JPH07239331A - ハプテンの濃度を測定する方法 - Google Patents
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 イムノメトリック法における反応速度の遅
さ、“高濃度域のフック現象"、および固定化する工程
のバッチ間のバラツキの問題を解消する。 【構成】 液体試料中のハプテンの濃度を測定する方法
であって、（ａ）液相反応において、上記ハプテンに特
異的な複数の抗-ハプテンとの化学的結合が可能で、か
つ液相中に溶解されるマトリックスに、リガンドが結合
されたものに、上記抗-ハプテンを介して、上記ハプテ
ンが結合されてなる可溶性複合体を形成すること；
（ｂ）抗-リガンドを介して、上記可溶性複合体のリガ
ンドに結合された固体支持体と、上記ハプテンに結合し
た標識とを含む不溶化複合体を形成すること；（ｃ）上
記不溶化複合体を洗浄すること；（ｄ）上記サンプル中
の前記ハプテン）の濃度の表示である標識の存在を知る
ために、上記洗浄された不溶化複合体を観測することを
順に含む方法。
さ、“高濃度域のフック現象"、および固定化する工程
のバッチ間のバラツキの問題を解消する。 【構成】 液体試料中のハプテンの濃度を測定する方法
であって、（ａ）液相反応において、上記ハプテンに特
異的な複数の抗-ハプテンとの化学的結合が可能で、か
つ液相中に溶解されるマトリックスに、リガンドが結合
されたものに、上記抗-ハプテンを介して、上記ハプテ
ンが結合されてなる可溶性複合体を形成すること；
（ｂ）抗-リガンドを介して、上記可溶性複合体のリガ
ンドに結合された固体支持体と、上記ハプテンに結合し
た標識とを含む不溶化複合体を形成すること；（ｃ）上
記不溶化複合体を洗浄すること；（ｄ）上記サンプル中
の前記ハプテン）の濃度の表示である標識の存在を知る
ために、上記洗浄された不溶化複合体を観測することを
順に含む方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生体液中を循環するハプ
テンの濃度を測定する方法に関する。
テンの濃度を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】液相および固相免疫測定方法並びにこれ
らの変形および変法は、循環する抗原および抗体のホス
トの測定についての文献において記載されてきた。１つ
またはそれ以上の免疫測定方法技術に関し、米国または
その他の国において数々の特許が出されている。抗原お
よびハプテンの測定においては、拮抗的な二抗体放射性
免疫測定法が実質的に重要な役割を果している。この方
法は感度も再現性も良いが、抗原と結合した抗体から結
合しなかった抗原またはハプテンを分離するために遠心
操作が必要である。この方法は、一次の液相動力学を用
いるが、ポリエチレングリコ―ルを触媒とする第二抗体
に依拠する。そこで、この方法においてはいくつかの欠
点が必然的となる。即ち(a)同位体標識のために高度に
精製された抗原またはハプテンがどうしても必要であ
り、また(b) トレ―サの不純物と不安定性および／また
はポリエチレングリコ―ル−第二抗体の分離に一部依拠
して極めて非特異性のある結合が起る。
らの変形および変法は、循環する抗原および抗体のホス
トの測定についての文献において記載されてきた。１つ
またはそれ以上の免疫測定方法技術に関し、米国または
その他の国において数々の特許が出されている。抗原お
よびハプテンの測定においては、拮抗的な二抗体放射性
免疫測定法が実質的に重要な役割を果している。この方
法は感度も再現性も良いが、抗原と結合した抗体から結
合しなかった抗原またはハプテンを分離するために遠心
操作が必要である。この方法は、一次の液相動力学を用
いるが、ポリエチレングリコ―ルを触媒とする第二抗体
に依拠する。そこで、この方法においてはいくつかの欠
点が必然的となる。即ち(a)同位体標識のために高度に
精製された抗原またはハプテンがどうしても必要であ
り、また(b) トレ―サの不純物と不安定性および／また
はポリエチレングリコ―ル−第二抗体の分離に一部依拠
して極めて非特異性のある結合が起る。
【０００３】拮抗的な二抗体酵素免疫測定方法は、前記
方法に比べはるかに小規模で使用されている。抗原また
はハプテンの酵素標識は、それらの同位体標識に比べて
はるかに安定であるけれども、かかる測定方法において
は、非特異的な結合が生じて何度も洗浄する必要があ
り、そのために、感度および再現性を落す結果となって
いる。
方法に比べはるかに小規模で使用されている。抗原また
はハプテンの酵素標識は、それらの同位体標識に比べて
はるかに安定であるけれども、かかる測定方法において
は、非特異的な結合が生じて何度も洗浄する必要があ
り、そのために、感度および再現性を落す結果となって
いる。
【０００４】前記の二重抗体拮抗型の測定方法において
は、蛍光物質または化学発光物質標識を用いた場合で
も、非特異的な結合や感度の低さ、再現性といった固有
の問題を十分に解決することができない。米国特許第3,
817,837号に記載されている均一系の酵素免疫測定方法
は、拮抗的な二抗体放射免疫測定に対する上述した非特
異的な結合問題を部分的には解決した。しかしながら、
前記米国特許第3,817,837号の方法は、体液中にかなり
高濃度で存在する低分子量のハプテン(不完全抗原)に限
られている。
は、蛍光物質または化学発光物質標識を用いた場合で
も、非特異的な結合や感度の低さ、再現性といった固有
の問題を十分に解決することができない。米国特許第3,
817,837号に記載されている均一系の酵素免疫測定方法
は、拮抗的な二抗体放射免疫測定に対する上述した非特
異的な結合問題を部分的には解決した。しかしながら、
前記米国特許第3,817,837号の方法は、体液中にかなり
高濃度で存在する低分子量のハプテン(不完全抗原)に限
られている。
【０００５】米国特許第4,420,568号に記載された蛍光
偏光拮抗免疫測定方法は、米国特許第3,817,837号に記
載された感度問題の大部分を解決することに成功した。
しかしながら、その応用は低分子量の分子に限られてい
る。以来、他の拮抗的な蛍光免疫測定方法が高分子量の
抗原に対し報告されているが、蛍光偏光法と同様、実施
のために特殊な装置が必要である。
偏光拮抗免疫測定方法は、米国特許第3,817,837号に記
載された感度問題の大部分を解決することに成功した。
しかしながら、その応用は低分子量の分子に限られてい
る。以来、他の拮抗的な蛍光免疫測定方法が高分子量の
抗原に対し報告されているが、蛍光偏光法と同様、実施
のために特殊な装置が必要である。
【０００６】拮抗的な固体相免疫測定方法は、この過去
１０年で使用されるようになり、低分子量のハプテンと
分子量30,000(ドルトン)以下のいくつかの高分子量の抗
原に対して拮抗的な二抗体法に次第にとってかわってい
る。このような同位体を用いた拮抗的な固体相免疫測定
方法は、液相免疫測定方法にともなう非特異結合の問題
を実質上なくしたが、固体支持体上の立体障害に一部依
拠する高分子量の抗原に対しては応用することができな
い。
１０年で使用されるようになり、低分子量のハプテンと
分子量30,000(ドルトン)以下のいくつかの高分子量の抗
原に対して拮抗的な二抗体法に次第にとってかわってい
る。このような同位体を用いた拮抗的な固体相免疫測定
方法は、液相免疫測定方法にともなう非特異結合の問題
を実質上なくしたが、固体支持体上の立体障害に一部依
拠する高分子量の抗原に対しては応用することができな
い。
【０００７】固体相非同位体拮抗免疫測定方法は、同様
な固体支持体上の立体障害の問題があり、酵素標識の場
合には、標識それ自体の大きさが立体的な問題に加わ
る。本発明は、拮抗的な固体相免疫測定方法に固有な固
相支持体の立体障害問題を解決しようとするものであ
る。高分子量で多価の抗原および抗体を測定するため
に、固体相免疫学的放射能および非放射能測定方法が十
分に開発されてきた。いくつかの方法が報告されてお
り、最近、米国およびその他の国の特許のいくつかにお
いてかかる分析技術の種々の態様が記載されている。
な固体支持体上の立体障害の問題があり、酵素標識の場
合には、標識それ自体の大きさが立体的な問題に加わ
る。本発明は、拮抗的な固体相免疫測定方法に固有な固
相支持体の立体障害問題を解決しようとするものであ
る。高分子量で多価の抗原および抗体を測定するため
に、固体相免疫学的放射能および非放射能測定方法が十
分に開発されてきた。いくつかの方法が報告されてお
り、最近、米国およびその他の国の特許のいくつかにお
いてかかる分析技術の種々の態様が記載されている。
【０００８】米国特許第3,654,090号は、多価の抗原を
検出するための逐次的二段階免疫測定方法の最も初期の
技術のひとつである。以来、上記特許の基本的技術の変
法が放射能または非放射能信号を発生するプロ―ブを用
いて高分子量の抗原を測定するために応用されている。
このような方法はイムノメトリック法と呼ばれている。
検出するための逐次的二段階免疫測定方法の最も初期の
技術のひとつである。以来、上記特許の基本的技術の変
法が放射能または非放射能信号を発生するプロ―ブを用
いて高分子量の抗原を測定するために応用されている。
このような方法はイムノメトリック法と呼ばれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】イムノメトリック法に
おいて、同一の抗原に対して異なる種において生起する
２種類のポリクロ―ナル抗体（ひとつは固体支持体に固
定化され、第２のものは信号発生プロ―ブで標識されて
いる。）を用いると、測定感度が上がり、バックグラウ
ンド信号がある程度減少することが分析的見地から確認
され、その方法が確立されている。米国特許第4,376,11
0号は、イムノメトリック法において多価の抗体上の２
種の異なるエピト―プに対し２種のモノクロ―ナル抗体
を使用することを教示している。これとは異なり、米国
特許第3,654,090号、米国特許第4,376,110号は、同時イ
ンキュベ―ション (非段階測定システム) を採用してい
る。同様に、米国特許第4,474,892号も、同一の抗原に
対して異なるクラスまたはサブクラスのモノクロ―ナル
抗体を用いる２部位イムノメトリック法を記載してい
る。これらの上記方法は、十分な感度，特異性およびバ
ックグラウンド信号のある程度の低減を達成するが、抗
体を固体支持体に固定し、固体相型の反応とするため
に、全て反応速度が遅くなるという問題を生ずる。固体
相反応が液相反応より遅いということははっきりと確認
されており、また、固定化に先立って、固定化される抗
体が高い親和性定数を持つものであったとしても、非常
に低いバックグラウンド比を持つということも十分知ら
