CZ308742B6 - Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů - Google Patents
Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308742B6 CZ308742B6 CZ2015-19A CZ201519A CZ308742B6 CZ 308742 B6 CZ308742 B6 CZ 308742B6 CZ 201519 A CZ201519 A CZ 201519A CZ 308742 B6 CZ308742 B6 CZ 308742B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- conjugate
- tag
- group
- protein
- proteins
- Prior art date
Links
- 238000012800 visualization Methods 0.000 title claims description 12
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 title description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 24
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 19
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 17
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 17
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 11
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 8
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 claims description 3
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 0.000 claims description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 claims description 2
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 claims description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims 1
- 108010018381 streptavidin-binding peptide Proteins 0.000 claims 1
- 230000009834 selective interaction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 164
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 83
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 50
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 33
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 25
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical group SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 12
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- -1 cobalt cation Chemical class 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 8
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropan-2-ol Chemical group CC(O)CN HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropyl methacrylate Chemical compound CC(O)COC(=O)C(C)=C VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 6
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- BNCJEZWKLUBUBB-QXEWZRGKSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(2-aminoethyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCN)SC[C@@H]21 BNCJEZWKLUBUBB-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091006057 GST-tagged proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IDSLBLWCPSAZBL-UHFFFAOYSA-N 2-cyanopropan-2-yl benzenecarbodithioate Chemical compound N#CC(C)(C)SC(=S)C1=CC=CC=C1 IDSLBLWCPSAZBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710183768 Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 3
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCOCC HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QPCKLXWQFRRTAR-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-[3-oxo-3-(2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl)propyl]prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NCCC(=O)N1CCSC1=S QPCKLXWQFRRTAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229920001002 functional polymer Polymers 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000012712 reversible addition−fragmentation chain-transfer polymerization Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- XSRYGQJQNPJNKZ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCOCCOCCOCCOCCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O XSRYGQJQNPJNKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 101100545272 Caenorhabditis elegans zif-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710147523 DNA damage-inducible protein 1 Proteins 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical group S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010048963 Glutamate carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053987 NEDD8 Human genes 0.000 description 1
- 108700004934 NEDD8 Proteins 0.000 description 1
- 101150107958 NEDD8 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100532088 Oryza sativa subsp. japonica RUB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100532090 Oryza sativa subsp. japonica RUB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000012986 chain transfer agent Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000058 cyclopentadienyl group Chemical group C1(=CC=CC1)* 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229920000370 gamma-poly(glutamate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N gramicidin S Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009774 gramicidin s Drugs 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002187 poly[N-2-(hydroxypropyl) methacrylamide] polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150024074 rub1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 150000003627 tricarboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 125000005500 uronium group Chemical group 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/10—Esters
- C08F220/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
- C08F220/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
- C08F220/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
- C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
Řešení poskytuje makromolekulární konjugát pro selektivní interakci s proteiny, který obsahuje syntetický kopolymer, na nějž je kovalentní vazbou připojena alespoň jedna vazebná skupina a alespoň jedna další skupina vybraná z afinitní kotvy a reportérové skupiny. Makromolekulární konjugát je vhodný zejména pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro.
Description
PATENTOVÝ SPIS (11) Číslo dokumentu:
308 742 (19)
ČESKÁ REPUBLIKA
| (21) | Číslo přihlášky: | 2015-19 |
| (22) | Přihlášeno: | 14.01.2015 |
| (40) | Zveřejněno: (Věstník č. 30/2016) | 27.07.2016 |
| (47) | Uděleno: | 11.03.2021 |
| (24) | Oznámení o udělení ve věstníku: (Věstník ě. 16/2021) | 21.04.2021 |
(13) Druh dokumentu: B6 (51)Int. Cl.:
C08F 220/18 (2006.01)
C07K 5/00 (2006.01)
C07K17/08 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/532 (2006.01)
ÚŘAD PRŮMYSLOVÉHO VLASTNICTVÍ (56) Relevantní dokumenty:
J.E: Gautrott et al.: Protein - Resistant NTA-Functionalized Polymer Brushes for Selective and Stable Immobilization of Histidine - Taged Proteins ACS Appl. Mater. Interfaces 2 (1), 193-202 (2010); V. Subr, K. Ulbrich: Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups Reactive & Functional Polymers 66, 1525-1538 (2006); B. Jeong, A. Gutowska: Lessons from nature: stimuli-responsive polymers and their biomedical applications TRENDS in Biotechnology, 20 (7), 305-311 (2002); K. Ulbrich, V. Subr: Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers Advanced Drug Delivery Reviews 62, 150-166 (2010); S.P.Cullen: Synthesis and Evaluation of Polymer Brushes and Crosslinked Thin Films as Scaffolds for Biomolecule Immobilization, University of WisconcinMadison 2008; H. Ding et al.: Two-step Fluorescence Screening of CD21-Binding Peptides with One-bead One-compound Library and Investigation of Binding Properties of HPMA Copolymer - Peptide Conjugate Biomacromolecules 7 (11) 3037-3046 (2006); C.J. Galvin, Jan Genzer: Application of surface grafted macromolecules derived from post-polymerization modification reactions Progress in Polymer Science 37, 871-906 (2012); D.Kim, A.E. Herr: Protein Immobilization for microfluidic assays Biomicrofluidics 7, 041501-47 (2013); M. Solovskij, E. Panarin: Polymer water-soluble derivatives of polypeptide antibiotic, gramicidin-S based on reactive copolymers of N-(2-hydroxypropyl)methacrylate Journal of Controlled Release 58, 1-8 (1999).
_______EP 2 362 220 Al; WO 01/94032 AL__________________________________________________________________________________________ (7 3 ) Maj itel patentu:
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.,
Praha 6, CZ
Ústav makromolekulám! chemie AV ČR, v. v. i.,
Praha 6, Břevnov, CZ
Univerzita Karlova, Praha 1, Staré Město, CZ (72) Původce:
Mgr. Pavel Šácha, Ph.D., Praha 17, CZ doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc., Praha 6, CZ
Mgr. Jih Schimer, Praha 8, CZ
Mgr. Tomáš Knedlík, Kopřivnice, CZ
Ing. Vladimír Šubr, CSc., Mělník, CZ prof. Ing. Karel Ulbrich, DrSc., Praha 4, CZ
Ing. Jih Strohalm, Praha 6, CZ (74) Zástupce:
HARBER IP s.r.o., Dukelských hrdinů 567/52,
170 00 Praha 7, Holešovice (54) Název vynálezu:
Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů (57) Anotace:
Řešení poskytuje makromolekulární konjugát pro selektivní interakci s proteiny, který obsahuje syntetický kopolymer, na nějž je kovalentní vazbou připojena alespoň jedna vazebná skupina a alespoň jedna další skupina vybraná z afinitní kotvy a reportérové skupiny. Makromolekulární konjugát je vhodný zejména pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro.
Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů
Oblast techniky
Předkládaný vynález popisuje syntetické makromolekulámí konjugáty umožňující izolaci, imobilizaci a vizualizaci rekombinantních proteinů označených purifikační značkou v biochemii, molekulární biologii a příbuzných vědách.
Dosavadní stav techniky
Rozvoj biochemických a molekulámě-biologických metod umožňujících relativně snadno produkovat velké množství rekombinantních proteinů ve velkých výtěžcích s sebou přinesl potřebu jejich snadné a zejména univerzální izolace a následné vizualizace. Následný vznik afinitních (purifikačních) značek (tagů) znamenal možnost izolovat, puntíkovat a vizualizovat různé proteiny vždy stejnou technologií, což znamenalo podstatné vylepšení metodologie produkce rekombinantních proteinů a zrychlení jejich izolace a purifikace.
Polyhistidinová sekvence (také značka či tag, zkráceně 6*His-tag) obsahující nejčastěji 6 histidinů, známá pod komerčním jménem His-tag, představuje pravděpodobně nejznámější a nej používanější takovouto značku. Sekvence 6/His-tag je poměrně specificky vázána komplexem obsahujícím chelatační sloučeninu s dvoj mocným kationtem niklu či kobaltu. Touto chelatační sloučeninou může být např. kyselina nitrilotrioctová (NTA), která se nejčastěji používá pro purifikaci proteinů označených polyhistidinovou sekvencí. Použitím sloučeniny obsahující více molekul nitrilotrioctové kyseliny, např. triNTA, lze afinitu dále zvýšit.
Pro detekci proteinů s polyhistidinovou sekvencí na Western blotu je třeba použít protilátku rozpoznávající tuto sekvenci. Citlivost mnoha komerčně dostupných protilátek proti polyhistidinové sekvenci není dostatečná pro kvantifikaci malých množství proteinů označených polyhistidinovou sekvencí. Vazba mezi protilátkou a polyhistidinovou sekvencí obecně nemusí být příliš silná, a proto může docházet k disociaci vzniknuvšího komplexu. Toto je problém zejména u metod vyžadujících velmi silnou vazbu pro imobilizaci proteinů označených polyhistidinovou sekvencí, jako jsou např. ELISA či povrchová plazmonová rezonance (SPR).
