JP2023533529A - アフィニティ精製のための免疫グロブリン結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、配列番号１のＩｇ結合タンパク質又は機能的に類似するタンパク質の４又は６又は８位に対応する分枝状側鎖を有する高疎水性アミノ酸（Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、又は芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐ）を有する１つ又は複数のドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質に関する。該新規タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）の高効率精製法のための優れた特性を有し、例えば該タンパク質は、高い結合容量及び高い化学的安定性を有する。本発明はさらに、本発明のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンのアフィニティ精製のためのこれらのＩｇ結合タンパク質又はアフィニティマトリックスの使用、及び本発明のＩｇ結合タンパク質を用いたアフィニティ精製の方法に関する。【選択図】 図２

Description

本発明は、配列番号１のＩｇ結合タンパク質又は機能的に類似するタンパク質の４又は６又は８位に対応する分枝状側鎖を有する高疎水性アミノ酸（Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、又は芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐ）を有する１つ又は複数のドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質に関する。該新規タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）の高効率精製法のための優れた特性を有し、例えば該タンパク質は、高い結合容量及び高い化学的安定性を有する。本発明はさらに、本発明のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンのアフィニティ精製のためのこれらのＩｇ結合タンパク質又はアフィニティマトリックスの使用、及び本発明のＩｇ結合タンパク質を用いたアフィニティ精製の方法に関する。

多くの生物工学的及び医薬的適用は、抗体を含有する試料からの混入物の除去を必要とする。抗体を捕捉及び精製するための確立された手順が、免疫グロブリンの選択的リガンドとしての黄色ブドウ球菌由来の細菌細胞表面プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーである（例えば、Ｈｕｓｅらによるレビュー、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１，２００２：２１７－２３１を参照）。野生型プロテインＡは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に高い親和性及び選択性で結合する。アルカリ安定性などの特性が改善されたプロテインＡのバリアントが、抗体を精製するために利用可能であり、プロテインＡリガンドを含む様々なクロマトグラフィーマトリックスが、市販されている。しかし、現在利用可能なプロテインＡを基にしたクロマトグラフィーマトリックスは、アルカリ条件への暴露後に免疫グロブリンへの結合容量の損失を示し、４未満のｐＨでの溶出条件を必要とする。

抗体又はＦｃ含有融合タンパク質のためのほとんどの大規模生成工程は、アフィニティ精製のためにプロテインＡを利用する。しかし、アフィニティクロマトグラフィーにおけるプロテインＡ適用の限界により、免疫グロブリンのアフィニティ精製を容易にするために、免疫グロブリンに特異的に結合する改善された特性を有する新規Ｉｇ結合タンパク質を提供することが、当該技術分野で必要とされている。Ｉｇ結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックスの価値を最大限に探究するためには、アフィニティリガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい。マトリックスの残存混入物の消毒及び除去のために、クロマトグラフィーサイクルの間に徹底した浄化手順が必要となる。この手順では、高濃度のＮａＯＨを含むアルカリ溶液をアフィニティリガンドマトリックスに適用することが、一般的実践である。野生型プロテインＡドメインは、長期間のそのような過酷なアルカリ条件に耐えることができず、免疫グロブリンへの結合容量を急速に損失する。さらに、アフィニティリガンドマトリックスの反復使用のためには、過酷な酸性条件下での浄化ステップが必要となる。

したがって、Ｉｇ配列を含むタンパク質、例えば抗体に結合することが可能な新規タンパク質を得ること、及び免疫グロブリンのアフィニティ精製に適用される過酷な浄化条件に耐えること、が可能な新規タンパク質を得ることが、この分野で引き続き必要とされる。

本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製に特にうまく適合するＩｇ結合タンパク質を提供する。詳細には、本発明のＩｇ結合タンパク質は、複数の利点を有する。本発明のＩｇ結合タンパク質の１つの顕著な利点は、高い力学的結合容量と共に、Ｉｇ結合容量を低減しない長期間（２日より長いなど）の高ｐＨでの改善された安定性である。さらに、本発明の新規タンパク質は、弱酸性溶出条件が必要となる抗体のアフィニティ精製に特に有用となる。

上記概要は、本発明により解決された全ての問題を必ずしも記載していない。

本発明の態様は、アフィニティ精製に適したＩｇ結合タンパク質を提供することである。

［１］これは、１つ又は複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質で実現され、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインは、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、配列番号１の４、６、又は８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又は芳香族アミノ酸である。Ｉｇ結合タンパク質は、アルカリ安定性である（０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも２０時間）。様々な態様において、Ｉｇ結合タンパク質は、１つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含んでおり、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインは、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸であり、該Ｉｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間安定している。

［２］（ａ）配列番号１の８位に対応する該アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）若しくはチロシン（Ｙ）であり、好ましくは配列番号１の８位に対応する該アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）であるか、又は（ｂ）配列番号１の４位に対応する該アミノ酸が、トリプトファン（Ｗ）若しくはフェニルアラニン（Ｆ）であるか、又は（ｃ）配列番号１の６位に対応する該アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）、トリプトファン（Ｗ）、若しくはチロシン（Ｙ）、若しくはロイシン（Ｌ）である、
項目［１］によるＩｇ結合タンパク質。

［３］配列番号１の１０、１４、１６、１７、１８又は２８位に対応する１つ又は複数のアミノ酸（複数可）が、好ましくは１４又は２８位の、ヒスチジン（Ｈ）、又はアスパラギン酸塩（Ｄ）若しくはグルタミン酸塩（Ｅ）から選択される酸性アミノ酸の群から選択される、項目［１］又は［２］によるＩｇ結合タンパク質。様々な態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有していて、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸であり、配列番号１の１４位に対応する該アミノ酸が、ヒスチジンである。様々な態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有していて、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸であり、配列番号１の１４位に対応する該アミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）であり、配列番号１の２９位に対応するアミノ酸が、リシン（Ｋ）である。好ましくは、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又は芳香族アミノ酸であり、該芳香族アミノ酸は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシン（Ｙ）のいずれかであってもよい。より好ましくは配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）であり、より好ましくは配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）である。様々な態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１の４３又は４６位に対応する位置にシステイン（Ｃ）残基を有してもよい。

［４］配列番号１の２９位に対応する該アミノ酸が、リシン（Ｋ）である、項目［１］～［３］のいずれか１つによるＩｇ結合タンパク質。

［５］該少なくとも１つのドメインが、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、又はそれからなる、項目［１］～［４］のいずれか１つによるＩｇ結合タンパク質。様々な態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号４～９、２０～３６、及び４０～４９のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号４～３６、４０～４９のいずれかに対して少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

［６］ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、Ｉｇ領域を含む融合タンパク質、及びＩｇ領域を含むコンジュゲートの１つ又は複数に結合する、項目［１］～［５］のいずれか１つによるＩｇ結合タンパク質。様々な態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、Ｆｃ領域を含むタンパク質に結合している、又はＦｃ断片に結合している。

［７］互いにつなげられた２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのドメインを含む、項目［１］～［６］のいずれか１つによるＩｇ結合タンパク質。

［８］ホモマルチマー又はヘテロマルチマーである、項目［７］によるＩｇ結合タンパク質。幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号３７、配列番号５０、又は配列番号５１の配列を含むダイマーである。

［９］固体担体に固定される、項目［１］～［８］のいずれか１つによるＩｇ結合タンパク質。幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１の４３又は４６位に対応する位置でシステイン（Ｃ）による固体担体に固定される。

［１０］アルカリ条件下で、場合により０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも２０時間安定している、項目［１］～［９］のいずれか１つによるＩｇ結合タンパク質。

［１１］前記アフィニティ分離マトリックスに連結された、項目［１］～［１０］のいずれか１つのＩｇ結合タンパク質を含む前記アフィニティ分離マトリックス。

［１２］該Ｉｇ結合タンパク質への親和性を有する任意のタンパク質のアフィニティ精製のための、項目［１］～［１０］のいずれか１つのＩｇ結合タンパク質の使用又は項目［１１］のアフィニティ分離マトリックスの使用。

［１３］ａ）Ｉｇ配列を含むタンパク質を含有する液体を提供すること；
ｂ）項目［１１］のアフィニティ分離マトリックスに連結された項目［１］～［１０］のいずれか１つの少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質を含む項目［１１］によるアフィニティ分離マトリックスを提供すること；
ｃ）Ｉｇ配列を含むタンパク質への、項目［１］～［１０］のいずれか１つによる該少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質の結合を可能にする条件下で、前記アフィニティ分離マトリックスを該液体と接触させること；及び
ｄ）Ｉｇ配列を含む前記タンパク質を前記アフィニティ精製マトリックスから溶出し、それにより前記免疫グロブリンを含有する溶離液を得ること、
を含む、Ｉｇ配列を含むタンパク質のアフィニティ精製の方法。

［１４］ステップ（ｄ）において、該Ｉｇ配列を含む該タンパク質の９５％より多くが、ｐＨ３．７以上で項目［１］～［１０］のいずれかによるＩｇ結合タンパク質を含む該アフィニティ分離マトリックスから溶出される、項目［１３］による方法。様々な態様において、ステップ（ｄ）において、該Ｉｇ配列を含む該タンパク質の９５％より多くが、ｐＨ４．５で項目［１］～［１０］のいずれかによるＩｇ結合タンパク質を含む該アフィニティ分離マトリックスから溶出される。

［１５］場合により、該Ｉｇ結合タンパク質の少なくとも９０％が０．５Ｍ ＮａＯＨでの少なくとも２０時間のインキュベーション後にＩｇ結合活性を保持する、該アフィニティ精製マトリックスをアルカリ浄化液で浄化する追加的ステップ（ｅ）を含む、項目［１３］～［１４］のいずれかによる方法。

［１６］本発明は、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを提供し、配列番号１の４、６、又は８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又は芳香族アミノ酸である。好ましくは該免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインは、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質であり、又は該Ｉｇタンパク質に対応し、配列番号１の４、６、又は８位に対応する該アミノ酸は、先の項目［１］のもとで記載された通り、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又は芳香族アミノ酸である。