れている。このことは大部分，固体支持体上の立体障害
効果が大きいためである。このような方法にあっては、
固定化される抗体の量並びに第二の抗体に結合され信号
を発生するプロ―ブの濃度および特異的な活性を最適に
合わせないと、いわゆる “高濃度域のフック現象" が
起ってしまい、かかる方法の信頼性および有効性を損う
結果となってしまう。
おいて、同一の抗原に対して異なる種において生起する
２種類のポリクロ―ナル抗体（ひとつは固体支持体に固
定化され、第２のものは信号発生プロ―ブで標識されて
いる。）を用いると、測定感度が上がり、バックグラウ
ンド信号がある程度減少することが分析的見地から確認
され、その方法が確立されている。米国特許第4,376,11
0号は、イムノメトリック法において多価の抗体上の２
種の異なるエピト―プに対し２種のモノクロ―ナル抗体
を使用することを教示している。これとは異なり、米国
特許第3,654,090号、米国特許第4,376,110号は、同時イ
ンキュベ―ション (非段階測定システム) を採用してい
る。同様に、米国特許第4,474,892号も、同一の抗原に
対して異なるクラスまたはサブクラスのモノクロ―ナル
抗体を用いる２部位イムノメトリック法を記載してい
る。これらの上記方法は、十分な感度，特異性およびバ
ックグラウンド信号のある程度の低減を達成するが、抗
体を固体支持体に固定し、固体相型の反応とするため
に、全て反応速度が遅くなるという問題を生ずる。固体
相反応が液相反応より遅いということははっきりと確認
されており、また、固定化に先立って、固定化される抗
体が高い親和性定数を持つものであったとしても、非常
に低いバックグラウンド比を持つということも十分知ら
れている。このことは大部分，固体支持体上の立体障害
効果が大きいためである。このような方法にあっては、
固定化される抗体の量並びに第二の抗体に結合され信号
を発生するプロ―ブの濃度および特異的な活性を最適に
合わせないと、いわゆる “高濃度域のフック現象" が
起ってしまい、かかる方法の信頼性および有効性を損う
結果となってしまう。
【００１０】イムノメトリック法の更なる欠点は抗体を
固定化する工程のバッチ間のバラツキである。米国特許
第4,496,654号は、抗体の固定化におけるバラツキにつ
いて論じ、最初にアビジンを固体支持体上に固定化し、
次いで、この支持体とビオチニル化した抗体とを反応さ
せ固体相抗体支持体を形成すると、均一な固定化が達成
されることを教示している。しかしながら、かかる開示
された変法においても、反応速度の遅さと、“高濃度域
のフック現象" の危険性は避けられない。本発明は、こ
れらイムノメトック法に特有のこれら欠点を解消せんと
するものである。
固定化する工程のバッチ間のバラツキである。米国特許
第4,496,654号は、抗体の固定化におけるバラツキにつ
いて論じ、最初にアビジンを固体支持体上に固定化し、
次いで、この支持体とビオチニル化した抗体とを反応さ
せ固体相抗体支持体を形成すると、均一な固定化が達成
されることを教示している。しかしながら、かかる開示
された変法においても、反応速度の遅さと、“高濃度域
のフック現象" の危険性は避けられない。本発明は、こ
れらイムノメトック法に特有のこれら欠点を解消せんと
するものである。
【００１１】従来の抗原を検出するためのイムノメトリ
ック法の変法は、イムノソルバントのような固定化され
た抗原を用いることにより、特異的な抗体を測定するた
めにも拡張されている。このような技術の注目に値する
応用は、アレルゲン特異性免疫グロブリンIgE (レアギ
ン性免疫グロブリン) の検出のために広く用いられてい
る。歴史的には、特異的なアレルゲン試験は、米国特許
第3,720,760号およびその他の国における対応特許の教
示に従い、かかる特許においては、特異的なアレルゲン
は固体支持体 (主として濾紙ディスク) に固定し、アレ
ルゲン特異性免疫グロブリンIgE を含有する可能性のあ
る被検試料と反応させる。最初のインキュベ―ション
(通常２４時間) の後、血清成分に由来する非特異的結
合を除くため固体支持体を洗浄し、次いで、固体支持体
を標識した抗−IgE 抗体と反応させる。固体支持体の第
２の洗浄工程の後、標識された物質の存在をチェックす
る。この方法は広く普及しているが、いくつかの欠点を
持っている。即ち、固体相反応であるために反応速度が
遅く、IgE に対し本来のアレルゲンと同一の結合特性を
有する固定化されたアレルゲンを生成することが困難な
こと、さらに、固体相アレルゲンの製造におけるバッチ
間のバラツキがあることである。最近、Aalberseらは、
ラジオアレルゴソルベント試験型測定方法における固体
相に結合された抗原に代えてハプテンで修飾した抗体を
使用することを記載している (J.Imm.Methods 87:51‐5
7 (1986) ) 。かかる方法においては、特異的なアレル
ゲンIgEを含有する可能性のある被検試料をトリニトロ
ベンゼンスルホン酸 (ＴＮＰ) で修飾した特異的なアレ
ルゲンと２時間反応させ、次いで、固体相に結合された
抗ＴＮＰと一晩反応させて、IgE −アレルゲン−ＴＮＰ
−抗ＴＮＰ複合体を形成する。この固体相を洗浄した
後、再度125 Ｉ−抗IgE 抗体と反応させ再洗浄し、被検
試料中のアレルゲン特異性IgE の濃度に正比例する125
Ｉ同位体の存在をカウントする。このアプロ―チにおい
て、著者は、最初の反応で液相の反応動力学の利点を活
用したと主張しているが、アレルゲンのＴＮＰ標識の程
度を立証できていない。アレルゲンをハプテン例えばＴ
ＮＰで直接標識することは、標識の過程で標識されてい
ない必須アレルゲン成分を見落す可能性があり、したが
って、上記方法においては、定量することができない。
さらに、この方法では反応時間が２日であり、この点で
も米国特許第3,720,760号に記載された方法と比べて反
応時間が長く改善されていない。
ック法の変法は、イムノソルバントのような固定化され
た抗原を用いることにより、特異的な抗体を測定するた
めにも拡張されている。このような技術の注目に値する
応用は、アレルゲン特異性免疫グロブリンIgE (レアギ
ン性免疫グロブリン) の検出のために広く用いられてい
る。歴史的には、特異的なアレルゲン試験は、米国特許
第3,720,760号およびその他の国における対応特許の教
示に従い、かかる特許においては、特異的なアレルゲン
は固体支持体 (主として濾紙ディスク) に固定し、アレ
ルゲン特異性免疫グロブリンIgE を含有する可能性のあ
る被検試料と反応させる。最初のインキュベ―ション
(通常２４時間) の後、血清成分に由来する非特異的結
合を除くため固体支持体を洗浄し、次いで、固体支持体
を標識した抗−IgE 抗体と反応させる。固体支持体の第
２の洗浄工程の後、標識された物質の存在をチェックす
る。この方法は広く普及しているが、いくつかの欠点を
持っている。即ち、固体相反応であるために反応速度が
遅く、IgE に対し本来のアレルゲンと同一の結合特性を
有する固定化されたアレルゲンを生成することが困難な
こと、さらに、固体相アレルゲンの製造におけるバッチ
間のバラツキがあることである。最近、Aalberseらは、
ラジオアレルゴソルベント試験型測定方法における固体
相に結合された抗原に代えてハプテンで修飾した抗体を
使用することを記載している (J.Imm.Methods 87:51‐5
7 (1986) ) 。かかる方法においては、特異的なアレル
ゲンIgEを含有する可能性のある被検試料をトリニトロ
ベンゼンスルホン酸 (ＴＮＰ) で修飾した特異的なアレ
ルゲンと２時間反応させ、次いで、固体相に結合された
抗ＴＮＰと一晩反応させて、IgE −アレルゲン−ＴＮＰ
−抗ＴＮＰ複合体を形成する。この固体相を洗浄した
後、再度125 Ｉ−抗IgE 抗体と反応させ再洗浄し、被検
試料中のアレルゲン特異性IgE の濃度に正比例する125
Ｉ同位体の存在をカウントする。このアプロ―チにおい
て、著者は、最初の反応で液相の反応動力学の利点を活
用したと主張しているが、アレルゲンのＴＮＰ標識の程
度を立証できていない。アレルゲンをハプテン例えばＴ
ＮＰで直接標識することは、標識の過程で標識されてい
ない必須アレルゲン成分を見落す可能性があり、したが
って、上記方法においては、定量することができない。
さらに、この方法では反応時間が２日であり、この点で
も米国特許第3,720,760号に記載された方法と比べて反
応時間が長く改善されていない。
【００１２】本発明は、従来のアレルゲンテストおよび
その改良法にともなう問題点を解消せんとするものであ
る。
その改良法にともなう問題点を解消せんとするものであ
る。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、新しい方法を
用いる生物体液中で循環する抗原または抗体の測定に関
するものである。本明細書中において記載する方法は、
まず所定のリガンドで実質的に標識されているマトリッ
クスまたはバックボ―ンに化学的に結合された特異的な
抗原または抗体を使用する。そして被検試料との最初の
液相反応の後、被検抗原または抗体と信号発生プロ―ブ
で標識された抗−抗原または抗−抗体との間で形成され
る免疫複合体を、マトリックスに結合したリガンドに対
する抗リガンドを含有する固体支持体上でそのまま固定
することを特徴とするものである。
用いる生物体液中で循環する抗原または抗体の測定に関
するものである。本明細書中において記載する方法は、
まず所定のリガンドで実質的に標識されているマトリッ
クスまたはバックボ―ンに化学的に結合された特異的な
抗原または抗体を使用する。そして被検試料との最初の
液相反応の後、被検抗原または抗体と信号発生プロ―ブ
で標識された抗−抗原または抗−抗体との間で形成され
る免疫複合体を、マトリックスに結合したリガンドに対
する抗リガンドを含有する固体支持体上でそのまま固定
することを特徴とするものである。
【００１４】
【作用】所定のリガンドで実質的に標識されたマトリッ
クスに対し抗原または抗体を結合させる本方法は、少な
くとも２つの明確な目的に役立つ。
クスに対し抗原または抗体を結合させる本方法は、少な
くとも２つの明確な目的に役立つ。
【００１５】(a) マトリックスに結合されるリガンドが
ごく少数でも免疫複合体全てが効果的に完全に固定化さ
れるので、抗リガンドを介して固体支持体上に固定化さ
れることのできる免疫複合体の数が大きく増大する。本
明細書中で記載するようにマトリックスを使用すること
なく抗原または抗体を所定のリガンドで直接標識すると
抗リガンドにより固体支持体に固定化される免疫複合体
の数が制限される。何故ならば、少数の抗原または抗体
のみが所定のリガンドで標識されまた標識されていない
