CN111606995A - 抗人pd-l1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为抗人PD‑L1单克隆抗体及其应用。所述抗人PD‑L1抗体包括：序列选自SEQ ID NO：1‑6，或对其进行保守修饰的VH CDR1；序列选自SEQ ID NO:7‑12，或对其进行保守修饰的VH CDR2；序列选自SEQ ID NO:13‑18，或对其进行保守修饰的VH CDR3；序列选自SEQ ID NO:19‑24，或对其进行保守修饰的VL CDR1；序列选自SEQ ID NO:25‑30，或对其进行保守修饰的VL CDR2；序列选自SEQ ID NO:31‑36，或对其进行保守修饰的VL CDR3。

Description

抗人PD-L1单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体，具体为兔抗人PD-L1胞外域的单克隆抗体及其应用。
背景技术
程序性死亡受体1(PD-1)是CD28超家族中的一员，其主要表达于活化的T细胞、B细胞以及髓样细胞表面。PD-1能够与T细胞受体(TCR)结合从而抑制T细胞介导的信号通路。PD-1还是重要的免疫检查点之一，其能够通过促进淋巴结内抗原特异性T细胞凋亡、减少调节性T细胞凋亡的双重机制来防止自身免疫，进而在免疫调节和外周耐受中发挥重要作用。
PD-1具有两个细胞表面配体：程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2)。PD-L1和PD-L2都是能够与PD-1特异性结合的B7家族同源物，其与PD-1的结合能够抑制T细胞的活化及细胞因子的分泌。
PD-L1是由人CD274基因编码的蛋白质，也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)；是一种1型跨膜糖蛋白，分子量40kDa。现有技术中已经在包括活化的B、T细胞、幼稚淋巴细胞、树突细胞和单核细胞等多种类型的免疫细胞表面发现了PD-L1的表达；同时，还在包括肺癌、卵巢癌和结肠癌以及各种骨髓瘤等多种癌症患者的肿瘤组织中发现了PD-L1。另外，在非淋巴细胞(如：血管内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞和扁桃体细胞等多种非淋巴细胞)中能够检测到PD-L1的mRNA。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了兔抗人PD-L1胞外域的单克隆抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种抗体，包括：
(a)VH CDR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(b)VH CDR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(c)VH CDR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(d)VL CDR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(e)VL CDR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
以及(f)VL CDR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种。
进一步地，所述抗体包括：(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：1所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：7所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：13所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VLCDR1包含如SEQ ID NO：19所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR2包含如SEQID NO：25所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：31所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
或(b)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：2所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：8所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：14所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：20所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：26所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：32所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
或(c)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：3所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：9所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：15所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：21所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：27所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：33所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
或(d)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：4所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：10所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：16所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR1包含如SEQ IDNO：22所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：28所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：34所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
或(e)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：5所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：11所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：17所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR1包含如SEQ IDNO：23所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：29所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：35所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
或(f)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：6所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：12所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：18所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR1包含如SEQ IDNO：24所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：30所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：36所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体与PD-L2没有或仅有少量交叉反应。
进一步地，所述抗体是兔单克隆或多克隆抗体或其片段。
进一步地，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
进一步地，所述CDR之间具有47.4％-100％的同源性。
进一步地，还包括FR，所述FR包括：
(a)VH FR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40的任一种；
(b)VH FR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42的任一种；
(c)VH FR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47的任一种；
(d)VH FR4，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的任一种；
(e)VL FR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54的任一种；
(f)VL FR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的任一种；
(g)VL FR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62的任一种；
以及(h)VL FR4，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64的任一种。
进一步地，所述FR之间具有55.6％-100％的同源性。
进一步地，还包括共价或非共价连接的偶联物。
进一步地，所述偶联物包括酶、荧光蛋白、荧光团、生物素或链霉亲和素。
进一步地，所述酶包括HRP。
一种抗体，包括：
(a)VH，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
以及(b)VL，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种。
进一步地，(a)所述VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:65，所述VL的氨基酸序列包括SEQ ID NO:71；
或(b)所述VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:66，所述VL的氨基酸序列包括SEQ IDNO:72；
或(c)所述VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:67，所述VL的氨基酸序列包括SEQ IDNO:73；
或(d)所述VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:68，所述VL的氨基酸序列包括SEQ IDNO:74；
或(e)所述VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:69，所述VL的氨基酸序列包括SEQ IDNO:75；
或(f)所述VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:70，所述VL的氨基酸序列包括SEQ IDNO:76。
如上述的抗体在制备检测人PD-L1的试剂盒中的应用。
进一步地，所述试剂盒包括ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒可以用于直接ELISA、捕获ELISA和夹心ELISA中的任一种。
进一步地，所述用于夹心ELISA的试剂盒中包括第一抗体和第二抗体，其中第一抗体捕获人PD-L1的胞外域，第二抗体包括用于检测的偶联物；第一抗体与第二抗体不同；所述第一抗体和第二抗体分别选自3B8、2C5和8C6中的任一种。
本发明还提供了一种用于检测人PD-L1表达的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括兔抗人PD-L1胞外域抗体。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
PD-L1在多种人类肿瘤类型的诊断和预后评估中具有重要作用，可以作为一种生物标志物使用。肿瘤细胞膜上的PD-L1与PD-1结合，能够导致肿瘤特异性T细胞的免疫抑制和/或死亡。在患有包括黑色素瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和肾癌在内的患病动物体内，PD-L1的表达水平可能与患者的不良预后和存活有关。
本发明提供了兔抗人PD-L1单克隆抗体以及特异性且精准定量检测PD-L1的免疫检测试剂盒。本发明中的兔抗人PD-L1单克隆抗体能够在诊断和预后检测、以及在免疫肿瘤学领域的PD-L1动力学作用机制研究中发挥重要作用。
附图说明
图1是本发明的一个或多个实施例的兔抗人PD-L1 mAb结构；
图2是兔抗人PD-L1 mAb的重链CDR序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；其中，A是CDR1序列比对结果；B是CDR2序列比对结果；C是CDR3序列比对结果；
图3是兔抗人PD-L1 mAb的轻链CDR1序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；其中，A是CDR1序列比对结果；B是CDR2序列比对结果；C是CDR3序列比对结果；
图4是兔抗人PD-L1 mAb的重链FR序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；其中，A是FR1序列比对结果；B是FR2序列比对结果；C是FR3序列比对结果；D是FR4序列比对结果；
图5是兔抗人PD-L1 mAb的轻链FR序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；其中，A是FR1序列比对结果；B是FR2序列比对结果；C是FR3序列比对结果；D是FR4序列比对结果；
图6是兔抗人PD-L1 mAb的重链可变区序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；
图7是兔抗人PD-L1 mAb的轻链可变区序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；