本発明の概要は、本発明の全ての特色を必ずしも記載していない。他の態様は、続く詳細な記載のレビューから明白となろう。

新規Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列。最上行の数は、Ｉｇ結合タンパク質内の対応するアミノ酸位置である。 ０．５Ｍ ＮａＯＨとの２０時間のインキュベーション後にＰｒａｅｓｔｏ Ｅｐｏｘｙ８５樹脂（３５℃で１８時間連結）に連結されたＩｇ結合タンパク質の苛性安定性（ｃａｕｓｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）。６ｍｇ ＧａｍｍｍａｎｏｒｍでのＳＢＣ決定。三番目のヘリックス内に配置されたシステイン（４３Ｃの位置）を介してバリアント及び親物質を樹脂に連結。バリアント８Ｉ、８Ｖ、８Ｆ、８Ｗ、８Ｌ、及び８Ｙは、親分子（ｃｓ２６）に比較して、アルカリ条件での長期インキュベーション後の残存活性の有意な改善を示す。 ０．５Ｍ ＮａＯＨとの２０時間のインキュベーション後にＰｒａｅｓｔｏ Ｅｐｏｘｙ８５樹脂（３５℃で１８時間連結）に連結されたＩｇ結合タンパク質の苛性安定性（ｃａｕｓｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）。６ｍｇ ＧａｍｍｍａｎｏｒｍでのＳＢＣ決定。三番目のヘリックス内に配置されたシステイン（４３Ｃの位置）を介してバリアント及び親物質を樹脂に連結。バリアント４Ｆ及び４Ｗは、親分子（ｃｓ２６）に比較して、アルカリ条件での長期インキュベーション後に改善された残存活性を示す。 ０．５Ｍ ＮａＯＨとの２０時間のインキュベーション後にＰｒａｅｓｔｏ Ｅｐｏｘｙ８５樹脂（３５℃で１８時間連結）に連結されたＩｇ結合タンパク質の苛性安定性（ｃａｕｓｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）。６ｍｇ ＧａｍｍｍａｎｏｒｍでのＳＢＣ決定。三番目のヘリックス内に配置されたシステイン（４３Ｃの位置）を介してバリアント及び親物質を樹脂に連結。バリアント６Ｆ、６Ｉ、６Ｌ、６Ｖ、６Ｗ、６Ｙ、６Ｒは、親分子（ｃｓ２６）と比較して、アルカリ条件での長期インキュベーション後に改善された残存活性を示す。 アフィニティリガンド（配列番号５１）からのベリムマブの溶出プロファイル。抗体は、固定されたアフィニティリガンド（配列番号５１）を有するカラムに注入され、ｐＨ６．０から２．０への直線的ｐＨ勾配で溶出された。溶出ピーク最大値のｐＨが、リードアウトとして用いられた。 アフィニティリガンド配列番号５１のＤＢＣ１０％決定。ベリムマブが、１０％の標的ブレークスルーまで、固定されたアフィニティリガンド配列番号５１（図の「ＩＤ５１」）を有する樹脂にロードされた。ベリムマブの溶出は、ｐＨ４．８で実施され、その後、ｐＨ１．７でＣＩＰを実施した。クロマトグラムは、ｐＨ４．８で結合されたベリムマブの完全な溶出を示している。

本発明が、以下に詳細に記載される前に、本明細書に記載された個々の方法論、プロトコル及び試薬は、変動し得るため、本発明がこれらに限定されないことが、理解されなければならない。同じく、本明細書で用いられた技術が個々の態様を記載することのみを目的としていて、本発明の範囲を限定せず、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得ることが、理解されなければならない。他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語が、本発明が属する技術分野の当業者により慣例的に理解されるものと同じ意味を有する。

好ましくは本明細書で用いられる用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，ｂ．ａｎｄ Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄに提供された定義と一致している。

以下の本明細書及び特許請求の範囲全体で、他に文脈で要求されない限り、言語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などの変形例は、述べられた部材、整数若しくはステップ、又は部材、整数若しくはステップの群の包含を示唆し、任意の他の部材、整数若しくはステップ、又は手段、整数若しくはステップの群の除外を示唆しないことが、理解されよう。

本発明の記載及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈で他に明確に示されない限り、互換的に用いられ、複数形も含むものとし、それぞれの意味に含まれるものとする。同じく本明細書で用いられる「及び／又は」は、列挙された項目の１つ又は複数のあらゆる可能な組み合わせと、代わり（「又は」）で解釈される場合には組み合わせの欠如をいい、それを包含する。

本明細書で用いられる用語「約」は、明確に列挙された量及びそれから±１０％の偏差を包含する。より好ましくは５％の偏差が、用語「約」により包含される。

複数の文献（例えば、特許、特許出願、科学文献、製造業者の仕様書ほか）が、本明細書の本文を通して引用される。本明細書内のいずれも、先行の発明によってそのような開示を以前の日付にする権利を本発明が与えないことの承認と解釈されてはならない。本明細書で引用された文献の幾つかは、「参照により取り込まれる」ことを特徴とする。そのような取り込まれた参照の定義又は技術と、本明細書に列挙された定義又は技術の間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先する。

本明細書で参照される全ての配列は、全ての内容及び開示と共に本明細書の一部である添付の配列表に開示される。

本発明の文脈において、用語「Ｉｇ結合タンパク質」又は「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンに特異的に結合することが可能なタンパク質を記載するために用いられる。さらに、本発明の文脈において、用語「Ｉｇ結合ドメイン」又は「免疫グロブリン結合ドメイン」は、免疫グロブリンに特異的に結合することが可能なタンパク質を記載するために用いられる。本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、本明細書では時には本発明のリガンドと称される。本明細書で理解される「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」は、例えばヒトＩｇＧ_１、ヒトＩｇＧ_２、ヒトＩｇＧ_４、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウシＩｇＧ、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧなどの哺乳動物ＩｇＧ；ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ；並びにＦｃ領域（「Ｆｃ断片」又は「Ｆｃ」とも称される）を含む免疫グロブリン断片、及び／又はＦａｂ領域（「Ｆａｂ断片」又は「Ｆａｂ」とも称される）を含む免疫グロブリン断片を包含し得るが、必ずしもこれらに限定されない。Ｉｇ結合タンパク質は、免疫グロブリン全体に、そしてＦｃ領域を含むＩｇ断片及び／又はＦａｂ領域を含むＩｇ断片に結合することが可能である。本明細書で理解される定義「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンを含む融合タンパク質、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの断片（Ｆｃ断片）、Ｆａｂ領域を含む免疫グロブリンの断片（Ｆａｂ断片）、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの断片を含む融合タンパク質、Ｆａｂ領域を含む免疫グロブリンの断片を含む融合タンパク質、Ｉｇ又はＦｃ領域を含むＩｇ断片（Ｆｃ断片）を含むコンジュゲート、及びＦａｂ領域を含むＩｇ断片（Ｆａｂ断片）を含むコンジュゲートを包含する。

当業者に察知される通り、用語「免疫グロブリン」及び「抗体」は、本明細書では互換的に用いられ得る。したがって用語「免疫グロブリン」に関係して本明細書で開示された任意の定義が、用語「抗体」に適用される。

本発明による用語「結合」は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」は、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが別の非免疫グロブリンターゲットへの結合に比較して特異的である免疫グロブリンにより強力に結合することを意味する。

用語「結合活性」は、免疫グロブリンに結合する本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの能力をいう。例えば結合活性は、アルカリ処理の前及び／又は後に決定され得る。用語（免疫グロブリン）「結合活性」及び「結合容量」は、本明細書では互換的に用いられ得る。結合活性は、Ｉｇ結合タンパク質について、又はマトリックスに連結されたＩｇ結合タンパク質について、即ち固定されたＩｇ結合タンパク質について決定され得る。同じく結合活性は、Ｉｇ結合ドメインについて、又はマトリックスに連結されたＩｇ結合ドメインについて、即ち固定されたＩｇ結合ドメインについて決定され得る。用語「人工」は、天然由来でない物体をいい、即ち該用語は、ヒトにより生成又は修飾された物体をいう。例えば人により（例えば、遺伝子操作による、シャトリング法による、又は化学反応による、などで実験室において）作製された、又は意図的に修飾されたポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、人工である。

用語「解離定数」又は「Ｋ_Ｄ」は、特異的結合親和性を定義する。本明細書で用いられる用語「Ｋ_Ｄ」（通常は「ｍｏｌ／Ｌ」で、時には「Ｍ」と略されて測定される）は、第一のタンパク質と第二のタンパク質の個々の相互作用の解離平衡定数をいうものとする。本発明の文脈では、用語Ｋ_Ｄは、特にＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインと免疫グロブリンとの結合親和性を記載するために用いられる。本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、少なくとも５００ｎＭ以下、又は好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下の免疫グロブリンに対する解離定数Ｋ_Ｄを有するなら、免疫グロブリンに結合すると見なされる。

用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合によりつなげられた２つ以上のアミノ酸の任意の直線状分子鎖をいい、生成物の具体的長さに言及しない。したがって「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖をいうために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はそれと互換的に用いられ得る。用語「ポリペプチド」はまた、非限定的にグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解、切断、非天然由来アミノ酸による修飾、及び当該技術分野で周知の類似の修飾をはじめとし、ポリペプチドの翻訳後修飾の生成物をいうものとする。したがって、２つ以上のタンパク質ドメインを含むＩｇ結合タンパク質も、用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」の定義に該当する。

用語「アルカリ安定性のある」又は「アルカリ安定性」又は「苛性安定性のある」又は「苛性安定性」（本明細書では「ｃｓ」とも略される）は、本明細書では互換的に用いられ得、免疫グロブリンに結合する能力を著しく損失することなく、アルカリ条件に耐える、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの能力をいう場合がある。この分野の当業者は、例えば実施例に記載される通り、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを、例えば水酸化ナトリウム溶液、と共にインキュベートし、続いて当業者に知られる日常的実験により、例えばクロマトグラフィーアプローチにより、免疫グロブリンへの結合容量又は結合活性をテストすることにより、アルカリ安定性を容易にテストすることができる。アルカリ安定性は、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップに連結させること、並びにアルカリ溶液への暴露前及び後に免疫グロブリンへの結合容量又は結合活性をアッセイすること、により決定されてもよい。アルカリ処理は、例えば０．５Ｍ ＮａＯＨ中で長期間、例えば少なくとも２０時間、実施され得る。

本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメイン、及び本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを含むマトリックスは、「上昇された」又は「改善された」アルカリ安定性を呈し、つまり前記Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを組み込んだ分子及びマトリックスは、参照に比べてアルカリ条件下で長期間、安定している。様々な態様において、該参照は、配列番号１～３の任意の１つの配列、好ましくは配列番号３の配列（ｃｓ２６ ４３Ｃ）を有する親分子ｃｓ２６であってもよい。様々な他の態様において、該参照は、置換Ｄ８Ｅ（Ａｓｐ８Ｇｌｕ）を有する配列番号１～３のいずれかの親分子ｃｓ２６、好ましくは置換Ｄ８Ｅ（Ａｓｐ８Ｇｌｕ）を有する配列番号３の親分子ｃｓ２６であってもよい。

