CZ310462B6 - Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití - Google Patents

Abstract

Vynález se týká makromolekulárních blokátorů nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a významně tak snižuje nespecifické interakce ve stanovení. Makromolekulární blokátor obsahuje syntetický kopolymer nebo homopolymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát, poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), 2-polyoxazolín, na nějž je kovalentní vazbou připojena alespoň jedna hydrofobně-aktivní kotva umožňující omezení nespecifických interakcí v imunotestech. Řešení se dále týká způsobu přípravy a použití makromolekulárních blokátorů pro cílené zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze.

Description

Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález popisuje syntetické makromolekulámí blokátory nespecifických interakcí během imunochemických stanovení a adherentní kotvy umožňující provedení imunotestů bez přítomnosti běžně používaných blokačních proteinů.

Dosavadní stav techniky

Jedním z klíčových problémů každého imunochemického stanovení, tj. stanovení využívajícího interakci analytu se specifickou protilátkou, imunoglobulinem, je problém nespecifických vazeb jednotlivých reaktantů (analytu, dalších složek ze vzorku, protilátky a komplexu analytprotilátka) na povrch pevné fáze používané jako součást systému, případně na povrch reakční nádobky. Problém nespecifických vazeb, v anglickém jazyce zkracovaný jako NSB (NonSpecific-Binding), vede ke zhoršení některých parametrů stanovení (citlivost, specificita a reprodukovatelnost). K minimalizaci NSB se nejčastěji používají inertní, tj. k vlastní imunochemické reakci indiferentní, reaktanty vázající se na pevnou fázi nespecificky a tím minimalizující analogickou nespecifickou vazbu molekul účastnících se imunochemické reakce, respektive detekce.

Historicky nej používanějšími blokátory NSB jsou proteiny živočišného původu, a sice hovězí sérový albumin (BSA), kasein, odtučněné mléko, rybí případně prasečí želatina, apod. Společnou nevýhodou těchto blokátorů živočišného původu je nezanedbatelná variabilita jednotlivých výrobních šarží vyžadující nákladné testování každé nové šarže u koncových uživatelů, kteří tyto blokátory používají pro svoji standardizovanou výrobu. Další nevýhodou související s používáním vstupního materiálu živočišného původu jsou požadavky na testy prokazující nezávadnost z hlediska obsahu příslušnou legislativou vyjmenovaných zvířecích patogenů či kontaminantů.

Jako nej používanější blokátor nespecifických interakcí, a to i přes výše uvedené výhrady, lze označit BSA. Pro účely imunochemických testů se jedná o tzv. „Albumin Fraction V“, izolovanou způsobem, kdy dochází ke zničení enzymatických aktivit proteáz. BSA se nepoužívá pouze jako blokátor NSB, ale nemálo diagnostických systémů využívá BSA konjugované s biotinem k vazbě avidinu, resp. streptavidinu, a následně pak k vazbě další biotinylované složky jako protilátky či antigenu. Využití avidinu či streptavidinu jako „cross“ reaktantů díky jeho čtyř vazebným místům pro biotin se s výhodnou používá pro konstrukci relativně robustní pevné fáze. BSA však rozhodně není ideální molekulou optimalizovanou pro potlačení těchto nespecifických interakcí, a to ani svými sorpčními vlastnostmi, ani vlastnostmi, které vyplývají z toho, že BSA je živočišného původu.

Syntetické molekuly, např. detergenty jako Tween 20 nebo polymery jako je póly viny lalkohol nebo Ficoll, byly použity jako alternativy pro proteinová blokující činidla (Rodda, D.J. and H. Yamazaki, Poly(vinyl alcohol) as a blocking agent in enzyme immunoassays. Immunological Investigations, 1994. 23(6-7): p. 421-428; Gardas, A. and A. Lewartowska, Coating of proteins to polystyrene ELISA plates in the presence of detergents. Journal of Immunological Methods, 1988. 106(2): p. 251-255; Steinitz, M., Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry, 2000. 282(2): p. 232-238; Lim, C.S., et al, On optimizing the blocking step of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for Epstein-Barr virus serology. Clinica Chimica Acta, 2013. 415: p. 158-161), nicméně často nebrání nespecifické vazbě v dostatečné míře (Huber, D., et al., Effectiveness of natural and synthetic blocking reagents and their application for detecting food allergens in enzyme-linked

- 1 CZ 310462 B6 immunosorbent assays. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009. 394(2): p. 539-548). Proto existuje poptávka po lepších technikách blokování.

Byla popsána blokovací činidla, která jsou strukturně na bázi kationtových povrchově aktivních látek založených na strukturně různých poly(ethylenglykolech) konjugovaných s alkylaminy (Fujimoto, N., et al., Polyethylene glycol-conjugated alkylamines - A novel class of surfactants for the saturation of immunoassay solid phase surfaces. Taianta, 2020. 211; Fujimoto, N., et al.. Novel synthetic blocking reagents. 2010: EP 2261662 Al). Kromě modifikovaných PEG bylo popsáno, že použití polyvinylalkoholu snižuje množství nespecifické vazby protilátek a polyvinylpyrrolidon zvyšuje citlivost detekce protilátek (Studentsov, Y.Y., et al., Enhanced enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to virus-like particles of human papillomavirus. Journal of Clinical Microbiology, 2002. 40(5): p. 1755-1760).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká syntetických makromolekulámích blokátorů nespecifických interakcí v imunotestech a podobných typech diagnostických testů schopných potlačit nespecifickou sorpci použitých protilátek či jiných makromolekul na pevnou fázi. Vynález popisuje molekuly na bázi polyHPMA, které mohou být použitelné k náhradě BSA a k potlačení nespecifických interakcí v diagnostických stanoveních. Vynález dále popisuje využití syntetických makromolekul jako vysoce účinných adherentních kotev nahrazujících používané blokační proteiny v adhezní složce diagnostických testů. Polymemí konjugáty podle předkládaného vynálezu jsou vysoce biokompatibilní, neimunogenní, netoxické, velmi dobře rozpustné ve vodných roztocích a umožňují připojit jak molekuly pouze jediného typu, tak i kombinace různých typů s různými funkcemi. Využití kontrolované radikálové kopolymerizace rovněž umožňuje připravit telechelické polymery nesoucí dvě různé funkční skupiny na koncích svých řetězců.

Předkládaný vynález popisuje vodorozpustný syntetický polymemí konjugát (makromolekulám! blokátor nespecifických interakcí), který obsahuje funkční součásti, a to především “hydrofobněaktivní” kotvu a ligand omezující nespecifické nekovalentní interakce v biologických médiích (“interakce-snižující ligand”), které slouží jako synergické součásti systému a zvyšují blokační aktivitu makromolekulámího blokátorů nespecifických interakcí. Základní funkcí popsaného blokátorů je jeho vysoká aktivita při účinném blokování povrchu pevné fáze a při blokování nespecifických interakcí v roztoku, čímž se významně omezuje komplexní nespecifická interakce analytu s povrchem pevné fáze. Tímto omezením nespecifické sorpce klesá signál šumu a současně se zvyšuje podíl signálu analytu k signálu šumu, což vede k významnému zpřesnění analytického stanovení. S výhodou je možné popsaný makromolekulámí blokátor využít i pro ukotvení bio-specifické molekuly, např. avidinu, streptavidinu, a následně pak k vazbě další složky reagující s bio-specifickou složkou, např. biotinylovanou, jako jsou protilátky či antigeny. V tomto případě makromolekulámí blokátor obsahuje navíc bio-specifickou kotvu, s výhodou biotin. S výhodou je možné kombinovat dvě varianty makromolekulámího blokátom, a to blokátor neobsahující bio-specifickou kotvu a blokátor obsahující tuto kotvu. Druhý z blokátorů umožní navázání bioaktivní molekuly, např. avidinu, na pevnou fázi, a první blokátor, který neobsahuje bio-specifickou kotvu, je zodpovědný za dokonalé odstínění nespecifických interakcí analytu s povrchem pevné fáze.

Kostra makromolekulámího blokátom je tvořena syntetickým kopolymerem, na který jsou kovalentní vazbou připojeny funkční součásti: i) alespoň jedna “hydrofobně-aktivní” kotva umožňující omezení nespecifických interakcí v imunotestech; ii) s výhodou “interakce-snižující ligand” zvyšující blokační aktivitu celého blokátom; iii) v některých případech může kopolymer s výhodou obsahovat ještě bio-specifickou kotvu.

-2CZ 310462 B6

Předmětem předkládaného vynálezu je polymemí konjugát fungující jako makromolekulám! blokátor nespecifických interakcí v biologických médiích, který má obecný vzorec XXX

CH₃

(XXX), ve kterém je zastoupení monomemích jednotek obecného vzorce I v rozmezí od 0,5 do 10 % mol.;

CH₃

Γ Ί ——CH?———

L J (I) přičemž R² je vybrané ze skupiny sestávající z: fenyl; -NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b(CH=CH-CH2)_a-(CH2)b-CH3; -O-(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

přičemž X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; přičemž pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² navázaná přes svou koncovouNH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlík (pokud R² je fenyl) ke koncové karbonylové skupině spojky X;

přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

a přičemž D jsou nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z:

1^. '’li, Η 2 ™Ό ™”52 H j

- 3 CZ 310462 B6

R je vybrané ze skupiny sestávající z -OH,

-4CZ 310462 B6

- 5 CZ 310462 B6

kde n je celé číslo od 1 do 5;

a přičemž molekulová hmotnost polymemího konjugátu je v rozmezí od 5000 do 500 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 10 000 do 150 000 g/mol, výhodněji v rozmezí od 15 000 do 60 000 g/mol (což odpovídá 80 až 400 monomemím jednotkám).

