JP3110480B2 - 対合ポリペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、結合アッセイ用試薬
及び上記の試薬を用いるイン・ビトロ診断法に関係す
る。この試薬は、特異的結合用分子及び光学的染料標識
と共有結合した主鎖のポリペプチドを含み、増強ペプチ
ド（enhancing polypeptide ）と会合している。この結
合アッセイ用試薬及び上記の試薬を用いる方法は上記の
特許請求の範囲に記してある。
及び上記の試薬を用いるイン・ビトロ診断法に関係す
る。この試薬は、特異的結合用分子及び光学的染料標識
と共有結合した主鎖のポリペプチドを含み、増強ペプチ
ド（enhancing polypeptide ）と会合している。この結
合アッセイ用試薬及び上記の試薬を用いる方法は上記の
特許請求の範囲に記してある。
【０００２】この対合ポリペプチド試薬（ｐａｉｒｅｄ
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ）は、染料
ポリマー結合体（ｄｙｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）と増強ペプチドの複合体であるが、血液、血
清、血漿、尿、唾液、涙、汗、リンパ液等の生物学的液
体中での様々な結合アッセイにおいて標的分子の存在の
有無及び／又は量を光学的に検出するのに有用である。
このようなアッセイの実施例は、制限することなく、抗
原と抗体間の結合に基づく免疫アッセイ、又はアビジン
／ビオチン検出システムを含む結合アッセイを含む。そ
のようなアッセイにおいて、増強ペプチドはアッセイ感
度及び染料ポリマー結合体の結合特性を有意に増大させ
る。
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ）は、染料
ポリマー結合体（ｄｙｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）と増強ペプチドの複合体であるが、血液、血
清、血漿、尿、唾液、涙、汗、リンパ液等の生物学的液
体中での様々な結合アッセイにおいて標的分子の存在の
有無及び／又は量を光学的に検出するのに有用である。
このようなアッセイの実施例は、制限することなく、抗
原と抗体間の結合に基づく免疫アッセイ、又はアビジン
／ビオチン検出システムを含む結合アッセイを含む。そ
のようなアッセイにおいて、増強ペプチドはアッセイ感
度及び染料ポリマー結合体の結合特性を有意に増大させ
る。
【０００３】一般的に、この発明の新しい対合ペプチド
を用いるアッセイ試験システムは、アッセイ試料中で疑
われている標的分子に結合出来る適当な結合用分子を有
する染料ポリマー結合体、その染料ポリマー結合体と複
合体を形成する増強ペプチド、及び染料からの光学的放
射の検出及び／又は定量のための手段を含む。好ましく
は、このアッセイは、結合用分子が固相に結合されてい
て、被検査試料にさらした後で標的分子結合用分子複合
体を溶液から分離するのを容易にする競争的結合アッセ
イである。このアッセイはサンドイッチ型のアッセイで
もあり、固相はその上に固定化され標的分子の一部に向
けられた結合用分子を有し、標的分子を含む試料にさら
されてから、染料ポリマー（増強ペプチドと複合体を形
成している）を含む溶液にさらされるが、それは同じ標
的分子の異なる部位に向けられた結合用分子を含む。適
当な固相の一例はアガロースゲルである。適当な固相の
他の例は当業者には明白であり、結合アッセイの分野で
は周知である。
を用いるアッセイ試験システムは、アッセイ試料中で疑
われている標的分子に結合出来る適当な結合用分子を有
する染料ポリマー結合体、その染料ポリマー結合体と複
合体を形成する増強ペプチド、及び染料からの光学的放
射の検出及び／又は定量のための手段を含む。好ましく
は、このアッセイは、結合用分子が固相に結合されてい
て、被検査試料にさらした後で標的分子結合用分子複合
体を溶液から分離するのを容易にする競争的結合アッセ
イである。このアッセイはサンドイッチ型のアッセイで
もあり、固相はその上に固定化され標的分子の一部に向
けられた結合用分子を有し、標的分子を含む試料にさら
されてから、染料ポリマー（増強ペプチドと複合体を形
成している）を含む溶液にさらされるが、それは同じ標
的分子の異なる部位に向けられた結合用分子を含む。適
当な固相の一例はアガロースゲルである。適当な固相の
他の例は当業者には明白であり、結合アッセイの分野で
は周知である。
【０００４】この発明のポリペプチド主鎖は染料で高度
に置換され得、従って、このアッセイシステムに改良さ
れた感度を提供する。例えば、フルオレセインでの置換
はこのペプチドの遊離のアミノ基の約６０−７０％に光
学的標識の結合を生じる。フルオレセインで置換された
とき、ポリペプチド主鎖の各分子は６００以上のフルオ
レセイン残基を含んで良く、モル吸光係数Ｅｍ＝６×１
０7 で相対的分子質量（relative molecular mass ）８
×１０5 ダルトンを与える。吸光度は１リットル当りの
モル濃度のモル吸光係数倍に等しい、即ち、数１が成り
立つ。
に置換され得、従って、このアッセイシステムに改良さ
れた感度を提供する。例えば、フルオレセインでの置換
はこのペプチドの遊離のアミノ基の約６０−７０％に光
学的標識の結合を生じる。フルオレセインで置換された
とき、ポリペプチド主鎖の各分子は６００以上のフルオ
レセイン残基を含んで良く、モル吸光係数Ｅｍ＝６×１
０7 で相対的分子質量（relative molecular mass ）８
×１０5 ダルトンを与える。吸光度は１リットル当りの
モル濃度のモル吸光係数倍に等しい、即ち、数１が成り
立つ。
【０００５】
【数１】
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】残りのアミノ基は結合
用分子との共有結合に利用出来る。この染料ポリマーを
アッセイシステム用の試薬として用いることは、それが
多量の標識分子を供給するので非常に好ましい。遺憾な
がら、十分には分からない理由により、この染料ポリマ
ーの結合用分子部分は標的分子に全く結合しない訳では
ないが良く結合しない。それ故、増強ペプチドを染料ポ
リマー結合体との混和物の形態で又は染料ポリマー結合
体との複合体を形成して供給すると染料ポリマーの結合
パラメーターが増大してこの余り役に立たない試薬を顕
著に免疫アッセイに適したものにするということを見出
したことは驚くべきことである。
用分子との共有結合に利用出来る。この染料ポリマーを
アッセイシステム用の試薬として用いることは、それが
多量の標識分子を供給するので非常に好ましい。遺憾な
がら、十分には分からない理由により、この染料ポリマ
ーの結合用分子部分は標的分子に全く結合しない訳では
ないが良く結合しない。それ故、増強ペプチドを染料ポ
リマー結合体との混和物の形態で又は染料ポリマー結合
体との複合体を形成して供給すると染料ポリマーの結合
パラメーターが増大してこの余り役に立たない試薬を顕
著に免疫アッセイに適したものにするということを見出
したことは驚くべきことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】主鎖のポリペプチドは、
当業者に既知の任意のペプチド合成法に従って合成して
良い。例えば、Ｂｌｏｕｔ，Ｅ．Ｒ．とＫａｒｌｓｏ
ｎ，Ｒ．Ｈ．Journal ofthe American Chemical Societ
y、78 巻、941-946頁、1956 年 3月；Ｈａｎｂｙ，Ｗ．
Ｅ．、Ｗａｌｅｙ，Ｓ．Ｇ．及びＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Jo
urnal of the Chemical Society, Article 632巻、3239-
3249頁、1950 年；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．、Ｂｏｄａ
ｎｓｚｋｙ，Ａ．、The Practice of Peptide Synthesi
s 、Springer-Varlay、Berlin、Heidelberg、New York、Tok
yo、1984 年、211頁；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．、Ｂｏｄ
ａｎｓｚｋｙ，Ａ．、Principles of Peptide Synthesi
s 、Springer-Varlay、Berlin、Heidelberg、New York、Tok
yo、1984 年、211頁を参照。好ましくは、それらは改変さ
れた開環重合法を用いて、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水
物を利用して合成するのが良い（Ｌｅｕｃｈｓ，Ｈ．：
Beridtsch Chem. Ges.39巻、857頁、(1906) ；Ｌｅｕｃｈ
ｓ，Ｈ．、Ｇｅｉｇｅｒ，Ｗ．、 同誌、41 巻、1721 頁、
(1908) ）。
当業者に既知の任意のペプチド合成法に従って合成して
良い。例えば、Ｂｌｏｕｔ，Ｅ．Ｒ．とＫａｒｌｓｏ
ｎ，Ｒ．Ｈ．Journal ofthe American Chemical Societ
y、78 巻、941-946頁、1956 年 3月；Ｈａｎｂｙ，Ｗ．
Ｅ．、Ｗａｌｅｙ，Ｓ．Ｇ．及びＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Jo
urnal of the Chemical Society, Article 632巻、3239-
3249頁、1950 年；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．、Ｂｏｄａ
ｎｓｚｋｙ，Ａ．、The Practice of Peptide Synthesi
s 、Springer-Varlay、Berlin、Heidelberg、New York、Tok
