WO2018135651A1 - 抗体－多糖結合体及びそれを用いた高感度免疫測定方法 - Google Patents

抗体－多糖結合体及びそれを用いた高感度免疫測定方法 Download PDF

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WO2018135651A1
WO2018135651A1 PCT/JP2018/001690 JP2018001690W WO2018135651A1 WO 2018135651 A1 WO2018135651 A1 WO 2018135651A1 JP 2018001690 W JP2018001690 W JP 2018001690W WO 2018135651 A1 WO2018135651 A1 WO 2018135651A1
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antibody
group
vhh
protein
polysaccharide
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PCT/JP2018/001690
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隆彦 松下
松岡　浩司
幡野　健
根本　直人
秀直 新井
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国立大学法人埼玉大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to an ELISA method (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; enzyme immunoassay), which is one of immunological measurement methods. More specifically, the present invention relates to a method for enhancing detection sensitivity when a sample is measured by a sandwich ELISA method described later, and a reagent used in the method.
  • ELISA method Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; enzyme immunoassay
  • target antigens antibodies that specifically recognize target antigens contained in a sample solution (hereinafter also referred to as “specific antibodies”). And then performing detection or quantification using an enzyme reaction.
  • the target antigen refers to a substance having an antigenic determinant (epitope) that causes antibody production in B cells, and includes peptides, proteins, sugar chains and the like having a certain length or more.
  • antibody includes both natural antibodies and artificial antibodies.
  • natural antibody refers to an antibody having the same amino acid sequence as an antibody produced by any vertebrate.
  • artificial antibody refers to an artificially constructed antibody, for example, an antibody in which an appropriate mutation is introduced into the amino acid sequence of the natural antibody, or other modifications that are usually not present in nature. The antibody which performed.
  • a substrate for the enzyme used in the sample solution After binding the antigen and antibody as described above, adding a substrate for the enzyme used in the sample solution produces a dye, or a fluorescent or chemiluminescent substance, depending on the enzyme activity. The Then, the absorbance is measured when a dye is produced, and the fluorescence or chemiluminescence is measured and detected when a fluorescent substance or a chemiluminescent substance is produced.
  • sandwich ELISA method uses two types of antibodies, a capture antibody and a detection antibody. Since the capture antibody is used by being bound to a solid phase, it is also called a solid phase antibody. In this sandwich ELISA method, an antigen is detected and quantified by sandwiching the antigen between a solid phase antibody and a detection antibody.
  • IgG immunoglobulin
  • IgM immunoglobulin M
  • a substance that becomes an antigen is administered to a mammal multiple times (immunization) over a certain period, blood is collected after a certain period of time has passed since the last administration, and antibodies in the serum are purified Is not available.
  • binding molecules include single chain antibodies (single chain Fv: scFv) that are composed of a single chain polypeptide and can recognize and bind to a target substance alone. Is sometimes referred to as a single chain antibody.
  • the single chain antibody may be a natural one, for example, a single chain antibody produced by a camelid animal (hereinafter referred to as a single domain antibody, “VHH antibody” or “VHH”, see FIG. 1. See Zhang L., et al., 1993, Nature, 362: 446-448) and non-naturally produced by gene recombination.
  • a non-natural single chain antibody is a recombinant antibody produced by linking two variable region fragments (heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL)) that constitute this antigen-binding site with a flexible linker.
  • VH variable region
  • VL light chain variable region
  • the fragment include a single chain Fv (scFv: single chain fragment of variable region) (Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). These single chain antibodies can be expressed in microorganisms relatively easily.
  • VHH whose molecular weight is less than 1/10 of IgG should be artificially produced using a library that does not use phage display and other immune reactions (hereinafter sometimes referred to as “non-immune library”). Can do.
  • the Kd (dissociation constant) of general IgG is 10 ⁇ 6 to 10 ⁇ 9 M, and among these, it can be determined that IgG showing 10 ⁇ 9 M has high antigen affinity.
  • Kd of VHH antibodies and IgNAR antibodies obtained from non-immune libraries is about 10 ⁇ 5 to 10 ⁇ 8 (see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2), and has a lower antigen affinity than IgG. It is known.
  • the antigen-binding ability of the immobilized antigen is important for increasing the measurement sensitivity.
  • a recombinant VHH antibody produced in E. coli or the like is physically adsorbed directly onto a substrate such as polystyrene, the antigen binding power inherent in the VHH antibody tends to be lost.
  • the solid-phased VHH antibody directly physically adsorbed is easier to peel (drop off) from the substrate by the washing operation included in the ELISA method than the solid-phased IgG antibody.
  • substrate-specific binding peptide a peptide that specifically binds to the substrate
  • substrate-specific binding peptide A method of solid-phased while controlling (hereinafter referred to as “Prior Art 3”; see Non-Patent Document 8) is known.
  • a protein or peptide such as an enzyme is reduced in activity (ie, binding ability is reduced) when adsorbed on a solid surface composed of a metal or a metal oxide or the like.
  • a method for improving the decrease in activity has been proposed. Residual activity when the enzyme is immobilized by using a “cushioning adsorbent comprising at least one selected from the group consisting of a peptide consisting of a specific sequence and a cushion protein” that can be adsorbed on a solid surface It has been reported that this can be improved as compared with the case where no is used (hereinafter referred to as “Prior Art 4”, see Patent Document 1).
  • a polysaccharide is used as a scaffold for binding a target substance, and a molecule is detected by using a structure of solid phase surface- (chemical bond) -polysaccharide- (chemical bond) -target substance (protein, nucleic acid, etc.).
  • a system has been proposed (hereinafter referred to as “Prior Art 5”, see Patent Document 2).
  • Conventional technique 1 is an excellent technique in that a multimer (multivalent antibody) having a valency of VHH antibody of about 2 to 10 is constructed using Escherichia coli or the like to enhance antigen affinity.
  • a multimer (multivalent antibody) having a valency of VHH antibody of about 2 to 10 is constructed using Escherichia coli or the like to enhance antigen affinity.
  • the production amount of the above-mentioned multivalent antibody produced by Escherichia coli or the like is small as compared with the case of producing the VHH antibody alone.
  • VHH antibodies capable of constructing multivalent antibodies or the spatial distance between VHH antibodies largely depends on the structure or properties of self-associating tag molecules. For this reason, there is a problem that the avidity enhancement effect that can be desired and the degree of freedom in designing VHH multimers are greatly limited. This means that it is difficult to impart an avidity enhancement effect that matches the antigen affinity of the VHH antibody, or to adjust the avidity to be imparted, and it is not very versatile for industrial use. Leads to.
  • tag molecules introduced for the construction of multimers cause non-specific adsorption, and such non-specific adsorption causes noise in blanks and low-concentration regions during ELISA, reducing detection sensitivity. There is also concern that it will be a factor.
  • Conventional techniques 2 and 3 are excellent techniques in that the antibody is indirectly adsorbed on the solid surface, so that it prevents changes in the conformation of the antibody molecule (see FIGS. 2 (A) and (B)). .
  • the conformational change is considered to occur at the contact surface on the antibody molecule due to physical adsorption. Due to the characteristics of the VHH antibody, it may be possible to develop products with a small lot difference that can be stored at room temperature by substituting IgG for sandwich ELISA.
  • the molecular weight of the VHH antibody which is a low molecular antibody
  • the contact area with the substrate is also much smaller than IgG, and there is a problem that VHH is not stably adsorbed (see FIGS. 2A and 2B).
  • the structure of the antigen binding site is likely to have a more direct effect due to the low molecular weight. For this reason, if the full-length antibody used in the sandwich ELISA method is simply replaced with the VHH antibody, there is often a problem that the detection sensitivity is greatly reduced.
  • the conventional technique 4 is superior in that when the target protein is adsorbed on the solid phase surface via the cushioning solid phase adsorbent, higher residual activity can be maintained than when the target protein is directly adsorbed. It is.
  • Thermococcus codacarensis ribonuclease HII or a variant thereof is used as a cushioning solid-phase adsorbent.
  • a cushioning solid-phase adsorbent even when a cushioning solid-phase adsorbent is used, there is a problem in that it does not reach the detection sensitivity when using a full-length antibody, and further improvement in detection sensitivity is required.
  • Prior art 5 is an excellent invention in that it uses a polysaccharide such as dextran, which is a linear polysaccharide, glycogen, and amylopectin, which are linear polysaccharides, as a scaffold for binding a target substance, and suppresses a decrease in detection sensitivity. is there.
  • a polysaccharide such as dextran, which is a linear polysaccharide, glycogen, and amylopectin, which are linear polysaccharides
  • the inventors of the present invention have studied a method for enhancing the sensitivity of the ELISA method and a reagent used in the method, and have developed a water-soluble polysulfide having a reactive functional group introduced into the side chain.
  • An antibody-polysaccharide conjugate was constructed by covalently binding a low molecular weight antibody molecule to a saccharide.
  • the inventors have found that the detection sensitivity of the ELISA method can be enhanced by using the antibody-polysaccharide conjugate as a capture antibody for the ELISA method described above, thereby completing the present invention.
  • one aspect of the present invention is an antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay comprising a water-soluble polysaccharide, a low-molecular antibody molecule, and a linker that connects the water-soluble polysaccharide and the low-molecular antibody molecule.
  • the linker is an antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay characterized by comprising a reactive functional group that reacts with an amino acid residue of the low-molecular antibody molecule and a cushion protein.
  • the water-soluble polysaccharide is not particularly limited as long as it can serve as a scaffold for binding an antibody.
  • a linear polysaccharide it is easy to control the chain length of the polysaccharide, which will be described later. It is preferable because the orientation control of the antibody or chemical modification of the side chain of the polysaccharide is easy, nonspecific adsorption to polysaccharides or a solid phase can be suppressed, and steric hindrance in the antigen-antibody reaction can be prevented.
  • the linear water-soluble polysaccharide is at least one selected from the group consisting of pullulan, dextran, agarose, curdlan, glucomannan, hyaluronic acid, alginate, carrageenan, gellan gum, chitosan salt and water-soluble chitin. It is preferable because chemical modification of the side chain of these polysaccharides is easy, and it is highly reactive to be any one selected from the group consisting of pullulan, dextran, agarose, curdlan and glucomannan. This is more preferable because many hydroxyl groups are contained in the side chain.
  • the reactive functional group preferably includes a maleimide group, an iodoacetyl group, a bromoacetyl group, and a cushion protein.
  • the reactive functional group is selected from the group consisting of maleimide group, iodoacetyl group, bromoacetyl group, pyridyl disulfide group, imide ester group, aldehyde group, propionaldehyde group, butyraldehyde group, hydrazide group and epoxy group.
  • a maleimide group, an iodoacetyl group, a bromoacetyl group, and a pyridyl disulfide group are used under conditions near neutrality. This is particularly preferable because it reacts specifically with a sulfhydryl group.
  • the cushion protein is preferably a protein having a function of mitigating the influence of a direct interaction between a molecule immobilized on a substrate and a solid surface, such as a stefin A mutant, an ankyrin repeat Any one selected from the group consisting of a protein variant, collagen, VHH antibody and gelatin is preferable because it has high thermal stability and hardly undergoes structural change.
  • the low molecular weight antibody molecule is preferably at least one selected from the group consisting of a VHH antibody, an IgNAR antibody, an scFv, and a peptide aptamer from the viewpoint of good accessibility to the antigen.
  • the antibody is more preferably selected from the group consisting of a VHH antibody, an IgNAR antibody, an scFv, and a peptide aptamer because of its low molecular weight and high thermal stability.
  • Another aspect of the present invention is an immunoassay method using the above-described immunoassay antibody-polysaccharide conjugate.
  • the immunoassay method is preferably an ELISA method or an immunochromatography method from the viewpoint that measurement can be performed quickly with high sensitivity.
  • an antibody or the like is covalently bound to a water-soluble polysaccharide via a linker containing a cushion protein. For this reason, it is possible to form a conjugate that is more stable and has a high orientation of the antibody as compared with a complex bound by a non-covalent bond. Further, by controlling the amount and structure of the reactive functional group introduced into the side chain of the water-soluble polysaccharide, the number of antibody molecules that can be bound and the interval between the antibodies can be freely designed. This makes it possible to control the avidity effect that can be induced in the antibody-polysaccharide conjugate.
  • the structure of the antibody can be stabilized without impairing the antigen affinity due to the molecular chaperone effect of the water-soluble polysaccharide.
  • non-specific adsorption can be suppressed by the hydrophilic property of the polysaccharide, and the antigen detection sensitivity can be enhanced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a normal antibody, a heavy chain antibody and a VHH antibody.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the state of the VHH antibody adsorbed directly or indirectly on the solid surface.
  • A is a complex with VHH antibody and tag (hereinafter referred to as “antibody complex”)
  • B is a complex with VHH, cushion protein (STM) and tag.
  • C uses a conjugate in which VHH is directly bound to a sugar chain as a scaffold
  • (D) uses a conjugate in which VHH is bound to the sugar chain via a cushion protein. It is the figure which showed each case typically.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a normal antibody, a heavy chain antibody and a VHH antibody.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the state of the VHH antibody adsorbed directly or indirectly on the solid surface.
  • A is a complex with VHH antibody and tag (hereinafter referred to as “antibody complex”)
  • B is a complex with
  • FIG. 3 is a schematic diagram when the antibody-polysaccharide conjugate of the present invention is used in a sandwich ELISA method.
  • FIG. 4A shows a flow (part 1) of the method for preparing the antibody-polysaccharide conjugate of the present invention.
  • FIG. 4B shows a flow (part 2) of the method for preparing the antibody-polysaccharide conjugate of the present invention.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence of an antibody complex consisting of a VHH antibody-stefin A mutant.
  • FIG. 6 shows 1 H NMR spectral data.
  • A shows the spectrum data of 1 H NMR of pullulan.
  • B shows 1 H NMR spectral data when ethylenediamine is bonded to a linker bonded to pullulan.
  • C shows 1 H NMR spectrum data when an iodoacetyl group is bonded to a linker bonded to pullulan.
  • D shows the 1 H NMR spectrum data when L-cysteine is bound to the linker bound to pullulan.
  • FIG. 7 is a graph showing the detection sensitivity in the sandwich ELISA method when only the VHH antibody is used and when the VHH antibody-pullulan conjugate is used.
  • FIG. 8 is a graph showing the detection sensitivity in the sandwich ELISA method when a conjugate of VHH-cushion protein (VHH-STM) is used.
  • FIG. 9 is a graph showing detection sensitivity in the sandwich ELISA method when a VHH-STM conjugate is used, a VHH-STM-pullulan conjugate is used, and a mouse monoclonal antibody is used.
  • FIG. 10 is a graph showing the detection sensitivity in the sandwich ELISA method when only the VHH antibody is used and when the VHH antibody-STM conjugate is used.