本明細書で用いられる用語「バリアント」は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入により別のアミノ酸配列と異なるＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアミノ酸配列を包含する。これらの修飾は、人により実行された遺伝子操作により、又は化学合成若しくは化学反応により、作製されてもよい。

本明細書で用いられる用語「コンジュゲート」は、第二のタンパク質又は非タンパク質部分など他の物質に化学的に付着された少なくとも１つの第一のタンパク質を含む、又はそれから本質的になる分子に関する。

用語「修飾」又は「アミノ酸修飾」は、別のアミノ酸による、ポリペプチド配列内の特定の位置にあるアミノ酸の交換、欠失、又は挿入をいう。当業者は、公知の遺伝子コード、並びに組換え及び合成ＤＮＡ技術があれば、アミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを即座に構築することができる。

用語「置換」又は「アミノ酸置換」は、別のアミノ酸によるポリペプチド配列内の個々の位置でのアミノ酸の交換をいう。用語「欠失」又は「アミノ酸欠失」は、ポリペプチド配列内の個々の位置でのアミノ酸の除去をいう。

用語「挿入」又は「アミノ酸挿入」は、ポリペプチド配列へのアミノ酸の付加をいう。

本記載全体を通して、アミノ酸残基の位置番号は、例えば配列番号１の中の、位置番号に対応して称される。

用語「アミノ酸配列同一性」は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（又は相違）の定量的比較をいう。参照ポリペプチド配列に比べた「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「パーセント同一の」又は「パーセント同一性」は、最大限のパーセント配列同一性を実現するために、必要に応じて配列をアライメントしてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。様々な態様において、用語「配列同一性」は、デフォルトギャップ加重を利用したプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適にアライメントされた時に、２つの（ヌクレオチド又は）アミノ酸配列が、少なくとも７０％の配列同一性、又は少なくとも８０％の配列同一性、又は少なくとも８５％の配列同一性、又は少なくとも９０％の配列同一性、又は少なくとも９５％若しくはより多くの配列同一性を共有することを意味する。

配列同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列がアライメントされて、参照タンパク質の配列に比較される。配列アライメント及び配列比較アルゴリズムのための方法は、当該技術分野で周知である。例えば参照アミノ酸配列に比べた任意ポリペプチドのアミノ酸配列同一性の度合いを決定するために、ＳＩＭローカル類似性プログラムが、好ましくは用いられる。多重アライメント解析のために、好ましくは当業者に知られるＣｌｕｓｔａｌＷが、用いられる。

配列同一性の度合いは、一般に未修飾配列の全長に比べて計算される。本明細書で用いられる、２つのポリペプチド配列の文脈の語句「パーセント同一の」又は「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「パーセント同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いた測定で、又は視覚的検証により、最大対応のための比較及びアライメントされた場合に、幾つかの態様で少なくとも８９．５％、幾つかの態様で少なくとも９１％、幾つかの態様で少なくとも９２％、幾つかの態様で少なくとも９３％、幾つかの態様で少なくとも９４％、幾つかの態様で少なくとも９５％、幾つかの態様で少なくとも９６％、幾つかの態様で少なくとも９７％、幾つかの態様で少なくとも９８％、及び幾つかの態様で少なくとも１００％のアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列をいう。明瞭さの理由で、例えば少なくとも８９．５％の同一性を有する配列は、８９．５％より高い同一性を有する全ての配列、例えば少なくとも８９．６％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸同一性を有する態様を包含する。

パーセント同一性は、幾つかの態様において、少なくとも５２残基の領域にわたり、幾つかの態様において少なくとも５３残基の領域にわたり、幾つかの態様において少なくとも５４残基の領域にわたり、幾つかの態様において少なくとも５５残基の領域にわたり、幾つかの態様において少なくとも５６残基の領域にわたり、幾つかの態様において少なくとも５７残基の領域にわたり、幾つかの態様において少なくとも５８残基の領域にわたり、存在する。

用語「融合された」は、ポリペプチド成分又は単位が直接、若しくはペプチドリンカーを介する、のどちらかでペプチド結合によりつなげられていることを意味する。様々な態様において、用語「融合された」は、ポリペプチド成分又は単位が、例えば化学的コンジュゲーションを通して、非ペプチドリンカーによりつなげられていることを意味し得る。

用語「融合タンパク質」は、少なくとも１つの第二のタンパク質に遺伝子的に接続された少なくとも１つの第一のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、元々別のタンパク質をコードした２つ以上の遺伝子の接続を通して作製される。したがって融合タンパク質は、単一の直鎖状ポリペプチドとして発現された同一又は異なるタンパク質のマルチマーを含んでもよい。様々な態様において、融合タンパク質は、例えば化学的コンジュゲーションを通して、非ペプチドリンカーを介した２つ以上のポリペプチドの接続を通して作製される。様々な態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのダイマーは、「融合タンパク質」と見なされてもよい。

本明細書で用いられる用語「リンカー」は、最も広い意味では、少なくとも２つの他の分子を共有結合で接続する分子をいう。本発明の典型的な態様において、「リンカー」は、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを少なくとも１つのさらなるＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインと連結する部分、即ち、２つのタンパク質ドメインを互いにつないでダイマー又はマルチマーを作製している部分として理解されなければならない。好ましい態様において、「リンカー」は、ペプチドリンカーであり、即ち、２つの結合タンパク質又は結合ドメインをつなぐ部分は、１つの単一アミノ酸又は２つ以上のアミノ酸を含むペプチドになる。様々な態様において、本発明のダイマー又はマルチマーは、２つ以上のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを互いに接続するリンカーを含んでもよい。

用語「クロマトグラフィー」は、移動相及び固定相を用いて、試料中の１つの型の分子（例えば、免疫グロブリン）を別の分子（例えば、混入物又は他の免疫グロブリン）から分離する分離技術をいう。液体移動相は、分子の混合物を含有し、これらを、固定相（固体マトリックスなど）を横切って、又は通過して輸送する。移動相の異なる分子と固定相との差別的な相互作用により、移動相中の分子が、分離され得る。

用語「アフィニティクロマトグラフィー」は、固定相に連結されたリガンドが移動相（試料）中の分子（即ち、免疫グロブリン）と相互作用する、即ち、該リガンドが精製される分子への特異的な結合親和性又は結合容量を有する、クロマトグラフィーの特異的様式をいう。本発明の文脈で理解される通り、アフィニティクロマトグラフィーは、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインなどのクロマトグラフィーリガンドを含む固定相への、免疫グロブリンを含有する（液体）試料の付加を含む。

用語「固体担体」又は「固体マトリックス」は、本明細書では互換的に用いられ、様々な態様において、固定相に用いられる。

本明細書で互換的に用いられる用語「アフィニティマトリックス」又は「アフィニティ分離マトリックス」又は「アフィニティクロマトグラフィーマトリックス」は、アフィニティリガンド、例えば本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが付着されるマトリックス、例えばクロマトグラフィーマトリックスをいう。リガンド（例えば、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメイン）は、混合物（液体試料中）から精製又は除去されるべき該当する分子（例えば、先に定義された免疫グロブリン）に特異的に結合することが可能である。当業者に察知される通り、用語「アフィニティマトリックス」又は「アフィニティ分離マトリックス」又は「アフィニティクロマトグラフィーマトリックス」は、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを用いることによる、該当する分子（詳細には免疫グロブリン）の分離を記載している。したがって用語「アフィニティマトリックス」又は「アフィニティ分離マトリックス」又は「アフィニティクロマトグラフィーマトリックス」又は「分離マトリックス」は、本明細書では互換的に用いられてもよい。

本明細書で用いられる用語「アフィニティ精製」は、先に定義された該当する免疫グロブリンを、マトリックスに固定されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインに結合させることにより、液体（試料）から先に定義された該当する免疫グロブリンを精製する方法をいう。それにより、該当する免疫グロブリン以外の混合物の全ての他の成分が、除去される。様々な態様において、混合物の前記他の成分としては、例えば該当しない他の免疫グロブリンを挙げることができる。さらなるステップにおいて、該当する免疫グロブリンは、精製された形態で溶出される。用語「アフィニティ精製」又は「アフィニティクロマトグラフィー精製」又は「アフィニティ分離」又は「アフィニティクロマトグラフィー分離」は、本明細書では互換的に用いられ得る。

発明の態様
ここに、本発明をさらに記載する。以下の一節において、本発明の異なる態様が、より詳細に定義される。以下に定義される各態様は、反することが明確に示されない限り、任意の他の態様と組み合わせられてもよい。詳細には、好ましい、又は有利であるとして示された任意の特色が、好ましい又は有利であるとして示された任意の他の特色又は複数の特色と組み合わせられてもよい。

本発明は、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応するＩｇ結合ドメインを提供し、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸であり、該芳香族アミノ酸は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシン（Ｙ）であってもよい。好ましくは配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）であり、より好ましくは配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）である。様々な態様において、配列番号１の１４位に対応する該アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）であり、そして／又は配列番号１の２９位に対応する該アミノ酸は、リシン（Ｋ）である。該Ｉｇ結合ドメインはさらに、配列番号１の４３又は４６位に対応する位置にシステイン（Ｃ）残基を有してもよい。該Ｉｇ結合ドメインは、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間安定している。本明細書の他の箇所に記載される通り、本発明のＩｇ結合タンパク質は、１つ又は複数のそのようなＩｇ結合ドメインを含む。

一態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、１つ又は複数のドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号１の４、６、又は８位に対応する１つ又は複数のアミノ酸にアミノ酸置換を含み、又はそれから本質的になり、又はそれからなり、配列番号１の４、６、又は８位に対応するアミノ酸の該置換は、Ｉｓｏ（Ｉ）、Ｌｅｕ（ｌ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、又はＴｒｐ（Ｗ）の群から選択されるアミノ酸であり、該Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％同一である。

一態様において、該Ｉｇタンパク質は、１つ又は複数のドメインを含み、該少なくとも１つのドメインは、分枝状側鎖を有する高疎水性アミノ酸（Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、又は芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐ）の群から選択される配列番号１の８位に対応するアミノ酸でのアミノ酸置換を含み、該Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％同一である。幾つかの態様において、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）又はチロシン（Ｙ）である。幾つかの好ましい態様において、配列番号１（又は機能的に均等なタンパク質）の８位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）である。様々な態様において、配列番号１の８位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）は、該Ｉｇ結合容量及び苛性安定性を改善する。さらに、配列番号１（又は機能的に均等なタンパク質）の８位に対応する位置のイソロイシン（Ｉ）は、該タンパク質の発現を改善し得る。アフィニティクロマトグラフィーでの使用に適した高い結合容量及び苛性安定性を有する本発明のＩｇ結合リガンドについては、８位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、又はアラニン（Ａ）の任意の１つから選択されないことが、重要である（図２参照）。本発明は、配列番号１の８位の置換を越える、そしてＤ８Ｅ（Ａｓｐ８Ｇｌｕ）の置換を越える改善された苛性安定性を実証する。したがって本発明の様々な態様において、配列番号１の８位に対応する該アミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）でない。