yo、1984 年、211頁；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．、Ｂｏｄ
ａｎｓｚｋｙ，Ａ．、Principles of Peptide Synthesi
s 、Springer-Varlay、Berlin、Heidelberg、New York、Tok
yo、1984 年、211頁を参照。好ましくは、それらは改変さ
れた開環重合法を用いて、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水
物を利用して合成するのが良い（Ｌｅｕｃｈｓ，Ｈ．：
Beridtsch Chem. Ges.39巻、857頁、(1906) ；Ｌｅｕｃｈ
ｓ，Ｈ．、Ｇｅｉｇｅｒ，Ｗ．、 同誌、41 巻、1721 頁、
(1908) ）。
【０００８】開環重合法において、所望のアミノ酸のＮ
−カルボキシ無水物は、最初、ガンマーベンジル−Ｎ−
カルボベンゾキシグルタメート及びＮ−ｅ，ａジカルボ
ベンゾキシリジンナトリウムから五塩化燐との反応によ
って製造する。結晶反応生成物を精製し、洗浄する。最
適量のナトリウムメトキシドを増強ペプチドの製造にお
いてＮ−カルボキシ無水物アミノ酸の重合を開始するの
に利用する。
−カルボキシ無水物は、最初、ガンマーベンジル−Ｎ−
カルボベンゾキシグルタメート及びＮ−ｅ，ａジカルボ
ベンゾキシリジンナトリウムから五塩化燐との反応によ
って製造する。結晶反応生成物を精製し、洗浄する。最
適量のナトリウムメトキシドを増強ペプチドの製造にお
いてＮ−カルボキシ無水物アミノ酸の重合を開始するの
に利用する。
【０００９】グルタミン酸及びリジンのＮ−カルボキシ
無水物（ＮＣＡ）誘導体のランダムコポリマーはＮＣＡ
アミノ酸結晶をジオキサンに溶かし、十分量のナトリウ
ムメトキシドを加えて最適のＮＣＡアミノ酸：イニシエ
ーター比を提供し、その混合物を反応させ、かつ溶媒を
蒸発させることにより合成する。ポリペプチド主鎖の製
造において、ＮＣＡアミノ酸：イニシエーター比は約５
００：１である。
無水物（ＮＣＡ）誘導体のランダムコポリマーはＮＣＡ
アミノ酸結晶をジオキサンに溶かし、十分量のナトリウ
ムメトキシドを加えて最適のＮＣＡアミノ酸：イニシエ
ーター比を提供し、その混合物を反応させ、かつ溶媒を
蒸発させることにより合成する。ポリペプチド主鎖の製
造において、ＮＣＡアミノ酸：イニシエーター比は約５
００：１である。
【００１０】グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物誘導
体はリジンのＮ−カルボキシ無水物誘導体の３倍の速度
で重合するので、その結果生じる主鎖のポリペプチドの
配列は完全にランダムではない。最終的コポリマーの一
端は顕著にグルタミン酸を含み、他端は顕著にリジンを
含む。それぞれ約４：１という過剰モル比である。
体はリジンのＮ−カルボキシ無水物誘導体の３倍の速度
で重合するので、その結果生じる主鎖のポリペプチドの
配列は完全にランダムではない。最終的コポリマーの一
端は顕著にグルタミン酸を含み、他端は顕著にリジンを
含む。それぞれ約４：１という過剰モル比である。
【００１１】重合の後、リジン及びグルタミン酸の保護
されているイプシロンアミノ基及びガンマーカルボキシ
ル基をそれぞれ、再蒸留氷酢酸及び酢酸中の臭化水素を
用いて脱保護する。４−１２℃で３日後、ポリマーをエ
ーテルで沈殿させ、濾過により塊として回収する。その
塊をｐＨ９−１０に調整された０．５Ｍ ＮａＯＨに再
懸濁し、その溶液を約８，０００−１０，０００以下の
分子量を透過させる Spectra-por膜（Spectra Medical
Industries製、Los Angeles, California ）に入れて脱
イオン水に対して数日間透析する。透析後、生成物を凍
結乾燥し、フルオレセイン又はローダミンなどの光学的
染料で標識する。
されているイプシロンアミノ基及びガンマーカルボキシ
ル基をそれぞれ、再蒸留氷酢酸及び酢酸中の臭化水素を
用いて脱保護する。４−１２℃で３日後、ポリマーをエ
ーテルで沈殿させ、濾過により塊として回収する。その
塊をｐＨ９−１０に調整された０．５Ｍ ＮａＯＨに再
懸濁し、その溶液を約８，０００−１０，０００以下の
分子量を透過させる Spectra-por膜（Spectra Medical
Industries製、Los Angeles, California ）に入れて脱
イオン水に対して数日間透析する。透析後、生成物を凍
結乾燥し、フルオレセイン又はローダミンなどの光学的
染料で標識する。
【００１２】染料分子は、蛋白質及びペプチドをローダ
ミン又はフルオレセインなどの光学的染料で標識するた
めの当業者に既知の方法；例えば標準イソチオシアネー
ト反応を用いて主鎖ポリペプチドのアミノ基に結合し得
る。好ましくは、この発明の主鎖ポリペプチドは、引用
したＷｉｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Immunochemistry、28章、405
頁、4版、Blackwell Publications、Boston、 1986年の方法
に従って、フルオレセインイソチオシアネートをゆっく
りと加え、続いて透析及び分子ふるいクロマトグラフィ
ーで精製することにより、フルオレセインで標識する。
ミン又はフルオレセインなどの光学的染料で標識するた
めの当業者に既知の方法；例えば標準イソチオシアネー
ト反応を用いて主鎖ポリペプチドのアミノ基に結合し得
る。好ましくは、この発明の主鎖ポリペプチドは、引用
したＷｉｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Immunochemistry、28章、405
頁、4版、Blackwell Publications、Boston、 1986年の方法
に従って、フルオレセインイソチオシアネートをゆっく
りと加え、続いて透析及び分子ふるいクロマトグラフィ
ーで精製することにより、フルオレセインで標識する。
【００１３】この染料ポリマーは中性又は弱アルカリ性
水性媒質に可溶性である。それは又ジメチルホルムアミ
ドにも可溶性である。染料ポリマーの溶液は同濃度の未
反応のポリペプチド主鎖を含む溶液より粘性が低い。
水性媒質に可溶性である。それは又ジメチルホルムアミ
ドにも可溶性である。染料ポリマーの溶液は同濃度の未
反応のポリペプチド主鎖を含む溶液より粘性が低い。
【００１４】染料ポリマーの製造の後で、適当な結合用
分子を染料ポリマーに共有結合させて染料ポリマー結合
体を形成する。結合用分子をポリペプチドのアミノ基に
共有結合させるための適当な方法は、当業者には周知で
ある。そのような方法の一つは、Ｃａｒｌｓｓｏｎ，
Ｊ．、Ｄｒｅｖｉｎ，Ｈ．及びＡｘｅｎ，Ｒ．、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、１７３巻、７２３
頁、１９７８年に開示されている。好ましくは、用いら
れる結合方法は、Ｃａｒｌｓｓｏｎ（前出）により教示
されたものの変法であり、そこでは、ポリペプチド及び
結合用分子は、最初、Ｎ−スクシンイミジル３−（２ピ
リジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で修飾さ
れ、続いてジスルフィド結合で結合される。ＳＰＤＰ
は、一つのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分
及び一つのｓ−ピリジルジスルフィド部分を含むヘテロ
二官能性試薬である。このエステルはポリマーの第一級
アミノ基と反応して安定なアミド結合を形成する。修飾
されたポリペプチドは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
で還元される２−ピリジルジスルフィド構造を含む。こ
の還元反応は、ピリジンチオンの遊離を生じ、遊離のス
ルフヒドリル基を有する修飾されたポリマー（チオレー
ト化ポリマー）を生成する。遊離されたピリジンチオン
の濃度は分光測光的に監視され、その得られる値が被修
飾ポリペプチドに導入されたスルフヒドリル基の数の程
度である。第二に、結合用分子は染料ポリマーを修飾す
るのに用いられたのと同じ方法によってＳＰＤＰで修飾
されるが、２−ピリジルジスルフィド構造の還元は行わ
ない。ＳＰＤＰ修飾された結合用分子は、二成分を緩衝
液中で一晩混合することによりチオレート化ポリマーに
共有結合される。反応をヨード酢酸のナトリウム塩を加
えることにより停止させ、染料ポリマー結合体を数回の
沈殿及び遠心分離により精製する。精製された染料ポリ
マー結合体を０．１５ＭトリスｐＨ８．５に約３５０−
４００ＡＵ／ｍｌに懸濁させる。
分子を染料ポリマーに共有結合させて染料ポリマー結合
体を形成する。結合用分子をポリペプチドのアミノ基に
共有結合させるための適当な方法は、当業者には周知で
ある。そのような方法の一つは、Ｃａｒｌｓｓｏｎ，
Ｊ．、Ｄｒｅｖｉｎ，Ｈ．及びＡｘｅｎ，Ｒ．、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、１７３巻、７２３
頁、１９７８年に開示されている。好ましくは、用いら
れる結合方法は、Ｃａｒｌｓｓｏｎ（前出）により教示
されたものの変法であり、そこでは、ポリペプチド及び
結合用分子は、最初、Ｎ−スクシンイミジル３−（２ピ
リジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で修飾さ
れ、続いてジスルフィド結合で結合される。ＳＰＤＰ
は、一つのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分
及び一つのｓ−ピリジルジスルフィド部分を含むヘテロ
二官能性試薬である。このエステルはポリマーの第一級
アミノ基と反応して安定なアミド結合を形成する。修飾
されたポリペプチドは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