  • FIG. 3 In the present invention, as described above, (a) a water-soluble polysaccharide having a plurality of side chains and (b) a low molecular antibody molecule connect (c) the side chain and the low molecular antibody molecule.
  • This is an antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay linked via a linker (see FIG. 3, steps 1 and 2).
  • a water-soluble polysaccharide having a plurality of side chains will be described below, divided into (a-1) a water-soluble polysaccharide and (a-2) a plurality of side chains.
  • the water-soluble polysaccharide (shown as “PS” in the figure) is on a solid surface (shown as “SP” in the figure) such as an immunoassay substrate described later.
  • SP Solid surface
  • Function as a scaffold for immobilizing the above-described antibodies indicated as “VH” in the figure
  • polysaccharide is a compound produced by dehydration condensation of two or more molecules of monosaccharide, and the molecular weight is not particularly limited.
  • water-soluble polysaccharide refers to a polysaccharide having a property of being dissolved in water, and means having abundant reactive hydroxy groups in the side chain. Since such a hydroxyl group rich in reactivity is easily chemically modified, it is used to attach the water-soluble polysaccharide to a substrate for immunoassay or the like, as will be described later. It also has a function of controlling the orientation of the cushion protein when a linker, which will be described later, binds to the side chain. On the other hand, non-specific adsorption of proteins other than the target protein (hereinafter sometimes referred to as “target protein”) can be suppressed.
  • the water-soluble polysaccharides are roughly classified into linear polysaccharides and branched polysaccharides.
  • linear means that the main chain is not branched or the length is sufficiently short with respect to the chain length of the main chain.
  • the chain length of the branched chain is preferably 1/2 or less of the length of the main chain.
  • the use of a linear polysaccharide makes it easy to control the chain length, can sufficiently fulfill the role of forming a scaffold for immobilizing the antibody, etc., and is nonspecific for the antigen. This is preferable because it is difficult to cause a reaction.
  • the water-soluble polysaccharides can be roughly classified into simple polysaccharides (homopolysaccharides) composed of one type of monosaccharide and complex polysaccharides (heteropolysaccharides) composed of a plurality of monosaccharides.
  • simple polysaccharide include pullulan, dextran, agarose, curdlan, glucomannan, hyaluronic acid, alginate, carrageenan, gellan gum, chitosan salt and water-soluble chitin.
  • hyaluronic acid in which two sugars N-acetylglucosamine and glucuronic acid are linked by ⁇ 1-4 and ⁇ 1-3 bonds, and ⁇ -D-mannuronic acid and ⁇ -L-guluronic acid are ⁇ 1- 4-linked alginate, and their sodium or potassium salts; carrageenan composed of D-galactose, 4 sugars, 2 glucose, 1 glucuronic acid and 1 rhamnose in the main chain Gelatin gum, chitosan salt with ⁇ 1-4 linked glucosamine, chitin with long-acetyl-D-glucosamine bound water-soluble chitin partially deacetylated with aqueous alkali such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide Etc. can be mentioned. This is because chemical modification of the side chain of the polysaccharide is easy.
  • the first reason is that the functional groups of the side chains of the constituent saccharides of the above-mentioned polysaccharide are all highly reactive hydroxy groups, so that the linker and the functional group can be easily combined.
  • the reason for this is that the orientation control of the linker to be bonded becomes easy. This is because the low-molecular antibody molecules bound to the linker are arranged in an orderly manner on the immunoassay base material and the like, so that the measurement sensitivity is further improved.
  • the side chain will be described later.
  • the water-soluble polysaccharide has a plurality of side chains, and these plural side chains are the side chains of the constituent sugars of the polysaccharide.
  • the low molecular weight antibody molecule mentioned later is couple
  • a linker is bonded to the functional group of the side chain of the water-soluble polysaccharide, and then a covalent bond is formed between the linker and the low-molecular antibody molecule, and the antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay Is prepared (see FIGS. 4A and B).
  • Examples of the functional group of the side chain include a hydroxy group, a ketone group, a formyl group, a carboxyl group, a sulfone group, a thiol group, an amino group, an imino group, a cyano group, and a nitro group.
  • linker is a linking group having a function of linking the water-soluble polysaccharide and a low molecular antibody described later, and at least an amino acid of the low molecular antibody molecule. It includes a reactive functional group that reacts with a residue and a cushion protein. This linking group is bound to the low molecular weight antibody via its amino acid residue and the cushion protein, and to the above-mentioned polysaccharide side chain via a reactive functional group that can be bound ( (See FIG. 4B).
  • the reactive functional group is a sulfhydryl group present in the cysteine side chain, a primary amine present in the N-terminus of the polypeptide or the side chain of a lysine residue
  • functional groups that react with carboxyl groups present on the C-terminus of the polypeptide group, in the aspartic acid side chain, and in the glutamic acid side chain can be exemplified.
  • Examples of the functional group that reacts with the sulfhydryl group include a haloacetyl group, a maleimide group, an aziridine group, an acryloyl group, a vinyl sulfone group, a pyridyl disulfide group, a thiol group, and a disulfide group.
  • Examples of functional groups that react with primary amines include isothiocyanate groups, isocyanate groups, acyl azide groups, aldehyde groups, epoxy groups, imide ester groups, and carbodiimide groups.
  • the compound having an imide ester group includes N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester).
  • the functional group that reacts with the carboxyl group is a carbodiimide group or the like.
  • the compound having a carbodiimide group includes 1-ethyl-3-(-3dimethylaminopropyl) carboxylic acid imide hydrochloride and N ′, N′-dicyclohexylcarbodiimide.
  • the reactive functional group includes maleimide group, iodoacetyl group, bromoacetyl group, pyridyl disulfide group, N-hydroxysuccinimide ester group, imide ester group, aldehyde group, propionaldehyde group, butyraldehyde group, hydrazide group and epoxy group. Any one selected from the group consisting of is preferable from the viewpoint of the efficiency of reaction with an antibody or the like.
  • the maleimide group reacts specifically with the sulfhydryl group in the range of pH 6.5-7.5 and the iodoacetyl group and bromoacetyl group each in the range of pH 7.2-9, forming a stable thioether bond.
  • Pyridyl disulfides also react with sulfhydryl groups in a wide pH range to form stable disulfide bonds.
  • the polysaccharide itself does not have a sulfhydryl group, so the presence of these reactive functional groups allows the sulfhydryl group and linker contained in antibodies, etc., to be bound stably in a solution at a pH near neutral. It is preferable at the point which can be made.
  • the “cushion protein” is a protein that is contained in the linker and binds to a low molecular antibody.
  • a cushion protein is used for the purpose of alleviating the influence of direct interaction between a biopolymer and a solid surface.
  • a cushion protein with a polystyrene tag is coated on a solid phase (hydrophilic polystyrene) and used to link a target protein via a flexible linker.
  • the cushion protein directly binds to the solid phase and functions as a scaffold for binding the target protein.
  • the above-mentioned water-soluble polysaccharide plays a role as a scaffold that directly binds to the solid phase.
  • the cushion protein plays a role of controlling the orientation of the low-molecular antibody.
  • the linker may contain at least one molecule of cushion protein. When two or more molecules of cushion protein are included, they may be the same protein or different proteins.
  • the cushion protein used in the present invention is the same as the low molecular weight antibody bound to the cushion protein in order to prevent itself from becoming a steric hindrance upon binding of the low molecular weight antibody and the antigen. Or it is preferable that it is the magnitude
  • Specific examples include a stefin A mutant, an ankyrin repeat protein mutant, collagen, a VHH antibody, and gelatin. These proteins can be preferably used because they have high thermal stability and hardly undergo structural changes.
  • the low molecular weight antibody and the cushion protein contained in the linker may be directly bound by a peptide bond or indirectly bound.
  • a peptide sequence necessary for gene recombination such as a protein purification tag sequence or a specific recognition sequence, may be sandwiched between the low-molecular antibody and the cushion protein.
  • the tag sequence or peptide sequence as described above may be included between them.
  • cushion protein since the antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay of the present invention is used in an ELISA method, proteins having enzyme activity or binding activity, or proteins that non-specifically adsorb other proteins are not suitable as cushion proteins. Eligible. Cushion protein has properties such as affinity to the solid phase substrate used for immunoassay, non-self-association, etc., high thermal stability, and stable structure It is necessary to have characteristics such as
  • the cushion protein used in the present invention may be a natural protein, but may be a protein prepared from a gene prepared by a gene recombination technique or a variant obtained by modifying them. Such protein modification can be performed according to a conventional method.
  • a fusion gene comprising an antibody gene that binds to the target protein (antigen) and a cushion protein gene is prepared, and this fusion gene is expressed in an appropriate expression system, and the antibody And the antibody complex containing cushion protein may be directly prepared.
  • the amino acid sequence of the antibody complex includes a sequence necessary for gene recombination, such as a purification tag sequence or a specific recognition sequence, this fusion protein can be easily purified. It becomes like this.
  • the cushion protein is designed so that cysteine, lysine, glutamic acid, or aspartic acid is arranged at the N-terminus or C-terminus of the cushion protein so as to ensure binding with the linker.
  • cushion protein for example, a stefin A mutant, an ankyrin repetitive protein mutant, collagen, VHH antibody, and gelatin are preferably used from the viewpoint of thermal stability.
  • the Stefin A mutant is a protein obtained by modifying Stefin A by a gene recombination technique.
  • the fourth glycine of the amino acid sequence of wild type Stefin A is tryptophan
  • the 48th valine is aspartic acid
  • the 71st lysine is asparagine
  • the 72nd serine is glycine
  • the 73rd A protein in which leucine is mutated to proline is a stefin A mutant.
  • the amino acid sequence is shown in FIG.
  • An ankyrin repetitive protein mutant is a protein obtained by modifying an ankyrin repetitive protein using a gene recombination technique.
  • an ankyrin repeat protein module consisting of a desired amino acid sequence is prepared according to a conventional method, and in this obtained module, the N-terminal and C-terminal cappin module parts of the repeat domain of a natural ankyrin repeat protein are combined. Obtained by substitution. In this way, an ankyrin repetitive protein variant that has high thermal stability and is unlikely to undergo structural changes can be obtained.
  • low molecular antibody molecule refers to an antibody fragment in which a full-length antibody (whole antibody, such as whole IgG, etc.) is partially deleted. It is preferable to include either or both (see FIG. 1).
  • the amino acid sequence of VH or VL can include substitutions, deletions, additions and / or insertions.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv.
  • specific examples of low molecular weight antibodies include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain chain Fv), diabody, and only the variable part of the Fab part.
  • sc (Fv) 2 single chain heavy chain antibody variable regions obtained from camelids, IgNAR antibodies or scFv obtained from cartilaginous fish, and peptide aptamers, etc.
  • any one selected from the group consisting of VHH antibody, IgNAR antibody, scFv, and peptide aptamer can be preferably used.
  • multimers for example, dimers, trimers, tetramers, polymers
  • these low molecular antibodies are also included in the low molecular antibodies of the present invention.
  • low molecular weight antibodies have lower molecular weight and higher thermal stability than full-length antibodies, high solubility in aqueous solutions, high production by microorganisms, good regeneration from denatured state, proteins It is known to have many excellent properties such as easy production and modification using engineering techniques.
  • the low molecular antibody can be obtained by, for example, treating an antibody with an enzyme such as papain, pepsin, or plasmin to produce an antibody fragment.
  • the VHH antibody is a 12 kDa single domain antibody derived from a camelid, and has a characteristic of high thermal stability.
  • camelids include llama, guanoco, vicugna, alpaca, bactrian camel and dromedary.
  • VHH antibodies can also be collected and collected from serum of these animals.
  • an appropriate host cell into which an expression vector into which a gene encoding these antibody fragments has been introduced for example, an antibody fragment expressed by culturing E. coli is isolated and purified from a culture solution containing the host cell.
  • Co et al. J. Immunol.
  • IgNAR Ig-new antigen-receptor antibody
  • cartilaginous fish examples include sharks and rays.
  • ScFv single-chain variable fragment
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • Any linker that satisfies the above conditions may be either a peptide linker or a non-peptide linker.
  • peptidic linkers include Stefin A mutant, ankyrin repeat protein mutant, collagen, VHH antibody, and gelatin.
  • Non-peptidic linkers include polymers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyvinyl alcohol. Can be mentioned.
  • the antibody or antibody complex is bound to the water-soluble polysaccharide having a plurality of side chains obtained as described above via a linker as described below, and the antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay is obtained.
  • the immunoassay includes other methods using antigen-antibody binding reactions such as ELISA, immunochromatography, immunoblotting, dot blotting, multi-fluorescence microbeads, etc., but ELISA or immunochromatography is preferred. Can be used.
  • the linker to be bound to the side chain of pullulan can be prepared by a known method by arbitrarily combining the reactive functional group of the linker and the amino acid residue such as an antibody to be bound thereto.
  • a linker having a reactive functional group that reacts with a sulfhydryl group such as an antibody is bonded to the hydroxyl group of the side chain of a water-soluble polysaccharide of pullulan
  • the linker is water-soluble in a dimethyl sulfoxide (DMSO) solvent.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • CDI 1,1′-carbonyldiimidazole
  • VHH antibody-pullulan conjugate which is an antibody-polysaccharide conjugate employing VHH antibody as an antibody and pullulan as a water-soluble polysaccharide, is prepared by the following procedure.
  • VHH-STM complex An antibody complex composed of a desired VHH antibody, for example, an anti-human survivin VHH antibody and a stefin A mutant (hereinafter sometimes referred to as “VHH-STM complex”). The case where it is used will be described as an example.
  • a gene encoding the amino acid sequence of the VHH-STM complex (SEQ ID NO: 1) is synthesized. This synthesis can be carried out by requesting a company commissioned to synthesize DNA.
  • a PCR reaction solution having the composition shown in Table 1 below is prepared, and the above gene is amplified by PCR under the desired conditions using primers such as those shown in SEQ ID NOs: 2 to 5, for example.
  • the PCR program is, for example, (a) 95-98 °C (10 seconds), (b) 53-60 °C (15 seconds), (c) 65-72 °C (30 seconds), and steps (a)-(c ) Can be 25-35 cycles.
  • VHH-STM complex By purifying the obtained PCR product, an insert gene encoding a desired amount of VHH-STM complex can be obtained. Such purification can be performed using a commercially available purification kit (for example, QIAquick PCR-Purification kit manufactured by Qiagen) according to the manual attached to the kit. In the “VHH-STM complex”, a protein can also be indicated.
  • a commercially available purification kit for example, QIAquick PCR-Purification kit manufactured by Qiagen
  • An expression vector for transformation is prepared as follows.