幾つかの態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、以下の（１）～（３）から選択される：（１）８番目の位置のアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又は芳香族アミノ酸により置換されている、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；（２）８番目の位置以外の位置の１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加をさらに有する、（１）に指定されたアミノ酸配列を含むタンパク質；（３）（１）に指定されたアミノ酸配列と少なくとも８０％又はより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、但し、８番目の位置の（１）に指定されたアミノ酸置換が（３）でさらに変異されないことを条件とする。

本発明はさらに、分枝状側鎖を有する高疎水性アミノ酸（Ｉｓｏ、Ｌｅｕ）又は芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐ）の群から選択される配列番号１の４位に対応する位置にアミノ酸置換を含むＩｇタンパク質を提供し、該Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％同一である。好ましい態様において、配列番号１の４位に対応するアミノ酸は、トリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）である。配列番号１の４位に対応する位置のＷ又はＦなどの芳香族アミノ酸は、アフィニティクロマトグラフィーのリガンドの結合容量及び苛性安定性を改善する。アフィニティクロマトグラフィーにおける使用に適した高い結合容量及び苛性安定性を有するＩｇ結合リガンドについては、４位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、又はバリン（Ｖ）から選択されないことが、重要である（図３参照）。

幾つかの態様において、本発明のタンパク質は、以下の（１）～（３）から選択される：（１）４位に対応するアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｌｅｕ、又は芳香族アミノ酸により置換されている、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；（２）４位以外の位置の１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加をさらに有する、（１）に指定されたアミノ酸配列を含むタンパク質；（３）（１）に指定されたアミノ酸配列と少なくとも８０％又はより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、但し、４番目の位置の（１）に指定されたアミノ酸置換が（３）でさらに変異されないことを条件とする。

本発明はさらに、Ｉｓｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐの群から選択される配列番号１の６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むＩｇタンパク質を提供し、該Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％同一である。好ましい態様において、配列番号１の６位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）、又はロイシン（Ｌ）である。配列番号１の６位に対応する位置のＴｒｐ（Ｗ）若しくはＴｙｒ（Ｙ）などの芳香族アミノ酸、又はＩｓｏ（Ｉ）若しくはＬｅｕ（ｌ）から選択されるアミノ酸は、アフィニティクロマトグラフィーのリガンドの結合容量及び苛性安定性を改善する。アフィニティクロマトグラフィーにおける使用に適した高い結合容量及び苛性安定性を有するＩｇ結合リガンドについては、６位のアミノ酸がバリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、又はアラニン（Ａ）から選択されないことが、重要である（図４参照）。

幾つかの態様において、本発明のタンパク質は、以下の（１）～（３）から選択される：（１）６位に対応するアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｌｅｕ、又は芳香族アミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；（２）６位以外の位置の１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加をさらに有する、（１）に指定されたアミノ酸配列を含むタンパク質；（３）（１）に指定されたアミノ酸配列と少なくとも８０％又はより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、但し、６番目の位置の（１）に指定されたアミノ酸置換が（３）でさらに変異されないことを条件とする。

本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインの驚くべき利点が、Ｉｇ結合特性を損失することのない、高ｐＨ（ｐＨ１３以上）などの極端な条件の下での安定性である。本明細書に記載されたＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、Ｉｇ結合特性を損なうことなく長期間のアルカリ安定性を実証する（図２、３、４及び実施例参照）。さらにそれらは、Ｉｇ結合特性を有意に損失することなく低ｐＨで安定している。アルカリ安定性の特色は、例えばマトリックスが複数回用いられるように、マトリックス上の混入物を除去するために高いＮａＯＨ濃度のアルカリ溶液を用いた浄化手順を含むクロマトグラフィーアプローチにとって特に重要である。Ｉｇ結合タンパク質は、高い苛性安定性に加え、実施例に示される通り高い連結効率を示す。

さらに、アフィニティクロマトグラフィーにおける重要なステップは、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインに結合される該当するタンパク質、詳細には該当する免疫グロブリンの溶出である。このステップは通常、低ｐＨで実行される。本発明のアフィニティリガンドは、この処置の後にＩｇへの結合特性を損失せず、一方で該当するタンパク質の溶出は、低ｐＨで可能である。

一部の状況では、ｐＨ４．３以上など３．７より高く、例えばｐＨ５．５までの間のアフィニティリガンドからの抗体（免疫グロブリン）の溶出のための条件を有することが、重要である。本発明のリガンドの特徴を改善するために、さらなる修飾が、先に記載されたリガンドに施され得る。幾つかの態様において、配列番号１の１０、１４、１６、１７、１８、又は２８位に対応する１つ又は複数のアミノ酸（複数可）は、ヒスチジン（Ｈ）、又はアスパラギン酸塩（Ｄ）若しくはグルタミン酸塩（Ｅ）から選択される酸性アミノ酸の群から選択される。幾つかの態様において、配列番号１の１４位に対応するアミノ酸は、Ｈである。幾つかの態様において、配列番号１の１６位に対応するアミノ酸は、Ｈである。他の態様において、配列番号１の２８位に対応するアミノ酸は、Ｈである。幾つかの態様において、配列番号１の２８位に対応するアミノ酸は、Ｅである。他の態様において、配列番号１の９位に対応するアミノ酸は、Ｈである。幾つかの態様において、配列番号１の１０位に対応するアミノ酸は、Ｈである。配列番号１の１０、１４、１６、１７、１８、又は２８位に対応する位置にＨｉｓ（Ｈ）、Ａｓｐ（Ｄ）、又はＧｌｕ（Ｅ）を有する本発明のリガンドは、Ｆｃ結合親和性を弱めて、４．０、又はｐＨ４．３より高くｐＨ５．５までのｐＨで、該当する結合されたＩｇタンパク質の溶出を可能にする。

驚くべきことに、配列番号１の１４位に対応する位置のヒスチジン（Ｈ）、又は配列番号１の１６位に対応する位置のヒスチジン（Ｈ）を含む本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが、弱いｐＨ条件（ｐＨ５．５まで）での固定されたリガンドからの該当するＩｇ分子の溶出に特に適することが、見出された（表３参照）。この特色は、溶出ステップがｐＨ３．７より高い弱酸性条件で、詳細にはｐＨ４．０からｐＨ５．５以下の範囲内で、実行されなければならない、分離マトリックスを用いた免疫グロブリン、詳細にはＦｃ領域を有するＩｇを単離するのに特に有用である。

幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、以下の（１）～（３）から選択される：（１）８番目の位置に対応するアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又は芳香族アミノ酸である、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；（２）１０番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、又は２８番目の位置に対応するアミノ酸残基がＨｉｓ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、好ましくは１４位に対応するアミノ酸がＨｉｓであるか、１６位に対応するアミノ酸がＨｉｓであるか、１０位に対応するアミノ酸がＡｓｐ若しくはＨｉｓであるか、１７位に対応するアミノ酸がＨｉｓであるか、１８位に対応するアミノ酸がＧｌｕであるか、又は２８位に対応するアミノ酸がＨｉｓ若しくはＧｌｕであり、より好ましくは１４位に対応するアミノ酸がＨｉｓである、（１）に指定されたアミノ酸配列を含むタンパク質；（３）（１）に指定されたアミノ酸配列と少なくとも８０％又はより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、但し、８番目の位置に対応する（１）に指定されたアミノ酸及び１０番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、又は２８番目の位置に対応する（２）のアミノ酸が（３）でさらに変異されないことを条件とする。

さらなる修飾は、アフィニティクロマトグラフィーのための特定の特性を修飾するためにタンパク質に導入され得る。例えばシステインは、Ｃ末端に付加され得る。あるいはシステインは、マトリックスへの効率的連結を可能にするためにタンパク質のヘリックス３の中の位置に、例えば４３位又は４６位に導入され得る。

別の態様において、Ｉｇの結合を低下させるため（Ｆａｂ－ＶＨ３結合を排除することによる）、そしてより高いｐＨ値での溶出特性を改善するために、２９位に対応する位置が交換されていてもよい。幾つかの態様において、配列番号１の２９位に対応するアミノ酸は、Ｌｙｓ（Ｋ）である。幾つかの態様において、本発明の得られたリガンドは、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する。

幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、以下の（１）～（３）から選択される：
（１）８番目の位置に対応するアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又は芳香族アミノ酸である、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）１０番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、又は２８番目の位置に対応するアミノ酸残基がＨｉｓ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、好ましくは１４位に対応するアミノ酸がＨｉｓであるか、１６位に対応するアミノ酸がＨｉｓであるか、１０位に対応するアミノ酸がＡｓｐ若しくはＨｉｓであるか、１７位に対応するアミノ酸がＨｉｓであるか、１８位に対応するアミノ酸がＧｌｕであるか、又は２８位に対応するアミノ酸がＨｉｓ若しくはＧｌｕであり、より好ましくは１４位に対応するアミノ酸がＨｉｓである、（１）に指定されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３）２９番目の位置に対応するアミノ酸残基がＬｙｓである、（１）に指定されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
（４）（１）に指定されたアミノ酸配列と少なくとも８０％又はより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、但し、（１）、（２）、及び（３）に指定されたアミノ酸が（４）でさらに変異されないことを条件とする。

好ましいＩｇ結合ドメイン
様々な態様において、該Ｉｇ結合ドメインは、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、又はそれからなる。様々な態様において、該Ｉｇ結合ドメインは、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号４～３６及び４０～４９のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、又はそれから本質的になる、又はそれからなる。

好ましいＩｇ結合タンパク質
幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、１つ又は複数のドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、又はそれからなる。幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、１つ又は複数のドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号４～３６及び４０～４９のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、又はそれから本質的になる、又はそれからなる。

