JP2007512542A - 複合体、及び検出方法におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
「定量的検出」は、系中のアナライトの量、濃度又は活性を測定する。「定性的検出」という用語はまた、系中のアナライトのおよその量、濃度若しくは活性だけを記録するか又は相対的な量、濃度若しくは活性の指示を与えるためにだけ使用できる半定量的方法を包含する。「定量的検出」は、単純に、アナライト又はその活性がサンプル中に存在するか存在しないかを検出するか、又はサンプル中のアナライトの量、濃度又は活性が一つの特定の閾値又は幾つかの特定の閾値よりも高いか低いかを示すことを意味すると理解すべきである。
増感剤粒子又は化学発光体粒子の製造
増感剤粒子及び化学発光体粒子の製造は、EP 0 515 194、Clin. Chem. (1996) 42: 1518-1526 及び Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 5426-5430に詳細に記載されている。粒子は、例えば、デキストラン被膜を担持し、結合したストレプトアビジンをさらに有することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 5426-5430も参照)。増感剤粒子及び化学発光体粒子の変種の製造を、下記に一例として記載する(さらなる詳細についてはEP 0 515 194の実施例8も参照):
ベンジルアルコール中のクロロフィル−aの溶液(1.0ml;0.6mM)を、105℃に加熱したベンジルアルコール0.8mlに加える。水中のラテックス粒子(175nm、カルボキシルで修飾したラテックス、Bangs Laboratories, Carmel, IN)の懸濁液(10%;1.0ml)を上記ベンジルアルコール溶液に加える。この混合物を105℃で5分間攪拌し、次いで室温に冷却する。エタノール10mlを加え、この混合物を遠心分離する。ペレットを1:1の水−エタノール混合物(10ml)に再懸濁し、この懸濁液を再度遠心分離する。同じ手順を水を用いて繰り返し、次いでペレットを生理食塩水に入れる。
カルボキシルで修飾したラテックス粒子懸濁液(水中の10%懸濁液)20mlを2−エトキシエタノール20mlと混合する。この混合物を90℃に加熱する。2−エトキシエタノール中の10mM ジオキサン、20mM 物質 3−(2−チエノイル)-1,1,1−トリフルオロアセトンとのユーロピウムキレート(Kodak, CAS # 14054-87-6)(EuTTA)及び60mM トリオクチルホスフィンオキシド(TOPO)からなる溶液20mlを上記粒子懸濁液に加える。この混合物を97℃でさらに7分間加熱する。室温に冷却した後、エタノール40mlを加え、この混合物を遠心分離する。次いでペレットを80%エタノールに再懸濁し、遠心分離する。この洗浄工程を10%エタノールを用いて繰り返す。最後に、粒子を生理食塩水に入れる。
万能試薬の製造
ストレプトアビジンを含有する化学発光体粒子(=受容体粒子):
受容体粒子 20mgを、ストレプトアビジン(Gerbu から、高純度、#3058)2.0mg及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム(Sigmaから、S 8628)0.2mgと、カップリング緩衝液(0.05 M β−モルホリノ−エタンスルホン酸;Serva から、Art. 29834)中で一緒に混合し、この混合物を+37℃で 24時間インキュベートした。インキュベーション中のカップリング条件は:粒子 50mg/カップリング液ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム 0.5mg/カップリング液ml、ストレプトアビジン2mg/粒子 20mgであった。
インキュベーションの後、カルボキシメトキシルアミン半塩酸塩(Aldrich から、98%濃度、Cat. No. C1,340-8)の 0.48 M 溶液 65.6μl を加えて混合し、この混合物を+37℃でさらに2時間インキュベートした。
上澄み液を遠心分離により分離し、粒子をカップリング緩衝液(0.6 M NaCl を含有する、Merck から)に再懸濁した。その後に、上澄み液を遠心分離により再度分離し、粒子を取り出し、貯蔵緩衝液(0.1 M tris-HCl、0.3 M NaCl、25mM EDTA、0.1% BSA、0.1%
デキストラン T-500、0.1% 両性洗浄剤 3-14、0.01% ゲンタマイシン、15 ppm の ProClin-300、pH 8.0)に再懸濁した。