抗原または抗体からリガンドで標識された抗原または抗
体を分離するための高度なアフィニティ−クロマトグラ
フィ技術を使用する必要が生じるからである。
ごく少数でも免疫複合体全てが効果的に完全に固定化さ
れるので、抗リガンドを介して固体支持体上に固定化さ
れることのできる免疫複合体の数が大きく増大する。本
明細書中で記載するようにマトリックスを使用すること
なく抗原または抗体を所定のリガンドで直接標識すると
抗リガンドにより固体支持体に固定化される免疫複合体
の数が制限される。何故ならば、少数の抗原または抗体
のみが所定のリガンドで標識されまた標識されていない
抗原または抗体からリガンドで標識された抗原または抗
体を分離するための高度なアフィニティ−クロマトグラ
フィ技術を使用する必要が生じるからである。
【００１６】(b) 最初の反応で液相の反応動力学を用い
る有用性が明らかである。何故ならば、これによりマト
リックスに結合した抗原または抗体と信号を発生する標
識された抗−抗原または抗−抗体との間の免疫複合体の
形成が促進されるからである。 液相の反応動力学が必
要ない場合には、本発明の教示は、抗原または抗体をマ
トリックスに結合し、前記マトリックスを所定のリガン
ドで標識し、次いで、前記マトリックスを抗リガンドを
含有する固体相支持体と予め反応させることにより、有
効な固体相マトリックスを製造するために用いることが
できる。
る有用性が明らかである。何故ならば、これによりマト
リックスに結合した抗原または抗体と信号を発生する標
識された抗−抗原または抗−抗体との間の免疫複合体の
形成が促進されるからである。 液相の反応動力学が必
要ない場合には、本発明の教示は、抗原または抗体をマ
トリックスに結合し、前記マトリックスを所定のリガン
ドで標識し、次いで、前記マトリックスを抗リガンドを
含有する固体相支持体と予め反応させることにより、有
効な固体相マトリックスを製造するために用いることが
できる。
【００１７】
【実施例】次に上記概要の本願発明をそのいくつかの分
析スキ―ムを以下に示すことによりさらに詳しく説明す
る。
析スキ―ムを以下に示すことによりさらに詳しく説明す
る。
【００１８】スキ―ムＩ: 非段階的測定方法 所定の抗原または抗体を含有する可能性のある被検試料
を、液相中で標識されたリガンド−抗体または標識され
たリガンド−抗原と、それらとは異なるように標識され
た特異的な抗−抗体または標識された特異的な抗−抗原
の存在下で反応させる。液相中の免疫複合体を、マトリ
ックスを介して特異的な抗原または抗体に結合したリガ
ンドに対する固体支持体上の固定化された抗リガンドと
反応させる。次いでこの固体相を洗浄し、抗−抗原また
は抗−抗体に結合した標識発生信号をチェックする。抗
原または抗体の検出に対し適用した本方法を図１及び図
２に図式的に示す。
を、液相中で標識されたリガンド−抗体または標識され
たリガンド−抗原と、それらとは異なるように標識され
た特異的な抗−抗体または標識された特異的な抗−抗原
の存在下で反応させる。液相中の免疫複合体を、マトリ
ックスを介して特異的な抗原または抗体に結合したリガ
ンドに対する固体支持体上の固定化された抗リガンドと
反応させる。次いでこの固体相を洗浄し、抗−抗原また
は抗−抗体に結合した標識発生信号をチェックする。抗
原または抗体の検出に対し適用した本方法を図１及び図
２に図式的に示す。
【００１９】スキ―ムII : 段階的測定方法 段階的測定方法においては、被検試料をリガンドで標識
した抗原または抗体と反応させ、次いで固体相抗リガン
ドと接触させ特定の時間反応させる。続いて、固体相を
洗浄し、信号発生プロ―ブで標識した抗−抗原または抗
−抗体と再度反応させる。固体相を再び洗浄し、信号発
生プローブに対しチェックする。図３及び図４にかかる
概念を概略的に示す。
した抗原または抗体と反応させ、次いで固体相抗リガン
ドと接触させ特定の時間反応させる。続いて、固体相を
洗浄し、信号発生プロ―ブで標識した抗−抗原または抗
−抗体と再度反応させる。固体相を再び洗浄し、信号発
生プローブに対しチェックする。図３及び図４にかかる
概念を概略的に示す。
【００２０】スキ―ムIII: ハプテンの検出: 拮抗的測
定方法 ハプテン検出の場合、所定のハプテンに対する抗体をマ
トリックスまたはバックボ―ンに化学的に結合させ、次
いでリガンドで標識する。上記のハプテンを含有する可
能性のある被検試料を、液相でリガンドで標識された抗
体を含むマトリックスと、以下に示すように、ハプテン
で標識されたプロ―ブ (Ｈ−Ｚ) の存在下で反応させ
る。所定の時間内にリガンドで標識された抗体上の結合
部位に対する被検ハプテンと標識されたハプテンプロ―
ブとの間の拮抗が起こる。次いで、固体相を含有するマ
トリックスに結合したリガンドに対する固体支持体上に
固定化された抗リガンドを添加する。固体相を洗浄し、
被検試料中のハプテンの濃度に反比例するハプテンで標
識されたプロ―ブの存在をチェックする。図５にかかる
概念を示す。
定方法 ハプテン検出の場合、所定のハプテンに対する抗体をマ
トリックスまたはバックボ―ンに化学的に結合させ、次
いでリガンドで標識する。上記のハプテンを含有する可
能性のある被検試料を、液相でリガンドで標識された抗
体を含むマトリックスと、以下に示すように、ハプテン
で標識されたプロ―ブ (Ｈ−Ｚ) の存在下で反応させ
る。所定の時間内にリガンドで標識された抗体上の結合
部位に対する被検ハプテンと標識されたハプテンプロ―
ブとの間の拮抗が起こる。次いで、固体相を含有するマ
トリックスに結合したリガンドに対する固体支持体上に
固定化された抗リガンドを添加する。固体相を洗浄し、
被検試料中のハプテンの濃度に反比例するハプテンで標
識されたプロ―ブの存在をチェックする。図５にかかる
概念を示す。
【００２１】ある種のハプテンに対しては、ハプテンで
標識した信号発生プロ―ブが高分子量の特にある種の標
識である場合には、生じ得る立体障害を回避するために
マトリックスを用いることなくリガンドを直接ハプテン
抗体に結合するのが有利であることもある。
標識した信号発生プロ―ブが高分子量の特にある種の標
識である場合には、生じ得る立体障害を回避するために
マトリックスを用いることなくリガンドを直接ハプテン
抗体に結合するのが有利であることもある。
【００２２】特異的な抗原または抗体を結合させるため
にマトリックスまたはバックボ―ンを用い、次いで前記
バックボ―ンを所定のリガンドで標識するのが本発明の
好ましい実施態様である。当業者であれば、前記マトリ
ックスに対する結合の様式または順序を変えることは容
易に想到することができるであろう。
にマトリックスまたはバックボ―ンを用い、次いで前記
バックボ―ンを所定のリガンドで標識するのが本発明の
好ましい実施態様である。当業者であれば、前記マトリ
ックスに対する結合の様式または順序を変えることは容
易に想到することができるであろう。
【００２３】可溶性の抗原または抗体のマトリックスの
調製 以下の一連の反応は、所定の抗原または抗体と特異的な
リガンドを含有するマトリックスまたはバックボ―ンの
ための種々の反応スキ―ムである。これら一連の反応に
おいて、可溶性ポリマは種々の化合物で活性化され、種
々の機構により反応せしめられる。活性化されたポリマ
・マトリックスは、抗原または抗体に直接結合される場
合もあるし、ポリペプチドポリマまたはコポリマを介し
て間接的に抗原または抗体に結合され、次いでこれに抗
原または抗体が共有結合される場合もある。マトリック
ス−抗原もしくは抗体複合体またはマトリックス−ポリ
ペプチド／コポリマ−抗原もしくは抗体複合体は、然る
後、リガンドで直接または予め標識されたリガンド鎖で
間接的に標識される。これらの例で使用されるリガンド
はビオチンであり、かつ抗リガンドはアビジンである。
他の使用し得るリガンド−抗リガンドの組合せについて
は、可能な他のリガンドについての記載部分において言
及する。
調製 以下の一連の反応は、所定の抗原または抗体と特異的な
リガンドを含有するマトリックスまたはバックボ―ンの
ための種々の反応スキ―ムである。これら一連の反応に
おいて、可溶性ポリマは種々の化合物で活性化され、種
々の機構により反応せしめられる。活性化されたポリマ
・マトリックスは、抗原または抗体に直接結合される場
合もあるし、ポリペプチドポリマまたはコポリマを介し
て間接的に抗原または抗体に結合され、次いでこれに抗
原または抗体が共有結合される場合もある。マトリック
ス−抗原もしくは抗体複合体またはマトリックス−ポリ
ペプチド／コポリマ−抗原もしくは抗体複合体は、然る
後、リガンドで直接または予め標識されたリガンド鎖で
間接的に標識される。これらの例で使用されるリガンド
はビオチンであり、かつ抗リガンドはアビジンである。
他の使用し得るリガンド−抗リガンドの組合せについて
は、可能な他のリガンドについての記載部分において言
及する。
【００２４】反応スキ―ム１ かかる反応手順においては、２つの可溶性炭水化物を用
いた。即ち、(ｉ)分子量6,000〜80,000(ドルトン) の可
溶性デキストランおよび(ii)分子量70,000〜400,000(ド
ルトン)の可溶性フィコ―ル。これら２つの炭水化物は
以下の実施例中でも用い、マトリックス−ＯＨで表わ
す。以下の実施例で使用したアミノ酸コポリマは(a) ポ
リリジン、フエニルアラニン、(b) ポリリジン、アラニ
ン、(c) ポリグルタミン酸、グルタミン酸エステル、
(d) ポリグルタミン酸、アラニン、リジン、チロシンな
ど多数のコポリマの例から選択することができる。当業
者であれば、他のアミノ酸コポリマも容易に想到するこ
とができるであろう。反応手順を図６及び図７に示す。
いた。即ち、(ｉ)分子量6,000〜80,000(ドルトン) の可
溶性デキストランおよび(ii)分子量70,000〜400,000(ド
ルトン)の可溶性フィコ―ル。これら２つの炭水化物は
以下の実施例中でも用い、マトリックス−ＯＨで表わ
す。以下の実施例で使用したアミノ酸コポリマは(a) ポ
リリジン、フエニルアラニン、(b) ポリリジン、アラニ
ン、(c) ポリグルタミン酸、グルタミン酸エステル、
(d) ポリグルタミン酸、アラニン、リジン、チロシンな
ど多数のコポリマの例から選択することができる。当業
者であれば、他のアミノ酸コポリマも容易に想到するこ
とができるであろう。反応手順を図６及び図７に示す。
【００２５】「実施例」 以下に実施例を挙げるが本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
されるものではない。
【００２６】実施例１ 反応手順１b を用いた特異的なアレルゲンを含有するマ
トリックスの調製 ;Bethell,G らの方法 (J.Biol.Chem.