  • As an expression vector a plurality of expression vectors in which, for example, four types of signal sequences shown in Table 2 below are incorporated can be used. Twelve types of expression vectors can be prepared by incorporating each of the four types of signal sequences shown in Table 2 below into three types of expression vectors (pBIC, pBICm, and pBICs).
  • Transformation Transformation can be performed using a commercially available kit (for example, BIC System (manufactured by Takara Bio Inc.)) or the like according to the manual attached to this kit. That is, a DNA solution obtained by mixing the above expression vector and the above PCR product is added to a solution containing desired bacteria, seeded on an appropriate plate medium, and cultured at about 28-35 ° C. overnight. The transformant of these bacteria can be obtained as a single colony. Examples of the desired bacterium include Brevibacillus choshinensis.
  • Suitable plate media include MTNm plate media (10 g / L glucose, 10 g / L phyton peptone, 5 g / L Erlich skipjack extract, 2 g / L yeast extract B2, 10 mg / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 mg / L ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 50 ⁇ g / mL neomycin).
  • MTNm plate media (10 g / L glucose, 10 g / L phyton peptone, 5 g / L Erlich skipjack extract, 2 g / L yeast extract B2, 10 mg / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 mg / L ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 50 ⁇ g / mL neomycin).
  • the single colony transformed as described above is suspended in an appropriate medium and cultured at about 30 to 33 ° C. for 1.5 to 2.5 days, and the culture supernatant is recovered, The protein produced by the transformed bacteria is purified.
  • the sample obtained by purification is subjected to SDS-PAGE analysis according to a conventional method to confirm protein expression.
  • Suitable media include, for example, 2SYN medium (20 g / L glucose, 40 g / L Bacto Soytone, 5 g / L Bacto Yeast Extract, 0.15 g / L CaCl 2. 2H 2 O, 50 ⁇ g / mL neomycin) and the like.
  • the protein produced by the transformant may be purified using a commercially available kit (for example, His Spin Trap kit (manufactured by GE Healthcare)) according to the manual attached to this kit.
  • the above SDS-PAGE is stained with a desired staining solution, for example, Coomassie Brilliant Blue (CBB), and the cells are collected from a sample in which a specific band is recognized by CBB staining. Thereafter, the plasmid is extracted from the collected cells. Plasmid extraction can be performed using a commercially available kit (for example, Plasmid DNA Extraction Mini Kit (Favorgen)). Sequence analysis of the obtained plasmid is performed according to a conventional method, and it is confirmed that the sequence of the VHH-STM complex is incorporated.
  • a desired staining solution for example, Coomassie Brilliant Blue (CBB)
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • VHH-STM complex is prepared from the culture supernatant and stored.
  • a binding buffer for example, about 15 to 25 mM sodium phosphate [pH about 7.4]
  • Buffer exchange is performed with about 450 to 550 mM NaCl or 5 to 15 mM Tris-HCl [pH about 8.0], about 450 to 550 mM NaCl).
  • Ni-NTA Agarose Qiagen equilibrated with a binding buffer, and a washing buffer (for example, about 15 to 25 mM sodium phosphate [pH about 7.4], about 450 to 550 mM NaCl, about Wash with 15-25 mM imidazole or about 5-15 mM Tris-HCl [pH about 8.0], about 450-550 ⁇ mM NaCl, about 15-25 mM imidazole, then elution buffer (about 15-25mM phosphorus) Sodium oxalate (pH 7.4), 450-550 mM NaCl, 200 200-300 mM imidazole, or 5-15 mM Tris-HCl [pH ⁇ 8.0], 450-550 mM NaCl, 200-300 mM imidazole) Elute the VHH-STM complex at
  • PBS -
  • TBS about 25-75 mM Tris-HCl [pH about 8.0], about 100-200 mM NaCl
  • the tube is centrifuged at about 600 to 800 ⁇ g for about 4 to 8 minutes to remove the supernatant, the precipitate is suspended in about 0.5 to 1.5 ⁇ mL of 2-propanol, and again at about 600 to 800 ⁇ g. Centrifuge for approximately 4-8 minutes and remove the supernatant.
  • Add about 1.5-2.5 mL of distilled water to the resulting precipitate incubate at about 40-60 °C for complete dissolution, and then dialyze in distilled water for about 20-30 hours using a dialysis tube. To do.
  • a syringe filter pore size: about 0.45 ⁇ m
  • This reaction solution is transferred to, for example, Amicon® Ultra-0.5 mL (NMWL: 100,000), and centrifuged at about 12,000 to 16,000 ⁇ g at about 20 to 26 ° C. for about 8 to 12 minutes. After discarding the membrane permeate in this device, add approximately 300-500 ⁇ L of concentrated solution, and centrifuge at approximately 12,000-16,000 ⁇ g at approximately 20-26 ° C. for approximately 8-12 minutes. This operation is repeated three times to concentrate, and the resulting concentrated solution is centrifuged at about 1,500 to 2,500 ⁇ g at about 20 to 26 ° C. for 1.5 to 2.5 minutes to obtain iodoacetylated pullulan. Obtainable.
  • Half of the solution collected by the above centrifugation is diluted with about 500 to 700 ⁇ L of heavy water and subjected to NMR analysis to confirm iodoacetylation of the amino group.
  • the resulting iodoacetylated pullulan / heavy aqueous solution (about 70 ⁇ 80 mg), about 350-450 ⁇ L distilled water, about 160-180 ⁇ L about 0.1-0.3 M boric acid-sodium hydroxide buffer (pH about 8.4), and about 30-40 ⁇ L about 0.05-0.15 M Of L-cysteine is added and stirred at room temperature for about 1.5-3 hours.
  • the obtained concentrated solution was centrifuged at about 1,500 to 2,500 ⁇ g at about 20 to 26 ° C. for about 1 to 3 minutes, and the collected solution was diluted with about 500 to 700 ⁇ L of heavy water for NMR analysis. Confirm that the iodoacetylated pullulan reacted with the sulfhydryl group of L-cysteine to form a thioether bond.
  • the reaction solution obtained after completion of stirring is transferred to Amicon Ultra-0.5 mL (NMWL: 100,000) and centrifuged at about 12,000-16,000 ⁇ g at about 0-6 ° C. for about 8-12 minutes. After discarding the membrane permeate, add approximately 300 to 500 ⁇ L of boric acid-sodium hydroxide buffer (pH approximately 8.4) to the resulting concentrated solution, approximately 12,000 to 16,000 ⁇ g, approximately 20 to 26 ° C. Centrifuge for approximately 8-12 minutes. This operation is repeated again, and the resulting concentrated solution is centrifuged at about 1,500 to 2,500 ⁇ g at about 0 to 6 ° C. for about 1.5 to 2.5 minutes to obtain a VHH antibody-pullulan conjugate.
  • Amicon Ultra-0.5 mL NMWL: 100,000
  • boric acid-sodium hydroxide buffer pH approximately 8.4
  • a carboxylic acid is obtained by utilizing an oxidation reaction.
  • carboxymethyl group is introduced by reacting chloroacetic acid, bromoacetic acid or the like with the hydroxyl group of the polysaccharide side chain.
  • NHS and carboxylic acid are esterified under predetermined conditions to form a linker having an imide ester group on the side chain of the water-soluble polysaccharide.
  • the linker thus prepared can be bound to an antibody or the like under predetermined conditions.
  • the antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay of the present invention can be prepared by binding the above-mentioned linker having an iodoacetyl group to a sulfhydryl group of cysteine such as an antibody under predetermined conditions.
  • the above-described immunoassay antibody-polysaccharide conjugate of the present invention can be prepared by binding a linker having an imide ester group to a primary amine of lysine such as an antibody under the predetermined conditions.
  • Another embodiment of the present invention is an immunoassay method using the antibody-polysaccharide conjugate for immunoassay.
  • a sandwich ELISA method can be performed using the immunoassay antibody-polysaccharide conjugate prepared as described above.
  • an antibody-polysaccharide conjugate is dissolved in a predetermined concentration of buffer to prepare an antibody-polysaccharide conjugate solution.
  • This is placed in a 96-well microplate, and the antibody-polysaccharide conjugate is adsorbed to a solid phase under predetermined conditions.
  • a blocking agent such as skim milk is added thereto to block the solid phase.
  • a target protein solution having a predetermined concentration is added and left standing for a predetermined time (see FIG. 2, step 3).
  • a plurality of antibodies of the antibody-polysaccharide conjugate and a plurality of target proteins can be bound, and a high avidity effect can be obtained.
  • a primary antibody capable of binding to the target protein is added and allowed to stand for a predetermined time, and then washed several times with a washing buffer.
  • the enzyme-labeled secondary antibody is added and allowed to stand for a predetermined time.
  • an enzyme substrate is added, and the product of the enzyme reaction is detected with a plate reader or the like.
  • the target protein can be detected with high sensitivity by using a plurality of enzyme labels bound via an antibody-polysaccharide conjugate (see FIG. 2, step 4).
  • Still another embodiment of the present invention is an antibody complex composed of a low molecular antibody and a cushion protein.
  • the cushion protein is preferably one selected from the group consisting of a Stefin A mutant, an ankyrin repetitive protein mutant, collagen, a VHH antibody, and gelatin.
  • the low molecular antibody is preferably any one selected from the group consisting of a VHH antibody, an IgNAR antibody, an scFv, and a peptide aptamer.
  • VHH for antibody complexes used in both Examples and Comparative Examples was prepared according to the following production examples.
  • Production of VHH for antibody complex containing VHH antibody and Stefin A mutant (1) Construction of insert gene The gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of an antibody complex consisting of an anti-human survivin VHH antibody and a stefin A mutant (hereinafter referred to as VHH-STM complex) is synthesized by commissioning Eurofin Genomics Co., Ltd. (See FIG. 4).
  • a PCR reaction solution having the composition shown in Table 3 was prepared, and the gene was amplified by the PCR program under the following conditions using the following primers (SEQ ID NOs: 2 to 5).
  • the PCR program was (a) 98 ° C. (10 seconds), (b) 55 ° C. (15 seconds), (c) 68 ° C. (30 seconds), and steps (a) to (c) were performed 30 cycles.
  • the PCR product obtained was purified using a QIAquick® PCR purification kit (manufactured by Qiagen) according to the attached manual.
  • Expression vector construction As expression vectors, 12 types of expression vectors (Takara), each of which incorporates one of the four signal sequences shown in Table 4 below into three types of expression vectors (pBIC, pBICm and pBICs). (Manufactured by Bio Inc.).
  • Liquid culture Single colonies of transformed bacteria are 2SYN medium (20 g / L glucose, 40 g / L Bacto Soytone, 5 g / L Bacto Yeast Extract) , 0.15 g / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 50 ⁇ g / mL neomycin) at 30 ° C. for 2 days.
  • 2SYN + Arg medium (20 g / L glucose, 40 g / L bacto-seuton, 5 g / L bacto-east extract, 0.15 g / L CaCl 2 ⁇ 2H) 2 O, 50 ⁇ g / mL neomycin, 200 mM arginine) at 30 ° C. for 2 days.
  • PBS ⁇
  • TBS 50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl
  • Example 1 Preparation of VHH Antibody-STM Complex-Pullan Conjugate (1) Preparation of Aminated Pullulan First, 9.75 mg of pullulan (manufactured by Hayashibara) was added to 950 ⁇ L of DMSO (manufactured by Kanto Kagaku). After dissolution, 19.3 ⁇ L of 1.6M CDI / DMSO solution was added. After incubation at 50 ° C. for 40 minutes, 50.2 ⁇ L of ethylenediamine was added and incubated at 50 ° C. for 42 hours. After cooling to room temperature, 1 mL of 2-propanol (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added and ice-cooled for 15 minutes.
  • DMSO manufactured by Kanto Kagaku
  • 2-propanol manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.
  • reaction vessel was centrifuged at 700 ⁇ g for 6 minutes using a Hitachi micro high-speed centrifuge CF16RXII type and an angle rotor (T15A39-0535) (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.) to remove the supernatant.
  • the precipitate was suspended in 1 mL of 2-propanol and centrifuged at 700 ⁇ g for 6 minutes to remove the supernatant.
  • reaction solution was transferred to Amicon Ultra-0.5 mL (NMWL: 100,000) and centrifuged at 14,000 ⁇ g, 23 ° C. for 10 minutes. After discarding the membrane permeate, 400 ⁇ L of heavy water was added to the concentrate, followed by centrifugation at 14,000 ⁇ g and 23 ° C. for 10 minutes. This operation was performed 3 times in total.
  • the collected solution was collected by centrifugation at 2,000 ⁇ g, 23 ° C. for 2 minutes, and diluted with 600 ⁇ L of heavy water and measured by 1 H NMR.
  • peaks characteristic of 3.04, 3.13 ppm (cysteine side, -S-CH 2- ) and 3.34 ppm (pullulan side, -S-CH 2- ) were detected, and iodoacetylated pullulan was found to be L-cysteine. It was confirmed that it reacted with a sulfhydryl group to form a thioether bond (see D in FIG. 5).
  • VHH antibody-pullulan conjugate obtained in Example 2 was added to 50 mM sodium borate buffer and 5 mM EDTA (pH 8.4) to 100.
  • a double diluted VHH-pullulan conjugate solution was prepared.
  • 50 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl (TBS, pH 7.6), 0.1% Tween-20 was used as a washing buffer.
  • reaction buffer 50 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl (TBS, pH 7.6), 0.05% Tween-20, 2 mg / mL Bovine Serum Albumin (Fraction V, Fatty Acids / IgG / Protease Free, WAKO, # 017-25771) was used as the reaction buffer.
  • Human survivin (1-142 aa, N-terminal calmodulin tag, recombinant, # SUR0801) was purchased from ATGen Co., Ltd. Using the above reaction buffer, 100 ng / mL, 10 ng / mL, and 1 ng / mL survivin dilution series were prepared.
  • Rabbit anti-survivin polyclonal antibody (# NB500-201) was purchased from Novus Biologicals. A 0.1 ⁇ g / mL rabbit anti-survivin polyclonal antibody solution was prepared using the reaction buffer.
  • Goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody HRP labeling (# ab97051) was purchased from Abcam. A 0.2 ⁇ g / mL goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody HRP labeling solution was prepared using the reaction buffer. TMB solution (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd., ELISA method POD substrate TMB kit (Popular) -2 solution type) was used as a color developing solution. As the stop solution, 1 mol / L sulfuric acid was used.