Glutathion-S-transferáza (GST) je enzym vázající glutathion a účastnící se detoxikačních procesů v organismu. GST může být exprimována ve fúzi s daným proteinem (GST-tag); tento fúzní protein je pak možné vázat pomocí nosiče s glutathionem. GST-tag je vedle His-tagu další široce používanou afinitní značkou pro purifikaci proteinů.
Molekuly protilátek jsou velké glykosylované proteiny s disulfidovými vazbami, a proto je produkce protilátek vázáná na eukaryotický expresní systém umožňující provádění zmíněných posttranslačních modifikací. Z tohoto důvodu je výroba protilátek finančně poměrně nákladná. Molekuly protilátek jsou navíc poměrně náchylné k degradaci: jakožto proteiny musejí být obecně uchovávány při snížené teplotě, příp. zamražené v alikvotech. Jejich opakované rozmrazování často vede ke ztrátě jejich schopnosti vázat daný antigen.
Polymery připravené homopolymerací A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) jsou biokompatibilní, neimunogenní a rozpustné ve vodě. Díky těmto vlastnostem se HPMA kopolymery využívají jako nosiče pro léčiva a zobrazovací sloučeniny, mající uplatnění zejména jako protinádorová léčiva [1-2], HPMA kopolymery jsou multivalentní makromolekuly, na které lze připojit různé nízkomolekulámí sloučeniny, např. fluorescenční sondy, radionuklidy či léčiva. Vedle těchto nízkomolekulámích látek mohou být HPMA kopolymery modifikovány i (glyko)proteiny, oligonukleotidy a polynukleotidy. Multivalence HPMA kopolymerů umožňuje
- 1 CZ 308742 B6 připojit jak molekuly pouze jediného typu, tak i kombinace různých typů s různými funkcemi [35]·
Předkládaný vynález popisuje makromolekulámí konjugáty kopolymerů schopné vizualizace, imobilizace a separace proteinů označených purifikační značkou.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje makromolekulámí konjugát syntetického kopolymerů s nízkomolekulámími funkčními sloučeninami (zde nazývány také jako funkční skupiny, tj. vazebná skupina, reportérova skupina a afinitní kotva; toto označení se vztahuje k jejich funkci ve výsledném konjugátu a nemá nic společného s tzv. chemickými funkčními skupinami). Kostra makromolekuly (konjugátu) je tvořena syntetickým kopolymerem, na který jsou kovalentní vazbou připojeny molekuly funkčních skupin: (a) alespoň jedné vazebné skupiny umožňující specifickou vazbu konjugátu na daný protein, a alespoň jedné (b) afinitní kotvy a/nebo (c) reportérové skupiny. Schéma popisovaného konjugátu je uvedeno na obr. 1.
Je výhodné, když jsou syntetické kopolymery vodorozpustné.
Příprava syntetického kopolymerů byla popsána již dříve [5-6]; polymemí konjugáty jsou připraveny z polymemích prekurzom, které obsahují monomery:
kde: R1 je vybráno z H, CH3; a
R2 je vybráno z NH2, NH-CH2-CH(OH)-CH3, NH-CH3, NH-CH2CH3, NH-CH2CH2-OH, NHCH2CH2CH2-OH, NHC(CH2OH)3, NH-CH2CH2-N (CH3)3C1-, O-CH2CH2-OH, O-(CH2CH2O)2-H
O-(CH2CH2O)3-H, O-CH2CH2-NÁCH3)3C1-NH-(CH2)3NÁCH3)2-(CH2)2-COO a alespoň jeden typ monomerů vzorce 2:
(2) kde: R1 je vybráno z H, CH3; a
X je vybráno z NH-(CH2)2-CO, NH-(CH2)3-CO, NH-(CH2)4-CO, NH-(CH2)5-CO, Gly, GlyGly, GlyPheLeuGly; a
R3 je vybráno z:
-2 CZ 308742 B6
(R3 představuje reaktivní skupinu).
Obsah reaktivních skupin (tj. obsah monomeru vzorce 2) v kopolymerů je s výhodou v rozmezí 0,5 až 30 % mol., výhodněji 2 až 20 % mol.
V polymemím konjugátu je alespoň jedna reaktivní skupina R3 kopolymerů nahrazena vazebnou skupinou, alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena afmitní kotvou a/nebo alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena reportérovou skupinou. S výhodou je uvedenými skupinami nahrazena více než j edna reaktivní skupina R3. Výhodněj i j e uvedenými skupinami nahrazeno více než 50 % reaktivních skupin R3, ještě výhodněji 100 % reaktivních skupin R3. Reaktivní skupiny zbývající v polymemím řetězci po konjugaci jsou vždy nahrazeny l-aminopropan-2-ol skupinou.
Jako základní kopolymer je možno s výhodou použít kopolymer HPMA, tj. poly(HPMA-co-Maβ-Ala-TT); kopolymer připravený klasickou radikálovou roztokovou kopolymerací nebo řízenou radikálovou kopolymerací (např. RAFT-kopolymerací, reversible addition-fragmentation chaintransfer) A-(2-hydroxypropyl)methak ryl amidu (HPMA) a 3-(3methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionu (Ma-β-Ala-TT). Obsah HPMA je s výhodou v rozmezí 70 až 98 % mol, obsah reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin je 2 až 30 % mol.
Funkční skupiny jsou připojené k polymemímu řetězci přes amidovou vazbu, jež vznikne reakcí aminoskupiny přítomné na molekule funkční sloučeniny, tj. prekurzoru vazebné skupiny, afmitní kotvy nebo reportérové skupiny, a reaktivní skupiny (s výhodou thiazolidin-2-thionové) přítomné na polymemím řetězci.
Molekulová hmotnost konjugátu je s výhodou v rozmezí 1000 až 500 000 g/mol, s výhodou v rozmezí 20 000 až 150 000 g/mol.
Vazebnou skupinou je nízkomolekulámí látka zajišťující specifickou vazbu celého konjugátu na určitý protein; specifita cílení konjugátu je dána vlastnostmi této vazebné skupiny. Jako vazebné skupiny byly vybrány sloučeniny vázající některou z komerčně dostupných proteinových (purifikačních) značek (tagů), jako je např. kyselina nitrilotrioctová (NTA) pro vazbu polyhistidinového tágu (His-tag) či redukovaná forma glutathionu pro vazbu glutathion-Stransferázy (GST-tag). Obdržený konjugát je pak použitelný proti libovolným proteinům, jenž obsahují tuto proteinovou značku.
Sloučeniny vázající His-tag jsou obecně komplexy iontů a chelatačních činidel; mezi nejčastěji používaná chelatační činidla patří kyselina iminodioctová (IDA), kyselina nitrilotrioctová (NTA) a karboxylmethylaspartát (CMA), nebo triNTA skupina, která je derivátem odvozeným od NTA; použití vícenásobných komplexů zvyšuje afinitu těchto sloučenin k His-tagu. Nejčastěji používané komplexy jsou Ni-IDA, Ni-NTA, Co-CMA. Dle vlastností studovaného proteinu je možné použít jak nativní podmínky, tak denatumjící podmínky pro purifikaci (např. v koncentrované močovině). Po navázání proteinu na konjugát obsahující komplexy vázající His-tag je možné eluovat tento protein z nosiče pomocí roztoku imidazolu.
Glutathion (GSH) zajišťuje vazbu proteinů produkovaných ve fúzi s glutathion-S-transferázou (GST). Po navázání fúzního proteinu na konjugát s glutathionem je možné eluovat tento protein z nosiče pomocí roztoku volného glutathionu.
Vazebná skupina může být na syntetický kopolymer připojena prostřednictvím flexibilní spojky, například spojky na bázi (oligo)polyethylenglykolu, peptidu, nukleové kyseliny či oligosacharidu. Spojka umožňuje vazbu vazebné skupiny na cílový protein tak, aby nedocházelo ke sterickému bránění interakce připojeného ligandu s dalšími molekulami. S výhodou je spojka vybrána ze skupiny zahrnující spojky na bázi polyethylenglykolu, peptidu, s výhodou peptidu o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol, nebo nukleové kyseliny, s výhodou nukleové kyseliny obsahující 1 až 40 nukleotidů, nebo oligosacharidu, s výhodou oligosacharidu obsahujícího 1 až 40 monosacharidů.