254 : 2572 , 1979年) を改変した上記ＣＤＩ活性化反
応を、反応手順１b に従いアレルゲンの調製に応用し
た。以下にその手順を記載する。
トリックスの調製 ;Bethell,G らの方法 (J.Biol.Chem.
254 : 2572 , 1979年) を改変した上記ＣＤＩ活性化反
応を、反応手順１b に従いアレルゲンの調製に応用し
た。以下にその手順を記載する。
【００２７】(i) 上記反応手順１に記載した124nＭの
マトリックス−ＯＨを、1,1′−カルボニルジイミダゾ
―ル (ＣＤＩ) 10.0mgを含むジメチルスルホキシド2.0m
lに溶解し、室温で振盪しながら３０分間反応させた。 (ii) アミノ酸コポリマ (例えばグルタミン酸、グルタ
ミン酸エチルエステル)770nＭをジメチルスルホキシド
2.0mlに溶解し、上記(i)の反応混合物に加え、振盪しな
がら、室温で２４時間反応させた。
マトリックス−ＯＨを、1,1′−カルボニルジイミダゾ
―ル (ＣＤＩ) 10.0mgを含むジメチルスルホキシド2.0m
lに溶解し、室温で振盪しながら３０分間反応させた。 (ii) アミノ酸コポリマ (例えばグルタミン酸、グルタ
ミン酸エチルエステル)770nＭをジメチルスルホキシド
2.0mlに溶解し、上記(i)の反応混合物に加え、振盪しな
がら、室温で２４時間反応させた。
【００２８】(iii) 上記(i)の反応混合物を体積２倍の
水で希釈し、セファクリル−300カラムでクロマト分離
し、マトリックス−コポリマ複合体を単離した。 (iv) マトリックス−コポリマを含有する画分を蒸留水
に対して透析し、更に、pＨ5.0の酢酸緩衝液に対して透
析した。 (v) 透析したマトリックス−コポリマ複合体に、凍結
乾燥したアレルゲン抽出物20.0mgを加え、続いてＮ−エ
チル−Ｎ′− (ジメチルアミノプロピル) カルボジイミ
ド (ＥＤＣ) 0.15Ｍを加え、振盪しながら４℃で２４時
間反応させた。反応のpＨは、かかる反応中pＨ5.0に保
持した。次いで、反応混合物をpＨ8.1の0.1Ｍ炭酸水素
ナトリウム緩衝液に対して４℃で12時間透析した。
水で希釈し、セファクリル−300カラムでクロマト分離
し、マトリックス−コポリマ複合体を単離した。 (iv) マトリックス−コポリマを含有する画分を蒸留水
に対して透析し、更に、pＨ5.0の酢酸緩衝液に対して透
析した。 (v) 透析したマトリックス−コポリマ複合体に、凍結
乾燥したアレルゲン抽出物20.0mgを加え、続いてＮ−エ
チル−Ｎ′− (ジメチルアミノプロピル) カルボジイミ
ド (ＥＤＣ) 0.15Ｍを加え、振盪しながら４℃で２４時
間反応させた。反応のpＨは、かかる反応中pＨ5.0に保
持した。次いで、反応混合物をpＨ8.1の0.1Ｍ炭酸水素
ナトリウム緩衝液に対して４℃で12時間透析した。
【００２９】(vi) マトリックス−コポリマ複合体をジ
メチルホルムアミド1.0mlに溶解したＮ−ハイドロキシ
スクシンイミドビオチン7.3μＭと４℃で一晩反応させ
た。最終反応混合物をセファクリル−300カラムでクロ
マト分離し、マトリックス−コポリマ−アレルゲン−ビ
オチン複合体に対応する画分を集め、以下に詳述するよ
うにアレルゲン活性をチェックした。これとは別に、上
記反応を改変した。かかる変法においては、ビオチニル
化したポリリジンを以下のように上記工程(vi)において
マトリックス−コポリマ−アレルゲン複合体と反応させ
た。ポリリジン [分子量3,800(ドルトン)] １．８μＭ
とＮ−ハイドロキシスクシンイミドビオチン180μＭを
ジメチルホルムアミド1.0mlに溶解した。ビオチニル化
したポリリジンをＣＭ−セファロ―スカラムに吸着し、
NaCl 2.0Ｍを含有するpＨ9.0の50nＭ−ホウ酸ナトリウ
ム緩衝液で溶出した。ビオチニル化したポリリジン複合
体をp Ｈ5.0に調製し、(vi)で記載したようにＥＤＣを
用いてマトリックス−コポリマ―アレルゲン複合体と反
応させ、クロマト分離し、マトリックス−コポリマ―ア
レルゲン−ポリリジン−ビオチン複合体を得た。反応手
順を図８及び図９に示す。
メチルホルムアミド1.0mlに溶解したＮ−ハイドロキシ
スクシンイミドビオチン7.3μＭと４℃で一晩反応させ
た。最終反応混合物をセファクリル−300カラムでクロ
マト分離し、マトリックス−コポリマ−アレルゲン−ビ
オチン複合体に対応する画分を集め、以下に詳述するよ
うにアレルゲン活性をチェックした。これとは別に、上
記反応を改変した。かかる変法においては、ビオチニル
化したポリリジンを以下のように上記工程(vi)において
マトリックス−コポリマ−アレルゲン複合体と反応させ
た。ポリリジン [分子量3,800(ドルトン)] １．８μＭ
とＮ−ハイドロキシスクシンイミドビオチン180μＭを
ジメチルホルムアミド1.0mlに溶解した。ビオチニル化
したポリリジンをＣＭ−セファロ―スカラムに吸着し、
NaCl 2.0Ｍを含有するpＨ9.0の50nＭ−ホウ酸ナトリウ
ム緩衝液で溶出した。ビオチニル化したポリリジン複合
体をp Ｈ5.0に調製し、(vi)で記載したようにＥＤＣを
用いてマトリックス−コポリマ―アレルゲン複合体と反
応させ、クロマト分離し、マトリックス−コポリマ―ア
レルゲン−ポリリジン−ビオチン複合体を得た。反応手
順を図８及び図９に示す。
【００３０】実施例２ 反応手順２b を用いたアレルゲンを含有するマトリック
スの調製 ;March,Sらの方法 (Anal.Biochem. 60 149、1
974年) を改変した上記シアノゲンブロマイド活性化反
応を反応手順２b に従い特異的なアレルゲンの調製に応
用した。以下に記載する。 (i) 上記スキ―ム１で記載したように124mＭのマトリ
ックス−ＯＨを2.0Ｍ炭酸ナトリウム2.0mlに溶解し、シ
アノゲンブロマイド溶液 (２gのCNBr結晶をアセトリト
リル1.0mlに溶解したもの) 100μlと２分間pＨ11.0で反
応させ、さらに同様のシアノゲンブロマイド溶液100μl
と２分間反応させた。 (ii) その後、直ちに、アミノ酸コポリマ385μＭを上
記(i)に加え、室温で攪拌しながら、一晩反応させた。
スの調製 ;March,Sらの方法 (Anal.Biochem. 60 149、1
974年) を改変した上記シアノゲンブロマイド活性化反
応を反応手順２b に従い特異的なアレルゲンの調製に応
用した。以下に記載する。 (i) 上記スキ―ム１で記載したように124mＭのマトリ
ックス−ＯＨを2.0Ｍ炭酸ナトリウム2.0mlに溶解し、シ
アノゲンブロマイド溶液 (２gのCNBr結晶をアセトリト
リル1.0mlに溶解したもの) 100μlと２分間pＨ11.0で反
応させ、さらに同様のシアノゲンブロマイド溶液100μl
と２分間反応させた。 (ii) その後、直ちに、アミノ酸コポリマ385μＭを上
記(i)に加え、室温で攪拌しながら、一晩反応させた。
【００３１】(iii) 反応混合物をセファクリル300カラ
ムでクロマト分離してマトリックス−コポリマ複合体を
単離し、蒸留水に対して透析後、pＨ5.0の酢酸緩衝液に
対して透析した。 (iv) 透析したマトリックス−コポリマ複合体に凍結乾
燥したアレルゲン抽出物２０mgとＥＤＣ0.15Ｍとを加
え、反応混合物をpＨ5.0に保持しながら、４℃で２４時
間反応させた。続いて、この反応混合物をpＨ8.1の０．
１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液に対して、４℃で１２時
間透析した。この後の反応手順は、実施例１で記載した
工程(vi)に従う。ビオチニル化されたポリリジンを用い
る変法も又、上記実施例１と同様である。反応手順を図
１０および図１１に示す。
ムでクロマト分離してマトリックス−コポリマ複合体を
単離し、蒸留水に対して透析後、pＨ5.0の酢酸緩衝液に
対して透析した。 (iv) 透析したマトリックス−コポリマ複合体に凍結乾
燥したアレルゲン抽出物２０mgとＥＤＣ0.15Ｍとを加
え、反応混合物をpＨ5.0に保持しながら、４℃で２４時
間反応させた。続いて、この反応混合物をpＨ8.1の０．
１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液に対して、４℃で１２時
間透析した。この後の反応手順は、実施例１で記載した
工程(vi)に従う。ビオチニル化されたポリリジンを用い
る変法も又、上記実施例１と同様である。反応手順を図
１０および図１１に示す。
【００３２】実施例３ 反応手順３b を用いた特異的なアレルゲンを含有するマ
トリックスの調製 ;Sunberg,L. らの方法 (Chromatogra
phy, 90 871974年) を改変した上記ＢＤＤＧＥ活性化反
応を反応手順２b に従いアレルゲンの調製に応用した。