  • VHH antibody (10 ⁇ g / mL, 100 ⁇ L / well) or VHH antibody-pullulan conjugate solution to a 96-well microplate at 100 ⁇ L / well, and add 12 at 4 ° C. Let stand for hours. The solution was removed, a skim blocker stock solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added at 200 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • a skim blocker stock solution manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • L-cysteine / 50 mM boric acid-sodium hydroxide buffer solution and 5 mM EDTA (pH 8.4) were added to a concentration of 100 ⁇ L / well at room temperature. Left for 1 hour. After removing the solution and washing 3 times with the washing buffer, the Survivin dilution series was added to 100 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the rabbit anti-survivin polyclonal antibody was added at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed and the plate was washed 3 times with a washing buffer, and then the above goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody HRP label was added at 100 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed and washed 3 times with a washing buffer. The TMB solution was added at 100 ⁇ L / well and stirred for 30 seconds, and then allowed to stand for 14 minutes and 30 seconds.
  • the above stop solution was added to 100 ⁇ L / well, stirred for 30 seconds, and immediately measured with a plate reader (ChroMate 4300 series, manufactured by Awareness Technology) (main wavelength 450 mm, subwavelength 630 nm) .
  • a plate reader ChroMate 4300 series, manufactured by Awareness Technology
  • main wavelength 450 mm, subwavelength 630 nm main wavelength 450 mm, subwavelength 630 nm
  • Comparative Example 2 Comparative Test by Sandwich ELISA Using a Pair of Normal Antibodies
  • Mouse anti-survivin monoclonal antibody (# WH0000332M1) was purchased from Sigma-Aldrich.
  • a mouse anti-survivin monoclonal antibody PBS (-) solution (1 ⁇ g / mL) was added to a 96-well microplate at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. Subsequent operations were performed in the same manner as the above sandwich ELISA. The results are shown in FIG. Although the antigen detection sensitivity of Comparative Example 2 was higher than that of Comparative Example 1, it was confirmed that Example 1 of the present invention exceeded the sensitivity of normal antibodies.
  • a 96-well microplate containing no STM, VHH antibody having the following sequence (hereinafter referred to as R7-A, 10 ⁇ g / mL) and VHH-STM complex (10 ⁇ g / mL) were each 100 ⁇ L / well. And allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours.
  • cushion protein examples include “a cushioning adsorbent containing SS25 peptide, SS25 ′ peptide, and / or cushion protein”.
  • Prior art 4 shows that the presence of the cushion protein is about 4 times higher than the activity in the absence of the cushion protein (about 8% when the solid phase binding is 100%), VHH It was thought that maintaining the antibody activity led to an improvement in ELISA detection sensitivity. However, using only the cushion protein did not reach the detection sensitivity when the detection was performed using the full-length antibody (see FIG. 7).
  • VHH antibody physical adsorption
  • linker chemical bond
  • polysaccharide- chemical bond
  • the linker contains cushion protein
  • the solid phase surface-linker-target substance (VHH antibody: binding via cushion protein-chemical bond)-polysaccharide (chemical bond)-cushion protein-target substance (VHH antibody) It was also shown that it can be configured.
  • the presence of the cushion protein enables recognition of a high target molecule between the solid phase and the polysaccharide.
  • a polysaccharide as a scaffold and binding a single chain antibody via a cushion protein, it has become possible to detect a target protein with higher sensitivity than when a full-length antibody is used.
  • the pullulan was used as a water-soluble polysaccharide, it is not limited to this. It has been confirmed that other water-soluble polysaccharides such as dextran, agarose, curdlan and glucomannan are also effective as scaffolds for binding antibodies.
  • the present invention is useful in the field of analytical chemistry.
  • AB1 Primary antibody AB2: Secondary antibody AG: Antigen EL: Enzyme label L: Linker PS: Polysaccharide SP: Solid phase surface VH: VHH antibody
  • SEQ ID NO: 1 Anti-human survivin VHH antibody-antibody complex containing Stefin A mutant gene
  • SEQ ID NO: 2 PCR forward primer
  • SEQ ID NO: 3 PCR forward primer
  • SEQ ID NO: 4 PCR forward primer
  • SEQ ID NO: 5 for PCR Reverse primer
  • SEQ ID NO: 6 Signal sequence for expression vector
  • SEQ ID NO: 7 Signal sequence for expression vector
  • SEQ ID NO: 8 Signal sequence for expression vector
  • SEQ ID NO: 9 Signal sequence for expression vector 10: VHH antibody not containing STM (R7- A) Array

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Abstract

本発明は、水溶性多糖類の少なくとも一つの側鎖に、リンカーを介して抗体又は抗体複合体が結合してなる免疫測定用抗体-多糖結合体及びそれを使用した免疫測定用方法を提供することを目的とする。　プルラン等の水溶性多糖類の側鎖の官能基に、リンカーを介してVHH抗体等の抗体、又はステフィンA変異体等のクッションタンパク質と抗体からなる抗体複合体を結合させることで、水溶性多糖類が免疫測定用の固相表面に吸着した際に、抗体の配向制御が容易になり、また、構造が安定で多価化した抗体が、他のタンパク質と非特異吸着せずに目的タンパク質と結合できる、高感度なサンドイッチELISA法やイムノクロマト法等の免疫測定用抗体－多糖結合体及びそれを用いた高感度免疫測定方法を提供する。

Description

抗体－多糖結合体及びそれを用いた高感度免疫測定方法
　本発明は、免疫学的測定方法のひとつである、ELISA法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；酵素免疫測定法）に関する。より詳細には、ELISA法のうち、後述するサンドイッチELISA法で試料を測定する際の検出感度を増強する方法及びその方法で使用する試薬に関する。
　ELISA法は、ある試料溶液中に含まれる目的とする抗原（以下、「標的抗原」という。）を、これらの抗原を特異的に認識する抗体（以下、「特異抗体」ということがある。）で捕捉し、それに引き続いて酵素反応を利用した検出又は定量を行う方法である。上記標的抗原は、Ｂ細胞に抗体産生を生じさせる抗原決定基（エピトープ）を有する物質をいい、一定の長さ以上のペプチド、タンパク質、糖鎖等が含まれる。
　本明細書において、「抗体」とは、天然抗体及び人工抗体の双方を含む。ここで、「天然抗体」とは、いずれかの脊椎動物が産生する抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体をいう。また、「人工抗体」とは、人工的に構築された抗体をいい、例えば、前記天然抗体のアミノ酸配列に適当な変異を導入した抗体その他、通常、自然界には存在しない構造を含むように改変を行った抗体をいう。
　上記のような抗原と抗体とを結合をさせた後に、試料溶液中に使用される酵素の基質を加えると、酵素活性に依存して色素が生成され、又は蛍光物質若しくは化学発光物質が生成される。そして、色素が生成された場合には吸光度を、また、蛍光物質又は化学発光物質が生成された場合には、蛍光又は化学発光等を測定して検出する。
　抗原と抗体との組合せによって、直接法、間接法、サンドイッチ法（以下、「サンドイッチ ELISA法」ということがある。）、競合法等に分類される。これらのうち、サンドイッチELISA法では、捕捉抗体及び検出抗体という２種類の抗体を使用する。前記捕捉抗体は、固相に結合させて使用するため、固相用抗体とも呼ばれる。このサンドイッチELISA法では、固相用抗体と検出抗体とで抗原を挟み込むことで抗原を検出し、定量する。
　サンドイッチELISA法では、通常、抗体として免疫グロブリン（以下、「IgG」、又は「全長抗体」ということがある。図１参照）が用いられる。IgGは単一分子の抗体であり、五量体となっている免疫グロブリンM（以下、「IgM」と略すことがある。）等と比べると、生体高分子としては分子量は小さいが、それでも分子量は約17万である。また、複数のドメインを有するIgGは人工的に合成することができない。このため、哺乳動物に抗原となる物質を一定の期間をおいて複数回投与（免疫）し、最終の投与の時から一定期間が経過した後に血液を採取し、血清中の抗体を精製する以外には、入手することができない。
　このように動物を免疫してIgGを入手するには、採決までの期間、動物を健常に飼育することが不可欠であり、また、投与する抗原も大量に必要である。さらに、採決した血液から血清を分離し、血清中の抗体を精製しなければならない。このため、所望の抗原と十分に結合し得る抗体を入手するためには、時間と費用が必要となる。
　こうした問題を解決するための１つの手段として、上述したようなIgGに代えて使用できる新たな抗原結合性分子の研究が進められてきた。こうした結合性分子としては、例えば、一本鎖ポリペプチドで構成され、かつ単体で標的物質を認識し、結合することのできる一本鎖抗体（single chain Fv：scFv）を挙げることができ、これらは単鎖抗体と呼ばれることもある。
　単鎖抗体は、天然のもの、例えば、ラクダ科の動物が産生する一本鎖抗体（以下、シングルドメイン抗体、「VHH抗体」又は「VHH」ということがある。図１参照。Zhang L., et al., 1993, Nature, 362:446-448）と遺伝子組換えによってつくられた非天然のものとに大別される。非天然の単鎖抗体は、この抗原結合部位を構成する2つの可変領域断片（重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)）を柔軟なリンカーで結んで作製された組換え抗体断片であり、例えば、一本鎖Ｆｖ（scFv:single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook, 1994 - 1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL）等を挙げることができる。これらの単鎖抗体は、比較的容易に微生物で発現させることができる。
　実際に、分子量がIgGの1/10未満であるVHHは、ファージディスプレイとその他の免疫反応を利用しないライブラリ（以下、「非免疫ライブラリ」ということがある。）を用いて人工的に作製することができる。
　ところで、一般的なIgGのKd（解離定数）は10-6～10-9 Mであり、これらのうち、10-9 Mを示すIgGは抗原親和性が高いと判断することができる。これに対し、非免疫ライブラリから得られるVHH抗体やIgNAR抗体のKdは10-5～10-8程度であり（非特許文献１及び非特許文献２参照）、IgGに比べて抗原親和性が低いことが知られている。
　ELISA法で安定した定量を行うためには、一定以上の抗原親和性が必要である。そして、抗原親和性を増強させる方法としては、多価化によるアビディティー（特異抗原との結合力）の導入が知られている。こうしたアビディティーを増強するには、動物細胞の発現系を用いて、VHH抗体のようなシングルドメイン抗体とタグ分子とを融合させた融合タンパク質として発現させ、その後、タグ分子を介して自己会合させることにより抗体多量体を構築した例が幾つか報告されている（以下、「従来技術１」という。非特許文献３参照）。
　ELISA法では、固相化抗原の抗原結合能が測定感度を上げる上で重要である。これまで、大腸菌等に産生させたリコンビナントVHH抗体を、ポリスチレン等の基材に直接物理吸着させると、上記VHH抗体が本来備えていた抗原結合力を失う傾向が非常に高いことが知られている（非特許文献４～６参照）。また、直接物理吸着させた固相化VHH抗体は、固相化IgG抗体に比べて、ELISA法に含まれる洗浄操作によって基材から剥離（脱落）しやすいことも知られている。
