JPH10507778A

JPH10507778A - ポリペプチド：デンドリマー複合体

Info

Publication number: JPH10507778A
Application number: JP9509402A
Authority: JP
Inventors: シン，プラタップ
Original assignee: デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1995-08-11
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 1998-07-28
Also published as: EP0786087B1; DE69619493D1; ATE213837T1; AU6722796A; US6083708A; ES2171705T3; EP0786087A1; CA2201712A1; WO1997007398A1; DE69619493T2

Abstract

(57)【要約】第一のポリペプチドが制御可能に結合されているデンドリマーを含んでなる組成物を開示する。このようなポリペプチド−デンドリマーの組成物は、そのデンドリマーに第二のポリペプチドを制御可能に結合させるのに有効である。上記第一と第二のポリペプチドは別個の明確に規定された生物学的活性を有し、例えば第一と第二の結合特異性を有する二つの抗体または一つの抗体および酵素標識である。このような組成物は、特異的結合アッセイたとえばイムノアッセイの指示薬として有用である。２種のポリペプチドを順にデンドリマーに結合させて本発明の組成物を製造する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ポリペプチド：デンドリマー複合体発明の技術分野本発明は一般に、デンドリマー(dendrimer)に結合させた第一ポリペプチド次いで任意に同デンドリマーに結合させた第二ポリペプチドを含んでなる組成物に関する。また本発明は、デンドリマーに第一ポリペプチドを結合させ、次いで任意に第二ポリペプチドを結合させる方法に関する。発明の背景デンドリマーは、明確に定義された組成を有し、かつ明確に定義された分子量を有する球形または他の三次元形態のポリマーである。デンドリマーは、内側部分を外側部分を適当に選択することによって水溶性巨大分子として合成することができる（米国特許第4,507,466 号および同第4,568,737 号参照。なおこれらの特許は本明細書に援用するものである）。Starburst（登録商標）デンドリマーはDow Chemical Company社が製造している。デンドリマーは、診断または治療に用いるため、各種の医薬物質ならびに選択された身体の部位に接合体を導く働きをする向標的分子に接合されている（例えば国際特許願公開第WO 8601178号参照。なおこの特許願は本明細書に援用するものである）。デンドリマーは、腫瘍の治療と診断に用いる放射能標識化抗体の比活性を増大する手段として、抗体分子に合成ポルフィリン類（ヘム類、クロロフィル）を共有結合させるのに使用されている（Roberts，J．C.ら，"Using Starb urst Dendrimers as Linker Molecules to Radiolabel Antibodies"，Bioconjug ．Chemistry，1巻、305〜308頁、1990年）。デンドリマーに、２種のポリペプチドを直接共有結合させて例えば診断アッセイ用の接合試薬を製造することが知られている。ポリペプチド−ポリペプチド接合体は有用であるが、いくつかの欠点がある。その接合反応は比較的制御されていない場合が多く、各ポリペプチドの所望の数を超える数の部位での２個のポリペプチドの分子間接合、同一ポリペプチドの２個の分子の分子間接合、および同一ポリペプチド分子内の分子内接合さえも起こしている。各々の種の比率は各生産ロットによって変化して、多様な力価、純度、特異性および比活性になる。固相診断アッセイでは、これらの種のうちいくつかは、非特異的結合性が高くなりかつアッセイ感度が低下する。このような接合体を製造する場合、非常に多数でかつ高価格の品質管理と標準化の手順が必要になる。さらに、このような接合ポリペプチド試薬の有効期間は、これら接合体が貯蔵溶液中に不均質に分布する傾向があるため変動がある。すなわち、これら接合体は、実質的に可溶性であるとはいえ、完全に可溶性のままではなくて時間の経過とともに溶液からいくらか次降することがある。貯蔵溶液を周期的に混合しても、重力作用、温度勾配およびその外の物理作用によって不均質になることがある。