増感剤粒子を、「ストレプトアビジンを含有する化学発光体粒子(=受容体粒子)」のカップリングと同様にしてカップリングさせた。
増感剤粒子 15mgを、抗ジゴキシゲニン抗体(Mab DIG 2H6、Dade Behring Inc. から)3mg 及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム(Sigma から、S 8628)0.15mgと、カップリング緩衝液(0.05 M β−モルホリノエタンスルホン酸;Serva から、Art. 29834)中で一緒に混合し、この混合物を+37℃で 24時間インキュベートした。インキュベーション中のカップリング条件は:粒子 32.8mg/カップリング液ml、抗体 6.6mg/カップリング液ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム 0.33mg/カップリング液ml、抗体3mg/粒子 15mgであった。
インキュベーションの後、カルボキシメトキシルアミン半塩酸塩(Aldrich から、98%濃度、Cat. No. C1,340-8)の0.48M 溶液 49.2μlを加えて混合し、この混合物を+37℃でさらに2時間インキュベートした。
上澄み液を遠心分離により分離し、粒子をカップリング緩衝液(0.6 M NaCl を含有する、Merck から)に再懸濁した。その後に、上澄み液を遠心分離により再度分離し、粒子を取り出し、貯蔵緩衝液(0.1 M tris-HCl、0.3 M NaCl、25mM EDTA、0.1% BSA、0.1%
デキストラン T-500、0.1% 両性洗浄剤 3-14、0.01% ゲンタマイシン、15ppm の ProClin-300、pH 8.0)に再懸濁した。
受容体粒子を、「抗ジゴキシゲニンを含有する増感剤粒子」のカップリングと同様にして、ジゴキシゲニン対して又はトロポニンに対して誘導した抗体にカップリングさせた。
下記に実施例において、万能試薬A(ストレプトアビジンを含有する受容体粒子)を万能試薬B(抗ジゴキシゲニンを含有する増感剤粒子)と組み合わせて用いるか、又は万能試薬A(抗ジゴキシゲニンを含有する受容体粒子)を万能試薬B(ストレプトアビジンを含有する増感剤粒子)と組み合わせて用いる。
PSA特異的試薬の製造
複合体C1(ビオチニル化抗PSA抗体):
DMSO(RdH から、34943)に溶解したビオチン−LC−NHS(Pierce から、Art. 21336、免疫学的に純粋)0.23mgを、抗PSA抗体(MAK <PSA> 92-284/03、Dade Behring Marburg HmbH から、0.1 M 炭酸ナトリウム(RdH から、31432)中)2.3mgに加えて混合し、この混合物を+4℃で 16 時間インキュベートした。採用したモル比 [Ab]:[ビオチン−LC−NHS]= 1:35 。
この複合体を、リン酸塩緩衝液(0.15 M 塩化ナトリウムを含有する0.05 M リン二酸水素ナトリウム、pH 7.5)を用い、PD-10 Sephadex G-25M(Pharmacia Biotech から、Code 17-0851-01)のカラムに通して精製した。
抗PSA抗体(MAK <PSA> 92-283/029 Dade Behring Marburg HmbH)を、DIG−抗体標識キット(Behringer Mannheim Biochemica から、Order No. 1367200、実施:タンパク質を DIG-NHS 1. モノクローナル抗体で標識する)の使用上の指示/注意に従ってジゴキシゲニンで標識した。
Ttris 0.1mol/l + NaCl 0.3mol/l + EDTA 25mmol/l + 0.1% RSA + 0.1% デキストラン T-500 + 0.1% 両性洗浄剤 3-14 + 0.01% ゲンタマイシン + ProClin-300 15 ppm、pH 8.00 。
試験を行うために、下記のように成分を混合してインキュベートした:
10μlのサンプル
75μlのアッセイ緩衝液
25μlの複合体C1(ビオチニル化抗PSA抗体)及び複合体C2(ジゴキシゲニン化抗PSA抗体)、それぞれの場合 0.96μg/ml
371秒間の+37℃でのインキュベーション
100μlのアッセイ緩衝液
20μlの抗ジゴキシゲニン含有増感剤粒子(0.2mg/ml)
20μlのストレプトアビジン含有受容体粒子(0.2mg/ml)
762.5秒間の+37℃でのインキュベーション
