CZ308742B6 - Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů - Google Patents

Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů Download PDF

Info

Publication number
CZ308742B6
CZ308742B6 CZ2015-19A CZ201519A CZ308742B6 CZ 308742 B6 CZ308742 B6 CZ 308742B6 CZ 201519 A CZ201519 A CZ 201519A CZ 308742 B6 CZ308742 B6 CZ 308742B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
conjugate
tag
group
protein
proteins
Prior art date
Application number
CZ2015-19A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ201519A3 (cs
Inventor
Pavel Šácha
Šácha Pavel Mgr., Ph.D.
Jan Konvalinka
CSc. Konvalinka Jan doc. RNDr.
Jiří Schimer
Jiří Mgr. Schimer
Tomáš Knedlík
Tomáš Mgr. Knedlík
VladimĂ­r Ĺ ubr
CSc. Šubr Vladimír Ing.
Karel Ulbrich
DrSc. Ulbrich Karel prof. Ing.
Jiří Strohalm
Jiří Ing. Strohalm
Original Assignee
Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I.
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Univerzita Karlova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I., Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Univerzita Karlova filed Critical Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I.
Priority to CZ2015-19A priority Critical patent/CZ308742B6/cs
Priority to EP16706121.7A priority patent/EP3245513B1/en
Priority to CA2970845A priority patent/CA2970845C/en
Priority to SG11201705002SA priority patent/SG11201705002SA/en
Priority to US15/542,792 priority patent/US10114014B2/en
Priority to AU2016207125A priority patent/AU2016207125B2/en
Priority to PCT/CZ2016/050002 priority patent/WO2016112882A2/en
Publication of CZ201519A3 publication Critical patent/CZ201519A3/cs
Priority to IL253406A priority patent/IL253406B/en
Publication of CZ308742B6 publication Critical patent/CZ308742B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F220/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
    • C08F220/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

Řešení poskytuje makromolekulární konjugát pro selektivní interakci s proteiny, který obsahuje syntetický kopolymer, na nějž je kovalentní vazbou připojena alespoň jedna vazebná skupina a alespoň jedna další skupina vybraná z afinitní kotvy a reportérové skupiny. Makromolekulární konjugát je vhodný zejména pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro.

Description

PATENTOVÝ SPIS (11) Číslo dokumentu:
308 742 (19)
ČESKÁ REPUBLIKA
(21) Číslo přihlášky: 2015-19
(22) Přihlášeno: 14.01.2015
(40) Zveřejněno: (Věstník č. 30/2016) 27.07.2016
(47) Uděleno: 11.03.2021
(24) Oznámení o udělení ve věstníku: (Věstník ě. 16/2021) 21.04.2021
(13) Druh dokumentu: B6 (51)Int. Cl.:
C08F 220/18 (2006.01)
C07K 5/00 (2006.01)
C07K17/08 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/532 (2006.01)
ÚŘAD PRŮMYSLOVÉHO VLASTNICTVÍ (56) Relevantní dokumenty:
J.E: Gautrott et al.: Protein - Resistant NTA-Functionalized Polymer Brushes for Selective and Stable Immobilization of Histidine - Taged Proteins ACS Appl. Mater. Interfaces 2 (1), 193-202 (2010); V. Subr, K. Ulbrich: Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups Reactive & Functional Polymers 66, 1525-1538 (2006); B. Jeong, A. Gutowska: Lessons from nature: stimuli-responsive polymers and their biomedical applications TRENDS in Biotechnology, 20 (7), 305-311 (2002); K. Ulbrich, V. Subr: Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers Advanced Drug Delivery Reviews 62, 150-166 (2010); S.P.Cullen: Synthesis and Evaluation of Polymer Brushes and Crosslinked Thin Films as Scaffolds for Biomolecule Immobilization, University of WisconcinMadison 2008; H. Ding et al.: Two-step Fluorescence Screening of CD21-Binding Peptides with One-bead One-compound Library and Investigation of Binding Properties of HPMA Copolymer - Peptide Conjugate Biomacromolecules 7 (11) 3037-3046 (2006); C.J. Galvin, Jan Genzer: Application of surface grafted macromolecules derived from post-polymerization modification reactions Progress in Polymer Science 37, 871-906 (2012); D.Kim, A.E. Herr: Protein Immobilization for microfluidic assays Biomicrofluidics 7, 041501-47 (2013); M. Solovskij, E. Panarin: Polymer water-soluble derivatives of polypeptide antibiotic, gramicidin-S based on reactive copolymers of N-(2-hydroxypropyl)methacrylate Journal of Controlled Release 58, 1-8 (1999).
_______EP 2 362 220 Al; WO 01/94032 AL__________________________________________________________________________________________ (7 3 ) Maj itel patentu:
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.,
Praha 6, CZ
Ústav makromolekulám! chemie AV ČR, v. v. i.,
Praha 6, Břevnov, CZ
Univerzita Karlova, Praha 1, Staré Město, CZ (72) Původce:
Mgr. Pavel Šácha, Ph.D., Praha 17, CZ doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc., Praha 6, CZ
Mgr. Jih Schimer, Praha 8, CZ
Mgr. Tomáš Knedlík, Kopřivnice, CZ
Ing. Vladimír Šubr, CSc., Mělník, CZ prof. Ing. Karel Ulbrich, DrSc., Praha 4, CZ
Ing. Jih Strohalm, Praha 6, CZ (74) Zástupce:
HARBER IP s.r.o., Dukelských hrdinů 567/52,
170 00 Praha 7, Holešovice (54) Název vynálezu:
Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů (57) Anotace:
Řešení poskytuje makromolekulární konjugát pro selektivní interakci s proteiny, který obsahuje syntetický kopolymer, na nějž je kovalentní vazbou připojena alespoň jedna vazebná skupina a alespoň jedna další skupina vybraná z afinitní kotvy a reportérové skupiny. Makromolekulární konjugát je vhodný zejména pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro.
Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů
Oblast techniky
Předkládaný vynález popisuje syntetické makromolekulámí konjugáty umožňující izolaci, imobilizaci a vizualizaci rekombinantních proteinů označených purifikační značkou v biochemii, molekulární biologii a příbuzných vědách.
Dosavadní stav techniky
Rozvoj biochemických a molekulámě-biologických metod umožňujících relativně snadno produkovat velké množství rekombinantních proteinů ve velkých výtěžcích s sebou přinesl potřebu jejich snadné a zejména univerzální izolace a následné vizualizace. Následný vznik afinitních (purifikačních) značek (tagů) znamenal možnost izolovat, puntíkovat a vizualizovat různé proteiny vždy stejnou technologií, což znamenalo podstatné vylepšení metodologie produkce rekombinantních proteinů a zrychlení jejich izolace a purifikace.
Polyhistidinová sekvence (také značka či tag, zkráceně 6*His-tag) obsahující nejčastěji 6 histidinů, známá pod komerčním jménem His-tag, představuje pravděpodobně nejznámější a nej používanější takovouto značku. Sekvence 6/His-tag je poměrně specificky vázána komplexem obsahujícím chelatační sloučeninu s dvoj mocným kationtem niklu či kobaltu. Touto chelatační sloučeninou může být např. kyselina nitrilotrioctová (NTA), která se nejčastěji používá pro purifikaci proteinů označených polyhistidinovou sekvencí. Použitím sloučeniny obsahující více molekul nitrilotrioctové kyseliny, např. triNTA, lze afinitu dále zvýšit.
Pro detekci proteinů s polyhistidinovou sekvencí na Western blotu je třeba použít protilátku rozpoznávající tuto sekvenci. Citlivost mnoha komerčně dostupných protilátek proti polyhistidinové sekvenci není dostatečná pro kvantifikaci malých množství proteinů označených polyhistidinovou sekvencí. Vazba mezi protilátkou a polyhistidinovou sekvencí obecně nemusí být příliš silná, a proto může docházet k disociaci vzniknuvšího komplexu. Toto je problém zejména u metod vyžadujících velmi silnou vazbu pro imobilizaci proteinů označených polyhistidinovou sekvencí, jako jsou např. ELISA či povrchová plazmonová rezonance (SPR).
Glutathion-S-transferáza (GST) je enzym vázající glutathion a účastnící se detoxikačních procesů v organismu. GST může být exprimována ve fúzi s daným proteinem (GST-tag); tento fúzní protein je pak možné vázat pomocí nosiče s glutathionem. GST-tag je vedle His-tagu další široce používanou afinitní značkou pro purifikaci proteinů.
