KR102612555B1 - 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 면역침강(immunoprecipitation)용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질, 상기 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강용 키트, 및 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법에 관한 것이다.

Description

항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법{IMMUNOPRECIPITATION USING ANTIBODY BINDING PROTEIN-CALSEQUESTRIN FUSION PROTEIN}

본 발명은 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 면역침강(immunoprecipitation)용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질, 상기 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강용 키트, 및 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법에 관한 것이다.

면역침강법(Immunoprecipitation, IP)은 항원과 항체의 특이적 면역 반응성을 이용하여, 용액으로부터 항원(또는 항원과 친화성을 가진 단백질)을 분리하는 기술로서, 항원의 분자량의 결정, 단백질의 상호작용 연구, 특정 효소 활성의 측정, 단백질의 전사후 변화 모니터링과 단백질의 양과 존재유무 등을 확인하기 위하여 널리 사용되고 있다. 면역침강법에서 단백질과 단백질의 상호작용을 확인하기 위해서는 단백질과 결합한 항체를 효과적으로 탐지할 수 있는 침강제의 역할이 꼭 필요하다.

항체의 바인딩 파트너인 프로테인 A(Protein A)는 42kDa의 크기로 스타필로코쿠스 아레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 발견된 세포 표면 단백질이다. 이 단백질의 본 기능은 숙주세포의 면역 공격을 회피하기 위해 항체가 미생물의 항원을 인식하고 포식세포의 수용체와 결합하기 이전에 먼저 프로테인 A(Protein A)가 항체의 Fc 부분에 결합함으로써 항체-수용체 간의 반응을 방해함으로 면역 유도 반응을 회피시키는 것이다. 이 단백질은 다섯 개의 상동 도메인으로 구성되어 있고, 알파 헬릭스 구조를 이룬다. 또한, 각 도메인은 서로 다른 면역글로불린에 결합하는 특성을 가진다. 프로테인 A(Protein A) 뿐만 아니라 면역글로불린에 결합력을 가지는 바인딩 파트너로는 프로테인 실리카 형성G(Protein G) 그리고 프로테인 L(Protein L) 또한 발견되어 보고되었다. 현재 바이오 산업에서는 프로테인 A(Protein A), 프로테인 G(Protein G), 또는 A/G의 혼합품을 주로 생산하고 상용화 되고 있다. 하지만, 이들 제품들은 사용량 대비 추출 단백질량이 작아 효율적인 면역침강을 수행하기에는 한계가 존재한다. 또한 기존 제품의 침강제로 이용되는 아가로우즈(Agarose) 비드는 비특이적 흡착이 높아 원하지 않는 단백질도 침강되는 한계가 존재한다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0041801호

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, Z-도메인, 단백질 A, 단백질 G와 같은 항체결합단백질과 칼시퀘스트린의 융합단백질을 이용하여 항원 및 항체의 면역침강 (immunoprecipitation)을 수행하는 경우, 항원 및 항체가 높은 순도로 분리될 수 있음을 확인한 후, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 면역침강(immunoprecipitation)용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 제공하는 것으로 목적으로 한다.