免疫グロブリンへの親和性
本明細書に記載された全てのＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、好ましくは２００ｎＭ未満の、又は１００ｎＭ未満の、より好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数Ｋ_Ｄで免疫グロブリンに結合する。幾つかの態様において、該Ｉｇタンパク質又はＩｇ結合ドメインは、好ましくは２００ｎＭ未満の、又は１００ｎＭ未満の、より好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数Ｋ_ＤでＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、Ｉｇ領域を含む融合タンパク質、及びＩｇ領域を含むコンジュゲートに結合する。Ｉｇ結合タンパク質又はドメインの結合親和性又は結合容量を決定するため、即ち解離定数Ｋ_Ｄを決定するための方法は、当業者に知られており、例えば当該技術分野で知られる以下の方法から、選択され得る：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術、結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡアッセイ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、等量滴定熱測定（ＩＴＣ）、分析超遠心分離、放射免疫測定法（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）及び増感化学発光（ＥＣＬ）。該方法の幾つかは、実施例にさらに記載される。典型的には解離定数Ｋ_Ｄは、２０℃、２５℃、又は３０℃で決定される。他に具体的に示されなければ、本明細書に列挙されたＫ_Ｄ値は、表面プラズモン共鳴分光法により２２℃±３℃で決定される。一態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、０．１ｎＭ～１００ｎＭの間、好ましくは０．１ｎＭ～５０ｎＭの間の範囲の、ヒトＩｇＧ_１に対する解離定数Ｋ_Ｄを有する。

Ｉｇ結合タンパク質の高いアルカリ安定性
本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、驚くべきことに、高い動的結合容量（ＤＢＣ）に加え、実施例及び図面に示される通り、特に良好なアルカリ安定性を提供する。該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性は、Ｉｇ結合活性の損失を比較することにより決定される。幾つかの態様において、該アルカリ液は、０．１～１．０ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくは０．２５～０．５ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインの高いアルカリ安定性により、１３より高いｐＨのアルカリ液が、固定された本発明のＩｇ結合タンパク質又は固定された本発明のＩｇ結合ドメインを有するアフィニティマトリックスを浄化するために用いられ得る。幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性は、０．５Ｍ ＮａＯＨ中での少なくとも２０時間のインキュベーションの後にＩｇ結合活性の損失を比較することにより決定される（図２、図３、図４及び実施例参照）。幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性は、アルカリ溶液中での非常に長いインキュベーション、例えば０．５Ｍ ＮａＯＨ中での少なくとも２日間（少なくとも４８時間）のインキュベーションの後にＩｇ結合活性の損失を比較し（実施例参照）、本明細書に記載されたＩｇ結合タンパク質の並外れた安定性を反映させることにより、決定される。

本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、アルカリ条件下で、詳細には０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間安定している。様々な態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、アルカリ条件下で、詳細には０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２４時間安定している。好ましい態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、アルカリ条件下で、詳細には０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも５０時間、安定している。

本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、免疫グロブリンのためのアルカリ安定性リガンドである。本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、０．５Ｍ ＮａＯＨへの少なくとも２０時間の暴露の後に、免疫グロブリンのための結合容量（又は結合親和性）を保持する。本明細書にさらに記載される通り、本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、本明細書に記載されたアルカリ条件への暴露の後に、免疫グロブリンのための少なくとも８５％又は少なくとも９０％の結合容量を保持する。さらに好ましい態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、アルカリ条件へ（０．５Ｍ ＮａＯＨへの少なくとも２０又は２４時間）の暴露の後に、好ましくは０．５Ｍ ＮａＯＨへの少なくとも４８時間の暴露後、より好ましくは０．５Ｍ ＮａＯＨへの少なくとも５０時間の暴露後に、免疫グロブリンのための少なくとも９４％の結合容量を保持する。様々な態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、固体担体に、好ましくはアフィニティ分離マトリックスの固体担体に固定された場合、先に記載された通り免疫グロブリンのための結合容量を保持する。

本明細書にさらに記載される通り、本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインは、典型的には室温のアルカリ条件下で安定している。室温という用語は、１５℃～２５℃の間の温度、より具体的には２０℃～２５℃の間の温度を包含し得る。様々な態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、２２℃±３℃のアルカリ条件下で安定している。

様々な態様において、先に記載されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性は、固体担体に、好ましくはアフィニティ分離マトリックスの固体担体に固定されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性を意味する。こうして様々な態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性は、固体担体に、好ましくはアフィニティ分離マトリックスの固体担体に固定された場合のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのＩｇ結合活性又はＩｇ結合容量の損失を比較することにより決定される。こうして他の態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性は、固体担体に固定された場合の長時間のアルカリ処理の後に、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのＩｇ結合活性を参照タンパク質に比較することにより決定される（図２、３、４参照）。

本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの免疫グロブリンのための結合容量又は結合親和性は、当該技術で周知の方法、詳細には本明細書の他の箇所に記載される解離定数Ｋ_Ｄを決定するための方法を利用して当業者により評価され得る。様々な態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの免疫グロブリンのための結合容量又は結合親和性は、同じく本明細書の他の箇所に記載される通り、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法を利用して決定される。他の態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの免疫グロブリンのための結合容量又は結合親和性は、本明細書の他の箇所に記載される通り、結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡアッセイ）又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定される。

本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの免疫グロブリンのための結合容量又は結合親和性は、本明細書に記載されたアルカリ条件への暴露の前及び後に、各候補リガンドについて評定され得る。

マルチマー
一態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの互いにつなげられたＩｇ結合ドメインを含み、即ちＩｇ結合タンパク質は、例えばモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、又はヘキサマーであり得る。マルチマーは、２つ、３つ、４つ、又はより多くの結合ドメインを含んでもよい。本発明のマルチマーは、一般には当業者に周知の組換えＤＮＡ技術により、人工的に作製された融合タンパク質である。

幾つかの態様において、該マルチマーは、ホモマルチマーであり、例えばＩｇ結合タンパク質のＩｇ結合ドメインの全てのアミノ酸配列が、同一である。幾つかの態様において、該マルチマーは、ヘテロマルチマーであり、例えば少なくとも１つのＩｇ結合ドメインが、Ｉｇ結合タンパク質内の他のＩｇ結合ドメインと異なるアミノ酸配列を有する。

マルチマーは、２つ以上のＩｇ結合ドメインを含んでいてもよく、前記Ｉｇ結合ドメインは、好ましくは先に記載されたアミノ酸配列を含む、又はそれから本質的になる。幾つかの態様において、該マルチマーは、ダイマーである。本発明は、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれかのモノマーを含むダイマーを提供する。様々な態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質は、２つのＩｇ結合ドメインを含むダイマーであり、該２つのＩｇ結合ドメインのそれぞれは、配列番号４～３６及び４０～４９のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、該ダイマーＩｇ結合タンパク質は、アルカリ条件下で安定している。好ましい態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質は、２つのＩｇ結合ドメインを含むダイマーであり、該２つのＩｇ結合ドメインのそれぞれは、配列番号４～９、２０～３６及び４０～４９のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、配列番号４～９、２０～３６及び４０～４９の８位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸（Ｙ、Ｆ、又はＷ）であり、該ダイマーＩｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間安定している。より好ましい態様において、本発明のダイマーＩｇ結合タンパク質は、配列番号４～５、２０～３６及び４０～４９のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応するＩｇ結合ドメインを含み、配列番号４～５、２０～３６及び４０～４９の８位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）であり、該ダイマーＩｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間安定している。より好ましい態様において、本発明のダイマーＩｇ結合タンパク質は、配列番号４～５、２０～３６及び４０～４９のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応するＩｇ結合ドメインを含み、配列番号４～５、２０～３６及び４０～４９の８位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）であり、該ダイマーＩｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間安定しており、該ダイマーＩｇ結合タンパク質は、少なくとも４．０のｐＨという穏やかな溶出条件下で標的の溶出を可能にする。様々な態様において、２つのＩｇ結合ドメインを含むダイマーのＮ末端Ｉｇ結合ドメインは、それぞれ配列番号１又は配列番号４～３６及び４０～４９のいずれかの４３又は４６位に対応する位置のシステイン（Ｃ）を有する。

さらなる好ましい態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質は、２つのＩｇ結合ドメインを含み、一方のＩｇ結合ドメインは、配列番号４に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、他方のＩｇ結合ドメインは、配列番号５に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応する。好ましくは配列番号５に基づくドメインは、配列番号４に基づくドメインの上流に配置される。さらなる特に好ましい態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質は、２つのＩｇ結合ドメインを含み、一方のＩｇ結合ドメインは、配列番号４３に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、他方のＩｇ結合ドメインは、配列番号４６に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応する。好ましくは配列番号４６に基づくドメインは、配列番号４３に基づくドメインの上流に配置される。

幾つかの具体的態様において、該Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号３７、配列番号５０、又は配列番号５１の配列を含むダイマーである。

リンカー
様々な態様において、該１つ又は複数のＩｇ結合ドメインは、互いに直接つなげられている。他の態様において、該１つ又は複数のＩｇ結合ドメインは、１つ又は複数のリンカーにより互いにつなげられている。これらの典型的態様において好ましいのは、ペプチドリンカーである。これは、ペプチドリンカーが１つ又は複数のアミノ酸、例えば第一のＩｇ結合ドメインを第二のＩｇ結合ドメインと連結させるアミノ酸配列であることを意味する。該ペプチドリンカーは、第一のＩｇ結合ドメイン及び第二のＩｇ結合ドメインに、ドメインのＣ末端とＮ末端の間のペプチド結合により連結され、それにより単一の直鎖状ポリペプチド鎖を作製する。リンカーの長さ及び組成は、アミノ酸を少なくとも１つ、そして約３０までの間で変動し得る。より具体的にはペプチドリンカーは、１～３０アミノ酸の間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーのアミノ酸配列が苛性条件及びプロテアーゼに対して安定していることが、好ましい。リンカーは、Ｉｇ結合タンパク質中のドメインの立体配座を不安定にしてはならない。グリシン及びセリンなどの小さなアミノ酸を含む、又はそれからなるリンカーは、周知である。リンカーは、グリシンリッチであり得る（例えば、リンカー内の残基の５０％より多くがグリシン残基であり得る）。同じく好ましいのは、さらなるアミノ酸を含むリンカーである。本発明の他の態様は、アラニン、プロリン、及びセリンからなるリンカーを含む。タンパク質の融合のための他のリンカーが、当該技術分野で知られており、用いられ得る。幾つかの態様において、Ｉｇ結合タンパク質のマルチマーは、Ｉｇ結合ドメインを連結する１つ又は複数のリンカーを含み、該リンカーは、同一又は異なる。