Přirozenými aminokyselinami se rozumí histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, kyselina asparagová, asparagin, kyselina glutamová, serin, selenocystein.

Postranními řetězci přirozené aminokyseliny jsou řetězce navázané k alfa-uhlíku dané aminokyseliny.

Ve výhodném provedení jsou tyto postranní řetězce přirozené aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující methyl, isopropyl, isobutyl, -C H(CH,)(CH2C^ -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH₂-(C₆H4)OH, -(CH₂)2-S-CH₃, -CH2SH, -(CH₂)₄-NH₂, -CH2COOH, -CH₂C(O)NH₂, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)2C(O)NH₂, -(CH₂)₃NH-C(=NH)(NH₂), benzyl.

Ve výhodném provedení je X spojkou -NH-(CH₂)n-C(=O)-; přičemž n je vybráno ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; výhodněji n je 2;

a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)b-CH₃; -NH-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a(CH2)b-CH₃; -O-(CH2)b-CH₃; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

V nej výhodnějším provedení je X spojka-NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je vybráno ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; výhodněji n je 2;

a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)n-CH₃; -NH-(CH2)s-CH=CH-(CH2)7-CH₃; -O-(CH2)n-CH₃; přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

Ve výhodném provedení je R vybrané ze skupiny sestávající z:

-6CZ 310462 B6

Ve výhodném provedení je koncová skupina D vybraná ze skupiny sestávající z € H j

--C —

CN

CHj

--C —C -CH ₅

CN

nebo ___q 'C $ Ό -C

CN o výhodněji je koncovou skupinou

S výhodou polymemí konjugát v tomto provedení obsahuje od 0,7 do 5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, výhodněji od 0,7 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, ještě výhodněji od 0,9 do 2 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I.

V závislosti na způsobu přípravy uvedeného polymemího konjugátu může tento po navázání hydrofobně-aktivní kotvy jako postranní řetězce obsahovat rezidua aktivních esterů (například thiazolidin-2-thionovou skupinu). Tyto aktivní skupiny se odstraní reakcí s aminoalkoholem, což dává vzniknout monomemím jednotkám obecného vzorce III. V tomto provedení tedy polymemí konjugát dále obsahuje kromě monomemích jednotek obecného vzorce I ještě monomemí jednotky obecného vzorce III

-7 CZ 310462 B6

k r^! (III), kde

R⁴ je vybrané ze skupiny sestávající z -NH-(CH2)_X-CH2(OH); -NH-(CH2)_y-CH(OH)-CH3;

-NH-(CH2)y-CH(OH)-(CH2)_z-CH3; a -NH-C(=O)-CH3; kde x je celé číslo od 0 do 4, y je celé číslo od 0 do 3 a z je celé číslo od 1 do 4; přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R⁴ navázaná přes svou koncovou -NH- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

Množství monomemích jednotek základního lineárního polymeru, které jsou statisticky nahrazené polymemími jednotkami obecného vzorce III je od alespoň jedné monomemí jednotky do 15 % mol. monomemích jednotek, s výhodou od 1 % mol. do 12 % mol. monomemích jednotek, výhodněji od 5 do 9,5 %mol. monomemích jednotek.

Ve výhodném provedení může polymemí konjugát obsahovat kromě hydrofobně-aktivní kotvy dále “interakce-snižující ligand”, zvyšující blokační aktivitu celého blokátom, a/nebo biospecifickou kotvu. V obou případech jsou tyto řetězce připojeny k polymemímu konjugátu jako postranní řetězce monomemích jednotek. Jako bio-specifická kotva může sloužit například biotin,

His6 nebo tris-nitrilooctová kyselina. Interakce-snižujícím ligandem je například aminocyklooktyl, aminochinuklidin nebo norbomenyl.

V tomto provedení tedy polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu má dále od alespoň jedné monomemí jednotky do 10 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymem statisticky nahrazeno monomemími jednotkami obecného vzorce V / ch₃\ J^CHz-C—/c—o x

Ř (V), kde

R je definováno výše;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)_n-C(=O)-; -NH-(CH2-CH2-O)_o-CH2CH₂-C(=O)-; -O-(CH2-CH₂-O)o-CH2-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_PC(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; o je celé číslo od 1 do 15; p, q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

-8CZ 310462 B6 přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je navázané přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce V.

V jednom provedení obsahuje polymemí konjugát od 0,5 do 5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, s výhodou od 0,7 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, výhodněji od 0,9 do 2 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I.

V jednom provedení obsahuje polymemí konjugát od 0 do 15 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III, s výhodou od alespoň jedné monomemí jednotky do 12 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III, výhodněji od 1 % mol. do 9,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III.

V jednom provedení obsahuje polymemí konjugát od 0 do 10 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V, s výhodou od 0 do 5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V, výhodněji od 0,5 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V, výhodněji od 0,7 do 2,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V.

Ve výhodném provedení obsahuje polymemí konjugát od 65 do 99,5 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymem, od 0,5 do 10 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, od 0 do 10 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V a od 0 do 15 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III.

S výhodou obsahuje polymemí konjugát od 78,0 do 99,3 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymem, od 0,7 do 5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, od 0 do 5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V, a od 0 do 12 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III.

S výhodou obsahuje polymemí konjugát od 81 do 98,8 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymem, od 0,7 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, od 0,5 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V a od 0 do 12 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III.

V jednom provedení obsahuje polymemí konjugát od 98 do 99,1 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymem, od 0,9 do 2 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I.

V jednom provedení má polymemí konjugát obecný vzorec B

kde

-9CZ 310462 B6

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; a přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R² je definované výše

R⁴je definované výše;

R je definované výše;

přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, jsou skupiny R², R⁴ a R navázané přes svou koncovou-NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlíkový atom (v případě, že R² je fenyl) ke koncové karbonylové skupině spojky X;

a přičemž koncové skupiny D statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce B jsou definovány výše. Monomemí jednotky v obecném vzorci B odpovídají monomemí jednotce HPMA a monomemím jednotkám obecného vzorce I, III a V, jejichž zastoupení je s výhodou následující: od 81 do 98,8 % mol. monomemích jednotek HPMA, od 0,7 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I, od 0,5 do 3,5 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce V a od alespoň jedné monomemí jednotky do 12 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce III.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob přípravy polymemího konjugátu, který obsahuje následující kroky:

0) poskytnutí monomerů lineárního kopolymeru;

i) polymerace monomerů lineárního kopolymeru, a to buď roztokovou nebo srážecí radikálovou polymerací nebo RAFT polymerací nebo kationtovou polymerací za otevření kruhu;

ii) navázání hydrofobní kotvy, popřípadě hydrofobně-podpůrné kotvy na lineární kopolymer za vzniku konjugátu;

iii) popřípadě navázání bio-specifické kotvy.

Uvedené polymemí konjugáty na bázi vinylických nebo cyklických monomerů jsou připraveny buď klasickou radikálovou roztokovou nebo srážecí polymerizací nebo kontrolovanou RAFT polymerizací.

Prekurzory polymemích konjugátů popsaných výše jsou s výhodou připravovány klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací monomerů HPMA a monomerů obecného vzorce Y a/nebo Z a popřípadě T

CH₃

CH_Z—C c-o

I (Y),

-10 CZ 310462 B6 ch₃

CHř—C

C—O

I

X (Z), ch₃

CH?—C

C-0

X R (T),

R² je vybrané ze skupiny sestávající z: fenyl; -NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a -(CH2)_b-CH₃;

-O-(CH2)b-CH₃; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

přičemž pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² je navázaná přes svou koncovou-NHnebo -O- skupinu nebo přes uhlík (v případě fenylu) ke koncové karbonylové skupině spojky X;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)_n-C(=O)-; navázaná přes svou koncovou NH- nebo -O- skupinu ke karbonylové skupině monomeru obecného vzorce Y nebo Z nebo T, přičemž n je celé číslo od 1 do 7;

přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R⁷ je vybraný z

R je definované výše;

přičemž krok i) se provede roztokovou nebo srážecí radikálovou kopolymerací nebo RAFT polymerací monomeru HPMA a monomerů obecného vzorce Y a/nebo Z a/nebo T; přičemž alespoň jedním z monomerů je monomer obecného vzorce Y a/nebo Z, přičemž celkový obsah komonomerů obecného vzorce Y a Z je v rozmezí od 0,5 do 20 % mol., vztaženo na celkový počet monomerů; a přičemž reakce se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, JVýV-dimethylacetamid, ΛΆ'-dimcthylformamid. sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon. aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

- 11 CZ 310462 B6 za vzniku lineárního kopolymeru.

Popřípadě se následně nahradí skupiny R⁷ hydrofobním molekulou obecného vzorce R²-H, kde R² je definováno výše, za vzniku polymemího konjugátu, obsahujícího hydrofobně-aktivní kotvu navázanou amidovou nebo esterovou vazbou ke karbonylové skupině postranního řetězce monomemí jednotky.

Skupiny R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionové skupiny lineárního kopolymeru se popřípadě současně s předchozím krokem nebo následně konjugují s nejvýše 10 % mol. (0 až 10 % mol.), vztaženo na celkový počet monomerů, biospecifické skupiny vzorce R-H, kde R je definované výše, za vzniku polymemího konjugátu, obsahujícího biospecifickou skupinu R navázanou amidovou nebo esterovou vazbou ke karbonylové skupině postranního řetězce monomemí jednotky.

Případné nezreagované reaktivní skupiny R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionové skupiny se odstraní reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)_X-CH2(OH); NH2-(CH2)_yCH(OH)-CH3; NH2-(CH2)_y-CH(OH)-(CH2)z-CH3; kde x je celé číslo od 0 do 4, y je celé číslo od 0 do 3 azje od 1 do 4; s výhodou je aminoalkoholem l-aminopropan-2-ol.