　上記のようなVHH抗体の直接物理吸着による抗原結合能の低下を改善する方法として、ストレプトアビジンとビオチンとを用いる方法がある。具体的には、基材表面にストレプトアビジンを吸着させ、VHH抗体をビオチンと結合させてビオチン化VHHとし、上記基材表面に吸着したストレプトアビジンを介してビオチン化VHHを間接的に固相化する方法（以下、「従来技術２」という。非特許文献７参照)が知られている。
　また、VHH抗体の末端に基材に特異的に結合するペプチド（以下、「基材特異的結合ペプチド」という。）を融合させ、この基材特異的結合ペプチドを介することにより、VHHの配向を制御しながら固相化する方法（以下、「従来技術３」という。非特許文献８参照）などが知られている。
　また、酵素等のタンパク質又はペプチドは、金属又は金属酸化物等で構成された固体表面に吸着すると活性が低下する（すなわち、結合能が低下する）ことが知られており、こうしたタンパク質やペプチドの活性の低下を改善する方法が提案されている。「特定の配列からなるペプチド、およびクッションタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つを含む、固体表面に吸着できるクッション性吸着剤」を使用することによって、酵素を固相化した際の残存活性を使用しない場合よりも向上させることができることが報告されている（以下、「従来技術４」という。特許文献１参照）。
　また、目的物質を結合するための足場として多糖を利用し、固相表面－（化学結合）－多糖－（化学結合）－目的物質（タンパク質、核酸など）という構成とすることで分子を検出するシステムが提案されている（以下、「従来技術５」という。特許文献２参照。）
特開2008-054599 特表2011-520111
Immunol. Today, 2000, 21, 371-378. Mol. Immunol. 2003, 40, 25-33 J. Immunol. Methods, 2007, 318, 88-94 J. Virol. 2008, 82, 9753-9764 Mol. Immunol. 1994, 31, 219-226 Anal. Biochem. 2003, 312, 113-124 PLoS One. 2013, 8, e83928 Biotechnol. Prog., 2015, 31, 1563-1570
　従来のサンドイッチELISA法で使用されているIgGに代えて、VHH抗体を使用しつつ、測定感度を維持するためには、抗原親和性の向上と、基材への物理吸着後の活性の維持という２つの課題を解決する必要がある。
　従来技術１は、大腸菌等を用いて、VHH抗体の価数が2～10程度の多量体（多価化抗体）を構築し、抗原親和性を増強させるという点では優れた技術である。しかし、大腸菌等によって産生される上記のような多価化抗体の産生量は、VHH抗体単独を産生させる場合と比較すると少ないという問題がある。
　また、多価化抗体の構築が可能なVHH抗体の最大分子数（価数）又はVHH抗体同士の空間的距離は、自己会合性タグ分子の構造又は性質に大きく依存する。このため、望み得るアビディティーの増強効果とVHH多量体の設計の自由度が大きく制限されるという問題もある。このことは、VHH抗体が持つ抗原親和性に見合ったアビディティーの増強効果の付与、又は付与すべきアビディティーの調節が難しいことを意味し、産業上利用する上での汎用性に乏しいという問題につながる。
　また、多量体の構築のために導入したタグ分子が非特異的吸着を起こし、こうした非特異的吸着が、ELISA法の際に、ブランクや低濃度領域のノイズとなって、検出感度を低下させる要因となるという懸念もある。
　従来技術２及び３は、固相表面に抗体を間接的に吸着させることから、抗体分子のコンフォメーションの変化を防ぐという点では優れた技術である（図2(A)及び(B)参照）。ここで、コンフォメーションの変化は、物理吸着による抗体分子上の接触面に生じると考えられる。VHH抗体の特性から、サンドイッチELISA法で使用するIgGに代替させれば、常温保存が可能な、ロット差の小さい製品が開発できるとも考えられる。
　しかし、低分子抗体であるVHH抗体の分子量は、上述したようにIgGの10分の1未満と小さい。このため、基材との接触面積もIgGよりもはるかに小さくなり、VHHが安定して吸着されないという問題がある（図2(A)及び(B)参照）。さらに、分子量が小さいことに起因して、抗原結合部位の構造に、より直接的な影響が出やすいという懸念もある。このため、サンドイッチELISA法に用いられる全長抗体を単にVHH抗体に代えると、しばしば、検出感度が大きく低下するという問題がある。
　また、従来技術４は、クッション性固相吸着材を介して目的のタンパク質を固相表面に吸着させると、直接目的タンパク質を吸着させた場合よりも高い残存活性を維持できるという点では優れた技術である。ここでは、サーモコッカス・コダカレンシスのリボヌクレアーゼHII又はその変異体が、クッション性固相吸着材として用いられている。しかし、クッション性固相吸着材を用いても、全長抗体を使用したときの検出感度には及ばず、検出感度のさらなる向上が必要とされているという問題がある。
　従来技術５は、目的物質を結合するための足場として、直鎖多糖であるデキストラン、分岐鎖多糖であるグリコーゲン及びアミロペクチンという多糖を利用し、検出感度の低下を抑制するという点では優れた発明である。
　しかし、化学結合に適した固相表面を用意しなければならないこと、化学結合を二度行うため、手間がかかるという問題がある。また、標的認識を行なうことができる接触面が少ないという問題がある（図1(C)参照）。
　以上から、サンドイッチELISA法において、検出感度を低下させることなく、抗体に代えて使用できる低分子抗体を含む免疫測定用として使用可能な材料（結合体）に対する強い社会的要請があった。また、高感度サンドイッチELISA法で使用可能な、前記結合体を使用する高感度免疫測定方法に対する強い社会的要請もあった。
　さらに、常温保存が可能で、製品のロット差が少ない、高感度サンドイッチELISA法用の試薬に対する強い社会的要請があった。
　このような状況を鑑み、本発明の発明者等は、ELISA法の感度を増強するための方法及びその方法で使用する試薬の研究を行い、側鎖に反応性官能基を導入した水溶性多糖類に、低分子抗体分子を共有結合させて抗体－多糖結合体を構築した。そして、上記抗体－多糖結合体を上述したELISA法用捕捉抗体として用いることにより、ELISA法の検出感度を増強できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の一態様は、水溶性多糖類、低分子抗体分子、並びに前記水溶性多糖類及び前記低分子抗体分子とをつなぐリンカーと、を含む免疫測定用抗体－多糖結合体であって、前記リンカーは、前記低分子抗体分子のアミノ酸残基と反応する反応性官能基と、クッションタンパク質とを含むことを特徴とする、免疫測定用抗体－多糖結合体である。
　ここで、前記水溶性多糖類は、抗体を結合する足場となり得るものであれば特に限定されず、直鎖状多糖類を使用すると、多糖類の鎖長の制御が容易であること、後述する抗体の配向制御又は前記多糖の側鎖の化学修飾が容易であること、多糖同士又は固相への非特異吸着を抑制できること、及び抗原抗体反応における立体障害を防止できることから好ましい。
　前記直鎖状水溶性多糖類としては、プルラン、デキストラン、アガロース、カードラン、グルコマンナン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、カラギーナン、ジェランガム、キトサン塩及び水溶性キチンからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが、これらの多糖類の側鎖の化学修飾が容易であることから好ましく、プルラン、デキストラン、アガロース、カードラン及びグルコマンナンからなる群から選ばれるいずれかであることが、反応性に富んだ水酸基が側鎖に多く含まれている点でより好ましい。
　ここで、前記反応性官能基は、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基基と、クッションタンパク質とを含むものであることが好ましい。
　ここで、前記反応性官能基は、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ピリジルジスルフィド基、イミドエステル基、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、ヒドラジド基及びエポキシ基からなる群から選ばれるいずれかであることが、抗体又は抗体複合体との結合安定性の点から好ましく、これらの中でも、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基及びピリジルジスルフィド基は、中性付近の条件下でスルフヒドリル基と特異的に反応するため、特に好ましい。
　前記クッションタンパク質は、基材に固定化された分子と固体表面との間に生じる直接的な相互作用の影響を緩和する機能を有するタンパク質であることが好ましく、例えば、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体及びジェラチンからなる群から選ばれるいずれかであることが、熱安定性が高く構造変化が起こりにくいことから好ましい。
　前記低分子抗体分子は、VHH抗体、IgNAR抗体、scFv及びペプチドアプタマーからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが、抗原に対するアクセシビリティがよいという点から好ましい。前記抗体は、VHH抗体、IgNAR抗体、scFv及びペプチドアプタマーからなる群から選ばれるいずれかであることが、分子量が小さく熱安定性が高いことからさらに好ましい。
　本発明の別の態様は、上述した免疫測定用抗体-多糖結合体を用いた免疫測定方法である。ここで、前記免疫測定方法は、ELISA法又はイムノクロマト法であることが、高感度で迅速に測定ができる点で好ましい。
　本発明によれば、本発明の免疫測定用抗体－多糖結合体では、抗体等がクッションタンパク質を含むリンカーを介して、水溶性多糖類と共有結合される。このため、非共有結合で結合された複合体と対比すると、より安定で、前記抗体の配向性の高い結合体を形成することができる。
　また、水溶性多糖類の側鎖に導入する反応性官能基の量や構造を制御することで、結合されうる抗体分子の数や抗体同士の間隔を自在に設計することができる。そして、これによって、前記抗体－多糖結合体において誘起されうるアビディティー効果を制御することが可能となる。
　さらに水溶性多糖類を使用していることから、水溶性多糖が有する分子シャペロン効果によって、抗原親和性を損なうことなく抗体の構造を安定化することができる。またこれとともに、多糖の有する親水性により非特異吸着を抑制することができ、抗原検出感度を増強することができる。
図１は、通常抗体、重鎖抗体及びVHH抗体の模式図である。 図２は、固相表面に直接又は間接に吸着したVHH抗体の状態を模式的に示した図である。（A）はVHH抗体とタグが結合した複合体（以下、「抗体複合体」ということがある。）を用いた場合、（B）はVHH、クッションタンパク質（STM）及びタグが結合した複合体を用いた場合、（C）はVHHが足場としての糖鎖に直接結合された結合体を用いた場合、（D）はVHHがクッションタンパク質を介して上記糖鎖に結合された結合体を用いた場合を、それぞれ模式的に示した図である。 図３は、本発明の抗体－多糖結合体をサンドイッチELISA法に使用した場合の模式図である。 図４Ａは、本発明の抗体-多糖結合体の調製方法のフロー（その１）を示す。 図４Ｂは、本発明の抗体-多糖結合体の調製方法のフロー（その２）を示す。 図５は、VHH抗体-ステフィンA変異体からなる抗体複合体のアミノ酸配列を示す。
図６は、1H NMRのスペクトルデータを示す。Ａは、プルランの1H NMRのスペクトルデータを示す。Ｂは、プルランに結合したリンカーにエチレンジアミンを結合させたときの1H NMRのスペクトルデータを示す。Ｃは、プルランに結合したリンカーにヨードアセチル基を結合させたときの1H NMRのスペクトルデータを示す。Ｄは、プルランに結合したリンカーに、Ｌ－システインを結合させたときの1H NMRのスペクトルデータを示す。 図７は、VHH抗体のみを使用した場合、及びVHH抗体-プルラン結合体を使用した場合のサンドイッチELISA法における検出感度を示したグラフである。 図８は、VHH-クッションタンパク質（VHH-STM）の結合体を使用した場合のサンドイッチELISA法における検出感度を示したグラフである。 図９は、VHH-STM結合体を使用した場合、VHH-STM-プルラン結合体を使用した場合、及びマウスモノクローナル抗体を使用した場合のサンドイッチELISA法における検出感度を示したグラフである。 図１０は、VHH抗体のみを使用した場合、及びVHH抗体-STM結合体を使用した場合のサンドイッチELISA法における検出感度を示したグラフである。
　以下に、本発明を、図３、図４Ａ及びＢを参照しつつ詳細に説明する。
　本発明は、上述したように、（ａ）複数の側鎖を有する水溶性多糖類と、（ｂ）低分子抗体分子とが、（ｃ）前記側鎖と前記低分子抗体分子とをつなぐためのリンカーを介して結合された免疫測定用抗体－多糖結合体である（図３、工程１及び２参照）。
　先ず、（ａ）複数の側鎖を有する水溶性多糖類について、（ａ－１）水溶性多糖類と（ａ－２）複数の側鎖とに分けて、以下に説明する。
（ａ－１）水溶性多糖類
　前記水溶性多糖類（図中、「PS」と示す）は、後述する免疫測定用基材等の固相表面（図中、「SP」と示す）上に、前記抗体等（図中、「VH」と示す）を固定するための足場として機能する（図３、工程３及び４参照）。すなわち、前記抗体等は、前記固相表面上に直接固定されないため、上述したようなコンフォメーションの変化が起きることを防止することができ、それによって抗原（図中、「AG」と示す）との結合能の低下をも避けることができるようになる。
　本明細書中、「多糖類」とは、単糖類二分子以上が脱水縮合して生ずる化合物であり、分子量については特に限定されない。また、「水溶性多糖類」とは、水に溶解する性質を有する多糖類をいい、反応性に富んだヒドロキシ基を側鎖に豊富に有するものをいう。こうした反応性に富むヒドロキシ基は化学修飾が容易であることから、後述するように、免疫測定用の基材等へ、上記水溶性多糖類を付着させるために使用される。また、後述するリンカーが側鎖に結合する際に、クッションタンパク質の配向性を制御する機能をも有する。一方で、目的とするタンパク質（以下、「標的タンパク質」ということがある。）以外のタンパク質の非特異吸着を抑制することができる。
　ここで、前記水溶性多糖類は、直鎖状多糖類及び分枝状多糖類に大別される。ここで、「直鎖状」とは、主鎖に分岐がないか、あってもその長さが主鎖の鎖長に対して十分短い状態にあることをいう。具体的には、分岐鎖の鎖長が主鎖の長さの１/２以下であることが好ましい。本発明においては、直鎖状多糖類を使用することが、鎖長の制御がし易く、前記抗体等を固定する足場を形成するという役割を十分に果たすことができること、及び抗原と非特異的な反応を起こしにくい点で好ましい。
　前記水溶性多糖は、１種類の単糖で構成される単純多糖（ホモ多糖）と複数の単糖で構成される複合多糖（ヘテロ多糖）とに大別することができる。上記単純多糖としては、例えば、プルラン、デキストラン、アガロース、カードラン、グルコマンナン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、カラギーナン、ジェランガム、キトサン塩及び水溶性キチン等を挙げることができる。
　また、複合多糖としては、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の２つの糖がβ1-4、β1-3結合で連結したヒアルロン酸、及びβ-D－マンヌロン酸とα-L-グルロン酸がβ1-4結合したアルギン酸塩、並びにこれらのナトリウム塩又はカリウム塩； D-ガラクトースを構成糖とするカラギーナン、主鎖に2個のグルコース、1個のグルクロン酸及び1個のラムノースの4つの糖が結合したジェランガム、グルコサミンがβ1-4結合したキトサン塩、-アセチル-D-グルコサミンが長く結合したキチンを水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ水溶液で部分的に脱アセチル化した水溶化キチン等を、挙げることができる。上記多糖類の側鎖の化学修飾が容易であるためである。
　これらの中でも、グルコース3分子がα1-4結合したマルトトリオースがα1-6結合で繋がった繰り返し構造を持つプルラン、グルコースを構成成分としたデキストラン、D-ガラクトースがβ1-4結合で3,6-アンヒドロ-L-ガラクトースと繋がったアガロビオースがα1-3結合で連なった構造を持つアガロース、グルコースがβ1-3結合で連なった直鎖状の多糖類であるカードラン、グルコースとマンノースがおよそ2:3の割合でβ1-4結合したグルコマンナンを、以下の２つの理由から好適に使用することができる。
　まず第１の理由は、上述した多糖類の構成糖類の側鎖の官能基は、全て反応性の高いヒドロキシ基であるため、リンカーと当該官能基の結合が容易であることであり、第２の理由は、結合するリンカーの配向制御が容易になることである。これにより、リンカーに結合された低分子抗体分子が、免疫測定用基材等の上に秩序立って配置されるため、測定感度が一層向上するためである。なお、側鎖については後述する。
（ａ－２）複数の側鎖
　上記の水溶性多糖類には複数の側鎖が存在するが、これら複数の側鎖は前記多糖類の構成糖類の側鎖である。そして、少なくとも一つの側鎖の官能基に、後述する低分子抗体分子がリンカーを介して共有結合によって結合される。その際、先ず、前記水溶性多糖類の側鎖の官能基にリンカーを結合させ、次いで、前記リンカーと前記低分子抗体分子との間に共有結合を形成させ、免疫測定用抗体-多糖結合体を調製する（図４Ａ及びＢ参照）。
　当該側鎖の官能基としては、ヒドロキシ基、ケトン基、ホルミル基、カルボキシル基、スルホン基、チオール基、アミノ基、イミノ基、シアノ基及びニトロ基等を挙げることができる。
（ｂ）リンカー