で還元される２−ピリジルジスルフィド構造を含む。こ
の還元反応は、ピリジンチオンの遊離を生じ、遊離のス
ルフヒドリル基を有する修飾されたポリマー（チオレー
ト化ポリマー）を生成する。遊離されたピリジンチオン
の濃度は分光測光的に監視され、その得られる値が被修
飾ポリペプチドに導入されたスルフヒドリル基の数の程
度である。第二に、結合用分子は染料ポリマーを修飾す
るのに用いられたのと同じ方法によってＳＰＤＰで修飾
されるが、２−ピリジルジスルフィド構造の還元は行わ
ない。ＳＰＤＰ修飾された結合用分子は、二成分を緩衝
液中で一晩混合することによりチオレート化ポリマーに
共有結合される。反応をヨード酢酸のナトリウム塩を加
えることにより停止させ、染料ポリマー結合体を数回の
沈殿及び遠心分離により精製する。精製された染料ポリ
マー結合体を０．１５ＭトリスｐＨ８．５に約３５０−
４００ＡＵ／ｍｌに懸濁させる。
【００１５】増強ペプチドは、好ましくは、約２×１０
4 −２×１０5 ダルトンの分子量のペプチドであるが、
この範囲外の値のものも使用出来る。増強ペプチドを、
等しい数の陽及び陰電荷又は過剰の陰電荷を生じるよう
な酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸に対する比で合成する
ということはこの発明の重要な面である。即ち、酸性成
分は塩基性成分と等モル量か又は塩基性成分より過剰に
あってよく、最大の正味の陰電荷１．５を生じる範囲に
あってよい。好ましくは、塩基性及び酸性アミノ酸は反
対の立体化学的配置（即ち、Ｄ及びＬアミノ酸）を持つ
のが良い。
4 −２×１０5 ダルトンの分子量のペプチドであるが、
この範囲外の値のものも使用出来る。増強ペプチドを、
等しい数の陽及び陰電荷又は過剰の陰電荷を生じるよう
な酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸に対する比で合成する
ということはこの発明の重要な面である。即ち、酸性成
分は塩基性成分と等モル量か又は塩基性成分より過剰に
あってよく、最大の正味の陰電荷１．５を生じる範囲に
あってよい。好ましくは、塩基性及び酸性アミノ酸は反
対の立体化学的配置（即ち、Ｄ及びＬアミノ酸）を持つ
のが良い。
【００１６】増強ペプチド中で用いるのに適当な酸性ア
ミノ酸の例は、Ｌ−アスパラギン酸塩、Ｄ−アスパラギ
ン酸塩、Ｌ−グルタミン酸、及びＤ−グルタミン酸であ
る。増強ペプチド中で反対の立体化学的配置の酸性アミ
ノ酸と組み合わせて用いるのに適当な塩基性アミノ酸の
例は、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−
アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、及びＬ
−オルニチンとＤ−オルニチンである。
ミノ酸の例は、Ｌ−アスパラギン酸塩、Ｄ−アスパラギ
ン酸塩、Ｌ−グルタミン酸、及びＤ−グルタミン酸であ
る。増強ペプチド中で反対の立体化学的配置の酸性アミ
ノ酸と組み合わせて用いるのに適当な塩基性アミノ酸の
例は、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−
アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、及びＬ
−オルニチンとＤ−オルニチンである。
【００１７】好ましくは、この増強ペプチドコポリマー
は、反対の立体化学的配置のアスパラギン酸及びリジン
残基又は反対の立体化学的配置のグルタミン酸及びリジ
ン残基を含み、分子量２×１０4 −２×１０5 ダルトン
を有する。最も好ましくは、この増強ペプチドは、Ｌ−
グルタミン酸とＤ−リジンの、又はＤ−グルタミン酸と
Ｌ−リジンのそれぞれ１：１〜２：１の適当なモル比の
ランダムコポリマーである。このようなペプチドは、好
ましくは、分子量約１×１０5 ダルトンを有する。比が
大きいと安定な結果を生じるが、グルタミン酸のリジン
に対するモル比が増大するにつれて、その結果の増強ペ
プチドの活性は減少し、従って、低いモル比のときと同
様の所望の結果を達成するためには、より完全な増強ペ
プチドを必要とするということが見出されている。
は、反対の立体化学的配置のアスパラギン酸及びリジン
残基又は反対の立体化学的配置のグルタミン酸及びリジ
ン残基を含み、分子量２×１０4 −２×１０5 ダルトン
を有する。最も好ましくは、この増強ペプチドは、Ｌ−
グルタミン酸とＤ−リジンの、又はＤ−グルタミン酸と
Ｌ−リジンのそれぞれ１：１〜２：１の適当なモル比の
ランダムコポリマーである。このようなペプチドは、好
ましくは、分子量約１×１０5 ダルトンを有する。比が
大きいと安定な結果を生じるが、グルタミン酸のリジン
に対するモル比が増大するにつれて、その結果の増強ペ
プチドの活性は減少し、従って、低いモル比のときと同
様の所望の結果を達成するためには、より完全な増強ペ
プチドを必要とするということが見出されている。
【００１８】別法として、増強ペプチドは酸性アミノ酸
のホモポリマーと塩基性アミノ酸のホモポリマーの混合
物であってよい。染料ポリマー結合体の非特異的結合を
減らすためにホモポリマーの混合物を用いた場合は、二
種類のホモポリマーは同じか又は反対の立体化学的配置
を持ち得る。しかしながら、両ペプチドがＬ型であるホ
モポリマー混合物は、結合の増強活性が、Ｄ及びＬ、又
は二種類のＤ型ポリペプチドの混合物より有意に低いと
いうことが観察されている。好ましくは、混合するホモ
ポリマーは、Ｄ−リジン（Ｍｒ １４Ｋ）とＬ−グルタ
ミン酸（Ｍｒ７７Ｋ）ホモポリマー、Ｄ−リジン（Ｍｒ
１３Ｋ）とＤ−グルタミン酸（Ｍｒ６６Ｋ）ホモポリ
マー、又はＤ−リジン（Ｍｒ ２６．３Ｋ）とＤ−グル
タミン酸（Ｍｒ ６６Ｋ）が良いが、アミノ酸は上述と
同じ比で存在する。
のホモポリマーと塩基性アミノ酸のホモポリマーの混合
物であってよい。染料ポリマー結合体の非特異的結合を
減らすためにホモポリマーの混合物を用いた場合は、二
種類のホモポリマーは同じか又は反対の立体化学的配置
を持ち得る。しかしながら、両ペプチドがＬ型であるホ
モポリマー混合物は、結合の増強活性が、Ｄ及びＬ、又
は二種類のＤ型ポリペプチドの混合物より有意に低いと
いうことが観察されている。好ましくは、混合するホモ
ポリマーは、Ｄ−リジン（Ｍｒ １４Ｋ）とＬ−グルタ
ミン酸（Ｍｒ７７Ｋ）ホモポリマー、Ｄ−リジン（Ｍｒ
１３Ｋ）とＤ−グルタミン酸（Ｍｒ６６Ｋ）ホモポリ
マー、又はＤ−リジン（Ｍｒ ２６．３Ｋ）とＤ−グル
タミン酸（Ｍｒ ６６Ｋ）が良いが、アミノ酸は上述と
同じ比で存在する。
【００１９】増強ペプチドは、それらの組み合わされた
立体化学的配置のために、染料ポリマー結合体に結合し
てアッセイ用試薬複合体を形成し、それは、染料ポリマ
ー結合体が単独で用いられる場合と比較して、アッセイ
処理において有意に増強された結合性を示す。好ましく
は、酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基に対するモ
ル比は、２：１〜１：１の範囲内であり、最も好ましく
は約１：１である。この発明の試薬は、染料ポリマー結
合体と増強ペプチドとの混合物（恐らくは、複合体）で
あり、濃度は増強ペプチドの酸性残基の塩基性残基に対
するモル比により変化する。例えば、酸性残基の比が増
えるにつれて、小さい比において得られるのと同じ結果
を達成するのに要する増強ペプチドの量は増加する。従
って、適当な濃度は、混合物の全重量に対して増強ペプ
チドが５０〜９７％であり、好ましくは、６５〜９０％
であって、残りは染料ポリマー結合体である。これらの
濃度は、１ｍｇの染料ポリマーが８０吸光度単位を有す
ることに基づいている。
立体化学的配置のために、染料ポリマー結合体に結合し
てアッセイ用試薬複合体を形成し、それは、染料ポリマ
ー結合体が単独で用いられる場合と比較して、アッセイ
処理において有意に増強された結合性を示す。好ましく
は、酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基に対するモ
ル比は、２：１〜１：１の範囲内であり、最も好ましく
は約１：１である。この発明の試薬は、染料ポリマー結
合体と増強ペプチドとの混合物（恐らくは、複合体）で
あり、濃度は増強ペプチドの酸性残基の塩基性残基に対
するモル比により変化する。例えば、酸性残基の比が増
えるにつれて、小さい比において得られるのと同じ結果
を達成するのに要する増強ペプチドの量は増加する。従
って、適当な濃度は、混合物の全重量に対して増強ペプ
チドが５０〜９７％であり、好ましくは、６５〜９０％
であって、残りは染料ポリマー結合体である。これらの
濃度は、１ｍｇの染料ポリマーが８０吸光度単位を有す
ることに基づいている。
【００２０】出願人は、この増強ペプチドの作用様式が
如何なる特定の理論に束縛されることも希望しないが、
現在、これらのペプチドはその電荷、形状及び比較的小
さな大きさであることにより染料ポリマー結合体に結合
出来るミクロコロイド又はミセルを形成すると考えられ
ている。その結果の複合体はより球状に成り、それ故標
的分子と反応し易く成る。ペプチド鎖の方向はアミノ酸
残基の配置が変化する各点において効果的に変わるの
で、Ｄ及びＬアミノ酸を取り込むことは増強ペプチドの
活性に重要であるということも又論じられている。この
ことは、同一の配置を有するアミノ酸から成るペプチド
より一層球形のペプチドを生じさせると信じられてい
る。球形であることが増強ペプチドの染料ポリマーとの
結合を増大させ、それ故、アッセイシステムで要求され
る結合において増強ペプチドの正の効果を増大させると
仮定されている。
如何なる特定の理論に束縛されることも希望しないが、
現在、これらのペプチドはその電荷、形状及び比較的小
さな大きさであることにより染料ポリマー結合体に結合
出来るミクロコロイド又はミセルを形成すると考えられ
ている。その結果の複合体はより球状に成り、それ故標
