JP2003194821A

JP2003194821A - 水溶性担体−抗体複合体の製造方法および使用方法

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Publication number: JP2003194821A
Application number: JP2001396009A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Abe; 敏明阿部; Norio Shibata; 典緒柴田
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2001-12-27
Publication date: 2003-07-09
Anticipated expiration: 2021-12-27
Also published as: JP4086277B2

Abstract

(57)【要約】【目的】従来の標識抗体の持つ問題点を解決し、抗
体の結合数、標識物質の結合数をコントロールすること
が可能な水溶性担体−抗体複合体の製造方法およびそれ
を用いた免疫測定試薬を提供する。高感度で、しかも安
定性を向上した高品質の水溶性担体−抗体複合体を提供
する。【解決手段】高分子量の水溶性担体として複数の活
性ハロゲン基を導入した多糖類を用い、抗体または抗体
断片とさらに標識物質を結合させることにより、複数の
抗体または抗体断片と複数の標識物質が結合した水溶性
担体−抗体複合体が得られた。水溶性担体−抗体複
合体の免疫測定への使用は、測定感度の上昇、試薬ブラ
ンク値の減少、再現性および安定性の向上や非特異反応
の抑制に効果が大きい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、複数の活性ハロゲ
ン基を導入した水溶性坦体を介して、（１）複数の抗
体（または抗体断片）及び標識酵素を結合させたエンザ
イムイムノアッセイ（ＥＩＡ）に有用な水溶性担体−抗
体複合体、（２）複数の抗体（または抗体断片）を結
合し、さらに結合した抗体（または抗体断片）の芳香環
を介して放射性物質を結合させたラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）に有用な水溶性担体−抗体複合体、（３）
複数の抗体（または抗体断片）を結合させた免疫比濁法
（ＴＩＡ）に有用な水溶性担体−抗体複合体、に関し
それらの製造方法、またそれらを試薬として用いた免疫
学的測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野において、抗原・抗
体反応を利用した免疫学的検査方法は、感度、特異性が
高いことから、特に体液中の微量物質の定量に多用され
てきた。また、これらの免疫学的測定法で、より高感度
に、より精度良く測定するために各種の改良が試みられ
てきた。

【０００３】最近、重合化した抗体や担体上に複数
の抗体や標識物質を結合し、それを用いてＥＩＡやＴＩ
Ａなどの免疫測定を行い、その高感度化を図った特許が
公開されている。例えば特許第2848457号では、抗体の
オリゴマーを用いるサンドイッチイムノアッセイを行っ
ている。分子量200,000、400,000、500,000〜800,000、
800,000以上の反応性を比較すると、オリゴマー化度の
増加によりフック効果が減少し、広い測定範囲が得られ
るとしている。しかし、抗体の架橋は重合度の調製が困
難であり、さらに、抗体重合後に標識するため、高分子
の酵素を標識すると抗体の抗原結合部位（パラトープ）
が隠れるため、キレート剤などの低分子しか標識物質と
して使用できない。特開平 9-54092号ではラジカル重
合可能な重合性基を抗体に導入し、ラジカル重合した重
合化抗体を免疫比濁法に応用している。しかし高分子量
の重合体は得られるものの重合度の調製は困難である。
特許第 2704760号では化学的架橋剤を用いて重合し
たIgGの2〜3量体を用いた免疫比濁法を開示している。
しかしグルタルアルデヒドで架橋しているため重合度の
調整が困難である。ゲルろ過の結果では原料IgGがかな
り残っており、重合度も低いのでそれほど高感度ではな
い。特開2000-193665では、抗体が結合した酵素にさ
らに酵素を結合させてなる酵素抗体結合体を開示してお
り、抗体1分子に酵素が3分子結合している。この例で
は、抗体を重合しておらず酵素の結合数も少なく、高感
度化はそれほど大きくない。これらの例のように酵
素または抗体同士を架橋剤で重合する方法は一般に、重
合度の調製は困難とされている。

【０００４】また、特開2000-88850号では、チオール
基を導入した担体とマレイミド基を導入した酵素を結合
して酵素複合体を作製し、さらに担体に残存するアミノ
基にマレイミド基を導入し、抗体断片を還元して得たチ
オール基（Fab'-SH）と反応させ、酵素抗体複合体を作
製している。しかしこの方法は製造工程が煩雑である。
実施例では、ポリ-L-リジンを担体として使用している
が、その水溶性は低い。さらに、製造の工程が多く、反
応に要するトータル時間はかなり長い。そのため標識酵
素の失活が考えられる。