試験を行い、改良 Tecan Sample Processor により測定し、Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526, 1996, EP 0515194 A2)参照、シグナルを記録した。
抗体当たりのビオチンラベルの数の変化
実施例3に記載したビオチニル化方法により、抗PSA抗体(Mab <PSA> 92-284/03、Dade Behring Marburg HmbH)を変化する量のビオチン分子に複合させ、そして抗PSA抗体(Mab <PSA> 92-283/09、Dade Behring Marburg HmbH)を変化する量のジゴキシゲニン分子に複合させた。抗体ペアを用いて得られた結果を下記の表に示す。
デキストラン−抗体−ビオチン複合体の製造
N−スクシンイミジル S−アセチルチオアセテート(SATA)による抗体の活性化
0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液(Riedel de Haen から、31432)中の抗PSA抗体(Mab <PSA> 92-284/03、Dade Behring Marburg HmbH)10.4mgを、混合緩衝液(LiBO3/20% ジオキサン)、pH 8.5 中で再緩衝し、DMF(2mg/ml)中の SATA(Pierce から)104μlと混合する。この混合物を 37℃で 1.5 時間インキュベートした後、NH2OH 200μl と共に 45 分間インキュベートする。
次いで複合体を、0.1 M リン酸塩緩衝液、pH 6.0 を用い、PD-10 カラムに通して脱塩する。
FlukaBioDex(70000 kDa、製品番号 14402、ビオチン置換 20mol/mol)3.9mg(1.95ml)を混合緩衝液(2mg/ml)に入れ、ジオキサン(6mg/ml)中の GMBS 溶液(N−マレインイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Pierce から)26μl と混合する。この混合物を 18℃で1時間インキュベートする。次いで複合体を、0.1 M リン酸塩緩衝液、pH 6.0 を用い、PD-10 カラムに通して脱塩する。
複合体1:
抗体−SATA 溶液(1mg/ml)1.7mlを、FlukaBioDex−GMBS 溶液(1.32mg/ml)509μlと混合する。この混合物を 37℃で2時間インキュベートし、次いでn−エチルマレインイミドの 0.1 M 溶液 220μl で停止する。精製/脱塩を、0.1 M TRIS/HCl、150mM NaCl、pH 7.4 を用い、Sephacryl S300(直径 1.6 cm、ゲル床高さ 90 cm、負荷量約2ml)に通して行う。複合体を含有する分画をプールし、1.7ml(約 0.65mg/ml)まで濃縮した。
抗体−SATA 溶液(1mg/ml)1.7mlを、FlukaBioDex−GMBS 溶液(1.32mg/ml)102μlと混合する。この混合物を 37℃で2時間インキュベートし、次いでn−エチルマレインイミドの 0.1 M 溶液 180μl で停止する。精製/脱塩を、0.1 M TRIS/HCl、150mM NaCl、pH 7.4 を用い、Sephacryl S300(直径 1.6 cm、ゲル床高さ 90 cm、負荷量約 2ml)に通して行う。複合体を含有する分画をプールし、1.7ml(約 0.64mg/ml)まで濃縮した。
風疹IgMアッセイ
風疹IgM特異的試薬の製造
複合体C1(ビオチニル化抗ヒトIgM抗体):
ヤギ抗ヒトIgM抗体(Pab <h-IgM> 62FX022, Dade Behring Marburg HmbH)を抗PSA抗体のビオチニル化と同様にしてビオチニル化した(実施例3参照)。
抗風疹抗体(Mab <rubella> 93-9/08, Dade Behring Marburg HmbH)を、DIG-抗体標識キット(Behringer Mannheim Biochemica から、Order No. 1367200、実施:DIG-NHS 1. モノクローナル抗体を用いてタンパク質を標識する)の使用上の指示/注意に従ってジゴキシゲニンで標識した。
tris 0.1mol/l + NaCl 0.3mol/l + EDTA 25mmol/l + 0.1% RSA + 0.1% デキストラン T-500 + 0.1% 両性洗浄剤 3-14 + 0.01% ゲンタマイシン + ProClin-300 15 ppm、pH 7.3 。
Dade Behring Marburg HmbH からのリウマチ因子(RF)吸着剤、製品番号 OUCG 。
Intergen から、CDP (lot 8320)
