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MnSO4・4H2O、1 mg/L ZnSO4・7H2O、50 μg/mL ネオマイシン)で、30 ℃にて一晩培養して形質転換させた。
形質転換させた菌の単一コロニーは、2SYN培地(20 g/L グルコース、40 g/L バクトソイトン(Bacto Soytone)、5 g/L バクト・イースト・エキストラクト(Bacto Yeast Extract)、0.15 g/L CaCl2・2H2O、50 μg/mL ネオマイシン)で、30 ℃にて2日間培養した。また、発現ベクターpBIC3を使用した場合は、上記以外に2SYN+Arg培地(20 g/L グルコース、40 g/L バクトソイトン、5 g/L バクト・イースト・エキストラクト、0.15 g/L CaCl2・2H2O、50 μg/mL ネオマイシン、200 mM アルギニン)を用いて、30 ℃にて、2日間培養した。
アクリルアミドゲル用の濃縮ゲル(4%アクリルアミド, 125 mMのTris-HCl [pH 6.8], 0.1% SDS)、分離ゲル(12% アクリルアミド, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8], 0.1% SDS)。及び泳動用ランニング緩衝液(25 mM Tris, 192 mM グリシン, 0.1% SDS)を調製した。上記サンプルは等量の2xSDSサンプルバッファー(125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 4% SDS, 10% メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.004 %ブロモフェノールブルー)を加えた後、95℃で15分程度加熱し、変性・還元した。電気泳動におけるサンプルの濃縮は10 mA定電圧で、分離は20 mA定電圧で行った。泳動後のポリアクリルアミドゲル上のタンパク質は、CBB溶液(0.25% クマシーブリリアントブルーR-250, 5%メタノール, 7.5%酢酸)にて染色した。
上記培養上清から、VHH-STM複合体を以下のようにして調製した。
先ず、得られた培養上清をAmicon Ultra-15 (Merck Millipore社製、MWCO=3,000)にアプライし、次いで結合バッファー(20 mM リン酸ナトリウム [pH 7.4]、500 mM NaCl又は10 mM Tris-HCl [pH 8.0]、500 mM NaCl)でバッファー交換を行った。
溶出後のVHH-STM複合体溶液をAmicon Ultra-4 (Merck Millipore社製、MWCO=10,000)にアプライし、PBS(-)(10 mMのリン酸ナトリウム [pH 7.4]、150 mMのNaCl)又はTBS(50 mMのTris-HCl [pH 8.0], 150 mMのNaCl)にバッファー交換をし、使用するまで-20℃にて保存した。
(1)アミノ化プルランの調製
先ず、9.75mgのプルラン((株)林原製)を950μLのDMSO(関東科学(株)製)に溶解させた後、19.3μLの1.6M CDI/DMSO溶液を添加した。50℃で40分間インキュベートした後、50.2μLのエチレンジアミンを加えて、50℃で42時間インキュベートした。室温まで冷却した後、1mLの2-プロパノール((株)関東化学製)を加えて、15分間氷冷した。
上記で調製した136μLのアミノ化プルラン溶液/重水(6.73 mg/mL)に、844μLの蒸留水、350μLの0.2M ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH 8.4)、及び70μLの0.2MのN-スクシンイミジル ヨードアセテート/DMSO溶液を加えて、室温で一時間撹拌した。反応液を、Amicon Ultra-0.5mL(Merck Millipore社製、NMWL:100,000)に移して14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。膜透過液を廃棄した後、400μLの濃縮液を加えて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。この操作を3回行った後、濃縮液を、2,000×g、23℃で2分間遠心分離を行い、ヨードアセチル化プルランを得た。
上記のNMR測定用溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL(NMWL:100,000)を用いて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離して濃縮した。膜透過液を廃棄した後、濃縮液を2,000×g、23℃で2分間遠心分離を行い、得られた76mgのヨードアセチル化プルラン/重水溶液に、414μLの蒸留水、175μLの0.2M ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH 8.4)、及び35μLの0.1 MのL-システイン溶液を加えて、室温で2時間撹拌した。反応溶液をAmicon Ultra-0.5 mL(NMWL:100,000)に移して、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。膜透過液を廃棄した後、濃縮液に400μLの重水を加えて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。この操作を計3回行った。