非Ｉｇ結合タンパク質
幾つかの態様において、先に記載されたＩｇ結合タンパク質はさらに、開示されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインと全く異なる少なくとも１つのさらなるポリペプチドを含む。様々な態様において、本明細書に開示されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインと全く異なるさらなるポリペプチドは、非Ｉｇ結合タンパク質、例えば非限定的に免疫グロブリンのＦｃ部分に結合しないタンパク質であってもよい。したがって幾つかの態様は、本明細書に開示されたその１つ又は２つ又はより多くのＩｇ結合タンパク質（複数可）と、１つ又は２つ又はより多くの非Ｉｇ結合ポリペプチド（複数可）と、を含む融合タンパク質を包含する。幾つかの態様において、融合タンパク質は、１つ（又はより多くの）非Ｉｇ結合タンパク質（複数可）に融合された本明細書に開示された１つ（又はより多くの）Ｉｇ結合タンパク質（複数可）及び／又は１つ（又はより多くの）Ｉｇ結合ドメイン（複数可）を含んでもよい。

幾つかの態様において、非Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号３８又は配列番号３９に対して少なくとも８９．５％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９８％又は１００％の同一性を有する。配列番号３９は、非Ｉｇ結合タンパク質である。配列番号３９は、配列番号１と同じ塩基性足場を有するが、配列番号１内に修飾Ｄ８Ｉ、Ｆ１３Ｄ、Ｙ１４Ｋ、Ｉ３１Ｒ、ｌ４２Ａを有し、それらが配列番号３９の非Ｉｇ結合特性に導く。８位のイソロイシンへの修飾は、非Ｉｇ結合タンパク質中の高い安定性、例えばアルカリ条件下での高い安定性などの改善された生化学的特性をもたらす。したがって８位に対応する位置のイソロイシンは、機能（即ち、Ｉｇ結合タンパク質又は非Ｉｇ結合タンパク質）にかかわらず、配列番号１内に存在する類似の三重らせん構造を有するタンパク質のより高い安定性をもたらす。したがって本発明はさらに、１つ又は複数のドメインを含むタンパク質を含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質に対応し、配列番号１の８位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）である。幾つかの態様において、該タンパク質は、１つ又は複数のドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号１（ｃｓ２６）に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質に対応し、配列番号１の８位に対応するアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）であり、アルカリ条件下で安定している。

上記にしたがって、本発明は、配列番号１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む非免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を提供し、該非Ｉｇ結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１の８位に対応する位置の、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐ）の任意の１つ、好ましくはイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、又は芳香族アミノ酸（Ｙ、Ｆ、Ｗ）の任意の１つ、より好ましくはイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、より好ましくはイソロイシン（Ｉ）から選択されるアミノ酸；
（ｉｉ）配列番号１の１３位に対応する位置のアスパラギン酸塩（Ｄ）；
（ｉｉｉ）配列番号１の１４位に対応する位置のリシン（Ｋ）又はセリン（Ｓ）；
（ｉｖ）配列番号１の３１位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）；及び
（ｖ）配列番号１の４２位に対応する位置のアラニン（Ａ）又はロイシン（Ｌ）、
を含む。幾つかの態様において、該非Ｉｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間、安定している。

本発明はさらに、配列番号３８又は配列番号３９のアミノ酸配列に対して少なくとも８９．５％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９８％又は１００％の配列同一性を有する非Ｉｇ結合タンパク質を提供し、該非Ｉｇ結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号３８又は３９の８位に対応する位置の、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又は芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐ）の任意の１つ、好ましくはイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、又は芳香族アミノ酸（Ｙ、Ｆ、Ｗ）の任意の１つ、より好ましくはイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、より好ましくはイソロイシン（Ｉ）から選択されるアミノ酸；
（ｉｉ）配列番号３８又は３９の１３位に対応する位置のアスパラギン酸塩（Ｄ）；
（ｉｉｉ）配列番号３８又は３９の１４位に対応する位置のリシン（Ｋ）又はセリン（Ｓ）；
（ｉｖ）配列番号３８又は３９の３１位に対応する位置のアルギニン（Ｒ）；及び
（ｖ）配列番号３８又は３９の４２位に対応する位置のアラニン（Ａ）又はロイシン（Ｌ）、
を含む。幾つかの態様において、該非Ｉｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間、安定している。

アフィニティ分離マトリックス
別の態様において、本発明は、これまでの態様のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを含むアフィニティ分離マトリックスを対象とする。

好ましい態様において、該アフィニティ分離マトリックスは、固体担体である。該アフィニティ分離マトリックスは、先に記載された少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを含む。

アフィニティマトリックスは、免疫グロブリンの分離に有用であり、浄化工程の間に適用される高いアルカリ条件の後であっても、該Ｉｇ結合特性を保持しなければならない。マトリックスのそのような浄化は、マトリックスの長期反復使用にとって肝要である。

アフィニティクロマトグラフィーのための固体担体マトリックスは、当該技術分野で知られており、例えばアガロース及びアガロースの安定化誘導体（例えば、Ｐｒａｅｓｔｏ（登録商標）Ｐｕｒｅ、Ｐｒａｅｓｔｏ（登録商標）Ｊｅｔｔｅｄ Ａ５０、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）、ＰｒｉｓｍＡ（登録商標）、セファロース６Ｂ、ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）、ｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗほか）、セルロース又はセルロース誘導体、制御された多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ樹脂）、モノリス（例えば、ＣＩＭ（登録商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（例えば、ＣＭジルコニア又はＣＰＧ（登録商標））、酸化チタン、又は合成ポリマー（例えば、Ｐｏｒｏｓ ５０Ａ又はＰｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）Ａ樹脂などのポリスチレン、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、単分散ポリアクリレート樹脂（例えば、ＵｎｉＭａｂ（商標）、ＵｎｉＭａｂ（商標）Ｐｒｏ）、ポリアクリル酸ヒドロキシアルキル、ポリメタクリル酸ヒドロキシアルキル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドほか）、及び様々な組成物のヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、該担体は、多糖などのポリヒドロキシポリマーを含む。担体に適した多糖の例としては、寒天、アガロース、デキストラン、デンプン、セルロース、プルランほか、及びこれらの安定化バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。

固体担体マトリックスの形式は、任意の適切な周知の種類であり得る。本明細書に記載されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを連結するためのそのような固体担体マトリックスは、例えば以下のものの１つを含み得る：カラム、キャピラリー、粒子、膜、フィルター、モノリス、繊維、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセット、又はクロマトグラフィーで慣例的に用いられて当業者に知られる任意の他の形式。

一態様において、該マトリックスは、ビーズ、例えばセファロース又はアガロースビーズ又は単分散ポリアクリレートビーズとしても知られる実質的に球形の粒子で構成される。適切な粒子サイズは、１０～１００μｍなど、２０～８０μｍなど、４０～７０μｍなど、５～５００μｍの径範囲内であってもよい。粒子形態のマトリックスが、充填層として、又は膨張層を含む懸濁形態で用いられ得る。

代わりの態様において、該固体担体マトリックスは、膜、例えばヒドロゲル膜である。幾つかの態様において、該アフィニティ精製は、一態様のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが共有結合されたマトリックスとしての膜を含む。固体担体はまた、カートリッジ内の膜の形態であり得る。

幾つかの態様において、該アフィニティ精製は、一態様のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが共有結合された固体担体マトリックスを含有するクロマトグラフィーカラムを含む。

固体担体への固定
本発明の態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、固体担体にコンジュゲートされる。本発明の幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、Ｎ及び／又はＣ末端に追加的アミノ酸残基を含んでもよい。本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、従来の連結技術を介して適切な固体担体マトリックスに付着されてもよい。固体担体へのタンパク質リガンドの固定のための方法は、この分野で周知であり、標準的技術及び器具を用いてこの分野の当業者により容易に実施される。幾つかの態様において、該連結は、例えば複数のリシンを介した、マルチポイントカップリング（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、又は例えばシステインを介した、シングルポイントカップリング（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）であってもよい。

幾つかの態様において、該アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、固相（マトリックス）への共有結合での付着のための付着部位を含む。部位特異的付着部位は、固相の反応基、又は固相と該タンパク質の間のリンカーとの特異的化学反応を可能にするシステイン又はリシンなどの天然アミノ酸を含む。

幾つかの態様において、該付着部位は、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのＣ又はＮ末端に直接であってもよい。幾つかの態様において、単一のシステインが、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの部位特異的固定のためにＣ末端に配置される。Ｃ末端システインを有することの利点は、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの連結がシステインチオールと担体上の求電子基の反応を通して実現されて、チオエーテル架橋の連結をもたらし得ることである。これは、連結されたタンパク質の優れた可動性を提供して、結合容量の増加を提供する。

他の態様において、該付着部位は、例えば配列番号１の４３位又は４６位に対応する位置の、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの三番目のヘリックスの中に配置されてもよい。

他の態様において、Ｎ又はＣ末端と付着部位の間にリンカーが存在してもよい。本発明の幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、末端システインと共に、３～２０アミノ酸、好ましくは４～１０アミノ酸のＮ又はＣ末端アミノ酸配列を含んでもよい。末端付着部位のためのアミノ酸は、プロリン、グリシン、アラニン、及びセリンの群から選択されて、連結のためにＣ末端に単一のシステインを有してもよい。

本発明の幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインはまた、Ｎ及び／若しくはＣ末端に追加的アミノ酸残基、例えばＮ末端のリーダー配列、及び／又はＮ若しくはＣ末端にタグを有する、若しくは有さない連結配列を含んでもよい。

Ｉｇ結合タンパク質の使用
一態様において、本発明は、免疫グロブリン又はそのバリアントのアフィニティ精製のための、一態様のＩｇ結合タンパク質若しくはＩｇ結合ドメイン、又は一態様のアフィニティマトリックスの使用を対象とし、即ち、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィーに使用される。幾つかの態様において、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインは、本発明の一態様に記載された通り固体担体に固定される。

免疫グロブリンのアフィニティ精製の方法
一態様において、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製の方法を対象とし、該方法は、以下のステップ：
（ａ）ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、又はＦａｂ断片（先に定義された通り融合タンパク質又はコンジュゲートを含む）などのＩｇを含有する液体（試料）を提供するステップと；
（ｂ）アフィニティ分離マトリックスに固定された、先に記載された固定Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを含む前記アフィニティ分離マトリックスを提供するステップと；
（ｃ）Ｉｇへの、先に記載された少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの結合を可能にする条件下で、前記液体を前記アフィニティ分離マトリックスと接触させるステップと；
（ｄ）前記マトリックスから前記Ｉｇを溶出し、それにより前記Ｉｇを含有する溶離液を得るステップと、
を含む。