图8是兔抗人PD-L1 mAb的Fab片段重链序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；
图9是兔抗人PD-L1 mAb的Fab片段轻链序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；
图10是兔抗人PD-L1 mAb的Fc片段序列比对结果，包括部分实施例中的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2；
图11是本发明的一个实施例中，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2在直接ELISA检测人PD-L1中的标准曲线；
图12是本发明的一个实施例中，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2在直接ELISA检测人PD-L2的结果；
图13是本发明的一个实施例中，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2在捕获ELISA检测人PD-L1中的标准曲线；
图14是本发明的部分实施例中夹心ELISA的检测结果；其中，A是使用兔抗人PD-L1mAb 2C5作捕获抗体、8C6作检测抗体；B是使用兔抗人PD-L1 mAb 8C6作捕获抗体、2C5作检测抗体；C是使用兔抗人PD-L1 mAb 2C5作捕获抗体、3B8作检测抗体；D是使用兔抗人PD-L1mAb 3B8作捕获抗体、2C5作检测抗体；E是使用兔抗人PD-L1 mAb 8C6作捕获抗体、3B8作检测抗体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本申请中的“抗体”为广义概念，包括各种抗体结构，包括但不限于Y形抗体(即全长抗体)、Y形抗体的抗原结合部分、及前述两者的遗传或化学修饰。抗原结合部分指Y形抗体的一个或多个片段，且所述一个或多个片段保留抗体特异性结合PD-L1的能力。现有技术中已经证实全长抗体的抗原结合功能是能够通过其片段来实现的。
本申请中的“单克隆抗体”(mAb)是指基本同质的抗体，各个抗体基本相同，个别抗体中可能存在少量自然突变。单克隆抗体能够表现出对特定抗原表位的特异性和亲和力。单克隆抗体与多克隆抗体不同，多克隆抗体包括针对不同抗原表位的多种不同抗体，而单克隆抗体一般仅可以靶向抗原相同或基本相同的表位。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，而不要求通过任何特定方法生产。事实上，抗体可以通过各种方法制备，如单个B细胞培养和克隆、杂交瘤、重组DNA或噬菌体抗体文库分离筛选。
本申请中的“抗人PD-L1 mAb”指能够以足够的亲和力结合人PD-L1的单克隆抗体，从而能够在靶向人PD-L1的检测、诊断和/或治疗剂中使用。本申请中的术语“亲和力”指在分子(如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(如，抗原)之间的总的非共价分子间相互作用的强度。分子间的相互作用包括氢键、静电相互作用、疏水力以及范德华力。
本申请中的“兔抗体”、“兔抗人PD-L1 mAb”等术语中的修饰语“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来自兔种系免疫球蛋白序列。兔抗体或兔抗人PD-L1 mAb包括CDR序列来自兔种系免疫球蛋白序列的抗体。优选地，兔抗体或兔抗人PD-L1 mAb包括CDR序列来自兔种系免疫球蛋白序列，而抗体骨架区(FR)来自另一种哺乳动物(如鼠或人类)的免疫球蛋白序列的抗体。优选地，兔抗体或兔抗人PD-L1mAb包括其FR和CDR均来自兔种系免疫球蛋白序列的抗体。本申请中的“兔抗体”或“兔抗人PD-L1 mAb”也可以是不包含由兔种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机或定点诱变、体内体细胞突变引发的抗体。但，本申请中的“兔抗体”或“兔抗人PD-L1 mAb”不包括CDR序列来自其他哺乳动物(如小鼠)的抗体。
在本申请的一个实施例中，兔抗人PD-L1 mAb是Y形抗体。如图1所示，在某个实施例中，兔抗人PD-L1 mAb包括两对重链2和轻链3，重链2包括一个可变区(VH)和至少一个恒定区(CH)。在某个实施例中，重链2包括一个VH和三个CH，即CH1、CH2和CH3。VH一般位于重链的N端，且与CH相比，VH在氨基酸序列上具有更高的变异性。不同抗体的VH可以是不同的，且可以对每种抗体特异性识别。在同种型或同类型的抗体中，CH的氨基酸序列可以是相同的，但不同种型CH的氨基酸序列是不同的。本申请中的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如，IgG)。哺乳动物抗体具有五种不同类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，分别代表了五种类型的抗体：IgG、IgD、IgA、IgM和IgE。兔子至少具有四种同种型，分别为IgA、IgE、IgG和IgM；而人和小鼠具有上述五种抗体同种型。
轻链3是相对于重链2的小多肽亚基，包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。VL一般位于轻链3的N端，且与CL相比，VL在氨基酸序列上具有更高的变异性。不同抗体的VH可以是不同的，并且对每种抗体的氨基酸序列具有特异性。
在本申请的一个实施例中，可变区VH和VL负责识别人PD-L1并与其结合。优选地，CH和CL不直接与人PD-1的残基接触。
两对重链2和轻链3可以形成包括两个Fab(抗原结合片段)片段7，一个Fc(可结晶片段)片段8和铰链区10的Y形结构。两个Fab片段7看起来像是“Y”的两个臂，Fc片段8看起来像“Y”的基部，而铰链区10将Fc片段8与两个Fab片段7连接起来。
每个Fab片段7包括来自重链2的VH和CH1，以及来自轻链3的VL和CL。Fab片段7包含由VL和VH形成的可变片段(Fv片段)9。Fv片段9容纳抗原结合位点即互补位，互补位可以位于Y形兔单抗1的臂末端。
每个可变区VH和VL包括互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。CDR是可变区内的高变区，其包含抗原接触残基，能够实现Y形兔mAb 1对人PD-L1胞外域的识别和接触功能。Y形兔mAb1包含六个CDR，其中三个在VH区，即VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；另外三个在VL区，即VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。
VH和VL的CDR由FR隔开。Y形兔mAb 1包含八个FR，其中四个在VH区(VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4)，另外四个在VL区(VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4)。在某实施例中，FR占可变区的约85％。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。FR是可变区的保守区，可充当支架使CDR具备能够与抗原(如人PD-L1的胞外域)接触的三维结构。
CDR区决定Y型兔mAb 1的特异性和亲和力。FR区能够协助维持Y型兔mAb 1可变区的整体结构，并支撑CDR使其能够以合适的构型与抗原结合。
不同抗体FR的三维结构可以是相同的。在某实施例中，Y形兔mAb 1的CDR可以在保留其结合人PD-L1的能力的情况下转接至来自其他物种的另一抗体的FR中，以形成嵌合抗体。如，可以将Y形兔mAb 1的CDR移植到人抗体的FR中，形成针对人PD-L1的人源化抗体。
Fc片段8可以由来自两条重链2的CH 2和CH 3形成。在某实施例中，Fc片段8包括三个恒定区。由于Fc片段8由重链的恒定区组成，而Y形兔mAb 1和抗原的结合与Fc片段8无关，因此，可以根据重链类别对抗体进行分类。在某实施例中，Fc片段8能够通过与特定种类的Fc受体或免疫分子(如补体蛋白)结合来调节免疫细胞的活性。当CDR与抗原结合时，Fc片段8还能够发挥一定的免疫应答效应。Fc片段8还可以介导不同的生理效应，包括但不限于：与FcγR结合时对修饰后的微粒进行识别；与Fcε受体结合时，对肥大细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞脱粒；与补体蛋白结合时，裂解细胞或补体依赖性细胞毒性；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)与新生Fc受体(FcRn)相互作用，能够减缓抗体降解并延长其血清半衰期。
Y形兔抗人PD-L1 mAb的可以包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2。这些抗体能够识别并结合人PD-L1胞外域表位，其结构、抗原结合部分、衍生物和应用描述如下。
如图2A-C，分别显示了某些实施例中的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的重链(VH)可变区的CDR1、CDR2和CDR3的比对结果。
如图2A，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH CDR1的长度为9-10个氨基酸。2C5的VH CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：1；3B8的VH CDR1的包括SEQ ID NO：2；8C6的包括SEQID NO：3；10H6的包括SEQ ID NO：4；11G7的包括SEQ ID NO：5；12H2的包括SEQ ID NO：6。
3B8、10H6和12H2的VH CDR1的序列通式为FSFS[S/N][S/I/N][Y/A]Y[M/L]C。“[]”表示蛋白序列中的单个位置，符号“/”表示“或”，如[A/B/C]表示A或B或C。
如图2B，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH CDR2长度为18-20个氨基酸。2C5的VHCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7；3B8的包括SEQ ID NO：8；8C6的包括SEQ ID NO：9；10H6的包括SEQ ID NO：10；11G7的包括SEQ ID NO：11；12H2的包括SEQ ID NO：12。
如图2C，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH CDR3长度为13-19个氨基酸。2C5的VHCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：13；3B8的包括SEQ ID NO：14；8C6的包括SEQ ID NO：15；10H6的包括SEQ ID NO：16；11G7的包括SEQ ID NO：17；12H2的包括SEQ ID NO：18。
如图3A-C，分别显示了某些实施例的兔抗人PD-L1mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的轻链(VL)可变区的CDR1、CDR2和CDR3的比对结果。
如图3A，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL CDR1的长度为9-11个氨基酸。2C5的VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO：19；3B8的是SEQ ID NO：20；8C6的是SEQ ID NO：21；10H6的是SEQ ID NO：22；11G7的是SEQ ID NO：23；12H2的是SEQ ID NO：24。2C5和11G7的VLCDR1通式为[H/Q]NVY[S/N][D/K][N/K][R/N]L[S/A]W。3B8、8C6、10H6和12H2的VL CDR1通式为[Q/E]SI[S/G/A][S/G][Y/W]LAW。
如图3B，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL CDR2的长度为11个氨基酸。2C5的VLCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：25；3B8的包括SEQ ID NO：26；8C6的包括SEQ ID NO：27；10H6的包括SEQ ID NO：28；11G7的包括SEQ ID NO：29；12H2的包括SEQ ID NO：30。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL CDR2通式为LIY[K/R/W/D]A[S/Y][T/I/D]L[A/E]SG。
如图3C，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL CDR3长度为9-15个氨基酸。2C5的VLCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：31；3B8的包括SEQ ID NO：32；8C6的包括SEQ ID NO：33；10H6的包括SEQ ID NO：34；11G7的包括SEQ ID NO：35；12H2的包括SEQ ID NO：36。3B8和8C6的VL CDR3通式为QGYS[S/A][E/T]NIDN[S/A]F。11G7和2C5的VL CDR3通式为G[G/D]Y[S/I]G[N/S][I/R][Y/A][T/-]F，其中“-”表示缺失，即在相应序列位置缺失氨基酸。
如图4A-D，分别显示了某些实施例中的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6，10H6、11G7和12H2)的VH FR1，VH FR2，VH FR3和VH FR4的比对结果。
如图4A，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR1的长度为25-26个氨基酸。2C5和11G7的VH FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO：37；3B8的包括SEQ ID NO：38；8C6的包括SEQ IDNO：39；10H6和12H2的包括SEQ ID NO：40。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR1序列模式为Q[S/E][Q/-][L/V][E/V]ESGG[R/G/D]LV[T/Q/K]P[G/E][T/G/A][P/S][L/R]TLTCT[A/V]SG。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR1具有通式Qx[x/-]xxESGGxLVxPxxxxTLTCTxSG，其中“x”代表单个氨基酸位点，“[x/-]”代表一个氨基酸位点或一个缺失。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR4具有57.7％的相同氨基酸残基和96.2％的共有氨基酸残基。