風疹IgMアッセイの実施
試験を行うために、下記のように成分を混合してインキュベートした:
10μlのサンプル、RF吸着剤中に1+9部に希釈
40μlのアッセイ緩衝液
25μlの複合体C1(ビオチニル化抗ヒトIgM抗体、8μg/ml)及び複合体C2(ジゴキシゲニン化抗風疹抗体、2μg/ml)
25μlの風疹抗原(4μg/ml)
453.5 秒間の+37℃でのインキュベーション
75μlのアッセイ緩衝液
25μlの抗ジゴキシゲニン含有受容体粒子(0.05mg/ml)
50μlのストレプトアビジン含有増感剤粒子(0.4mg/ml)
432.5 秒間の+37℃でのインキュベーション
試験を行い、改良 Tecan Sample Processor により測定し、Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526, 1996, EP 0515 194 A2)参照、シグナルを記録した。
ビオチン標準複合体をビオチニル化担体分子−Fab’複合体と比較するためのトロポニンアッセイの使用
ビオチニル化担体分子−Fab’複合体(「M−IgG−ビオチン抗トロポニン複合体」)の製造
0.1 M リン酸塩緩衝液(5mM EDTA、pH 7.0)中のネズミIgG抗体(「M−IgG」)の溶液(15.0ml、M-IgG 2.6mg/ml、0.26mmol)を、スルホスクシンイミジル (4−ヨードアセチル)アミノ−ベンゾエートの水溶液(0.66ml、2.0mg/ml)と混合する。25℃で1時間の反応時間の後、この混合物をゲル濾過カラム(AcA22, Ciphergen, Fermont, CA)を用いて濃縮し、精製する。単量体の活性化M−IgG(HPLCで試験)を含有する分画をプールする。
当たり 50μl)を加える。室温で1時間の後、この溶液をゲル濾過カラム(AcA22, Ciphergen, Fermont, CA)を用いて 10mM リン酸塩緩衝液(300mM NaCl、pH 7.0)中で濃縮し、精製する。タンパク質分画をプールする。
10mM リン酸塩緩衝液(300mM NaCl、pH 7.0)中の抗トロポニン抗体のFab’断片の溶液(5mg/タンパク質溶液ml 2ml)を、Pierce Chemical Company, Rockford, III からのPEO−ヨードアセチルビオチン溶液(10mg/ml;DMF中4mmol)0.22mlと混合する。室温で4時間の反応時間後、この混合物を pH 7.0 リン酸塩緩衝液に対して透析する。タンパク質濃度を、Pierce Chemical Company により供給されたBCAタンパク質アッセイを用いて決定する。
A)試験の実施
試験を行うために、下記のように成分を混合してインキュベートした:
20μlのサンプル
10μlの水
15μlの複合体(標準ビオチン抗トロポニン複合体:12.5μg/ml 又はM−IgG−ビオチン抗トロポニン複合体:8μg/ml)
13μlの抗トロポニン含有受容体粒子(210μg/ml)
435 秒間の+37℃でのインキュベーション
13μlのストレプトアビジン含有増感剤粒子(1.5mg/ml)
10μlの水
87 秒間の+37℃でのインキュベーション
169μlの水
試験を行い、改良 Tecan Sample Processor により測定し、Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526, 1996, EP 0515194 A2)参照、シグナルを記録した。
Claims (24)
- 1個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに会合している担体分子からなる複合体であって、この複合体が特異的結合パートナーX又はYのための追加の結合部位を有する、上記複合体。
- 担体分子が、デキストラン、シクロデキストリン又はデンドリマー又は一緒に共有結合している抗体、アルブミン分子、酵素又はそれらの混合物からなる、請求項1に記載の複合体。
- 追加の結合部位が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール又は一本鎖核酸鎖である、請求項1又は2に記載の複合体。
- 担体分子が、1個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに一緒に共有結合している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の複合体。