Molekuly protilátek jsou velké glykosylované proteiny s disulfidovými vazbami, a proto je produkce protilátek vázáná na eukaryotický expresní systém umožňující provádění zmíněných posttranslačních modifikací. Z tohoto důvodu je výroba protilátek finančně poměrně nákladná. Molekuly protilátek jsou navíc poměrně náchylné k degradaci: jakožto proteiny musejí být obecně uchovávány při snížené teplotě, příp. zamražené v alikvotech. Jejich opakované rozmrazování často vede ke ztrátě jejich schopnosti vázat daný antigen.
Polymery připravené homopolymerací A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) jsou biokompatibilní, neimunogenní a rozpustné ve vodě. Díky těmto vlastnostem se HPMA kopolymery využívají jako nosiče pro léčiva a zobrazovací sloučeniny, mající uplatnění zejména jako protinádorová léčiva [1-2], HPMA kopolymery jsou multivalentní makromolekuly, na které lze připojit různé nízkomolekulámí sloučeniny, např. fluorescenční sondy, radionuklidy či léčiva. Vedle těchto nízkomolekulámích látek mohou být HPMA kopolymery modifikovány i (glyko)proteiny, oligonukleotidy a polynukleotidy. Multivalence HPMA kopolymerů umožňuje
- 1 CZ 308742 B6 připojit jak molekuly pouze jediného typu, tak i kombinace různých typů s různými funkcemi [35]·
Předkládaný vynález popisuje makromolekulámí konjugáty kopolymerů schopné vizualizace, imobilizace a separace proteinů označených purifikační značkou.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje makromolekulámí konjugát syntetického kopolymerů s nízkomolekulámími funkčními sloučeninami (zde nazývány také jako funkční skupiny, tj. vazebná skupina, reportérova skupina a afinitní kotva; toto označení se vztahuje k jejich funkci ve výsledném konjugátu a nemá nic společného s tzv. chemickými funkčními skupinami). Kostra makromolekuly (konjugátu) je tvořena syntetickým kopolymerem, na který jsou kovalentní vazbou připojeny molekuly funkčních skupin: (a) alespoň jedné vazebné skupiny umožňující specifickou vazbu konjugátu na daný protein, a alespoň jedné (b) afinitní kotvy a/nebo (c) reportérové skupiny. Schéma popisovaného konjugátu je uvedeno na obr. 1.
Je výhodné, když jsou syntetické kopolymery vodorozpustné.
Příprava syntetického kopolymerů byla popsána již dříve [5-6]; polymemí konjugáty jsou připraveny z polymemích prekurzom, které obsahují monomery:
kde: R1 je vybráno z H, CH3; a
R2 je vybráno z NH2, NH-CH2-CH(OH)-CH3, NH-CH3, NH-CH2CH3, NH-CH2CH2-OH, NHCH2CH2CH2-OH, NHC(CH2OH)3, NH-CH2CH2-N (CH3)3C1-, O-CH2CH2-OH, O-(CH2CH2O)2-H
O-(CH2CH2O)3-H, O-CH2CH2-NÁCH3)3C1-NH-(CH2)3NÁCH3)2-(CH2)2-COO a alespoň jeden typ monomerů vzorce 2:
(2) kde: R1 je vybráno z H, CH3; a
X je vybráno z NH-(CH2)2-CO, NH-(CH2)3-CO, NH-(CH2)4-CO, NH-(CH2)5-CO, Gly, GlyGly, GlyPheLeuGly; a
R3 je vybráno z:
-2 CZ 308742 B6
(R3 představuje reaktivní skupinu).
Obsah reaktivních skupin (tj. obsah monomeru vzorce 2) v kopolymerů je s výhodou v rozmezí 0,5 až 30 % mol., výhodněji 2 až 20 % mol.
V polymemím konjugátu je alespoň jedna reaktivní skupina R3 kopolymerů nahrazena vazebnou skupinou, alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena afmitní kotvou a/nebo alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena reportérovou skupinou. S výhodou je uvedenými skupinami nahrazena více než j edna reaktivní skupina R3. Výhodněj i j e uvedenými skupinami nahrazeno více než 50 % reaktivních skupin R3, ještě výhodněji 100 % reaktivních skupin R3. Reaktivní skupiny zbývající v polymemím řetězci po konjugaci jsou vždy nahrazeny l-aminopropan-2-ol skupinou.
Jako základní kopolymer je možno s výhodou použít kopolymer HPMA, tj. poly(HPMA-co-Maβ-Ala-TT); kopolymer připravený klasickou radikálovou roztokovou kopolymerací nebo řízenou radikálovou kopolymerací (např. RAFT-kopolymerací, reversible addition-fragmentation chaintransfer) A-(2-hydroxypropyl)methak ryl amidu (HPMA) a 3-(3methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionu (Ma-β-Ala-TT). Obsah HPMA je s výhodou v rozmezí 70 až 98 % mol, obsah reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin je 2 až 30 % mol.
Funkční skupiny jsou připojené k polymemímu řetězci přes amidovou vazbu, jež vznikne reakcí aminoskupiny přítomné na molekule funkční sloučeniny, tj. prekurzoru vazebné skupiny, afmitní kotvy nebo reportérové skupiny, a reaktivní skupiny (s výhodou thiazolidin-2-thionové) přítomné na polymemím řetězci.
Molekulová hmotnost konjugátu je s výhodou v rozmezí 1000 až 500 000 g/mol, s výhodou v rozmezí 20 000 až 150 000 g/mol.
Vazebnou skupinou je nízkomolekulámí látka zajišťující specifickou vazbu celého konjugátu na určitý protein; specifita cílení konjugátu je dána vlastnostmi této vazebné skupiny. Jako vazebné skupiny byly vybrány sloučeniny vázající některou z komerčně dostupných proteinových (purifikačních) značek (tagů), jako je např. kyselina nitrilotrioctová (NTA) pro vazbu polyhistidinového tágu (His-tag) či redukovaná forma glutathionu pro vazbu glutathion-Stransferázy (GST-tag). Obdržený konjugát je pak použitelný proti libovolným proteinům, jenž obsahují tuto proteinovou značku.
Sloučeniny vázající His-tag jsou obecně komplexy iontů a chelatačních činidel; mezi nejčastěji používaná chelatační činidla patří kyselina iminodioctová (IDA), kyselina nitrilotrioctová (NTA) a karboxylmethylaspartát (CMA), nebo triNTA skupina, která je derivátem odvozeným od NTA; použití vícenásobných komplexů zvyšuje afinitu těchto sloučenin k His-tagu. Nejčastěji používané komplexy jsou Ni-IDA, Ni-NTA, Co-CMA. Dle vlastností studovaného proteinu je možné použít jak nativní podmínky, tak denatumjící podmínky pro purifikaci (např. v koncentrované močovině). Po navázání proteinu na konjugát obsahující komplexy vázající His-tag je možné eluovat tento protein z nosiče pomocí roztoku imidazolu.
Glutathion (GSH) zajišťuje vazbu proteinů produkovaných ve fúzi s glutathion-S-transferázou (GST). Po navázání fúzního proteinu na konjugát s glutathionem je možné eluovat tento protein z nosiče pomocí roztoku volného glutathionu.
Vazebná skupina může být na syntetický kopolymer připojena prostřednictvím flexibilní spojky, například spojky na bázi (oligo)polyethylenglykolu, peptidu, nukleové kyseliny či oligosacharidu. Spojka umožňuje vazbu vazebné skupiny na cílový protein tak, aby nedocházelo ke sterickému bránění interakce připojeného ligandu s dalšími molekulami. S výhodou je spojka vybrána ze skupiny zahrnující spojky na bázi polyethylenglykolu, peptidu, s výhodou peptidu o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol, nebo nukleové kyseliny, s výhodou nukleové kyseliny obsahující 1 až 40 nukleotidů, nebo oligosacharidu, s výhodou oligosacharidu obsahujícího 1 až 40 monosacharidů.
Afmitní skupinou může být např. biotin: díky velmi silné interakci biotinavidin/streptavidin/neutravidin je konjugát snadno imobilizovatelný na nosiči na bázi Streptavidin Sepharózy. Díky velmi silné vazbě biotin-avidin/streptavidin/neutravidin (Kd ~ 10“15), je prakticky vyloučena disociace konjugátu z nosiče. Přes biotin je možné vázat ha konjugát další proteiny konjugované se streptavidinem (chemicky či genetickou fúzí). Toho se dá využít např. v metodě ELISA (vazba neutravidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou).