以下に記載する。 (i) 反応スキ―ム１に記載したように、150nＭのマト
リックス−ＯＨを0.26mＭのNaBH4を含有する0.3Ｍ水酸
化ナトリウム溶液4.0mlに溶解し、1,4−ブタンジオ―ル
−ジグリシジルエ―テル2.7mＭと室温で４時間反応させ
た。
トリックスの調製 ;Sunberg,L. らの方法 (Chromatogra
phy, 90 871974年) を改変した上記ＢＤＤＧＥ活性化反
応を反応手順２b に従いアレルゲンの調製に応用した。
以下に記載する。 (i) 反応スキ―ム１に記載したように、150nＭのマト
リックス−ＯＨを0.26mＭのNaBH4を含有する0.3Ｍ水酸
化ナトリウム溶液4.0mlに溶解し、1,4−ブタンジオ―ル
−ジグリシジルエ―テル2.7mＭと室温で４時間反応させ
た。
【００３３】(ii) 上記(i)で活性化したマトリックス
にアミノ酸コポリマ600nＭを加え、４℃でさらに４時間
反応させた。次いで、反応混合物を蒸留水に対して透析
し、さらにpＨ5.0の酢酸緩衝液に対して透析した。 (iii) 生成したマトリックス−コポリマ―複合体に、
凍結乾燥したアレルゲン抽出物20.0mgとＥＤＣ0.15Ｍと
を実施例１の反応工程(v)におけるように添加した。続
いて反応手順は、実施例１の反応工程(vi)に従う。これ
とは別のビオチニル化ポリシジンの反応手順もまた実施
例１と同様である。反応手順を図１２に示す。
にアミノ酸コポリマ600nＭを加え、４℃でさらに４時間
反応させた。次いで、反応混合物を蒸留水に対して透析
し、さらにpＨ5.0の酢酸緩衝液に対して透析した。 (iii) 生成したマトリックス−コポリマ―複合体に、
凍結乾燥したアレルゲン抽出物20.0mgとＥＤＣ0.15Ｍと
を実施例１の反応工程(v)におけるように添加した。続
いて反応手順は、実施例１の反応工程(vi)に従う。これ
とは別のビオチニル化ポリシジンの反応手順もまた実施
例１と同様である。反応手順を図１２に示す。
【００３４】実施例４ 反応手順４を用いるアレルゲンを含有するマトリックス
の調製 ;Inman,J の方法 (J.Immunol. 114 : 704 (197
5) を改変したカルボキシメチル化による活性化反応を
反応手順４に従い特異的なアレルゲンの調製に応用し
た。以下に記載する。 (i) 反応スキ―ム１で記載したマトリックス−ＯＨ
0.33μＭを0.32mlの1.35Ｍモノクロル酢酸ナトリウム
(蒸留水300ml＋５Ｍ水酸化ナトリウム135ml＋モノクロ
ル酢酸64.4gをp Ｈ6.8に調製し、最終体積を蒸留水で50
0mlとしたもの)に溶解した。この混合物を数分間激しく
混合した。 (ii) 10Ｍ水酸化ナトリウム86μlを加え、蒸留水で体
積を0.43mlに調製し、40℃で３時間反応させた。
の調製 ;Inman,J の方法 (J.Immunol. 114 : 704 (197
5) を改変したカルボキシメチル化による活性化反応を
反応手順４に従い特異的なアレルゲンの調製に応用し
た。以下に記載する。 (i) 反応スキ―ム１で記載したマトリックス−ＯＨ
0.33μＭを0.32mlの1.35Ｍモノクロル酢酸ナトリウム
(蒸留水300ml＋５Ｍ水酸化ナトリウム135ml＋モノクロ
ル酢酸64.4gをp Ｈ6.8に調製し、最終体積を蒸留水で50
0mlとしたもの)に溶解した。この混合物を数分間激しく
混合した。 (ii) 10Ｍ水酸化ナトリウム86μlを加え、蒸留水で体
積を0.43mlに調製し、40℃で３時間反応させた。
【００３５】(iii) この反応混合物に2.0Ｍリン酸ナト
リウム17.2μlを加え、0.1Ｍの塩酸を用いて滴定しpＨ
7.0に調製した。活性化されたマトリックスを蒸留水に
対して透析し、続いて、pＨ5.0の酢酸緩衝液に対してさ
らに透析した。 (iv) 次いで、カルボキシメチル−マトリックスをアミ
ノ酸コポリマ770nＭと0.15ＭのＥＤＣ存在下pＨ5.0，４
℃で２４時間反応させた。次いで、反応混合物を蒸留水
に対して透析し、続いて、pＨ5.0の酢酸緩衝液に対して
さらに透析した。 (v) 凍結乾燥した特異的なアレルゲン２０mgを0.15Ｍ
ＥＤＣとともに工程(iv)におけるマトリックス−コポ
リマ複合体に加え、実施例１の工程(v)におけるように
反応させた。これ以後の反応手順は、実施例１の反応工
程(vi)に従い、これとは別のビオチニル化されたポリリ
ジンを用いる反応もまた実施例１におけると同様であ
る。反応手順を図１３および図１４に示す。
リウム17.2μlを加え、0.1Ｍの塩酸を用いて滴定しpＨ
7.0に調製した。活性化されたマトリックスを蒸留水に
対して透析し、続いて、pＨ5.0の酢酸緩衝液に対してさ
らに透析した。 (iv) 次いで、カルボキシメチル−マトリックスをアミ
ノ酸コポリマ770nＭと0.15ＭのＥＤＣ存在下pＨ5.0，４
℃で２４時間反応させた。次いで、反応混合物を蒸留水
に対して透析し、続いて、pＨ5.0の酢酸緩衝液に対して
さらに透析した。 (v) 凍結乾燥した特異的なアレルゲン２０mgを0.15Ｍ
ＥＤＣとともに工程(iv)におけるマトリックス−コポ
リマ複合体に加え、実施例１の工程(v)におけるように
反応させた。これ以後の反応手順は、実施例１の反応工
程(vi)に従い、これとは別のビオチニル化されたポリリ
ジンを用いる反応もまた実施例１におけると同様であ
る。反応手順を図１３および図１４に示す。
【００３６】実施例５ 反応手順５を用いた特異的なアレルゲンを含有するマト
リックスの調製;Nakane,P. らの方法 (J.Histochem Cyt
ochem. 22 : 1084 (1974)を改変した過ヨウ素酸化活性
化反応を反応手順５b に従い特異アレルゲンの調製に応
用した。以下に記載する。 (i) 反応手順１に記載した124nＭのマトリックス−Ｏ
Ｈを0.3Ｍの炭酸水素ナトリウムにpＨ8.1で溶解し、1.0
mlの0.2Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムと１時間室温で反応さ
せた。
リックスの調製;Nakane,P. らの方法 (J.Histochem Cyt
ochem. 22 : 1084 (1974)を改変した過ヨウ素酸化活性
化反応を反応手順５b に従い特異アレルゲンの調製に応
用した。以下に記載する。 (i) 反応手順１に記載した124nＭのマトリックス−Ｏ
Ｈを0.3Ｍの炭酸水素ナトリウムにpＨ8.1で溶解し、1.0
mlの0.2Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムと１時間室温で反応さ
せた。
【００３７】(ii) アミノ酸コポリマ500nＭを加え、15
0分間室温で反応させた。ナトリウムボロハイドライド
0.26mＭを加えて、シッフ塩基を安定化した。 (iii) マトリックス−コポリマ複合体を蒸留水に対し
て透析し、更にpＨ5.0の酢酸緩衝液に対して透析した。
次いで、実施例１における反応工程(v)、(vi)と同様の
工程を行う。これとは別にビオチニル化したポリリジン
を用いた反応もまた実施例１に従う。
0分間室温で反応させた。ナトリウムボロハイドライド
0.26mＭを加えて、シッフ塩基を安定化した。 (iii) マトリックス−コポリマ複合体を蒸留水に対し
て透析し、更にpＨ5.0の酢酸緩衝液に対して透析した。
次いで、実施例１における反応工程(v)、(vi)と同様の
工程を行う。これとは別にビオチニル化したポリリジン
を用いた反応もまた実施例１に従う。
【００３８】反応スキ―ムII この反応スキ―ムでは、可溶性のポリマを用いる。即
ち、(i)分子量5,000〜120,000(ドルトン)のポリアクリ
ル酸(ii)分子量120,000〜240,000(ドルトン)のカルボキ
シル化されたポリアクリルアミド (カルボシル化度50〜
100％) (iii)分子量5,000〜200,000の反応性カルボキシ
ル基を有するポリペプチド又はコポリマ。これらの形態
のポリマ及びコポリマの反応手順は同じである。その概
略を図１５に示す。
ち、(i)分子量5,000〜120,000(ドルトン)のポリアクリ
ル酸(ii)分子量120,000〜240,000(ドルトン)のカルボキ
シル化されたポリアクリルアミド (カルボシル化度50〜
100％) (iii)分子量5,000〜200,000の反応性カルボキシ
ル基を有するポリペプチド又はコポリマ。これらの形態
のポリマ及びコポリマの反応手順は同じである。その概
略を図１５に示す。
【００３９】実施例６ 反応スキ―ムIIを用いた特異的なアレルゲンを含有する
マトリックスの調製; (i) ポリアクリル酸又はカルボキシル化したポリアク
リルアミド0.033nＭを2.0mlの0.01Ｍリン酸緩衝液pＨ8.