的分子と反応し易く成る。ペプチド鎖の方向はアミノ酸
残基の配置が変化する各点において効果的に変わるの
で、Ｄ及びＬアミノ酸を取り込むことは増強ペプチドの
活性に重要であるということも又論じられている。この
ことは、同一の配置を有するアミノ酸から成るペプチド
より一層球形のペプチドを生じさせると信じられてい
る。球形であることが増強ペプチドの染料ポリマーとの
結合を増大させ、それ故、アッセイシステムで要求され
る結合において増強ペプチドの正の効果を増大させると
仮定されている。
【００２１】酸性及び塩基性ホモポリマーの混合物の場
合、試験結果は、反対に荷電しているホモポリマーも又
染料ポリマー結合体に効果的に結合出来る球状複合体に
会合するということを示唆する。この会合した複合体の
大きさも又、まだ分かっていない方法で染料複合体への
結合に影響するようである。例えば、Ｄ−リジンとＬ−
グルタミン酸の混合物は、少なくとも一方のホモポリマ
ーの分子量がある臨界量を越えて増加すると活性の減少
を示す。これは、システムの特性及び用いられる様々な
ポリマー及び材料によって変化する。
合、試験結果は、反対に荷電しているホモポリマーも又
染料ポリマー結合体に効果的に結合出来る球状複合体に
会合するということを示唆する。この会合した複合体の
大きさも又、まだ分かっていない方法で染料複合体への
結合に影響するようである。例えば、Ｄ−リジンとＬ−
グルタミン酸の混合物は、少なくとも一方のホモポリマ
ーの分子量がある臨界量を越えて増加すると活性の減少
を示す。これは、システムの特性及び用いられる様々な
ポリマー及び材料によって変化する。
【００２２】増強ペプチドはポリペプチド合成のための
適当な公知の方法によって合成することが出来、特に、
前述したポリペプチド主鎖の合成に用いたのと同じ方法
で合成出来る。従って、例えば、適当な酸性及び塩基性
アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物誘導体はナトリウムメ
トキシドを重合のイニシエーターとして用いて重合す
る。重合並びに保護されたアミノ基及びカルボキシル基
の脱保護の後、そのペプチドを６，０００−８，０００
以下の分子量を透過させる Spectra-por膜に入れて脱イ
オン水に対して二日間透析し、そして凍結乾燥する。
適当な公知の方法によって合成することが出来、特に、
前述したポリペプチド主鎖の合成に用いたのと同じ方法
で合成出来る。従って、例えば、適当な酸性及び塩基性
アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物誘導体はナトリウムメ
トキシドを重合のイニシエーターとして用いて重合す
る。重合並びに保護されたアミノ基及びカルボキシル基
の脱保護の後、そのペプチドを６，０００−８，０００
以下の分子量を透過させる Spectra-por膜に入れて脱イ
オン水に対して二日間透析し、そして凍結乾燥する。
【００２３】増強ペプチドの凝集は、染料ポリマー結合
体との複合体を沈殿させるだけでなく複合体形成を阻害
もするということが観察された。それ故、このペプチド
の溶解度は少なくとも部分的に、非特異的結合を減らす
機能のある分子量の上限を決定すると考えられる。阻害
的凝集の除去を確実にするために、凍結乾燥した増強ペ
プチドを３００，０００×ｇで２時間超遠心分離し、上
清を試験用に取って、１）非特異的結合アッセイにおけ
る活性、２）ゲル濾過による相対的分子質量、及び３）
酸加水分解後のＨＰＬＣによる酸性アミノ酸残基の塩基
性アミノ酸残基に対する比を決定した。
体との複合体を沈殿させるだけでなく複合体形成を阻害
もするということが観察された。それ故、このペプチド
の溶解度は少なくとも部分的に、非特異的結合を減らす
機能のある分子量の上限を決定すると考えられる。阻害
的凝集の除去を確実にするために、凍結乾燥した増強ペ
プチドを３００，０００×ｇで２時間超遠心分離し、上
清を試験用に取って、１）非特異的結合アッセイにおけ
る活性、２）ゲル濾過による相対的分子質量、及び３）
酸加水分解後のＨＰＬＣによる酸性アミノ酸残基の塩基
性アミノ酸残基に対する比を決定した。
【００２４】染料ポリマー結合体及び増強ペプチドは続
いての後者を伴う結合アッセイに用いるためにプレミッ
クスするが、後者はペプチドを加えた複合体の混合物に
対して５０〜９７、好ましくは、６５〜９０重量％存在
する。この発明の対合したポリペプチド試薬は、アビジ
ン／ビオチンアッセイなどの非免疫学的アッセイにおい
て結合を増大させるのに有効であるが、免疫学的アッセ
イ、特に、競争的結合アッセイ、及び特に、チロキシン
（Ｔ4 ）などの小さい分子及びチロキシン結合性グロブ
リン（ＴＢＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）
及びアポ−Ａ1などの大きい分子を含むアッセイで用い
られるとき特に有用である。
いての後者を伴う結合アッセイに用いるためにプレミッ
クスするが、後者はペプチドを加えた複合体の混合物に
対して５０〜９７、好ましくは、６５〜９０重量％存在
する。この発明の対合したポリペプチド試薬は、アビジ
ン／ビオチンアッセイなどの非免疫学的アッセイにおい
て結合を増大させるのに有効であるが、免疫学的アッセ
イ、特に、競争的結合アッセイ、及び特に、チロキシン
（Ｔ4 ）などの小さい分子及びチロキシン結合性グロブ
リン（ＴＢＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）
及びアポ−Ａ1などの大きい分子を含むアッセイで用い
られるとき特に有用である。
【００２５】下記の実施例はこの発明の特定の具体例を
説明するだけであり、発明はそれに限定されないことは
理解される。実施例中で又は明細中の何処かで様々な成
分の量はすべて、別に明示されている場合以外は、重量
による。
説明するだけであり、発明はそれに限定されないことは
理解される。実施例中で又は明細中の何処かで様々な成
分の量はすべて、別に明示されている場合以外は、重量
による。
【００２６】
実施例１ 染料ポリマー結合体を合成するために、まず、Ｌ−リジ
ンとＬ−グルタミン酸の４：１のランダムコポリマー
を、下記のプロトコールに従って、アミノ酸Ｎ−カルボ
キシ無水物の開環重合を用いて合成した。
ンとＬ−グルタミン酸の４：１のランダムコポリマー
を、下記のプロトコールに従って、アミノ酸Ｎ−カルボ
キシ無水物の開環重合を用いて合成した。
【００２７】１． ガンマーベンジルＮ−カルボキシ−
Ｌ−グルタメート無水物（ｇ−Ｂｚ−Ｌ−ＧＬＵ ＮＣ
Ａ）の合成。すべてのガラス器具類を洗剤と熱水で洗
い、まず脱イオン水で、次いでアセトンですすぎ、１２
０℃で少なくとも２時間乾燥した。反応前に、反応容器
を反応媒質中で用いる溶媒ですすいだ。
Ｌ−グルタメート無水物（ｇ−Ｂｚ−Ｌ−ＧＬＵ ＮＣ
Ａ）の合成。すべてのガラス器具類を洗剤と熱水で洗
い、まず脱イオン水で、次いでアセトンですすぎ、１２
０℃で少なくとも２時間乾燥した。反応前に、反応容器
を反応媒質中で用いる溶媒ですすいだ。
【００２８】ガンマーベンジル−Ｎ−カルボベンゾキシ
Ｌ−グルタメート４ｇを乾燥した１００ｍｌの攪拌棒を
装備した丸底フラスコに入れ、試薬粒子を確実に溶解さ
せるために破砕した。無水エーテル２４ｍｌを加え、乾
燥用チューブ（drying tube）を挿入した。反応物を室
温で３０分間穏やかに攪拌して溶解した。完全に溶解し
た後、反応混合物を、攪拌を続けながら、氷浴中で１０
℃に冷却した。五塩化燐（ＰＣｌ5 ）粉末（２．６９
ｇ）を素早く加え、攪拌を１０℃で続けた。約３０−４
０分で、反応混合物は固化した。
Ｌ−グルタメート４ｇを乾燥した１００ｍｌの攪拌棒を
装備した丸底フラスコに入れ、試薬粒子を確実に溶解さ
せるために破砕した。無水エーテル２４ｍｌを加え、乾
燥用チューブ（drying tube）を挿入した。反応物を室
温で３０分間穏やかに攪拌して溶解した。完全に溶解し
た後、反応混合物を、攪拌を続けながら、氷浴中で１０
℃に冷却した。五塩化燐（ＰＣｌ5 ）粉末（２．６９
ｇ）を素早く加え、攪拌を１０℃で続けた。約３０−４
０分で、反応混合物は固化した。
【００２９】ガード乾燥用チューブ（guard drying tub
e ）付きのロータリーエバポレーターにアセトンとエー
テルを流した。エーテル層を蒸発させると、白色の固体
が残った。酢酸エチル１５ｍｌを加えて、攪拌し、そし
て蒸発させた。無水の酢酸エチルを加えて蒸発させるこ
とを繰り返した。透明なシロップが得られた。
e ）付きのロータリーエバポレーターにアセトンとエー
テルを流した。エーテル層を蒸発させると、白色の固体
が残った。酢酸エチル１５ｍｌを加えて、攪拌し、そし
て蒸発させた。無水の酢酸エチルを加えて蒸発させるこ
とを繰り返した。透明なシロップが得られた。
【００３０】このシロップを無水の酢酸エチル約１０ｍ
ｌに溶解させた。必要なときは、混合物を油浴中で５０
℃に加熱する。無水ヘキサンを溶液が濁るまで加えた。
溶液を室温まで冷却し、次いで、フラスコに乾燥用チュ
ーブをしっかり付けて、フリーザー中に一晩置いた。
ｌに溶解させた。必要なときは、混合物を油浴中で５０
℃に加熱する。無水ヘキサンを溶液が濁るまで加えた。
溶液を室温まで冷却し、次いで、フラスコに乾燥用チュ
ーブをしっかり付けて、フリーザー中に一晩置いた。
【００３１】その結果生じた結晶をブフナー漏斗で、Ｐ
−４フィッシャーろ紙を用いて濾過し、ヘキサンで２回
洗い、そしてデシケーター内で真空中で乾燥させた。こ
の生成物の融点は８４−８８℃のはずである。
−４フィッシャーろ紙を用いて濾過し、ヘキサンで２回
洗い、そしてデシケーター内で真空中で乾燥させた。こ
の生成物の融点は８４−８８℃のはずである。
【００３２】２． Ｎ−ｅ−ＣＢＺ−Ｎ−ａ−カルボキ
シ−Ｌ−リジンのＮＣＡの合成。Ｎ−ａ−Ｎ−ｅジ−Ｃ
ＢＺ−Ｌ−リジン５ｇを乾燥した１００ｍｌの攪拌棒付
きの丸底フラスコに入れた。無水エーテル２５ｍｌを加
えて、混合物を攪拌し、スラリーを得た。１０℃の氷及