Afmitní skupinou může být např. biotin: díky velmi silné interakci biotinavidin/streptavidin/neutravidin je konjugát snadno imobilizovatelný na nosiči na bázi Streptavidin Sepharózy. Díky velmi silné vazbě biotin-avidin/streptavidin/neutravidin (Kd ~ 10“15), je prakticky vyloučena disociace konjugátu z nosiče. Přes biotin je možné vázat ha konjugát další proteiny konjugované se streptavidinem (chemicky či genetickou fúzí). Toho se dá využít např. v metodě ELISA (vazba neutravidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou).
Mimo biotin může být afmitní kotvou také FLAG tag (sekvence DYKDDDDK rozpoznávaná protilátkou), His-tag (polyhistidinová sekvence vázaná chelatovaným niklem; nikoliv však v případě konjugátu vážícího His-tag), hemaglutininový tag (HA-tag, sekvence aminokyselin YPYDVPDYA odvozená od povrchového glykoproteinu chřipkového viru hemaglutininu, rozpoznávaná protilátkou), Strep-tag (oktapeptidová sekvence WSHPQFEK vázaná modifikovaným streptavidinem - Strep-Tactinem), Avi-Tag (peptidová sekvence rozpoznávaná biotinligasou, biotinylace umožňuje následnou izolaci pomocí streptavidinu), GST (glutathion-Stransferáza; enzym vázající glutathion), c-myc-tag (peptidová sekvence EQKLISEEDL rozpoznávaná protilátkou), V5-tag (peptidová sekvence GKPIPNPLLGLDST rozpoznávaná protilátkou), E-tag (peptidová sekvence GAPVPYPDPLEPR rozpoznávaná protilátkou), S-tag (peptidová sekvence KETAAAKFERQHMDS rozpoznávaná protilátkou), SBP-tag (delší peptidová sekvence vázaná streptavidinem), poly(Glu)-tag (polyglutamátová sekvence, např. hexaglutamát, vázající se na aniontové iontoměniče), kalmodulinový tag (delší peptidová sekvence vázaná kalmodulinem) či jiná sloučenina schopná imobilizace na pevnou fázi.
Reportérovou skupinou může být fluorofor, s výhodou s excitačním maximem v rozmezí 350 až 850 nm, např. fluorofor ATT0488 nebo DY676, umožňující vizualizaci polymeru a proteinů či buněk, na které je konjugát navázán. Díky tomu je možné konjugát použít v metodách jako jsou, např. průtoková cytometric (a odvozená technika FACS; Fluorescence-activated cell sorting; separující buňky na základě jejich fluorescence při dané vlnové délce) či imunocytochemie a imunohistochemie. Pro detekci proteinů na Western blotu (pomocí systémů zachycujících fluorescenci, jako je např. systém Odyssey CLx) je možné s výhodou použít fluorofor s emisí záření ve vzdáleně červené či blízce infračervené oblasti spektra (far-red fluorescence či near-infrared fluorescence), jelikož použití záření s delší vlnovou délkou výrazně snižuje autofluorescenci a rozptyl světla.
V jiném provedení vynálezu může reportérovou skupinou být komplex kovu, např. lanthanoidu (zejména Gd, Mn, příp. Dy, Eu). V dalším provedení může reportérovou skupinou být komplex radionuklidu, např. vybraného ze skupiny zahrnující 64Cu, 68Ga, 18F. V jiném provedení může být reportérovou skupinou také komplex radionuklidu vybraného ze skupiny 99mTc, 1231, 1251, 1311, 57Co, 51Cr, 67Ga, 64Cu, inIn, 90Y. Ligandy vhodné pro komplexaci uvedených kovů jsou dobře známy v oboru, například makrocyklické ligandy, deriváty cyklopentadienylu, fosfmové a azinové ligandy.
Předkládaný vynález má oproti v současnosti používaným protilátkám několik výhod. Příprava polymemích konjugátu je poměrně snadná a nepříliš nákladná. Polymemí kostra, díky
-4 CZ 308742 B6 neproteinovému charakteru molekuly, zaručuje zvýšenou chemickou stabilitu, což umožňuje nejenom použití v nefýziologických podmínkách, ale i velmi snížené nároky na uchovávání a manipulaci. Mnohonásobná přítomnost NTA skupin na triNTA konjugátu pak vede ke zvýšení afinity a pevnější vazbě tohoto konjugátu k His-tagu.
V příkladech této patentové přihlášky byla pomocí několika běžných biochemických a molekulámě-biologických metod testována funkčnost připravených konjugátu:
Western blot je imunologická metoda umožňující selektivní detekci daného proteinu na membráně po přenesení z gelu po provedení SDS-PAGE elektroforézy dělicí proteiny dle jejich velikosti. V konkrétním provedení vynálezu je použit konjugát obsahující derivát kyseliny nitrilotrisoctové (triNTA), který se (po navázání nikelnatých kationtů) váže na polyhistidinovou sekvenci (His-tag). Po přenesení proteinů na membránu (mokrý blot: 100 V/l hod) jsou nejprve neobsazená místa na membráně blokována 1% roztokem kaseinu v PBS a poté je membrána inkubována 1 hod při laboratorní teplotě s roztokem polymemího konjugátu s triNTA rozpoznávající studovaný protein s His-tagem (koncentrace konjugátu je v rozmezí 100 nM až 100 pM). Po inkubaci a následném promytí je membrána inkubována v roztoku Neutravidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou (ředění 1:2500) vázajícím biotin přítomný na polymemím konjugátu. Množství daného proteinu je poté stanoveno chemiluminiscenčně, popř. fluorescenčně (pomocí fluoroforu přítomném na konjugátu; není pak nutné přidávat Neutravidin).
Imunoprecipitace (resp. pulldown, tj. analogická metoda k imunoprecipitaci používající jiné látky než protilátky) spočívá v imobilizaci polymemího konjugátu na pevnou fázi, např. streptavidin sepharózu. Poté je nosič inkubován se vzorkem obsahujícím protein rozpoznávaný konjugátem. Po promytí nosiče je daný protein z nosiče uvolněn, např. změnou pH, změnou iontové síly, zahřátím v přítomnosti SDS apod. Jinou možností je nejprve inkubovat spolu vzorek s konjugátem a vzniknuvší komplex konjugát-protein separovat ze vzorku pomocí streptavidin sepharózy.
Měření povrchové plazmonové rezonance (SPR) je biofýzikami technika analyzující průběh vazby (a následně pak sílu této vazby) dvou interagujících látek. V prvním uspořádání, kdy je na zlatém čipu biosenzoru imobilizován daný protein a poté je analyzována vazba konjugátu na tento protein, je možné stanovit disociační konstantu pro vazbu protein-konjugát. V druhém uspořádání, kdy je polymemí konjugát použit pro imobilizaci daného proteinu na povrch biosenzoru, je možné analyzovat vazbu mezi daným proteinem a další látkou.
ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) je imunologická metoda, jež ve svém sendvičovém uspořádání se dvěma různými látkami umožňuje kvantifikaci daného proteinu. Nejprve je primární protilátka proti danému proteinu sorbována na povrch destičky a neobsazený povrch destičky je zablokován roztokem kaseinu. Poté je přidán vzorek se stanovovaným proteinem a po jeho navázaní na protilátku je přidán polymemí konjugát vázající tento protein. Navázaný konjugát je stanoven pomocí Neutravidinu (konjugovaného s křenovou peroxidázou) vázajícího biotin přítomný na konjugátu. Mimo tento způsob stanovení konjugátu (chemiluminiscenčně) je možné konjugát stanovit i fluorescenčně pomocí fluoroforu přítomném na konjugátu. Alternativně k výše uvedenému postupu metody ELISA lze taktéž imobilizovat i polymemí konjugát vazbou na neutravidin/streptavidin sorbovaný na povrch destičky (skrze vazbu biotin-streptavidin). Po vazbě stanovovaného proteinu je přidána biotinylovaná primární protilátka proti danému proteinu, která je poté stanovena opět pomocí Neutravidinu (konjugovaného s křenovou peroxidázou) vázajícího biotin přítomný na protilátce. Biotin přítomný na konjugátu tak lze použít jak pro imobilizaci, tak i pro detekci, naopak fluorofor pouze pro detekci.
Konjugáty jsou navrženy pro izolaci, vizualizaci či imobilizaci rekombinantních proteinů v biochemických a molekulámě-biologických metodách, jako jsou např. ELISA, imunoprecipitace (resp. pull-down v případě použití látky neprotilátkového charakteru), Western blot, povrchová
- 5 CZ 308742 B6 plazmonová rezonance a další. Zároveň je možné využít imobilizace proteinů pro testování sloučenin vážících se na tyto proteiny.
Objasnění výkresů
Obr. 1 zobrazuje schématickou strukturu polymemích konjugátu.
Obr. 2 zobrazuje strukturu sloučeniny A určené k cílení proteinové značky His-tag.
Obr. 3 zobrazuje strukturu konjugátu 1 určeného k cílení proteinů se značkou His-tag.