【０００５】特表平6-509167号ではビニル基を導入
した水溶性担体であるデキストラン及びそれを用いた標
識抗体を記載している。実施例では、デキストランにジ
ビニルスルホンを反応させ、ビニル基を導入し、ビニル
基を介して、抗体と酵素を担体上に結合しているが、ジ
ビニルスルホン基は反応性が低くpHをアルカリにしかつ
高温処理が必要である。製造工程は多くなり、反応時間
も長く作製した酵素担体抗体複合体の品質に問題がある
ものと考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目
的は、これらの問題を解決し、少ない製造工程で短時間
でしかも温和な条件で製造でき、抗体や標識酵素の結合
率が高く、さらに失活の少ない水溶性担体−抗体複合体
を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高品
質な水溶性担体−抗体複合体を得るために水溶性担体と
抗体及び酵素との結合方法について検討し、反応性官能
基即ち活性ハロゲン基導入水溶性担体と抗体及び酵素と
結合する方法で目的を達成することを見出し、本発明の
完成に至ったものである。本発明における水溶性担体−
抗体複合体とは、抗体集合体、標識抗体複合体、酵素抗
体結合体の総称（以下それぞれの名称で略す）である。
即ち、本発明は（1）複数の活性ハロゲン基を導入した
水溶性坦体の活性ハロゲン基と、抗体あるいは抗体断片
上のジスルフィド結合を選択的に還元して得られたチオ
ール基とを、化学結合してなる水溶性の抗体集合体。
（2）複数の活性ハロゲン基を導入した水溶性坦体の活
性ハロゲン基と、抗体あるいは抗体断片上のジスルフィ
ド結合を選択的に還元して得られたチオール基とを、化
学結合して抗体集合体とし、更に、結合した抗体を介し
て標識物質を結合してなる水溶性の標識抗体複合体。
（3）抗体あるいは抗体断片上のジスルフィド結合を選
択的に還元し、得られたチオール基、および酵素に導入
されたチオール基または酵素に既存するチオール基を、
複数の活性ハロゲン基を導入した水溶性坦体のハロゲン
基と化学結合してなる、水溶性の酵素抗体結合体の製造
方法および使用方法に関するものである。

【０００８】本発明でいう水溶性担体とは、カルボキシ
キル基またはアミノ基を導入した多糖類及びポリマーま
たは、ポリアミノ酸などである。多糖類としては、デキ
ストラン、デキストリン、アガロース、ＣＭ−セルロー
ス、可溶性澱粉などが挙げられる。ポリマーとしては、
ポリビニルアルコール、ポリアクリルアルコール、ポリ
エチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリアリルアミ
ンなどが、ポリアミノ酸としては、アルギニン、リジ
ン、グルタミン酸などのホモポリマー、リジンとグリシ
ン、リジンとセリンなどのランダムコポリマーが挙げら
れる。免疫測定の感度を上げるには多数の抗体を担体に
結合させることが望ましい。従って、担体はある程度の
大きさの分子量即ち1,000以上が必要である。担体の溶
解度および粘度、さらに担体に抗体および酵素が結合し
た水溶性担体−抗体複合体の免疫測定における感度など
より、好ましくは50万から300万分子量の担体が適して
いる。ただし上記範囲より大きいあるいは小さい分子量
のものでも本発明の目的を達成されるのであれば使用可
能である。その具体例としてアミノ基を導入したデキス
トランが挙げられる。