V jednom provedení se polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu připraví klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací monomem HPMA a monomerů obecného vzorce Z, přičemž obsah monomerů obecného vzorce Z v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 10 % mol., s výhodou od 0,5 do 5 % mol., z celkového množství monomem v reakční směsi.

V jednom provedení se polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu připraví klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací monomem HPMA a monomem obecného vzorce Z a T, přičemž obsah monomem obecného vzorce Z v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 10 % mol. z celkového množství monomem v reakční směsi a obsah monomerů obecného vzorce T v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 10 % mol., s výhodou od 0,5 do 5 % mol., z celkového množství monomem v reakční směsi.

V jednom provedení se polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu připraví klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací monomem HPMA a monomerů obecného vzorce Y, přičemž obsah monomem obecného vzorce Y v reakční směsi jev rozmezí od 0,5 do 20 % mol. z celkového množství monomem v reakční směsi. Reaktivní skupiny R⁷ monomem Y umožňují navázání funkčních molekul (hydrofobně-aktivních kotev, bio-specifických molekul, interakce-snižujících ligandů). Funkční molekuly jsou navázány kovalentní amidickou nebo esterovou vazbou, která vzniká reakcí reaktivních skupin R⁷ zavedených do polymerů s aminoskupinami nebo hydroxy skupinami funkčních molekul. Jako rozpouštědlo je s výhodou využit DMA, DMF, DMSO nebo metanol.

V jiném provedení se polymemí konjugát podle předkládaného vynálezu připraví způsobem, obsahujícím následující kroky:

i) polymerace monomem HPMA a monomerů obecného vzorce Y a/nebo Z a popřípadě T, přičemž krok i) se provede RAFT polymerací při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, N.Ndimethylacetamid, A.A-dimcthylformamid. sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

v přítomnosti přenosového činidla obecného vzorce R⁸-X“-E,

- 12 CZ 310462 B6 kde R⁸ je fenyl, -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH3)2; -S-(CH2)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)b-CH3; -S(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

X” je -S-C(=S)-; přičemž skupina R⁸ je navázaná přes svou koncovou -S- skupinu nebo přes uhlík (v případě fenylu) k thiokarbonylové skupině spojky X”; a

E je koncová skupina vybraná z:

CH3	ch3 1	CH3 CH3
—c—ch3	--C— CHř	—c—ch2-ch
CN		? CN

CH· ch_{3 o} ch₃ o

I í II —c—ch₂—c —c—ch₂—c—ch₃

CH₃ 'd— CH₃ ' Cří CH3

I//

CNR

CHjCH —c—gh₂—c— ch₃

CH₃CH kde Rje definované výše, s výhodou je R vybrané ze skupiny sestávající z OH,

Tímto způsobem se připraví polymemí konjugát obecného vzorce XXX.

Přenosovým činidlem R⁸-X“-E je s výhodou 2-kyanoprop-2-yl-dodecyltrithiokarbonát nebo N[2-[5-[(3aR,4R,6aS)-2-oxo-l,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4yl]pentanoylamino]ethyl]-4-kyano-4-dodecylsulfanylkarbothioylsulfanyl-pentanamid.

JV-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) je komerčně dostupný.

- 13 CZ 310462 B6

Látky vzorce Y a Z byly připraveny podle postupů uvedených literatuře (Šubr, V. and K. Ulbrich, Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups. React. Funct. Polym., 2006. 66: p. 1525-1538; Ulbrich, K., et al., Targeted Drug Delivery with Polymers and Magnetic Nanoparticles: Covalent and Noncovalent Approaches, Release Control, and Clinical Studies. Chemical Reviews, 2016. 116(9): p. 5338-5431). Látky vzorce (X) byly připraveny dle postupů uvedených v literatuře (Glassner, Μ., M. Vergaelen and R. Hoogenboom, Poly(2-oxazoline)s: A comprehensive overview of polymer structures and their physical properties. Polymer International, 2018, 67(1), 32-45).

Látky vzorce T byly získány postupem, kdy se 3-methakrylamidopropanová kyselina (Ma- β Ala-OH) a amin obecného vzorce NH2-R (kde R je definováno výše) rozpustí v dichlormethanu a k roztoku se přidá katalytické množství 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně N-(3dimethylaminopropylj-A’-ethylkarbodiimid hydrochlorid (EDC HC1). Reakční směs se míchá po dobu 4 hodin při pokojové teplotě. Následně se reakční směs naředí dichlormethanem (DCM) a extrahuje destilovanou vodou. Organická fáze se usuší Na2SO4, vakuově zahustí a krystaluje v mrazničce. Vzniklé krystaly látky vzorce T se odfiltrují, promyjí chladným CHCE a suší ve vakuu.

Klasická roztoková nebo srážecí polymerace je iniciována iniciátorem 2,2 -azobis(2methylpropionitril) ABIN nebo 2,2'-azobis[A-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidin] (V-70). Lineární kopolymer z kroku i) je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru.

RAFT polymerace je iniciována iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující V-70, AIBN, ABIK a ABIK-Biotin, kde ABIK-Biotin je A-[2-[5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-l,3,3a,4,6,6ahexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethyl]-4-[(E)-[4-[2-[5-[(3aS,4S,6aR)-2oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethylamino] -1 -kyano-1 methyl-4-oxobutyl]azo]-4-kyano-pentanamid, za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou CTA-dodecylamin-biotin nebo CTA-dodecyl-COA, kde CTA-dodecylamin-biotin je A-[2-[5[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-l,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethyl]4-kyano-4-dodecylsulfanylkarbothioylsulfanyl-pentanamid a CTA-dodecylamin-COA je 4kyano-N-cyklooktyl-4-dodecylsulfanylkarbothioylsulfanyl-pentanamid.

V jednom z případů je připraven RAFT polymerací telechelický polymer, který již obsahuje na alfa-konci hydrofobně-aktivní kotvu a na omega-konci buď interakce-snižující ligand nebo biospecifickou kotvu.

Navázání hydrofobní kotvy na lineární kopolymer z kroku i) za vzniku polymemího konjugátu se provede konjugací reaktivních skupin na polymeru, např. R⁷ nebo thiazolidin-2-thionových (TT) skupin monomemích jednotek po zabudování monomeru obecného vzorce Y, popsaného výše, s hydrofobně aktivní kotvou (prekurzorem obecného vzorce R²-H, kde R² je definováno výše, například nízkomolekulámím hydrofobním alifatickým řetězcem), který obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou nebo hydroxylovou skupinu nebo SH skupinu); přičemž nízkomolekulámím alifatickým hydrofobním řetězcem je řetězec, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 100 do 400 g/mol. Hydrofobní kotva je tedy k lineárnímu kopolymeru navázána amidovou nebo esterovou vazbou mezi karbonylovou skupinou monomemí jednotky Y a -NH- nebo -O- skupinou X, vzniklou reakcí reaktivních skupin na polymeru, aktivovaných karboxylů s aminoskupinami nebo hydroxy skupinami řetězce hydrofobní kotvy.

Případné nezreagované reaktivní skupiny kopolymeru, např. TT skupiny, se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)_a-CH2(OH); NH2-(CH2)bCH(OH)-CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)_c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od

- 14 CZ 310462 B6 do 3 a c je od 1 do 4, s výhodou s l-aminopropan-2-olem, a/nebo se nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem.

Může následovat volitelný krok přečištění kolonovou chromatografií a lyofilizace výsledného produktu z předchozího kroku.

Případný interakce-snižující ligand je navázán analogicky.

Volitelná modifikace makromolekulámího blokátoru bio-specifickou molekulou umožňuje selektivní interakci s některými složkami imunoanalytického systému a jejich uchycení na pevnou fázi. Navázání bio-specifické kotvy na lineární kopolymer se provede konjugací reaktivních skupin na polymeru, např. thiazolidin-2-thionových (TT) skupin monomemích jednotek po zabudování monomeru obecného vzorce Y, popsaného výše, s bio-specifickou kotvou (např. derivátem biotinu), který obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou nebo hydroxylovou skupinu); přičemž kotvou je molekula s molekulovou hmotnost v rozmezí od 80 do 1000 g/mol. Případná molekula kotvy je k lineárnímu kopolymeru navázána amidovou nebo esterovou vazbou vzniklou mezi reaktivními skupinami lineárního kopolymeru a vázanou kotvou, například aktivované karboxyly, a aminoskupinami nebo hydroxylovými skupinami biospecifických kotev.

Připojení funkčních molekul je ve všech případech realizováno pomocí kovalentních vazeb mezi reaktivními skupinami na funkčních molekulách s reaktivními skupinami na kopolymerech nebo homopolymerech. S výhodou je využito reakce aminoskupin nebo hydroxylových skupin lokalizovaných na funkčních molekulách s aktivovanými karboxylovými skupinami na kopolymerech.

Hlavní aktivní skupinou je “hydrofobně-aktivní” kotva (skupina R²), která zajišťuje aktivitu celého polymemího konjugátu jako blokátoru nespecifických interakcí a vhodného materiálu pro saturaci povrchů pevné fáze imunotestů. Aktivita polymemího konjugátu je dále navýšena pomocí interakce-snižujícího ligandu (skupina R), který synergicky v souladu s hydrofobněaktivní kotvou zvyšuje blokační a saturační schopnost celého syntetického blokátoru nespecifických interakcí.