Mimo biotin může být afmitní kotvou také FLAG tag (sekvence DYKDDDDK rozpoznávaná protilátkou), His-tag (polyhistidinová sekvence vázaná chelatovaným niklem; nikoliv však v případě konjugátu vážícího His-tag), hemaglutininový tag (HA-tag, sekvence aminokyselin YPYDVPDYA odvozená od povrchového glykoproteinu chřipkového viru hemaglutininu, rozpoznávaná protilátkou), Strep-tag (oktapeptidová sekvence WSHPQFEK vázaná modifikovaným streptavidinem - Strep-Tactinem), Avi-Tag (peptidová sekvence rozpoznávaná biotinligasou, biotinylace umožňuje následnou izolaci pomocí streptavidinu), GST (glutathion-Stransferáza; enzym vázající glutathion), c-myc-tag (peptidová sekvence EQKLISEEDL rozpoznávaná protilátkou), V5-tag (peptidová sekvence GKPIPNPLLGLDST rozpoznávaná protilátkou), E-tag (peptidová sekvence GAPVPYPDPLEPR rozpoznávaná protilátkou), S-tag (peptidová sekvence KETAAAKFERQHMDS rozpoznávaná protilátkou), SBP-tag (delší peptidová sekvence vázaná streptavidinem), poly(Glu)-tag (polyglutamátová sekvence, např. hexaglutamát, vázající se na aniontové iontoměniče), kalmodulinový tag (delší peptidová sekvence vázaná kalmodulinem) či jiná sloučenina schopná imobilizace na pevnou fázi.
Reportérovou skupinou může být fluorofor, s výhodou s excitačním maximem v rozmezí 350 až 850 nm, např. fluorofor ATT0488 nebo DY676, umožňující vizualizaci polymeru a proteinů či buněk, na které je konjugát navázán. Díky tomu je možné konjugát použít v metodách jako jsou, např. průtoková cytometric (a odvozená technika FACS; Fluorescence-activated cell sorting; separující buňky na základě jejich fluorescence při dané vlnové délce) či imunocytochemie a imunohistochemie. Pro detekci proteinů na Western blotu (pomocí systémů zachycujících fluorescenci, jako je např. systém Odyssey CLx) je možné s výhodou použít fluorofor s emisí záření ve vzdáleně červené či blízce infračervené oblasti spektra (far-red fluorescence či near-infrared fluorescence), jelikož použití záření s delší vlnovou délkou výrazně snižuje autofluorescenci a rozptyl světla.
V jiném provedení vynálezu může reportérovou skupinou být komplex kovu, např. lanthanoidu (zejména Gd, Mn, příp. Dy, Eu). V dalším provedení může reportérovou skupinou být komplex radionuklidu, např. vybraného ze skupiny zahrnující 64Cu, 68Ga, 18F. V jiném provedení může být reportérovou skupinou také komplex radionuklidu vybraného ze skupiny 99mTc, 1231, 1251, 1311, 57Co, 51Cr, 67Ga, 64Cu, inIn, 90Y. Ligandy vhodné pro komplexaci uvedených kovů jsou dobře známy v oboru, například makrocyklické ligandy, deriváty cyklopentadienylu, fosfmové a azinové ligandy.
Předkládaný vynález má oproti v současnosti používaným protilátkám několik výhod. Příprava polymemích konjugátu je poměrně snadná a nepříliš nákladná. Polymemí kostra, díky
-4 CZ 308742 B6 neproteinovému charakteru molekuly, zaručuje zvýšenou chemickou stabilitu, což umožňuje nejenom použití v nefýziologických podmínkách, ale i velmi snížené nároky na uchovávání a manipulaci. Mnohonásobná přítomnost NTA skupin na triNTA konjugátu pak vede ke zvýšení afinity a pevnější vazbě tohoto konjugátu k His-tagu.
V příkladech této patentové přihlášky byla pomocí několika běžných biochemických a molekulámě-biologických metod testována funkčnost připravených konjugátu:
Western blot je imunologická metoda umožňující selektivní detekci daného proteinu na membráně po přenesení z gelu po provedení SDS-PAGE elektroforézy dělicí proteiny dle jejich velikosti. V konkrétním provedení vynálezu je použit konjugát obsahující derivát kyseliny nitrilotrisoctové (triNTA), který se (po navázání nikelnatých kationtů) váže na polyhistidinovou sekvenci (His-tag). Po přenesení proteinů na membránu (mokrý blot: 100 V/l hod) jsou nejprve neobsazená místa na membráně blokována 1% roztokem kaseinu v PBS a poté je membrána inkubována 1 hod při laboratorní teplotě s roztokem polymemího konjugátu s triNTA rozpoznávající studovaný protein s His-tagem (koncentrace konjugátu je v rozmezí 100 nM až 100 pM). Po inkubaci a následném promytí je membrána inkubována v roztoku Neutravidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou (ředění 1:2500) vázajícím biotin přítomný na polymemím konjugátu. Množství daného proteinu je poté stanoveno chemiluminiscenčně, popř. fluorescenčně (pomocí fluoroforu přítomném na konjugátu; není pak nutné přidávat Neutravidin).
Imunoprecipitace (resp. pulldown, tj. analogická metoda k imunoprecipitaci používající jiné látky než protilátky) spočívá v imobilizaci polymemího konjugátu na pevnou fázi, např. streptavidin sepharózu. Poté je nosič inkubován se vzorkem obsahujícím protein rozpoznávaný konjugátem. Po promytí nosiče je daný protein z nosiče uvolněn, např. změnou pH, změnou iontové síly, zahřátím v přítomnosti SDS apod. Jinou možností je nejprve inkubovat spolu vzorek s konjugátem a vzniknuvší komplex konjugát-protein separovat ze vzorku pomocí streptavidin sepharózy.
Měření povrchové plazmonové rezonance (SPR) je biofýzikami technika analyzující průběh vazby (a následně pak sílu této vazby) dvou interagujících látek. V prvním uspořádání, kdy je na zlatém čipu biosenzoru imobilizován daný protein a poté je analyzována vazba konjugátu na tento protein, je možné stanovit disociační konstantu pro vazbu protein-konjugát. V druhém uspořádání, kdy je polymemí konjugát použit pro imobilizaci daného proteinu na povrch biosenzoru, je možné analyzovat vazbu mezi daným proteinem a další látkou.
ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) je imunologická metoda, jež ve svém sendvičovém uspořádání se dvěma různými látkami umožňuje kvantifikaci daného proteinu. Nejprve je primární protilátka proti danému proteinu sorbována na povrch destičky a neobsazený povrch destičky je zablokován roztokem kaseinu. Poté je přidán vzorek se stanovovaným proteinem a po jeho navázaní na protilátku je přidán polymemí konjugát vázající tento protein. Navázaný konjugát je stanoven pomocí Neutravidinu (konjugovaného s křenovou peroxidázou) vázajícího biotin přítomný na konjugátu. Mimo tento způsob stanovení konjugátu (chemiluminiscenčně) je možné konjugát stanovit i fluorescenčně pomocí fluoroforu přítomném na konjugátu. Alternativně k výše uvedenému postupu metody ELISA lze taktéž imobilizovat i polymemí konjugát vazbou na neutravidin/streptavidin sorbovaný na povrch destičky (skrze vazbu biotin-streptavidin). Po vazbě stanovovaného proteinu je přidána biotinylovaná primární protilátka proti danému proteinu, která je poté stanovena opět pomocí Neutravidinu (konjugovaného s křenovou peroxidázou) vázajícího biotin přítomný na protilátce. Biotin přítomný na konjugátu tak lze použít jak pro imobilizaci, tak i pro detekci, naopak fluorofor pouze pro detekci.
Konjugáty jsou navrženy pro izolaci, vizualizaci či imobilizaci rekombinantních proteinů v biochemických a molekulámě-biologických metodách, jako jsou např. ELISA, imunoprecipitace (resp. pull-down v případě použití látky neprotilátkového charakteru), Western blot, povrchová
- 5 CZ 308742 B6 plazmonová rezonance a další. Zároveň je možné využít imobilizace proteinů pro testování sloučenin vážících se na tyto proteiny.
Objasnění výkresů
Obr. 1 zobrazuje schématickou strukturu polymemích konjugátu.
Obr. 2 zobrazuje strukturu sloučeniny A určené k cílení proteinové značky His-tag.
Obr. 3 zobrazuje strukturu konjugátu 1 určeného k cílení proteinů se značkou His-tag.
Obr. 4 zobrazuje strukturu konjugátu 2 určeného k cílení proteinů se značkou His-tag.
Obr. 5 zobrazuje strukturu konjugátu 3 bez vazebné skupiny (negativní kontrola).
Obr. 6 zobrazuje strukturu konjugátu 4 bez vazebné skupiny (negativní kontrola).