幾つかの態様において、アフィニティ精製の該方法はさらに、アフィニティ分離マトリックスからそれに非特異的に結合された一部又は全ての分子を除去するのに十分な条件下で、ステップ（ｃ）と（ｄ）の間で実行された１つ又は複数の洗浄ステップを含んでもよい。非特異的結合は、少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインとＩｇの間の相互作用を含まない任意の結合を意味する。

開示された使用及び方法に適したアフィニティ分離マトリックスは、先に記載されていて、当業者に知られた態様によるそれらのマトリックスである。

幾つかの態様において、ステップ（ｄ）におけるＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメイン（を含むマトリックス）からの免疫グロブリンの溶出は、ｐＨの変化及び／又は塩濃度の変化を通して実行される。一般に、アフィニティ精製の方法を実施するための適切な条件は、当業者に周知である。幾つかの態様において、開示されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを含むアフィニティ精製の開示された使用又は方法は、３．７以上のｐＨ（例えば、約ｐＨ４．０、約ｐＨ４．５、約ｐＨ５．０、又は約ｐＨ５．５）でＩｇ含有タンパク質の少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の溶出を提供し得る。本発明のＩｇ結合タンパク質及びＩｇ結合ドメインの高い安定性により、ｐＨ３．７以上の溶液が、Ｉｇタンパク質の溶出に用いられ得る（実施例参照）。

幾つかの態様において、アフィニティ精製の方法のステップ（ｄ）において、Ｉｇ配列を含むタンパク質（例えば、抗体）の９５％より多くが、先に記載された通りの固定されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを含むマトリックスからｐＨ３．７以上（約ｐＨ５．５まで）で溶出される。幾つかの態様において、該アフィニティマトリックスの効率的浄化のためのさらなるステップ（ｅ）が、好ましくは、例えば１３～１４のｐＨの、アルカリ液を用いることにより、添加される。特定の態様において、該浄化液は、０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくは０．２５～０．５Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの高いアルカリ安定性により、そのような強アルカリ溶液が、浄化目的で用いられ得る。アフィニティ精製マトリックスをアルカリ浄化液で浄化した後、幾つかの態様において、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの少なくとも８８％が、０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも４８時間インキュベートされた場合にＩｇ結合活性を有する。幾つかの態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインのＩｇ結合容量は、例えば０．５Ｍ ＮａＯＨ中での少なくとも２０時間のインキュベーションの後に残存するＩｇ結合容量により決定される通り、アルカリ条件下でのインキュベーション前のＩｇ結合容量の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は１００％である。

本発明はさらに、（ａ）免疫グロブリンを含む液体試料を、複数のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメイン（固体担体に連結された）を含む分離マトリックスと接触させるステップと；（ｂ）該分離マトリックスをｐＨ３．７より高い（５．５までの）ｐＨの洗浄液で洗浄するステップと；（ｃ）分離マトリックスから該免疫グロブリンを溶出するステップと；（ｄ）該免疫グロブリンを得るステップと、を含む、免疫グロブリンを単離する方法を提供する。

核酸分子
一態様において、本発明は、先に開示されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインをコードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子を対象とする。一態様において、本発明は、核酸分子を含むベクターを対象とする。ベクターは、宿主細胞に情報をコードするタンパク質を移行させるために用いられ得る任意の分子又は物体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を意味する。一態様において、該ベクターは、発現ベクターである。

一態様において、本発明は、先に開示された核酸又はベクターを含む発現系、例えば原核宿主細胞、例えば大腸菌、又は真核宿主、例えば酵母サッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリス又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を対象とする。

Ｉｇ結合タンパク質の生成のための方法
一態様において、本発明は、本発明のＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの生成のための方法であって、（ａ）前記Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを得るために該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの発現のための適切な条件下で一態様の宿主細胞を培養するステップと；（ｂ）場合により、前記Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを単離するステップと、を含む、方法を対象とする。原核又は真核宿主を培養するための適切な条件は、当業者に周知である。

本発明のＩｇ結合分子は、平易な有機合成方策、固相の支援による合成技術又は市販の自動合成装置によるなど、多くの従来の技術及び周知の技術のいずれかにより調製されてもよい。その一方でそれらはまた、従来の組換え技術のみにより、又は従来の合成技術と組み合わせて、調製されてもよい。

本発明の一態様は、先に詳述された本発明によるＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの調製のための方法を対象とし、前記方法は、以下のステップ：（ａ）先に定義されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインをコードする核酸を調製するステップと；（ｂ）前記核酸を発現ベクターに導入するステップと；（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと；（ｄ）該宿主細胞を培養するステップと；（ｅ）Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが発現される培養条件下に該宿主細胞を供ステップと、それにより（ｅ）先に記載されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを生成するステップと；（ｆ）場合により、ステップ（ｅ）で生成されたＩｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを単離するステップと；（ｇ）場合により、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインを先に記載された固体マトリックスにコンジュゲートするステップと、を含む。本発明のさらなる態様において、該Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインの生成は、無細胞インビトロ転写／翻訳により実施される。

以下の実施例は、本発明のさらなる例示のために提供される。しかし本発明は、それに限定されず、以下の実施例は単に、上記を基にして本発明の実行可能性を示している。

実施例１．本発明のＩｇ結合タンパク質の作製
修飾は、個々のアミノ酸残基の部位飽和突然変異により配列番号１（ｃｓ２６）に導入された。以下の交換：８Ｉ、８Ｆ、８Ｙ、８Ｗ、８Ｌ、８Ｖ、６Ｉ、６Ｙ、６Ｗ、６Ｌ、４Ｉ、４Ｆ、４Ｗ、４Ｙ、４Ｌが、アフィニティクロマトグラフィーにおける特性のために導入及び分析され；４３位は、マトリックスへの連結のためにＣ（システイン）に交換された。

実施例２．Ｉｇ結合タンパク質の発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞が、Ｉｇ結合タンパク質（例えば、２０３５２４及び２０３５５０）をコードした発現プラスミドで形質転換された。細胞が選択寒天プレート（カナマイシン）に播種され、２１℃で２日間又は３７℃で一晩のどちらかでインキュベートされた。前培養物が、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充された５０ｍｌ ２ｘＹＴ培地中の単一コロニーから接種され、２５０ｍＬ三角フラスコ内で、従来のオービタルシェーカを用いて２１０ｒｐｍにて３７℃で１７時間培養された。ＯＤ_６００のリードアウトは、３．５～６の範囲内でなければならない。主な培養物が、１Ｌ肉厚三角フラスコ内で５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び微量元素（Ｓｔｕｄｉｅｒ ２００５参照）を補充された３００ｍｌスーパーリッチ培地（２％グルコース、５％酵母エキス、０．８９％グリセロール、０．７６％ラクトース、２５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２０２ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、ｐＨ７．４、消泡剤ＳＥ１５からなる改変Ｈ１５培地）中の、開始ＯＤ_６００を０．３に調製された先の一夜培養物から接種された。培養物を低周波共振音響ミキサー（ＲＡＭ_ｂｉｏ）に移して、３７℃及び２０×ｇでインキュベートされた。エアレーションが、Ｏｘｙ－Ｐｕｍｐストッパーにより容易に行われた。組換えタンパク質発現が、グルコースを代謝すること、そして続いてラクトースを細胞に進入させることにより誘導された。細胞が一晩、およそ１８時間成育され、最終的なＯＤ_６００が約３５～５５に達した。回収前にＯＤ_６００が測定され、０．６／ＯＤ_６００に調整された試料が取り出されてペレット化され、－２０で凍結された。バイオマスを回収するために、細胞が２０℃及び１２０００×ｇで２０分間遠心分離された。ペレットが計量された（湿重量）。細胞は、処理の前に－２０℃で貯蔵された。

実施例３：Ｉｇ結合タンパク質の発現及び溶解度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
試料を９０μｌの抽出緩衝液（０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５ｘ ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、６ｍＭ ＭｇＳＯ_４、６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを補充されたＰＢＳ）に再懸濁されて、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ内で８５０ｒｐｍ、室温での１５分間撹拌、続く－８０℃での１５分間インキュベートにより可溶化された。解凍した後、可溶性タンパク質が、遠心分離（１６０００×ｇ、２分間、室温）により不溶性タンパク質から分離された。上清が取り出され（可溶性画分）、ペレット（不溶性画分）が同量の尿素緩衝液（８Ｍ尿素、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に再懸濁された。３５μｌが可溶性画分及び不溶性画分の両方から採取されて、１０μｌの５×試料緩衝液及び５μｌの０．５Ｍ ＤＴＴが添加された。試料が９５℃で５分間煮沸された。最後に、それらの試料の５μｌがＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳゲルに導入され、製造業者の推奨にしたがって泳動されて、クーマシーで染色された。結果：高レベルの発現が、選択された期間内に最適化条件下で見出された。発現されたＩｇ結合タンパク質は全て、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにしたがって１００％可溶性であった。

実施例４：Ｉｇ結合タンパク質の精製
Ｉｇ結合タンパク質が、大腸菌の可溶性画分で発現された。細胞が細胞破壊緩衝液に再懸濁されて、超音波細胞破壊システム（Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ＨＤ２２００、Ｂａｎｄｅｌｉｎ）により溶解された。精製ステップが、ＡＫＴＡｖａｎｔシステム（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＩＥＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ－ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、製造業者の使用説明書に従って、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ３．０）を用いて実施された。１０カラム容量での直線勾配で塩化ナトリウム濃度を１Ｍに上昇させることにより、純粋なタンパク質画分が溶出された。クエン酸緩衝液ｐＨ６．０（２０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）を用いて、製造業者の使用説明書にしたがったサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）により、さらなる（Ｆｕｒｔｈ）精製が実施された。結果：バリアント８Ｉ及び６Ｌの純度は、ＳＥ－ＨＰＬＣの後は９５％より高く、ＲＰ－ＨＰＬＣの後は９０％より高かった。