Variantně je na kopolymer také kovalentně připojena “biospecificky se vážící” kotva (skupina R, obsahující biotin, tris-NTA), která umožňuje využití kopolymeru jako bispecifického činidla s funkcí adherentní kotvy pro imobilizaci na pevnou fázi imunotestů jako jsou např. zkumavky, jamky mikrotitrační destičky, paramagnetické částice apod., a zároveň imobilizující další molekuly skrze vazbu na “biospecificky se vážící” kotvu. Jako vhodné biospecifické vazebné skupiny mohou být vybrány sloučeniny vázající některou z komerčně dostupných proteinových (purifikačních) značek (tagů), jako je např. tris-nitriltrioctová kyselina (tris-NTA) vážící oligohistidinové tágy. Vazebnou skupinou může být např. biotin, který díky velmi silné interakci biotin-avidin/streptavidin/neutravidin umožní celý kopolymer využít posléze pro imobilizaci biomolekul jako jsou specifické protilátky či antigeny nej různějších molekulových hmotností.

Všechny funkční molekuly mohou být na kopolymer připojeny prostřednictvím spojek, které jsou na bázi alifatických aminokyselin s 2 až 7 jednotkami CH2, klasických aminokyselin, oligopeptidů, nebo oligoPEGu. Spojka umožňuje omezení stérického bránění funkčních molekul tak, aby mohly vhodně interagovat s ostatními molekulami nebo povrchem destičky imunotestů. S výhodou je spojka vybrána ze skupiny zahrnující spojky na bázi alifatických aminokyselin a klasických aminokyselin a oligopeptidů.

Polymemí konjugáty dle předkládaného vynálezu (syntetické makromolekulámí blokátory nespecifických interakcí) mají oproti v současnosti používaným proteinovým blokátorům na živočišné bázi několik výhod. Příprava makromolekulámího blokátoru je poměrně snadná a založená na kontrolovaném polymerizačním principu a příprava jednotlivých polymemích

- 15 CZ 310462 B6 prekurzorů a finálních blokátorů je vysoce reprodukovatelná. Jedná se o syntetický kopolymer, který není živočišného původu. Vzhledem k metodě přípravy se jedná o produkt s naprosto reprodukovatelnými vlastnostmi.

Blokátor může být využit především jako reduktant nespecifických interakcí analyzované složky a dalších komponent tvořících analytický systém na povrch pevné fáze. Blokátor je přítomen v roztoku v nadbytku a interaguje s povrchem pevné fáze i ostatními složkami v roztoku, a tím potlačuje nespecifické interakce analytu a dalších složek, což by vedlo k ovlivnění výsledku testu. Blokátor může být využit v imunochemických metodách jakéhokoliv principu využívajících pevnou fázi jakékoliv formátu (paramagnetické částice, jamky mikrotitrační destičky, zkumavky, kuličky, apod.). Vedle využití jako blokátor, může být kopolymer také využit k cílenému navázání některé složky imunoanalytického systému na pevnou fázi.

Makromolekulámí blokátory jsou s výhodou využitelné v imunochemických nebo obdobných metodách, s výhodou vybraných z metod stanovení s luminiscenční, chemiluminiscenční, fluorescenční, radioaktivní, či enzymatickou detekcí, popřípadě stanovení využívající značení koloidními kovy. S výhodou v metodách luminiscenční imunoanalýza (LIA), imunoluminometrická analýza (ILMA), chemiluminiscenční imunoanalýza (CLIA), imunochemiluminometrická analýza (ICMA), elektrochemiluminiscenční analýza (ECL), fluorescenční imunanalýza (FIA), imunofluorometrická analýza (IFMA), radioaktivní imunoanalýza (RIA), imunoradiometrická analýza (IRMA), enzymová imunoanalýza (EIA), imunoenzymometrická analýza (IEMA), metodách průtokové cytometric, immunohistochemie (IHC), či western blottingu (WB).

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy rovněž použití polymemího konjugátu v imunochemických metodách jako blokátorů nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a popřípadě pro zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze, zejména ve výše uvedených imunochemických metodách.

Kopolymery jsou navrženy jako vysoce aktivní syntetické makromolekulámí inhibitory nespecifických interakcí v analytických stanoveních využívajících jakýkoliv detekční signál (radioaktivita, kolorimetrie, fluorescence, luminiscence, turbidimetric, apod.).

Výše uvedené je shrnuto v následujících větách.

Makromolekulámí blokátor nespecifických interakcí podle vynálezu je funkční molekulou, která slouží v testech jako blokátor nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a významně tak snižuje nespecifické interakce ve stanovení. Blokátor může být také použit pro cílené zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze. Makromolekulámí blokátor je syntetického původu a jeho příprava je vysoce definovaná. Aktivita blokátom je založena na kombinaci dvou kotev, kdy základní hydrofobní kotva způsobuje vysokou afinitu k pevné fázi a omezuje hydrofobní nespecifické interakce v samotném roztoku a interakce-omezující ligand přidává celému makromolekulámímu blokátom přidanou funkcionalitu, která se projeví v navýšení jeho blokační aktivity.

Předkládaný vynález umožní nahrazení proteinů živočišného původu syntetickým makromolekulámích blokátorem, který je nejenom účinnější v samotné blokační aktivitě, ale je také definovaný ve své stmktuře, má vysokou reprodukovatelnost mezi jednotlivými šaržemi a není ho nutné testovat na přítomnost virů a jiných patogenů.

Předkládaný vynález umožňuje zlepšit výsledky a průběh stanovení v rámci imunotestů a podobných diagnostických stanovení. Makromolekulámí blokátor v rámci stanovení nahrazuje

- 16 CZ 310462 B6 jak část odpovídající za omezení nespecifických interakcí, tak umožňuje zakotvení důležitých molekul, např. specifických protilátek na povrch pevné fáze.

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Porovnání výsledků při využití systému s BSA a s konjugáty 2 a 3 (A, vlevo) a výřez pro malé hodnoty (B, vpravo).

Příklady uskutečnění vynálezu

Všechny použité chemikálie pocházely od firmy Sigma-Aldrich, není-li uvedeno jinak.

Monomemí sloučeniny A-(2-hydroxypropyl)mcthakiylamid (HPMA) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (Μη-β-Ala-TT) byly připraveny podle publikovaného postupu (Subr, V. and K. Ulbrich, Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups. React. Funct. Polym., 2006. 66: p. 1525-1538; Chytil, P„ et al., N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide-based polymer conjugates with pH-controlled activation of doxorubicin for cell-specific or passive tumour-targeting. Synthesis by RAFT polymerisation and physicochemical characterisation. Eur. J. Pharm. Sci., 2010. 41: |v 473-482).

Příklad 1

Příprava monomem A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidu

CH₃ ! ³

CHy“C ³ !

C-Ό O i ÍÍ

3-methakrylamidopropanová kyselina (Μη-β-Ala-OH, 2 g) a NH2-dodecylamin (2,54 g) byly rozpuštěny v 10 ml dichlormethanu (DCM) a k roztoku bylo přidáno katalytické množství 4dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně 3,1 g A-(3-dimcthylaminopropyl)-Aethylkarbodiimid hydrochloridu (EDC HC1). Reakční směs byla míchána 4 h při pokojové teplotě. Reakční směs byla naředěna 10 ml dichlormethanu (DCM) a extrahována 3x 10 ml destilované vody. Organická fáze byla usušena Na2SO4 a vakuově zahuštěna na 5 ml a dána krystalovat do mrazničky. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty chladným CHCE a sušeny ve vakuu. Bylo získáno 2,8 g monomem Ma^-Ala-dodecylaminu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 12,8 min při 220 nm.

Příklad 2

Příprava monomem A-[3-(octadecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidu

- 17 CZ 310462 B6

0¾

CHy-Q

C^Q O

Ma-P-Ala-OH (2 g) a NH2-oktadecylamin (3,69 g) byly rozpuštěny v 15 ml dichlormethanu (DCM) a k roztoku bylo přidáno katalytické množství 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně 3,1 g EDC HC1. Reakční směs byla míchána 4 h při pokojové teplotě. Reakční směs byla naředěna 10 ml DCM a extrahována 3x 10 ml destilované vody. Organická fáze byla usušena Na2SO4 a vakuově zahuštěna na 5 ml a dána krystalovat do mrazničky. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty chladným CHCI; a sušeny ve vakuu. Bylo získáno 3,8 g monomeru Ma-P-Ala-oktadecylaminu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 13,9 min při 220 nm.

Příklad 3

Příprava statistického kopolymeru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) radikálovou polymerizací

CH, /

I /

CN \

CH, \ CH-<

-CH, —C — ř — CH,—C—- / +-0-0¾ í ' Ií i c—O C—O / CN

II /

NHNM

1I

ČHjCH

CH-OH0¾

I

Kopolymer obsahující thiazolin-2-thionové (TT) reaktivní skupiny byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerací HPMA s 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionem v DMSO při 60 °C po dobu 6 hodin. Celková koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmota, a koncentrace AIBN (azobisizobutyronitril) byla 1,0 % hmota.

HPMA (1 g, 6,98 mmol), 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (0,246 g, 0,95 mmol) a AIBN (100 mg,) bylo rozpuštěno v 7,8 ml DMSO. Roztok byl probublán argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 60 °C po dobu 6 h. Kopolymer byl izolován vysrážením do směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyl etherem a vysušen ve vakuu. Polymer byl rozpuštěn v methanolu (5,5 ml) a přesrážen do směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyl etherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,965 mg kopolymeru o Mw 37 700 a dispersitě 2,04. Obsah TT reaktivních skupin byl 12,8 % mol., vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.

Příklad 4

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin) radikálovou srážecí kopolymerací konjugát 1

- 18 CZ 310462 B6 ch₃/ . . I ί .

_δΗ C—h -CH, I Ϊ CN \

CH, CH₃ í i

NH

CH₂ !