デンドリマー：抗体複合体は、ポリペプチド−ポリペプチド接合体の上記問題点のいくつかを克服するアッセイ試薬を製造するのに使用されている。かような複合体のデンドリマーの部分は、アッセイ試薬を固相に固定化し易くするのに使用されている。例えば、抗体は、スルホスクシンイミジルー（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ-SIAB）で誘導体化されたデンドリマーおよび抗体のスルフヒドリル基の間に炭素−硫黄（C-S）結合を生成させることによってデンドリマーに結合されている（米国特許願第08/021,928号参照。なおこの特許願いは本明細書に援用するものである）。公知のデンドリマー結合抗体類は上記イムノアッセイで用いられるガラス繊維の固相（タブ）に対して非常に強い親和性を有している（米国特許願第08/021,9 28号および同第08/222,172号。これら特許願はいずれも本明細書に援用するものである）。スポッティング緩衝液(pH8.0)中では、上記タブは正味の負電荷をもっているが、一方デンドリマー−抗体複合体は、非常に多数の遊離アミノ基が存在するため正味の正電荷を有している。デンドリマー−抗体およびガラス繊維固相の間の電荷相互作用は強力なので該固相の適用場所にデンドリマー総合抗体を配置することができる。発明の要約本明細書にはデンドリマー／ポリペプチド複合体を開示する。これらの複合体は、複数の末端を有するデンドリマー、第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドで構成されている。第一ポリペプチドと第二ポリペプチドは、デンドリマーにその末端を通じて順次結合される。該複合体の第一と第二のポリペプチドはそれぞれ第一と第二の規定された生物学的活性を示す。あるいは、デンドリマー／ポリペプチド複合体は、第一の規定された生物学的活性を示す第一ポリペプチドに結合されたデンドリマー、および第二の規定された生物学的活性を有する第二ポリペプチドが結合されているデンドリマーの少なくとも一つの末端で構成されている。デンドリマー／ポリペプチド複合体の末端の一部分は結合されていない。末結合の末端は所望により封鎖してもよい。本発明に有用なデンドリマーとしては、制限はないが、第１、２、３、４および第５世代のエチレンジアミン・コアのデンドリマーがある。あるいは本発明のデンドリマーは、第１、２、３、４又は第５の半世代のエチレンジアミン・コア・デンドリマーでもよい。規定された生物学的活性のうちの一つとして例えば酵素触媒作用が含まれていてもよい。かような酵素触媒作用としては、基質と接触した後、蛍光生成物、比色法用生成物、化学発光生成物、リン光生成物、放射能測定用生成物またはハイブリッドさせた生成物を生成する作用が含まれる。このような酵素触媒作用を示すポリペプチドとしては、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼおよびアセチルコリンエステラーゼでもよい。他の適切な特定生物法性としては、分析対象または、分析対象の受容体に対する特異的結合活性がある。このような特異的結合性を有するポリペプチドとしては、例えばクレアチンキナーゼアイソザイムMB、トロポニンＩ、ミオグロビン、中状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモンまたはフェリチンに対する特異性を有する抗体またはフラグメントがある。ポリペプチド／デンドリマー複合体の製造法を本明細書に開示する。この方法は、複数の活性化末端を有するデンドリマーを準備し、少なくとも一つの反応性部分を有する第一ポリペプチドを準備し、次いで第一ポリペプチドをその反応性部分を通じて、上記活性化末端のなかの一つに結合させるステップからなる方法である。この方法によれば、第一ポリペプチドがもっている第一の規定された生物学的活性を示すポリペプチド／デンドリマー複合体が製造される。このような複合体は、第二特性生物活性を有する第二ポリペプチドを、デンドリマーに結合させるのに利用する。上記の方法に用いるデンドリマーは、第１、２、３、４または第５世代のエチレンジアミンコアデンドリマーでもよい。ポリペプチドの反応性部分はスルフヒドリル基を含有していてもよくそしてその活性化末端はヨードアセチル基を含有していてもよい。またかような方法に用いるデンドリマーは、第１、２、３、４または第５の半世代のエチレンジアミンコアデンドリマーでもよい。かようなデンドリマーの場合、ポリペプチドの反応性部分はアミノ基を含有していてもよくそしてその活性化末端はN-ヒドロキシスクシンイミジル基を含有していてもよい。