【０００９】本発明でいう、活性ハロゲン基を導入した
水溶性坦体とは、カルボキシル基またはアミノ基を導入
した多糖類およびポリマーまたは、ポリアミノ酸などに
活性ハロゲン基を導入する架橋剤を結合することにより
得られる。担体のアミノ基に活性ハロゲン基を導入する
には、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（N-Succ
inimidyl iodoacetate SIA)、Ｎ−スクシンイミジル
４−ヨードアセチルアミノベンゾエート(N-Succinimidy
l[4-iodoacetyl]aminobennzoate SIAB)、スルホスクシ
ンイミジル４−ヨードアセチルアミノベンゾエート（Su
lfosuccinimidyl[4-iodoacetyl]aminobennzoate Sulfo
-SIAB）などを用いる方法が知られている。これらの試
薬とアミノ基を導入した水溶性担体をpH7以上で混合す
ることで活性ハロゲン基を導入した水溶性坦体が得られ
る。また、ヨード酢酸（Iodoacetic acid）、3-ヨード
プロピオン酸（3-Iodopropionic acid）、6-ブロモヘキ
サン酸（6-Bromohexanoic acid）などとアミノ基を導入
した水溶性担体をカルボジイミド反応により活性ハロゲ
ン基を導入することもできる。カルボキシル基を導入し
た水溶性担体とヨード酢酸ヒドラジド（Iodoacetic aci
d hydrazide）、ヨード酢酸エチルアミン（Iodoacetic
acid ethylamine）などとカルボジイミド反応により活
性ハロゲン基を導入することもできる。これらの反応に
より担体１分子あたり数十から数百個の活性ハロゲン基
の導入が可能である。

【００１０】本発明でいう抗体とは、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体および抗体断片が適している。
複数の活性ハロゲン基を導入した水溶性坦体と抗体上の
ジスルフィド基を2-メルカプトエチルアミン、2-メルカ
プトエタノール、ジチオスレイトールなどで還元するこ
とによりチオール化した抗体と反応させることにより抗
体集合体を得る。活性ハロゲン基とチオール基との反
応により安定なチオエーテル結合が形成される。反応は
適当な緩衝液媒体中pH7.5以上好ましくは7.5〜8.5の範
囲内のpH条件で行う。緩衝液はpH7.5以上を維持できし
かも活性ハロゲン基と反応しないものであればよい。ま
たこの反応は４〜３７℃範囲の温度で行うことができ
る。この反応は温和な条件下で進みしかも結合率が高
い。従って、未反応の抗体がほとんど出ず、さらなる精
製工程も必要ない。さらに抗体活性も維持することが可
能である。また、この反応において担体の分子量および
抗体の添加量により抗体集合体の分子量を容易に調整で
きる。即ち、担体に抗体を反応させる際に抗体量を変化
すると、抗体量に比例して抗体集合体の分子量は変化
し、逆に担体の分子量を変化すると、担体の分子量に比
例して抗体集合体の分子量を変化させることが可能であ
る。親和性の弱い抗体の場合、水溶性坦体に結合する抗
体の量を増やすことで抗体集合体の抗原抗体反応性を上
げることが可能であり、また親和性が強い場合は、抗体
量を減らし、酵素を増量し酵素活性を増幅させることが
可能である。ＥＩＡの場合、抗体断片、特にF(ab')2を
用いて、酵素抗体結合体を作製するとブランクが低く、
非特異反応を抑制した測定試薬とすることができる。Ｔ
ＩＡの場合、抗体をそのまま用いて、抗体集合体を作製
した方が高感度である。F(ab')2を用いて抗体集合体を
作製することや、水溶性担体への抗体結合量を調整する
ことで抗原抗体反応性を制御することが可能である。

【００１１】本発明では抗体集合体に酵素を結合させる
ことによりＥＩＡ用の酵素抗体結合体を製造することが
できる。抗体集合体に結合させる酵素はＥＩＡ用の標識
酵素として用いられている酵素であれば特に制限はな
い。具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。酵
素にチオール基を導入するには、N-スクシンイミジル-S
-アセチルチオアセテート、S-アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸Ｎ-ス
クシンイミジル（ＳＰＤＰ）などを用いる方法が知られ
ている。これらの試薬は酵素のアミノ基と反応しブロッ
クされたチオール基が酵素に導入される。その後、前二
試薬を用いた場合にはヒドロキシルアミン、後者（ＳＰ
ＤＰ）を用いた場合にはＤＴＴで処理するすることによ
りチオール基を生成する。本発明の酵素抗体結合体は複
数の活性ハロゲン基を導入した抗体集合体と酵素に導入
されたチオール基またははじめから酵素に存在するチオ
ール基との反応により得ることができる。この反応は温
和な条件下で行われるため酵素活性の失活もない。また
反応は速く結合率が高い。しかも、作製した水溶性担体
−抗体複合体は分解することなく長期保存に耐えうる。
従って、本発明の酵素抗体結合体は従来のマレイミド基
で製造した酵素抗体結合体に比べ安定性において優れて
おりその詳細を実施例で示す。この反応において抗体集
合体の分子量と添加酵素量により酵素抗体結合体の分子
量を容易に調整できる。即ち、酵素抗体結合体の分子量
を調整することによりＥＩＡにおける所望の感度を得る
ことが可能である。

