JP4231888B2 - バイオセンサーの製造方法 - Google Patents
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好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
好ましくは、官能基を有する有機層で被覆した基板表面は、アミノ基を有するアルカンチオールで被覆した基板表面である。
好ましくは、アミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物、又は末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールとヒドラジドまたはジアミンとの反応により得られる化合物のいずれかである。
好ましくは、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比は1/1〜1/1,000,000の範囲である。
好ましくは、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水基を有するアルカンチオールの分子長よりも長い。
好ましくは、反応性基を有する親水性高分子は多糖類である。
好ましくは、スピンコート法またはスプレーコート法により、反応性基を有する親水性高分子を薄膜状態で基板表面に接触させる。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは、表面プラズモン共鳴分析に使用される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
式(1): −SO2CH=CH2
式(2): −SO2CH2CH2X
式(2)中、Xは、式(2)で表される官能基が求核試薬あるいは塩基と反応する際、置換反応あるいは脱離反応によって離脱する基(例えば、−Cl、−OSO2CH3、−OSO2C6H4CH3、−OCOCH3、−OSO3 - 、ピリジニウム等)である。
式(3)
式(5):
式(7): −NHCONHCOCH=CH2
式(8): −NHCONHCOCH2CH2X
式中、Xは式(2)のXと同義である。
式(9): −COX
式中、Xは、式(9)で表される官能基がアミノ基と反応した際に容易に脱離する基(例えば、
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類:アクリルアミド、メタクリルアミド、N−アクリロイルモルホリン、N,N−ジメチルアクリルアミド、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(もしくはその塩)等、
芳香族単量体:スチレン、ビニルトルエン、p−t−ブチルスチレン、p−ビニル安息香酸、ビニルナフタレン等、
その他のビニル単量体:エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、N−ビニルピロリドン、N−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
P−2:M−1/2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体(30/70)
P−3:M−1/2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体(50/50)
P−4:M−1/メチルメタクリレート共重合体(20/80)
P−5:M−2/アクリル酸ソーダ共重合体(30/70)
P−6:M−2/2−ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体(20/80)
P−7:M−3/ブチルアクリレート共重合体(60/40)
P−8:M−4/2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体(30/70)
P−9:M−6/エチルアクリレート共重合体(60/40)
P−10:M−7/N−ビニルピロリドン共重合体(20/80)
P−12:M−10/メタクリル酸ソーダ共重合体(15/85)
P−13:M−10/メチルアクリレート/メチルメタクリレート共重合体(20/40/40)
P−14:M−12/エチルメタクリレート共重合体(33/67)
P−15:M−12/2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体(15/85)
P−16:M−13/メチルメタクリレート共重合体(33/67)
P−17:M−13/2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体(20/80)
P−18:M−13/N−アクリロイルモルホリン共重合体(20/80)
P−19:M−13/メトキシポリエチレングリコール(23量体)モノメタクリレート共重合体(50/50)
P−20:M−18/N,N−ジメチルアクリルアミド共重合体(5/95)
P−22:M−18/スチレン/ブチルアクリレート共重合体(20/30/50)
P−23:M−19/2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体(20/80)
P−24:M−23/メチルアクリレート共重合体(20/80)
P−25:M−24/エチルアクリレート/スチレン共重合体(20/50/30)
P−26:M−26/アクリルアミド共重合体(25/75)
P−27:M−26/N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体(30/70)
ノニオン性基を有するモノマー:2−ヒドロキシエチルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、2−ヒドロキシ−3−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、1,4−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、1−ブテニルアルコール等。