본 발명은 또한 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강(immunoprecipitation)용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법(immunoprecipitation)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "융합단백질"은 서로 별개로 코딩되던 두 개 이상의 유전자를 결합(joining)시켜 제조한 단백질을 의미한다. 상기 융합단백질은 재조합 DNA 기술을 통하여 인공적으로 제조할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 생리활성 단백질 또는 펩타이드와 면역글로불린 Fc 단편이 링커 없이 연결된 형태, 또는 펩타이드성 링커를 통하여 연결된 형태일 수 있다. 여기서, 펩타이드성 링커란, 융합단백질을 구성하는 두 종류의 단백질을 서로 연결하는 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드성 링커는 융합단백질의 구성요소인 두 단백질이 융합단백질 형태에서도 독립적으로 접히거나(folding), 각각의 기능을 유지할 수 있도록 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역글로불린 Fc 단편"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(derivatives)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 것을 의미하고 자연적으로 발생하거나 인위적으로 발생시킬 수 있다. 면역글로불린의 Fc 단편은 결실, 삽입, 비상보적 또는 상보적 치환 또는 이들의 조합에 의한 유도체를 포함한다. 삽입은 통상적으로 약 1개 내지 20개 아미노산의 연속 서열로 이루어지나, 보다 큰 삽입도 가능하다. 결실은 통상적으로 약 1개 내지 30개의 잔기로 이루어진다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편의 서열 유도체를 제조하는 기술은, 본 명세서에 참고로서 포함되는, 국제특허 공개 WO97/34631호, 국제특허 공개 WO96/32478호 등에 개시되어 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 사이의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화, 황산화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화, 파네실화(farnesylation), 아세틸화, 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니아 피그 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인(papain)을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신(pepsin)을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab')2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc 단편은 미생물로부터 유래한 단백질A, 단백질G, 단백질A/G 또는 단백질 L을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "칼시퀘스트린(calsequestrin)"은 근소포체(sarcoplasmic reticulum)의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근소포체에서 칼슘의 농도가 더 높을 지라도 근육 수축 후에 칼슘과 결합하여 근소포체의 시스터나에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 한다. 하나의 칼시퀘스트린 분자가 여러 칼슘(예를 들면, 칼시퀘스트린 한 분자당 40-50개의 칼슘 결합 부위를 가짐)과 결합할 수 있기 때문에 칼슘 저장 능력이 매우 우수하다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항체결합단백질”은 항체의 Fc 부위에 결합하는 활성을 가진 단백질로서, 이러한 활성을 가진 단백질, 펩티드는 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하기는, 상기 항체결합단백질은 Z 단백질, 단백질 G, 단백질 A 또는 단백질 A/G일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Z 단백질"은 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 얻어진 것으로, 이는 숙주세포 내에 존재하는 항체에 대한 방어 작용에 사용되는 단백질을 의미한다. 상기 Z 단백질은 숙주세포 내 항체의 Fc 부위와 결합하여 마크로파지(macrophage)에 의한 식균작용이 일어나지 못하게 하는 자기 방어 기작으로 사용된다. 단백질 A에서 항체와 결합하는 부위만을 조작하여 만든 탠덤 리피트 다이머(tandem repeat dimer)를 "Z 도메인"이라 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “단백질 A” 항체의 Fc 영역에 높은 친화력 (인간 IgG에 약 10^-8 M)으로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레아스(Staphylococcus aureas)의 대부분의 균주에서 발견되는 약 42 kD 세포벽 단백질을 의미한다. 상기 단백질 A는 이의 천연 공급원에서 회수된 단백질 A, (예를 들면, 펩티드 합성, 재조합 기술 등에 의해) 합성 생성된 단백질 A, 및 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질을 결합시키는 능력을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “단백질 G”는 G군 연쇄상 구균(Group G Streptococcus)으로부터의 세포벽 단백질을 의미한다. 단백질 G는 항체, 특히 IgG 항체의 Fc 영역에 높은 친화력으로 결합하는 III형 Fc 수용체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 G"는 이의 천연 공급원에서 회수된 단백질 G, (예를 들면, 펩티드 합성, 재조합 기술 등에 의해) 합성 생성된 단백질 G, 및 Fc 영역을 갖는 단백질을 결합시키는 능력을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “단백질 A/G”는 단백질 A와 단백질 G의 IgG 결합 프로파일을 조합한 유전적으로 처리된 단백질로서, 바실러스의 비병원성 형태로부터 분비된 유전자 융합 산물을 의미한다.

본 발명에 따른 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법은 종래 ProteinA-Agarose 방법에 비하여 항원 및 항체를 높은 순도로 분리할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 Z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법의 모식도를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따른 Z-CSQ1와 ZZ-CSQ1의 칼슘 농도에 따른 Turbidity 결과를 나타낸다.
도 3은 Z-CSQ1와 ZZ-CSQ1의 칼슘에 의한 크기 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 Z-CSQ1와 ZZ-CSQ1의 칼슘에 의한 침전을 농도별로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 ZZ-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Herceptin 항체 분리 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 ZZ-CSQ2 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Anti-BSA 항체 분리 확인 결과를 나타낸다.
도 7은 Z-CSQ1와 ProteinA-Agarose를 사용하여 Anti-BSA 항체와 Bovine Serum Albumin(BSA) 항원의 면역침강을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 ZZ-CSQ1와 ProteinA-Agarose를 사용하여 Trastuzumab과 HER2 항원의 면역침강을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 ZZ-CSQ2와 ProteinA-Agarose를 사용하여 Anti-VEGF 항체와 VEGF 항원의 면역침강을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 Z(5)-CSQ와 ProteinA-Agarose를 사용하여 Anti-BSA 항체와 Bovine Serum Albumin(BSA) 항원의 면역침강을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 CSQ-proteinA와 ProteinA-Agarose를 사용하여 Anti-BSA 항체와 Bovine Serum Albumin(BSA) 항원의 면역침강을 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 CSQ-proteinG 와 ProteinA-Agarose를 사용하여 Anti-BSA 항체와 Bovine Serum Albumin(BSA) 항원의 면역침강을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 구체적인 구현예에 따른 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법에 대하여 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 하나의 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니며, 발명의 권리범위 내에서 구현예에 대한 다양한 변형이 가능함은 당업자에게 자명하다.