び水浴中で冷却後、五塩化燐２．８ｇをスラリーに、１
０℃で攪拌しながら加えた。約３０分で、透明な溶液を
生じた。
シ−Ｌ−リジンのＮＣＡの合成。Ｎ−ａ−Ｎ−ｅジ−Ｃ
ＢＺ−Ｌ−リジン５ｇを乾燥した１００ｍｌの攪拌棒付
きの丸底フラスコに入れた。無水エーテル２５ｍｌを加
えて、混合物を攪拌し、スラリーを得た。１０℃の氷及
び水浴中で冷却後、五塩化燐２．８ｇをスラリーに、１
０℃で攪拌しながら加えた。約３０分で、透明な溶液を
生じた。
【００３３】エーテルを、回転式蒸発（roto-evaporati
on）及び無水酢酸エチル（１５ｍｌを２回分）との共蒸
発（co-evaporation）により除去した。白色の固体が得
られた。
on）及び無水酢酸エチル（１５ｍｌを２回分）との共蒸
発（co-evaporation）により除去した。白色の固体が得
られた。
【００３４】この結晶を、無水酢酸エチル１５ｍｌ及び
無水ヘキサン約５ｍｌから再結晶したが、ヘキサンを加
える前に、溶液を油浴中で約５０℃に加熱した。次いで
それを室温まで冷却し、乾燥用チューブ付きの容器に入
れて４℃の冷却器の中に一晩置いた。
無水ヘキサン約５ｍｌから再結晶したが、ヘキサンを加
える前に、溶液を油浴中で約５０℃に加熱した。次いで
それを室温まで冷却し、乾燥用チューブ付きの容器に入
れて４℃の冷却器の中に一晩置いた。
【００３５】この結晶をブフナー漏斗上で集めて、ヘキ
サンで洗い、真空中で乾燥した。この生成物の融点は９
０−９５℃のはずである。
サンで洗い、真空中で乾燥した。この生成物の融点は９
０−９５℃のはずである。
【００３６】３． ランダムコポリマーの合成。ｇ−ベ
ンジル−Ｌ−グルタミン酸のＮＣＡ０．９５ｇを攪拌棒
と乾燥用チューブを付けた５００ｍｌの丸底フラスコに
入れた。無水ジオキサン（Aldrich SureSeal ）５７ｍ
ｌを加え、攪拌して溶解させた。無色の溶液を生じた。
ンジル−Ｌ−グルタミン酸のＮＣＡ０．９５ｇを攪拌棒
と乾燥用チューブを付けた５００ｍｌの丸底フラスコに
入れた。無水ジオキサン（Aldrich SureSeal ）５７ｍ
ｌを加え、攪拌して溶解させた。無色の溶液を生じた。
【００３７】Ｎ−ｅ−ＣＢＺ−Ｎ−ａ−カルボキシ−Ｌ
−リジンのＮＣＡ４．３８ｇを乾燥した１００ｍｌのフ
ラスコに入れ、ジオキサン４４ｍｌを加えた。無色の溶
液を生じた。
−リジンのＮＣＡ４．３８ｇを乾燥した１００ｍｌのフ
ラスコに入れ、ジオキサン４４ｍｌを加えた。無色の溶
液を生じた。
【００３８】リジン溶液をグルタミン酸溶液に加え、次
に、無水メタノール中の新鮮な０．１４Ｍ ナトリウム
メトキシド溶液を加えて無水物：イニシエーター比を５
００：１にした。ＮＣＡ溶液を激しく攪拌しながら、ナ
トリウムメトキシドをシリンジから滴下した。イニシエ
ーターの添加の後、乾燥用チューブをフラスコに取り付
けた。反応を、室温で１時間攪拌して行い、次いで、遮
光して室温に一晩置いた。
に、無水メタノール中の新鮮な０．１４Ｍ ナトリウム
メトキシド溶液を加えて無水物：イニシエーター比を５
００：１にした。ＮＣＡ溶液を激しく攪拌しながら、ナ
トリウムメトキシドをシリンジから滴下した。イニシエ
ーターの添加の後、乾燥用チューブをフラスコに取り付
けた。反応を、室温で１時間攪拌して行い、次いで、遮
光して室温に一晩置いた。
【００３９】翌日、回転式蒸発により溶媒を除去し、ペ
ースト状の残留物を得た。この生成物を真空デシケータ
ー中でDrierite上で少なくとも４時間乾燥した。
ースト状の残留物を得た。この生成物を真空デシケータ
ー中でDrierite上で少なくとも４時間乾燥した。
【００４０】４． ポリペプチドの脱保護。再蒸留氷酢
酸５０ｍｌを保護されたポリペプチドに加え、その混合
物を固体粒子が殆ど溶解するまで、約１５分間攪拌し
た。酢酸中の３０％臭化水素１００ｍｌを、次いで、加
えた。
酸５０ｍｌを保護されたポリペプチドに加え、その混合
物を固体粒子が殆ど溶解するまで、約１５分間攪拌し
た。酢酸中の３０％臭化水素１００ｍｌを、次いで、加
えた。
【００４１】室温で水分の無い状態で１時間攪拌した
後、透明乃至黄色味がかった溶液が得られるが、それは
約１５−２０分で濁る。その時点で、フラスコを冷却箱
に移し、３日間攪拌した（４−１２℃）。濃いスラリー
が出来た。
後、透明乃至黄色味がかった溶液が得られるが、それは
約１５−２０分で濁る。その時点で、フラスコを冷却箱
に移し、３日間攪拌した（４−１２℃）。濃いスラリー
が出来た。
【００４２】３日間冷却した後、エーテル１容（１５０
−２００ｍｌ）を加え、その混合物をフリーザー中に２
時間置いた。沈殿をＰ−４ろ紙を付けたブフナー漏斗上
で濾過し、その塊をエーテル２０ｍｌで２回洗った。
−２００ｍｌ）を加え、その混合物をフリーザー中に２
時間置いた。沈殿をＰ−４ろ紙を付けたブフナー漏斗上
で濾過し、その塊をエーテル２０ｍｌで２回洗った。
【００４３】その塊を２５０ｍｌの三角フラスコに移
し、０．０５Ｍ ＮａＯＨ１００ｍｌを加えて、濁った
溶液を作った。ｐＨを９−１０に調整した。水を加えて
１５０ｍｌにし、その試料を、約８，０００−１０，０
００ダルトン以下の分子量について透過性の Spectra-p
or膜内に入れた。その試料を４×８Ｌ容の脱イオン水に
対して２日間室温で透析し、凍結乾燥した。
し、０．０５Ｍ ＮａＯＨ１００ｍｌを加えて、濁った
溶液を作った。ｐＨを９−１０に調整した。水を加えて
１５０ｍｌにし、その試料を、約８，０００−１０，０
００ダルトン以下の分子量について透過性の Spectra-p
or膜内に入れた。その試料を４×８Ｌ容の脱イオン水に
対して２日間室温で透析し、凍結乾燥した。
【００４４】５． ポリペプチドの特徴付け。相対的分
子質量（Ｍｒ）を基準化されたセファロースＣＬ−６Ｂ
カラム上で、ゲル濾過により決定した。
子質量（Ｍｒ）を基準化されたセファロースＣＬ−６Ｂ
カラム上で、ゲル濾過により決定した。
【００４５】リジンのグルタミン酸に対する比は、ＨＰ
ＬＣで決定したところ、４．００：１．０１であった。
上記の方法において出発材料を適当に変えることによ
り、様々な比を作り得る。
ＬＣで決定したところ、４．００：１．０１であった。
上記の方法において出発材料を適当に変えることによ
り、様々な比を作り得る。
【００４６】６． ポリペプチド主鎖の標識。Ｌ−リジ
ンとＬ−グルタミン酸のランダムコポリマー（ポリペプ
チド主鎖）を、下記の方法で、フルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）の添加により、フルオレセイン
で標識した。
ンとＬ−グルタミン酸のランダムコポリマー（ポリペプ
チド主鎖）を、下記の方法で、フルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）の添加により、フルオレセイン
で標識した。
【００４７】１． ペプチド主鎖の精製 ａ） ランダムコポリマー｛ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｈ
Ｂｒ）１：４、分子量約３８０，０００（Sigma Chemic
al Company, St.Louis,Mo.,Cat No.P-0650ヨリ購入）｝を
ビカルボネート緩衝液、０．１５Ｍ、ｐＨ９．５、１０
０ｍｌ中に溶解した。その溶液を２×１Ｌ容の同緩衝液
に対して室温で４８時間透析した。
Ｂｒ）１：４、分子量約３８０，０００（Sigma Chemic
al Company, St.Louis,Mo.,Cat No.P-0650ヨリ購入）｝を
ビカルボネート緩衝液、０．１５Ｍ、ｐＨ９．５、１０
０ｍｌ中に溶解した。その溶液を２×１Ｌ容の同緩衝液
に対して室温で４８時間透析した。
【００４８】２． ＦＩＴＣ標識されたペプチド主鎖の
製造 ａ） 残留物（ペプチド主鎖７５ｍｇを含む）を２５０
ｍｌの琥珀色の攪拌棒を備えたフラスコに入れた。
製造 ａ） 残留物（ペプチド主鎖７５ｍｇを含む）を２５０
ｍｌの琥珀色の攪拌棒を備えたフラスコに入れた。
【００４９】ｂ） フルオレセインイソチオシアネート
３５０ｍｇを計り、乾燥した琥珀色のフラスコ中の無水
ジメチルホルムアミド６５．０ｍｌ中に溶解した。
３５０ｍｇを計り、乾燥した琥珀色のフラスコ中の無水
ジメチルホルムアミド６５．０ｍｌ中に溶解した。
【００５０】ｃ） ＦＩＴＣ溶液を乾燥した琥珀色の分
液漏斗に移した。
液漏斗に移した。
【００５１】ｄ）ペプチド溶液を激しく攪拌しながら、
ＦＩＴＣを約２秒に１滴の速度で加えた。
ＦＩＴＣを約２秒に１滴の速度で加えた。
【００５２】ｅ） ＦＩＴＣ添加の後、反応を５時間攪
拌しながら行った。
拌しながら行った。
【００５３】３．ＦＩＴＣで標識されたペプチド主鎖の
精製 ａ） ＦＩＴＣ標識された主鎖ポリマーを２×４Ｌ容の
ビカルボネート緩衝液に対して２時間透析した。
精製 ａ） ＦＩＴＣ標識された主鎖ポリマーを２×４Ｌ容の
ビカルボネート緩衝液に対して２時間透析した。
【００５４】ｂ） ＦＩＴＣ標識されたペプチドを、Sp
ectra/Por ＵＦ膜（ＭＷＣＯ １×１０6 ）を取り付け
たSpectrum限外濾過装置（Spectrum Medical Industrie
s,Los Angeles,CA）にかけて、０．０５Ｍ リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ９．０、１．０Ｌで溶出し、次い
で、２５ｍｌ容に濃縮した。
ectra/Por ＵＦ膜（ＭＷＣＯ １×１０6 ）を取り付け
たSpectrum限外濾過装置（Spectrum Medical Industrie
s,Los Angeles,CA）にかけて、０．０５Ｍ リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ９．０、１．０Ｌで溶出し、次い
で、２５ｍｌ容に濃縮した。
【００５５】ｃ） この溶液を、前もって０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラム（２．５ｃｍ×５４ｃｍ）上で精製し
