JP6455149B2 - センサーチップの製造方法 - Google Patents
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Description
特に、センサーチップ用の基体(透明支持体)に抗体等のリガンドを固定するために、リガンドの足場として、立体制御された三次元構造を形成するが、この際に有機溶剤を必須とする(例えば、特許文献1参照)。
そこで、有機溶剤の使用量を少なくして材料選択の自由度を向上させるセンサーチップの製造方法として、金属膜上に自己組織化単分子膜(SAM)を形成し、この自己組織化単分子膜(SAM)に対して、ヒドロゲルを固定化することが知られている(例えば、特許文献2参照)。
透明支持体の表面に金属膜を形成する工程と、
下記式(1)で表される水溶性高分子の水溶液で前記透明支持体の金属膜を被覆して前記水溶性高分子を前記金属膜に結合させる工程とを含む、センサーチップの製造方法である。
X−L1−Y−L2・・・(1)
(X:金属に結合できる官能基、L1:ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、L2:水溶性高分子、Y:水溶性高分子L2との結合点)。
本発明に係るセンサーチップの製造方法は、透明支持体2の表面に金属膜3を形成する工程と、下記式(1)で表される糖鎖化合物の水溶液で前記透明支持体2の金属膜3を被覆して前記糖鎖化合物を前記金属膜3に結合させる工程とを含む(図1(A)〜(C)参照)。
X−L1−Y−L2・・・(1)
(X:金属膜3に結合できる官能基、L1:ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、L2:多糖類(水溶性高分子)、Y:多糖類L2との結合点、)。
ここで、前記水溶性高分子化合物を金属膜に結合させる工程の前に、分子量分画を経る前記水溶性高分子化合物の調製工程を含むことが望ましい。
また、前記蛍光測定がSPFSによる免疫蛍光測定であり、前記透明支持体は、SPFSによる免疫蛍光測定で用いられる蛍光標識物質を励起させる光を生成するためのプリズムであることが望ましい。さらに、前記透明支持体がアクリル樹脂製であることが望ましい。
前記結合点(Y)における化学結合は、−CO−HN−、又は、C−N−Cであることが望ましく、前記水溶性高分子L2は多糖類であることが望ましい。
また、前記炭化水素鎖L1と前記多糖類L2との結合点Yの化学結合は前記多糖類L2の還元末端由来であることが望ましい。前記多糖類L2の重量平均分子量が1000〜5000000であることが望ましい。また、前記多糖類L2がカルボキシメチルデキストランであることが望ましい。前記炭化水素鎖L1は、炭素数2〜10の直鎖状又は分岐鎖を有するアルキル鎖またはアルキレン鎖であることが望ましい。
前記官能基(X)は、チオール基(−SH)、テルル基(−TeH)、セレノール基(−SeH)、対称又は非対称ジセレニド基(−SeSe−)、対称又は非対称ジスルフィド基(−SS−)、チオイソシアニド基(−SCN)、イソニトリル基(−NC)、3価リン酸基(−PO4 2-)、ジスルフィド基(−SSRZ)、スルフィド基(−SRZ)、ジセレニド基(−SeSeRY)、セレニド基(−SeRZ)、キサンテート基(−OCSS−)、ニトロ基(−NO2)、チオカルバメート基(−SCH)、ホスフィン基(−PR2)、チオ酸基又はジチオ酸基(−COSH、−CSSH)、カルボン酸(−CООH)およびシラン基(−SiH3)からなる群から選択される一つ又はそれ以上である、ことが望ましい。
本発明に係るセンサーチップの製造方法は、上述したように、透明支持体2の表面に金属膜3を形成する工程を含む(図1(A)参照)。この金属膜3は、例えば後述するSPFS装置の光源から透明支持体2を介して照射された光を受けて表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させるものであり、SPFS等による蛍光測定法に用いられる蛍光標識色素の発光をもたらす役割を有する(図3参照)。
透明支持体2はセンサーチップ1の構造を支持するために用いられる。透明支持体2は、図3に示すように、金属膜3形成用の平面部4と、プリズム部5等とを有している。この平面部4とプリズム部5とは別体であっても一体であってもよい。
透明支持体2の平面部4の法線方向に沿ったプリズム部5の断面の形状として、三角形(図3参照)、半円形状、楕円形状とすることができる。プリズム部5は、SPFS装置の光源7からの励起光をプリズム部5の内部に入射させる入射面5aと、透明支持体2の平面部4上の金属膜3の裏面で反射した前記励起光をプリズム部5の外部に出射する出射面5bとを有する(図3参照)。
金属膜3は、全反射条件でプリズム部5の内部に入射した照射光が金属膜3と平面部4との界面で全反射することにより生じるエバネッセント波(増強電場)を増幅するための部材である。
被覆工程は、下記式(1)で表される糖鎖化合物(下記式(1)参照)の水溶液で前記透明支持体2上の金属膜3を被覆して前記糖鎖化合物を前記金属膜3に結合させる工程である(図1参照)。