如图4B，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR2长度为11个氨基酸。2C5、3B8、10H6、11G7和12H2的VH FR2各自包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。8C6的VH FR2包括SEQ IDNO：42的氨基酸序列；2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR2s可以具有WVRQAPGxGLE的共同结构，其中“x”代表单个氨基酸位点。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR2具有90.9％的相同氨基酸残基和100％的共有氨基酸残基。
如图4C，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR3长度为26至27个氨基酸。2C5的VHFR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：43；3B8和10H6的包括SEQ ID NO：44；8C6的包括SEQ IDNO：45；11G7的包括SEQ ID NO：46；12H2的包括SEQ ID NO：47。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR3具有通式为GRFTIS[K/R/E]TS[S/-][T/N]TV[T/D/A]L[Q/K/E][M/I]TS[L/P]T[A/T/I][E/A]DTAT，其中“-”表示缺失。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR3具有通式GRFTISxTS[x/-]xTVxLxxTSxTxxDTAT，其中“x”代表单个氨基酸位点，“[x/-]”代表一个氨基酸位点或一个缺失。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR3具有67.7％的相同氨基酸残基和100％的共有氨基酸残基。
如图4C，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR4长度为11个氨基酸。2C5、3B8、10H6和12H2的VH FR4包括通式SEQ ID NO：48；8C6和11G7的VH FR4包括通式SEQ ID NO：49；2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR4包括通式为WG[P/Q]GTLVTVSS的基序；2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR4具有通式WGxGTLVVTVSS的结构，其中“x”代表单个氨基酸位点。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VH FR4具有90.9％的相同氨基酸残基和100％的共有氨基酸残基。
如图5A-D，分别显示了某些实施例的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5，3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的轻链(VL)的FR1、FR2、FR3和FR4的比对结果。
如图5A，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR1的长度为26至27个氨基酸。2C5的VL FR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：50；3B8和8C6的VL FR1的包括SEQ ID NO：51；10H6的包括SEQ ID NO：52；11G7的包括SEQ ID NO：53；12H2的包括SEQ ID NO：54；2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR1具有以下公式：[A/-][Q/D/-][Y/V/I/L][D/V/-][M/L/P]TQT[P/A][S/A][P/S]V[S/E][A/V]AVGGTVTI[N/K]CQ[A/S]S。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VLFR1s具有TQTxxxVxxAVGGTVTIxCQxS的共同结构，其中“x”代表单个氨基酸位点。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR1具有55.6％的相同氨基酸残基和96.3％的共有氨基酸残基。
如图5B，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR2长度为11个氨基酸。2C5的VL FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：55；3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的包括SEQ ID NO：56。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR2具有YQQK[P/L]GQPPKL的序列通式。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR2s具有YQQKxGQPPKL的共同结构，其中“x”代表单个氨基酸。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR2具有90.9％的相同氨基酸残基和100％的共有氨基酸残基。
如图5C，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR3长度为32个氨基酸的长度。2C5的VL FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：57；3B8的包括SEQ ID NO：58；8C6的包括SEQ IDNO：59；10H6的包括SEQ ID NO：60；11G7的包括SEQ ID NO：61；12H2的包括SEQ ID NO：62。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的具有以下公式：V[P/A/S]SRF[K/S/R]GSGSGT[Q/E]FTLTI[S/T][D/G][L/V]EC[A/D/T]DAATYYC[Q/A]。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的具有VxSRFxGSGSGTxFTLTIxxxECxDAATYCx的通用结构，其中“x”代表单个氨基酸位点。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR3具有75.0％的相同氨基酸残基和100％的共有氨基酸残基。
如图5D，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR4长度为9个氨基酸。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR4包含通式SEQ ID NO：63。3B8的包含通式SEQ ID NO：64。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR4具有GGGT[E/D]VVVK的序列公式和GGGTxVVVK的通用结构。2C5、8C6、10H6、11G7和12H2的VL FR4具有88.9％的相同氨基酸残基和100％的共有氨基酸残基。
如图6，显示了某些实施例中兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)重链(VH)可变区的序列比对结果。
2C5的VH序列包括SEQ ID NO:65；3B8的VH序列包括SEQ ID NO:66；8C6的VH序列包括SEQ ID NO:67；10H6的VH序列包括SEQ ID NO:68；11G7的VH序列包括SEQ ID NO:69；12H2的VH序列包括SEQ ID NO:70。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VH具有87.1％的共有氨基酸残基和50.0％的相同氨基酸残基。
如图7，显示了某些实施例的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)轻链(VL)可变区的序列比对结果。
2C5的VL序列包括SEQ ID NO:71；3B8的VL序列包括SEQ ID NO:72；8C6的VL序列包括SEQ ID NO:73；10H6的VL序列包括SEQ ID NO:74；11G7的VL序列包括SEQ ID NO:75。12H2的VL序列包括SEQ ID NO:76。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的VL具有90.5％的共有氨基酸残基和56.9％的相同氨基酸残基。
如图8，显示了某些实施例的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的Fab片段的重链序列比对结果。
2C5 Fab片段的重链序列包括SEQ ID NO:77；3B8 Fab片段的重链序列包括SEQ IDNO:78；8C6 Fab片段的重链序列包括SEQ ID NO:79；10H6 Fab片段的重链序列包括SEQ IDNO:80；11G7 Fab片段的重链序列包括SEQ ID NO:81；12H2 Fab片段的重链序列包括SEQ IDNO:82。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的Fab片段的重链具有92.2％的共有氨基酸残基和71.7％的相同氨基酸残基。
如图9，显示了某些实施例的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的Fab片段的轻链序列比对结果。
2C5 Fab片段的轻链序列包括SEQ ID NO:83；3B8 Fab片段的轻链序列包括SEQ IDNO:84；8C6 Fab片段的轻链序列包括SEQ ID NO:85；10H6 Fab片段的轻链序列包括SEQ IDNO:86；11G7 Fab片段的轻链序列包括SEQ ID NO:87；12H2 Fab片段的轻链序列包括SEQ IDNO:88。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的Fab片段轻链具有95.9％的共有氨基酸残基和78.2％的相同氨基酸残基。
如图10，显示了某些实施例的兔抗人PD-L1 mAb(包括2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的Fc片段的重链序列比对。
2C5、8C6和12H2 Fc片段的重链序列包括SEQ ID NO:89；3B8和10H6 Fc片段的重链序列包括SEQ ID NO:90；11G7 Fc片段的重链序列包括SEQ ID NO:91。2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的Fc片段的重链具有100％共有氨基酸残基和97.8％相同氨基酸残基。
在某实施例中，兔抗PD-L1 mAb可以是本申请中所述的Y形抗体的抗原结合部分；也可以是由VL、VH、CL和CH1结构域形成的Fab单价片段；也可以是包含两个连接的Fab片段7的F(ab')2二价片段，两个Fab片段7可以通过例如铰链区10的二硫键连接；也可以是由VH和CH1结构域形成的Fd片段；也可以是由VL和VH结构域形成的Fv片段9；也可以是由全长抗体的VH结构域组成的单结构域抗体(sdAb)；也可以是独立的互补决定区。
所述的兔抗PD-L1 mAb还可以包括对各实施例中所述的抗体结构或其抗原结合部分进行遗传修饰后的抗体结构，包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体等。其中人源化抗体包括对兔抗PD-L1 mAb蛋白序列进行修饰，以增加其与人天然抗体的相似性。尽管某些来源于兔的CDR在抗体与人PD-L1的结合中至关重要，但人源化抗体的蛋白序列基本上是可以与人源变异的蛋白序列相同的。在某实施例中，可以通过将非人源抗体(如兔抗体)的CDR插入人抗体支架中来制备人源化抗体。对于嵌合抗体，可以通过融合来自Y形抗体的重链和轻链可变区、以及来自其他物种(如人)的恒定区制备得到；也可以通过融合来自兔抗PD-L1 mAb的Fab以及来自人源抗体的Fc制备得到。在某实施例中，兔抗PD-L1 mAb可以是单链Fv(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)是由不同的基因编码的，但是，可以通过合成连接子将两者重组连接起来，构成scFv。本申请中的遗传修饰包括现有技术中已知的修饰方法，且可以用与全长抗体相同的筛选方法来筛选遗传修饰结构。
本申请中的抗体还包括对各实施例中所述的抗体结构或其抗原结合部分进行化学修饰后的抗体结构。在某实施例中，化学修饰可以是化学交联，包括将一种或多种偶联物通过共价或非共价与抗体连接。偶联物可以是与抗体共价连接、用于检测抗原的分子标记；也可以是小分子。小分子可以是生物素、链霉亲和素或荧光染料。荧光染料包括但不限于Alexa荧光剂、氨基甲基香豆素(AMCA)、Atto染料、花青染料、DyLight荧光剂、FITC、FluoProbes 647H、若丹明和德克萨斯红。Alexa荧光剂包括但不限于Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647和AlexaFluor700。Atto染料包括但不限于Atto 390、Atto 488、Atto 565、Atto 633和Atto700。所述花菁染料包括但不限于Cy3、Cy5和Cy5.5。DyLight染料包括但不限于DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 755和DyLight 800。偶联物还可以是包含两个共价连接的荧光分子的串联染料，其中一个荧光分子充当供体，另一个荧光分子充当受体，分别表现出供体的激发性质和受体的发射性质。串联燃料包括但不限于别藻蓝蛋白-Cy5.5、别藻蓝蛋白-Cy 7、PE-Atto 594、PE-Cy 5、PE-Cy 5.5、PE-Cy 7、PE-得克萨斯红、PE-Alexa Fluor 647、PE-Alexa Fluor 700、PE-Alexa Fluor 750、APC-Alexa Fluor 750和PerCP-Cy5.5。
偶联物还可以是大分子，如：酶，包括但不限于碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(Gox)及辣根过氧化物酶(HRP)；还可以是荧光蛋白，包括但不限于别藻蓝蛋白(APC)、B-藻红蛋白(BPE)、R-藻红蛋白(R-PE)、PerCP和R-藻蓝蛋白(RPC)；还可以是特异性不同于兔单克隆抗人PD-L1抗体的抗体，共同形成具有多种特异性的串联抗体。
抗人PD-L1抗体在体外或体内具有多种应用方式，包括但不限于免疫测定、免疫染色、免疫组织化学、与PD-L1相关的人类疾病诊断、免疫肿瘤疗法以及某些由PD-L1引起的感染性疾病的治疗。免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。兔抗人PD-L1抗体可用于各种形式的ELISA中。
抗人PD-L1抗体可以用于直接ELISA中，包括基于吸附板的免疫吸附检测，能够检测或定量检测复杂生物样品中的特定抗原。