Obr. 7 zobrazuje Western blot s rekombinantním purifikovaným proteinem Miz chřipkového viru označeným značkou His-tag (Ml-HisTag), jenž byl vizualizován pomocí komerční protilátky proti značce His-tag a pomocí konjugátu 1. Dráha 1: Ml-HisTag (10 ng); 2: Ml-HisTag (5 ng); 3: MlHisTag (1 ng); 4: Ml-HisTag (0,5 ng); 5: All blue marker (2 ul); 6: Ml-HisTag (0,1 ng); 7: MlHisTag (0,5 ng); 8: Ml-HisTag (1 ng); 9: Ml-HisTag (5 ng); 10: Ml-HisTag (10 ng).
Obr. 8 zobrazuje Western blot s bakteriálním lyzátem obsahujícím poly(A)-polymerázu z E. coli označenou značkou HisTag (PAP-HisTag), jenž byl vizualizován jednak pomocí komerční protilátky proti značce His-tag a jednak pomocí konjugátu 1 a konjugátu 2. Dráha 1: bakteriální lyzát (10 μΐ); 2: bakteriální lyzát (5 μΐ); 3 bakteriální lyzát (1 μΐ); 4: All blue marker (2 μΐ); 5: bakteriální lyzát (10 μΐ); 6: bakteriální lyzát (5 μΐ); 7: bakteriální lyzát (1 μΐ); 8: All blue marker (2 μΐ); 9: bakteriální lyzát (10 μΐ); 10: bakteriální lyzát (5 μΐ); 11: bakteriální lyzát (1 μΐ).
Obr. 9A zobrazuje afmitní izolaci (pull-down) proteinu obsahujícího značku His-tag (NEDD8HisTag) pomocí konjugátu 1 za nativních podmínek. Proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE elektroforézy a gel byl obarven stříbrem. Dráha 1: NEDD8-HisTag (500 ng); 2: konjugát 1 (25 pg); 3: All Blue Marker (2 μΐ); 4: Load; 5: FT: konjugát 1; 6: FT: konjugát 3; 7: FT: konjugát 4; 8: FT: kontrola bez polymeru; 9: Eluce: konjugát 1; 10: Eluce: konjugát 3; 11: Eluce: konjugát 4; 12: Eluce: kontrola bez polymeru. Do všech drah jednotlivých frakcí bylo naneseno 5 μΐ vzorku.
Obr. 9B zobrazuje afmitní izolaci (pull-down) proteinu obsahujícího značku His-tag (NEDD8HisTag) pomocí konjugátu 1 za denaturujících podmínek. Proteiny byly rozděleny pomocí SDSPAGE elektroforézy a gel byl obarven stříbrem. Dráha 1: NEDD8-HisTag (500 ng); 2: Load; 3: FT: konjugát 3; 4: FT: konjugát 4; 5: FT: konjugát 1; 6: FT: kontrola bez polymeru; 7: Eluce: konjugát 3; 8: Eluce: konjugát 4; 9: Eluce: konjugát 1; 10: Eluce: kontrola bez polymeru. Do všech drah jednotlivých frakcí bylo naneseno 5 μΐ vzorku.
Obr. 10 zobrazuje afmitní izolaci (pull-down) proteinu obsahujícího značku His-tag (DdilHisTag) z bakteriálního lyzátu pomocí konjugátu 1. Proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE elektroforézy a gel byl obarven stříbrem. Dráha 1: All blue marker (2 μΐ); 2: volná dráha; 3: Load; 4: volná dráha; 5: Eluce: konjugát 1; 6: Eluce: konjugát 3; 7: Eluce: kontrola bez polymeru. Do všech drah jednotlivých frakcí bylo naneseno 5 μΐ vzorku.
Obr. 11 zobrazuje strukturu sloučeniny B určené k cílení proteinové značky GST-tag.
Obr. 12 zobrazuje strukturu konjugátu 5 určeného k cílení proteinů se značkou GST-tag.
-6CZ 308742 B6
Obr. 13 zobrazuje strukturu konjugátu 6 určeného k cílení proteinů se značkou GST-tag.
Příklady uskutečnění vynálezu
Všechny použité chemikálie pocházely od firmy Sigma-Aldrich, není-li uvedeno jinak. Všechny sloučeniny testované v biologických esejích byly vyčištěny pomocí preparativního HPLC systému Waters Delta 600 (průtok 7 ml/min; gradient zobrazený pro každou sloučeninu, včetně retenčních časů) s kolonou Waters SunFire C18 OBD Prep Column, 5 pm, 19x150 mm. Čistota sloučenin byla ověřena na analytickém HPLC systému Jasco PU-1580 HPLC (průtok 1 ml/min, s konstantním gradientem 2 až 100 % acetonitrilu ve 30 min; retenční čas zobrazen pro každou sloučeninu) s kolonou Watrex C18 Analytical Column, 5 pm, 250x5 mm. Finální sloučeniny byly minimálně 99% čistoty a jejich struktura byla dále potvrzena pomocí HR-MS na LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) a pomocí NMR (Bruker Avance I™ 500 MHz vybavený kryo-sondou). Všechny uvedené interakční konstanty jsou v Hz.
Příklad 1: Příprava sloučeniny A
Sloučenina A byla připravena podle následujícího schématu:
a) 1) DCC, DMF; 2) TFA
-7 CZ 308742 B6 (1) Sloučenina Ao
Sloučenina Ao, NH2-triNTA(o-tBu)9: Syntéza sloučeniny Ao byla provedena podle publikovaného postupu [7], s malou odchylkou v jednom kroku: v reakci mezi derivátem trikarboxylové kyseliny (odvozené od lysinu) a třemi monomery nitrilotrioctové kyseliny byl jako aktivační činidlo použit AA/V',/V-tetramethyl-O-(/V-sukcinimidyl)uronium tetrafluoroborát (TSTU) namísto NHS/EDC, jelikož TSTU poskytovalo výrazně vyšší výtěžky.
(2) Sloučenina A
Sloučenina A, NH2-PEG5-triNTA: Sloučenina Ao (52 mg, 38 pmol, 1,0 ekv., vyčištěna pomocí HPLC před tímto krokem) byla rozpuštěna v 1 ml DMF, kam bylo následně v jednom kroku přidáno 15 mg (38 pmol, 1,0 ekv.) linkeru Boc-O2Oc-O2Oc-OH (Iris-Biotech, #BAA1485). Do reakční směsi bylo dále přidáno 16 mg (76 pmol, 2,0 ekv.) DCC a reakce byla ponechána reagovat 24 h při pokojové teplotě. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno a surová směs byla smíchána s 1 ml čisté TFA; reakční směs byla následně střídavě míchána a sonikována ve vodní lázni 3 h. TFA byla odstraněna plynným dusíkem a konečný produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient: 2 až 30 % ACN v 50 min, R/ = 35 min). Hmotnost získaného čistého produktu byla 4 mg (výtěžek = 32 %).
Analytické HPLC (gradient 2 až 100 %, 30 min) RT = 12,0 min. HR-MS (ESI+): spočítáno pro C43H71O27N10 [M]+1159,44846. Nalezeno 1159,44849.
Příklad 2: Příprava konjugátu 1 (1) Příprava polymemího prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT)
Monomemí sloučeniny N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (Ma-P-Ala-TT) byly připraveny podle publikovaného postupu [1, 5], Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven pomocí RAFTkopolymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). V 7,3 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 1,0 g HPMA (85 % mol) a k roztoku bylo přidáno 318 mg Ma-P-Ala-TT (15 %mol) rozpuštěného v 1,9 ml DMSO, 2,42 mg 2-kyano-2-propylbenzodithioátu a 0,90 mg 2,2'-azobis(2methylpropionitrilu) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 70 °C (16 h). Polymemí prekurzor byl izolován vysrážením do směsi acetomdiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Koncové dithiobenzoátové skupiny byly odstraněny podle dříve publikovaného postupu [8],
Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 81 600 g/mol, polydisperzitou D = 1,18 a obsahující 14,6 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových (TT) skupin.