Obr. 4 zobrazuje strukturu konjugátu 2 určeného k cílení proteinů se značkou His-tag.
Obr. 5 zobrazuje strukturu konjugátu 3 bez vazebné skupiny (negativní kontrola).
Obr. 6 zobrazuje strukturu konjugátu 4 bez vazebné skupiny (negativní kontrola).
Obr. 7 zobrazuje Western blot s rekombinantním purifikovaným proteinem Miz chřipkového viru označeným značkou His-tag (Ml-HisTag), jenž byl vizualizován pomocí komerční protilátky proti značce His-tag a pomocí konjugátu 1. Dráha 1: Ml-HisTag (10 ng); 2: Ml-HisTag (5 ng); 3: MlHisTag (1 ng); 4: Ml-HisTag (0,5 ng); 5: All blue marker (2 ul); 6: Ml-HisTag (0,1 ng); 7: MlHisTag (0,5 ng); 8: Ml-HisTag (1 ng); 9: Ml-HisTag (5 ng); 10: Ml-HisTag (10 ng).
Obr. 8 zobrazuje Western blot s bakteriálním lyzátem obsahujícím poly(A)-polymerázu z E. coli označenou značkou HisTag (PAP-HisTag), jenž byl vizualizován jednak pomocí komerční protilátky proti značce His-tag a jednak pomocí konjugátu 1 a konjugátu 2. Dráha 1: bakteriální lyzát (10 μΐ); 2: bakteriální lyzát (5 μΐ); 3 bakteriální lyzát (1 μΐ); 4: All blue marker (2 μΐ); 5: bakteriální lyzát (10 μΐ); 6: bakteriální lyzát (5 μΐ); 7: bakteriální lyzát (1 μΐ); 8: All blue marker (2 μΐ); 9: bakteriální lyzát (10 μΐ); 10: bakteriální lyzát (5 μΐ); 11: bakteriální lyzát (1 μΐ).
Obr. 9A zobrazuje afmitní izolaci (pull-down) proteinu obsahujícího značku His-tag (NEDD8HisTag) pomocí konjugátu 1 za nativních podmínek. Proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE elektroforézy a gel byl obarven stříbrem. Dráha 1: NEDD8-HisTag (500 ng); 2: konjugát 1 (25 pg); 3: All Blue Marker (2 μΐ); 4: Load; 5: FT: konjugát 1; 6: FT: konjugát 3; 7: FT: konjugát 4; 8: FT: kontrola bez polymeru; 9: Eluce: konjugát 1; 10: Eluce: konjugát 3; 11: Eluce: konjugát 4; 12: Eluce: kontrola bez polymeru. Do všech drah jednotlivých frakcí bylo naneseno 5 μΐ vzorku.
Obr. 9B zobrazuje afmitní izolaci (pull-down) proteinu obsahujícího značku His-tag (NEDD8HisTag) pomocí konjugátu 1 za denaturujících podmínek. Proteiny byly rozděleny pomocí SDSPAGE elektroforézy a gel byl obarven stříbrem. Dráha 1: NEDD8-HisTag (500 ng); 2: Load; 3: FT: konjugát 3; 4: FT: konjugát 4; 5: FT: konjugát 1; 6: FT: kontrola bez polymeru; 7: Eluce: konjugát 3; 8: Eluce: konjugát 4; 9: Eluce: konjugát 1; 10: Eluce: kontrola bez polymeru. Do všech drah jednotlivých frakcí bylo naneseno 5 μΐ vzorku.
Obr. 10 zobrazuje afmitní izolaci (pull-down) proteinu obsahujícího značku His-tag (DdilHisTag) z bakteriálního lyzátu pomocí konjugátu 1. Proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE elektroforézy a gel byl obarven stříbrem. Dráha 1: All blue marker (2 μΐ); 2: volná dráha; 3: Load; 4: volná dráha; 5: Eluce: konjugát 1; 6: Eluce: konjugát 3; 7: Eluce: kontrola bez polymeru. Do všech drah jednotlivých frakcí bylo naneseno 5 μΐ vzorku.
Obr. 11 zobrazuje strukturu sloučeniny B určené k cílení proteinové značky GST-tag.
Obr. 12 zobrazuje strukturu konjugátu 5 určeného k cílení proteinů se značkou GST-tag.
-6CZ 308742 B6
Obr. 13 zobrazuje strukturu konjugátu 6 určeného k cílení proteinů se značkou GST-tag.
Příklady uskutečnění vynálezu
Všechny použité chemikálie pocházely od firmy Sigma-Aldrich, není-li uvedeno jinak. Všechny sloučeniny testované v biologických esejích byly vyčištěny pomocí preparativního HPLC systému Waters Delta 600 (průtok 7 ml/min; gradient zobrazený pro každou sloučeninu, včetně retenčních časů) s kolonou Waters SunFire C18 OBD Prep Column, 5 pm, 19x150 mm. Čistota sloučenin byla ověřena na analytickém HPLC systému Jasco PU-1580 HPLC (průtok 1 ml/min, s konstantním gradientem 2 až 100 % acetonitrilu ve 30 min; retenční čas zobrazen pro každou sloučeninu) s kolonou Watrex C18 Analytical Column, 5 pm, 250x5 mm. Finální sloučeniny byly minimálně 99% čistoty a jejich struktura byla dále potvrzena pomocí HR-MS na LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) a pomocí NMR (Bruker Avance I™ 500 MHz vybavený kryo-sondou). Všechny uvedené interakční konstanty jsou v Hz.
Příklad 1: Příprava sloučeniny A
Sloučenina A byla připravena podle následujícího schématu:
a) 1) DCC, DMF; 2) TFA
-7 CZ 308742 B6 (1) Sloučenina Ao
Sloučenina Ao, NH2-triNTA(o-tBu)9: Syntéza sloučeniny Ao byla provedena podle publikovaného postupu [7], s malou odchylkou v jednom kroku: v reakci mezi derivátem trikarboxylové kyseliny (odvozené od lysinu) a třemi monomery nitrilotrioctové kyseliny byl jako aktivační činidlo použit AA/V',/V-tetramethyl-O-(/V-sukcinimidyl)uronium tetrafluoroborát (TSTU) namísto NHS/EDC, jelikož TSTU poskytovalo výrazně vyšší výtěžky.
(2) Sloučenina A
Sloučenina A, NH2-PEG5-triNTA: Sloučenina Ao (52 mg, 38 pmol, 1,0 ekv., vyčištěna pomocí HPLC před tímto krokem) byla rozpuštěna v 1 ml DMF, kam bylo následně v jednom kroku přidáno 15 mg (38 pmol, 1,0 ekv.) linkeru Boc-O2Oc-O2Oc-OH (Iris-Biotech, #BAA1485). Do reakční směsi bylo dále přidáno 16 mg (76 pmol, 2,0 ekv.) DCC a reakce byla ponechána reagovat 24 h při pokojové teplotě. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno a surová směs byla smíchána s 1 ml čisté TFA; reakční směs byla následně střídavě míchána a sonikována ve vodní lázni 3 h. TFA byla odstraněna plynným dusíkem a konečný produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient: 2 až 30 % ACN v 50 min, R/ = 35 min). Hmotnost získaného čistého produktu byla 4 mg (výtěžek = 32 %).
Analytické HPLC (gradient 2 až 100 %, 30 min) RT = 12,0 min. HR-MS (ESI+): spočítáno pro C43H71O27N10 [M]+1159,44846. Nalezeno 1159,44849.
Příklad 2: Příprava konjugátu 1 (1) Příprava polymemího prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT)
Monomemí sloučeniny N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (Ma-P-Ala-TT) byly připraveny podle publikovaného postupu [1, 5], Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven pomocí RAFTkopolymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). V 7,3 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 1,0 g HPMA (85 % mol) a k roztoku bylo přidáno 318 mg Ma-P-Ala-TT (15 %mol) rozpuštěného v 1,9 ml DMSO, 2,42 mg 2-kyano-2-propylbenzodithioátu a 0,90 mg 2,2'-azobis(2methylpropionitrilu) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 70 °C (16 h). Polymemí prekurzor byl izolován vysrážením do směsi acetomdiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Koncové dithiobenzoátové skupiny byly odstraněny podle dříve publikovaného postupu [8],
Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 81 600 g/mol, polydisperzitou D = 1,18 a obsahující 14,6 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových (TT) skupin.