CH-OH

I

NH !

CH₂ !

CH₂

I

O-“O

NH—CHa—(CH₂1_;8-CH₃

Konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin) byl připraven srážecí radikálovou kopolymerací HPMA s A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidem, připraveným dle Příkladu 1, v acetonu při 60 °C po dobu 6 hodin. Celková koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmota, a koncentrace AIBN byla 1,25 % hmota.

HPMA (1 g, 6,98 mmol), A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidem (0,046 g, 0,142 mmol) a AIBN (100 mg, 0,61 mmol) bylo rozpuštěno v 8,8 ml acetonu. Roztok byl probubláván argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 60 °C po dobu 6 h. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,879 g kopolymeru (83,7 %) s molekulovou hmotností Mw 46 300, obsahem hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od N-|3-(dodccylamino)-3oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidu) 1,5 %mol. adisperzitou 1,63.

Příklad 5

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin) (konjugát 2) - roztoková polymerace

ch3/	CHa	ch3	ch;3	\ CHj
CH,C—b	-CH2—C—/ —CH,-	-C— í —CH,I “	1 -C—J I	' j—C—CH3
Ín \	C=O	c=o	é=o	/ CN
	1 1 NH		iÍh
	CHS	Ah2	ch2
	CH OH		ch.
	ch3	c=o I	1 c=o
		NH |	| NH—	CH,—(CH^-CHs
		ch2
		1 CH—OH

CH₃

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, 12,8 % mol TT) a dodecylamin (4,4 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (10,4 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od JV-[3(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidu) 0,8 % mol. byl stanoven v hydrolyzáta vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 34 300 a disperzita 1,67 byla stanovena pomocí HPLC

- 19 CZ 310462 B6

Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru. Obsah jednotek typu III byl 11,2 % mol..

Příklad 6

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) (konjugát 3) - roztoková polymerace

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,5 g, Mw = 41 600 g/mol, 11,8 % mol TT), byl rozpuštěn v 2,8 ml DMSO. K roztoku bylo přidáno 528 μΐ (14,5 mg) zásobního roztoku dodecylaminu (27,5 mg/lml CHCE) a 489 μΐ (21,5 mg) zásobního roztoku N-(2aminoethyljbiotinamidu trifluoracetatu (NH2-ED-biotinu.CF3COOH) (22 mg/0,5 ml DMSO). Poté byl přidán ΛξΑ-diisopropylethylamin (DIPEA) (46,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-aminopropan-2-ol (50 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát C3 poly(HPMA-co-Ma-P-Aladodecylamin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2enamidu) 1 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem, obsah jednotek obsahujících biotin byl 1,6 % mol. byl stanoven spektroskopicky pomocí HABA/avidin kitu, obsah jednotek typu III byl 9,2 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 51 600 a disperzita 1,46 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 7

Příprava statistického kopolymeru Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) RAFT polymerizací

-20 CZ 310462 B6

CN

CH, I _______ “ ¹ . ·ι·ι·ι·ι·ι·.· £ .....

* i

C—Ό i NH

án-OH ch₃

CH, \ CH_S

I ) I

CH₂—C—/ +-C~ CHj

C-0 / CH

NH f CH,

Íh₂ έ”Ο

Polymemí prekurzor Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven pomocí RAFTkopolymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). V 10,9 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 1,25 g HPMA (88 % mol) a k roztoku bylo přidáno 308 mg Ma-β-ΑΙη-ΤΤ (12 % mol) rozpuštěného v 2,8 ml DMAc (dimethylacetamid), 3,13 mg 2-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-2methylpropannitril a 2,35 mg 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitril) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 40 °C (24 h). Polymemí prekurzor Raftpoly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Koncové trithiokarbonátové skupiny byly odstraněny podle dříve publikovaného postupu Perrier, S., P. Takolpuckdee, and C.A. Mars, Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization: End group modification for functionalized polymers and chain transfer agent recovery. Macromolecules, 2005. 38(6): p. 2033-2036. Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-coMa-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 49 000 g/mol, polydisperzitou D = 1,23 a obsahující 11,6 % mol. reaktivních thiazolidin-2-thionových (TT) skupin, vztaženo na celkový počet monomemích jednotek.

Příklad 8

Příprava konjugátu Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin) (konjugát 4)

CH,/ CH₃ CH·. CH₃ \ CH₃

CH₃—C—fi-CH_a—C— f — CH_a—C— / — CH,—C— / -Uc-CHj Ín \ c=o é=o é=o / cn

I I l!

NH NHNH

CH, Íh,CH,

I I I

CH—OH CH,CH,

I II ch₃ c=oc=o lliH NH—CH_a (CH_a)_w—CH,.

CH, I CH—OH I CH,.

Polymemí prekurzor Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (82 mg, Mw = 49 000 g/mol, 11,6 % mol TT), připravený dle příkladu 7, a dodecylamin (1,8 mg) byl rozpuštěn v 0,35 ml DMSO. Poté byl přidán N, A-diisopropylethylamin (DIPEA) (4,2 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Aladodecylamin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od /V-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidu) 0,6 % mol. byl

-21 CZ 310462 B6 stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 11 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 66 000 a disperzita 1,09 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a RI detektorem.

Příklad 9

Příprava konjugátu Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) (konjugát 5)

Η H

Polymemí prekurzor Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (50 mg, Mw = 49 000 g/mol, 11,6 % mol TT), připravený podle příkladu 7, dodecylamin (1,0 mg) a NH2-ED-biotin.CF3COOH (2,4 mg) bylo rozpuštěno v 0,22 ml DMSO. Poté byl přidán Λ'.Λ'-diisopropylcthylamin (DIPEA) (9,9 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od A-[3(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamidu) 0,9 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6 N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 8,7 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 59 000 a disperzita 1,18 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory na Superose 6increase v PBS pufiru. obsah jednotek obsahujících biotin byl 2,0 % mol. byl stanoven pomocí kitu HABA-Avidin od Sigma-Aldrich.

Příklad 10

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-oleylamin) - konjugát 6

-22 CZ 310462 B6

CH₃ ch₃

I NH 6h₂ íÝ-GH io ₃

CH₃

-C.— / έ=ο

CH₂ ch₂ ch₃ \ ch₃ —CHž—C— / j-C-CH s έ=ο / CN

I CH,

I

CH 2 .1 .-.

CH₂—(CH^ —C H=C H—(C H₂j ₇-C H ₃

CH—QH

6h₃

Polymemi prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, 12,8 % mol TT), připravený podle příkladu 3, a oleylamin (4,0 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán ΛΆ'-diisopropylcthylamin (DIPEA) (6,5 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán 1 -aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-oleylamin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující oleylamin) 0,8 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 12 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 45 200 a disperzita 1,70 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 11

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-stearylamin) - konjugát 7

CH₃ GH_a

-CH,—C— f —CH,—C— / —CH₂c-oé=o iMHl*iH

II

CH-_ŽCH

II

OH-OHCH

II ch₃co

MH I CH_a I

CH—OH I ch₃

NHCH₂ —

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, 12,8 % mol TT), připravený podle příkladu 3, a stearylamin (3,6 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán ΛζΑ-diisopropylethylamin (DIPEA) (5,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán 1 -aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-stearylamin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující stearylamin) 0,9 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 11,9 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 46 300 a disperzita 1,68 byla stanovena pomocí HPLC

-23 CZ 310462 B6

Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 12

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecanol) - konjugát 8

CH₃ —C—/ —ch₂ c=o

NH

I CH,

I CH-OH

I CH, ch₃ ch₃ \ch —C—/ —ch₇—c—/Xc-ch₃

C=O C=O /CN

I I

NHNH

II

CH_aCH

CH₂CH c-oc-o

II

NH O--(CH₂)h—CH® gh₂

CH-OH

I ch₃

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (200 mg, Mw = 40 200 g/mol, 10,8 % mol PFP) a 1-dodekanol (3,6 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (5,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodekanol) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující dodekanol) 1,1 % mol. byl stanoven pomocí ’H NMR spektroskopie. Obsah jednotek typu III byl 9,7 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 400 a disperzita 1,81 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 13

Příprava prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-TT) a konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-propanol) (konjugát 9) radikálovou terpolymerizací

CH₃/ ch₃ch ch₃—C—/—ch₂—C—/ —ch₂—O—l —ch₂ cn \ c=oé=o

X II

NH II

CH,CH

II

CH—OHCH i Á„ ch₃C=O jI

NH

I CH.,

CH-OH I

CH,

I

NH—CH₂—(CH_a)_w—CH,

CH₃ —c— I c=o

I ch₂

CH, I C-O

-24 CZ 310462 B6

Konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven roztokovou radikálovou terpolymerací HPMA s A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2enamidem a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionem v DMSO při 60 °C po dobu 6 hodin. Koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmota, a koncentrace AIBN byla 1,25 % hmota.

HPMA (1 g, 6,98 mmol), A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamid (0,051 g, 0,157 mmol) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (0,182 g, 0,706 mmol) a AIBN (118 mg) bylo rozpuštěno v 7,4 ml DMSO. Roztok byl probublán argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 60 °C po dobu 6 h. Kopolymer byl izolován vysrážením do 200 ml směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,999 g kopolymeru (84,5 %) s obsahem 10,2 %mol. reaktivních TT skupin.

Takto získaný polymer (200 mg) byl rozpuštěn v DMSO (1,2 ml) a k roztoku bylo přidáno 20 μΐ l-amino-2-propanolu a mícháno 10 min do odbarvení reakční směsi. Konjugát 9 byl vysrážen do 30 ml směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 184 mg kopolymeru o Mw 38 700 a dispersitě 1,51. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od A-[3-(dodecylamino)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2enamidu) 0,8 % mol.. Obsah jednotek typu III byl 9,4 % mol..