50 mM ホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液、144.4μLの5 mMのEDTA(pH 8.4)に、実施例1で調製した20.9μLのVHH-STM複合体溶液と、上記(2)で調製した1.0μLのヨードアセチル化プルラン溶液を加えて、4℃で12時間撹拌した。反応溶液をアミコンウルトラ-0.5デバイス(NMWL:100 k)に移して、14,000×g、4℃で10分間遠心分離を行った。膜透過液を廃棄した後、濃縮液に400μLのホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH 8.4)を加えて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。この操作をもう一度繰り返した後、濃縮液を、2,000×g、4℃で2分間遠心分離を行い、VHH抗体-プルラン結合体を得た。
(5-1)試薬の準備
実施例2で得られたVHH抗体-プルラン結合体を、50 mM Sodium borate buffer、5 mM EDTA(pH 8.4)で100倍希釈したVHH-プルラン結合体溶液を調製した。
50 mM Tris-HCl、138 mM NaCl、2.7 mM KCl (TBS、pH 7.6)、0.1% Tween-20を洗浄バッファーとして用いた。また、50 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl、2.7 mM KCl (TBS、pH 7.6)、0.05% Tween-20、2 mg/mL Bovine Serum Albumin (Fraction V, Fatty Acids/IgG/Protease Free, WAKO, #017-25771) を反応バッファーとして用いた。
96穴マイクロプレートにVHH抗体(10 μg/mL, 100 μL/well)、又はVHH抗体-プルラン結合体溶液を100 μL/wellとなるように加え、4℃で12時間静置した。溶液を取り除き、スキムブロッカー原液(和光純薬工業(株)製)を200 μL/wellとなるように加えて室温で2時間静置した。溶液を取り除いて上記洗浄バッファーで3回洗浄した後、L-システイン/50 mMホウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液及び5 mM EDTA(pH8.4)を100 μL/wellとなるように加えて、室温で1時間静置した。溶液を取り除いて上記洗浄バッファーで3回洗浄した後、上記サバイビン希釈系列を100 μL/wellとなるように加えて室温で1時間静置した。
マウス抗サバイビンモノクローナル抗体(#WH0000332M1)はSigma-Aldrich社から購入した。96穴マイクロプレートにマウス抗サバイビンモノクローナル抗体のPBS(-)溶液(1 μg/mL)を100 μL/wellとなるように加え、4℃で12時間静置した。以後の操作は上述のサンドイッチELISAと同様に行った。
結果を図7に示す。比較例2の抗原検出の感度は比較例1より高かったが、本発明の実施例1は、通常抗体の感度を上回ることが確認された。
(1)VHH-STM複合体の形成
VHH抗体-多糖結合体を固相化する場合、親水性の足場である多糖は、疎水性相互作用にほとんど寄与し得ない。このため、固相表面との物理吸着に関与しているのは、VHH抗体-多糖結合体に含まれるVHH抗体のうち、1つ又は複数のVHH抗体であると考えられた。この場合、固相表面と接触しているVHH抗体がいかに活性を維持しながら抗原結合に寄与するかが検出感度の向上には極めて重要である。この点を確認するために、以下の実験を行った。固相表面に吸着したVHH抗体又はVHH抗体複合体が抗原と結合しているときのイメージ図を、参考図2に示す。
Met Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Asn Thr
Asp Met Ile Met Ile Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
Gly Val Leu Ala Ala Ile Tyr Lys Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
Cys Ala Ala Ile Arg Ala Val Ile Gly Arg His Ile Arg Pro His Ile
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gly Gly Gly Ser His His
His His His His Gly Gly Ser [配列番号10]
上記実施例と同様の方法で評価を行った。その結果、図8に示すように、STMを持たないVHH抗体と比較して、VHH-STM複合体の方が、100 ng/mLの濃度で抗原検出感度が明らかに高いことが示された。以上の結果から、クッションタンパク質の存在が固相化にともなうVHH抗体の失活や剥離を効果的に抑制していることが確認された。
また、以上の結果から、図2の(A)と(B)とに模式的に示されるように、クッションタンパクを含む場合と含まない場合とを比較すると、クッションタンパク質を含むVHH抗体では固相化後も抗原結合活性が維持され、結果として検出感度が向上していた。多糖連結体においても同様の効果を期待できる。
従って、VHH抗体-多糖連結体(図2の(C))よりもVHH抗体-クッションタンパク-多糖連結体(図2の(D))は検出感度が高いと結論付けられた。
従来技術4では、クッションタンパク質が存在すれば、クッションタンパク質がない状態の活性(固相結合前を100%とした場合に、8%程度)よりも4倍程度は高くなることが示され、VHH抗体の活性が維持されたことでELISA検出感度の向上につながったものと考えられた。しかし、クッションタンパク質を使用しただけでは、全長抗体を使用して検出を行なった場合の検出感度には及ばなかった(図7参照)。
以上の通り、多糖を足場とし、クッションタンパク質を介して単鎖抗体を結合させることによって、全長抗体を使用した場合以上の高い感度での標的タンパク質の検出が可能となった。
AB2:二次抗体
AG:抗原