0に溶解した。0.1ＭのＥＤＣと0.1ＭのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドをポリマ溶液に加え、さらに凍結乾燥し
た特異的なアレルゲン抽出物10.0mgを加え、pＨを8.0に
保持しながら、室温で24時間インキュベ―トした。
マトリックスの調製; (i) ポリアクリル酸又はカルボキシル化したポリアク
リルアミド0.033nＭを2.0mlの0.01Ｍリン酸緩衝液pＨ8.
0に溶解した。0.1ＭのＥＤＣと0.1ＭのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドをポリマ溶液に加え、さらに凍結乾燥し
た特異的なアレルゲン抽出物10.0mgを加え、pＨを8.0に
保持しながら、室温で24時間インキュベ―トした。
【００４０】(ii) ポリマ―アレルゲン複合体をセファ
デックスＧ−100カラムでクロマト分離し、pＨ7.5の0.01
Ｍリン酸緩衝液で溶出し、排除体積画分を集めた。 (iii) 集めた画分を遠心濃縮機で2.0mlまで濃縮し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドビオチン0.73mＭと２時間
室温で反応させた。 (iv) ポリマ―アレルゲン−ビオチン複合体をpＨ7.5の
0.01Ｍリン酸緩衝液に対して４℃で18時間透析した。
デックスＧ−100カラムでクロマト分離し、pＨ7.5の0.01
Ｍリン酸緩衝液で溶出し、排除体積画分を集めた。 (iii) 集めた画分を遠心濃縮機で2.0mlまで濃縮し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドビオチン0.73mＭと２時間
室温で反応させた。 (iv) ポリマ―アレルゲン−ビオチン複合体をpＨ7.5の
0.01Ｍリン酸緩衝液に対して４℃で18時間透析した。
【００４１】リガンドと抗リガンドの選択 本発明に用いることのできる特異的なリガンドとそれら
に対する抗リガンドは、種々の化合物の中から選択され
る。ここに示す例は単に説明するために示したものであ
って、当業者であれば、それ以外のいかなるリガンド−
抗リガンドの組合せも容易に想到することができるであ
ろう。
に対する抗リガンドは、種々の化合物の中から選択され
る。ここに示す例は単に説明するために示したものであ
って、当業者であれば、それ以外のいかなるリガンド−
抗リガンドの組合せも容易に想到することができるであ
ろう。
【００４２】 リガンド 抗リガンド ハプテン 抗ハプテン ビオチン アビジン フロオロセイン 抗フロオロセイン ジニトロフエノ―ル 抗ジニトロフエノ―ル アビジン 抗アビジン ビオチン 抗ビオチン 牛血清アルブミン 抗牛血清アルブミン
【００４３】リガンドおよび抗リガンドの上記例におい
て、ここに記載した反応手順は、反応容器例えば試験管
中で行なわれ、次いで、抗リガンドを含有する固体相支
持体をその反応容器に入れる。この場合の固体相支持体
は、被覆されたビ―ズ，浸漬スティック等である。
て、ここに記載した反応手順は、反応容器例えば試験管
中で行なわれ、次いで、抗リガンドを含有する固体相支
持体をその反応容器に入れる。この場合の固体相支持体
は、被覆されたビ―ズ，浸漬スティック等である。
【００４４】被覆したチュ―ブ固体相法を用いるのも場
合によっては望ましい。何故ならば、操作および洗浄が
容易であるからである。この場合、上記のリガンド−抗
リガンドの組合せは不適当となる可能性もある。その理
由は、第１反応を液相で行い、続いて固体相の分離を行
うからである。上記のリガンド抗リガンドの組合せを液
相の第１反応中で使用する必要がない場合には上記リガ
ンド−抗リガンドの組合せを効果的な固体相系の調製に
使用することができる。一方、液相の第１反応を、被覆
されたチュ―ブのような同一の反応容器中で実施したい
場合には、以下に記載したような手法が可能である。
合によっては望ましい。何故ならば、操作および洗浄が
容易であるからである。この場合、上記のリガンド−抗
リガンドの組合せは不適当となる可能性もある。その理
由は、第１反応を液相で行い、続いて固体相の分離を行
うからである。上記のリガンド抗リガンドの組合せを液
相の第１反応中で使用する必要がない場合には上記リガ
ンド−抗リガンドの組合せを効果的な固体相系の調製に
使用することができる。一方、液相の第１反応を、被覆
されたチュ―ブのような同一の反応容器中で実施したい
場合には、以下に記載したような手法が可能である。
【００４５】(１) マトリックスに結合したリガンド
が、アビジンであり、かつ固体相被覆チュ―ブがアビジ
ンで被覆されている。アビジンを含有する免疫複合体−
マトリックスをアビジン被覆チュ―ブに効果的に固定化
するために、最初の液相反応が完結した後にビオチンを
加える。これにより上記スキ―ムＩ及びIIに示したよう
に図１６に示すような固定化された複合体が形成され
る。
が、アビジンであり、かつ固体相被覆チュ―ブがアビジ
ンで被覆されている。アビジンを含有する免疫複合体−
マトリックスをアビジン被覆チュ―ブに効果的に固定化
するために、最初の液相反応が完結した後にビオチンを
加える。これにより上記スキ―ムＩ及びIIに示したよう
に図１６に示すような固定化された複合体が形成され
る。
【００４６】(２) 先に記載したように、マトリックス
をビオチニル化し、被覆された固体上の抗アビジン抗体
を用いることで、前者の後者への固定化は最初の液相反
応の後、抗アビジン抗体とビオチニル化された液体免疫
複合体マトリックスの両方に結合する反応混合物にアビ
ジンを添加することにより達成される。これは図１７に
示すような固定化された複合体を形成する。
をビオチニル化し、被覆された固体上の抗アビジン抗体
を用いることで、前者の後者への固定化は最初の液相反
応の後、抗アビジン抗体とビオチニル化された液体免疫
複合体マトリックスの両方に結合する反応混合物にアビ
ジンを添加することにより達成される。これは図１７に
示すような固定化された複合体を形成する。
【００４７】(３) 先に記載したようにマトリックスを
ビオチニル化し、ビオチニル化された蛋白質例えば牛血
清アルブミンを用いることで、前者の後者への固定化は
最初の液相反応が生じた後、反応容器にアビジンを添加
することにより達成される。この場合、固体相には図１
８に示すような免疫複合体が形成される。この他、当業
者であれば、他の可能な組合わせは容易に想到すること
ができるであろう。
ビオチニル化し、ビオチニル化された蛋白質例えば牛血
清アルブミンを用いることで、前者の後者への固定化は
最初の液相反応が生じた後、反応容器にアビジンを添加
することにより達成される。この場合、固体相には図１
８に示すような免疫複合体が形成される。この他、当業
者であれば、他の可能な組合わせは容易に想到すること
ができるであろう。
【００４８】実施例７ 本発明による循環する全IgE (レアギン免疫グロブリ
ン)の測定;二種類のモノクロ―ナル抗体を、精製IgE に
対して作製し、Galfe,G とMistein,C の方法 (Preparat
ion of Monoclonal Antibodies:Strategies and Proced
ures In Enzymology,Immunochemical Techniques Vol.7
3 Langone, J.and Van Vunakis,H.,eds. A cademic Pre
ss (1981) PP 3‐46) を用いて、IgE 分子上の相異るエ
ピト―プを識別することを確認した。各々の抗体からIg
G 画分を、硫安沈澱の後、ＤＥＡＥ−セファロ―スＣＬ
−６Ｂにより精製する。一方の抗体は、Nakane,P. らの
過ヨウ素酸方法 (J.Histochem.Cytochem 22 1084 (197
4) ) を用いてホ―スラディシュパ―オキシダ―ゼに結
合させ、適当な濃度になるように、0.15Ｍの塩化ナトリ
ウム0.01％のチメロサ―ル及び0.1％のヒト血清アルブ
ミンを含有するＰＨ7.0の0.05Ｍリン酸緩衝液で試験溶
液に稀釈した。IgE に対する第２のモノクロナ―ル抗体
は反応スキ―ム、実施例６で記載したように、ポリアク
リル酸に結合させ、実施例６に記載した特異的なアレル
ゲンの代わりに精製したIgG 2.94nＭを用いてさらにビ
オチニル化した。ポリアクリル酸−抗IgE −ビ オチン
複合体は、上記の酵素標識抗体と同じ緩衝液にて適当に
稀釈する。
ン)の測定;二種類のモノクロ―ナル抗体を、精製IgE に
対して作製し、Galfe,G とMistein,C の方法 (Preparat
ion of Monoclonal Antibodies:Strategies and Proced
ures In Enzymology,Immunochemical Techniques Vol.7
3 Langone, J.and Van Vunakis,H.,eds. A cademic Pre
ss (1981) PP 3‐46) を用いて、IgE 分子上の相異るエ
ピト―プを識別することを確認した。各々の抗体からIg
G 画分を、硫安沈澱の後、ＤＥＡＥ−セファロ―スＣＬ
−６Ｂにより精製する。一方の抗体は、Nakane,P. らの
過ヨウ素酸方法 (J.Histochem.Cytochem 22 1084 (197
4) ) を用いてホ―スラディシュパ―オキシダ―ゼに結
合させ、適当な濃度になるように、0.15Ｍの塩化ナトリ
ウム0.01％のチメロサ―ル及び0.1％のヒト血清アルブ
ミンを含有するＰＨ7.0の0.05Ｍリン酸緩衝液で試験溶
液に稀釈した。IgE に対する第２のモノクロナ―ル抗体
は反応スキ―ム、実施例６で記載したように、ポリアク
リル酸に結合させ、実施例６に記載した特異的なアレル
ゲンの代わりに精製したIgG 2.94nＭを用いてさらにビ
オチニル化した。ポリアクリル酸−抗IgE −ビ オチン