Příklad 14

Příprava polymemího konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Alaaminochinuklidin) (konjugát 10) radikálovou terpolymerizací

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 41 200 g/mol, D = 2,08, 11,8 % mol TT), připravený podle příkladu 3, a dodecylamin (4,4 mg) byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO. Poté byl přidán ΛζΑ-diisopropylethylamin (DIPEA) (4,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 1 h při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidáno 55 μΐ zásobního roztoku 3aminochinuklidinu (12,41 mg/200 μΐ DMSO) a ΛΆ'-diisopropylcthylamin (DIPEA) (10,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 24 h při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán 1aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 10, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-aminochinuklidin), izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující dodecylamin) 0,7 % mol. a obsah komonomemí jednotky obsahující aminochinuklidin 0,9 % mol. byl stanoven v hydrolyzáta vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. obsah jednotek typu III byl 10,2 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 40000 a disperzita

-25 CZ 310462 B6

1,44 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 15

Příprava polymemího konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma- β -Alaaminocyklooktan) (konjugát 11)

CH

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, D = 2,04, 12,84 % mol TT), připravený podle příkladu 3, byl rozpuštěn v 0,7 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 93 μΐ (4,4 mg) zásobního roztoku dodecylaminu (23,66 mg/500 μΐ C HCI,) a 125 μΐ (2,18 mg) zásobního roztoku aminocyklooktanu (8,7 mg/500 μΐ DMSO). Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (14,9 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán 1-aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 11, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Alaaminocyklooktan), izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující dodecylamin) 0,7 % mol. a obsah komonomemí jednotky obsahující aminocyklooctan 0,85 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith Cl8 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 11,29 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 000 a disperzita 1,43 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 16

Příprava polymemího konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Alanorbomen-2-methylamin) (konjugát 12)

-26 CZ 310462 B6

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, D = 2,04, 12,84 % mol TT), připravený podle příkladu 3, byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 93 μΐ (4,4 mg) zásobního roztoku dodecylaminu (23,66 mg/500 μΐ CHCE) a 84 μΐ (2,1 mg) zásobního roztoku 5-norbomen-2-methylaminu (4,99 mg/200 μΐ DMSO). Poté byl přidán A7v'-diisopropylcthylamin (DIPEA) (14,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán 1 -aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 12, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-coMa-P-Ala-5-norbomen-2-methylamin), izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující dodecylamin) 0,75 % mol. a obsah komonomemí jednotky obsahující 5-norbomen-2-methylamin 2,5 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 9,59 % mol.. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 000 a disperzita 1,45 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 17

Příprava polymemího konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-co-Ma-P-Ala-(2,6-X(2-aminoethyl)oktahydroxycyklopentapyrrol-2-karboxamid) (konjugát 13)

Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, D = 2,04, 12,84 % mol TT), připravený podle příkladu 3, byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 93 μΐ (4,4 mg) zásobního roztoku dodecylaminu (23,66 mg/500 μΐ CHCE) a dále bylo přidáno 3,4 mg (2,6)-A-(2-aminoethyl)oktahydrocyklopentapyrrol-2-karboxamidu. Poté byl přidán A7v'-diisopropylcthylamin (DIPEA) (15,3 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán 1 -aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát 13, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin-coMa-b-Ala-(2,6-A-(2-aminoethyl)oktahydrocyklopentapyrrol-2-karboxamid), izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (obsahující dodecylamin) 0,75 % mol. a obsah komonomemí jednotky obsahující A-(2-aminoethyl)oktahydrocyklopentapyrrol-2-karboxamidu 1,8 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu III byl 10,29 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 000 a disperzita 1,45 byla stanovena pomocí HPLC

-27 CZ 310462 B6

Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 18

Příprava 2-methyl-X-tetradecyl-prop-2-enamidu (Ma-tetradecylamin).

Tetradecylamin (4,0 g, 18,8 mmol) byl rozpuštěn v 40 ml ethylacetatu a k roztoku byl přidán inhibitor 2,5-di-terc-butylhydrochinonu. Methakryloyl anhydrid (2,9 g, 18,8 mmol) byl naředěn 3 ml ethylacetátu a pozvolna přikapán k roztoku tetradecylaminu při pokojové teplotě tak aby nepřesáhla 25 C. Po přídavku veškerého anhydridu byla reakční směs míchána 1 h při pokojové teplotě. Reakční směs byla vytřepána 3x 50 ml 2% NaHCOs a 50 ml H2O. Reakční směs byla usušena bezvodým Na2SO4 a produkt byl vykrystalován v mrazničce. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty vychlazeným ethylacetátem a sušeny za vakua. Bylo získáno 3,5 g (66,1%) monomeru 2-methyl-X-tetradecyl-prop-2-enamidu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 13,8 min při 220 nm. CHN analýza C=76,81(nalezeno 76,90); H= 12,53(nalezeno 12,54); N=4,98(nalezeno 5,04).

Příklad 19

Příprava konjugátu poly(HPM-co-Ma-tetradecylamin) radikálovou srážecí kopolymerací

OCHj CH₃/ ch₃—c—ch₂—c—í

CH₃ CN \

ch3 1	CB3 \	CHj OCH3
-ch2—c—/—	ch2—c— / 4-	-C— CH2-C—CH;
c=o	r°7	CN CH3
1 NH	NH 1
ch2	ch2 1 z
1 CH—OH
1 CH3	ch3

Konjugát poly(HPMA-co-Ma-tetradecylamin) byl připraven srážecí radikálovou kopolymerací HPMA s 2-methyl-X-tetradecyl-prop-2-enamidem, dle Příkladu 18, v acetonu při 40 °C po dobu 24 hodin. Celková koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmota, a koncentrace iniciátoru 2,2'-azobis[X-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidinu (V-70) byla 0,5 % hmota. HPMA (0,3 g, 2,1 mmol), 2-methyl-X-tetradecyl-prop-2-enamidu (0,025 g, 0,087 mmol) a AIBN (13 mg, 0,04 mmol) bylo rozpuštěno v 2,9 ml acetonu. Roztok byl probubláván argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 40 °C po dobu 24 h. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,196 g kopolymeru (60,4 %) s molekulovou hmotností Mw 44 300 a disperzitou 2,21. Obsah hydrofobní komonomemí jednotky (odvozené od 2-mcthyl-Atetradecyl-prop-2-enamidu) byl 1,0 % mol..

Příklad 20

Potlačení nespecifické sorpce IgG-HRP konjugátu na povrch jamek ELISA desky

Koncentrát konjugátu polyklonální králičí protilátky s křenovou peroxidázou připravený glutaraldehydovou metodou byl ředěn 500x do fosfátového pufru s různým obsahem BSA, biotinylovaného BSA, konjugátu 1 z příkladu 4 a konjugátu 3 z příkladu 6. Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován každý testovaný roztok, a to vždy do čtyř jamek v objemu 200 μΐ do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 60 minut na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3x

-28 CZ 310462 B6

350 μΐ) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byla vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 μΐ TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 2 M HC1. Následně se měřila absorbance (optická densita OD) při vlnové délce 450 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1. Výsledky potlačení nespecifické sorpce komerčními BSA a konjugáty 1 a 3

	komsKirace iestvraaých ítlakstorú ve fosřátwéai pe&q, gft
RSAt^Tř	biot BSA (g/I)	Kffnjiigáí 1 íg?!)	Konjugát 3 (g/1)
	0,2	1	3·		8^	2	82	1	5	0,1	85	2
	3,190	0,654	6,677	2517	0,540	0,089			0,049	1,632	6 165	6268 7
	2,7®	0.609		2.435	6.4-96	0,098	0,375	S.129	•T úA 7	0,997	7. 194	0,088
	3.045	0,®l		2,«S	9,504	0.165	S..5SÍÍ		0.045	6.676	SA S4	0,105
	2,882	0,782	2.375	2,564	3.5 4	δ,υο		0,13	&043	C, 94?	v 169
průměr	2^70-	OS4	0.072	1,5:01	0512	0,105	8385	81’5	0,047	0,981	8,178	(UMá
C.E , %	6,34			2Ϊ5		16,8.7			?,r	2,56	7,62

Z hodnot OD při koncentracích BSA, 1,0 g/1, a konjugátu 1, 0,2 g/1, plyne, že konjugát 1 snižuje nespecifickou sorpci použitého IgG-HRP konjugátu nejméně 5x více než BSA. V případě biotinylovaného BSA a konjugátu 3 obsahujícího také biotin je z porovnání OD při koncentracích 0,1 a 0,5 g/1 obou blokátorů zřejmé, že hodnoty OD u konjugátu 3 jsou nejméně 2,5x menší. Rovněž je zřejmé, že zavedení biotinu přibližně 2x zlepší blokační účinek u BSA.

Příklad 21:

Modelový systém ELISA na stanovení TSH v krevním séru:

Ze dvou komerčně dostupných myších monoklonálních protilátek byl sestaven sendvičový systém ELISA na stanovení lidského TSH (human Thyroid Stimulating Hormone). Jedna monoklonální protilátka byla konjugována s biotinem a druhá s křenovou peroxidázou.

Příprava konjugátu s biotinem:

mg protilátky v 1 ml borátového pufru pH 8,5 se biotinyluje 4% (w/w) Biotin-NHS, který se přidává v koncentraci 10 mg/ml v DMF, biotinylace probíhá po dobu 20 minut a je ukončena přídavkem 100 μΐ 0,2 M roztoku NILCl. Následnou dialýzou se oddělí volný biotin.