　本明細書中で、「リンカー」とは、上記水溶性多糖類と、後述する低分子抗体とを連結させる機能を有する連結基であって、少なくとも、前記低分子抗体分子のアミノ酸残基と反応する反応性官能基と、クッションタンパク質とを含んで構成される。この連結基は、低分子抗体とは、そのアミノ酸残基と上記クッションタンパク質を介して結合され、そして、上述した多糖の側鎖とは、結合し得る反応性官能基を介して連結される（図４Ｂ参照）。
（ｂ－１）反応性官能基
　ここで、前記反応性官能基は、システイン側鎖中に存在するスルフヒドリル基、ポリペプチドのN末端やリジン残基の側鎖中に存在する第一級アミン、並びにポリペプチド基のC末端上、アスパラギン酸側鎖中及びグルタミン酸側鎖中に存在するカルボキシル基と反応する官能基等を挙げることができる。
　スルフヒドリル基と反応する官能基としては、ハロアセチル基、マレイミド基、アジリジン基、アクリロイル基、ビニルスルホン基、ピリジルジスルフィド基、チオール基、ジスルフィド基等を挙げることができる。
　第一級アミンと反応する官能基としては、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アシルアジド基、アルデヒド基、エポキシ基、イミドエステル基、カルボジイミド基等を挙げることができる。イミドエステル基を有する化合物には、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHSエステル）が含まれる。
　カルボキシル基と反応する官能基としては、カルボジイミド基等である。カルボジイミド基を有する化合物には1-エチル-3-（-3ジメチルアミノプロピル）カルボン酸イミド塩酸塩や、N',N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドが含まれる。
　上記反応性官能基は、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ピリジルジスルフィド基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、ヒドラジド基及びエポキシ基からなる群から選ばれるいずれかであることが、抗体等との反応の効率の点で好ましい。
　特に、マレイミド基はpH6.5-7.5の範囲で、ヨードアセチル基及びブロモアセチル基はpH 7.2～9の範囲で、それぞれスルフヒドリル基と特異的に反応して、安定したチオエーテル結合を形成する。また、ピリジルジスルフィドは、広範なpH領域でスルフヒドリル基と反応して、安定したジスルフィド結合を形成する。
　多糖類そのものには無論のこと、スルフヒドリル基はないため、これらの反応性官能基が含まれることが、抗体等に含まれるスルフヒドリル基とリンカーとを中性付近のpHの溶液中で安定に結合させることができる点で好ましい。
（ｂ－２）クッションタンパク質
　本明細書中、「クッションタンパク質」とは、前記リンカーに含まれ、低分子抗体と結合するタンパク質である。本来、クッションタンパク質は、生体高分子と固相表面との間に生じる直接的な相互作用の影響を緩和することを目的として用いられるものである。具体的には、例えば、固相（親水性ポリスチレン）上にポリスチレンタグを付けたクッションタンパク質をコートし、標的タンパク質をフレキシブルリンカーを介して連結するために使用される。いわば、クッションタンパク質が、固相と直接結合して、標的タンパク質を結合させるための足場として機能する。
　これに対し、本発明では、固相と直接結合する足場としての役割は、上述した水溶性多糖が担う。そして、クッションタンパク質は、低分子抗体の配向性を制御するという役割を担う。
　前記リンカーには、少なくとも１分子のクッションタンパク質が含まれていればよい。クッションタンパク質を２分子以上含む場合には、それらは同一のタンパク質であってもよく、異なるタンパク質であってもよい。
　このため、本発明で使用するクッションタンパク質は、低分子抗体と抗原との結合に際してそれ自身が立体障害とならないようにするために、前記クッションタンパク質に結合している低分子抗体と同程度か、又はそれ以下の大きさのものであることが好ましい。
　具体的には、例えば、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体、ジェラチン等を挙げることができる。これらのタンパク質は、熱安定性が高く構造変化が起こりにくいため、好適に使用することができる。
　また、低分子抗体と前記リンカーに含まれるクッションタンパク質とは、ペプチド結合により直接結合されていてもよいし、間接的に結合されていてもよい。例えば、低分子抗体とクッションタンパク質との間に、タンパク質精製用のタグ配列や特定の認識配列等の遺伝子組換えの際に必要なペプチド配列等を挟んでいてもよい。また、２分子以上のクッションタンパク質が結合されている場合には、それらの間にも上記のようなタグ配列やペプチド配列が含まれていてもよい。
　また、本発明の免疫測定用抗体－多糖結合体は、ELISA法で使用するため、酵素活性や結合活性を有するタンパク質、又は他のタンパク質を非特異吸着するようなタンパク質は、クッションタンパク質としては不適格である。また、クッションタンパク質は、免疫測定に使用される固相用基材に親和性があること、自己会合しないことなどの性質を有するものであり、熱安定性が高く、構造が安定しているものであるといった特性を有する必要がある。
　本発明で使用するクッションタンパク質は、天然のタンパク質でもよいが、遺伝子組換技術によって作製した遺伝子から調製したタンパク質又はそれらを改変した変異体であってもよい。こうしたタンパク質の改変は、常法にしたがって行うことができる。
　合成した遺伝子から調製する場合は、例えば、目的のタンパク質（抗原）と結合する抗体の遺伝子とクッションタンパク質の遺伝子を含む融合遺伝子を作製して、この融合遺伝子を適切な発現系で発現させ、抗体とクッションタンパク質とを含む抗体複合体を直接調製してもよい。その場合、抗体複合体のアミノ酸配列に、精製用のタグ配列や、特定の認識配列等、遺伝子組換えの際に必要な配列を含めておくと、この融合タンパク質を容易に精製することができるようになる。また、クッションタンパク質のＮ末端又はＣ末端に、システイン、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸が配列されているように設計し、上記リンカーとの結合を確保するようにする。
　前記クッションタンパク質としては、熱安定性という点から、例えば、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体及びジェラチン等を好適に使用することができる。
　ここで、ステフィンA変異体は、遺伝子組換え技術によりステフィンAを改変して得られたタンパク質である。具体的には、野生型ステフィンAのアミノ酸配列の4番目のグリシンがトリプトファンに、48番目のバリンがアスパラギン酸に、71番目のリシンがアスパラギンに、72番目のセリンがグリシンに、及び73番目のロイシンがプロリンにそれぞれ変異したタンパク質がステフィンA変異体である。アミノ酸配列を図４に示す。このような変異を導入することによって、熱安定性が高く、構造変化が起こりにくいステフィンA変異体を得ることができ、本発明のELISA法の感度増強方法において、好適に使用することができる。
　アンキリン反復タンパク質変異体は、アンキリン反復タンパク質を、遺伝子組換え技術を用いて改変して得られたタンパク質である。このタンパク質は、例えば、所望のアミノ酸配列からなるアンキリン反復タンパク質モジュールを常法に従って調製し、得られたこのモジュールで、天然のアンキリン反復タンパク質の反復ドメインのＮ末端とＣ末端のキャッピンモジュール部分を置換することで得られる。このようにして、熱安定性が高く、構造変化が起こりにくいアンキリン反復タンパク質変異体を得ることができる。
（ｃ）低分子抗体分子
　本明細書中において、「低分子抗体分子」とは、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）が部分的に欠損している抗体断片をいい、VH及びVLのいずれか、または両方を含んでいることが好ましい（図１参照）。VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および/または挿入を含むことができる。なお、上記可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
　抗体断片の具体例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー(Diabody)、Fab部分の可変部のみを結合させたsc(Fv)2（single chain (Fv)2）などに加えて、ラクダ科動物から得られる一本鎖重鎖抗体可変領域、軟骨魚類から得られるIgNAR抗体又はscFv、及びペプチドアプタマー等を挙げることができ、具体的には、VHH抗体、IgNAR抗体、scFv及びペプチドアプタマーからなる群から選ばれるいずれかのものを、好適に使用することができる。なお、これらの低分子抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子抗体に含まれる。
　以上のような低分子抗体は、全長抗体に比べて分子量が小さく熱安定性が高い、水溶液中での溶解性が高い、微生物による生産量が多い、変性状態からの再生が良好である、タンパク質工学の手法を用いた産生や改変が容易であるといった数多くの優れた特性を有していることが知られている。
　上記低分子抗体は、例えば、パパイン、ペプシン、あるいはプラスミン等の酵素で抗体を処理して抗体断片を生成させて入手することができる。
　ここで、VHH抗体は、図１に模式的に示した通り、ラクダ科動物由来の12kDaのシングルドメイン抗体であり、熱安定性が高いという特性を有する。ここで、ラクダ科動物としては、ラマ、グアノコ、ビクーニャ、アルパカ、フタコブラクダ及びヒトコブラクダが挙げられる。VHH抗体は、これらの動物の血液を採取し、血清中から分離回収することもできる。また、これら抗体断片をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターが導入された適切な宿主細胞、例えば、大腸菌を培養して発現した抗体断片を、宿主細胞を含む培養液から単離、精製して得ることもできる（例えば、Coら（J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976）、Betterら（Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496）、Plueckthunら（Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496）、Lamoyi（Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663）、Rousseauxら（Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669）、Birdら（TIBTECH (1991) 9, 132-137）参照）。
　IgNAR（Ig-new antigen receptor）抗体は、軟骨魚類の重鎖抗体であり、軟骨魚類としては、サメ及びエイが挙げられる。また、scFv（single-chain variable fragment）は、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域(VL)から構成される可変領域を、ペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメントであり、分子量は約30kDaである。
　上記条件を満たすリンカーであれば、ペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーのいずれかであってもよい。ペプチド性リンカーとしては、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体及びジェラチン等を挙げることができ、非ペプチド性リンカーとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール等の重合体等を挙げることができる。
　以上のようにして得られた、複数の側鎖を有する水溶性多糖類に、抗体又は抗体複合体を、以下で述べるようにしてリンカーを介して結合させ、免疫測定用抗体－多糖結合体を得ることができ、これをELISA法の感度の増強に使用することができる。ここで、免疫測定は、ELISA法、イムノクロマト法、イムノブロッティング法、ドットブロット法、マルチ蛍光マイクロビーズ法等その他の抗原及び抗体の結合反応を利用する方法を含むが、ELISA法又はイムノクロマト法を好適に利用することができる。
　以下に、水溶性多糖類としてプルランを使用した場合の免疫測定用抗体-多糖結合体の作製を例に挙げて説明する（図３Ａ及びＢ参照）。
　先ず、プルランの側鎖に結合させるリンカーは、リンカーの反応性官能基と、それと結合させる抗体等のアミノ酸残基との関係から、任意に組み合わせて公知の方法により調製することができる。
　例えば、プルランの水溶性多糖類の側鎖のヒドロキシ基に、抗体等のスルフヒドリル基と反応する反応性官能基を有するリンカーを結合させる場合には、先ず、ジメチルスルホキシド（DMSO）溶媒中で水溶性多糖類と1,1’－カルボニルジイミダゾール（CDI）を所定の条件下で反応させ、側鎖にイミダゾール基を結合させる。その後、エチレンジアミンを加えて所定の条件下で反応させた後、ヨード酢酸NHSエステルを反応させて、水溶性多糖類の側鎖にヨードアセチル基を有するリンカーを調製することができる。具体的には、以下のような手順で、抗体等にVHH抗体及び水溶性多糖類にプルランを採用した抗体-多糖結合体である、VHH抗体-プルラン結合体を調製する。
（１）インサート遺伝子の構築
　所望のVHH抗体、例えば、抗ヒトサバイビンVHH抗体と、ステフィンA変異体とで構成される抗体複合体（以下、「VHH-STM複合体」ということがある。）を使用した場合を例に挙げて説明する。VHH-STM複合体のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子を合成する。この合成は、DNAの合成を受託する企業に依頼して行うことができる。
　下記表１に示す組成のPCR反応液を調製し、上記の遺伝子を、例えば、配列番号２～５に示すようなプライマーを用いて、所望の条件でPCRにより増幅させる。PCRプログラムは、例えば、(a) 95～98 ℃(10秒)、(b) 53～60 ℃(15秒)、(c) 65～72 ℃(30秒)とし、ステップ(a)～(c)を25～35サイクルとすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られたPCR産物を精製することにより、所望の量のVHH-STM複合体をコードしたインサート遺伝子を得ることができる。こうした精製は市販の精製キット（例えば、Qiagen社製のQIAquick PCR Purificationキット）用いて、このキットに添付されているマニュアルに従って行うことができる。なお、「VHH-STM複合体」では、タンパク質を示すことも可能である。
（２）発現ベクターの構築
　以下のようにして、形質転換用の発現ベクターを調製する。発現ベクターとして、複数の発現ベクターに、例えば、下記表２に示す４種類のシグナル配列を組み込んだものを使用することができる。３種類の発現ベクター（pBIC、pBICm及びpBICs）に、以下の表２に示す４種のシグナル配列を１つそれぞれ組み込むと、12種類の発現ベクターを調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）形質転換
　形質転換は、市販のキット（例えば、BIC System（タカラバイオ（株）製））等を使用し、このキットに添付のマニュアルに従って行うことができる。すなわち、上記の発現ベクターと上記PCR産物とを混合したDNA溶液を、所望のバクテリアを含む溶液に加えて、適当なプレート培地に播種し、約28～35℃にて、一晩培養することにより、これらの菌の形質転換体を単一コロニーとして得ることができる。所望のバクテリアとしては、例えば、ブレビバシラス・コシネンシス（Brevibacillus choshinensis）等を挙げることができる。また、適当なプレート培地としては、例えば、MTNmプレート培地（10 g/L グルコース、10 g/L ファイトンペプトン、5 g/L エルリッヒ　カツオエキス、2 g/L 酵母エキス B2、10 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MnSO4・4H2O、1 mg/L ZnSO4・7H2O、50 μg/mL ネオマイシン）等を挙げることができる。
（４）液体培養
　上記のようにして形質転換させた単一コロニーの菌を、適当な培地に懸濁して約30～33 ℃にて、1.5～2.5日間培養し、培養上清を回収し、形質転換された菌が産生したタンパク質の精製を行う。精製して得られたサンプルを、常法に従ってSDS-PAGE分析に供し、タンパク質の発現を確認する。
　適当な培地としては、例えば、2SYN培地（20 g/L グルコース、40 g/L バクトソイトン（Bacto Soytone）、5 g/L バクト・イースト・エキストラクト（Bacto Yeast Extract）、0.15 g/L CaCl2・2H2O、50μg/mL ネオマイシン）等を挙げることができる。形質転換体が産生したタンパク質の精製は、市販のキット（例えば、His Spin Trap キット（GE Healthcare社製））を用いて、このキットに添付されたマニュアルに従って行うようにしてもよい。
　上記SDS-PAGEを、所望の染色液、例えば、クマシーブリリアントブルー(CBB)で染色し、CBB染色によって特異的なバンドが認められたサンプルから、菌体を回収する。その後、回収した菌体からプラスミドを抽出する。プラスミドの抽出は、市販のキット（例えば、Plasmid DNA Extraction Mini kit（Favorgen社製））等を用いて行うことができる。得られたプラスミドのシークエンス解析を常法に従って行い、VHH-STM複合体の配列が組み込まれていることを確認する。