X−L1−Y−L2・・・(1)
(X:金属膜3に結合できる官能基、L1:ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、L2:多糖類、Y:多糖類L2との結合点)
式(1)の官能基Xは、金属膜3に結合することができる基を示す。官能基Xとしては、例えば、
・チオール基(−SH)、テルル基(−TeH)、セレノール基(−SeH)、
・対称又は非対称ジセレニド基(−SeSe−)、対称又は非対称ジスルフィド基(−SS−)、
・チオイソシアニド基(−SCN)、イソニトリル基(−NC)、
・3価リン酸基(−PO4 2-)、
・スルフィド基(−SRZ)、ジスルフィド基(−SSRZ)、セレニド基(−SeRZ)、ジセレニド基(−SeSeRY)、
・キサンテート基(−OCSS−)、
・ニトロ基(−NO2)、
・チオカルバメート基(−SCH)、
・ホスフィン基(−PR2)、
・チオ酸基又はジチオ酸基(−COSH、−CSSH)、
・カルボキシル基(−CООH)、
・シラン基(−SiH3)等が好ましく用いられる。
式(1)において、L1は連結基を示し、好ましくは、場合によりヘテロ原子により中断されてもよい炭化水素鎖である。この炭化水素鎖L1は、分岐鎖であっても枝分かれしていない直鎖であってもよく、場合により二重及び又は三重結合を含んでいてもよい。また、カルボキシル基等を含んでいてもよい。
式(1)において、結合点Yは、炭化水素鎖L1と多糖類L2との結合点を示す。炭化水素鎖L1と多糖類L2との結合点Yとしては、特に限定されないが、官能基Xと異なる反応基であることが好ましい。結合点Yの例としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合などの共有結合の他、アビジン−ビオチン相互作用による結合なども用いることができる。
多糖類L2は、後述する一次捕捉分子としてのリガンド6を固定するためのもので、カルボキシル基を有していることが望ましい。
図2に示すように、複数の糖鎖化合物が金属膜3に固定されて多糖類L2同士が隣接することで多糖類L2の層(固相化層)が形成される。この固相化層は、その密度として2ng/mm2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる多糖類L2の種類や分子量、糖鎖の分岐鎖の分岐の程度等に応じて適宜調整することができる。これにより、リガンド6の密度も調整することができる。
以下、糖鎖化合物(X−L1−Y−L2)の製造について具体的に説明する。糖鎖化合物(X−L1−Y−L2)の製造は、還元剤の存在化でアルデヒド基又はケトン基を有する多糖類L2と、官能基Xとアミン基を有するアミンとを反応させることで作成することができる。
官能基Xを有するアミンは、分岐鎖のある又はない、アルキル鎖またはアルキレン鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物であり、例えば、アミノエタンチオール、10−アミノデカンチオール、システイン、ホモシステイン、4,6−ジアミノー2−メルカプトピリミジンなどの化合物を用いることができる。これらの化合物は入手が容易であるが、別途合成によっても得ることができる。
還元的アミノ化とは、アルデヒド(又はケトン)とアミンの脱水縮合により調製したイミンを還元する反応で、このプロセスにより、官能基Xを有するアミンはアルキル化される。
還元剤に2−ピコリンボランを用いる場合、pH緩衝液にはpH4〜7の間にpH緩衝能を有する水性の緩衝液であれば、特に限定されない。酢酸緩衝液の場合、pH3.6〜5.6の間にpH緩衝能を有しているので特に好適である。その他にも、クエン酸緩衝液(緩衝pH=3.0〜6.2)、MES(緩衝pH=5.5〜7.0)、Bis−Tris(緩衝pH=5.5〜7.3)、ADA(緩衝pH=5.8〜7.4)、フタル酸(緩衝pH=4.4〜6.4)、リン酸緩衝液(緩衝pH=5.8〜8.0)、クエン酸‐リン酸緩衝液(緩衝pH=2.6〜7.0)を用いることができる。
糖鎖化合物L2についてゲル濾過等の分子量分画を行うことで金属膜3の表面に固定される糖鎖の丈(金属膜3の表面の法線方向の高さ)が金属膜3の平面方向で一様となり、糖鎖にリガンド6を固定した状態で金属膜3の表面からのリガンド6の存在位置範囲(空間)を一定範囲に限定させることができ、その結果、励起光による蛍光標識物質の励起の程度もリガンド6,・・・間で一様となり、得られる結果の精度を上昇させることができる。
特に多糖類L2がカルボキシメチルデキストラン(CMD)の場合、糖鎖化合物の重量平均分子量が500000のものが特に好ましい。分子量500000のCMDであれば、隣接するCMDが互いにクーロン斥力で好適に反発して凝集しにくく、糖鎖化合物が金属膜3の平面方向で精緻に並びやすくなるからである。
糖鎖化合物を金属膜3へ固定する被覆工程は、以下の方法により行うことができる。