本発明の方法として、さらに、少なくとも一つの反応性部分を有する第二ペプチドを準備し、次いで第二ポリペプチドをその反応性部分を通じて上記活性化末端のなかの一つに結合させて２−ポリペプチド／デンドリマー複合体を製造するステップを含んでなる方法がある。その第二ポリペプチドは第二の規定された生物学的活性を有しているので、得られる複合体は第一と第二の規定された生物学的活性の両方を示す。この方法の場合、第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの反応性部分はスルフヒドリル基を含んでいてもよく、かつ複数の活性化末端はヨードアセチル基、ブロモアセチル基、クロロアセチル基、エポキシ基またはマレイミド基を含有していてもよい。あるいは、第一ポリペプチド／デンドリマー複合体の活性化末端のうち少なくとも一つが未結合の場合、本発明の方法は、さらに、第二活性化基を有する複合体の未結合末端の一つ以上を活性化し、反応性部位と第二の規定された生物学的活性を有する第二ポリペプチドを準備し次いで第二ポリペチドの反応性部分を第二活性化末端に結合させて２−ポリペプチド／デンドリマー複合体を製造するステップを含んでなる方法である。このような複合体は、第一と第二のポリペプチドそれぞれの第一と第二の規定された生物学的活性の両方を示す。このような方法の場合、第一ポリペプチドの反応性部分はアミノ基を含有していてもよく、第二ポリペプチドの反応性部分はスルフヒドリル基を含有していてもよく、複数の活性化末端は、N-ヒドロキシスクシンイミジル基を含有していてもよく、かつ第二活性化末端はブロモアセチル基、ヨードアセチル基、クロロアセチル基、エポキシ基またはアレイミジン基を含有していてもよい。図面の簡単な説明図１は、Ultrogel AcA-34 カラムから溶出されたALP-E1-Fab’ポリペプチド：デンドリマー複合体のカラム画分の280 ナノメーター波長光の吸光度（A₂₈₀）を示す。図２は、Ultrogel AcA-34 カラムから溶出されたALP-E2-Fab’ポリペプチド：デンドリマー複合体のカラム画分のA₂₈₀を示す。図３は、Ultrogel AcA-34 カラムから溶出されたALP-E3-Fab’ポリペプチド：デンドリマー複合体のカラム画分のA₂₈₀を示す。図４は、Ultrogel AcA-34 カラムから溶出されたALP-E4-Feb’ポリペプチド：デンドリマー複合体のカラム画分のA₂₈₀を示す。図５は、Ultrogel AcA-34 カラムから溶出されたALP-E5-Fab’ポリペプチド：デンドリマー複合体のカラム画分のA₂₈₀を示す。発明の実施の形態本件出願人らは以下のような驚くべき発見をしたのである。すなわち別個の異なる生物活性を有する２種のポリペプチドを、組成物中の各ポリペプチドのポリペプチド／デンドリマー比が容易に制御され、かつ各ポリペプチドの固有の生物活性が実質的に保持されるように、同じデンドリマーに順次結合させることができることを発見したのである。本発明の組成物は、デンドリマーの少なくとも一つの末端分枝鎖に結合された第一ポリペプチドを含有し、その第一ポリペプチドは第一の規定された生物学的活性を有している。特定の組成物はさらに、第二の規定された生物学的活性を有しかつ同じデンドリマーに結合された第二ポリペプチドを含有していてもよい。本発明の組成物を製造するのに有用なデンドリマーは、米国特許第4,507,466 号に開示されているような”星形”立体配置を有するほぼ球形の分枝ポリマーである。星形立体配置のデンドリマーは、個々の分枝が核すなわちコア領域から放射状に広がるように構成された分枝をもっている。その多価のコアは、一つ以上の階層すなわち世代を通じて延出する少なくとも二つの規則正しい樹枝状の（樹木のような）分枝に共有結合している。その最外の階層すなわち世代は、各種の他の分子と化学的に反応性の官能基で終わっている。したがって星形デンドリマーは、以下の三つの特徴的な構造上の特徴を有する一体の分子集合体である。すなわち(a)開始コア、(b)開始コアに放射状に結合した繰返し単位で構成された内部層（世代）および(c)各分枝の最も外側の末端に結合した活性化官能基よりなる外表面を有している。デンドリマーの大きさ、形態および反応性は、開始コア、デンドリマーを製造する際に採用する世代の数、および各世代に用いられる繰返し単位を選択することによって調節するこができる。異なる大きさのデンドリマーは、利用される世代の数を増やせば容易に得られる。本発明に用いるのに適した立体配置のほぼ球形のデンドリマーは米国特許第4,507,466 号と同第4,568, 737 号に開示されている。