（５）VHH-STM複合体の調製
　上記培養上清からVHH-STM複合体を調製し、保存する。先ず、得られた培養上清を、例えば、Amicon Ultra-15 (MWCO=3, Merck Millipore社製)にアプライし、次いで結合バッファー（例えば、約15～25 mM リン酸ナトリウム [pH 約7.4]、約450～550 mM NaCl又は5～15 mM Tris-HCl [pH 約8.0]、約450～550 mM NaCl）でバッファー交換を行う。
　引き続き、これを結合バッファーで平衡化したNi-NTA Agarose（Qiagen社製）に添加し、洗浄バッファー（例えば、約15～25 mM リン酸ナトリウム [pH 約7.4]、約450～550 mM NaCl, 約15～25 mM イミダゾール又は約5～15 mM Tris-HCl [pH 約8.0]、約450～550 mM NaCl、約15～25 mM イミダゾール）にて洗浄し、その後、溶出バッファー（約15～25 mM リン酸ナトリウム [pH 約7.4]、約450～550 mM NaCl, 約200～300 mM イミダゾール又は約5～15 mM Tris-HCl [pH 約8.0]、約450～550 mM NaCl、約200～300 mM イミダゾール）にてVHH-STM複合体を溶出させる。
　溶出後のVHH-STM複合体溶液を、例えば、Amicon Ultra-4 (MWCO=10, Merck Millipore社製)にアプライし、PBS(-)（約5～15 mM リン酸ナトリウム [pH 約7.4]、約100～200 mM NaCl）又はTBS（約25～75 mM Tris-HCl [pH 約8.0], 約100～200 mM NaCl）にバッファーを交換し、使用するまで-20℃にて保存する。
（６）アミノ化プルランの調製
　先ず、約9.5～10 mgのプルランを、チューブに入れた約900～1,000μLのDMSOに溶解させ、その後、約18～20μLの1～2 MのCDI/DMSO溶液をここに添加する。約45～55℃で30～50分間インキュベートした後、約45～55μLのエチレンジアミンを加えて、約45～55℃で約40～45時間、再びインキュベートする。インキュベート終了後、室温まで冷却し、約0.5～1.5 mLの2-プロパノールを加えて、15分間氷冷する。
　続いて、このチューブを約600～800×gで約4～8分間遠心して上清を除き、沈殿物を約0.5～1.5 mLの2-プロパノールに懸濁し、再度、約600～800×gで約4～8分間遠心して上清を除く。得られた沈殿物に約1.5～2.5 mLの蒸留水を加えて、約40～60 ℃でインキュベートして完全に溶解させ、その後、透析チューブを用いて、蒸留水中にて約20～30時間透析する。透析後に得られた溶液を、シリンジフィルター（孔径約0.45μm）に通し、その後凍結乾燥すると、約6～8mgのアミノ化プルラン（白色のアモルファス）を得ることができる。
　このアミノ化プルランを約0.5～1.5 mLの重水に溶解させ、NMR分析を行うと、グルコース1残基あたりの置換された水酸基の平均数（置換度；DS）を求めることができる。
（７）ヨードアセチル化プルランの調製
　以上のようにして調製した約120～145μLのアミノ化プルラン溶液/重水（約6～8mg/mL）に、約800～900μLの蒸留水、約300～400μLの0.1～0.3M ホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液（pH　約8.4）、及び約60～80μLの約0.1～0.3M N-スクシンイミジル ヨードアセテート／DMSO溶液を加えて、室温で約0.5～2時間撹拌する。
　この反応液を、例えば、Amicon Ultra-0.5mL（NMWL：100,000）に移し、約12,000～16,000×gで、約20～26℃にて、約8～12分間遠心分離を行う。このデバイス中の膜透過液を廃棄した後、約300～500μLの濃縮液を加え、約12,000～16,000×gで、約20～26℃で、約8～12分間遠心分離を行う。この操作を3回繰り返して濃縮を行い、得られた濃縮液を、約1,500～2,500×gで、約20～26℃にて、1.5～2.5分間遠心分離を行うことにより、ヨードアセチル化プルランを得ることができる。
　上記の遠心によって回収した溶液の半分を、約500～700μLの重水で希釈し、NMR分析を行い、アミノ基のヨードアセチル化を確認する。
（８）ヨードアセチル化プルランの反応性確認試験
　上記のNMR測定用溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL（NMWL：100,000）に移して、約12,000～16,000×gで、約20～26℃で約8～12分間遠心分離して濃縮する。膜透過液を廃棄した後、得られた濃縮液を約1,500～2,500×gで、約20～26℃で約1.5～2.5分間遠心分離し、得られたヨードアセチル化プルラン/重水溶液（約70～80 mg）に、約350～450μLの蒸留水、約160～180μLの約0.1～0.3 Mのホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液(pH 約8.4)、及び約30～40μLの約0.05～0.15 MのL-システイン溶液を加えて、室温で約1.5～3時間撹拌する。
　得られた反応溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL（NMWL：100,000）に移して、約12,000～16,000×gで、約20～26℃で約8～12分間遠心分離する。膜透過液を廃棄した後に、得られた濃縮液に、約300～500μLの重水を加えて、約12,000～16,000×gで、約20～26℃で約8～12分間遠心分離を行う。この操作を、2～5回繰り返す。
　得られた濃縮液を、約1,500～2,500×gで、約20～26℃で約1～3分間遠心分離して回収した溶液を、約500～700μLの重水で希釈してNMR分析を行い、ヨードアセチル化プルランがL－システインのスルフヒドリル基と反応してチオエーテル結合を形成したことを確認する。
（９）VHH-STM複合体とヨード化アセチル化プルランの反応
　次いで、約40～60 mM ホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液、約140～150μLの約4～6 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH 約8.4）に、上記のようにして調製した約18～22μLのVHH-STM複合体溶液と、約0.5～2.0μLのヨードアセチル化プルラン溶液とを加えて、約0～6℃で約10～14時間撹拌する。撹拌終了後に得られた反応溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL（NMWL：100,000）に移して、約12,000～16,000×gで、約0～6℃で約8～12分間遠心分離する。膜透過液を廃棄した後、得られた濃縮液に、約300～500μLのホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液（pH 約8.4）を加えて、約12,000～16,000×gで、約20～26℃で約8～12分間遠心分離を行う。この操作を再度繰り返し、得られた濃縮液を、約1,500～2,500×gで、約0～6℃で約1.5～2.5分間遠心分離し、VHH抗体-プルラン結合体を得ることができる。
　この他、例えばプルランの水溶性多糖類の側鎖のヒドロキシ基に、抗体等の第一級アミンと反応する反応性官能基を有するリンカーを調製していく場合は、先ず、ヒドロキシ基を公知の酸化反応を利用してカルボン酸にする。或いは、クロロ酢酸やブロモ酢酸等を多糖類側鎖のヒドロキシ基と反応させてカルボキシメチル基を導入する。次に、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボキシイミド塩酸塩存在下、所定の条件下でNHSとカルボン酸をエステル化反応させて、水溶性多糖類の側鎖にイミドエステル基を有するリンカーを調製することができる。
　このようにして調製したリンカーと、所定の条件下で抗体等と結合させることができる。例えば、所定の条件下で、上記ヨードアセチル基を有するリンカーと、抗体等のシステインのスルフヒドリル基とを結合させ、本願発明の免疫測定用抗体-多糖結合体を調製することができる。また、上記、所定の条件下でイミドエステル基を有するリンカーと、抗体等のリジンの第一級アミンとを結合させ本願発明の免疫測定用抗体-多糖結合体を調製することができる。
　本発明の別の態様は、前記免疫測定用抗体－多糖結合体を用いた免疫測定方法である。
　例えば、上記のようにして調製した、免疫測定用抗体-多糖結合体を用いて、サンドイッチELISA法を行うことができる。先ず、抗体-多糖結合体を所定の濃度のバッファーに溶解し、抗体-多糖結合体溶液を調製する。これを、96穴マイクロプレートに入れ、所定の条件下で、抗体-多糖結合体を固相に吸着させる。ここに、スキムミルク等のブロッキング剤を加え固相のブロッキングを行う。洗浄用のバッファーで数回洗浄し、溶液を除いたあと、所定の濃度の目的のタンパク質溶液を加え、所定の時間静置する（図２、工程３参照）。
　この際、抗体－多糖結合体の複数の抗体と複数の目的のタンパク質が結合でき、高いアビディティー効果が得られる。次いで、目的のタンパク質と結合できる一次抗体を加えて所定の時間静置した後、洗浄用のバッファーで数回洗浄する。その後、酵素標識済みの二次抗体を加え、所定の時間静置する。洗浄用のバッファーで、余分な二次抗体を洗い流したあと、酵素の基質を加え、酵素反応の生成物をプレートリーダー等で検出する。この際、抗体-多糖結合体を介して結合した複数の酵素標識により、高感度に目的のタンパク質を検出することができる（図２、工程４参照）。
　本発明のさらに別の態様は、低分子抗体とクッションタンパク質からなる抗体複合体である。前記クッションタンパク質は、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体及びジェラチンからなる群から選ばれるいずれかであることが、熱安定性という点で好ましい。また、前記低分子抗体は、VHH抗体、IgNAR抗体、scFv及びペプチドアプタマーからなる群から選ばれるいずれかであることが好ましい。
　以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。なお、実施例及び比較例のいずれにおいても使用する抗体複合体用VHHは以下の製造例に従って調製した。
（製造例）VHH抗体及びステフィンA変異体を含む抗体複合体用VHHの製造
（１）インサート遺伝子の構築 
　抗ヒトサバイビンVHH抗体及びステフィンA変異体からなる抗体複合体（以下、VHH-STM複合体という）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子は、ユーロフィンジェノミクス（株）に委託して合成した（図４参照）。
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGVSNTDMIMIWFRQAPGKEREGVLAAIYKNSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAIRAVIGRHIRPHIYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQGGGGSLVPRGGGGSMIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFSGGAYSSGAPPMPPFGGSHHHHHHC　　　[配列番号１]
　表３に示す組成のPCR反応液を調製し、以下のプライマー（配列番号２～５）を用いて、上記遺伝子を以下の条件でPCRプログラムによる増幅を行った。
PCRプログラムは、(a)98 ℃(10秒)、(b)55 ℃(15秒)、(c)68 ℃(30秒)とし、ステップ(a)～(c)を30サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［配列番号２］
pBIC1用フォワードプライマー：5’-AACGTGGTATCGGCTGAGGTTCAGCTTGTGGAGTC-3’
［配列番号３］
pBIC2及びpBIC4用フォワードプライマー：5’-CCCATGGCTTTCGCTGAGGTTCAGCTTGTGGAGTC-3’
［配列番号４］
pBIC3用フォワードプライマー：5’-AGTTCCGCATTCGCTGAGGTTCAGCTTGTGGAGTC-3’
［配列番号５］
pBIC1～4共通リバースプライマー：5’-CATCCTGTTAAGCTTAGCAATGGTGATGGTGATGAT- 3’
　得られたPCR産物の精製は、QIAquick PCR purificationキット（Qiagen社製）を用いて、添付のマニュアルに従って行った。
（２）発現ベクターの構築
　発現ベクターとしては、３種類の発現ベクター（pBIC、pBICm及びpBICs）に、以下の表４に示す4種のシグナル配列を１つそれぞれ組み込んだ12種類の発現ベクター（タカラバイオ（株）製）を使用して調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（３）形質転換
　形質転換には、BIC System（タカラバイオ（株）製）を使用し、このキットに添付のマニュアルに従って行った。即ち、上記12種類の発現ベクターと上記PCR産物を混合したDNA溶液を、解凍後に集菌したブレビバシラス・コシネンシス（Brevibacillus choshinensis） HPD31-SP3に加え、MTNmプレート培地（10 g/L グルコース、10 g/L ファイトンペプトン、5 g/L エルリッヒ　カツオエキス、2 g/L 酵母エキス B2、10 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MnSO4・4H2O、1 mg/L ZnSO4・7H2O、50 μg/mL ネオマイシン）で、30 ℃にて一晩培養して形質転換させた。
（４）液体培養
　形質転換させた菌の単一コロニーは、2SYN培地（20 g/L グルコース、40 g/L バクトソイトン（Bacto Soytone）、5 g/L バクト・イースト・エキストラクト（Bacto Yeast Extract）、0.15 g/L CaCl2・2H2O、50 μg/mL ネオマイシン）で、30 ℃にて2日間培養した。また、発現ベクターpBIC3を使用した場合は、上記以外に2SYN+Arg培地（20 g/L グルコース、40 g/L バクトソイトン、5 g/L バクト・イースト・エキストラクト、0.15 g/L CaCl2・2H2O、50 μg/mL ネオマイシン、200 mM アルギニン）を用いて、30 ℃にて、2日間培養した。
　上記のようにして液体培養した後に培養上清を回収し、His Spin Trap キット（GE Healthcare社製）を用いて、このキットに添付されたマニュアルに従ってタンパク質の精製を行った。精製後に得られたサンプルを用いて、以下の条件でSDS-PAGE分析を行った。
　アクリルアミドゲル用の濃縮ゲル（4％アクリルアミド, 125 mMのTris-HCl [pH 6.8], 0.1％ SDS）、分離ゲル（12% アクリルアミド, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8], 0.1% SDS）。及び泳動用ランニング緩衝液（25 mM Tris, 192 mM グリシン, 0.1％ SDS）を調製した。上記サンプルは等量の2ｘSDSサンプルバッファー（125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 4% SDS, 10% メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.004 ％ブロモフェノールブルー）を加えた後、95℃で15分程度加熱し、変性・還元した。電気泳動におけるサンプルの濃縮は10 mA定電圧で、分離は20 mA定電圧で行った。泳動後のポリアクリルアミドゲル上のタンパク質は、CBB溶液（0.25% クマシーブリリアントブルーR-250, 5％メタノール, 7.5％酢酸）にて染色した。
　その結果、いずれの発現ベクターを使用した場合でも、タンパク質の発現が確認された。特に、発現ベクターpBIC3を使用したサンプルにおいては、夾雑物が少なく、高純度のタンパク質の発現が確認された。
　上記SDS-PAGE分析をクマシーブリリアントブルー(CBB)で染色し、CBB染色によって特異的なバンドが認められたサンプルから、菌体を回収した。回収した菌体から、Plasmid DNA Extraction Mini Kit（Favorgen社製）を用いてプラスミドを抽出した。シークエンス解析は、ユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼し、ダイターミネーター法を用いた４色蛍光修飾サンプルのキャピラリータイプDNAシークエンサー（アプライドバイオシステムス社製、ABI 3730XL）を使用して行った。その結果、VHH-STM複合体の配列が組み込まれていることが確認された。
（比較例１）VHH-STM複合体の調製
　上記培養上清から、VHH-STM複合体を以下のようにして調製した。
　先ず、得られた培養上清をAmicon Ultra-15 (Merck Millipore社製、MWCO=3,000)にアプライし、次いで結合バッファー（20 mM リン酸ナトリウム [pH 7.4]、500 mM NaCl又は10 mM Tris-HCl [pH 8.0]、500 mM NaCl）でバッファー交換を行った。
　引き続き、これを結合バッファーで平衡化したNi-NTA Agarose（Qiagen社製）に添加した。続いて、洗浄バッファー（20 mMのリン酸ナトリウム [pH 7.4]、500 mMのNaCl, 20 mMのイミダゾール又は10 mMのTris-HCl [pH 8.0]、500 mMのNaCl、20 mMのイミダゾール）にて洗浄した後、溶出バッファー（20 mMのリン酸ナトリウム [pH 7.4]、500 mMのNaCl, 250 mMのイミダゾール又は10 mMのTris-HCl [pH 8.0]、500 mMのNaCl、250 mMのイミダゾール）にてVHH-STM複合体を溶出させた。