본 명세서 전체에서 특별한 언급이 없는 한 "포함" 또는 "함유"라 함은 어떤 구성 요소(또는 구성 성분)를 별다른 제한 없이 포함함을 지칭하며, 다른 구성 요소(또는 구성 성분)의 부가를 제외하는 것으로 해석될 수 없다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 면역침강(immunoprecipitation)용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 제공하고자 하는 것으로,

상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,

상기 항체결합단백질은 Z-도메인, 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역침강용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질에 있어서, 상기 항체결합단백질은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 Z-도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A/G인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역침강용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질에 있어서, 상기 항체는 CD3(예를 들면, OKT3), CD52(예를 들면, alemtuzumab; Campath®), VEGF(예를 들면, bevacizumab; Avastin®), BSA, EGFR(예를 들면, cetuximab; Erbitux®), CD33(예를 들면, gemtuzumab; Mylotarg®), CD20(예를 들면, rituximab; Rituxan®; tositumomab; Bexxar®; ibritumomab; Zevalin®), HER-2(예를 들면, trastuzumab; Herceptin®), TNFα(예를 들면, adalimumab; Humira®, infliximab; Remicade®; etanercept; Embrel®), CD25(예를 들면, daclizumab; Zenapax®; basiliximab; Simulect®), RSV(예를 들면, palivizumab; Synagis®), IgE(예를 들면, omalizumab; Xolair®), gp Ilb/IIIa(예를 들면, abciximab; Reopro®), CD11a(예를 들면, efalizumab; Raptiva®) 및 α4 인테그린(예를 들면, natalizumab; Tysabri®)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원과 결합하는 것을 특징으로 한다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강(immunoprecipitation)용 키트를 제공하고자 하는 것으로,

상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,

상기 항체결합단백질은 Z-도메인, 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강용 키트에 있어서, 상기 항체결합단백질은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 Z-도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A/G인 것을 특징으로 한다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법(immunoprecipitation)으로, 상기 방법은:

(A-1) 항원을 함유하는 시료에 항체를 첨가하여 항원-항체 복합체를 형성한 후, 상기 항원-항체 복합체에 항체결합단백질 - 칼시퀘스트린(CSQ) 융합단백질을 첨가하여 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 형성하는 단계; 또는 (A-2) 항체와 항체결합단백질 - 칼시퀘스트린(CSQ) 융합단백질을 결합시켜 항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 형성한 후, 상기 항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 항원을 함유하는 시료에 첨가하여 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 형성하는 단계;

(B) 칼슘을 이용하여 상기 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 면역침강시키는 단계; 및

(C) 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하는 단계를 포함하고,

상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,

상기 항체결합단백질은 Z-도메인, 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법의 일 예시적인 모식도를 도 1에 나타내었다.

본 발명에 따른 면역침강 방법에 있어서, 상기 항체결합단백질은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 Z-도메인, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A/G인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역침강 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (C) 이전에 상기 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역침강 방법에 있어서, 상기 방법은 (D) 항원-특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blotting)을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역침강 방법에 있어서, 상기 칼슘의 농도는 1 mM 내지 100 mM인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역침강 방법에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직부검시료, 세포배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균발현계로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1. Z-도메인-칼시퀘스트린 융합단백질의 제조

하기의 표 1에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 Z-도메인 및 칼시퀘스트린을 포함하는 Z 도메인-칼시퀘스트린 융합단백질을 디자인하였다.