複合体は、上記の酵素標識抗体と同じ緩衝液にて適当に
稀釈する。
【００４９】アビジンはCatt,K.and Treggear,G.W の方
法(Science 158 : 1570 (1967) )を用いて1/8インチの
ポリスチレンビ―ズに固定化し、さらに凍結乾燥するこ
とによって余分の水分を除く。10〜600IＵ／mlのIgE 値
を有する標準溶液は、馬血清中に調製し、ＷＨＯ (世界
保健機構) のSecond International Refernce Preparat
ion のヒト血清IgE 75／502に対して正規化した。
法(Science 158 : 1570 (1967) )を用いて1/8インチの
ポリスチレンビ―ズに固定化し、さらに凍結乾燥するこ
とによって余分の水分を除く。10〜600IＵ／mlのIgE 値
を有する標準溶液は、馬血清中に調製し、ＷＨＯ (世界
保健機構) のSecond International Refernce Preparat
ion のヒト血清IgE 75／502に対して正規化した。
【００５０】循環血中の全IgE 試料をランダムに30選
び、以下の様に測定した。０濃度標準液も含めてIgE 標
準溶液各10μlと各血清試料10μlとを12×75mmの試験管
にピペットで入れた。各々のチュ―ブにポリアクリル酸
−抗IgE −ビオチン複合体溶液100μlと酵素で標識した
モノクロ―ナル抗IgE 抗体溶液100μlとを加え、てばや
く混ぜ、室温で30分間インキュベ―トした。この最初の
インキュベ―ションの後、各チュ―ブにアビジン被覆ビ
―ズをひとつずつ加え、室温で振盪しながらさらに30分
間インキュベ―トした。ビ―ズを前述の抗体を稀釈した
緩衝液に0.5％のTween 20を含む洗浄液で２回洗浄し、
0.5mlの酵素基質溶液 (過酸化水素3.5mg，Ｏ−フエニレ
ンジアミン5.0mgを0.1Ｍのクエン酸リン酸緩衝液ＰＨ
５．０に溶解したもの) を加え、10分間反応させた。0.
5Ｍの硫酸0.5mlを加えて呈色反応を停止させ、分光光度
計で波長492nmの吸収を測定した。標準曲線の各点の吸
収は、表１のようになった。
び、以下の様に測定した。０濃度標準液も含めてIgE 標
準溶液各10μlと各血清試料10μlとを12×75mmの試験管
にピペットで入れた。各々のチュ―ブにポリアクリル酸
−抗IgE −ビオチン複合体溶液100μlと酵素で標識した
モノクロ―ナル抗IgE 抗体溶液100μlとを加え、てばや
く混ぜ、室温で30分間インキュベ―トした。この最初の
インキュベ―ションの後、各チュ―ブにアビジン被覆ビ
―ズをひとつずつ加え、室温で振盪しながらさらに30分
間インキュベ―トした。ビ―ズを前述の抗体を稀釈した
緩衝液に0.5％のTween 20を含む洗浄液で２回洗浄し、
0.5mlの酵素基質溶液 (過酸化水素3.5mg，Ｏ−フエニレ
ンジアミン5.0mgを0.1Ｍのクエン酸リン酸緩衝液ＰＨ
５．０に溶解したもの) を加え、10分間反応させた。0.
5Ｍの硫酸0.5mlを加えて呈色反応を停止させ、分光光度
計で波長492nmの吸収を測定した。標準曲線の各点の吸
収は、表１のようになった。
【００５１】
【表１】
【００５２】30の血清試料の個々におけるIgE 濃度を上
記標準曲線から計算し、ファルマシア社 (ニュ―ジャ―
ジ―州、ピスカタウェイ) 製の全IgE 酵素測定法を用い
て同じ試料について測定したIgE 濃度と比較した。結果
は以下の通りであった。 ファルマシア法による平均値: 89 IU/ml 本方法による平均値 : 88 IU/ml (本法による測定値) ＝1.04 × (ファルマシア法による
測定値) −2.7 IU/ml 相関係数＝0.9690
記標準曲線から計算し、ファルマシア社 (ニュ―ジャ―
ジ―州、ピスカタウェイ) 製の全IgE 酵素測定法を用い
て同じ試料について測定したIgE 濃度と比較した。結果
は以下の通りであった。 ファルマシア法による平均値: 89 IU/ml 本方法による平均値 : 88 IU/ml (本法による測定値) ＝1.04 × (ファルマシア法による
測定値) −2.7 IU/ml 相関係数＝0.9690
【００５３】実施例８ 本発明を用いたIgE 特異性アレルゲンの測定;本発明の
実施態様を用いてIgE 特異性アレルゲンの測定を行なっ
た。以下に詳細を記載する。
実施態様を用いてIgE 特異性アレルゲンの測定を行なっ
た。以下に詳細を記載する。
【００５４】上記実施例７で記載したようにpＨ7.0の0.
05Ｍリン酸緩衝生理食塩水に溶解させたマトリックス−
アレルゲン−ビオチン，マトリックス−アレルゲン−Ａ
ＡＣ−ビオチンまたはマトリックス−アレルゲン−ＡＡ
Ｃ−ポリリジン−ビオチン200μlを被検血清またはアト
ピ―血清標準液100μlに添加し、室温で２時間反応させ
た。各チュ―ブに、アビジン被覆ビ―ズをひとつ加え、
室温で60分メカニカルシェ―カ―上200ストロ―ク／分
で振盪反応させた。実施例７と同様にビ―ズを２回洗浄
し、上記と同様に緩衝液で稀釈したヤギ由来−抗IgE −
ホ―スラディシュパ―オキシダ―ゼ酵素標識300μlと更
に60分反応した。ビ―ズを２回再洗浄し、実施例７で記
載したのと同様の酵素基質溶液300μlと20分間反応さ
せ、0.5mlの0.5Ｍ硫酸を加えて反応を停止し、492nmの
吸光度を測定した。
05Ｍリン酸緩衝生理食塩水に溶解させたマトリックス−
アレルゲン−ビオチン，マトリックス−アレルゲン−Ａ
ＡＣ−ビオチンまたはマトリックス−アレルゲン−ＡＡ
Ｃ−ポリリジン−ビオチン200μlを被検血清またはアト
ピ―血清標準液100μlに添加し、室温で２時間反応させ
た。各チュ―ブに、アビジン被覆ビ―ズをひとつ加え、
室温で60分メカニカルシェ―カ―上200ストロ―ク／分
で振盪反応させた。実施例７と同様にビ―ズを２回洗浄
し、上記と同様に緩衝液で稀釈したヤギ由来−抗IgE −
ホ―スラディシュパ―オキシダ―ゼ酵素標識300μlと更
に60分反応した。ビ―ズを２回再洗浄し、実施例７で記
載したのと同様の酵素基質溶液300μlと20分間反応さ
せ、0.5mlの0.5Ｍ硫酸を加えて反応を停止し、492nmの
吸光度を測定した。
【００５５】以下の結果は、反応スキ―ムＩ及びIIで記
載したような種々のマトリックスに結合したアレルゲン
群について得られたものである。
載したような種々のマトリックスに結合したアレルゲン
群について得られたものである。
【００５６】(a) オオアワガエリ (Ｇ６) 精製したオオアワガエリアレルゲン (Ｇ６) を(ｉ)反応
手順１b の実施例１に記載したようにポリグルタミン
酸，グルタミン酸エステルを介してフィコ―ル70に、(i
i)実施例６に記載したようにポリアクリル酸 (ＰＡＡ)
に、(iii)実施例６に記載したようにカルボキシル化し
たポリアクリルイミドに結合した。ファルマシア社 (ニ
ュ―ジャ―ジ―州ピスカタウェイ) 製のファデバス−ラ
スト (Phadebas‐Rast ) キットによって分類されてい
るＧ６に対するクラスのアトピ―血清を非アトピ―血清
で稀釈し、クラスIII，II及びＩのアトピ―血清をシュ
ミレ―トし、４つの他のアトピ―試料及び１つの非アト
ピ―血清とともに上記プロトコ―ルを用いて測定した。
これらの測定結果を表２に示す。
手順１b の実施例１に記載したようにポリグルタミン
酸，グルタミン酸エステルを介してフィコ―ル70に、(i
i)実施例６に記載したようにポリアクリル酸 (ＰＡＡ)
に、(iii)実施例６に記載したようにカルボキシル化し
たポリアクリルイミドに結合した。ファルマシア社 (ニ
ュ―ジャ―ジ―州ピスカタウェイ) 製のファデバス−ラ
スト (Phadebas‐Rast ) キットによって分類されてい
るＧ６に対するクラスのアトピ―血清を非アトピ―血清
で稀釈し、クラスIII，II及びＩのアトピ―血清をシュ
ミレ―トし、４つの他のアトピ―試料及び１つの非アト
ピ―血清とともに上記プロトコ―ルを用いて測定した。
これらの測定結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】(b) 樺の木 精製した樺の木アレルゲン抽出物 (Ｔ３) を、(ｉ) 反
応手順１b を用い実施例１に記載したようにアミノ酸コ
ポリマ―ポリリジンフエニルアラニンを介してフィコ―
ル70に、(ii) 反応手順２b を用い実施例１に記載した
ようにポリグルタミン酸，アラニン，リジン，チロシン
コポリマを介してデキストラン80に、(iii) 反応スキ
―ムIIの実施例６に記載したようにカルボキシル化した
ポリアクリルアミド (ＣＰＡ) に結合した。ファルマシ
ア社製のファデバス−ラストキットによって分類された
Ｔ３に対するクラス のアトピ―血清を非アトピ―血清
で稀釈し、クラスIII，IIおよびＩのアトピ―クラスを
シュミレ―トし、Ｔ３に対する２つのアトピ―血清と１
つの非アトピ―血清とともに上記プロトコ―ルを用い測
定した。表３に、これらの測定結果を示す。
応手順１b を用い実施例１に記載したようにアミノ酸コ
ポリマ―ポリリジンフエニルアラニンを介してフィコ―
ル70に、(ii) 反応手順２b を用い実施例１に記載した
ようにポリグルタミン酸，アラニン，リジン，チロシン
コポリマを介してデキストラン80に、(iii) 反応スキ
―ムIIの実施例６に記載したようにカルボキシル化した
ポリアクリルアミド (ＣＰＡ) に結合した。ファルマシ
ア社製のファデバス−ラストキットによって分類された
Ｔ３に対するクラス のアトピ―血清を非アトピ―血清
で稀釈し、クラスIII，IIおよびＩのアトピ―クラスを
シュミレ―トし、Ｔ３に対する２つのアトピ―血清と１
つの非アトピ―血清とともに上記プロトコ―ルを用い測
定した。表３に、これらの測定結果を示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】本発明について詳細に説明したが、本発明
はこれら具体例のみに限定されるものではなく特許請求