【００１２】本発明でいう標識抗体複合体での標識物質
とは、発色性物質、発蛍光性物質、ルミノール、ルシフ
ェリン等の発光性物質、放射性物質である。その例とし
て、放射性物質¹²⁵Iが挙げられる。抗体集合体に放射性
物質¹²⁵Iで標識するにはＲＩＡで通常用いられているク
ロラミンＴ法により容易に標識できる。抗体集合体の抗
体量により¹²⁵I標識率を容易に調整ができまたＲＩＡ測
定感度の調整も可能である。

【００１３】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００１４】実施例１水溶性坦体（アミノデキスト
ラン）への活性ハロゲン基の導入参考文献1）の方法に
より、デキストランT2000（ファルマシア製）にアミノ
基を導入した。アミノデキストラン6mgを0.1Mリン酸緩
衝液（pH7.2）300μlに溶解し、ジメチルホルムアミド
中に10mg/mlに溶解したN-(スクシンイミジル（4-ヨード
アセチル）アミノベンゾエート（SIAB、PIERCE社製）を
100μl加え、37℃で1時間反応させた。反応後、PD-10
（ファルマシア製）でゲル濾過し、ヨード基導入デキス
トラン部分を回収した。参考文献2)の方法により、ヨー
ド基の導入数を定量した。ヨード基は、デキストラン1
分子に256個導入されていた。

【００１５】実施例２抗体断片F(ab')2の還元による
Fab'-SHの作製モノクローナル抗前立腺特異抗原（PS
A）抗体N23（自家製）IgGを参考文献3）の方法によりペ
プシン消化し、F(ab')2を得た。10mg/mlのF(ab')2 1ml
に0.2Mの2-メルカプトエチルアミン（東京化成社製）10
0μlを添加し、37℃で1.5時間反応させた。反応後、PD-
10（ファルマシア製）でゲル濾過し、Fab'-SH部分を回
収した。

【００１６】実施例３西洋ワサビペルオキシダーゼ
へのSH基の導入 10mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（H
RP Type I-C、東洋紡製)を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）
1mlに溶解し、ジメチルホルムアミド中に10mg/mlに溶解
したN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート（P
IERCE社製）100μlを加えた。30℃で1時間反応させた
後、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩
酸緩衝（pH8.0） 200μl、1Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン
溶液を100μl、0.1Ｍエチレンジアミン四酢酸−0.1Mト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液を50μl順
次添加し、30℃で10分反応させた。反応後、PD-10（フ
ァルマシア製）にてゲルろ過し、ＳＨ基導入HRP部分を
回収した。参考文献4）の方法により、チオール基の導
入数を定量した。チオール基は、ＨＲＰ1分子に2個導入
されていた。

【００１７】実施例４酵素抗体結合体の作製実施例
１で調製した1mgのヨード基導入デキストランを10mMEDT
A-0.1Mホウ酸緩衝液（ｐＨ8.3）500μlに溶解し、実施
例２で調製した0.23mgのモノクローナル抗PSA抗体N23
（自家製）Fab'-SHを添加し、30℃で1時間反応させた。
さらに、実施例３で調製した4mgのチオール基導入HRPを
反応液に添加し、30℃で1時間反応させた。反応液を0.1
Mリン酸緩衝液（pH7.2）を用いて、Superdex 200 HR 10
/30（ファルマシア社製）でゲルろ過すると、ボイドピ
ークの酵素抗体結合体部分と分子量40,000付近に未反応
のHRPのピークが確認された。Fab'-SHは回収されなかっ
た。ボイドピークの酵素抗体結合体を回収し、280nmと4
03nmの吸光度を測定し、Fab'およびHRPの濃度を求め
た。また、参考文献５）のフェノール-硫酸反応により
デキストランを定量した。Fab'はデキストラン1分子あ
たり10個、HRPは134個それぞれ導入されており、平均分
子量は7,820,000であった。