(2) Příprava konjugátu 1
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,040 g, Mw = 81 600 g/mol, 14,6% mol TT), sloučenina A (6,0 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (5 mg) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán Λζ/V-diisopropylethylamin (DIPEA) (8,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán 1amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 1 poly(HPMA-co-Ma-p-Ala-sloučeninaA-co-Ma-p-Ala-ATT0488-co-Ma-p-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi acetondiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích
- 8 CZ 308742 B6 příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 1 byl 22 mg. Obsah ATT0488 4,17 % byl stanoven spektrofotometricky (s502nm = 90 000 l.mol-1.cm-1, destilovaná voda) a obsah inhibitoru 11,28% byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
(3) Příprava konjugátu 3 (srovnávací konjugát sloužící jako negativní kontrola)
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) pro přípravu konjugátu 3 byl připraven RAFT-kopolymerací podle postupu popsaného v příkladu 2 (viz výše), s použitím následujícího složení polymerizační směsi: v 3,8 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 500 mg HPMA (85 % mol), 159 mg Ma-P-Ala-TT (15 %mol) rozpuštěného v 0,8 ml DMSO, 1,21 mg 2-kyano-2propylbenzodithioátu, 0,45 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitrilu). Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 85 900 g/mol, polydisperzitou D = 1,22 a obsahující 13,4 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin.
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,045 g, Mw = 85 900 g/mol, 13,4 %mol TT) a 5 mg biotinu-NH2 bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (2,5 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 3 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-ATT0488-co-Ma-P-Ala-NHbiotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl čištěn na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 3 byl 32 mg, obsah ATT0488 5,1 % a obsah biotinu 10,8 %.
Příklad 3: Příprava konjugátu 2 (1) Příprava konjugátu 2
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,030 g, Mw = 81 600 g/mol, 14,6 % mol TT; viz Příprava konjugátu 1), sloučenina A (3,5 mg) a N-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (4 mg) byly rozpuštěny v 0,3 ml DMSO. Poté byl přidán W-diisopropylcthylamin (DIPEA) (4,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (2 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 2 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-sloučeninaA-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton.-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 2 byl 21 mg. Obsah biotinu 5,53 % byl stanoven pomocí kitu HABA/Avidin (Sigma) a obsah inhibitoru 10,43 % byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N-HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
(2) Příprava konjugátu 4 (srovnávací konjugát sloužící jako negativní kontrola)
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) pro přípravu konjugátu 4 byl připraven RAFT-kopolymerací podle postupu popsaného v příkladu 2 (viz výše), s použitím následujícího složení polymerizační směsi: 500 mg of HPMA (90 % mol), 100 mg Ma-P-Ala-TT (10 %mol), 4,29 mg 2-kyano-2-propylbenzodithioátu, 1,59 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitrilu) a 4,5 ml terc-butanolu. Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s
-9CZ 308742 B6 molekulovou hmotností Mw = 26 000 g/mol, polydisperzitou D = 1,07 a obsahující 10,4 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin.
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,04 g, Mw = 26 600 g/mol, 10,4 % mol TT) byl rozpuštěn v 0,25 ml DMSO, k roztoku bylo přidáno 5 mg biotin-NH2. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (3,0 μΐ). Látky byly spolu ponechány reagovat po dobu 4 h pň teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ). Polymemí konjugát 4 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) byl izolován srážením do směsi acetondiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethyletheru, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 4 byl 28 mg a obsah biotinu 6,4 %.
Příklad 4: Vizualizace proteinů nesoucích značku His-tag pomocí Western blotu s využitím konjugátu 1 a 2
Konjugát 1 a konjugát 2 (30 μΜ, 100 μΐ) byly před použitím nejprve inkubovány 1 h při teplotě místnosti v přítomnosti 94mM chloridu nikelnatého (tj. ve lOOnásobném molámím přebytku nikelnatých kationtů vůči NTA skupinám) pro obsazení vazebných skupin nikelnatými kationty. Poté byly nenavázané kationty odstraněny dialýzou pomocí Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10 kDa MWCO). Dialýza probíhala při teplotě místnosti nejprve 3 h proti 5 1 destilované vody a poté 12 h proti 3 1 TBS.
Různá množství (0,1 až 10 ng) vyčištěného rekombinantního proteinu Miz chřipkového viru označeného značkou His-tag (Ml-HisTag) byla nanesena na SDS-PAGE elektroforézu; po provedení elektroforézy byl gel následně přeblotován na membránu (mokrý blot: 100 V/60 min). Povrch membrány byl poté blokován pomocí 1,1% (hmotn./obj.) roztoku kaseinu v PBS (Casein Buffer 20X-4X Concentrate, SDT) při teplotě místnosti po dobu 1 hod. Pro vizualizaci proteinu Ml-HisTag byla membrána inkubována při teplotě místnosti 1 h S 5nM konjugátem 1 v PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST), či protilátkou proti značce His-tag konjugovanou s křenovou peroxidázou (Sigma, #A7O58-1VL; 1:2000 v PBST). Poté byly bloty (inkubované v roztoku konjugátu 1) omyty třikrát PBST a inkubovány 1 h s NeutrAvidinem konjugovaným s křenovou peroxidázou (Thermo Scientific, #31001; 1:2500 v PBST). Nakonec byly bloty omyty třikrát PBST a na membránu byl nanesen chemiluminiscenční substrát SuperSignal West Classico/Dura/Femto Chemiluminescent Substráte (Thermo Scientific). Chemiluminiscence byla zaznamenána pomocí ChemiDoc-ItTM 600 Imaging System (UVP).
Při porovnání citlivosti detekce rekombinantního čištěného proteinu Ml-HisTag pomocí 5nM konjugátu 1 a komerční protilátky (obr. 7) je zřejmé, že způsob detekce s použitím konjugátu 1 je citlivější než s použitou protilátkou (přibližně 5krát) a má tedy i nižší limit detekce (100 pg vs. 500 pg).
Nespecifická reaktivita konjugátu 1 a konjugátu 2 na Western blotu byla testována s použitím bakteriálního lyzátu obsahujícího poly(A)-polymerázu z E. coli označenou značkou His-tag (PAPHisTag) (obr. 8).
Příklad 5: Afinitní izolace (pull-down) proteinu NEDD8 nesoucího značku His-tag (NEDD8HisTag) pomocí konjugátu 1
Afinitní izolace proteinu NEDD8-HisTag byla provedena jak za nativních podmínek v 20mM TrisHC1, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,4 (TBST), tak za denaturujících podmínek v 8M močovině, 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH 7,4.
Konjugát 1, konjugát 3 a konjugát 4 (tj. negativní kontroly zobrazující nespecifickou vazbu; jako čtvrtý vzorek byl použit pouze čistý nosič bez žádného přidaného konjugátu) byly předvázány na 20 μΐ Streptavidin Sepharózy (200nM roztok v 1000 μΐ TBST, obsahující ImM NiCh, 1 h, 6 °C).
- 10CZ 308742 B6
Po promytí 3 χ 1000 jal TBST byl nosič smíchán s 1000 μΐ roztoku NEDD8-HisTag (5 ng/μΐ; buď za nativních či denaturujících podmínek) a inkubován při 6 °C po dobu 3 h. Nosič byl poté promyt 3x1000 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 50 μΐ vzorkového pufru pro SDSPAGE a zahřátím na 98 °C po dobu 10 min.
Protein NEDD8-HisTag byl úspěšně izolován pomocí konjugátu 1 jak za nativních podmínek (obr. 9A), tak za denaturujících podmínek (obr. 9B). Jednotlivé negativní kontroly (konjugát bez inhibitoru; konjugát bez inhibitoru a ATT0488; prázdný nosič Streptavidin Sepharóze) prokázaly, že vazba NEDD 8-HisTag se děje specificky přes sloučeninu A s NTA skupinami.
Příklad 6: Afinitní izolace (pull-down) proteinu Ddil nesoucího značku His-tag (Ddil-HisTag) z bakteriálního lyzátu pomocí konjugátu 1
Afinitní izolace proteinu Ddil (DNA damage-inducible protein 1) označeného značkou HisTag (Ddil-HisTag) byla provedena pomocí konjugátu 1 z bakteriálního lyzátu obsahujícího protein Ddil-HisTag (obr. 10).
Konjugát 1, konjugát 3 (tj. negativní kontrola zobrazující nespecifickou vazbu; jako třetí vzorek byl použit pouze čistý nosič bez žádného přidaného konjugátu) byly předvázány na 30 μΐ Streptavidin Agarózy (200nM roztok v 1000 μΐ TBST, 1 h, obsahující ImM NiCE). Po promytí 3x1000 μΐ TBST byl nosič smíchán s 1000 μΐ roztoku Ddil-HisTag a inkubován při pokojové teplotě po dobu 1 h. Nosič byl poté promyt 3x 1000 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 30 μΐ 250 mM imidazolu a inkubací 30 min.
Protein Ddil-HisTag byl úspěšně izolován pomocí konjugátu 1 z bakteriálního lyzátu (obr. 10). Eluční frakce obsahovala vedle proteinu Ddil-HisTag i dva další proteiny: přítomnost jednoho (~15 kDa) byla dána nespecifitou triNTA skupiny, druhého (~22 kDa) pak vazbou tohoto proteinu na nosič Streptavidin Agaróza.