なおこれらの特許は本明細書に援用するものである。あるいは、例えば米国特許第4,694,064 号（この特許は本明細書に援用する）に開示されているような非球形立体配置のデンドリマーを適応させて本発明に用いることができる。本発明に用いるデンドリマーは、第１〜第５世代のデンドリマーが好ましい。デンドリマーの末端のすべてまたは一部を化学的に修飾すると、特定の用途に適当な表面官能性が得られる。本発明の組成物に用いられるデンドリマーは、一つ以上の末端に結合された官能基化基をもっている。例えば、E5デンドリマーは第５世代であり、エチレンジアミン・コア粒子は128 個のアミンに終わる末端（表面）基を有し分子量が28,826である。同様にE2デンドリマーは16個の末端基を有し、その各々が１個のアミノ基をもっている。これらのアミン末端基は中性pHの溶液中のかようなデンドリマーの表面に正味の正電荷を与える。他の例として、G（4 1/2）半世代デンドリマーは、その５世代中間体のカルボキシメチル末端が最終ステップでアミノ基に変換される代わりに加水分解によってカルボキシ基に変換されて、それにより128 個の末端カルボキシル基を有する分子をつくり出している、５世代のエチレンジアミン・コア粒子である。同様にG(1 1/2)-COOH半世代デンドリマーは、16個のカルボキシル末端基を有している。これらカルボキシ末端基は、中性pHの溶液中のかようなデンドリマーの表面に正味の負電荷を与える。本発明に適したポリペプチドとしては、制限はないが、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、酵素、ペプチドホルモンおよび特異的認識を行う特定の反復配列をそれぞれ有するペプチドがある。デンドリマーに結合されるポリペプチドは、特定の実施態様の場合、オリゴペプチドでもよい。他の実施態様では、ポリペプチドは、結合後、残っている未結合のサブユニットと相互に作用して無傷の機能タンパク質を再構成するのに適している。マルチサブユニットタンパク質の−サブユニットを含有していてもよい。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、デンドリマーへの結合には関与していないがポリペプチドの生物活性にとって重要な関連補助因子または全属イオンリガンドを含有していてもよい。本発明の組成物の場合、１デンドリマー分子に結合された第一ポリペプチド分子の平均数（ポリペプチド：デンドリマー比）は約0.1 〜約10でよいが一般に約 0.2 〜約2.0 である。世代が高いデンドリマーの方が世代の低いデンドリマーよりポリペプチド：デンドリマー比が高いので、デンドリマーの世代を適当に選択すると所望のポリペプチド：デンドリマー比を保持するのに役立つことは明らかである。ポリペプチドの結合に関与するデンドリマー末端の平均数は、反応条件、例えば反応時間、pH等を変えることによって調節することができる。デンドリマー− ポリペプチド組成物は一般に、すべての末端基がポリペプチドの結合に関与しているわけではない。ポリペプチドの結合に関与していない末端は、所望により、例えば、残っている未結合の末端を、ヒドロキシル、アルキル、アリール、アミド、ニトリル、エーテル、チオエーテルの基または保護されたスルフヒドリル基で保護することによって他の形態に変換してもよい。例えば、組成物の正味の電荷が、目的とする最終用途に対して組成物がもっている有用な特性に悪影響を与える場合、未結合の末端基を無電荷の末端基で置換すると有利である。未結合の末端基の保護は、別個の保護ステップを要するかまたは結合ステップ中に行うことができる。第一ポリペプチドは第一生物活性を有している。ポリペプチドがもっている一般的な生物活性としては、制限はなく、分析対象または分析対象の受容体に対する特異的結合性、細胞壁または細胞膜に対する特異的結合性、酵素触媒反応、基質の直接のまたは間接的な検出、電荷の移動性能、特定の誘電率および特定の組合わせの条件下で考えられる特定の三次構造がある。本発明の組成物はさらに、デンドリマー：第一ポリペプチド複合体に結合させた第二ポリペプチドを含有していてもよい。１種以上の第二ポリペプチド分子が組成物中に存在している場合、その第二ポリペプチドの生物活性は第一ポリペプチドとは全く異なっている。すなわちこれら２種のポリペプチドは同じ生物活性をもっていない。しかし、特定の実施態様では、両者のポリペプチドは同じ一般機能を有しているが異なる特異性を有していることが認められる。例えば両ポリペプチドは抗体でもよく、各抗体は別の全く異なるエピトーブを認識する。