(2) Příprava konjugátu 1
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,040 g, Mw = 81 600 g/mol, 14,6% mol TT), sloučenina A (6,0 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (5 mg) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán Λζ/V-diisopropylethylamin (DIPEA) (8,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán 1amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 1 poly(HPMA-co-Ma-p-Ala-sloučeninaA-co-Ma-p-Ala-ATT0488-co-Ma-p-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi acetondiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích
- 8 CZ 308742 B6 příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 1 byl 22 mg. Obsah ATT0488 4,17 % byl stanoven spektrofotometricky (s502nm = 90 000 l.mol-1.cm-1, destilovaná voda) a obsah inhibitoru 11,28% byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
(3) Příprava konjugátu 3 (srovnávací konjugát sloužící jako negativní kontrola)
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) pro přípravu konjugátu 3 byl připraven RAFT-kopolymerací podle postupu popsaného v příkladu 2 (viz výše), s použitím následujícího složení polymerizační směsi: v 3,8 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 500 mg HPMA (85 % mol), 159 mg Ma-P-Ala-TT (15 %mol) rozpuštěného v 0,8 ml DMSO, 1,21 mg 2-kyano-2propylbenzodithioátu, 0,45 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitrilu). Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 85 900 g/mol, polydisperzitou D = 1,22 a obsahující 13,4 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin.
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,045 g, Mw = 85 900 g/mol, 13,4 %mol TT) a 5 mg biotinu-NH2 bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (2,5 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 3 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-ATT0488-co-Ma-P-Ala-NHbiotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl čištěn na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 3 byl 32 mg, obsah ATT0488 5,1 % a obsah biotinu 10,8 %.
Příklad 3: Příprava konjugátu 2 (1) Příprava konjugátu 2
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,030 g, Mw = 81 600 g/mol, 14,6 % mol TT; viz Příprava konjugátu 1), sloučenina A (3,5 mg) a N-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (4 mg) byly rozpuštěny v 0,3 ml DMSO. Poté byl přidán W-diisopropylcthylamin (DIPEA) (4,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (2 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 2 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-sloučeninaA-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton.-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 2 byl 21 mg. Obsah biotinu 5,53 % byl stanoven pomocí kitu HABA/Avidin (Sigma) a obsah inhibitoru 10,43 % byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N-HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
(2) Příprava konjugátu 4 (srovnávací konjugát sloužící jako negativní kontrola)
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) pro přípravu konjugátu 4 byl připraven RAFT-kopolymerací podle postupu popsaného v příkladu 2 (viz výše), s použitím následujícího složení polymerizační směsi: 500 mg of HPMA (90 % mol), 100 mg Ma-P-Ala-TT (10 %mol), 4,29 mg 2-kyano-2-propylbenzodithioátu, 1,59 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitrilu) a 4,5 ml terc-butanolu. Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s
-9CZ 308742 B6 molekulovou hmotností Mw = 26 000 g/mol, polydisperzitou D = 1,07 a obsahující 10,4 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin.
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,04 g, Mw = 26 600 g/mol, 10,4 % mol TT) byl rozpuštěn v 0,25 ml DMSO, k roztoku bylo přidáno 5 mg biotin-NH2. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (3,0 μΐ). Látky byly spolu ponechány reagovat po dobu 4 h pň teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ). Polymemí konjugát 4 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) byl izolován srážením do směsi acetondiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethyletheru, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 4 byl 28 mg a obsah biotinu 6,4 %.
Příklad 4: Vizualizace proteinů nesoucích značku His-tag pomocí Western blotu s využitím konjugátu 1 a 2
Konjugát 1 a konjugát 2 (30 μΜ, 100 μΐ) byly před použitím nejprve inkubovány 1 h při teplotě místnosti v přítomnosti 94mM chloridu nikelnatého (tj. ve lOOnásobném molámím přebytku nikelnatých kationtů vůči NTA skupinám) pro obsazení vazebných skupin nikelnatými kationty. Poté byly nenavázané kationty odstraněny dialýzou pomocí Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10 kDa MWCO). Dialýza probíhala při teplotě místnosti nejprve 3 h proti 5 1 destilované vody a poté 12 h proti 3 1 TBS.
Různá množství (0,1 až 10 ng) vyčištěného rekombinantního proteinu Miz chřipkového viru označeného značkou His-tag (Ml-HisTag) byla nanesena na SDS-PAGE elektroforézu; po provedení elektroforézy byl gel následně přeblotován na membránu (mokrý blot: 100 V/60 min). Povrch membrány byl poté blokován pomocí 1,1% (hmotn./obj.) roztoku kaseinu v PBS (Casein Buffer 20X-4X Concentrate, SDT) při teplotě místnosti po dobu 1 hod. Pro vizualizaci proteinu Ml-HisTag byla membrána inkubována při teplotě místnosti 1 h S 5nM konjugátem 1 v PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST), či protilátkou proti značce His-tag konjugovanou s křenovou peroxidázou (Sigma, #A7O58-1VL; 1:2000 v PBST). Poté byly bloty (inkubované v roztoku konjugátu 1) omyty třikrát PBST a inkubovány 1 h s NeutrAvidinem konjugovaným s křenovou peroxidázou (Thermo Scientific, #31001; 1:2500 v PBST). Nakonec byly bloty omyty třikrát PBST a na membránu byl nanesen chemiluminiscenční substrát SuperSignal West Classico/Dura/Femto Chemiluminescent Substráte (Thermo Scientific). Chemiluminiscence byla zaznamenána pomocí ChemiDoc-ItTM 600 Imaging System (UVP).
Při porovnání citlivosti detekce rekombinantního čištěného proteinu Ml-HisTag pomocí 5nM konjugátu 1 a komerční protilátky (obr. 7) je zřejmé, že způsob detekce s použitím konjugátu 1 je citlivější než s použitou protilátkou (přibližně 5krát) a má tedy i nižší limit detekce (100 pg vs. 500 pg).
Nespecifická reaktivita konjugátu 1 a konjugátu 2 na Western blotu byla testována s použitím bakteriálního lyzátu obsahujícího poly(A)-polymerázu z E. coli označenou značkou His-tag (PAPHisTag) (obr. 8).
Příklad 5: Afinitní izolace (pull-down) proteinu NEDD8 nesoucího značku His-tag (NEDD8HisTag) pomocí konjugátu 1
Afinitní izolace proteinu NEDD8-HisTag byla provedena jak za nativních podmínek v 20mM TrisHC1, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,4 (TBST), tak za denaturujících podmínek v 8M močovině, 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH 7,4.
Konjugát 1, konjugát 3 a konjugát 4 (tj. negativní kontroly zobrazující nespecifickou vazbu; jako čtvrtý vzorek byl použit pouze čistý nosič bez žádného přidaného konjugátu) byly předvázány na 20 μΐ Streptavidin Sepharózy (200nM roztok v 1000 μΐ TBST, obsahující ImM NiCh, 1 h, 6 °C).
- 10CZ 308742 B6
Po promytí 3 χ 1000 jal TBST byl nosič smíchán s 1000 μΐ roztoku NEDD8-HisTag (5 ng/μΐ; buď za nativních či denaturujících podmínek) a inkubován při 6 °C po dobu 3 h. Nosič byl poté promyt 3x1000 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 50 μΐ vzorkového pufru pro SDSPAGE a zahřátím na 98 °C po dobu 10 min.
Protein NEDD8-HisTag byl úspěšně izolován pomocí konjugátu 1 jak za nativních podmínek (obr. 9A), tak za denaturujících podmínek (obr. 9B). Jednotlivé negativní kontroly (konjugát bez inhibitoru; konjugát bez inhibitoru a ATT0488; prázdný nosič Streptavidin Sepharóze) prokázaly, že vazba NEDD 8-HisTag se děje specificky přes sloučeninu A s NTA skupinami.
Příklad 6: Afinitní izolace (pull-down) proteinu Ddil nesoucího značku His-tag (Ddil-HisTag) z bakteriálního lyzátu pomocí konjugátu 1
Afinitní izolace proteinu Ddil (DNA damage-inducible protein 1) označeného značkou HisTag (Ddil-HisTag) byla provedena pomocí konjugátu 1 z bakteriálního lyzátu obsahujícího protein Ddil-HisTag (obr. 10).
Konjugát 1, konjugát 3 (tj. negativní kontrola zobrazující nespecifickou vazbu; jako třetí vzorek byl použit pouze čistý nosič bez žádného přidaného konjugátu) byly předvázány na 30 μΐ Streptavidin Agarózy (200nM roztok v 1000 μΐ TBST, 1 h, obsahující ImM NiCE). Po promytí 3x1000 μΐ TBST byl nosič smíchán s 1000 μΐ roztoku Ddil-HisTag a inkubován při pokojové teplotě po dobu 1 h. Nosič byl poté promyt 3x 1000 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 30 μΐ 250 mM imidazolu a inkubací 30 min.
Protein Ddil-HisTag byl úspěšně izolován pomocí konjugátu 1 z bakteriálního lyzátu (obr. 10). Eluční frakce obsahovala vedle proteinu Ddil-HisTag i dva další proteiny: přítomnost jednoho (~15 kDa) byla dána nespecifitou triNTA skupiny, druhého (~22 kDa) pak vazbou tohoto proteinu na nosič Streptavidin Agaróza.