Příklad 7: Imobilizace rekombinantního lidského proteinu GCPII nesoucího značku His-tag (HisrhGCPII) a následné testování inhibiční potence inhibitorů GCPII
Do 96jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo na dno jamek naneseno 10 μΐ roztoku streptavidinu (o koncentraci 10 ng/μΐ) ve lOOmM borátovém pufru, pH 9,5 a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 h. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Neobsazený povrch jamky byl zablokován 0,55% (hmotn./obj.) roztokem kaseinu v TBS (Casein Buffer 20X4X Concentrate, SDT, 24 h). Po dalším promytí 3x 200 μΐ TBST byl na streptavidin navázán konjugát 2 nebo 4 (lOOnM v TBST, obsahující ImM NiCh, 2 h). Nenavázané konjugáty byly odmyty promytím 3x 200 μΐ TBST a následně byl do jamek přidán roztok rekombinantní HisrhGCPII v TBST (10 ng/jamku, 1 h, připravena podle [9]). Po promytí 3 χ 200 μΐ TBST byla přidána buď samotná detekční sonda ssPSMA (InM v TBST) vázající se do aktivního místa His-rhGCPII nebo směs této sondy a zvolené testované látky o zvolené koncentraci (typicky 100μΜ v TBST). Po inkubaci 1 h při teplotě místnosti byly jamky promyty 5x 200 μΐ TBST a množství navázané detekční sondy bylo poté stanoveno pomocí qPCR. Ze změny množství navázané sondy v jamkách inkubovaných s testovanou látkou oproti jamkám inkubovaným se samotnou sondou byla vypočtena frakce aktivních míst His-rhGCPII obsazených danou testovanou látkou a následně inhibiční konstanta této látky (podrobný popis detekční sondy ssPSMA a postupu výpočtu inhibiční konstanty je uveden v české patentové přihlášce PV 2014-527).
Pomocí tohoto postupu bylo možné určit inhibiční konstantu testovaného inhibitoru pomocí měření vzorku v jediné jamce; tato metoda byla použita pro změření dvaceti inhibitorů a získané hodnoty Ki odpovídaly hodnotám Ki obdrženým pomocí měření enzymové kinetiky His-rhGCPII.
V této patentové přihlášce byly popsány konjugáty obsahující sloučeniny založené na kyselině nitrilotrisoctové (NTA) vázající polyhistidinovou sekvenci (His-tag), jež je používána jako
- 11 CZ 308742 B6 purifikační a vizualizační značka u velké části rekombinantně připravovaných proteinů. Díky vazbě NT A na His-tag je tedy možné používat tyto konjugáty univerzálně na všechny proteiny nesoucí tuto afinitní značku. Pomocí SPR byla určena disociační konstanta vazby konjugátu na His-tag. Dále byly konjugáty použity pro izolaci a purifikaci proteinů s His-tag, jak v nativních, tak denaturujících podmínkách. Při použití konjugátu v metodě Western blot bylo možné detekovat velmi malá množství proteinů přenesených na membránu po SDS-PAGE elektroforéze. Limit detekce na Western blotu pomocí 5nM roztoku konjugátu 1 byl okolo 100 pg. Konjugát byl dále použit pro imobilizaci proteinů s His-tag v esejích odvozených od metody ELISA (v sendvičovém uspořádání), kdy jsou proteiny po imobilizaci přes His-tag inkubovány v přítomnosti testované látky a svého známého ligandu/inhibitoru (či obecně látky vázající se na tento protein), čímž bylo možné určit sílu vazby testovaných látek s daným proteinem a tím jejich inhibiční potenci.
Příklad 8: Příprava sloučeniny B
Sloučenina B byla připravena podle následujícího schématu:
a) Boc2O, THF/H2O; 1) TCEP, H2O, 2) Mal-PEG4-NHS, H2O/MeOH; c) ethylendiamin MeOH (1) Sloučenina Bo
- 12CZ 308742 B6
Kyselina (2S,2'S)-5,5'-(((2R,2'R)-disulfandiylbis(l-((karboxymethyl)amino)-l-oxopropan-3,2diyl))bis(azandiyl))bis(2-amino-5-oxopentanová), sloučenina Bo: 150 mg oxidovaného glutathionu (0,24 mmol, 1,0 ekv.) bylo rozpuštěno ve 3 ml vody a do roztoku bylo přidáno 111 mg Boc-anhydridu (0,50 mmol, 2,05 ekv.) rozpuštěného ve 3 ml methanolu. Pro zajištění bazického pH byla do reakční směsi přidána DIEA. Po 12 h byly veškeré látky odpařeny a surový produkt byl použit bez dalšího čištění v dalším kroku. Analytické HPLC prokázalo 99 % čistotu (Rt = 16,5 min). HRMS (ESI-) m/z pro C30H48O16N6S2 [M-H]“: spočítáno: 811,24954, nalezeno 811,24991.
(2) Sloučenina Bi
Kyselina (6S,6'S,11R,H'R)-11,1 T-(disulfandiylbis(methylen))bis(6-karboxy-2,2-dimethyl-4,9,12trioxo-3-oxa-5,10,13-triazapentadekan-15-ová), sloučenina By 90 mg sloučeniny Bo (0,11 mmol, 1,0 ekv.) bylo rozpuštěno v 1 ml vody a roztok byl za míchání 10 min probublán dusíkem. Poté bylo přidáno 35 mg tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP; 0,12 mmol, 1,1 ekv.) a reakce byla míchána po dobu 2 h pod inertní atmosférou. HPLC analýza prokázala kompletní vymizení sloučeniny Bo. Následně bylo přidáno 114 mg mal-dPEG4-NHS (0,22 mmol, 2,0 ekv., #PEG1575.0001, IRIS Biotech GmbH) rozpuštěného v 1 ml methanolu. Po 3 h byly těkavé látky odpařeny a surový produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient 15 až 50 % ACN v 50 min, Rt = 32 min). Po lyofilizaci bylo izolováno 95 mg sloučeniny Bi (výtěžek 47 %). Analytické HPLC: RT = 16,8. HRMS (ESI-) m/z pro C37H56Oi9N6S [M-H]“ spočítáno 919,32482, nalezeno 919,32444.
(3) Sloučenina B mg sloučeniny Bi (50 pmol, 1,0 ekv.) bylo rozpuštěno v 1 ml methanolu a k reakční směsi bylo přidáno 20 μΐ čerstvě redestilovaného ethylendiaminu (300 pmol, 6,0 ekv.). Reakční směs byla za míchání ponechána reagovat po dobu 3 h. Těkavé látky byly odpařeny a produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient 15 až 40 % ACN v 50 min, Rt= 29 min). Po lyofilizaci bylo izolováno 43 mg sloučeniny B (výtěžek 46 %). Analytické HPLC: Rt= 14,7. HRMS (ESI-) m/z pro C45H58O16N7S [M-H]“: spočítáno 866,38143, nalezeno 866,38118.
Příklad 9: Příprava konjugátu 5
Polymemí prekurzorpoly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,040 g, Mw= 81 600 g/mol, 14,6 %mol TT; viz Příprava konjugátu 1), sloučenina B (5,5 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (5 mg) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (8,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h pň teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 5 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-sloučenina B-co-Ma-P-AlaATTO488-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 5 byl 20 mg. Obsah ATTO488 4,78 % byl stanoven spektrofotometricky (85021™ = 90 000 LmolÁcm“1, destilovaná voda) a obsah glutathionu 10,87 % byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N-HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
Příklad 10: Příprava konjugátu 6
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,030 g, Mw = 81 600 g/mol, 14,6 % mol TT; viz příprava konjugátu 1), sloučenina B (3,8 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (4 mg) byly rozpuštěny v 0,3 ml DMSO. Poté byl přidán ΛΆ-diisopropylcthylamin
- 13 CZ 308742 B6 (DIPEA) (4,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (2 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 6 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-sloučenina B-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu 6 byl 18 mg. Obsah biotinu 5,23 % byl stanoven pomocí kitu HABA/Avidin (Sigma) a obsah glutathionu 10,85 % byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6NHC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 450 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-ftaldialdehydem.
Příklad 11: Afinitní izolace (pull-down) rekombinantního lidského proteinu GCPII s afínitní značkou GST-tag (GST-rhGCPII) pomocí konjugátu 5 a konjugátu 6
Afínitní izolace proteinu GST-rhGCPII byla provedena analogickým postupem jako v případě izolace proteinu nesoucího značku His-tag (viz příklad 5).