No.	아미노산 서열번호
	융합단백질	Z 도메인	칼시퀘스트린
제조예 １	Z-CSQ１	서열번호 4	서열번호 1
제조예 ２	ZZ-CSQ1	서열번호 5	서열번호 1
제조예 ３	ZZ-CSQ２	서열번호 5	서열번호 2
제조예 ４	Z（５）-CSQ１	서열번호 6	서열번호 1
제조예 5	CSQ１ -PROTEIN A	서열번호 7	서열번호 1
제조예 6	CSQ 1 -PROTEIN G	서열번호 8	서열번호 1

실시예 2: Z-CSQ1　및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 칼슘에 의한 Turbidity 측정

Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 Turbidity 확인을 위하여 각 단백질의 농도를 1mg/ml로 하여 Turbidity를 측정하였다. 융합단백질의 버퍼로는 20mM Tris-HCl (pH7.0)을 사용하였고, 융합단백질에 칼슘을 0, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15 및 20 mM의 농도로 첨가 및 혼합하고, 융합단백질들이 칼슘과 반응할 수 있도록 4℃에서 1hr 동안 반응시켰다. Nano-drop(Thermo)를 사용하여 UV-Vis (350nm)에서 각 농도 별 흡광도 값을 측정하였다. 그 결과, Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질 모두 2mM 칼슘에서부터 응집체가 형성되는 것으로 확인되었다 (도 2).

실시예 3: Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 칼슘에 의한 크기 측정

Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 칼슘에 의한 크기를 알아보기 위하여 각 단백질의 농도를 1mg/ml로 하여 측정하였다. 융합단백질의 버퍼로는 20mM Tris-HCl (pH7.0)을 사용하였고, 융합단백질에 칼슘을 0 및 2mM 농도 첨가 및 혼합한 후 각 융합단백질들이 칼슘과 반응할 수 있도록 4℃에서 1hr 동안 반응시켰다. Zeta Sizer Nano Range(ELSZ-2000, Otsuka)를 사용하여 Hydrodynamic size를 측정하였다. 그 결과, Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질 모두 2mM의 칼슘농도부터 2,000nm 크기의 응집체가 형성되는 것으로 확인되었다 (도 3).

실시예 4 Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 칼슘에 의한 침전도 확인

Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 칼슘에 의한 침전도를 알아보기 위하여, Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질의 융합단백질에 0, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15 및 20mM의 칼슘을 넣고 교반한 후 4℃에서 1hr 동안 반응시켰다. 그 다음, 상기 반응 혼합물을 4℃에서 30분 동안 4000g로 원심분리하였다. 원심분리하여 얻어진 침전물을 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시키고, 4X sample buffer를 넣고 80℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)으로 침전도를 확인하였다, 그 결과, Z-CSQ1 및 ZZ-CSQ1 융합단백질 모두 2mM의 칼슘농도부터 반응하여 침전되는 것으로 확인되었다 (도 4).

실시예 5: ZZ-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Trastuzumab 항체 분리 확인

ZZ-CSQ1 융합단백질의 용액에서 항체 분리가 가능한지 여부를 확인하기 위해서 Escherichia coli (E. coli) 세포를 초음파 분쇄하여 원심분리 한 상층액에 Trastuzumab (Herceptin) 항체를 섞어 반응 시료를 만들었다. 3mg/ml 농도의 ZZ-CSQ1를 반응액에 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 칼슘을 첨가 후 다시 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 비교예로서 ProteinA-Agarose도 동일한 방법으로 반응시켰다. 각 반응물들을 4℃에서 30분 동안 4000g로 원심분리하고, 생성된 침전물을 20mM Tris-HCl (pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 융합단백질의 항체 분리 확인을 위해 4X protein sample buffer를 넣고 80℃에서 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, ZZ-CSQ 융합단백질은 비교예로서 ProteinA-Agarose에 비해 명확하게 항체를 칼슘에 의해 면역침강하여 분리할 수 있는 것으로 확인되었다 (도 5).