Příklad 7: Imobilizace rekombinantního lidského proteinu GCPII nesoucího značku His-tag (HisrhGCPII) a následné testování inhibiční potence inhibitorů GCPII
Do 96jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo na dno jamek naneseno 10 μΐ roztoku streptavidinu (o koncentraci 10 ng/μΐ) ve lOOmM borátovém pufru, pH 9,5 a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 h. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Neobsazený povrch jamky byl zablokován 0,55% (hmotn./obj.) roztokem kaseinu v TBS (Casein Buffer 20X4X Concentrate, SDT, 24 h). Po dalším promytí 3x 200 μΐ TBST byl na streptavidin navázán konjugát 2 nebo 4 (lOOnM v TBST, obsahující ImM NiCh, 2 h). Nenavázané konjugáty byly odmyty promytím 3x 200 μΐ TBST a následně byl do jamek přidán roztok rekombinantní HisrhGCPII v TBST (10 ng/jamku, 1 h, připravena podle [9]). Po promytí 3 χ 200 μΐ TBST byla přidána buď samotná detekční sonda ssPSMA (InM v TBST) vázající se do aktivního místa His-rhGCPII nebo směs této sondy a zvolené testované látky o zvolené koncentraci (typicky 100μΜ v TBST). Po inkubaci 1 h při teplotě místnosti byly jamky promyty 5x 200 μΐ TBST a množství navázané detekční sondy bylo poté stanoveno pomocí qPCR. Ze změny množství navázané sondy v jamkách inkubovaných s testovanou látkou oproti jamkám inkubovaným se samotnou sondou byla vypočtena frakce aktivních míst His-rhGCPII obsazených danou testovanou látkou a následně inhibiční konstanta této látky (podrobný popis detekční sondy ssPSMA a postupu výpočtu inhibiční konstanty je uveden v české patentové přihlášce PV 2014-527).
Pomocí tohoto postupu bylo možné určit inhibiční konstantu testovaného inhibitoru pomocí měření vzorku v jediné jamce; tato metoda byla použita pro změření dvaceti inhibitorů a získané hodnoty Ki odpovídaly hodnotám Ki obdrženým pomocí měření enzymové kinetiky His-rhGCPII.
V této patentové přihlášce byly popsány konjugáty obsahující sloučeniny založené na kyselině nitrilotrisoctové (NTA) vázající polyhistidinovou sekvenci (His-tag), jež je používána jako
- 11 CZ 308742 B6 purifikační a vizualizační značka u velké části rekombinantně připravovaných proteinů. Díky vazbě NT A na His-tag je tedy možné používat tyto konjugáty univerzálně na všechny proteiny nesoucí tuto afinitní značku. Pomocí SPR byla určena disociační konstanta vazby konjugátu na His-tag. Dále byly konjugáty použity pro izolaci a purifikaci proteinů s His-tag, jak v nativních, tak denaturujících podmínkách. Při použití konjugátu v metodě Western blot bylo možné detekovat velmi malá množství proteinů přenesených na membránu po SDS-PAGE elektroforéze. Limit detekce na Western blotu pomocí 5nM roztoku konjugátu 1 byl okolo 100 pg. Konjugát byl dále použit pro imobilizaci proteinů s His-tag v esejích odvozených od metody ELISA (v sendvičovém uspořádání), kdy jsou proteiny po imobilizaci přes His-tag inkubovány v přítomnosti testované látky a svého známého ligandu/inhibitoru (či obecně látky vázající se na tento protein), čímž bylo možné určit sílu vazby testovaných látek s daným proteinem a tím jejich inhibiční potenci.
Příklad 8: Příprava sloučeniny B
Sloučenina B byla připravena podle následujícího schématu:
a) Boc2O, THF/H2O; 1) TCEP, H2O, 2) Mal-PEG4-NHS, H2O/MeOH; c) ethylendiamin MeOH (1) Sloučenina Bo
- 12CZ 308742 B6
Kyselina (2S,2'S)-5,5'-(((2R,2'R)-disulfandiylbis(l-((karboxymethyl)amino)-l-oxopropan-3,2diyl))bis(azandiyl))bis(2-amino-5-oxopentanová), sloučenina Bo: 150 mg oxidovaného glutathionu (0,24 mmol, 1,0 ekv.) bylo rozpuštěno ve 3 ml vody a do roztoku bylo přidáno 111 mg Boc-anhydridu (0,50 mmol, 2,05 ekv.) rozpuštěného ve 3 ml methanolu. Pro zajištění bazického pH byla do reakční směsi přidána DIEA. Po 12 h byly veškeré látky odpařeny a surový produkt byl použit bez dalšího čištění v dalším kroku. Analytické HPLC prokázalo 99 % čistotu (Rt = 16,5 min). HRMS (ESI-) m/z pro C30H48O16N6S2 [M-H]“: spočítáno: 811,24954, nalezeno 811,24991.
(2) Sloučenina Bi
Kyselina (6S,6'S,11R,H'R)-11,1 T-(disulfandiylbis(methylen))bis(6-karboxy-2,2-dimethyl-4,9,12trioxo-3-oxa-5,10,13-triazapentadekan-15-ová), sloučenina By 90 mg sloučeniny Bo (0,11 mmol, 1,0 ekv.) bylo rozpuštěno v 1 ml vody a roztok byl za míchání 10 min probublán dusíkem. Poté bylo přidáno 35 mg tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP; 0,12 mmol, 1,1 ekv.) a reakce byla míchána po dobu 2 h pod inertní atmosférou. HPLC analýza prokázala kompletní vymizení sloučeniny Bo. Následně bylo přidáno 114 mg mal-dPEG4-NHS (0,22 mmol, 2,0 ekv., #PEG1575.0001, IRIS Biotech GmbH) rozpuštěného v 1 ml methanolu. Po 3 h byly těkavé látky odpařeny a surový produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient 15 až 50 % ACN v 50 min, Rt = 32 min). Po lyofilizaci bylo izolováno 95 mg sloučeniny Bi (výtěžek 47 %). Analytické HPLC: RT = 16,8. HRMS (ESI-) m/z pro C37H56Oi9N6S [M-H]“ spočítáno 919,32482, nalezeno 919,32444.
(3) Sloučenina B mg sloučeniny Bi (50 pmol, 1,0 ekv.) bylo rozpuštěno v 1 ml methanolu a k reakční směsi bylo přidáno 20 μΐ čerstvě redestilovaného ethylendiaminu (300 pmol, 6,0 ekv.). Reakční směs byla za míchání ponechána reagovat po dobu 3 h. Těkavé látky byly odpařeny a produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient 15 až 40 % ACN v 50 min, Rt= 29 min). Po lyofilizaci bylo izolováno 43 mg sloučeniny B (výtěžek 46 %). Analytické HPLC: Rt= 14,7. HRMS (ESI-) m/z pro C45H58O16N7S [M-H]“: spočítáno 866,38143, nalezeno 866,38118.
Příklad 9: Příprava konjugátu 5
Polymemí prekurzorpoly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,040 g, Mw= 81 600 g/mol, 14,6 %mol TT; viz Příprava konjugátu 1), sloučenina B (5,5 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (5 mg) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (8,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h pň teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 5 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-sloučenina B-co-Ma-P-AlaATTO488-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 5 byl 20 mg. Obsah ATTO488 4,78 % byl stanoven spektrofotometricky (85021™ = 90 000 LmolÁcm“1, destilovaná voda) a obsah glutathionu 10,87 % byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N-HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
Příklad 10: Příprava konjugátu 6
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,030 g, Mw = 81 600 g/mol, 14,6 % mol TT; viz příprava konjugátu 1), sloučenina B (3,8 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (4 mg) byly rozpuštěny v 0,3 ml DMSO. Poté byl přidán ΛΆ-diisopropylcthylamin
- 13 CZ 308742 B6 (DIPEA) (4,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (2 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 6 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-sloučenina B-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 6 byl 18 mg. Obsah biotinu 5,23 % byl stanoven pomocí kitu HABA/Avidin (Sigma) a obsah glutathionu 10,85 % byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6NHC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
Příklad 11: Afinitní izolace (pull-down) rekombinantního lidského proteinu GCPII s afínitní značkou GST-tag (GST-rhGCPII) pomocí konjugátu 5 a konjugátu 6
Afínitní izolace proteinu GST-rhGCPII byla provedena analogickým postupem jako v případě izolace proteinu nesoucího značku His-tag (viz příklad 5).