た。
ン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラム（２．５ｃｍ×５４ｃｍ）上で精製し
た。
【００５６】ｄ） ボイドピーク画分（５０ｍｌ）を採
取した。
取した。
【００５７】４． ＦＩＴＣ標識したペプチド主鎖の特
徴付け ａ） セファデックスＧ−２５カラムから溶出したボイ
ドピークに含まれるポリマーの吸光度単位の数値を測定
した。
徴付け ａ） セファデックスＧ−２５カラムから溶出したボイ
ドピークに含まれるポリマーの吸光度単位の数値を測定
した。
【００５８】ｂ） 溶出液５０ｍｌを１０％酢酸で沈殿
させ、ペレットを水で洗い、遠心分離し、次いで、凍結
乾燥した。
させ、ペレットを水で洗い、遠心分離し、次いで、凍結
乾燥した。
【００５９】ｃ） 残留物の重量を測定し、残留物１．
０ｍｇ中に含まれる吸光度単位の数を（ｂ）を基準体積
として、計算した。
０ｍｇ中に含まれる吸光度単位の数を（ｂ）を基準体積
として、計算した。
【００６０】ＦＩＴＣ標識されたポリペプチド（染料ポ
リマー）を、次いで、下記の方法で抗体に結合した。
リマー）を、次いで、下記の方法で抗体に結合した。
【００６１】１． 抗体及び染料ポリマーのＳＰＤＰ誘
導体生成。エタノール（６．６７ｍｌ）を、エタノール
ですすいだシリンジを用いて、ガラス製円錐形遠沈管に
入れた。乾燥した部屋で、エタノールをＳＰＤＰ（デシ
ケーター中に保存）１０ｍｇに加えて１．５ｍｇ／ｍｌ
にした。実験室では、これらの成分を溶解するまで良く
混合した（１０−１５分 ）。
導体生成。エタノール（６．６７ｍｌ）を、エタノール
ですすいだシリンジを用いて、ガラス製円錐形遠沈管に
入れた。乾燥した部屋で、エタノールをＳＰＤＰ（デシ
ケーター中に保存）１０ｍｇに加えて１．５ｍｇ／ｍｌ
にした。実験室では、これらの成分を溶解するまで良く
混合した（１０−１５分 ）。
【００６２】抗体７０ｍｇを琥珀色のバイアルに入れた
（抗体濃度は３〜５ｍｇ／ｍｌである）。抗体１モル当
り８．６モルのＳＰＤＰを、４つのアリコートに５分間
隔で、攪拌しながら加えた。次いで、そのバイアルを、
攪拌を止めて、７５分間放置して反応を起こさせた。
（抗体濃度は３〜５ｍｇ／ｍｌである）。抗体１モル当
り８．６モルのＳＰＤＰを、４つのアリコートに５分間
隔で、攪拌しながら加えた。次いで、そのバイアルを、
攪拌を止めて、７５分間放置して反応を起こさせた。
【００６３】染料ポリマー１０，０００ＡＵを１５０−
２００ＡＵ／ｍｌで計量し、１００ｍｌの琥珀色の瓶に
入れた。残りのＳＰＤＰ３．５ｍｌをエタノールで１
０．５ｍｌに希釈した（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）。染
料ポリマー１モル当り３０モルのＳＰＤＰを４つのアリ
コートに５分間隔で、攪拌しながら加えた。攪拌を、更
に、２時間１５分続けた。
２００ＡＵ／ｍｌで計量し、１００ｍｌの琥珀色の瓶に
入れた。残りのＳＰＤＰ３．５ｍｌをエタノールで１
０．５ｍｌに希釈した（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）。染
料ポリマー１モル当り３０モルのＳＰＤＰを４つのアリ
コートに５分間隔で、攪拌しながら加えた。攪拌を、更
に、２時間１５分続けた。
【００６４】ＳＰＤＰ誘導体形成した抗体を２．５ｃｍ
透析チューブに入れて、１リットルの０．１Ｍ Ｐ０
４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、緩衝液、ｐＨ７．４に対して
一晩４℃で透析した。
透析チューブに入れて、１リットルの０．１Ｍ Ｐ０
４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、緩衝液、ｐＨ７．４に対して
一晩４℃で透析した。
【００６５】ＳＰＤＰ化された染料ポリマーを２リット
ルの０．０５Ｍ Ｐ０４、ｐＨ７．５に対して一晩４℃
で透析した。
ルの０．０５Ｍ Ｐ０４、ｐＨ７．５に対して一晩４℃
で透析した。
【００６６】２． ＳＰＤＰ誘導体化した染料ポリマー
の還元。染料ポリマーを透析チューブから取り出し、総
容積を測定した。染料ポリマーに加えるべき０．２Ｍ
ＤＴＴの量を、終濃度０．０２Ｍ ＤＴＴを得るように
計算し（染料ポリマー容積×１１％）、計算した容積の
ＤＴＴを清浄なキャップをした琥珀色の瓶中で攪拌しな
がら反応させた。
の還元。染料ポリマーを透析チューブから取り出し、総
容積を測定した。染料ポリマーに加えるべき０．２Ｍ
ＤＴＴの量を、終濃度０．０２Ｍ ＤＴＴを得るように
計算し（染料ポリマー容積×１１％）、計算した容積の
ＤＴＴを清浄なキャップをした琥珀色の瓶中で攪拌しな
がら反応させた。
【００６７】反応後、還元したポリマーを、１０％酢酸
で溶液のｐＨを５に下げることにより沈殿させた。試料
を５０ｍｌの円錐形管に入れて冷却遠心分離した。ピリ
ジン−２−チオンの測定及びこのポリマーに導入された
スルフヒドリル基の数の測定用に上清を保存した。
で溶液のｐＨを５に下げることにより沈殿させた。試料
を５０ｍｌの円錐形管に入れて冷却遠心分離した。ピリ
ジン−２−チオンの測定及びこのポリマーに導入された
スルフヒドリル基の数の測定用に上清を保存した。
【００６８】各ペレットを０．０１Ｍ 酢酸塩緩衝液、
ｐＨ５、５０ｍｌ中に分散させ、良く混合して、遠心分
離した。上清を捨て、この操作を繰り返した。冷却遠心
分離し、上清を捨てる操作は、遠心管を替えて行い、こ
の生成物を０．０１Ｍ酢酸ナトリウムで更に３回洗っ
た。
ｐＨ５、５０ｍｌ中に分散させ、良く混合して、遠心分
離した。上清を捨て、この操作を繰り返した。冷却遠心
分離し、上清を捨てる操作は、遠心管を替えて行い、こ
の生成物を０．０１Ｍ酢酸ナトリウムで更に３回洗っ
た。
【００６９】ペレットを脱イオン水で１回洗い、上清は
捨てた。そのペレットを、次いで、出発材料各２００Ａ
Ｕ当り、０．０５Ｍ Ｐ０４、ｐＨ７．４、１．０ｍｌ
中に溶解させた。直に、０．５Ｍ リン酸二水素ナトリ
ウムを用いて、ｐＨを７．５に調整した。このポリマー
の一部（０．１ｍｌ）を０．１５Ｍ トリス緩衝液、ｐ
Ｈ８．５で１：２００に希釈し、４９２ｎｍで測定し
た。回収した濃度及び全ＡＵを計算した。試料を、結合
用に、約１００ＡＵ／ｍｌに希釈した（一度還元したポ
リマーを希釈したら、抗体を３０分以内に加えなければ
成らない）。
捨てた。そのペレットを、次いで、出発材料各２００Ａ
Ｕ当り、０．０５Ｍ Ｐ０４、ｐＨ７．４、１．０ｍｌ
中に溶解させた。直に、０．５Ｍ リン酸二水素ナトリ
ウムを用いて、ｐＨを７．５に調整した。このポリマー
の一部（０．１ｍｌ）を０．１５Ｍ トリス緩衝液、ｐ
Ｈ８．５で１：２００に希釈し、４９２ｎｍで測定し
た。回収した濃度及び全ＡＵを計算した。試料を、結合
用に、約１００ＡＵ／ｍｌに希釈した（一度還元したポ
リマーを希釈したら、抗体を３０分以内に加えなければ
成らない）。
【００７０】チオール基の濃度はＣａｒｌｓｓｏｎ（前
出）の方法に従って計算した。
出）の方法に従って計算した。
【００７１】３． ＳＰＤＰ抗体の処理。ＳＰＤＰ抗体
を透析チューブから取り出し、体積を測定した。抗体濃
度は、２８０ｎｍで吸光度を読むことにより測定した。
を透析チューブから取り出し、体積を測定した。抗体濃
度は、２８０ｎｍで吸光度を読むことにより測定した。
【００７２】４． 染料ポリマーの抗体への結合。利用
可能な抗体の総ｍｇ及び利用可能な還元されたポリマー
の総ＡＵを計算した。各１，０００ＡＵのポリマーに対
しＳＰＤＰ修飾された抗体６．６ｍｇを用いて、形成さ
れ得た結合の量を計算したが、１．０ｍｇのＳＰＤＰ化
抗体はチオール基の試験用に保存した。
可能な抗体の総ｍｇ及び利用可能な還元されたポリマー
の総ＡＵを計算した。各１，０００ＡＵのポリマーに対
しＳＰＤＰ修飾された抗体６．６ｍｇを用いて、形成さ
れ得た結合の量を計算したが、１．０ｍｇのＳＰＤＰ化
抗体はチオール基の試験用に保存した。
【００７３】還元したポリマーを攪拌棒を備えた透明な
ガラス瓶に１００ＡＵ／ｍｌで入れた。抗体を、混合物
を攪拌しながら加え、次いで、その混合物を攪拌用プレ
ートから降ろし、室温で一晩インキュベートした（抗体
上のチオール基の数はＣａｒｌｓｓｏｎの方法に従って
計算した）。
ガラス瓶に１００ＡＵ／ｍｌで入れた。抗体を、混合物
を攪拌しながら加え、次いで、その混合物を攪拌用プレ
ートから降ろし、室温で一晩インキュベートした（抗体
上のチオール基の数はＣａｒｌｓｓｏｎの方法に従って
計算した）。
【００７４】結合反応は、その翌日に、１．０Ｍ ヨー
ド酢酸ナトリウム塩を各１０，０００ＡＵ当り１００ｍ
ｌ加えることにより停止した。数分間の混合の後、混合
物を攪拌なしで２時間放置した。
ド酢酸ナトリウム塩を各１０，０００ＡＵ当り１００ｍ
ｌ加えることにより停止した。数分間の混合の後、混合
物を攪拌なしで２時間放置した。
【００７５】５． 沈殿による結合物の精製。この結合
物を、各２５００ＡＵ当り、一本の５０ｍｌプラスチッ
ク遠心管に移し、１．０Ｍ リン酸水素二ナトリウムで
ｐＨを５．５に下げた。冷却遠心分離後、上清を捨て
た。
物を、各２５００ＡＵ当り、一本の５０ｍｌプラスチッ
ク遠心管に移し、１．０Ｍ リン酸水素二ナトリウムで
ｐＨを５．５に下げた。冷却遠心分離後、上清を捨て
た。
【００７６】各ペレットを冷０．１５Ｍ ＮａＣｌ ５
０ｍｌ中に分散させ、遠心分離して、そしてデカンテー
ションした。この洗浄処理を繰り返した。
０ｍｌ中に分散させ、遠心分離して、そしてデカンテー
ションした。この洗浄処理を繰り返した。
【００７７】ペレットを約１０ｍｌの０．０１Ｍ トリ
ス、ｐＨ８．５中に再溶解し、次いで、清浄な５０ｍｌ
のプラスチック遠心管に移した。ｐＨ調整、遠心分離及
びＮａＣｌでの洗浄を繰り返した。各ペレットを０．０
１Ｍ トリス、ｐＨ８．５、１０ｍｌ中に再溶解して、
この操作を清浄な遠心管を用いて繰り返し、最終的に、
ペレットを０．１５Ｍ トリス、ｐＨ８．５中に、約２