直接ELISA的检测方法有多种，包括：将抗原(如人PD-L1的胞外域)固定或吸附在塑料板表面。塑料板可以是多孔微量滴定板，如96孔聚苯乙烯板。也可以将过量的封闭蛋白(如牛血清蛋白)添加到塑料板表面，以阻断其他结合位点。或者将抗原特异性抗体(如人PD-L1的胞外域)添加到塑料板表面，从而与抗原形成复合物。抗体也可以与酶(如HRP)偶联。洗去多余的抗体后，与抗原结合的抗体被保留下来。向反应体系中添加底物，结合的抗体能够催化与底物的反应，释放出可借用分光光度计或酶标仪来检测的光。与其它形式的ELISA法相比，直接ELISA由于仅使用一种抗体、且操作步骤少，而具备更加快捷的特点。直接ELISA可以用于检测特异性抗体-抗原反应，并能够尽可能地减少其他抗体间的交叉反应；还可以用于抗原的定性或定量检测、抗体筛选及表位作图。
图11是某个实施例中，使用直接ELISA检测PD-L1的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的标准曲线。直接ELISA的具体方法见下述。如图11，X轴为PD-L1样品浓度，单位为ng/ml；Y轴为450nm处的光密度值，最高检测浓度为1000ng/ml。如图中所示，所有抗体均呈现标准的S曲线，除了空白缓冲液(即用于稀释抗人PD-L1抗体的缓冲液)做对照组外，其它所有抗体均采用相同的处理步骤。与阴性对照组相比，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2对各种浓度的人PD-L1均表现出极好的敏感性。
图12是某个实施例中，使用直接ELISA检测PD-L2的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的标准曲线。直接ELISA的具体方法见下述。如图12，X轴为PD-L2样品浓度，单位为ng/ml；Y轴为450nm处的光密度值，最高检测浓度为1000ng/ml。除了空白缓冲液(即用于稀释抗人PD-L2抗体的缓冲液)做对照组外，其它所有抗体均采用相同的处理步骤。与阴性对照的曲线相比，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2无法识别并结合人PD-L2。因此，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2不会发生人PD-L2的交叉反应。
抗人PD-L1抗体还可以用于捕获ELISA中，以代替直接ELISA，包括借助单克隆抗体将抗原(如人PD-L1)附着在塑料板上。与直接ELISA相比，捕获ELISA能够有效防止塑料板表面阻断或抗原变性。由于捕获ELISA能够更有效地暴露人PD-L1上的表位，因此其灵敏度比直接ELISA更高。捕获ELISA还可以用于筛选和检测能够识别天然构象表位的抗体。
图13是某实施例中，使用捕获ELISA检测PD-L1的2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2的标准曲线。捕获ELISA的方法如下述。如图13，X轴为PD-L1样品浓度，单位为ng/ml；Y轴为450nm处的光密度值，最高检测浓度为1000ng/ml。与图11中的直接ELISA相比，捕获ELISA的灵敏度通常高出两倍，捕获ELISA的OD450值是直接ELISA的两倍。例如，在10ng/ml的捕获ELISA中，2C5的OD450值略高于1.0，而在直接ELISA中该值略低于0.5。捕获ELISA中，11G7的灵敏度比直接ELISA的高15倍。例如，在10ng/ml的捕获ELISA中，11G7的OD450值约为0.1，而在捕获ELISA中该值接近1.5。
如图14，本申请中所有抗人PD-L1抗体均呈现标准的S曲线。除了空白缓冲液(即用于稀释抗人PD-L1抗体的缓冲液)做对照组外，其它所有抗体均采用相同的处理步骤。与阴性对照的曲线相比，2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2对各种浓度的人PD-L1均表现出极好的敏感性。
抗人PD-L1抗体还可以用于夹心ELISA中。夹心ELISA可以有效检测样品中的抗原。夹心ELISA能够检测或定量检测两个抗体(捕获抗体和检测抗体)之间的抗原，待测抗原包含至少两个能够与抗体结合而不会受到干扰的抗原表位。夹心ELISA非常敏感，不需要在检测前纯化抗原。在某些实施例中，夹心ELISA对人PD-L1的敏感性比直接ELISA至少高两倍。
夹心ELISA具有多种操作方法，包括将捕获抗体固定或包被在塑料板表面；或者将包含第一抗原表位和第二抗原表位的待测样品(如人PD-L1)铺设在塑料板表面。某些实施例中，捕获抗体与第一抗原表位结合，检测抗体与第二抗体结合，或者检测抗体与酶连的第二抗体结合。向反应体系中添加底物，与第二抗体连接的酶催化与底物的反应，释放出可借用分光光度计或酶标仪来检测的光度。
图14A-E显示了某实施例中使用兔抗人PD-L1mAb作捕获和检测抗体的夹心ELISA的结果。夹心ELISA的方法如下述。X轴为PD-L1样品浓度，单位为ng/ml；Y轴为450nm处的光密度值。除了空白缓冲液(即用于稀释抗人PD-L1抗体的缓冲液)做对照组外，其它所有抗体均采用相同的处理步骤。
如图14A，显示了使用兔抗人PD-L1 mAbs 2C5作捕获抗体、8C6作检测抗体的夹心ELISA的结果。阴性对照在OD450 nm处几乎没有检测值，但8C6作检测抗体时，OD450值随人PD-L1浓度的增加而逐渐升高，呈S型曲线。结果表明，捕获抗体2C5与人PD-L1的结合不会阻止检测抗体8C6与人PD-L1的结合，同时还说明，2C5和8C6与人PD-L1的不同抗原表位结合。
与图11中使用8C6做抗体的直接ELISA相比，以8C6作为检测抗体的夹心ELISA在相同浓度人PD-L1时显示出更高的OD450值。这说明与直接ELISA相比，夹心ELISA能够增强人PD-L1对2C5的敏感性。
如图14B，显示了使用兔抗人PD-L1 mAbs 8C6作捕获抗体、2C5作检测抗体的夹心ELISA的结果。结果显示，随着人PD-L1浓度的增加，OD450值越来越高，呈S型曲线，而阴性对照的OD450值不显著。结果表明，捕获抗体8C6与人PD-L1的结合不会阻止检测抗体2C5与人PD-L1的结合，同时还说明，2C5和8C6与人PD-L1的不同抗原表位结合。
与图11中使用2C5做抗体的直接ELISA相比，以2C5作为检测抗体的夹心ELISA在10ng/ml的人PD-L1是显示的OD 450值高于1.0，而直接ELISA仅为0.5。用2C5作为检测抗体的夹心ELISA对人PD-L1的敏感性至少是直接ELISA的两倍。
图14A-B说明2C5和8C6可以在夹心ELISA中作为一对抗体使用。
图14C为使用兔抗人PD-L1mAb 2C5作捕获抗体、3B8作检测抗体的夹心ELISA的结果。结果说明，2C5与人PD-L1结合不会干扰3B8与人PD-L1的结合。
图14D为使用兔抗人PD-L1mAb 3B8作捕获抗体、2C5作检测抗体的夹心ELISA的结果。结果说明，3B8与人PD-L1结合不会干扰2C5与人PD-L1的结合。
图14C和D说明2C5和3B8可以在夹心ELISA中作为一对抗体使用。2C5和3B8与人PD-L1上的不同抗原表位结合。
图14E为使用兔抗人PD-L1mAb 8C6作捕获抗体、3B8作检测抗体的夹心ELISA的结果。结果说明，8C6与人PD-L1的结合不会干扰3B8与人PD-L1的结合。说明8C6和3B8可以分别作为夹心ELISA中的捕获和检测抗体。8C6和3B8在人PD-L1的胞外域的不同位置结合不同的抗原表位。
上述的ELISA检测技术可以制备成包含抗人PD-L1mAb的ELISA试剂盒，用于检测或定量检测人PD-L1。抗人PD-L1mAb优选为兔抗人PD-L1mAb，如2C5、3B8、8C6、10H6、11G7或12H2或其抗原结合部分。兔抗人PD-L1mAb包括其衍生物和/或进行保守修饰的抗体。试剂盒中还可以包括ELISA板；进一步地，还可以包括第二抗体，如偶联抗体。
由于抗原结合的特异性主要是由CDR来决定的，且2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2均可以与PD-L1结合，因此，可以将不同来源的CDR序列重新混合或组合以制备多种抗人PD-L1抗体，优选结构相似且来自相同区(比如均为VH区或均为VL区)的CDR相互替换。显而易见地，一个CDR序列可以取代至少一个VH和/或VL CDR序列。
VH、VL、轻链和重链的氨基酸序列或核苷酸序列也可以重新混合或组合以制备其他PD-L1结合抗体。优选结构相似且来自相同区(比如均为VH区、VL区、轻链区或重链区)的序列相互替换。当重链和轻链混合时，优选被全长重链或轻链中的相似结构取代。
在某实施例中，抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列可以与本申请中已经披露的氨基酸序列保持一定程度的同源性，且具备相同的特异性。如，重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：65-70的序列具有至少80％的同源性，轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：71-76的序列具有至少80％的同源性。如，VH和/或VL氨基酸序列与上述序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。同源序列可以通过诱变(如定点突变或PCR介导的诱变)的方式获取，并通过功能测定检测同源序列是否保留原序列的功能效果。
两个氨基酸序列之间的同源性即两者之间的同一性，计算方式为：同源性％＝相同位置数目/总位置数目×100，序列比较时，需考虑缺失位置。
在某实施例中，抗人PD-L1抗体包括各自含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和轻链可变区，这些序列可以由已知的抗人PD-L1单抗(如2C5、3B8、8C6、10H6、11G7和12H2)的氨基酸序列诱变衍生而来，同时保留原序列的特异性和亲和力，如对原序列进行保守修饰的序列，或所得保守修饰序列的变体序列。
本申请中的“保守修饰”是指基本不影响原序列抗体特性的氨基酸修饰，包括氨基酸的突变、插入和缺失，具体修饰方式可以是本领域已知的修饰手段，如定点突变或PCR介导的诱变等。氨基酸的保守取代是指其氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。氨基酸残基家族为本领域公知定义，包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链氨基酸(如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链氨基酸(如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链氨基酸(如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸)，β支链侧链氨基酸(如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，CDR区的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基代替，并进行检测确保其保留原序列的功能。
本申请中的“保守修饰的变体”包括多肽序列的个别氨基酸被功能相似氨基酸取代、缺失或添加，还包括多态性变体、种间同系物及其等位基因。以下各组内氨基酸可以相互取代：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)。本申请中“保守序列修饰”指基本上不影响或改变其结合能力的氨基酸修饰。
本申请中涉及的制备或检测方法：
1.兔抗人PD-L1胞外域单克隆抗体的制备、分离和纯化。
兔抗人PD-L1 mAb的制备方法有多种，包括单克隆抗体法，如细胞杂交等，包括但不限于B淋巴细胞的病毒转化或原代转化，也可以通过单个B细胞制备技术获得。
脾细胞的免疫、分离及融合可采用本领域常规方法。如，通过刺激新西兰白兔的免疫反应获得人PD-L1蛋白的胞外域的免疫原，具体包括从PBMC和次级淋巴组织中分离出PD-L1特异性B细胞，扩增候选IgG基因以重组表达兔mAb。通过直接抗原ELISA验证mAb候选物的结合力和特异性，捕获ELISA和夹心ELISA对可识别人PD-L1的mAb进一步表征，以进行后续分析开发。
兔mAb的分离和纯化方法有多种，如可以从用兔抗体基因转染的哺乳动物细胞的培养上清液中分离，然后利用蛋白A亲和层析进行纯化，纯度和功能效果可以通过SDS-PAGE和ELISA进行验证。
2.偶联兔抗人PD-L1的单克隆抗体的制备
使用市场购买的Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin并按照其操作说明对兔单克隆抗体进行生物素化，具体为：将兔单克隆抗体与磺基-NHS-生物素在pH7.4的1x PBS缓冲液中，于室温孵育30min。
3.用兔抗人PD-L1或PD-L2 mAb进行直接ELISA。
将人PD-L1和PD-L2附着在ELISA板上，于4℃、1x PBS(pH7.4)包被过夜。使用含有0.5％(V/V)Tween-20的1x PBS洗涤，并用封闭缓冲液(含有0.5％(W/V)脱脂奶的1x PBS)封闭。封闭后，将板与兔抗PD-L1单克隆抗体在室温下孵育1小时，然后洗涤，并与偶联有HRP的山羊抗兔IgG抗体孵育。最后一次洗涤后，HRP催化显色，检测单克隆抗体是否结合PD-L1和PD-L2。
4.用兔抗人PD-L1单克隆抗体进行捕获ELISA。
将抗兔IgG Fc抗体附着在ELISA板上，于4℃、1x PBS(pH7.4)包被过夜。使用含有0.5％(W/V)Tween-20的1x PBS洗涤，并用封闭缓冲液(含有0.5％(V/V)脱脂奶的1x PBS)封闭。封闭后，将板与兔抗PD-L1单克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤，并与3倍稀释的生物素化PD-L1蛋白进行孵育。将板与偶联HRP的链霉亲和素孵育。最后一次洗涤后，HRP催化显色，检测单克隆抗体是否可以捕获PD-L1。
5.用兔抗人PD-L1单克隆抗体进行夹心ELISA。
将捕获抗体附着在ELISA板上，于4℃的碳酸氢盐缓冲液中包被过夜。使用含有0.5％(W/V)Tween-20的1x PBS洗涤，并用封闭缓冲液(含有0.5％(V/V)脱脂奶的1x PBS)封闭。封闭后，将板与稀释3倍的人PD-L1蛋白在室温下孵育1小时，然后洗涤，并与生物素化的抗PD-L1检测抗体一起孵育。将板与偶联HRP的链霉亲和素孵育。最后一次洗涤后，HRP催化显色，检测一对捕获和检测抗体是否可以同时结合PD-L1。
本申请中的“包括、包含、具有”均为开放式描述，表示“包括但不限于”。
本发明中所公开的仅为较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本申请中公开的修饰物和等同物包括编码本申请中的氨基酸序列的核苷酸序列。
本申请中的具体实施例如下：
实施例1抗体包括：
(a)序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6，或对其进行保守修饰的VH CDR1；
(b)序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12，或对其进行保守修饰的VH CDR2；
(c)序列选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18，或对其进行保守修饰的VH CDR3；
(d)序列选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24，或对其进行保守修饰的VL CDR1；