EL:酵素標識
L:リンカー
PS:多糖類
SP:固相表面
VH:VHH抗体
配列番号2:PCR用フォワードプライマー
配列番号3:PCR用フォワードプライマー
配列番号4:PCR用フォワードプライマー
配列番号5:PCR用リバースプライマー
配列番号6:発現ベクター用シグナル配列
配列番号7:発現ベクター用シグナル配列
配列番号8:発現ベクター用シグナル配列
配列番号9:発現ベクター用シグナル配列
配列10:STMを含まないVHH抗体(R7-A)の配列
Claims (6)
- 水溶性多糖類、低分子抗体分子、並びに前記水溶性多糖類及び前記低分子抗体分子とをつなぐリンカーと、を含む免疫測定用抗体-多糖結合体であって、
前記リンカーは、前記低分子抗体分子のアミノ酸残基と反応する反応性官能基と、クッションタンパク質とを含み、
前記水溶性多糖類はプルランである、ことを特徴とする、免疫測定用抗体-多糖結合体。 - 前記反応性官能基は、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ピリジルジスルフィド基からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする、請求項1に記載の免疫測定用抗体-多糖結合体。
- 前記クッションタンパク質は、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体及びジェラチンからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の免疫測定用抗体-多糖結合体。
- 前記低分子抗体分子は、VHH抗体、IgNAR抗体、scFv及びペプチドアプタマーからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする、請求項1~3のいずれかに記載の免疫測定用抗体-多糖結合体。
- 請求項1~4のいずれかに記載の免疫測定用抗体-多糖結合体を用いた免疫測定方法。
- 前記免疫測定方法は、ELISA法又はイムノクロマト法であることを特徴とする、請求項5に記載の免疫測定方法。
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---|---|---|---|---|
JP2003194821A (ja) | 2001-12-27 | 2003-07-09 | Eiken Chem Co Ltd | 水溶性担体−抗体複合体の製造方法および使用方法 |
JP2005257275A (ja) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | バイオチップおよびその製造方法、ならびに該チップを用いた化学物質の相互作用検出方法 |
JP2008054599A (ja) | 2006-08-31 | 2008-03-13 | Okayama Univ | Ss25ペプチド、ss25’ペプチド、および/またはクッションタンパク質を含む、クッション性吸着剤 |
JP2009530639A (ja) | 2006-03-20 | 2009-08-27 | インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 電気化学的検出のための水溶性コンジュゲート |
JP2010286467A (ja) | 2008-12-04 | 2010-12-24 | Fujifilm Corp | 断片化抗体固定化担体及びその製造方法 |
JP2011520786A (ja) | 2008-04-18 | 2011-07-21 | ユニヴァーシティ オブ リーズ | 修飾されたステフィンaスカフォールドタンパク質 |
WO2014109327A1 (ja) | 2013-01-11 | 2014-07-17 | コニカミノルタ株式会社 | センサーチップの製造方法 |
-
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003194821A (ja) | 2001-12-27 | 2003-07-09 | Eiken Chem Co Ltd | 水溶性担体−抗体複合体の製造方法および使用方法 |
JP2005257275A (ja) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | バイオチップおよびその製造方法、ならびに該チップを用いた化学物質の相互作用検出方法 |
JP2009530639A (ja) | 2006-03-20 | 2009-08-27 | インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 電気化学的検出のための水溶性コンジュゲート |
JP2008054599A (ja) | 2006-08-31 | 2008-03-13 | Okayama Univ | Ss25ペプチド、ss25’ペプチド、および/またはクッションタンパク質を含む、クッション性吸着剤 |
JP2011520786A (ja) | 2008-04-18 | 2011-07-21 | ユニヴァーシティ オブ リーズ | 修飾されたステフィンaスカフォールドタンパク質 |
JP2010286467A (ja) | 2008-12-04 | 2010-12-24 | Fujifilm Corp | 断片化抗体固定化担体及びその製造方法 |
WO2014109327A1 (ja) | 2013-01-11 | 2014-07-17 | コニカミノルタ株式会社 | センサーチップの製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. Immunoassay Immunochem.,2012年,vol.33, no.3,pp.234-251 |
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