실시예 6: ZZ-CSQ2 융합단백질와 Protein A-Agarose의 Anti-BSA 항체 분리 확인

상기 실시예 5에서 만든 Escherichia coli (E. coli) 배양액을 초음파 분쇄하여 원심분리 한 상층액에 Bovine Serum Albumin(BSA)-Antibody를 섞어 BSA antibody 반응액을 제조하였다. ZZ-CSQ2 융합단백질과 ProteinA-Agarose를 각각 넣고 4℃, 30분 반응하였다. ZZ-CSQ2 융합단백질에는 5mM 칼슘을 넣고 4℃, 30분 반응하였다. 반응액을 4℃, 30분, 4000g 원심분리 하여 상등액과 침전물로 나누고, 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 ZZ-CSQ2 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 항체 분리 확인을 위해 4X sample buffer를 넣고, 80℃, 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)으로 확인하였다(도 6).

<실험예>

실험예 1: Z-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Anti-BSA 항체와 BSA 항원의 면역침강 확인

Z-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 상기 실시예 5에서 제조한 Escherichia coli (E.coli) 배양액을 초음파 분쇄하여 원심분리 한 상층액에 Bovine Serum Albumin(BSA)와 BSA-antibody를 넣은 반응액을 제조하였다. Z-CSQ1과 ProteinA-Agarose를 각각 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 Z-CSQ1에 칼슘을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 반응액을 4℃에서 30분 동안 4000g 원심분리하여 상등액과 침전물로 나누고, 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 Z-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 4X sample buffer를 넣고, 80℃에서 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, 그 결과, 본 발명에 따른 ZZ-CSQ1 융합단백질을 사용한 경우, anti-BSA 항체와 BSA 항원이 ProteinA-Agarose에 비해 높은 순도로 분리되는 것으로 확인되었다 (도 7).

실험예 2: ZZ-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Trastuzumab(Herceptin) 항체와 HER2 항원의 면역침강 확인

ZZ-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Trastuzumab의 면역침강 확인을 위해 상기 실시예 5에서 제조한 Escherichia coli (E.coli) 배양액을 초음파 분쇄하여 원심분리 한 상층액에 Trastuzumab과 HER2 항원을 넣은 반응액을 제조하였다. ZZ-CSQ1와 ProteinA-Agarose를 각각 넣고 4℃에서 30분 동안 반응 후 ZZ-CSQ1에 칼슘을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 반응액을 4℃에서 30분 동안 4000g 원심분리하여 상등액과 침전물로 나누고, 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 ZZ-CSQ1 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강을 확인을 위하여 4X sample buffer를 넣고, 80℃, 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 ZZ-CSQ1 융합단백질을 사용한 경우, Trastuzumab과 HER2 항원이 서로 결합하였으며, ProteinA-Agarose에 비해 높은 순도로 분리되는 것으로 확인되었다 (도 8).

실험예 3: ZZ-CSQ2 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Anti-VEGF 항체와 VEGF 항원의 면역침강 확인

ZZ-CSQ2 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 상기 실시예 5에서 제조한 항체반응액을 사용하였다. Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)와 Avastin을 넣은 반응액에 ZZ-CSQ2와 ProteinA-Agarose를 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 ZZ-CSQ2에 칼슘을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 반응액을 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상등액과 침전물로 나누고, 생성된 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 ZZ-CSQ2 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위하여 4X sample buffer를 넣고, 80℃, 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 ZZ-CSQ2 융합단백질을 사용한 경우, anti-VEGF 항체와 VEGF 항원이 ProteinA-Agarose에 비해 높은 순도로 분리되는 것으로 확인되었다 (도 9).

실험예 4: Z(5)-CSQ 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Anti-BSA 항체와 BSA 항원의 면역침강 확인

Z(5)-CSQ 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 상기 실시예 5에서 제조한 항체반응액을 사용하였다. Bovine Serum Albumin(BSA)와 BSA-antibody를 넣은 반응액에 Z(5)-CSQ 와 ProteinA-Agarose를 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, Z(5)-CSQ에 칼슘을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 반응액을 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상등액과 침전물로 나누고, 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 Z(5)-CSQ 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 4X sample buffer를 넣고, 80℃에서 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 Z(5)-CSQ1 융합단백질을 사용한 경우, anti-BSA 항체와 BSA 항원이 ProteinA-Agarose에 비해 높은 순도로 분리되는 것으로 확인되었다 (도 10).