- 特異的結合パートナーX又はYのための少なくとも2個、好ましくは5個より多い、特に好ましくは10個より多い、更に特に好ましくは15個より多い、最適には18個より多い追加の結合部位を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の複合体。
- 担体分子が、一緒に共有結合している抗体、好ましくはマウス又はヤギIgG抗体からなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の複合体が、微粒子に結合した特異的結合パートナーX又はYによって結合されている微粒子、特にラテックス粒子。
- シグナル生成系の成分として、光増感剤又は化学発光物質に会合している、請求項7に記載の微粒子。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の1個若しくはそれ以上の複合体及び/又は請求項7又は8に記載の微粒子を含む試薬。
- 請求項9に記載の試薬を含有する試験キット。
- サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的の均一系又は不均一系結合試験における、請求項1〜6のいずれか1項に記載の複合体、請求項7又は8に記載の微粒子又は請求項7に記載の試薬の使用。
- シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーXのための特異的結合部位を有する請求項1〜6のいずれか1項に記載の複合体を、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で使用する結合試験。
- シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーYのための結合部位を有する請求項1〜6のいずれか1項に記載のもう一つの他の複合体を、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的でさらに使用する、請求項12に記載の結合試験。
- 特異的結合パートナーXのための結合部位の数が、少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、特に好ましくは少なくとも10個、更に特に好ましくは少なくとも15個である、請求項12又は13に記載の結合試験。
- 特異的結合パートナーYのための結合部位の数が、少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、特に好ましくは少なくとも10個、更に特に好ましくは少なくとも15個である、請求項12又は13に記載の結合試験。
- X又はYが、同一の特異的結合パートナー又は異なる特異的結合パートナーである、請求項12〜15のいずれか1項に記載の結合試験。
- Xが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素に特異的に結合できる抗体である、請求項12〜16のいずれか1項に記載の結合試験。
- Yが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素に特異的に結合できる抗体である、請求項12〜16のいずれか1項に記載の結合試験。
- シグナル生成系の成分が、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔てられ、この隔たりが、これらの成分間の相互作用、特にエネルギー移動を可能にし、そしてこの相互作用の大きさを測定する、請求項12〜18のいずれか1項に記載の結合試験。
- シグナル生成系の成分が、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔られ、この隔たりが、これらの成分間の相互作用を可能にしないか又は極めて僅かな相互作用だけを可能にし、特にエネルギー移動を全く可能にしないか又は極めて僅かなエネルギー移動だけを可能にし、そしてこの相互作用の残留した大きさを測定する、請求項12〜18のいずれか1項に記載の結合試験。
- シグナル生成系の成分が、微粒子、好ましくはラテックス粒子である、請求項12〜20のいずれか1項に記載の結合試験。
- シグナル生成系の成分が、微粒子に会合した光増感剤及び微粒子に会合した化学発光物質である、請求項12〜21のいずれか1項に記載の結合試験。
- 試験がイムノアッセイである、請求項12〜22のいずれか1項に記載の結合試験。
- 試験が均一系結合試験である、請求項12〜23のいずれか1項に記載の結合試験。
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