pH4〜10の緩衝液(イオン強度1〜1000mM)に対して、終濃度0.1〜1000mg/mlとなるように糖鎖化合物を溶解する。この水溶液に金属膜の形成工程後の金属膜3を被覆した透明支持体2を浸漬することで作成できる。また、官能基Xを有する他の化合物を同時に添加したり、前後に添加しても良い。
上記緩衝液は、官能基Xの金属膜への固定を妨げないものであれば良い。例えば、PBS、TBS、HEPES、MES、UltraSaline、ベローナル緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を使用することができる。
洗浄工程としては、上記緩衝液と同じ溶媒または緩衝液に、Tween20、TritonX100などの界面活性剤を好ましくは0.00001〜1質量%含有するよう溶解させたもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を10〜500mM含有させたものが望ましい。あるいは、低pHの緩衝液、例えば、10mM Glycine HClでpHが1.5〜4.0のものを洗浄液として用いてもよい。洗浄工程(洗浄液による洗浄時間)は、通常0.5〜180分間、好ましくは5〜60分間である。
「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し(または、認識され)結合し得る「分子」または「分子断片」をいう。リガンド6は、上記固相化層の中および外面に固定化、すなわち固相化層の3次元構造の中に分散して固定化される(図2および図3参照)。
リガンド6の固定化方法としては、金属膜3に固定された糖鎖化合物中に存在する、反応性官能基を有する多糖類L2(CMD等)が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔WSC〕(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩〔EDC〕など)とN−ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、リガンド6が有するアミノ基とを脱水反応させて固定化させる方法や、上記炭化水素鎖L1が有するカルボキシル基を、上述のようにしてリガンド6が有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
検体等がセンサーチップ1に非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンド6を固定化させた後に、センサーチップ1の表面を牛血清アルブミン〔BSA〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
製造したセンサーチップ1の作成後の保存に関しては、速やかに窒素雰囲気等で封入して、必要時に取り出して用いることが好ましい。窒素雰囲気での封入方法としては、水分透過率10-2g/m2・40℃・90%以下の防湿性能を有する防湿フィルム中に好適に保管することができる。
本発明に用いることができるSPFS装置は、その一方の表面に一次抗体を固定化したセンサーチップ1を装填可能な装置であることが好ましい。
送液するためのポンプとしては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ,循環送液には適用できないが送り精度が高く脈動が少ないシリンジポンプ,微量送液には不向きな場合があるが簡易で取り扱い性に優れるがチューブポンプなどが挙げられる。送液手段としては上記のポンプに限定されることなく、目的や用途に応じて種々の手段を適宜選択して用いることができる。
(1)炭化水素鎖L1と多糖類L2の分子とをあらかじめ結合させ、官能基Xを有する糖鎖化合物を形成しておき、この糖鎖化合物を基板等の透明支持体2の金属膜3の表面に対して一段階で結合させるものである。
[作製例1](センサーチップ用の透明支持体の作製)
アクリル樹脂「デルペット 70NH」(旭化成ケミカルズ(株)製)を厚さ1mmに成型加工した透明支持体の片面に、スパッタリング法により金(Au)薄膜(金属膜)を形成し、金薄膜を有するセンサーチップ用の透明支持体を得た。なお、この透明支持体上の金薄膜の厚さは42〜47nmであった。
重量平均分子量500000のカルボキシメチルデキストラン(CMD) 1量部、2−アミノエタンチオール 3量部、2−ピコリンボラン 10量部を用意し、これらを10%酢酸水溶液に添加して95℃で5時間反応させた。この反応後、洗浄を兼ねたゲル濾過(分子量分画)により糖鎖化合物を精製した。
作製例2で得られた糖鎖化合物を、pH7.4のHEPES緩衝生理食塩水[HEPES](イオン強度:10mM)10mLに対して、終濃度10mg/mLとなるように溶解した。この糖鎖化合物の溶液に、作製例1で得られたセンサーチップ用の透明支持体を1時間、25℃で浸漬させた。
作製例1で得られたセンサーチップ用の基板を、1mMに調整した11−アミノ−1−ウンデカンチオールのエタノール溶液10mLに24時間浸漬し、金薄膜の表面にSAMを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