실험예 5: CSQ-proteinA 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Bovine Serum Albumin (BSA) 면역침강 확인

CSQ-proteinA 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 상기 실시예 5에서 제조한 항체반응액을 사용하였다. Bovine Serum Albumin(BSA)와 BSA-antibody를 넣은 반응액에 CSQ-proteinA와 ProteinA-Agarose를 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 CSQ-proteinA에 칼슘을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 반응액을 4℃, 30분 원심분리하여 상등액과 침전물로 나누고, 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 CSQ-proteinA 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 4X sample buffer를 넣고, 80℃에서 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 CSQ-proteinA 융합단백질을 사용한 경우, Anti-BSA 항체와 BSA 항원이 ProteinA-Agarose에 비해 높은 순도로 분리되는 것으로 확인되었다 (도 11).

실험예 6: CSQ-proteinG 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 Bovine Serum Albumin (BSA) 면역침강 확인

CSQ-proteinG 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 상기 실시예 5에서 제조한 항체반응액을 사용하였다. Bovine Serum Albumin(BSA)와 BSA-antibody를 넣은 반응액에 CSQ-proteinG와 ProteinA-Agarose를 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 CSQ-proteinG에 칼슘을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 반응액을 4℃, 30분 원심분리하여 상등액과 침전물로 나누고, 침전물은 20mM Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 넣고 용해시킨 후 CSQ-proteinG 융합단백질과 ProteinA-Agarose의 면역침강 확인을 위해 4X sample buffer를 넣고, 80℃에서 10분 동안 열처리 후 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 CSQ-proteinG 융합단백질을 사용한 경우, Anti-BSA 항체와 BSA 항원이 ProteinA-Agarose에 비해 높은 순도로 분리되는 것으로 확인되었다 (도 12).