Konjugát 5, konjugát 6, konjugát 3 a konjugát 4 byly předvázány na 20 μΐ Streptavidin Sepharózy (200 nM roztok v 1000 μΐ TBST, 1 h, 6 °C). Po promytí 3* 1000 μΐ TBST byl nosič smíchán s 1000 μΐ roztoku GST-rhGCPII (5 ng/μΐ v TBST či lyzátu buněk LNCaP) a inkubován při 6 °C po dobu 3 h. Nosič byl poté promyt 3* 1000 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 50 μΐ vzorkového pufm pro SDS-PAGE a zahřátím na 98 °C po dobu 10 min.
Protein GST-rhGCPII byl úspěšně izolován pomocí konjugátu 5 a konjugátu 6 z obou vzorků (jak z čistého pufm, tak z lyzátu buněk LNCaP). Jednotlivé negativní kontroly (konjugát bez inhibitoru a konjugát bez inhibitom a ATTO488), prokázaly že vazba GST-rhGCPII se děje specificky přes vazebnou skupinu přítomnou na konjugátu.
Příklad 12: Kvantifikace interakce polymemích konjugátu s GST-rhGCPII pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR)
Měření interakce proteinu GST-rhGCPII s konjugáty 5 a 6 pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR) bylo provedeno na čtyřkanálovém SPR senzom vyvinutém na Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR v Praze [10-11], V typickém experimentu byl SPR čip (dodáván ÚFE AV ČR) ponořen na 1 h při 37 °C do ethanolového roztoku (7:3) alkanthiolů HS-(CH2)n-PEG4-OH a HS(CH2)h-PEG6-O-CH2-COOH (Prochimia) o výsledné koncentraci 0,2 mM. Čip byl následně opláchnut ethanolem pro UV spektroskopii, deionizovanou vodou a vysušen dusíkem. Nakonec byl čip nasazen na hranol SPR čipu; všechna měření byla provedena při 25 °C.
Aktivace koncových karboxylových skupin na povrchu senzom bylo provedeno in sítu přidáním směsi (1:1) ll,51mg/ml JV-hydroxysukcinimidu (NHS, Biacore) a 76,68 mg/ml l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu (EDC, Biacore) v deionizované vodě po dobu 5 min při průtoku 20 μΐ/min. Další části experimentu byly poté prováděny při průtoku 30 μΐ/min. Následně byl po dobu 8 min nanášen roztok neutravidinu (20 ng/μΐ) v lOmM octanu sodném, pH 5,0. Pro odstranění nespecificky navázaných molekul neutravidinu byl použit pufir o vysoké iontové síle (PBS s 0,5M NaCl) a poté byl pro deaktivaci zbylých aktivovaných karboxylových skupin aplikován 1M ethanolamin (Biacore). Na imobilizovaný neutravidin byl poté navázán konjugát 5 či 6 (1 μΜ v TBS, 10 min). Nakonec byl na tuto připravenou vrstvu injektován roztok rekombinantního proteinu GST-rhGCPII v TBS v proměnlivých koncentracích (koncentrace GSTrhGCPII byly 100, 200, 400 a 800 nM) a následně pouze TBS (fáze disociace). Křivky popisující vazbu byly exportovány a analyzovány v programu TraceDrawer v. 1.5 (Ridgeview Instruments AB) pro zisk parametrů kon a kOff.
Hodnota disociační konstanty mezi GST-rhGCPII a konjugátem 5 byla stanovena na Kd= 12 nM; mezi GST-rhGCPII a konjugátem 6 pak na Kd= 9 nM.
- 14CZ 308742 B6
Příklad 13: Imobilizace GST-rhGCPII a následné testování inhibiční potence inhibitorů GCPII
Experiment byl proveden analogicky k experimentu s imobilizaci GCPII přes značku His-tag (příklad 7).
Do 96jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo na dno jamek naneseno 10 μΐ roztoku streptavidinu (o koncentraci 10 ng/μΐ) ve lOOmM borátovém pufru, pH 9,5 a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 h. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Neobsazený povrch jamky byl zablokován 0,55% (hmotn./obj.) roztokem kaseinu v TBS (Casein Buffer 20X4X Concentrate, SDT, 24 h). Po dalším promytí 3* 200 μΐ TBST byl na streptavidin navázán konjugát 6 nebo 4 (lOOnM v TBST, 2 h). Nenavázané konjugáty byly odrnyty promytím 3* 200 μΐ TBST a následně byl do jamek přidán roztok rekombinantní GST-rhGCPII v TBST (lOng/jamku, 1 h, připravena podle [9]). Po promytí 3 x 200 μΐ TBST byla přidána buď samotná detekční sonda ssPSMA (InM v TBST) vázající se do aktivního místa GST-rhGCPII nebo směs této sondy a zvolené testované látky o zvolené koncentraci (typicky 100μΜ v TBST). Po inkubaci 1 h při teplotě místnosti byly jamky promyty 5* 200 μΐ TBST a množství navázané detekční sondy bylo poté stanoveno pomocí qPCR. Ze změny množství navázané sondy v jamkách inkubovaných s testovanou látkou oproti jamkám inkubovaným se samotnou sondou byla vypočtena frakce aktivních míst GST-rhGCPII obsazených danou testovanou látkou a následně inhibiční konstanta této látky (podrobný popis detekční sondy ssPSMA a postupu výpočtu inhibiční konstanty je uveden v české patentové přihlášce PV 2014-527).
Pomocí tohoto postupu bylo možné určit inhibiční konstantu testovaného inhibitoru pomocí měření vzorku v jediné jamce; tato metoda byla použita pro změření dvaceti inhibitorů a získané hodnoty Ki odpovídaly hodnotám Ki obdrženým pomocí měření enzymové kinetiky GST-rhGCPII.
Konjugáty 5 a 6 obsahující vazebnou skupinu pro GST-tag byly použity pro afmitní izolaci a purifikaci proteinů s GST-tagem z různých vzorků. Pomocí SPR byla analyzována vazba mezi těmito polymery a proteinem nesoucím GST-tag; disociační konstanta této vazby se nacházela v nanomolámí oblasti (okolo 10 nM). Dále, analogickým způsobem jako v případě konjugátu vázajícím His-tag, byl i tento konjugát použit pro imobilizaci proteinů se značkou GST-tag a následné testování látek kompetujících ve vazbě se známým ligandem daného proteinu.
Seznam referencí:
1. Ulbrich, K. and V. Subr, Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers. Adv Drug Deliv Rev, 2010. 62(2): p. 150-66.
2. Ulbrich, K., et al., Polymeric drugs based on conjugates of synthetic and natural macromolecules I. Synthesis and physico-chemical characterisation. Journal of Controlled Release, 2000. 64(1-3): p. 63-79.
3. Etrych, T., et al., N-(2-hydroxypropyl)niethacrylamide-basedpolymer conjugates with pHcontrolled activation of doxorubicin. I. New synthesis, physicochemical characterization and preliminary biological evaluation. Journal of Applied Polymer Science, 2008.109(5): p. 30503061.
4. Subr, V., et al., Synthesis of Well-Defined Semitelechelic Poly[N-(2hydroxypropyl)methacrylamide] Polymers with Functional Group at the alpha-End of the Polymer Chain by RAFT Polymerization. Macromolecules, 2013. 46(6): p. 2100-2108.
5. Subr, V. and K. Ulbrich, Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups. Reactive & Functional Polymers, 2006. 66(12): p. 1525-1538.
- 15 CZ 308742 B6
6. Kopeček, J., P. Rej manova, and V. Chytrý, Polymers Containing Enzymatically Degradable Bonds. 1. Chymotrypsin Catalyzed-Hydrolysis of Para-Nitroanilides of Phenylalanine and Tyrosine Attached to Side-Chains of Co-Polymers of N-(2-Hydroxypropyl)Methacrylamide. Makromolekulare Chemie-Macromolecular Chemistry and Physics, 1981. 182(3): p. 799-809.
7. Huang, Z , et al., Tris-nitrilotriacetic acids of subnanomolar affinity toward hexahistidine tagged molecules. Bioconjug Chem, 2009. 20(8): p. 1667-72.
8. Perrier, S., P. Takolpuckdee, and CA. Mars, Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization: End group modification for functionalized polymers and chain transfer agent recovery. Macromolecules, 2005. 38(6): p. 2033-2036.
9. Tykvart, J., et al., Efficient and versatile one-step affinity purification of in vivo biotinylated proteins: expression, characterization and structure analysis of recombinant human glutamate carboxypeptidase IE Protein Expr Purif, 2012. 82(1): p. Ji 106-15.
10. Hegnerova, K., et al., Surface plasmon resonance biosensors for detection of Alzheimer disease biomarker. Sensors and Actuators B-Chemical, 2009.139(1): p. 69-73.