(e)序列选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:30，或对其进行保守修饰的VL CDR2；
以及(f)序列选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，或对其进行保守修饰的VL CDR3。
实施例2如实施例1中的抗体，其中：
(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：1所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：7所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：13所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：19所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：25所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及(f)所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：31所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例3如实施例1中的抗体，其中：
(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：2所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：8所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：14所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：20所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：26所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及(f)所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：32所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例4如实施例1中的抗体，其中：
(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：3所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：9所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：15所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：21所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：27所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及(f)所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：33所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例5如实施例1中的抗体，其中：
(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：4所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：10所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：16所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：22所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：28所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及(f)所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：34所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例6如实施例1中的抗体，其中：
(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：5所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：11所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：17所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：23所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：29所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及(f)所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：35所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例6如实施例1中的抗体，其中：
(a)所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：6所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR2包含如SEQ ID NO：12所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR3包含如SEQ ID NO：15所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1包含如SEQ ID NO：24所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR2包含如SEQ ID NO：30所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及(f)所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：36所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例8如实施例1-7任一所述的抗体，还包括：
(a)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ IDNO：40的VH FR1；
(b)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42的VH FR2；
(c)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46或SEQ ID NO：47的VH FR3；
(d)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的VH FR4；
(e)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53或SEQ ID NO：54的VL FR1；
(f)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的VL FR2；
(g)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62的VL FR3；
以及(h)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64的VL FR4。
实施例9抗体包括：
(a)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70，或对其进行保守修饰的VH；
以及(b)氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76，或对其进行保守修饰的VL。
实施例10如实施例9所述的抗体：
其中VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:65，VL的氨基酸序列为SEQ ID NO:71。
实施例11如实施例9所述的抗体：
其中VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:66，VL的氨基酸序列包括SEQ ID NO:72。
实施例12如实施例9所述的抗体：
其中VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:67，VL的氨基酸序列包括SEQ ID NO:73。
实施例13如实施例9所述的抗体：
其中VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:68，VL的氨基酸序列包括SEQ ID NO:74。
实施例14如实施例9所述的抗体：
其中VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:69，VL的氨基酸序列包括SEQ ID NO:75。
实施例15如实施例9所述的抗体：
其中VH的氨基酸序列包括SEQ ID NO:70，VL的氨基酸序列包括SEQ ID NO:76。
实施例16一种具有包含重链和轻链的Fab片段的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82，或对其进行保守修饰的氨基酸序列；
以及，轻链的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:88，或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例17如实施例16的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:77，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:83。
实施例18如实施例16的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:78，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:84。
实施例19如实施例16的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:79，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:85。
实施例20如实施例16的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:80，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:86。
实施例21如实施例16的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:81，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:87。
实施例22如实施例16的抗体：
其中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:82，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID NO:88。
实施例23如实施例1-22任一所述的抗体：
还包括Fc片段，所述Fc片段氨基酸序列选自SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQID NO:91，或对其进行保守修饰的氨基酸序列。
实施例24如实施例1-23任一所述的抗体：
还包括共价或非共价连接的偶联物。
实施例25如实施例24所述的抗体：
所述偶联物包括酶、荧光团、生物素或链霉亲和素，或其组合。
实施例26如实施例1-25任一所述的抗体：
该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体或其组合。
实施例27如实施例1-26任一所述的抗体：
该抗体是人源化的抗体或嵌合抗体。
实施例28如实施例1-27任一所述的抗体：
该抗体是抗人PD-L1抗体。
实施例29如实施例1-28任一所述的抗体：
该抗体与PD-L2没有或仅有少量交叉反应。
实施例30如实施例1-29任一所述的抗体：
其中CDR具有47.4-100％的同源性。
实施例31如实施例1-30任一所述的抗体：
其中FR具有55.6-100％的同源性。
实施例32如实施例1-31任一所述的抗体：
该抗体包含至少一个兔CDR。
实施例33检测人PD-L1的ELISA试剂盒，包含如实施例1-32任一所述的抗体。
实施例34检测人PD-L1的方法，包括：
添加第一抗体，所述第一抗体如实施例1-30任一所述。
实施例35如实施例34所述的检测方法，具体为直接ELISA法。
实施例36如实施例34所述的检测方法，具体为捕获ELISA法。
实施例37如实施例34所述的检测方法，具体为夹心ELISA法。
实施例38所述检测人PD-L1的的方法还包括：
添加第二抗体，其中第一抗体捕获人PD-L1的胞外域，第二抗体包括用于检测的偶联物；
第一抗体与第二抗体不同；
所述第一抗体和第二抗体分别选自3B8、2C5和8C6。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司
<120> 抗人PD-L1单克隆抗体及其应用
<150> US62/857,145
<151> 2019-06-04
<160> 91
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Tyr Ile Gly Phe Ile Asn Pro Pro Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp
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Ala Lys
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Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Asn Thr Trp Tyr Ala
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Ser Trp Ala Lys
20
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Ala Lys
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Asn Trp Ala Lys
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Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Arg Phe Asp Asp Tyr Gly Asp Leu