【００１８】実施例５本発明の酵素抗体結合体を用
いたPSAの酵素免疫測定 0.15M NaCl添加20mMリン酸緩衝
液pH7.2(PBS)に、モノクローナル抗PSA抗体P2（自家
製） IgGを1.0μg/mlとなるよう溶解し、市販のELISA
用96穴マイクロタイタープレート(Maxisorp F96、NUNC
社製、商標)の各ウェルに、100μlずつ分注し、37℃で2
時間インキュベートした。各ウェルをPBSで5回洗浄後、
2％BSA（SIGMA社製）を300μl加え、室温で3時間インキ
ュベートし、プレートのブロッキングを行った。各濃度
のPSA（0〜500pg/ml）を各々50μlずつ、ウェルに添加
し、37℃で30分間インキュベーションした。反応終了
後、 PBSで3回洗浄した。次に、実施例4で作製した酵
素抗体結合体を2%BSA添加PBSで希釈しFab'濃度換算で0.
2μg/mlとした。各ウェルに100μlずつ加え、37℃で30
分インキュベーションした。反応終了後、0.01%Tween20
添加PBSで3回洗浄した。次に、発色剤として、o-フェニ
レンジアミン二塩酸塩（和光純薬工業社製）を添加した
0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.5）を100μlずつ加え、37℃
で15分間インキュベーションした。2N-H₂SO₄を100μlず
つ加えることによって反応停止させ、波長492nmにおけ
る吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果
を図1に示した。

【００１９】比較例１従来法によるHRP標識抗体を使
用したPSAの酵素免疫測定法参考文献６)に記載の方法
により、実施例2で作製したモノクローナル抗PSA抗体N2
3（自家製）Fab'-SHを、マレイミド基導入HRPと結合さ
せ、HRP標識抗体を作製した。平均分子量86,000で、Fa
b'とHRPは1：1で結合していた。実施例５の酵素標識抗
体の代わりに従来法による標識抗体を用いること以外は
全く同様の方法で、PSAの測定を行った。結果を図1に示
した。

【００２０】実施例６本発明の酵素抗体結合体を用
いたPSAの化学発光測定モノクローナル抗PSA抗体P2（自
家製） IgGをPBSで希釈して、1.0μg/mlとした抗体溶
液中にポリスチレンビーズ（直径1/4インチ、積水化学
社製）を浸漬し37℃で2時間放置した。PBSで洗浄後、1%B
SA含有PBSに37℃で4時間浸漬して、固相化抗体を得た。
実施例４で作製されたモノクローナル抗PSA抗体N23
（自家製）酵素抗体結合体2.5μg/mlまたは、比較例１
で作製された従来法によるHRP標識抗体2.5μg/mlを用い
て、各濃度のPSA（0〜500pg/ml）を測定した。上記の固
相化抗体（ポリスチレンビーズ）を用い、全自動化学発
光酵素免疫測定装置AL-1000（栄研化学社製）により発
光強度を測定した。プロトコールは、ルミスポット‘栄
研’PSA（栄研化学社製、商標）の取扱い説明書に従っ
た。結果を図2に示した。

【００２１】実施例７抗体と酵素の結合比率を変え
た酵素抗体結合体の作製実施例４の方法において、Fab'
-SHの添加量を0.23mgから0.46mg、1.15mgに増量した以
外は全く同様の方法で酵素抗体結合体を作製した。Fab'
とHRPの結合比率および平均分子量を表1に示した。ま
た、実施例１の方法において、デキストランT2000（フ
ァルマシア製）の代わりにデキストランT500（ファルマ
シア製）を用いた以外は全く同様の方法でヨード基導入
デキストランを作製した。参考文献2）の方法により、
ヨード基の導入数を定量した。ヨード基は、デキストラ
ン1分子に68個導入されていた。実施例４の方法におい
て、ヨード基導入デキストランT2000の代わりに、上記
のヨードド基導入デキストランT500を用いた以外は、全
く同様な方法で酵素抗体結合体を作製した。Fab'とHRP
の結合比率および平均分子量を表1に示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】実施例８酵素の結合量を変えた酵素抗
体結合体の作製とELISAの反応性実施例４の方法にお
いて、チオール基導入HRPの添加量を0.8mgまたは1.6mgに
変えた以外はまったく同様の方法で酵素抗体結合体を作
製した。チオール基導入HRPの添加量が0.8mgの場合、Fa
b'はデキストラン1分子あたり10個、HRPは38個それぞれ
導入されており、平均分子量は3,980,000であった。チ
オール基導入HRPの添加量が1.6mgの場合、Fab'はデキス
トラン1分子あたり10個、HRPは76個それぞれ導入されて
おり、平均分子量は4,500,000であった。この2種類の酵
素抗体結合体を用いて、実施例５に従い酵素免疫測定を
行った。結果を図３に示した。