実施例５：Ｉｇ結合タンパク質は高い親和性でＩｇＧに結合する（ＳＰＲ）
ＣＭ５センサーチップ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ランニング緩衝液と平衡にされた。ＥＤＣとＮＨＳの混合物を通過させて反応性エステル基を産することにより、表面が露出したカルボン酸基が活性化された。７００～１５００ＲＵオンリガンドがフローセルに固定され、オフリガンドが別のフローセルに固定された。リガンド固定後のエタノールアミンの注射で、非共有結合のＩｇ結合タンパク質が除去される。リガンド結合により、タンパク質の分析物が表面に蓄積されて、屈折率が上昇した。屈折率のこの変化が、実時間で測定され、応答又は共鳴単位（ＲＵ）として時間に対してプロットされた。分析物が、適切な流速（μｌ／分）で系列希釈のチップに導入された。各ランの後に、チップ表面が再生緩衝液で再生されて、ランニング緩衝液で平衡にされた。対照試料が、マトリックスに導入された。再生及び再平衡化が、先に述べられた通り実施された。結合試験が、２５℃でのＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用により実行され；データ評価が、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデル（ＲＩ＝０）の使用により、製造業者に提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウエアを介して操作された。評価された解離定数（Ｋ_Ｄ）は、表１のセツキシマブ（ＩｇＧ_１）、ナタリズマブ（ＩｇＧ_４）、及びパニツムマブ（ＩｇＧ_２）のＩｇ結合タンパク質のオフターゲット及びＫ_Ｄ値に対して標準化された。

実施例６．アガロースを基にしたクロマトグラフィービーズＰｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ８５に連結されたＩｇ結合タンパク質 － 連結効率、ＤＢＣ１０％、溶出
ＤＢＳ１０％：精製されたＩｇ結合タンパク質が、製造業者の使用説明書にしたがってアガロースを基にしたクロマトグラフィービーズ（Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ８５、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＲ０１２６５－１６４）に連結された（連結条件：ｐＨ９．５、３時間、３５℃、４．１Ｍ ＮａＳＯ_４、エタノールアミンで一晩ブロッキング）。連結された樹脂が、Ｓｕｐｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ５／５０カラム（Ｇｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）に充填された。ポリクローナルヒトＩｇＧ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（登録商標）（Ｏｃａｔｐｈａｒｍ）が、ＩｇＧ試料（濃度２．２ｍｇ／ｍｌ）として用いられた。ポリクローナルｈＩｇＧ試料が、固定されたＩｇ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で導入された。結果：バリアント８Ｉ（２０３５５０）は、親バリアント（２０３４４７）への比較でわずかに増加されたＤＢＣ１０％を示す。

マトリックスからの免疫グロブリンの溶出：マトリックスが、１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ３．７で洗浄され、その後、０．１Ｍリン酸、ｐＨ１．７で洗浄されて、固定されたＩｇ結合タンパク質に結合されたｈＩｇＧ（ロード：２．２ｍｇ／ｍＬ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、滞留時間６分） を溶出した。結果：親分子が固定された場合の９６％に比較して、テストされた全てのバリアントについては、抗体の９９％より多くが溶出された（例えば、Ｄ８Ｉ、Ｄ６Ｌ）；表２参照。

実施例７．エポキシ活性化マトリックスに連結されたＩｇ結合タンパク質のアルカリ安定性
カラムが、０．５Ｍ ＮａＯＨと共に室温（２２℃±３℃）で０時間及び２０時間インキュベートされた。固定されたタンパク質のＩｇ結合活性が、０．５Ｍ ＮａＯＨとのインキュベーション後に分析された。結果が、図２、図３及び図４に示される。固定された２５ｍｇ／ｍｌバリアント６Ｌ（２０３５２４）及び８Ｉ（２０３５５０）並びに対照を有するＰｒａｅｓｔｏ８５エポキシ樹脂が、０．５Ｍ ＮａＯＨと共に室温（２２℃±３℃）で５０時間インキュベートされた。結果：強アルカリ溶液中で２日より長く経た後であっても、バリアント８Ｉ及び６Ｌは、それぞれ９４．４％及び８８．５％の、Ｉｇへの残存結合容量を示した。５０時間のアルカリ処理の後の残存Ｉｇ結合容量は、親物質（配列番号３の苛性安定性Ｉｇ結合タンパク質；ＣＩＤ２０３４４７）（８３％の、Ｉｇへの残存結合容量）に比較して改善されている。表２の結果を参照されたい。

実施例８．固定されたリガンドからのｈＩｇＧの溶出
ｐＨ勾配での溶出ｐＨの決定。ＰＢＳ ｐＨ７．３中の１ｍｇ／ｍｌ ｈＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）が、カラムに注入された；接触時間：６分。カラムが、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ６．０で洗浄された。固定されたリガンドに結合されたｈＩｇＧが、ｐＨ６．０－２．０のｐＨ勾配形態を介して溶出された。溶出された主な画分のｐＨが、決定された（ピーク最大値）。ｃｓ２６でのピーク最大値ｐＨ３．７に比較して、全てのバリアントがｐＨ４．２及びｐＨ５．２の範囲内でピーク最大値を示すことが、表３で示される。

高ｐＨ（ｐＨ４．５）での溶出。マトリックスが５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５で洗浄され、その後、１００ｍＭ酢酸で洗浄されて、固定されたアフィニティリガンド（バリアント）に結合されたｈＩｇＧ（ロード：２．２ｍｇ／ｍＬ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、滞留時間６分）を溶出した。全てのリガンドがｐＨ４．５でｃｓ２６に比較してより有意に高いパーセンテージの回収抗体を示すことが、表４で示される。

実施例９：ＩｇＧのアフィニティ精製のリガンドとしての配列番号５１の特徴づけ
実験は、異なる手順がここで言及されない限り、先に記載された通り実施された。

純度：配列番号５１のアフィニティリガンドの純度が、ＲＰ ＨＰＬＣ後に１００％であった。タンパク質が、２２０ｎｍ吸収により検出された。

ｈＩｇＧ_１への親和性：アフィニティリガンド配列番号５１の分析のために、モノクローナル抗体セツキシマブ（ＩｇＧ_１）及びベリムマブ（ＩｇＧ_１）が、標的として用いられた。ＩｇＧセツキシマブのための配列番号５１のＫＤは、４０．８ｎＭであり、ＩｇＧ_１ベリムマブでは４７．４ｎＭであった。

結合容量：結合容量が、ＩｇＧ_１試料で決定された。滞留時間６分で１０％の標的ブレークスルーまで、抗体がアフィニティリガンド配列番号５１に連結された樹脂に注入された。ロードされた抗体が定量され、動的結合容量ＤＢＣ１０％として計算された。ｃｓ２６に比較した２．２ｍｇ／ｍｌベリムマブでの滞留時間６分でのＤＢＣ１０％は、ｃｓ２６に比較して１０４．１％であった。

苛性安定性：１９．６ｍｇ／ｍｌ 配列番号５１が固定された（ｐＨ＝１０．５及び２．０５ＭのＮａ_２ＳＯ_４で連結）Ｐｒａｅｓｔｏ８５エポキシ樹脂が、０．５Ｍ ＮａＯＨと共に室温（２２℃±３℃）で２４時間インキュベートされた。強アルカリ溶液中での２４時間後であっても、配列番号５１は、Ｉｇへの結合容量の低減を示さなかった（９９％）。

溶出ｐＨ：ピーク最大値の溶出ｐＨが、先に記載された通り決定された。配列番号５１は、ｃｓ２６（ｐＨ３．５）に比較してＧａｍｍａｎｏｒｍ及びベリムマブで高い溶出ｐＨ（ｐＨ５．０）を示した。表５参照。

段階的溶出：段階的溶出が、ｐＨ４．８での標的溶出について分析された。リガンド（配列番号５１）からの標的（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ又はベリムマブ）の残存溶出が、ｐＨ１．７の１００ｍＭリン酸ＣＩＰの後に分析された（回収）。標的タンパク質が、ｐＨ４．８で配列番号５１のリガンドからほぼ完全に溶出された。表６参照。

Claims (14)

1. １つ又は複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質であって、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインが、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＩｇ結合タンパク質に対応し、配列番号１の８位に対応する前記アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、又は芳香族アミノ酸であり、前記Ｉｇ結合タンパク質が、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ条件下で少なくとも２０時間、安定している、Ｉｇ結合タンパク質。
2. 配列番号１の８位に対応する前記アミノ酸が、イソロイシン（Ｉ）又はチロシン（Ｙ）である、請求項１に記載のＩｇ結合タンパク質。
3. 配列番号１の１０、１４、１６、１７、１８又は２８位に対応する１つ又は複数のアミノ酸（複数可）が、ヒスチジン（Ｈ）又はアスパラギン酸塩（Ｄ）又はグルタミン酸塩（Ｅ）の群から選択される、請求項１～２に記載のＩｇ結合タンパク質。
4. 少なくとも１つのドメインが、配列番号４～９、２０～２６、及び４０～４９のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号４～９、２０～２６、及び４０～４９のいずれかに対して少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質。
5. ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、Ｉｇ領域を含む融合タンパク質、及びＩｇ領域を含むコンジュゲートに結合する、請求項１～４のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質。
6. 互いにつなげられた２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのドメインを含む、請求項１～５のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質。
7. ホモマルチマー又はヘテロマルチマーである、請求項６に記載のＩｇ結合タンパク質。
8. 固体担体に固定される、請求項１～７のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質。
9. アフィニティ分離マトリックスに連結された、請求項１～８のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティ分離マトリックス。
10. Ｉｇ結合タンパク質への親和性を有する任意のタンパク質のアフィニティ精製のための、請求項１～８のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質の使用、又は請求項９に記載のアフィニティ分離マトリックスの使用。
11. ａ）Ｉｇ配列を含むタンパク質を含有する液体を提供すること；
    ｂ）請求項９に記載の前記アフィニティ分離マトリックスに連結された請求項１～８のいずれか１つに記載の少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質を含む請求項１０に記載のアフィニティ分離マトリックスを提供すること；
    ｃ）Ｉｇ配列を含むタンパク質への、請求項１～８のいずれか１つに記載の前記少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質の結合を可能にする条件下で、前記アフィニティ分離マトリックスを前記液体と接触させること；及び
    ｄ）Ｉｇ配列を含む前記タンパク質を前記アフィニティ精製マトリックスから溶出し、それにより前記免疫グロブリンを含有する溶離液を得ること、
    を含む、Ｉｇ配列を含むタンパク質のアフィニティ精製の方法。
12. ステップ（ｄ）において、前記Ｉｇ配列を含む前記タンパク質の９５％より多くが、ｐＨ３．７以上で、請求項１～８のいずれかに記載の前記Ｉｇ結合タンパク質を含む前記アフィニティ精製マトリックスから溶出される、請求項１１に記載の方法。
13. ステップ（ｄ）において、前記Ｉｇ配列を含む前記タンパク質の９５％より多くが、ｐＨ４．５以上で、請求項１～８のいずれかに記載の前記Ｉｇ結合タンパク質を含む前記アフィニティ精製マトリックスから溶出される、請求項１２に記載の方法。
14. （ｅ）前記アフィニティ精製マトリックスをアルカリ浄化液で浄化する追加的ステップを含む、請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。

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