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Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Ile Tyr Gly Tyr Ala Ile Asn Leu
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Tyr Phe Cys Val Arg Asp Arg Pro Asp Gly Ile Thr Ala Asn Leu
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Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Asp Asp Thr Gly Ser Gly Tyr Tyr Asn Leu
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Glu Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp
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Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
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Leu Ile Tyr Asp Ala Tyr Asp Leu Ala Ser Gly
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Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly
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Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly
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Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
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Gly Asp Tyr Ile Gly Ser Arg Ala Phe
1 5
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Gln Gly Tyr Ser Ser Glu Asn Ile Asp Asn Ser Phe
1 5 10
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<211> 12
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Gln Gly Tyr Ser Ala Thr Asn Ile Asp Asn Ala Phe
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Cys Thr Tyr Asp Ser Ser Asn Ser Arg Ile Tyr Pro Asn Val Phe
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Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Tyr Thr Phe
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
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Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
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Arg Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly
20 25
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1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly
20 25
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Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly
20 25
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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Asn Thr Val Asp Leu Lys Ile
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Thr Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln
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Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Glu Met
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Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr
20 25
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
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Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr
20 25
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln
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Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
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Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
20 25
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<211> 26
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<400> 52
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
20 25
<210> 53
<211> 26
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<213> rabbit
<400> 53
Ala Gln Leu Pro Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser
20 25
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Ala Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val
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Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
20 25
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Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu
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Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Thr Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
20 25 30
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Val Ser Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
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Val Ala Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
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Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
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Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu
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Thr Ile Thr Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
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Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
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Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
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1 5
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<213> rabbit
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Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Asp Asn
20 25 30
Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Leu Ile Asp Ile Leu Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Asn Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly
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Asp Gly Ser Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
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Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Arg Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Asn Ala
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Asn Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ala Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Ser Phe Tyr Phe Asn Leu Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 114
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<213> rabbit
<400> 67
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Arg His His
20 25 30
Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Asn Pro Pro Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Glu Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Arg
85 90 95
Phe Asp Asp Tyr Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<400> 68
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
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Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ile
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Tyr Tyr Leu Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Ile Tyr Gly Tyr Ala Ile Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
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<400> 69
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Asp
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Ser Tyr Phe Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asp Arg
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Pro Asp Gly Ile Thr Ala Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Val Ser Ser