【００２４】比較例２架橋剤Sulfo-HMCSを用いた、
酵素抗体結合体の作製実施例１の方法においてSIABの
代わりに、N-(8-マレイミドカプリルオキシ)スルホスク
シンイミドナトリウム塩（Sulfo-HMCS、同仁化学社製）
を用いる以外はまったく同様の方法でマレイミド基導入
デキストランを作製した。実施例４の方法において、ヨ
ード基導入デキストランの代わりにマレイミド基導入デ
キストランを用いる以外はまったく同様の方法で酵素抗
体結合体を作製した。

【００２５】比較例３架橋剤SPDPを用いた、酵素抗
体結合体の作製実施例１の方法においてSIABの代わ
りに、N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロ
ピオネート（SPDP、PIERCE社製）を用いる以外はまった
く同様の方法でピリジルジスルフィド基導入デキストラ
ンを作製した。実施例４の方法において、ヨード基導入
デキストランの代わりにピリジルジスルフィド基導入デ
キストランを用いる以外はまったく同様の方法で酵素抗
体結合体を作製した。

【００２６】実施例９酵素抗体結合体の安定性実
施例４で作製した本発明の酵素抗体結合体、比較例１、
２および３で作製した酵素抗体結合体を2%BSA添加PBS
（pH7.2）で希釈しFab'濃度換算で0.2μg/mlとした。各
酵素抗体結合体をプラスチック容器に1mlずつ分注し、4
℃および37℃で1週間保存した。実施例５の方法におい
てPSAの酵素免疫測定を行った。37℃保存における残存
活性を表２に示した。

【００２７】

【表２】

【００２８】実施例１０抗体の還元処理モノクロ
ーナル抗PSA抗体N23（自家製） IgGをPBSで希釈し、10
mg/mlとした。IgG溶液1mlに0.2Mの2-メルカプトエチル
アミン（2-ME、東京化成社製）100μlを添加し、37℃で
1.5時間反応させた。反応後、PD-10（ファルマシア製）
によりゲル濾過を行い、抗体部分を回収した。

【００２９】実施例１１抗体集合体の作製実施例１
で調製した1mgのヨード基導入デキストランを10mM EDT
A-0.1Mホウ酸緩衝液（ｐＨ8.3）500μlに溶解し、実施
例１０で調製した2.3mgのモノクローナル抗PSA抗体N23
（自家製）の2-ME処理した抗体を添加し、30℃で1時間
反応させた。反応液を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）を用
いて、Superdex 200 HR 10/30（ファルマシア社製）で
ゲルろ過すると、ボイドピークの架橋抗体のピークが確
認された。ボイドピークの抗体集合体を回収後、280nm
の吸光度を測定し、IgGの濃度を求めた。また、参考文
献５）のフェノール-硫酸反応によりデキストランを定
量した。IgGはデキストラン1分子あたり29個導入されて
おり、平均分子量は6,350,000であった。

【００３０】実施例１２放射性物質標識抗体複合体
の作製実施例１１で作製した、抗体集合体（1mg/ml）
50μlをガラスチューブに取り、0.5Mリン酸緩衝液（p
H7.4） 20μl、Na¹²⁵I 11.1MBqを加えた。さらに、クロ
ラミンT（1mg/ml）20μlを加え、室温で１分間反応させ
た。重亜硫酸ナトリウム（2.5mg/ml）50μl加えた。Sep
hadex G-50 Fine（ファルマシア社製）でゲル濾過、精
製し¹²⁵I標識抗体複合体を得た。