-29 CZ 310462 B6

Příprava konjugátu s křenovou peroxídázou:

mg protilátky se konjuguje s 5 mg křenové peroxidázy (HRP) pomocí glutaraldehydu. Nejprve se HRP aktivuje roztokem glutaraldehydu o koncentraci 1,25% ve fosfátovém pufru pH 6,8 po dobu 14 hodin. Po gelové chromatografii (Sephadex 25), kdy se odstraní volný glutaraldehyd, se aktivovaná HRP smíchá s roztokem IgG v 0,15 ml NaCl za přídavku 5% (v/v) karbonátbikarbonátové pufru pH 9,5. Reakce se zastaví po 14 hodinách přídavkem 5% (v/v) roztoku 0,2 M lysinu. Konjugát IgG-HRP se oddělí gelovou chromatografii na koloně s náplní Superdex HR 200.

Konjugáty pak byly použity pro konstrukci dvou sendvičových ELISA systémů.

Systém s BSA

Biotinem značená monoklonální protilátka je vázána na stěny mikrotitrační destičky využitím biotinylováného BSA:

Nejprve se do jamek mikrototrační destičky (Greiner) napipetuje 300 μΐ roztoku biot. BSA o koncentraci 10 μg/ml ve fosfátovém pufru, roztok se v jamkách nechá při pokojové teplotě do druhého dne. Obsah jamek se důkladně odsaje a napipetuje se 300 μΐ roztoku streptavidinu o koncentraci 1 pg/ml ve fosfátovém pufru. Opět probíhá inkubace za pokojové teploty do druhého dne, pak se roztok důkladně odsaje a napipetuje se 250 μΐ roztoku biotinylované monoklonální protilátky o koncentraci 1 pg/ml ve fosfátovém pufru obsahujícím i BSA v koncentraci 1 mg/ml. Tento roztok se v jamkách ponechá 48 hodin, pak následuje důkladné odsátí a sušení po dobu 4 hodin. Desky jsou takto připraveny k použití a lze je skladovat v lednici po dobu 6 měsíců.

Konjugát IgG-HRP se ředí 20 OOOx do citrátového pufru obsahující BSA v koncentraci 1 mg/ml.

Systém s konjugáty 2 a 3

V tomto případě je biotinem značená monoklonální protilátka vázána na jamky využitím konjugátů 2 a 3. Postup potahování jamek je identický jako v systému s BSA, avšak s dvěma změnami: (i) místo biotinylovaného BSA o koncentraci 10 pg/ml se používá konjugát 3 o koncentraci 0,1 pg/ml; (ii) potahovací roztok biotinylované protilátky místo BSA obsahuje konjugát 2, také o koncentraci 1 mg/ml.

Konjugát IgG-HRP se rovněž ředí 20 000 x do citrátového pufru, který však obsahuje konjugát 2 v koncentraci 1 mg/ml.

V obou systémech byly použité stejné kalibrátory, tj. roztoky lidského TSH (Sigma-Aldrich k.č. T9265) v hovězím séru, jejich koncentrace byly stanoveny pomocí WHO referenčního preparátoru (NIBSC 80/558). Pracovní protokol byl rovněž stejný v obou systémech:

- 50 pl kalibrátoru či vzorku + 150 pl roztoku konjugátu IgG-HRP je pipeto váno do jamky -120 min inkubace při pokojové teplotě, bez třepání

- Odsátí, promytí 3 x promývacím roztokem

- 200 pl TMB, 10 min při pokojové teplotě bez přístupu světla

- 50 pl2MHCl

- Měření optické density při 450 nm (OD450).

V následující tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty OD450 kalibrátorů pro oba systémy, každý kalibrátor byl v každém systému změřen ve dvou jamkách.

-30CZ 310462 B6

Tabulka 2. Kalibrační závislost kalibrátoru TSK při využití blokátorů na bázi komerčního BSA a kombinace konjugátu 2 a 3

Kalibrator TSH, mlTZ!	Systém s BSA	Systém s konjugáty 2 a 3
Průměr OD 450	C.V., %	Průměr OD450	C.V., %
0	0,043	2,64	0,041	0,17
0,1	0,048	1,18	0,051	1,96
0,5	0.082	0,52	0,093	1,06
2,5	0.269	2,50	0,330	3,92
10	0,899	3,30	1,123	1,53
50	3,416	1,51	3,827	1,83

Hodnoty OD obou kalibračních závislostí jsou srovnatelné, pro systém s konjugáty 2 a 3 jsou pro kalibrátory 2,5, 10 a 50 mIU/1 jsou odezvy kalibrace dokonce prokazatelně vyšší, stejně tak i hodnoty C.V. duplikátů jednotlivých kalibrátorů jsou srovnatelné. Je důležité si uvědomit, že pro dosažení shodné kalibrační křivky je nutné využít lOOnásobně nižší koncentraci konjugátu 3 než bitinylovaného BSA.

V obou systémech bylo analyzováno 500 reálných vzorků získaných z endokrinologické ambulance, získané výsledky jsou porovnány grafickou formou na obrázcích 1A a 1B. Je zřejmé, že využití systému s konjugáty 2 a 3 umožňuje dosáhnout stejných výsledků na reálných vzorcích jako systém BSA. I zde je nutné si uvědomit, že konjugát 3 je využíván při lOOkrát nižší koncentraci než BSA.

Příklad 22: Potlačení nespecifické sorpce HRP na povrch jamek ELISA desky

Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován roztok křenové peroxidázy o koncentraci 5 mg/1 ve fosfátovém pufiru s obsahem BSA, konjugátu 2 (příklad 5) a konjugátu 11 (příklad 15) o koncentraci 0,1 g/1. Každý roztok byl dávkován vždy do osmi jamek v objemu 200 μΐ do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 16 hodin na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3x 350 μΐ) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byla vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 μΐ TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 2 M HC1. Následně se měřila absorbance při vlnové délce 450 nm, výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3. Hodnoty absorbance při experimentu potlačení nespecifické sorpce HHP pomocí BSA, konjugátu 2 a konjugátu 11.

-31 CZ 310462 B6

	BSA	Koisjugát 2	Konjugát 11
Over, OD >3,6	0,405	0,220
0,356	0,210
0,358	0,232
0,300	0,195
0,365	0,206
0,393	0,200
0,363	0,311
0,434	0,253
průměr		0.372	6,228
CE, %	2^74	26,77

Z hodnot OD je zřejmé, že blokační účinek pro sorpci křenové peroxidázy roste v pořadí BSA konjugát 2 - konjugát 11. Zatímco BSA nebylo při koncentraci 0,1 mg/ml schopno zabránit HRP se nespecificky vázat na povrch destičky, tak konjugát 2 a 11 při této malé koncentraci již účinně omezovaly nespecifickou sorpci. Konjugát 11 obsahující kromě hydrofobně-aktivní kotvy i interakce-omezující ligand prokázal navýšenou schopnost blokace nespecifické interakce HRP na povrch destiček.

Příklad 23. Potlačení nespecifické sorpce IgG-HRP konjugátu na povrch paramagnetických mikročástic

Koncentrát konjugátu polyklonální králičí protilátky s křenovou peroxidázou připravený glutaraldehydovou metodou byl ředěn 500 x do fosfátového pufru s BSA, konjugátem 2 (příklad 5), konjugátem 11 (příklad 15) a konjugátem 12 (příklad 16), koncentrace blokátorů byla vždy 0,1 g/1. Suspenze paramagnetických částic (PMP) Invitrogen k. č. 11201D o objemu 5 μΐ byla smíchána s 600 μΐ promývacího fosfátového roztoku v malé nádobce s konickým dnem, pro separaci PMP byl ke stěně nádobky přiložen silný magnet, po oddělení PMP byl objem kapaliny odsát, tento promývací krok byl opakován. Následně bylo přidáno 300 μΐ roztoku konjugátu s testovaným blokátorem, suspenze byla ponechána 15 minut při teplotě laboratoře. Po magnetické separaci PMP a odsátí roztoku byly PMP dvakrát promyty již popsaným způsobem. V posledním kroku se k PMP přidal kolorimetrický substrát TMB v objemu 200 μΐ. Po 10 minutách bylo

-32CZ 310462 B6

150 μΐ roztoku převedeno do čisté jamky 96 jamkové mikrotitrační destičky a okamžitě přidán STOP roztok v objemu 50 μΐ. Byla změřena absorbance (optická densita OD) při vlnové délce 450 nm. Pro každý testovaný blokátor se celý proces opakoval třikrát. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5. Výsledky blokace nespecifické sorpce IgG-HRP na povrch PMP

	Biokátor v koncentraci 0,1 g/1
BSA	Konjngát 2	Konjngát11	Konjngát 12
2,893	0,469	0,878	1,051
3,030	0,537	1,090	1,007
3,944	0.599	1,087	0,931
Průměr	3,289	0,535	1,018	0,996
C.R, %	14,19	9,92	9,75	4,94

Blokační účinek nespecifické sorpce konjugátu IgG-HRP byl stanoven pro kontrolní vzorek BSA a tři vybrané blokátory. Z výsledků uvedených v tabulce 5. je zřejmé, že všechny testované syntetické blokátory vykazují několikrát lepší blokační aktivitu než samotný BSA. Bylo tedy prokázáno, že syntetické blokátory mají významně lepší blokační účinek než běžně používaný BSA.