５０〜４００ＡＵ／ｍｌで再溶解させた。３つの２０μ
ｌのアリコートを、０．１５Ｍ トリス（１：２００）
で４ｍｌに希釈し、４９２ｎｍでＯ．Ｄ．を読んだ。２
００倍した読みの平均値を用いて濃度を求めた。
ス、ｐＨ８．５中に再溶解し、次いで、清浄な５０ｍｌ
のプラスチック遠心管に移した。ｐＨ調整、遠心分離及
びＮａＣｌでの洗浄を繰り返した。各ペレットを０．０
１Ｍ トリス、ｐＨ８．５、１０ｍｌ中に再溶解して、
この操作を清浄な遠心管を用いて繰り返し、最終的に、
ペレットを０．１５Ｍ トリス、ｐＨ８．５中に、約２
５０〜４００ＡＵ／ｍｌで再溶解させた。３つの２０μ
ｌのアリコートを、０．１５Ｍ トリス（１：２００）
で４ｍｌに希釈し、４９２ｎｍでＯ．Ｄ．を読んだ。２
００倍した読みの平均値を用いて濃度を求めた。
【００７８】実施例２ Ｌ−グルタミン酸とＤ−リジンをモル比６：４でそれぞ
れ含む代表的増強ペプチドの合成は、実施例１で主鎖ポ
リペプチドの合成用に記述された様にして、下記の改変
を伴って達成された。 １． 用いたｇ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸のＮＣＡ
の量は２．８４ｇであった。 ２． 用いたＮ−ｅ−ＣＢＺ−Ｎ−ａカルボキシ−Ｄ−
リジンのＮＣＡの量は２．１９ｇであった。 ３． 無水物：イニシエーター比、５０：１を得るため
に用いたナトリウムメトキシドの容積は２．５ｍｌであ
った。 ４． 透析後に得たペプチドを３００，０００×ｇで、
２時間、超遠心分離した。その上清を回収し、凍結乾燥
した。 ５． そのポリペプチドの特徴付け：相対的分子質量
（Ｍｒ）を、基準化したセファクリルＳ−３００カラム
上のゲル濾過により決定した。 ６． グルタミン酸のリジンに対する比をＨＰＬＣによ
り決定し、６．０２〜４．０１であることを見出した。
前述のものより大きいか又は小さい比は、前述の方法に
おいて用いられたグルタミン酸及び／又はリジンの量を
適当に調整することにより作り得る。
れ含む代表的増強ペプチドの合成は、実施例１で主鎖ポ
リペプチドの合成用に記述された様にして、下記の改変
を伴って達成された。 １． 用いたｇ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸のＮＣＡ
の量は２．８４ｇであった。 ２． 用いたＮ−ｅ−ＣＢＺ−Ｎ−ａカルボキシ−Ｄ−
リジンのＮＣＡの量は２．１９ｇであった。 ３． 無水物：イニシエーター比、５０：１を得るため
に用いたナトリウムメトキシドの容積は２．５ｍｌであ
った。 ４． 透析後に得たペプチドを３００，０００×ｇで、
２時間、超遠心分離した。その上清を回収し、凍結乾燥
した。 ５． そのポリペプチドの特徴付け：相対的分子質量
（Ｍｒ）を、基準化したセファクリルＳ−３００カラム
上のゲル濾過により決定した。 ６． グルタミン酸のリジンに対する比をＨＰＬＣによ
り決定し、６．０２〜４．０１であることを見出した。
前述のものより大きいか又は小さい比は、前述の方法に
おいて用いられたグルタミン酸及び／又はリジンの量を
適当に調整することにより作り得る。
【００７９】実施例３ 増強ペプチドの活性の比較 Ｌ−ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓ、Ｄ−ｇｌｕ：Ｌ−ｌｙｓ、Ｌ
−ａｓｐ：Ｄ−ｌｙｓ、Ｌ−ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓ、Ｄ−
ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓの比が６：４の及びＤ−ｌｙｓ及び
Ｌ−ｇｌｕ又はＬ−ｌｙｓ及びＤ−ｇｌｕのホモポリマ
ーの混合物から成る増強ペプチドは免疫アッセイによっ
て免疫反応におけるそれらの染料ポリマー結合体の標的
分子に対する結合を増強する活性を試験した。
−ａｓｐ：Ｄ−ｌｙｓ、Ｌ−ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓ、Ｄ−
ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓの比が６：４の及びＤ−ｌｙｓ及び
Ｌ−ｇｌｕ又はＬ−ｌｙｓ及びＤ−ｇｌｕのホモポリマ
ーの混合物から成る増強ペプチドは免疫アッセイによっ
て免疫反応におけるそれらの染料ポリマー結合体の標的
分子に対する結合を増強する活性を試験した。
【００８０】ＴＢＧ免疫アッセイ：ＴＢＧの免疫アッセ
イは、抗−ＴＢＧ−染料ポリマー結合体の循環ＴＢＧへ
の結合能力と、その後、抗−ＴＢＧ−染料ポリマー−Ｔ
ＢＧ複合体が固相上に固定化されたＴ4 によって捕獲さ
れることに基づいている。
イは、抗−ＴＢＧ−染料ポリマー結合体の循環ＴＢＧへ
の結合能力と、その後、抗−ＴＢＧ−染料ポリマー−Ｔ
ＢＧ複合体が固相上に固定化されたＴ4 によって捕獲さ
れることに基づいている。
【００８１】実施例１の様にして製造した抗−ＴＢＧ−
染料ポリマー結合体（８ＡＵ）１００ｍｇを、６：４の
Ｄ−ｇｌｕ：Ｌ−ｌｙｓ比の増強ペプチドの２．５％溶
液４００μｌと、実施例２の様にして製造した増強ペプ
チド２ｍｇを含む０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．５
中でプレミックスした。この混合物は、現在、（増強ペ
プチドを加えた染料ポリマーの重量に対して）約９６％
の増強ペプチドを含むが、ＴＢＧを含む検体に加えた。
次に、固定化Ｔ4 を有しているゲルの懸濁液１ｍｌを加
え、液相の４９２ｎｍの吸光度の増加を６０分間のイン
キュベーションの後に測定した。少なくとも３００ミリ
ＡＵの吸光度の増加は、有意の増強ペプチド活性を表す
と考えられた。
染料ポリマー結合体（８ＡＵ）１００ｍｇを、６：４の
Ｄ−ｇｌｕ：Ｌ−ｌｙｓ比の増強ペプチドの２．５％溶
液４００μｌと、実施例２の様にして製造した増強ペプ
チド２ｍｇを含む０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．５
中でプレミックスした。この混合物は、現在、（増強ペ
プチドを加えた染料ポリマーの重量に対して）約９６％
の増強ペプチドを含むが、ＴＢＧを含む検体に加えた。
次に、固定化Ｔ4 を有しているゲルの懸濁液１ｍｌを加
え、液相の４９２ｎｍの吸光度の増加を６０分間のイン
キュベーションの後に測定した。少なくとも３００ミリ
ＡＵの吸光度の増加は、有意の増強ペプチド活性を表す
と考えられた。
【００８２】この免疫アッセイにおいて、６：４のＬ−
ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓ比の増強ペプチドは、約６０μｇ／
ｍｌのＴＢＧを含む試料中で、約２０００ミリＡＵの吸
光度の変化を与える。Ｌ−ｇｌｕ及びＬ−ｌｙｓ又はＤ
−ｇｌｕ及びＤ−ｌｙｓから成る類似の増強ペプチド
は、このアッセイにおいて殆ど又はまったく吸光度の変
化を与えないが、これは酸性及び塩基性アミノ酸が同じ
立体化学的配置を有する増強ペプチドは免疫アッセイに
おいて染料ポリマー結合体の結合を有意に増強させない
ということを示唆している。
ｇｌｕ：Ｄ−ｌｙｓ比の増強ペプチドは、約６０μｇ／
ｍｌのＴＢＧを含む試料中で、約２０００ミリＡＵの吸
光度の変化を与える。Ｌ−ｇｌｕ及びＬ−ｌｙｓ又はＤ
−ｇｌｕ及びＤ−ｌｙｓから成る類似の増強ペプチド
は、このアッセイにおいて殆ど又はまったく吸光度の変
化を与えないが、これは酸性及び塩基性アミノ酸が同じ
立体化学的配置を有する増強ペプチドは免疫アッセイに
おいて染料ポリマー結合体の結合を有意に増強させない
ということを示唆している。
【００８３】酸性及び塩基性アミノ酸のホモポリマーの
混合物は、ＴＢＧアッセイにおける非特異的結合の阻害
をも試験した。染料ポリマー結合体を添加する前に、等
モル量のホモポリマーを、ｐＨ８．５で、水に混合し
た。６０μｇ／ｍｌのＴＢＧを含む試料を用いて得られ
た結果を下記の表に示す。
混合物は、ＴＢＧアッセイにおける非特異的結合の阻害
をも試験した。染料ポリマー結合体を添加する前に、等
モル量のホモポリマーを、ｐＨ８．５で、水に混合し
た。６０μｇ／ｍｌのＴＢＧを含む試料を用いて得られ
た結果を下記の表に示す。
【００８４】
【表１】
【００８５】試料ａ、ｂ、ｃ及びｇは、結合の増強にお
いて容認出来る性質を示している。これらの結果は又、
立体化学的配置が活性にとって重要である単一の増強ペ
プチドとは対照的に、ホモポリマーがポリマーの複合体
中で用いられる場合は、同一の立体化学的配置が機能的
であるということをも示唆している。活性に対する複合
体の大きさの影響も又ある。
いて容認出来る性質を示している。これらの結果は又、
立体化学的配置が活性にとって重要である単一の増強ペ
プチドとは対照的に、ホモポリマーがポリマーの複合体
中で用いられる場合は、同一の立体化学的配置が機能的
であるということをも示唆している。活性に対する複合
体の大きさの影響も又ある。
【００８６】下記の表（表２）は、普通に患者の血漿中
で遭遇するＴＢＧ濃度の範囲に渡る組成物の活性を示し
ている。
で遭遇するＴＢＧ濃度の範囲に渡る組成物の活性を示し
ている。
【００８７】
【表２】
【００８８】実施例４Ｔ4 結合アッセイ ：この免疫アッセイの形式は、Ｔ4 を
含む試料と反応した抗−Ｔ4 染料ポリマーの添加と、そ
の後、未結合の抗−Ｔ4 染料ポリマー結合体を捕獲する
ための固体支持物上に固定化されたＴ3 を添加すること
に基づいている。
含む試料と反応した抗−Ｔ4 染料ポリマーの添加と、そ
の後、未結合の抗−Ｔ4 染料ポリマー結合体を捕獲する
ための固体支持物上に固定化されたＴ3 を添加すること
に基づいている。
【００８９】８−アニリノ−ナフタレンスルホネート
（ＡＮＳ）の２％溶液１００μｌを、表３に示されたレ
ベルのＴ4 を含む試料に加え、その後、前もって実施例
２における様にして調製したトリス、ｐＨ８．６中の増
強ペプチドの２．５％溶液４００μｌと混合した抗−Ｔ
4 −染料ポリマー結合体（８ＡＵ）を加えた。共有結合