[実施例2]
(アッセイの実施)
実施例1で製造したセンサーチップ(A)を用いて、以下の工程により免疫蛍光測定を実施した。
工程(c)として、工程(c)まで経たセンサチップ(A)の、金薄膜3を形成していない透明支持体2のプリズム部5の入射面5aから、プリズム部5(シグマ光機(株)製)を経由してレーザ光(640nm、40μW)を照射し、励起された蛍光標識物質(図3参照)から発光された蛍光量を、光電子増倍管〔PMT〕を有する光検出手段9で検出し、光検特性演算装置10で光量(シグナル値)を計測し「アッセイシグナル〔S〕」とした。
一方、前記工程(a)〜(c)において、上記工程(a)でAFPを全く含まない(0ng/mL)尿素2M、0.1mlPBS溶液をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイブランク〔N〕」とした。
比較例1で製造したセンサーチップ(B)について、実施例2および参考例1と同様に免疫蛍光測定を行いS/N比を算出した。
その結果、実施例に係るセンサーチップも問題なくSPFS蛍光測定に使用可能であることを確認することができた。また、実施例1に係るセンサーチップの方が、比較例1に係るセンサーチップよりもS/N比が高いものとなった。
2 透明支持体
3 金属膜
4 平面部
5 プリズム部
5a 入射面
5b 出射面
6 リガンド
7 光源
8 受光手段
9 光検出手段
10 光検特性演算装置
L1 炭化水素鎖
L2 多糖類
X 官能基
Y 結合基
Claims (9)
- 蛍光測定法用のセンサーチップの製造方法において、
透明支持体の表面に金属膜を形成する工程と、
下記式(1)で表される水溶性高分子化合物の水溶液で前記透明支持体の金属膜を被覆して前記水溶性高分子化合物を前記金属膜に結合させる工程と、
前記水溶性高分子化合物を金属膜に結合させる工程の前に、分子量分画を経る前記水溶性高分子化合物の調製工程と
を含み、前記水溶性高分子化合物が、還元剤の存在下で、アルデヒド基又はケトン基を有する多糖類L2と、アミノエタンチオール、10−アミノデカンチオール、システイン、ホモシステインまたは4,6−ジアミノ−2−メルカプトピリミジンとを反応させて得られる、センサーチップの製造方法。
X−L1−Y−L2・・・(1)
(X:金属に結合できる官能基、L1:ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、L2:水溶性高分子、Y:水溶性高分子L2との結合点) - 前記蛍光測定がSPFSによる免疫蛍光測定であり、
前記透明支持体は、SPFSによる免疫蛍光測定で用いられる蛍光標識物質を励起させる光を生成するためのプリズムである、請求項1に記載のセンサーチップの製造方法。 - 前記結合点(Y)における化学結合が−CO−HN−、又は、C−N−Cである、請求項1または2に記載のセンサーチップの製造方法。
- 前記炭化水素鎖L1と前記多糖類L2との結合点Yの化学結合が前記多糖類L2の還元末端由来である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のセンサーチップの製造方法。
- 前記多糖類L2の重量平均分子量が1000〜5000000である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のセンサーチップの製造方法。
- 前記多糖類L2がカルボキシメチルデキストランである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のセンサーチップの製造方法。
- 前記炭化水素鎖L1は、炭素数2〜10の直鎖状又は分岐鎖を有するアルキル鎖またはアルキレン鎖である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のセンサーチップの製造方法。
- 前記透明支持体がアクリル樹脂製である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のセンサーチップの製造方法。
- 前記官能基が、チオール基(−SH)、テルル基(−TeH)、セレノール基(−SeH)、対称又は非対称ジセレニド基(−SeSe−)、対称又は非対称ジスルフィド基(−SS−)、チオイソシアニド基(−SCN)、イソニトリル基(−NC)、3価リン酸基(−PO4 2-)、ジスルフィド基(−SSRZ)、スルフィド基(−SRZ)、ジセレニド基(−SeSeRY)、セレニド基(−SeRZ)、キサンテート基(−OCSS−)、ニトロ基(−NO2)、チオカルバメート基(−SCH)、ホスフィン基(−PR2)、チオ酸基又はジチオ酸基(−COSH、−CSSH)、カルボン酸(−CООH)およびシラン基(−SiH3)からなる群から選択される一つ又はそれ以上である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のセンサーチップの製造方法。
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