ウムクロリド、 [2−(メタクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド
等、
ル]ホスホリルコリン等。
ノニオン性基を有するモノマー:2−ヒドロキシエチルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、2−ヒドロキシ−3−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、1,4−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、1−ブテニルアルコール等。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはプロテインG、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
られる(例えば特開平6−167443号公報参照)。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
本実施例は、CMD(カルボキシメチルデキストラン)結合表面の作成において、溶液反応とスピンコート薄膜状態の反応の差に関するものである。
センサーチップ上に金膜のみが形成されている表面として、Biacore社センサーチップAuを用いて実験を行った。センサーチップAuを12分間、UVオゾン処理を行った後、8mLのエタノールと2mLの超純水に45μmol の11-Hydroxy-1-undecanethiol(Aldrich社製)と4μmol の16-Mercaptohexadecanoic acid(Aldrich社製)を溶解させた溶液中で40℃1時間反応させ、エタノールで1回、超純水で1回洗浄した。上記基板上にEDC(0.4M) / NHS(0.1M)混合溶液を100 μl滴下し、室温で15 分反応させ活性化した後、超純水で1回洗浄した。上記基板に1,2-ビス(アミノエトキシ)エタンを50 μl滴下し、室温で1 時間反応させた後、超純水で1回洗浄した。
超純水に0.5重量%となるようにCMD(名糖産業製:分子量100万)を溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の2%が活性化される計算量のEDC(0.4M) / NHS(0.1M)混合溶液を加え、室温で5分間攪拌した。
(1)で作成された基板の上に、(2)で作成された活性エステル化されたCMD溶液を200 μl滴下し、室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで1回、超純水で1回洗浄することで、目的の表面を得た。
(1)で作成された基板の上に、(2)で作成された活性エステル化されたCMD溶液を200 μl滴下し、7000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで1回、超純水で1回洗浄することで、目的の表面を得た。
本実施例は、実施例1で得られたセンサーチップに対するタンパク質のプレコンセントレーションに関するものである。タンパク質としては、BSA(Bovine Serum Albumin:SIGMA社製)を用いた。用いたBSAは、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー(Broad pI Kit, pH 3.5-9.3:Amersham Biosciences社製)との比較から、等電点が6.1程度であることを確認した。1mgのBSAを1mlのHBS-EPバッファー(ビアコア社製、0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005%Surfactant P20, 3mM EDTA)に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー(ビアコア社製、pH5.0)を加えることで、0.1mg/mlのBSA溶液(pH5.0, 0.1mg/ml)を調整した。
本実施例は、活性エステル化CMD以外の反応性基を有する親水性高分子を結合させた表面の作成法に関するものである。
実施例1の(1)で作成された基板の上に、10%のP-30溶液を200 μl滴下し、室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで1回、超純水で1回洗浄することで、試料3を得た。
実施例1の(1)で作成された基板の上に、10%のP-30溶液を200 μl滴下し、7000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで1回、超純水で1回洗浄することで、試料4を得た。
本実施例は、実施例3で得られたセンサーチップに対するタンパク質のプレコンセントレーションに関するものである。実施例2と全く同様の操作で、BSAのプレコンセントレーションについて検討した。得られた結果を表2に要約する。
本実施例は、従来法によるCMD結合表面の作成に関するものである。
(1)試料5(比較例)の作成
カルボキシメチルデキストランが結合した表面として、Biacore社センサーチップCM-5
(research grade)を、そのまま試料5として用いた。
(i)OH基を有する基板の作成
センサーチップ上に金膜のみが形成されている表面として、Biacore社センサーチップAuを用いて実験を行った。センサーチップAuを12分間、UVオゾン処理を行った後、5.0mMの16-ヒドロキシヘキサデカンチオール(Frontier Scientific社製)を溶解したエタノール/水(80/20)混合溶液中に浸漬し、40℃の振盪インキュベーターで20分間インキュベートした後、水で5回、50mlのエタノール/水(80/20)で5回、50mlの水で5回洗浄した。