【００３１】実施例１３放射性物質標識抗体複合体
を用いたラジオイムノアッセイ AbビーズPSA‘栄研’
（栄研化学社製）キットおよびキットの¹²⁵I標識抗体の
代わりに実施例１２で作製された¹²⁵I標識抗体複合体
（トータルカウント26,784cpmに調整した）を用いて各
濃度のPSA（0〜500pg/ml）をキットの取扱説明書に従い
測定した。実施例１２で作製された¹²⁵I標識抗体複合体
はキットの¹²⁵I標識抗体より高感度を示した。

【００３２】実施例１４抗体の還元処理ポリクロ
ーナル抗ヒトIgG抗体 LA-G（自家製） IgGをPBSで希
釈し、10mg/mlとした。IgG溶液1mlに0.2Mの2-メルカプ
トエチルアミン（2-ME、東京化成社製）100μlを添加
し、37℃で1.5時間反応させた。反応後、PD-10（ファル
マシア製）によりゲル濾過を行い、抗体部分を回収し
た。

【００３３】実施例１５抗体集合体の作製実施例１
で調製した1mgのヨード基導入デキストランを10mM EDT
A-0.1Mホウ酸緩衝液（ｐＨ8.3）500μlに溶解し、実施
例14で調製した5.3mgの2-ME処理した抗体を添加し、30
℃で１時間反応させた。反応液を0.1Mリン酸緩衝液（pH
7.2）を用いて、Superdex 200 HR 10/30（ファルマシア
社製）でゲルろ過すると、ボイドピークの抗体集合体の
ピークが確認された。未反応の抗体は回収されなかっ
た。ボイドピークの抗体集合体部分を回収し、280nmの
吸光度を測定しIgGの濃度を求めた。また、参考文献
５）のフェノール-硫酸反応によりデキストランを定量
した。IgGはデキストラン1分子あたり34個導入されてお
り、平均分子量は7,100,000であった。図４にゲルろ過
パターンを示した。

【００３４】比較例４架橋剤ジスクシンイミジルス
ベレート（DSS）を用いた抗体の重合化ポリクローナ
ル抗ヒトIgG抗体 LA-G（自家製） IgG 5mg（自家製）
を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2） 1mlに溶解し、ジメチル
ホルムアミド中に3mg/mlに溶解したDSS（PIERCE社製）
を200μl加え、30℃で１時間反応させた。1M Tris(pH7.
5)100μl添加し反応を停止した。反応液をSuperdex 200
HR 10/30（ファルマシア社製）でゲルろ過するとさま
ざまな分子量を有する重合化抗体と未反応のIgGが回収
された。図５にゲルろ過パターンを示した。

【００３５】実施例１６抗体集合体の免疫比濁法(TI
A) 実施例１５で作製したポリクローナル抗ヒトIgG抗体
の抗体集合体（本発明）を使用して、免疫比濁法により
抗原ヒトIgGとの免疫凝集能を調べた。また、比較とし
て未処理のポリクローナル抗ヒトIgG抗体を使用した免
疫比濁法を行った。第１試薬には2%デキストランT2000
（ファルマシア社製）および2%PEG#6,000（キシダ化学
社製）含有のPBS(ｐH7.2)を用いた。本発明の抗体集合
体および未処理の抗体を2mg/ml にPBSで希釈して第2試
薬とした。測定には7070型日立自動分析装置を使用し、
標準IgG溶液20μlに、第1試薬400μlを加え、37℃、5分
間インキュベートした。ついで、第2試薬を100μl添加
し、37℃、5分間インキュベートした。その後、主波長3
40nm、副波長700nmにおける吸光度変化量を測定した。
結果を図６に示した。

【００３６】参考文献1）「Bioconjugate Technique」
Academic Press発行（1996年）p623 参考文献2）「エ
ンザイムイムノアッセイ生化学実験法11」東京化学
同人発行（1989年）p236 参考文献3）「エンザイムイム
ノアッセイ生化学実験法11」東京化学同人発行（19
89年）p106 参考文献4）「エンザイムイムノアッセイ
生化学実験法11」東京化学同人発行（1989年）p227
参考文献５）「生化学実験講座４糖質の化学（下）
東京化学同人発行（1979年）p370 参考文献６）「エン
ザイムイムノアッセイ生化学実験法11」東京化学同
人発行（1989年）p237