Konjugát 5, konjugát 6, konjugát 3 a konjugát 4 byly předvázány na 20 μΐ Streptavidin Sepharózy (200 nM roztok v 1000 μΐ TBST, 1 h, 6 °C). Po promytí 3* 1000 μΐ TBST byl nosič smíchán s 1000 μΐ roztoku GST-rhGCPII (5 ng/μΐ v TBST či lyzátu buněk LNCaP) a inkubován při 6 °C po dobu 3 h. Nosič byl poté promyt 3* 1000 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 50 μΐ vzorkového pufm pro SDS-PAGE a zahřátím na 98 °C po dobu 10 min.
Protein GST-rhGCPII byl úspěšně izolován pomocí konjugátu 5 a konjugátu 6 z obou vzorků (jak z čistého pufm, tak z lyzátu buněk LNCaP). Jednotlivé negativní kontroly (konjugát bez inhibitoru a konjugát bez inhibitom a ATTO488), prokázaly že vazba GST-rhGCPII se děje specificky přes vazebnou skupinu přítomnou na konjugátu.
Příklad 12: Kvantifikace interakce polymemích konjugátu s GST-rhGCPII pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR)
Měření interakce proteinu GST-rhGCPII s konjugáty 5 a 6 pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR) bylo provedeno na čtyřkanálovém SPR senzom vyvinutém na Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR v Praze [10-11], V typickém experimentu byl SPR čip (dodáván ÚFE AV ČR) ponořen na 1 h při 37 °C do ethanolového roztoku (7:3) alkanthiolů HS-(CH2)n-PEG4-OH a HS(CH2)h-PEG6-O-CH2-COOH (Prochimia) o výsledné koncentraci 0,2 mM. Čip byl následně opláchnut ethanolem pro UV spektroskopii, deionizovanou vodou a vysušen dusíkem. Nakonec byl čip nasazen na hranol SPR čipu; všechna měření byla provedena při 25 °C.
Aktivace koncových karboxylových skupin na povrchu senzom bylo provedeno in sítu přidáním směsi (1:1) ll,51mg/ml JV-hydroxysukcinimidu (NHS, Biacore) a 76,68 mg/ml l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu (EDC, Biacore) v deionizované vodě po dobu 5 min při průtoku 20 μΐ/min. Další části experimentu byly poté prováděny při průtoku 30 μΐ/min. Následně byl po dobu 8 min nanášen roztok neutravidinu (20 ng/μΐ) v lOmM octanu sodném, pH 5,0. Pro odstranění nespecificky navázaných molekul neutravidinu byl použit pufir o vysoké iontové síle (PBS s 0,5M NaCl) a poté byl pro deaktivaci zbylých aktivovaných karboxylových skupin aplikován 1M ethanolamin (Biacore). Na imobilizovaný neutravidin byl poté navázán konjugát 5 či 6 (1 μΜ v TBS, 10 min). Nakonec byl na tuto připravenou vrstvu injektován roztok rekombinantního proteinu GST-rhGCPII v TBS v proměnlivých koncentracích (koncentrace GSTrhGCPII byly 100, 200, 400 a 800 nM) a následně pouze TBS (fáze disociace). Křivky popisující vazbu byly exportovány a analyzovány v programu TraceDrawer v. 1.5 (Ridgeview Instruments AB) pro zisk parametrů kon a kOff.
Hodnota disociační konstanty mezi GST-rhGCPII a konjugátem 5 byla stanovena na Kd= 12 nM; mezi GST-rhGCPII a konjugátem 6 pak na Kd= 9 nM.
- 14CZ 308742 B6
Příklad 13: Imobilizace GST-rhGCPII a následné testování inhibiční potence inhibitorů GCPII
Experiment byl proveden analogicky k experimentu s imobilizaci GCPII přes značku His-tag (příklad 7).
Do 96jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo na dno jamek naneseno 10 μΐ roztoku streptavidinu (o koncentraci 10 ng/μΐ) ve lOOmM borátovém pufru, pH 9,5 a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 h. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Neobsazený povrch jamky byl zablokován 0,55% (hmotn./obj.) roztokem kaseinu v TBS (Casein Buffer 20X4X Concentrate, SDT, 24 h). Po dalším promytí 3* 200 μΐ TBST byl na streptavidin navázán konjugát 6 nebo 4 (lOOnM v TBST, 2 h). Nenavázané konjugáty byly odrnyty promytím 3* 200 μΐ TBST a následně byl do jamek přidán roztok rekombinantní GST-rhGCPII v TBST (lOng/jamku, 1 h, připravena podle [9]). Po promytí 3 x 200 μΐ TBST byla přidána buď samotná detekční sonda ssPSMA (InM v TBST) vázající se do aktivního místa GST-rhGCPII nebo směs této sondy a zvolené testované látky o zvolené koncentraci (typicky 100μΜ v TBST). Po inkubaci 1 h při teplotě místnosti byly jamky promyty 5* 200 μΐ TBST a množství navázané detekční sondy bylo poté stanoveno pomocí qPCR. Ze změny množství navázané sondy v jamkách inkubovaných s testovanou látkou oproti jamkám inkubovaným se samotnou sondou byla vypočtena frakce aktivních míst GST-rhGCPII obsazených danou testovanou látkou a následně inhibiční konstanta této látky (podrobný popis detekční sondy ssPSMA a postupu výpočtu inhibiční konstanty je uveden v české patentové přihlášce PV 2014-527).
Pomocí tohoto postupu bylo možné určit inhibiční konstantu testovaného inhibitoru pomocí měření vzorku v jediné jamce; tato metoda byla použita pro změření dvaceti inhibitorů a získané hodnoty Ki odpovídaly hodnotám Ki obdrženým pomocí měření enzymové kinetiky GST-rhGCPII.
Konjugáty 5 a 6 obsahující vazebnou skupinu pro GST-tag byly použity pro afmitní izolaci a purifikaci proteinů s GST-tagem z různých vzorků. Pomocí SPR byla analyzována vazba mezi těmito polymery a proteinem nesoucím GST-tag; disociační konstanta této vazby se nacházela v nanomolámí oblasti (okolo 10 nM). Dále, analogickým způsobem jako v případě konjugátu vázajícím His-tag, byl i tento konjugát použit pro imobilizaci proteinů se značkou GST-tag a následné testování látek kompetujících ve vazbě se známým ligandem daného proteinu.
Seznam referencí:
1. Ulbrich, K. and V. Subr, Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers. Adv Drug Deliv Rev, 2010. 62(2): p. 150-66.
2. Ulbrich, K., et al., Polymeric drugs based on conjugates of synthetic and natural macromolecules I. Synthesis and physico-chemical characterisation. Journal of Controlled Release, 2000. 64(1-3): p. 63-79.
3. Etrych, T., et al., N-(2-hydroxypropyl)niethacrylamide-basedpolymer conjugates with pHcontrolled activation of doxorubicin. I. New synthesis, physicochemical characterization and preliminary biological evaluation. Journal of Applied Polymer Science, 2008.109(5): p. 30503061.
4. Subr, V., et al., Synthesis of Well-Defined Semitelechelic Poly[N-(2hydroxypropyl)methacrylamide] Polymers with Functional Group at the alpha-End of the Polymer Chain by RAFT Polymerization. Macromolecules, 2013. 46(6): p. 2100-2108.
5. Subr, V. and K. Ulbrich, Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups. Reactive & Functional Polymers, 2006. 66(12): p. 1525-1538.
- 15 CZ 308742 B6
6. Kopeček, J., P. Rej manova, and V. Chytrý, Polymers Containing Enzymatically Degradable Bonds. 1. Chymotrypsin Catalyzed-Hydrolysis of Para-Nitroanilides of Phenylalanine and Tyrosine Attached to Side-Chains of Co-Polymers of N-(2-Hydroxypropyl)Methacrylamide. Makromolekulare Chemie-Macromolecular Chemistry and Physics, 1981. 182(3): p. 799-809.
7. Huang, Z , et al., Tris-nitrilotriacetic acids of subnanomolar affinity toward hexahistidine tagged molecules. Bioconjug Chem, 2009. 20(8): p. 1667-72.
8. Perrier, S., P. Takolpuckdee, and CA. Mars, Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization: End group modification for functionalized polymers and chain transfer agent recovery. Macromolecules, 2005. 38(6): p. 2033-2036.
9. Tykvart, J., et al., Efficient and versatile one-step affinity purification of in vivo biotinylated proteins: expression, characterization and structure analysis of recombinant human glutamate carboxypeptidase IE Protein Expr Purif, 2012. 82(1): p. Ji 106-15.
10. Hegnerova, K., et al., Surface plasmon resonance biosensors for detection of Alzheimer disease biomarker. Sensors and Actuators B-Chemical, 2009.139(1): p. 69-73.
11. Pimkova, K., et al, Surface plasmon resonance biosensor for the detection of VEGFR-l-a protein marker of myelodysplastic syndromes. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012. 402(1): p. 381-387.