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Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
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Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
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Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ala Arg Asp Asp Asp Thr Gly Ser Gly Tyr Tyr Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Lys
20 25 30
Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asp Tyr Ile Gly
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Ser Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
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Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Tyr Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
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Ile Asp Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Asp Val Val Val Lys
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Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ala Ser Tyr
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Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Arg Gly
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Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ala Thr Asn
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Tyr
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Lys
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Ala Gln Leu Pro Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser His Asn Val Tyr Ser Asp
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Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Gly
85 90 95
Asn Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 76
<211> 111
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 76
Ala Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Tyr Phe Gly
85 90 95
Ser Val Ala Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 77
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Asp Asn
20 25 30
Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Leu Ile Asp Ile Leu Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Asn Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly
85 90 95
Asp Gly Ser Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys
115 120 125
Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr
145 150 155 160
Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr
180 185 190
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
195 200 205
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<211> 217
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 78
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Arg Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Asn Ala
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Asn Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ala Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Ser Phe Tyr Phe Asn Leu Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr
130 135 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro
165 170 175
Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser
180 185 190
Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215
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<213> rabbit
<400> 79
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Arg His His
20 25 30
Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Asn Pro Pro Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu Glu Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Arg
85 90 95
Phe Asp Asp Tyr Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
115 120 125
Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu
145 150 155 160
Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val
180 185 190
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
195 200 205
Val
<210> 80
<211> 216
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 80
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Tyr Leu Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Ile Tyr Gly Tyr Ala Ile Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser
165 170 175
Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val
180 185 190
Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 81
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Asp
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Ser Tyr Phe Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asp Arg
85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
145 150 155 160
Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro
180 185 190
Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Thr Val
210
<210> 82
<211> 216
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 82
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Trp Thr Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ala Arg Asp Asp Asp Thr Gly Ser Gly Tyr Tyr Asn Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser
165 170 175
Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val
180 185 190
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195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215
<210> 83
<211> 213
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 83
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Lys
20 25 30
Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asp Tyr Ile Gly
85 90 95
Ser Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro
100 105 110
Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala
115 120 125
Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp
130 135 140
Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile
145 150 155 160
Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu
180 185 190
Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Asp Cys
210
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 84
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Thr Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Glu Asn
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro
130 135 140
Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys
180 185 190
Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210
<210> 85
<211> 214
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 85
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ala Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp
100 105 110
Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val
115 120 125
Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro
130 135 140
Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys
180 185 190
Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210
<210> 86
<211> 217
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 86
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1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Ala Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Asp Ser Ser Asn
85 90 95
Ser Arg Ile Tyr Pro Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala
115 120 125
Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys
130 135 140
Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln
145 150 155 160
Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys
165 170 175
Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn
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Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
195 200 205
Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 87
Ala Gln Leu Pro Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser His Asn Val Tyr Ser Asp
20 25 30
Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Gly
85 90 95
Asn Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp
100 105 110
Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val
115 120 125
Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro
130 135 140
Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys
180 185 190
Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210
<210> 88
<211> 215
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 88
Ala Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Tyr Phe Gly
85 90 95
Ser Val Ala Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly
100 105 110
Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln
115 120 125
Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe
130 135 140
Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr
145 150 155 160
Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr
165 170 175
Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His
180 185 190
Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 89
<211> 228
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 89
Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln
50 55 60
Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
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180 185 190
Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val
195 200 205
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210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 90
<211> 228
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 90
Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln
50 55 60
Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Thr His Gln Asp Trp Leu Arg
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys
115 120 125
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130 135 140
Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
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180 185 190
Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 91
<211> 228
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 91
Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln
50 55 60
Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys
115 120 125
Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
180 185 190
Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225

Claims (10)

1.一种抗人PD-L1的抗体，包括：
(a)VH CDR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(b)VH CDR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(c)VH CDR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(d)VL CDR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
(e)VL CDR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
以及(f)VL CDR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种。
2.根据权利要求1所述的一种抗体，其特征在于：还包括FR，所述FR包括：
(a)VH FR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQID NO：40的任一种；
(b)VH FR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42的任一种；
(c)VH FR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQID NO：46或SEQ ID NO：47的任一种；
(d)VH FR4，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的任一种；
(e)VL FR1，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53或SEQ ID NO：54的任一种；
(f)VL FR2，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的任一种；
(g)VL FR3，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62的任一种；
以及(h)VL FR4，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种抗体，其特征在于：还包括共价或非共价连接的偶联物。
4.根据权利要求3所述的一种抗体，其特征在于：所述偶联物包括酶、荧光蛋白、荧光团、生物素或链霉亲和素。
5.一种抗体，包括：
(a)VH，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种；
以及(b)VL，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76，或对其进行保守修饰的氨基酸序列中的任一种。
6.根据权利要求1-5任一所述的抗体，其特征在于：所述抗体是兔单克隆或多克隆抗体或其片段。
7.根据权利要求1-5任一所述的抗体，其特征在于：所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
8.如权利要求1-5任一所述的抗体在制备检测人PD-L1的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括ELISA试剂盒，所述ELISA
试剂盒可以用于直接ELISA、捕获ELISA和夹心ELISA中的任一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述用于夹心ELISA的试剂盒中包括第一抗体和第二抗体，其中第一抗体捕获人PD-L1的胞外域，第二抗体包括用于检测的偶联物；第一抗体与第二抗体不同；所述第一抗体和第二抗体分别选自3B8、2C5和8C6中的任一种。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113354736A (zh) * 2021-07-05 2021-09-07 艾柏森(江苏)生物科技有限公司 靶向人pd-l1单克隆抗体及其应用
CN114262718A (zh) * 2021-12-28 2022-04-01 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用
CN114920834A (zh) * 2020-08-11 2022-08-19 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1的单克隆抗体及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115819578B (zh) * 2022-10-29 2023-08-18 武汉爱博泰克生物科技有限公司 高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015112805A1 (en) * 2014-01-23 2015-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to pd-l1
WO2016034718A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Medimmune Limited Methods for identifying patients responsive to anti-pd-l1 antibody therapy using markers (cxcl9, krt8.trim29, and ifngamma)
CN107488229A (zh) * 2016-06-13 2017-12-19 臧敬五 Pd‑l1抗体及其用途
CN107922503A (zh) * 2016-03-04 2018-04-17 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl‑1抗体、其药物组合物及其用途
CN108276492A (zh) * 2018-01-31 2018-07-13 中国药科大学 抗pd－l1单克隆抗体及其应用
CN108350082A (zh) * 2016-06-13 2018-07-31 爱迈博 Pd-l1抗体及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015112805A1 (en) * 2014-01-23 2015-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to pd-l1
WO2016034718A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Medimmune Limited Methods for identifying patients responsive to anti-pd-l1 antibody therapy using markers (cxcl9, krt8.trim29, and ifngamma)
CN107922503A (zh) * 2016-03-04 2018-04-17 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl‑1抗体、其药物组合物及其用途
CN107488229A (zh) * 2016-06-13 2017-12-19 臧敬五 Pd‑l1抗体及其用途
CN108350082A (zh) * 2016-06-13 2018-07-31 爱迈博 Pd-l1抗体及其用途
CN108276492A (zh) * 2018-01-31 2018-07-13 中国药科大学 抗pd－l1单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
韩笑等: "PD-1/PD-L1通路及其抗体耐药机制的研究进展", 《临床肿瘤学杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114920834A (zh) * 2020-08-11 2022-08-19 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1的单克隆抗体及其应用
CN113354736A (zh) * 2021-07-05 2021-09-07 艾柏森(江苏)生物科技有限公司 靶向人pd-l1单克隆抗体及其应用
CN113354736B (zh) * 2021-07-05 2022-05-20 艾柏森(江苏)生物科技有限公司 靶向人pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用
CN114262718A (zh) * 2021-12-28 2022-04-01 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用

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