실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> IMMUNOPRECIPITATION USING ANTIBODY BINDING PROTEIN-CALSEQUESTRIN FUSION PROTEIN <130> DP-2020-0284 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ1 <400> 1 Gln Glu Gly Leu Asp Phe Pro Glu Tyr Asp Gly Val Asp Arg Val Ile 1 5 10 15 Asn Val Asn Ala Lys Asn Tyr Lys Asn Val Phe Lys Lys Tyr Glu Val 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Tyr His Glu Pro Pro Glu Asp Asp Lys Ala Ser Gln 35 40 45 Arg Gln Phe Glu Met Glu Glu Leu Ile Leu Glu Leu Ala Ala Gln Val 50 55 60 Leu Glu Asp Lys Gly Val Gly Phe Gly Leu Val Asp Ser Glu Lys Asp 65 70 75 80 Ala Ala Val Ala Lys Lys Leu Gly Leu Thr Glu Val Asp Ser Met Tyr 85 90 95 Val Phe Lys Gly Asp Glu Val Ile Glu Tyr Asp Gly Glu Phe Ser Ala 100 105 110 Asp Thr Ile Val Glu Phe Leu Leu Asp Val Leu Glu Asp Pro Val Glu 115 120 125 Leu Ile Glu Gly Glu Arg Glu Leu Gln Ala Phe Glu Asn Ile Glu Asp 130 135 140 Glu Ile Lys Leu Ile Gly Tyr Phe Lys Ser Lys Asp Ser Glu His Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Phe Glu Asp Ala Ala Glu Glu Phe His Pro Tyr Ile Pro Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Phe Asp Ser Lys Val Ala Lys Lys Leu Thr Leu Lys Leu 180 185 190 Asn Glu Ile Asp Phe Tyr Glu Ala Phe Met Glu Glu Pro Val Thr Ile 195 200 205 Pro Asp Lys Pro Asn Ser Glu Glu Glu Ile Val Asn Phe Val Glu Glu 210 215 220 His Arg Arg Ser Thr Leu Arg Lys Leu Lys Pro Glu Ser Met Tyr Glu 225 230 235 240 Thr Trp Glu Asp Asp Met Asp Gly Ile His Ile Val Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Glu Ala Asp Pro Asp Gly Phe Glu Phe Leu Glu Thr Leu Lys Ala Val 260 265 270 Ala Gln Asp Asn Thr Glu Asn Pro Asp Leu Ser Ile Ile Trp Ile Asp 275 280 285 Pro Asp Asp Phe Pro Leu Leu Val Pro Tyr Trp Glu Lys Thr Phe Asp 290 295 300 Ile Asp Leu Ser Ala Pro Gln Ile Gly Val Val Asn Val Thr Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Trp Met Glu Met Asp Asp Glu Glu Asp Leu Pro Ser Ala 325 330 335 Glu Glu Leu Glu Asp Trp Leu Glu Asp Val Leu Glu Gly Glu Ile Asn 340 345 350 Thr Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 355 360 <210> 2 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ2(Delta) <400> 2 Glu Glu Gly Leu Asn Phe Pro Thr Tyr Asp Gly Lys Asp Arg Val Val 1 5 10 15 Ser Leu Ser Glu Lys Asn Phe Lys Gln Val Leu Lys Lys Tyr Asp Leu 20 25 30 Leu Cys Leu Tyr Tyr His Glu Pro Val Ser Ser Asp Lys Val Thr Pro 35 40 45 Lys Gln Phe Gln Leu Lys Glu Ile Val Leu Glu Leu Val Ala Gln Val 50 55 60 Leu Glu His Lys Ala Ile Gly Phe Val Met Val Asp Ala Lys Lys Glu 65 70 75 80 Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Gly Phe Asp Glu Glu Gly Ser Leu Tyr 85 90 95 Ile Leu Lys Gly Asp Arg Thr Ile Glu Phe Asp Gly Glu Phe Ala Ala 100 105 110 Asp Val Leu Val Glu Phe Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Pro Val Glu 115 120 125 Ile Ile Ser Ser Lys Leu Glu Val Gln Ala Phe Glu Arg Ile Glu Asp 130 135 140 Tyr Ile Lys Leu Ile Gly Phe Phe Lys Ser Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Phe Glu Glu Ala Ala Glu His Phe Gln Pro Tyr Ile Lys Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Phe Asp Lys Gly Val Ala Lys Lys Leu Ser Leu Lys Met 180 185 190 Asn Glu Val Asp Phe Tyr Glu Pro Phe Met Asp Glu Pro Ile Ala Ile 195 200 205 Pro Asn Lys Pro Tyr Thr Glu Glu Glu Leu Val Glu Phe Val Lys Glu 210 215 220 His Gln Arg Pro Thr Leu Arg Arg Leu Arg Pro Glu Glu Met Phe Glu 225 230 235 240 Thr Trp Glu Asp Asp Leu Asn Gly Ile His Ile Val Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Lys Ser Asp Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Gln Val 260 265 270 Ala Arg Asp Asn Thr Asp Asn Pro Asp Leu Ser Ile Leu Trp Ile Asp 275 280 285 Pro Asp Asp Phe Pro Leu Leu Val Ala Tyr Trp Glu Lys Thr Phe Lys 290 295 300 Ile Asp Leu Phe Arg Pro Gln Ile Gly Val Val Asn Val Thr Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Trp Met Glu Ile Pro Asp Asp Asp Asp Leu Pro Thr Ala 325 330 335 Glu Glu Leu Glu Asp Trp Ile Glu Asp Val Leu Ser Gly Lys Ile Asn 340 345 350 Thr Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp 355 360 <210> 3 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ2(full) <400> 3 Glu Glu Gly Leu Asn Phe Pro Thr Tyr Asp Gly Lys Asp Arg Val Val 1 5 10 15 Ser Leu Ser Glu Lys Asn Phe Lys Gln Val Leu Lys Lys Tyr Asp Leu 20 25 30 Leu Cys Leu Tyr Tyr His Glu Pro Val Ser Ser Asp Lys Val Thr Pro 35 40 45 Lys Gln Phe Gln Leu Lys Glu Ile Val Leu Glu Leu Val Ala Gln Val 50 55 60 Leu Glu His Lys Ala Ile Gly Phe Val Met Val Asp Ala Lys Lys Glu 65 70 75 80 Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Gly Phe Asp Glu Glu Gly Ser Leu Tyr 85 90 95 Ile Leu Lys Gly Asp Arg Thr Ile Glu Phe Asp Gly Glu Phe Ala Ala 100 105 110 Asp Val Leu Val Glu Phe Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Pro Val Glu 115 120 125 Ile Ile Ser Ser Lys Leu Glu Val Gln Ala Phe Glu Arg Ile Glu Asp 130 135 140 Tyr Ile Lys Leu Ile Gly Phe Phe Lys Ser Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Phe Glu Glu Ala Ala Glu His Phe Gln Pro Tyr Ile Lys Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Phe Asp Lys Gly Val Ala Lys Lys Leu Ser Leu Lys Met 180 185 190 Asn Glu Val Asp Phe Tyr Glu Pro Phe Met Asp Glu Pro Ile Ala Ile 195 200 205 Pro Asn Lys Pro Tyr Thr Glu Glu Glu Leu Val Glu Phe Val Lys Glu 210 215 220 His Gln Arg Pro Thr Leu Arg Arg Leu Arg Pro Glu Glu Met Phe Glu 225 230 235 240 Thr Trp Glu Asp Asp Leu Asn Gly Ile His Ile Val Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Lys Ser Asp Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Gln Val 260 265 270 Ala Arg Asp Asn Thr Asp Asn Pro Asp Leu Ser Ile Leu Trp Ile Asp 275 280 285 Pro Asp Asp Phe Pro Leu Leu Val Ala Tyr Trp Glu Lys Thr Phe Lys 290 295 300 Ile Asp Leu Phe Arg Pro Gln Ile Gly Val Val Asn Val Thr Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Trp Met Glu Ile Pro Asp Asp Asp Asp Leu Pro Thr Ala 325 330 335 Glu Glu Leu Glu Asp Trp Ile Glu Asp Val Leu Ser Gly Lys Ile Asn 340 345 350 Thr Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asn Ser Asp Glu 355 360 365 Glu Asp Asn Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Glu 370 375 380 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Z-DOMAIN <400> 4 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZZ <400> 5 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys 115 <210> 6 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Z(5) <400> 6 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 115 120 125 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn 130 135 140 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 165 170 175 Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 180 185 190 Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 195 200 205 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys 210 215 220 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 225 230 235 240 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu 245 250 255 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln 260 265 270 Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 275 280 285 Pro Lys 290 <210> 7 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein A <400> 7 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys Glu Glu Asp 290 <210> 8 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein G <400> 8 Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu 1 5 10 15 Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys 20 25 30 Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr 35 40 45 Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val 50 55 60 Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val 65 70 75 80 Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp 85 90 95 Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly 100 105 110 Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val 115 120 125 Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val 130 135 140 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 145 150 155 160 Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln 165 170 175 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 180 185 190 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 195 200 <210> 9 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein A/G <400> 9 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys Glu Glu Asp Ser Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr 290 295 300 Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu 305 310 315 320 Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn 325 330 335 Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr 340 345 350 Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr 355 360 365 Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys 370 375 380 Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala 385 390 395 400 Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr 405 410 415 Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 420 425