20mlの0.4M水酸化ナトリウム、20mlのジエチレングリコールジメチルエーテル、2.0mlのエピクロロヒドリンの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応後、50mlのエタノールで2回、50mlの水で5回洗浄した。
水40.5ml、デキストラン(T500, Pharmacia)13.5g、1M水酸化ナトリウム4.5mlの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、25℃の振盪インキュベーターで20時間反応後、50mlの50℃の水で15回洗浄した。
ブロモ酢酸3.5g、2M水酸化ナトリウム溶液27gの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、28℃の振盪インキュベーターで16時間反応後、水洗した。再度、ブロモ酢酸溶液による16時間反応、水洗を行い、試料6を得た。
本実施例は、実施例1および5で得られたセンサーチップに対するタンパク質の固定に関するものである。タンパク質としては、CA(Carbonic Anhydrase:SIGMA社製)を用いた。用いたCAは、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー(Broad pI Kit, pH 3.5-9.3:Amersham Biosciences社製)との比較から、等電点が5.8程度であることを確認した。1mgのCAを1mlのHBS-EPバッファー(ビアコア社製、0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005%Surfactant P20, 3mM EDTA)に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー(ビアコア社製、pH5.0)を加えることで、0.1mg/mlのCA溶液(pH5.0, 0.1mg/ml)を調整した。
本実施例は、実施例1および5で得られたセンサーチップに対する、低分子化合物の非特異吸着に関するものである。低分子化合物としては、Cyclin-Dependent KinasesのinhibitorであるCGP74514、および界面活性剤であるTween20を選択し、センサーチップ表面への非特異吸着抑制能について検討した。各試料に、CGP74514(50μM)を2分、その後Tween20(0.005wt%)を2分流した場合に得られたセンサーグラムを図2に示す。
本実施例は、スピンコートするCMD濃度を変化させた場合における、センサーチップの作成に関するものである。
CMD濃度を0.2%に変更した以外は試料3と同様の操作を行うことで、試料7を得た。
CMD濃度を0.1%に変更した以外は試料3と同様の操作を行うことで、試料8を得た。
CMD濃度が0.08%に変更した以外は試料3と同様の操作を行うことで、試料9を得た。
CMD濃度が0.05%に変更した以外は試料3と同様の操作を行うことで、試料10を得た。
CMD濃度が0.02%に変更した以外は試料3と同様の操作を行うことで、試料11を得た。
本実施例は、実施例1、実施例5、実施例7で得られたセンサーチップに対するタンパク質のプレコンセントレーションに関するものである。実施例2と全く同様の操作で、BSAのプレコンセントレーションについて検討した。得られた結果を表3に要約する。
本実施例は、スピンコート時の回転速度を変化させた場合における、センサーチップの作成に関するものである。
スピンコート時の回転数を4000rpmに変更した以外は試料5と同様の操作を行うことで、試料12を得た。
スピンコート時の回転数を1000rpmに変更した以外は試料5と同様の操作を行うことで、試料13を得た。
本実施例は、実施例1、実施例9で得られたセンサーチップに対するタンパク質のプレコンセントレーションに関するものである。実施例2と全く同様の操作で、BSAのプレコンセントレーションについて検討した。得られた結果を表4に要約する。
水溶解性の高いSAM化合物を用いて蛋白を固定できるヒドロゲル膜を作成し、蛋白質の固定量、および非特異吸着性能を評価した。
6-Hydroxy-1-undecanethiol(Aldrich社製)と8-Amino-1-octanethiol, hydrochloride(同仁化学社製)の混合水溶液(6-Hydroxy-1-undecanethiol 4.995mM /8-Amino-1-octanethiol, hydrochloride 0.005mM)を作成した。この溶液をA液と呼ぶ。
0.1重量%のCMD(名糖産業製:分子量100万)溶液4.95mlを溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の2%が活性化される計算量のEDC(1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)(0.4M) / NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)(0.1M)混合溶液50μlを加え、室温で攪拌した。
(1)で作成された基板の上に、(2)で作成された活性エステル化されたCMD溶液を500μl滴下し、1000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで5回、超純水で5回洗浄することで、試料1を得た。
実施例12は、実施例11で得られたセンサー試料に対する蛋白質の固定に関するものである。蛋白質としては、CA(Carbonic Anhydrase:SIGMA社製)を用いた。