の範囲に記載した発明こそが本発明の技術的思想であ
り、かかる発明について法律的な保護権利を求めるもの
である。
はこれら具体例のみに限定されるものではなく特許請求
の範囲に記載した発明こそが本発明の技術的思想であ
り、かかる発明について法律的な保護権利を求めるもの
である。
【００６１】
【発明の効果】本発明によれば、マトリックスに結合さ
れるリガンドがごく少数であっても、免疫複合体全てが
効果的に完全に固定化されるので、抗リガンドを介して
固体支持体上に固定化される免疫複合体の数を大きく増
大させることができる。また、本発明にあっては、第１
反応を液相の動力学に従って行うので、マトリックスに
結合した抗原又は抗体と信号を発生する標識された抗−
抗原又は抗−抗体との間の免疫複合体の形成を促進する
ことができる。
れるリガンドがごく少数であっても、免疫複合体全てが
効果的に完全に固定化されるので、抗リガンドを介して
固体支持体上に固定化される免疫複合体の数を大きく増
大させることができる。また、本発明にあっては、第１
反応を液相の動力学に従って行うので、マトリックスに
結合した抗原又は抗体と信号を発生する標識された抗−
抗原又は抗−抗体との間の免疫複合体の形成を促進する
ことができる。
【図１】 抗体検出の非段階的測定方法を示すフロー図
である。
である。
【図２】 抗原検出の非段階的測定方法を示すフロー図
である。
である。
【図３】 抗体検出の段階的測定方法を示すフロー図で
ある。
ある。
【図４】 抗原検出の段階的測定方法を示すフロー図で
ある。
ある。
【図５】 ハプテン検出の拮抗的測定方法を示すフロー
図である。
図である。
【図６】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有する
マトリックスの調製方法の第１の例を示すフロー図であ
る。
マトリックスの調製方法の第１の例を示すフロー図であ
る。
【図７】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有する
マトリックスの調製方法の第２の例を示すフロー図であ
る。
マトリックスの調製方法の第２の例を示すフロー図であ
る。
【図８】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有する
マトリックスの調製方法の第３の例を示すフロー図であ
る。
マトリックスの調製方法の第３の例を示すフロー図であ
る。
【図９】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有する
マトリックスの調製方法の第４の例を示すフロー図であ
る。
マトリックスの調製方法の第４の例を示すフロー図であ
る。
【図１０】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法の第５の例を示すフロー図で
ある。
るマトリックスの調製方法の第５の例を示すフロー図で
ある。
【図１１】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法の第６の例を示すフロー図で
ある。
るマトリックスの調製方法の第６の例を示すフロー図で
ある。
【図１２】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法の第７の例を示すフロー図で
ある。
るマトリックスの調製方法の第７の例を示すフロー図で
ある。
【図１３】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法の第８の例を示すフロー図で
ある。
るマトリックスの調製方法の第８の例を示すフロー図で
ある。
【図１４】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法の第９の例を示すフロー図で
ある。
るマトリックスの調製方法の第９の例を示すフロー図で
ある。
【図１５】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法の第１０の例を示すフロー図
である。
るマトリックスの調製方法の第１０の例を示すフロー図
である。
【図１６】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法において、可溶性複合体の一
例を示す図である。
るマトリックスの調製方法において、可溶性複合体の一
例を示す図である。
【図１７】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法において、可溶性複合体の一
例を示す図である。
るマトリックスの調製方法において、可溶性複合体の一
例を示す図である。
【図１８】 所定の抗原または抗体とリガンドを含有す
るマトリックスの調製方法において、可溶性複合体の一
例を示す図である。
るマトリックスの調製方法において、可溶性複合体の一
例を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 オルソラ・オー・アラバ アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 91104・パサデナ・エヌ・エル・モリノ・ アベニュー・1501 (72)発明者 チャールズ・エイ・カサル アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 91030・サウス・パサデナ・フェア・オー クス・アベニュー・1621
Claims (12)
- 【請求項１】 液体試料中のハプテンの濃度を測定する
方法であって、 （ａ）液相反応において、上記ハプテンに特異的な複数
の抗-ハプテンとの化学的結合が可能で、かつ液相中に
溶解されたマトリックスに、リガンドが結合されたもの
に、上記抗-ハプテンを介して、上記ハプテンが結合さ
れてなる可溶性複合体を形成すること； （ｂ）抗-リガンドを介して、上記可溶性複合体のリガ
ンドに結合された固体支持体と、上記ハプテンに結合し
た標識とを含む不溶化複合体を形成すること； （ｃ）上記不溶化複合体を洗浄すること； （ｄ）上記サンプル中の前記ハプテンの濃度の表示であ
る標識の存在を知るために、上記洗浄された不溶化複合
体を観測すること を順に含むことを特徴とする上記の方法。 - 【請求項２】 上記標識が酵素的標識、放射性標識、蛍
光性標識、化学発光性標識または生物発光性標識である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 上記マトリックスが、分子量が6,000〜8
0,000ダルトンの可溶性炭水化物または分子量が70,000
〜400,000ダルトンのフィコールであることを特徴とす
る請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 上記マトリックスがデキストランである
ことを特徴とする請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 上記マトリックスが分子量が5,000〜20
0,000の可溶性ポリマーまたはコポリマーであることを
特徴とする請求項１または２記載の方法。 - 【請求項６】 上記リガンドがアミノ酸コポリマーを介
して上記マトリックスに共有結合で結合されることを特
徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項７】 上記リガンドがアビジンであり、上記固
体支持体がアビジンで被覆されたチューブであり、ビオ
チンの添加により、可溶性複合体が前記アビジン被覆チ
ューブに効果的に固定化されることを特徴とする請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項８】 上記リガンドがビオチンであり、上記固
体支持体が抗アビジン抗体で被覆されたチューブであ
り、アビジンの添加により、可溶性複合体が前記抗アビ
ジン抗体被覆チューブに効果的に固定化されることを特
徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 上記リガンドがビオチンであり、上記固
体支持体がビオチニル化されたタンパク質で被覆された
チューブであり、アビジンの添加により、可溶性複合体
が前記抗アビジン抗体被覆チューブに効果的に固定化さ
れることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項１０】 上記リガンドがハプテンで、抗リガン
ドは抗ハプテンで、上記ハプテンはビオチン、フルオロ
セイン、およびジニトロフェノールから選ばれ、上記抗
ハプテンはアビジンと抗ビオチン、抗フルオロセイン、
および抗ジニトロフェノールから各々選ばれることを特
徴とする請求項１または２記載の方法。 - 【請求項１１】 上記リガンドが上記マトリックスに共
有結合され、上記特異的抗体または特異的抗原が化学的
に上記マトリックスに結合されることを特徴とする請求
項１または２記載の方法。 - 【請求項１２】 上記試料がハプテンを含み、かつ上記
可溶性複合体が、 上記可溶性複合体形成のために前記標識により標識化さ
れたハプテンプローブの存在化で、リガンドと特異的抗
ハプテンを含む前記マトリックスと、上記試料を液相中
で反応させ、次いで上記試料中の上記ハプテンと上記標
識化ハプテンプローブとの間で、上記マトリックス上の
抗ハプテン結合部位に対する結合を競合させ、次いで上
記不溶化複合体形成のために固体支持体上で、結果とし
て生じる上記可溶性複合体と固定化抗-リガンドとを反
応させ、次いで該不溶化複合体を洗浄し、次いで洗浄さ
れた不溶化複合体を標識のために観測することにより形
成されることを特徴とする請求項１または２に記載の方
法。
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