Claims (9)

1. 면역침강(immunoprecipitation)용 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질로서,
   상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,
   상기 항체결합단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A/G인 것을 특징으로 하는 것인, 융합단백질.
   
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3. 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강(immunoprecipitation)용 키트로서,
   상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,
   상기 항체결합단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A/G인 것을 특징으로 하는 것인, 면역침강용 키트.
   
   
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5. 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법(immunoprecipitation)으로, 상기 방법은:
   (A-1) 항원을 함유하는 시료에 항체를 첨가하여 항원-항체 복합체를 형성한 후, 상기 항원-항체 복합체에 항체결합단백질 - 칼시퀘스트린(CSQ) 융합단백질을 첨가하여 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 형성하는 단계; 또는 (A-2) 항체와 항체결합단백질 - 칼시퀘스트린(CSQ) 융합단백질을 결합시켜 항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 형성한 후, 상기 항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 항원을 함유하는 시료에 첨가하여 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 형성하는 단계;
   (B) 칼슘을 이용하여 상기 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 면역침강시키는 단계; 및
   (C) 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하는 단계를 포함하고,
   상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,
   상기 항체결합단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 A/G인 것을 특징으로 하는 것인, 면역침강 방법.
   
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7. 제5항에 있어서,
   상기 방법은 단계 (C) 이전에 상기 항원-항체-항체결합단백질-CSQ 복합체를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 면역침강 방법.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 방법은 (D) 항원-특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blotting)을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 면역침강 방법.
   
9. 제5항에 있어서,
   상기 칼슘의 농도는 1 mM 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 것인, 면역침강 방법.