実施例13は、実施例11で得られたセンサー試料に対する、低分子化合物の非特異吸着に関するものである。低分子化合物としては、Cyclin-Dependent KinasesのinhibitorであるCGP74514、および界面活性剤であるTween20を選択し、センサー試料表面への非特異吸着抑制能について検討した。
水溶解性の高いSAM化合物を用いて蛋白を固定できるヒドロゲル膜を作成し、蛋白質の固定量、および非特異吸着性能を評価した。
6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride(同仁化学社製)の1mM水溶液を作成した。この溶液をA液と呼ぶ。
1重量%のCMD(名糖産業製:平均分子量100万、糖1ユニット当たりのカルボキシメチル基置換度0.65)溶液10gを調製した後、カルボジイミド誘導体であるEDC(1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)の0.4M水溶液0.5mlと、超純水9.5mlを加え、室温で5分間攪拌した。
(1)で作成された基板の上に、(2)で作成した活性化されたCMD溶液を1ml滴下し、1000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、試料1を得た。
実施例12と同様の方法で、実施例14で得られたセンサー試料を評価した。CA固定量は、6300RUであった。
実施例13と同様の方法で、実施例14で得られたセンサー試料を評価した。非特異吸着量は、CGP74514が2RU、Tween20が4RUであった。
Claims (26)
- 官能基を有する有機層で被覆した基板表面に、該官能基と反応し得る反応性基を複数有する親水性高分子を接触させることによって、上記有機層に上記親水性高分子を結合させる工程を含むバイオセンサーの製造方法において、該反応性基がビニルスルホン基又はその前駆体、ジクロロトリアジン基、アセトアセチル基、又はカルボン酸活性エステル基であり、該反応性基を有する親水性高分子の水溶液を塗布し、水を蒸発させることによって、該反応性基を有する親水性高分子を基板表面に接触させることで結合させることを特徴とするバイオセンサーの製造方法。
- 基板が金属表面または金属膜である、請求項1に記載の方法。
- 金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項1又は2に記載の方法。
- 官能基を有する有機層で被覆した基板表面が、官能基を有するアルカンチオールで被覆した基板表面である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 官能基を有する有機層で被覆した基板表面が、アミノ基を有するアルカンチオールで被覆した基板表面である、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- アルカンチオールのアルキル鎖の長さが炭素数3〜20である、請求項1から5の何れかに記載の方法。
- アミノ基を有するアルカンチオールが、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物、又は末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールとヒドラジドまたはジアミンとの反応により得られる化合物のいずれかである、請求項5又は6に記載の方法。
- 官能基を有する有機層で被覆した基板表面が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆した基板表面である、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項8に記載の方法。
- アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が1/1〜1/1,000,000の範囲である、請求項8又は9に記載の方法。
- アミノ基を有するアルカンチオールの分子長が、親水基を有するアルカンチオールの分子長よりも長い、請求項9又は10に記載の方法。
- 親水性高分子が、カルボキシル基含有ポリマーである、請求項1から11の何れかに記載の方法。
- カルボキシル基含有ポリマーの平均分子量が10000〜2000000である、請求項12に記載の方法。
- 反応性基を有する親水性高分子が多糖類である、請求項1から11の何れかに記載の方法。
- 親水性高分子が、デキストランである、請求項1から11の何れかに記載の方法。
- 親水性高分子が、カルボキシメチルデキストランである、請求項1から11の何れかに記載の方法。
- スピンコート法またはスプレーコート法により、反応性基を有する親水性高分子を薄膜状態で基板表面に接触させる、請求項1から16の何れかに記載の方法。
- スピンコート時の回転数が、500rpm〜10000rpmである、請求項17に記載の方法。
- スピンコート時の親水性高分子の濃度が0.02%以上である、請求項17又は18に記載の方法。
- 請求項1から19の何れかに記載の方法により製造される、バイオセンサー。
- 非電気化学的検出に使用される、請求項20に記載のバイオセンサー。
- 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項20又は21に記載のバイオセンサー。
- 請求項20から22の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
- 生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項20から22の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項24に記載の方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項24又は25に記載の方法。
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