【００３７】

【発明の効果】本発明の水溶性担体-抗体複合体は、EI
Aにおける酵素標識抗体として、RIAの標識抗体として、
免疫比濁法の抗体として用いることにより、感度が高
く、低い抗原濃度範囲で良好な結果を得ることが可能に
なる。温和な条件下で水溶性担体-抗体複合体は製造で
きるので抗体並びに酵素の失活が少なく安定性も良好で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 EIAにおいて従来法より高感度であることを示
す図である。

【図２】化学発光測定において従来法より高感度であ
ることを示す図である。

【図３】 HRP標識抗体の結合比率による反応性を示す図
である。

【図４】抗体集合体のゲルろ過を示す図である。

【図５】架橋剤ジスクシンイミジルスペレートを用い
た重合化抗体のゲル濾過を示す図である。

【図６】 TIAにおいて従来法より高感度であることを示
す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/535 // Ｇ０１Ｎ 33/547 33/547

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体あるいは抗体断片上のジスルフィド
結合を選択的に還元し、得られたチオール基を複数の活
性ハロゲン基を導入した水溶性坦体のハロゲン基と化学
結合してなる水溶性担体−抗体複合体。
【請求項２】請求項１に記載の水溶性担体−抗体複合
体の抗体を介して標識物質を結合してなる水溶性担体−
抗体複合体。
【請求項３】酵素に導入されたチオール基または酵素に
既存するチオール基を介して更に酵素を化学結合してな
る請求項１に記載の水溶性担体−抗体複合体。
【請求項４】水溶性担体が、カルボキシル基またはア
ミノ基を導入した多糖類及びポリマーまたはポリアミノ
酸であることを特徴とする請求項１〜３に記載の水溶性
担体−抗体複合体。
【請求項５】多糖類及びポリマーまたはポリアミノ酸の
平均分子量が1,000以上あることを特徴とする請求項４
に記載の水溶性担体−抗体複合体。
【請求項６】多糖類がデキストランである請求項５に
記載の水溶性担体−抗体複合体。
【請求項７】デキストランの平均分子量が５０万−３
００万であることを特徴とする請求項６に記載の水溶性
担体−抗体複合体。
【請求項８】抗体断片がＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂｃで
あることを特徴とする請求項１に記載の水溶性担体−抗
体複合体。
【請求項９】抗体が、１種類以上のモノクローナル抗
体からなることを特徴とする請求項１に記載の水溶性担
体−抗体複合体。
【請求項１０】抗体が、ポリクローナル抗体であるこ
とを特徴とする請求項１に記載の水溶性担体−抗体複合
体。
【請求項１１】標識物質が発色性物質、発蛍光性物
質、ルミノール、ルシフェリン等の発光性物質、放射性
物質である請求項２項に記載の水溶性担体−抗体複合
体。
【請求項１２】酵素が、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼから選ば
れる少なくとも１つであることを特徴とする請求項３に
記載の水溶性担体−抗体複合体。
【請求項１３】放射性物質が、¹²⁵Iである請求項１２
に記載の水溶性担体−抗体複合体。
【請求項１４】以下の工程を含む水溶性担体−抗体複
合体の製造方法工程１：抗体あるいは抗体断片上のジ
スルフィド結合を選択的に還元し、得られたチオール基
を、複数の活性ハロゲン基を導入した水溶性坦体のハロ
ゲン基と化学結合する。工程２：抗体あるいは抗体断片
上のジスルフィド結合を選択的に還元し、得られたチオ
ール基を、複数の活性ハロゲン基を導入した水溶性坦体
のハロゲン基と化学結合し、更に結合した抗体を介して
標識物質を結合する。工程３：抗体あるいは抗体断片
上のジスルフィド結合を選択的に還元し、得られたチオ
ール基、および酵素に導入されたチオール基または酵素
に既存するチオール基を、複数の活性ハロゲン基を導入
した水溶性坦体のハロゲン基と化学結合する。
【請求項１５】請求項１〜１３のいずれか１項に記載
の水溶性担体−抗体複合体を含有する免疫学的測定用試
薬。
【請求項１６】請求項１〜１３のいずれか１項に記載
の水溶性担体−抗体複合体を使用する免疫学的測定方
法。