11. Pimkova, K., et al, Surface plasmon resonance biosensor for the detection of VEGFR-l-a protein marker of myelodysplastic syndromes. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012. 402(1): p. 381-387.

Claims (7)

1. Syntetický makromolekulámí konjugát pro použití pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro, přičemž uvedený syntetický makromolekulámí konjugát obsahuje syntetický kopolymer připravitelný kopolymerací alespoň jednoho monomem obecného vzorce 1:
kde:
R1 je vybráno z H, CH3; a
R2 je vybráno z NH2, NH-CH2-CH(OH)-CH3, NH-CH3, NH-CH2CH3, NH-CH2CH2-OH, NHCH2CH2CH2-OH, NHC(CH2OH)3, NH-CH2CH2-N+(CH3)3C1, O-CH2CH2-OH, O-(CH2CH2O)2H O-(CH2CH2O)3-H, O-CH2CH2-N+(CH3)3C1- NH-(CH2)3N+(CH3)2-(CH2)2-COO-;
a alespoň jednoho monomem obecného vzorce 2:
2. Makromolekulám! konjugát podle nároku 1, vyznačený tím, že molekulová hmotnost konjugátu je v rozmezí 20 000 až 150 000 g/mol.
(2), kde:
R1 je vybráno z H, CH3; a
X je vybráno z NH-(CH2)2-CO, NH-(CH2)3-CO, NH-(CH2)4-CO, NH-(CH2)5-CO-, Gly, GlyGly, GlyPheLeuGly; a
R3 je vybráno z:
přičemž
- 17CZ 308742 B6
- alespoň jedna reaktivní skupina R3 je v kopolymeru nahrazena kovalentně vázanou vazebnou skupinou vybranou z nitrilotrioctové kyseliny a tris(nitrilotrioctové) kyseliny, a
- alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena kovalentně vázanou afmitní kotvou vybranou ze skupiny zahrnující biotin, FLAG tag, His-tag, HA tag, Strep-tag, Avi-Tag, GST, c-myc-tag, V5tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, poly(Glu)-tag, kalmodulinový tag a/nebo alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena kovalentně vázanou reportérovou skupinou vybranou ze skupiny zahrnující fluorescenční sloučeniny, radionuklidy a komplexy kovů, a přičemž molekulová hmotnost konjugátu je s výhodou v rozmezí 1000 až 500 000 g/mol.
3. Makromolekulám! konjugát podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že vazebná skupina je připojena prostřednictvím spojky na bázi polyethylenglykolu, peptidu, s výhodou peptidu o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol, nebo nukleové kyseliny, s výhodou nukleové kyseliny obsahující 1 až 40 nukleotidů, nebo oligosacharidu, s výhodou oligosacharidu obsahujícího 1 až 40 monosacharidů.
4. Makromolekulám! konjugát podle nároku 1, vyznačený tím, že reportérová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující fluorofory s excitačním maximem v rozmezí 350 až 850 nm, s výhodou ATTO488, DY676; komplexy lanthanoidů Gd, Mn, Dy, Eu; a komplexy radionuklidů 64Cu, 68Ga, 18F, 99mTc, 1231, 125I, I31I,57Co, 51Cr, 67Ga, 64Cu, “Τη, 9Ύ.
5. Použití makromolekulámího konjugátu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro.
6. Použití makromolekulámího konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 v imunochemické metodě, s výhodou vybrané z ELISA, Western blotu a jeho modifikací, průtokové cytometric, imunoprecipitace, imunocytochemie.
7. Použití makromolekulámího konjugátu podle nároku 1 in vitro pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů obsahujících afmitní značku His-tag či GST-tag.
CZ2015-19A 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů CZ308742B6 (cs)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-19A CZ308742B6 (cs) 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů
EP16706121.7A EP3245513B1 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
CA2970845A CA2970845C (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
SG11201705002SA SG11201705002SA (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
US15/542,792 US10114014B2 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
AU2016207125A AU2016207125B2 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
PCT/CZ2016/050002 WO2016112882A2 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
IL253406A IL253406B (en) 2015-01-14 2017-07-11 Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and imaging of proteins

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-19A CZ308742B6 (cs) 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ201519A3 CZ201519A3 (cs) 2016-07-27
CZ308742B6 true CZ308742B6 (cs) 2021-04-21

Family

ID=55411123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2015-19A CZ308742B6 (cs) 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10114014B2 (cs)
EP (1) EP3245513B1 (cs)
AU (1) AU2016207125B2 (cs)
CA (1) CA2970845C (cs)
CZ (1) CZ308742B6 (cs)
IL (1) IL253406B (cs)
SG (1) SG11201705002SA (cs)
WO (1) WO2016112882A2 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2022167A3 (cs) * 2022-04-22 2023-11-01 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094032A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-13 Eppendorf Ag Verfahren zur herstellung von als ausgangsprodukte für mikroarrays dienenden oberflächenfunktionalisierten trägern zur immobilisierung von biomolekülen
EP2362220A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-31 Corning Incorporated Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4778751A (en) 1986-05-12 1988-10-18 Diagnostic Products Corporation Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies
EP1534347B1 (en) 2002-07-22 2009-12-02 Psimei Pharmaceuticals Plc Conjugates of n-hydroxypropymethacrylamide-methacrylate copolymer with nuclide activation agent and/or anti-cancer compounds
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
CZ2014527A3 (cs) 2014-08-05 2016-02-17 Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094032A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-13 Eppendorf Ag Verfahren zur herstellung von als ausgangsprodukte für mikroarrays dienenden oberflächenfunktionalisierten trägern zur immobilisierung von biomolekülen
EP2362220A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-31 Corning Incorporated Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. Jeong, A. Gutowska: "Lessons from nature: stimuli-responsive polymers and their biomedical applications" TRENDS in Biotechnology, 20 (7), 305-311 (2002) *
C.J. Galvin, Jan Genzer: "Application of surface grafted macromolecules derived from post-polymerization modification reactions" Progress in Polymer Science 37, 871-906 (2012) *
D.Kim, A.E. Herr: "Protein Immobilization for microfluidic assays" Biomicrofluidics 7, 041501-47 (2013) *
H. Ding et al.: "Two-step Fluorescence Screening of CD21-Binding Peptides with One-bead One-compound Library and Investigation of Binding Properties of HPMA Copolymer - Peptide Conjugate" Biomacromolecules 7 (11) 3037-3046 (2006) *
J.E: Gautrott et al.: "Protein - Resistant NTA-Functionalized Polymer Brushes for Selective and Stable Immobilization of Histidine - Taged Proteins" ACS Appl. Mater. Interfaces 2 (1), 193-202 (2010) *
K. Ulbrich, V. Šubr: "Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers" Advanced Drug Delivery Reviews 62, 150-166 (2010) *
M. Solovskij, E. Panarin: "Polymer water-soluble derivatives of polypeptide antibiotic, gramicidin-S based on reactive copolymers of N-(2-hydroxypropyl)methacrylate" Journal of Controlled Release 58, 1-8 (1999) *
S.P.Cullen: "Synthesis and Evaluation of Polymer Brushes and Crosslinked Thin Films as Scaffolds for Biomolecule Immobilization", University of Wisconcin-Madison 2008 *
V. Šubr, K. Ulbrich: "Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups" Reactive & Functional Polymers 66, 1525-1538 (2006) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3245513A2 (en) 2017-11-22
CA2970845C (en) 2019-11-26
IL253406A0 (en) 2017-09-28
US20180011085A1 (en) 2018-01-11
WO2016112882A3 (en) 2016-08-25
SG11201705002SA (en) 2017-07-28
IL253406B (en) 2019-09-26
AU2016207125B2 (en) 2018-05-17
WO2016112882A2 (en) 2016-07-21
CZ201519A3 (cs) 2016-07-27
CA2970845A1 (en) 2016-07-21
AU2016207125A1 (en) 2017-07-13
US10114014B2 (en) 2018-10-30
EP3245513B1 (en) 2019-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10302632B2 (en) Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
US10669358B2 (en) Polymer backbone element tags
US20120220540A1 (en) Synbodies to akt1
US10138267B2 (en) Bioconjugates of heterocyclic compounds
EP3177931A2 (en) Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
WO2016041022A1 (en) Sensor scaffold
EP3245513B1 (en) Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
US11614445B2 (en) Background blockers for binding assays
KR100941679B1 (ko) 인산기-선택적인 형광 프로브를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법
JP2018501238A (ja) 合成ビエピトープ化合物
JP5941845B2 (ja) ポリビオチニル化化合物の調製方法