したＴ3 を含む５０％ゲル懸濁液１ｍｌを最後に加え、
この混合物を１５−６０分間インキュベートした。４９
２ｎｍの吸光度を読み、吸光度の変化を前述したように
測定し、計算した。Ｔ4 を約１ｎｇ含む試料において、
吸光度の最小の許容される減少は約３００ミリＡＵであ
る。下記の表３は、Ｔ4 −モノクローナル抗体−染料ポ
リマー結合体を、６：４の比の増強ペプチドと共に用い
たときの免疫反応性を示している。
（ＡＮＳ）の２％溶液１００μｌを、表３に示されたレ
ベルのＴ4 を含む試料に加え、その後、前もって実施例
２における様にして調製したトリス、ｐＨ８．６中の増
強ペプチドの２．５％溶液４００μｌと混合した抗−Ｔ
4 −染料ポリマー結合体（８ＡＵ）を加えた。共有結合
したＴ3 を含む５０％ゲル懸濁液１ｍｌを最後に加え、
この混合物を１５−６０分間インキュベートした。４９
２ｎｍの吸光度を読み、吸光度の変化を前述したように
測定し、計算した。Ｔ4 を約１ｎｇ含む試料において、
吸光度の最小の許容される減少は約３００ミリＡＵであ
る。下記の表３は、Ｔ4 −モノクローナル抗体−染料ポ
リマー結合体を、６：４の比の増強ペプチドと共に用い
たときの免疫反応性を示している。
【００９０】
【表３】
【００９１】血清試料の試験を上記の試薬の錠剤を用い
て行った場合は、その結果は市販の試験キットを用いて
得られるものと一致した。
て行った場合は、その結果は市販の試験キットを用いて
得られるものと一致した。
【００９２】Ｔ4 結合アッセイにおいて、６：４のＤ−
ｇｌｕとＬ−Ｌｙｓを含む増強ペプチドとしてのランダ
ムコポリマーは、６：４のＬ−ｇｌｕとＤ−ｌｙｓの増
強ペプチドに匹敵することが見出された（１５分後で、
それぞれ、１，３６３ミリＡＵ及び１，１６６ミリＡＵ
の吸光度変化）。６：４のＬ−ＡｓｐとＤ−ｌｙｓのラ
ンダムコポリマーも又、１時間後で４１４ミリＡＵの吸
光度変化で、許容出来る増強活性を示した。１：１のＬ
−ｇｌｕ：Ｄ−Ｌｙｓの増強ペプチドを６：４の比の材
料の代わりに用いた場合、６：４の材料に類似の及び匹
敵する吸光度の変化を生じる増強ペプチドの量が１０倍
減少した。
ｇｌｕとＬ−Ｌｙｓを含む増強ペプチドとしてのランダ
ムコポリマーは、６：４のＬ−ｇｌｕとＤ−ｌｙｓの増
強ペプチドに匹敵することが見出された（１５分後で、
それぞれ、１，３６３ミリＡＵ及び１，１６６ミリＡＵ
の吸光度変化）。６：４のＬ−ＡｓｐとＤ−ｌｙｓのラ
ンダムコポリマーも又、１時間後で４１４ミリＡＵの吸
光度変化で、許容出来る増強活性を示した。１：１のＬ
−ｇｌｕ：Ｄ−Ｌｙｓの増強ペプチドを６：４の比の材
料の代わりに用いた場合、６：４の材料に類似の及び匹
敵する吸光度の変化を生じる増強ペプチドの量が１０倍
減少した。
【００９３】実施例５ヒト絨毛性ゴナドトロピン免疫アッセイ ＨＣＧのモノクローナル抗体を８ＡＵ（０．１ｍｇ）、
実施例１における様にして調製したＦＩＴＣ標識したポ
リマー結合体及び６：４の増強ペプチド（実施例２にお
ける様にして調製）２．０ｍｇを０．０５Ｍトリス緩衝
液、ｐＨ８．５、１．０ｍｌ中に含む試薬溶液を調製し
た。その溶液を混合し、室温に３０分間放置した。
実施例１における様にして調製したＦＩＴＣ標識したポ
リマー結合体及び６：４の増強ペプチド（実施例２にお
ける様にして調製）２．０ｍｇを０．０５Ｍトリス緩衝
液、ｐＨ８．５、１．０ｍｌ中に含む試薬溶液を調製し
た。その溶液を混合し、室温に３０分間放置した。
【００９４】ＨＣＧを０、１００及び２００ミリＩＵ含
む０．０５Ｍトリス緩衝液を４００μｌ含む一連の管
に、上記の試薬溶液を１．０ｍｌ加えた。その管を、そ
れから、室温で２時間混合した。
む０．０５Ｍトリス緩衝液を４００μｌ含む一連の管
に、上記の試薬溶液を１．０ｍｌ加えた。その管を、そ
れから、室温で２時間混合した。
【００９５】次いで、従来からのシアノゲンブロミド法
でウルトラゲル（Ultragel）に共有結合させたヤギの抗
−ＨＣＧ ＩｇＧを含む、０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐ
Ｈ８．５中の５０％ゲル懸濁液を２ｍｌ加えた。その管
を、それから、２時間室温で混合した。その上清のアリ
コートを取り出し、トリス緩衝液で希釈して、４９２ｎ
ｍで吸光度を読んだ。
でウルトラゲル（Ultragel）に共有結合させたヤギの抗
−ＨＣＧ ＩｇＧを含む、０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐ
Ｈ８．５中の５０％ゲル懸濁液を２ｍｌ加えた。その管
を、それから、２時間室温で混合した。その上清のアリ
コートを取り出し、トリス緩衝液で希釈して、４９２ｎ
ｍで吸光度を読んだ。
【００９６】
【表４】
【００９７】前述の詳細な説明は単に説明のためのもの
であり、この発明の趣旨を離れずに変形がなされ得るこ
とは理解される。
であり、この発明の趣旨を離れずに変形がなされ得るこ
とは理解される。
Claims (10)
- 【請求項１】 グルタミン酸残基及びリジン残基を主鎖
ポリペプチドが正味の正電荷を有するような比で含む主
鎖ポリペプチドを含み、上記の主鎖ポリペプチドが分子
質量２．０×１０5 ダルトン以上を持ち、主鎖ポリペプ
チドに共有結合した光学的染料標識、主鎖ポリペプチド
に共有結合した特異的結合用分子、及び主鎖ポリペプチ
ドに会合した増強ペプチドを有し、上記の増強ペプチド
が、ａ）酸性及び塩基性のＤ／Ｌアミノ酸モノマー残
基、又は、ｂ）酸性アミノ酸のホモポリマー及び塩基性
アミノ酸のホモポリマーの混合物から成り、かつ上記の
増強ペプチドが電気的に中性か又は正味の負電荷を有す
る、結合アッセイ用試薬。 - 【請求項２】 主鎖ポリペプチドがリジン及びグルタミ
ン酸をモル比３−５：１で含む、請求項１に記載の結合
アッセイ用試薬。 - 【請求項３】 増強ペプチドが分子質量２×１０4 〜２
×１０5 ダルトンを有し、かつＬ−グルタミン酸のＤ−
リジンに対する又はＤ−グルタミン酸のＬ−リジンに対
する又はＬ−アスパラギン酸のＤ−リジンに対するモル
比１：１〜２：１を有するポリペプチドよりなるグルー
プから選ばれる、請求項１又は２に記載の結合アッセイ
用試薬。 - 【請求項４】 光学的染料がフルオレセインであり、か
つ結合用分子が抗体、抗原、ビオチン及びアビジンのグ
ループから選ばれる、請求項３に記載の結合アッセイ用
試薬。 - 【請求項５】 結合用分子がＴＢＧに対する抗体、Ｔ4
に対する抗体、ＨＣＧに対する抗体、又はアポＡ1 に対
する抗体である、請求項４に記載の結合アッセイ用試
薬。 - 【請求項６】 増強ペプチドが等モル量の酸性及び塩基
性アミノ酸のホモポリマーの混合物であり、上記の混合
物がポリＬ−リジン及びポリＬ−グルタミン酸、ポリＤ
−リジン及びポリＬ−グルタミン酸、ポリＤ−リジン及
びポリＤ−グルタミン酸から成るグループから選ばれ
る、請求項１に記載の結合アッセイ用試薬。 - 【請求項７】 主鎖ポリペプチドが分子質量５−１０×
１０5 ダルトン、例えば、１×１０6 ダルトンを有す
る、請求項１〜４の内の任意の一つに記載の結合アッセ
イ用試薬。 - 【請求項８】 結合用分子がＴ4 に対する抗体、又は結
合用分子がＴＢＧに対する抗体、又は結合用分子がＨＣ
Ｇに対する抗体である、請求項７に記載の結合アッセイ
用試薬。 - 【請求項９】 請求項１〜８の任意の一つの試薬を液体
試料に一回、標的分子が上記の試薬と反応するのに十分
な条件下で接触させること、及び反応の程度とその液相
の上記の標的分子の量、有無を相関させること、及び試
料中の標的分子の量、有無を標準曲線を参照することに
より決定することを含む、液体試料中の標的分子の量、
有無を検出するイン・ビトロの分析方法。 - 【請求項１０】 相関させるステップを、液相の波長４
９２〜４９９ｎｍでの光学的吸光度の測定、及び試料中
の標的分子の量、有無を標準曲線を参照して決定するこ
とによって行い、この結合アッセイ用試薬に共有結合し
た結合用分子が抗−Ｔ4 抗体、抗−ＴＢＧ抗体、抗−Ｈ
ＣＧ抗体又は抗−アポＡ抗体である、請求項９に記載の
方法。
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| US7153701B1 (en) | 2000-02-17 | 2006-12-26 | Hamamatsu Photonics K.K. | Method for quantitatively detecting antigen |
| DE60238928D1 (de) * | 2001-09-19 | 2011-02-24 | Masaaki Kai | Lumineszierendes polymer und seine verwendung im bioassay |
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1990
- 1990-03-12 US US07/491,523 patent/US5019521A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-03-07 DE DE69120700T patent/DE69120700T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-07 EP EP91301927A patent/EP0447133B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-12 JP JP03070335A patent/JP3110480B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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| JPH05322892A (ja) | 1993-12-07 |
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