　溶出後のVHH-STM複合体溶液をAmicon Ultra-4 (Merck Millipore社製、MWCO=10,000)にアプライし、PBS(-)（10 mMのリン酸ナトリウム [pH 7.4]、150 mMのNaCl）又はTBS（50 mMのTris-HCl [pH 8.0], 150 mMのNaCl）にバッファー交換をし、使用するまで-20℃にて保存した。
（実施例１）VHH抗体-STM複合体-プルラン結合体の調製
（１）アミノ化プルランの調製
　先ず、9.75mgのプルラン（（株）林原製）を950μLのDMSO（関東科学（株）製）に溶解させた後、19.3μLの1.6M CDI/DMSO溶液を添加した。50℃で40分間インキュベートした後、50.2μLのエチレンジアミンを加えて、50℃で42時間インキュベートした。室温まで冷却した後、1mLの2-プロパノール（（株）関東化学製）を加えて、15分間氷冷した。
　続いて、反応容器を、日立微量高速遠心機CF16RXII形及びアングルローター（T15A39-0535）（日立工機（株）製）を用いて700×gで6分間遠心して上清を除いた。沈殿物を、1 mLの2-プロパノールに懸濁して、700×gで6分間遠心して上清を除いた。沈殿物に2 mLの蒸留水を加えて、50℃でインキュベートして完全に溶解させた後、透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ（株）製、ポア3、再生セルロース、分画分子量3,500）を用いて、蒸留水で24時間透析した。透析した溶液を、ポアサイズが0.45μmのシリンジフィルター（アドバンテック（株）製）に通した後、凍結乾燥させ、6.73 mgの白色アモルファスのアミノ化プルランを得た。
　これを1 mLの重水に溶解させ、Bruker AVANCE 500（ブルカー（株）製）を用いて、500 MHzで1H NMRによる測定を行なった。その結果、α1,6-結合したグルコースのアノマープロトンピーク（4.92 ppm）の積分値を1としたとき、エチレンジアミン由来のメチレンプロトンピーク（2.91 ppm, -CH2-CH2-NH2）の積分値が1.54となることから、グルコース1残基あたりの置換された水酸基の平均数（置換度；DS）は0.77と算出された（図５のＢ参照）。
（２）ヨードアセチル化プルランの調製
　上記で調製した136μLのアミノ化プルラン溶液/重水（6.73 mg/mL）に、844μLの蒸留水、350μLの0.2M ホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液（pH 8.4）、及び70μLの0.2MのN-スクシンイミジル ヨードアセテート／DMSO溶液を加えて、室温で一時間撹拌した。反応液を、Amicon Ultra-0.5mL（Merck Millipore社製、NMWL：100,000）に移して14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。膜透過液を廃棄した後、400μLの濃縮液を加えて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。この操作を3回行った後、濃縮液を、2,000×g、23℃で2分間遠心分離を行い、ヨードアセチル化プルランを得た。
　回収溶液の半分に、600μLの重水を加えて1H NMRによる測定を行った。エチレンジアミン由来のメチレンプロトンピーク（図５のＢ、2.91 ppm）が完全に低磁場シフトしたことから、アミノ基が定量的にヨードアセチル化されたことが確認された（図５のＣ参照）。
（３）ヨードアセチル化プルランの反応性確認試験
　上記のNMR測定用溶液を、Amicon Ultra-0.5 mL（NMWL：100,000）を用いて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離して濃縮した。膜透過液を廃棄した後、濃縮液を2,000×g、23℃で2分間遠心分離を行い、得られた76mgのヨードアセチル化プルラン/重水溶液に、414μLの蒸留水、175μLの0.2M ホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液(pH 8.4)、及び35μLの0.1 MのL-システイン溶液を加えて、室温で2時間撹拌した。反応溶液をAmicon Ultra-0.5 mL（NMWL：100,000）に移して、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。膜透過液を廃棄した後、濃縮液に400μLの重水を加えて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。この操作を計3回行った。
　濃縮液を、2,000×g、23℃で2分間遠心分離して回収した回収溶液を、600μLの重水で希釈して1H NMRによる測定を行った。その結果、3.04, 3.13 ppm（システイン側, -S-CH2-）及び3.34 ppm（プルラン側, -S-CH2-）に特徴的なピークが検出され、ヨードアセチル化プルランがL－システインのスルフヒドリル基と反応してチオエーテル結合を形成したことが確認された（図５のＤ参照）。
（４）VHH-STM複合体とヨード化アセチル化プルランの反応
　50 mM ホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液、144.4μLの5 mMのEDTA（pH 8.4）に、実施例1で調製した20.9μLのVHH-STM複合体溶液と、上記（２）で調製した1.0μLのヨードアセチル化プルラン溶液を加えて、4℃で12時間撹拌した。反応溶液をアミコンウルトラ-0.5デバイス（NMWL：100 k）に移して、14,000×g、4℃で10分間遠心分離を行った。膜透過液を廃棄した後、濃縮液に400μLのホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液（pH 8.4）を加えて、14,000×g、23℃で10分間遠心分離を行った。この操作をもう一度繰り返した後、濃縮液を、2,000×g、4℃で2分間遠心分離を行い、VHH抗体-プルラン結合体を得た。
（５）サンドイッチELISA法による抗原結合性の検討
（５－１）試薬の準備
　実施例２で得られたVHH抗体-プルラン結合体を、50 mM Sodium borate buffer、5 mM EDTA（pH 8.4）で100倍希釈したVHH-プルラン結合体溶液を調製した。
　50 mM Tris-HCl、138 mM NaCl、2.7 mM KCl (TBS、pH 7.6）、0.1% Tween-20を洗浄バッファーとして用いた。また、50 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl、2.7 mM KCl (TBS、pH 7.6)、0.05% Tween-20、2 mg/mL Bovine Serum Albumin (Fraction V, Fatty Acids/IgG/Protease Free, WAKO, #017-25771) を反応バッファーとして用いた。
　ヒトサバイビン（1-142 aa, N末端カルモジュリンタグ, リコンビナント、#SUR0801）は、ATGen Co., Ltd.から購入した。上記反応バッファーを用いて、100 ng/mL、10 ng/mL、及び1 ng/mLサバイビン希釈系列を調製した。ウサギ抗サバイビンポリクローナル抗体（#NB500-201）はNovus Biologicals社から購入した。上記反応バッファーを用いて、0.1μg/mLのウサギ抗サバイビンポリクローナル抗体溶液を調製した。
　ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体HRP標識（#ab97051）はAbcam社から購入した。上記反応バッファーを用いて、0.2μg/mLのヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体HRP標識溶液を調製した。TMB溶液（ナカライテスク（株）製、ELISA法 POD基質TMB キット(Popular)-2液タイプ）を発色液として用いた。停止液として1 mol/L 硫酸を用いた。
（５－２）サンドイッチELISA法
　96穴マイクロプレートにVHH抗体（10 μg/mL, 100 μL/well）、又はVHH抗体－プルラン結合体溶液を100 μL/wellとなるように加え、4℃で12時間静置した。溶液を取り除き、スキムブロッカー原液（和光純薬工業（株）製）を200 μL/wellとなるように加えて室温で2時間静置した。溶液を取り除いて上記洗浄バッファーで3回洗浄した後、L-システイン／50 mMホウ酸－水酸化ナトリウム緩衝液及び5 mM EDTA（pH8.4）を100 μL/wellとなるように加えて、室温で1時間静置した。溶液を取り除いて上記洗浄バッファーで3回洗浄した後、上記サバイビン希釈系列を100 μL/wellとなるように加えて室温で1時間静置した。
　上記ウサギ抗サバイビンポリクローナル抗体を100 μL/wellとなるように加えて室温で1時間静置した。静置後、溶液を取り除いて洗浄バッファーで3回洗浄した後、上記ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体HRP標識を100 μL/wellとなるように加えて室温で1時間静置した。静置後、溶液を取り除いて洗浄バッファーで3回洗浄した。TMB溶液を100 μL/wellとなるように加えて30秒間攪拌した後、14分30秒静置した。静置後、上記停止液を100 μL/wellとなるように加えて30秒間攪拌し、直ちにプレートリーダー（Awareness Technology社製、ChroMate 4300シリーズ）で測定した（主波長450 nm, 副波長630 nm）。その結果、VHH抗体と比較して、VHH-プルラン複合体の方が、100ng/mLの濃度で抗原検出感度が有意に高いことが示された（図６参照）。
(比較例２)　通常抗体のペアを用いたサンドイッチELISAによる比較試験
　マウス抗サバイビンモノクローナル抗体（#WH0000332M1）はSigma-Aldrich社から購入した。96穴マイクロプレートにマウス抗サバイビンモノクローナル抗体のPBS(-)溶液（1 μg/mL）を100 μL/wellとなるように加え、4℃で12時間静置した。以後の操作は上述のサンドイッチELISAと同様に行った。
　結果を図７に示す。比較例２の抗原検出の感度は比較例１より高かったが、本発明の実施例１は、通常抗体の感度を上回ることが確認された。
(参考例)　サンドイッチELISAによるクッションタンパク質の性能評価
（１）VHH-STM複合体の形成
　VHH抗体-多糖結合体を固相化する場合、親水性の足場である多糖は、疎水性相互作用にほとんど寄与し得ない。このため、固相表面との物理吸着に関与しているのは、VHH抗体-多糖結合体に含まれるVHH抗体のうち、１つ又は複数のVHH抗体であると考えられた。この場合、固相表面と接触しているVHH抗体がいかに活性を維持しながら抗原結合に寄与するかが検出感度の向上には極めて重要である。この点を確認するために、以下の実験を行った。固相表面に吸着したVHH抗体又はVHH抗体複合体が抗原と結合しているときのイメージ図を、参考図２に示す。
　96穴マイクロプレートにSTMを含まない、下記の配列を有するVHH抗体（以下、R7-Aという。10 μg/mL）、及びVHH-STM複合体（10 μg/mL）をそれぞれ、100 μL/wellとなるように加え、4℃で12時間静置した。
（STMを含まないVHH抗体R7-A）
Met Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Asn Thr 
Asp Met Ile Met Ile Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 
Gly Val Leu Ala Ala Ile Tyr Lys Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 
Cys Ala Ala Ile Arg Ala Val Ile Gly Arg His Ile Arg Pro His Ile 
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gly Gly Gly Ser His His 
His His His His Gly Gly Ser [配列番号10]
　（２）サンドイッチELISA法
　上記実施例と同様の方法で評価を行った。その結果、図８に示すように、STMを持たないVHH抗体と比較して、VHH-STM複合体の方が、100 ng/mLの濃度で抗原検出感度が明らかに高いことが示された。以上の結果から、クッションタンパク質の存在が固相化にともなうVHH抗体の失活や剥離を効果的に抑制していることが確認された。
　また、以上の結果から、図２の(A)と(B)とに模式的に示されるように、クッションタンパクを含む場合と含まない場合とを比較すると、クッションタンパク質を含むVHH抗体では固相化後も抗原結合活性が維持され、結果として検出感度が向上していた。多糖連結体においても同様の効果を期待できる。
　従って、VHH抗体-多糖連結体（図２の(C)）よりもVHH抗体-クッションタンパク-多糖連結体（図２の(D)）は検出感度が高いと結論付けられた。
　クッションタンパク質としては、「ＳＳ２５ペプチド、ＳＳ２５’ペプチド、および／またはクッションタンパク質を含む、クッション性吸着剤」等を挙げることができる。


　従来技術４では、クッションタンパク質が存在すれば、クッションタンパク質がない状態の活性（固相結合前を100％とした場合に、８％程度）よりも４倍程度は高くなることが示され、VHH抗体の活性が維持されたことでELISA検出感度の向上につながったものと考えられた。しかし、クッションタンパク質を使用しただけでは、全長抗体を使用して検出を行なった場合の検出感度には及ばなかった（図７参照）。
　これに対し、本発明のVHH－クッションタンパクを多糖に連結させたVHH-クッションタンパク-多糖結合体を使うことではじめて通常抗体の検出感度を上回ることができた（図７参照）。そして、本発明は固相表面－目的物質（VHH抗体：物理吸着）－リンカー（化学結合）－多糖－（化学結合）－目的物質（VHH抗体）という構成となるため、固相と多糖との間でも標的分子の認識が可能である。
　そして、リンカーにはクッションタンパク質が含まれるため、固相表面－リンカー－目的物質（VHH抗体：クッションタンパク質を介した結合－化学結合）－多糖（化学結合）－クッションタンパク質－目的物質（VHH抗体）という構成とすることができることも示された。すなわち、クッションタンパク質が存在することで、固相と多糖の間での高い標的分子の認識を可能にすることができるようになった。
　以上の通り、多糖を足場とし、クッションタンパク質を介して単鎖抗体を結合させることによって、全長抗体を使用した場合以上の高い感度での標的タンパク質の検出が可能となった。
　なお、上記実施例においては、水溶性多糖としてプルランを用いたが、これに限定されない。デキストラン、アガロース、カードラン及びグルコマンナン等他の水溶性多糖も抗体を結合する足場としてとして有効なことが確認されている。
　本願発明は、分析化学の分野において有用である。
　ＡＢ１：一次抗体
　ＡＢ２：二次抗体
　ＡＧ：抗原
　ＥＬ：酵素標識
　Ｌ：リンカー
　ＰＳ：多糖類
　ＳＰ：固相表面
　ＶＨ：ＶＨＨ抗体
配列番号１：抗ヒトサバイビンVHH抗体-ステフィンA変異体を含む抗体複合体遺伝子
配列番号２：PCR用フォワードプライマー
配列番号３：PCR用フォワードプライマー
配列番号４：PCR用フォワードプライマー
配列番号５：PCR用リバースプライマー
配列番号６：発現ベクター用シグナル配列
配列番号７：発現ベクター用シグナル配列
配列番号８：発現ベクター用シグナル配列
配列番号９：発現ベクター用シグナル配列
配列１０：STMを含まないVHH抗体（R7-A）の配列

Claims (7)

  1. 　水溶性多糖類、低分子抗体分子、並びに前記水溶性多糖類及び前記低分子抗体分子とをつなぐリンカーと、を含む免疫測定用抗体－多糖結合体であって、
    　前記リンカーは、前記低分子抗体分子のアミノ酸残基と反応する反応性官能基と、クッションタンパク質とを含むことを特徴とする、免疫測定用抗体－多糖結合体。
  2. 　前記水溶性多糖類は、プルラン、デキストラン、アガロース、カードラン及びグルコマンナンからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫測定用抗体－多糖結合体。
  3. 　前記反応性官能基は、マレイミド基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ピリジルジスルフィド基からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫測定用抗体－多糖結合体。
  4. 　前記クッションタンパク質は、ステフィンA変異体、アンキリン反復タンパク質変異体、コラーゲン、VHH抗体及びジェラチンからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫測定用抗体－多糖結合体。
  5. 　前記低分子抗体分子は、VHH抗体、IgNAR抗体、scFv及びペプチドアプタマーからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫測定用抗体－多糖結合体。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の免疫測定用抗体－多糖結合体を用いた免疫測定方法。
  7. 　前記免疫測定方法は、ELISA法又はイムノクロマト法であることを特徴とする、請求項６に記載の免疫測定方法。
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