Příklad 24

Potlačení nespecifické sorpce IgG-HRP konjugátu na povrch jamek ELISA desky - porovnání více konjugátů

Koncentrát konjugátu polyklonální králičí protilátky s křenovou peroxidázou připravený glutaraldehydovou metodou byl ředěn 500 x do fosfátového pufru s obsahem BSA 1 g/1, a jedenácti vybraných konjugátů o obsahu lOkrát menším, tj. 0.1 g/1. Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován každý testovaný roztok, a to vždy do osmi jamek v objemu 200 μΐ do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 60 minut na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3x 350 μΐ) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byla vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 μΐ TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 2 M HC1. Následně se měřila absorbance (optická densita OD) při vlnové délce 450 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6 Výsledky blokace nespecifické sorpce IgG-HRP na povrch jamek ELISA desky porovnání konjugátů (v popisu tabulky jsou uvedena jen čísla konjugátů)

-33 CZ 310462 B6

	BSA	5	4 1 2 1 9 1 1 1 11 1 12	13
1 gT	0,1 g/I
OD43&
0,699	0,992	0,850	0,687	0,593	0,538	0,592	0,805	0,895
0,555	0,967	0,S81	0,664	0,586	0,515	0,652	0,800	0,851
0,879	1,051	1.026	0,6138	0,578	0,.510	0,565	0,789	0,811
1,012	1,034	0,938	0.699	0,662	0.522	0,592	0,665	0,738
0,995	1,003	0,920	0,682	0.682	0,516	0,688	0.640	0,712
i,004	1,003	0,970	0,720	0,710	0,527	0,550	0,717	0,770
0,737	0,990	0,963	0,651	0,672	0,519	0,611	0,665	0,698
0 862	0,984	0,967	0.680	0,604	0,503	0,543	0,626	0,732
Průměr	0,843	1,003	0,939	0,685	0,636	0,519	0,599	0,714	0,776
	19,77	3	5,90	3,12	8,01	2,08	8,40	10,51	9,05

Pro všechny testované konjugáty bylo dosaženo srovnatelného případně i signifikantně lepšího blokačního účinku při koncentraci lOkrát menší než u BSA. Za zmínku stojí i prokazatelně lepší reprodukovatelnost měřeného signálu sorbovaného konjugátu IgG-HRP pro testované syntetické blokátory oproti BSA.

Příklad 25. Příprava monomeru N-[3-(cyklooktylamíno)-3-oxopropyl]-2-methylprop-2-enamíd

3-methakrylamidopropanová kyselina (Ma-P-Ala-OH, 2 g) a NH2-cyklooktylamin (1,62 g) byly rozpuštěny v 10 ml dichlormethanu (DCM) a k roztoku bylo přidáno katalytické množství 4dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně 3,1 g A-(3-dimcthylaminopropyl)-Aethylkarbodiimid hydrochloridu (EDC HC1). Reakční směs byla míchána 4 h při pokojové teplotě. Reakční směs byla naředěna 10 ml dichlormethanu (DCM) a extrahována 3x 10 ml destilované vody. Organická fáze byla usušena Na2SO4 a vakuově zahuštěna na 5 ml a dána krystalovat do mrazničky. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty chladným CHCE a sušeny ve vakuu. Bylo získáno 2,6 g monomeru Ma-P-Ala-cyklooktylaminu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 11,3 min při 220 nm. Další monomery typu T byly připraveny analogickou reakcí popsanou v tomto příkladu.

Claims (8)

1. Kopolymer pro blokování nespecifických interakcí v biologických médiích obecného vzorce XXX

0¾CHo

D—r— 0¾^-j.....— /---CH2”t'TD

J___0 §O

HN| \X

CH2

J_xR

HjC OH (XXX), a ve kterém je zastoupení monomemích jednotek obecného vzorce I

(I) v rozmezí od 0,5 do 10 % mol., přičemž

R²je vybrané ze skupiny sestávající z: fenyl,-NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a(CH2)b-CH3; -O-(CH2)b-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

Xje kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)_n-C(=O)-; navázaná přes svou koncovou

-NH-skupinu ke karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce (I), přičemž n je celé číslo od 1 do 7;

přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² navázaná přes svou koncovou

-NH- nebo -O-skupinu nebo přes uhlíkový atom fenylové skupiny ke koncové karbonylové skupině spojky X;

D je vybrané ze skupiny sestávající z:

- 35 CZ 310462 B6 přičemž

R je vybrané ze skupiny sestávající z -OH,

-36CZ 310462 B6

- 37 CZ 310462 B6

kde n je celé číslo od 1 do 5;

a přičemž molekulová hmotnost kopolymeru je v rozmezí od 5000 do 500 000 g/mol.

2. Kopolymer podle nároku 1, kde X je -NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je vybrané ze skupiny 5 sestávající z 1, 2 a 3; a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b(CH=CH-CH2)_a-(CH2)b-CH3; -O-(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17; přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

3. Kopolymer podle nároku 1 nebo 2, ve kterém je dále od alespoň jedné monomemí jednotky do ίο 15 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymeru statisticky nahrazeno monomemími jednotkami obecného vzorce III (III) kde

15 R⁴ je vybrané ze skupiny sestávající z -NH-(CH2)_X-CH2(OH); -NH-(CH2)_y-CH(OH)-CH3;

-NH-(CH2)y-CH(OH)-(CH2)_z-CH3; a-NH-C(=O)-CH3;kde xje celé číslo od 0 do 4,yje celé číslo od 0 do 3 a z je celé číslo od 1 do 4; přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R⁴ navázaná přes svou koncovou -NH- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X, definované v nároku 1.

-38CZ 310462 B6

4. Kopolymer podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, ve kterém je dále od alespoň jedné monomemí jednotky do 10 % mol. monomemích jednotek základního lineárního polymeru statisticky nahrazeno monomemími jednotkami obecného vzorce V

5 (V), kde

R a X j sou definovány v nároku 1; přičemž pokud X není kovalentní vazba, je X navázané přes svou koncovou -NH- nebo -Oskupinu ke karbonylové skupině monomemí jednotky obecného vzorce V.

ίο

5. Způsob přípravy kopolymeru podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, vyznačený tím, že zahrnuje následující kroky:

i) polymerace HPMA a monomerů vybraných ze skupiny zahrnující monomery obecného vzorce Y a/nebo Z a popřípadě T (Y) ch₃ (Z)

-39CZ 310462 B6 h₂c

(T) kde R, X a R² jsou definovány v nároku 1;

R⁷ je vybraný z

přičemž krok i) se provede roztokovou nebo srážecí radikálovou polymerací nebo RAFT polymerací; přičemž alespoň jedním z monomerů je monomer obecného vzorce (Y) a/nebo (Z), přičemž celkový obsah monomerů obecného vzorce (Y) a (Z) v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 20 % mol., vztaženo na celkový počet monomerů; a přičemž reakce se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, a rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, N.Ndimethylacetamid, Α,Α-dimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

za vzniku lineárního kopolymeru;

ii) pokud jsou v lineárním kopolymeru přítomné skupiny R⁷, následuje krok nahrazení skupin R⁷ skupinou R², kde R² je definováno v nároku 1, reakcí s hydrofobním prekurzorem obecného vzorce R²-H, za vzniku kopolymeru, obsahujícího od 0,5 do 10 % mol. monomemích jednotek obecného vzorce I;

iii) volitelně, nahrazení nezreagovaných skupin R⁷, pokud jsou přítomny, skupinou R reakcí se sloučeninou vzorce R-H, kde R je definované v nároku 1;

iv) pokud jsou v lineárním kopolymeru přítomné skupiny R⁷, následuje krok odstranění zbylých nezreagovaných reaktivních skupin R⁷ reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH₂-(CH₂)x-CH₂(OH); NH₂-(CH₂)_y-CH(OH)-CH₃;

NH₂-(CH₂)_y-CH(OH)-(CH₂)_z-CH3; kde xje celé číslo od 0 do 4,yje celé číslo od 0 do 3 a z je od 1 do 4; s výhodou je aminoalkoholem l-aminopropan-2-ol, za vzniku kopolymeru obecného vzorce XXX.

6. Způsob přípravy polymemího konjugátu podle nároku 5, vyznačený tím, že krok i) se provede RAFT polymerací při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, a rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, Α,Α-dimethylacetamid, Α,Α-dimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

-40CZ 310462 B6 v přítomnosti přenosového činidla obecného vzorce R⁸-X“-E, kde R⁸ je fenyl, -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH₃)2; -S-(CH2)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)b-CH3; -S(CEEjb-CHs; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

X”je -S-C(=S)-;

přičemž skupina R⁸ je navázaná přes svou koncovou -S- skupinu nebo přes uhlík fenylu k thiokarbonylové skupině spojky X”; a

E je koncová skupina vybraná z:

CH₃

..........ch₃

CN

9¾ch

9—ch₂ i\

CN

CH₃ ° —ί—ch₂-ch₂..0¾ ch₃ o ch₃ c _CH;. CH₃ ý—ch₂—---r—ch₂ |...........ch₃ ------—ch₂ Hch ^^h3 °.........^ch3 , CN _Cn_{3 a}CH

R je definované v nároku 1 za vzniku kopolymeru obecného vzorce XXX.

7. Použití kopolymeru podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4 v imunochemických metodách jako blokátoru nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a popřípadě pro zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze.

8. Použití podle nároku 7, kde imunochemické metody jsou vybrané ze skupiny zahrnující metody stanovení s luminiscenční, chemiluminisceční, fluorescenční, radioaktivní, či enzymatickou detekcí, popřípadě stanovení využívající značení koloidními kovy, s výhodou jsou imunochemické metody vybrané ze skupiny zahrnující luminiscenční imunoanalýzu, imunoluminometrickou analýzu, chemiluminiscenční imunoanalýzu, imunochemiluminometrickou analýzu, elektrochemiluminiscenční analýzu, fluorescenční imunanalýzu, imunofluorometrickou analýzu, radioaktivní imunoanalýzu, imunoradiometrickou analýzu, enzymovou imunoanalýzu, imunoenzymometrickou analýzu, metody průtokové cytometric, imunohistochemie, či Western blottingu.