Claims (7)
1. Syntetický makromolekulámí konjugát pro použití pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro, přičemž uvedený syntetický makromolekulámí konjugát obsahuje syntetický kopolymer připravitelný kopolymerací alespoň jednoho monomem obecného vzorce 1:
kde:
R1 je vybráno z H, CH3; a
R2 je vybráno z NH2, NH-CH2-CH(OH)-CH3, NH-CH3, NH-CH2CH3, NH-CH2CH2-OH, NHCH2CH2CH2-OH, NHC(CH2OH)3, NH-CH2CH2-N+(CH3)3C1, O-CH2CH2-OH, O-(CH2CH2O)2H O-(CH2CH2O)3-H, O-CH2CH2-N+(CH3)3C1- NH-(CH2)3N+(CH3)2-(CH2)2-COO-;
a alespoň jednoho monomem obecného vzorce 2:
2. Makromolekulám! konjugát podle nároku 1, vyznačený tím, že molekulová hmotnost konjugátu je v rozmezí 20 000 až 150 000 g/mol.
(2), kde:
R1 je vybráno z H, CH3; a
X je vybráno z NH-(CH2)2-CO, NH-(CH2)3-CO, NH-(CH2)4-CO, NH-(CH2)5-CO-, Gly, GlyGly, GlyPheLeuGly; a
R3 je vybráno z:
přičemž
- 17CZ 308742 B6
- alespoň jedna reaktivní skupina R3 je v kopolymeru nahrazena kovalentně vázanou vazebnou skupinou vybranou z nitrilotrioctové kyseliny a tris(nitrilotrioctové) kyseliny, a
- alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena kovalentně vázanou afmitní kotvou vybranou ze skupiny zahrnující biotin, FLAG tag, His-tag, HA tag, Strep-tag, Avi-Tag, GST, c-myc-tag, V5tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, poly(Glu)-tag, kalmodulinový tag a/nebo alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena kovalentně vázanou reportérovou skupinou vybranou ze skupiny zahrnující fluorescenční sloučeniny, radionuklidy a komplexy kovů, a přičemž molekulová hmotnost konjugátu je s výhodou v rozmezí 1000 až 500 000 g/mol.
3. Makromolekulám! konjugát podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že vazebná skupina je připojena prostřednictvím spojky na bázi polyethylenglykolu, peptidu, s výhodou peptidu o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol, nebo nukleové kyseliny, s výhodou nukleové kyseliny obsahující 1 až 40 nukleotidů, nebo oligosacharidu, s výhodou oligosacharidu obsahujícího 1 až 40 monosacharidů.
4. Makromolekulám! konjugát podle nároku 1, vyznačený tím, že reportérová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující fluorofory s excitačním maximem v rozmezí 350 až 850 nm, s výhodou ATTO488, DY676; komplexy lanthanoidů Gd, Mn, Dy, Eu; a komplexy radionuklidů 64Cu, 68Ga, 18F, 99mTc, 1231, 125I, I31I,57Co, 51Cr, 67Ga, 64Cu, “Τη, 9Ύ.
5. Použití makromolekulámího konjugátu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk in vitro.
6. Použití makromolekulámího konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 v imunochemické metodě, s výhodou vybrané z ELISA, Western blotu a jeho modifikací, průtokové cytometric, imunoprecipitace, imunocytochemie.
7. Použití makromolekulámího konjugátu podle nároku 1 in vitro pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů obsahujících afmitní značku His-tag či GST-tag.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-19A CZ308742B6 (cs) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů |
| US15/542,792 US10114014B2 (en) | 2015-01-14 | 2016-01-13 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins |
| AU2016207125A AU2016207125B2 (en) | 2015-01-14 | 2016-01-13 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins |
| CA2970845A CA2970845C (en) | 2015-01-14 | 2016-01-13 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins |
| SG11201705002SA SG11201705002SA (en) | 2015-01-14 | 2016-01-13 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins |
| PCT/CZ2016/050002 WO2016112882A2 (en) | 2015-01-14 | 2016-01-13 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins |
| EP16706121.7A EP3245513B1 (en) | 2015-01-14 | 2016-01-13 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins |
| IL253406A IL253406B (en) | 2015-01-14 | 2017-07-11 | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and imaging of proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-19A CZ308742B6 (cs) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ201519A3 CZ201519A3 (cs) | 2016-07-27 |
| CZ308742B6 true CZ308742B6 (cs) | 2021-04-21 |
Family
ID=55411123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-19A CZ308742B6 (cs) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | Makromolekulární konjugáty pro izolaci, imobilizaci a vizualizaci proteinů |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10114014B2 (cs) |
| EP (1) | EP3245513B1 (cs) |
| AU (1) | AU2016207125B2 (cs) |
| CA (1) | CA2970845C (cs) |
| CZ (1) | CZ308742B6 (cs) |
| IL (1) | IL253406B (cs) |
| SG (1) | SG11201705002SA (cs) |
| WO (1) | WO2016112882A2 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ310444B6 (cs) * | 2021-09-13 | 2025-06-25 | Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. | Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití |
| CZ310462B6 (cs) * | 2022-04-22 | 2025-07-09 | Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. | Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001094032A1 (de) * | 2000-06-02 | 2001-12-13 | Eppendorf Ag | Verfahren zur herstellung von als ausgangsprodukte für mikroarrays dienenden oberflächenfunktionalisierten trägern zur immobilisierung von biomolekülen |
| EP2362220A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-31 | Corning Incorporated | Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4778751A (en) * | 1986-05-12 | 1988-10-18 | Diagnostic Products Corporation | Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies |
| US7662360B2 (en) * | 2002-07-22 | 2010-02-16 | Psimei Pharmaceuticals Plc | Conjugates of N-hydroxypropymethacrylamide-methacrylate copolymer with nuclide activation agent and/or anti-cancer compounds |
| CZ294996B6 (cs) * | 2003-07-16 | 2005-04-13 | Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr | Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů |
| CZ2014527A3 (cs) | 2014-08-05 | 2016-02-17 | Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I. | Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů |
-
2015
- 2015-01-14 CZ CZ2015-19A patent/CZ308742B6/cs unknown
-
2016
- 2016-01-13 EP EP16706121.7A patent/EP3245513B1/en active Active
- 2016-01-13 WO PCT/CZ2016/050002 patent/WO2016112882A2/en not_active Ceased
- 2016-01-13 AU AU2016207125A patent/AU2016207125B2/en active Active
- 2016-01-13 US US15/542,792 patent/US10114014B2/en active Active
- 2016-01-13 SG SG11201705002SA patent/SG11201705002SA/en unknown
- 2016-01-13 CA CA2970845A patent/CA2970845C/en active Active
-
2017
- 2017-07-11 IL IL253406A patent/IL253406B/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001094032A1 (de) * | 2000-06-02 | 2001-12-13 | Eppendorf Ag | Verfahren zur herstellung von als ausgangsprodukte für mikroarrays dienenden oberflächenfunktionalisierten trägern zur immobilisierung von biomolekülen |
| EP2362220A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-31 | Corning Incorporated | Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof |
Non-Patent Citations (9)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2016207125B2 (en) | 2018-05-17 |
| SG11201705002SA (en) | 2017-07-28 |
| AU2016207125A1 (en) | 2017-07-13 |
| WO2016112882A2 (en) | 2016-07-21 |
| CZ201519A3 (cs) | 2016-07-27 |
| US20180011085A1 (en) | 2018-01-11 |
| EP3245513B1 (en) | 2019-07-10 |
| CA2970845A1 (en) | 2016-07-21 |
| IL253406B (en) | 2019-09-26 |
| EP3245513A2 (en) | 2017-11-22 |
| CA2970845C (en) | 2019-11-26 |
| US10114014B2 (en) | 2018-10-30 |
| IL253406A0 (en) | 2017-09-28 |
| WO2016112882A3 (en) | 2016-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10302632B2 (en) | Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells | |
| EP2960263B1 (en) | Polymer backbone element tags | |
| US20120220540A1 (en) | Synbodies to akt1 | |
| US10138267B2 (en) | Bioconjugates of heterocyclic compounds | |
| EP3177931A2 (en) | Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites | |
| EP4013834B1 (en) | Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof | |
| CA2970845C (en) | Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins | |
| Bloch et al. | The effect of linker type and recognition peptide conjugation chemistry on tissue affinity and cytotoxicity of charged polyacrylamide | |
| US11614445B2 (en) | Background blockers for binding assays | |
| KR100941679B1 (ko) | 인산기-선택적인 형광 프로브를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법 | |
| JP2018501238A (ja) | 合成ビエピトープ化合物 | |
| US20240280568A1 (en) | Affinity reagents having artificial polymer scaffolds | |
| US20250237656A1 (en) | Method for detecting an analyte of interest in a sample | |
| CN102822673B (zh) | 制备多生物素化化合物的方法 | |
| Tran | Nucleic Acid-Protein Hybrid Materials |