その２種のエピトーブは、同じ分子上または異なる分子上にあってもよい。他の実施態様では、両ポリペプチドは酵素でもよく、各酵素は別個の全く異なる触媒活性をもっている。このような実施態様は本発明の範囲内にある。組生物がさらに第二ポリペプチドを含有している場合、各ポリペプチドのポリペプチド：デンドリマー比は所望により異なっていてもよい。例えば第一ポリペプチドは組生物中約１：１比率で存在していてもよくそして第二ポリペプチドは約３：１の比率で存在していてもよい。この場合、第一ポリペプチド：第二ポリペプチド比は約0.33である。このような比率は、制御可能に変えて、各ポリペプチドのデンドリマーの１mole当りの所望の特異的生物活性値を得ることができる。所望のポリペプチドは、デンドリマー−ポリペプチド組成物の最終用途に基づいて選択される。好ましい実施態様において、ポリペプチドの一方は、抗体、抗体フラグメントまたは特定の結合タンパク質であり、他方のポリペプチドは、基質と接触した後、蛍光生成物、比色分析用生成物、化学発光生成物、リン光生成物または放射能分析用生成物を生成する酵素である。ポリペプチドをデンドリマーに制御可能に結合させる方法は、少なくとも一つの活性化末端基を含有する選択された世代のデンドリマーと、少なくとも一つの反応性部分を含有するポリペプチドとともにインキュベートすることからなる方法である。本発明に有用なデンドリマーは、末端基をポリペプチドの反応性部分に結合させるのに適した少なくとも一つの活性化末端基を有している。デンドリマーの末端は、ヘテロニ官能試薬を既存の末端基と反応させることによって活性化される。その反応は、緩和な条件下で行われるので、デンドリマーの特有の構造上の特徴に影響しない。ポリペプチドをデンドリマーに制御可能に結合させるため、活性化されたデンドリマー末端基をポリペプチドの反応性部分と反応させる。活性化された末端は、ポリペプチドをデンドリマーに結合させる場合、反応速度を加速するのに有用である。デンドリマーの末端基のほとんどすべてを活性化させることが好ましい。 ”ほとんどすべて”という用語は、デンドリマーの末端基の少なくとも90％好ましくは約95％、さらに好ましくは少なくとも約99％を意味する。しかし、特定の実施態様では、デンドリマーはその末端基の一部分が活性化され、残りの末端基は活性化されない。ポリペプチドは一般に、炭素−窒素（C-N）結合、炭素−酵素（C-O）結合または炭素−硫黄（C-S）結合を形成してデンドリマーに結合される。デンドリマーの末端のアミノ基は、ポリペプチドの反応性カルボキシル基に結合してC-N 結合を形成するのに適していることが知られている。デンドリマーの末端基を官能基化するのに適切な反応性基はヨードアセトアミド部分のような求電子性基である。ヨードアセトアミド基は、アミン含有の種を、ヨードアセトアミド含有分子の活性化エステル（例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル類）で処理することによって、緩和な反応条件下デンドリマーのアミノ末端に導入することができる。この目的のためいくつかの商業製品が入手可能であるが、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセドアミド（NIA、例えば米国イリノイ州ロスコー所在のBio Affinity Systems，Inc.社から入手できる）がある。しかし、疎水性の芳香族スペーサー基（例えばフェニル基）を有するN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルは、多数の疎水性基が本発明のポリペプチド：デンドリマー複合体に導入されると溶解性が低下するので好ましくない。カルポキシン化されたデンドリマーの末端を活性化するのに用いる好ましい基は、N，N，N'，N'- テトラメチル（スクシンイミド）ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU）である。この試薬は、カルボキシル基を活性化されたN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルに変換し、この反応で生成したNHS エステル化デンドリマーを精製しかつ定量することが可能になるので好ましい。この活性化されたデンドリマーは、ポリペプチドのリシル残基のε- アミノ基のような求核反応性部分を通じて結合させることによってポリペプチドと直接反応させることができる。活性化デンドリマー中間体を定量することによって、最終生成物の組成と純度を制御することができる。あるいは、デンドリマーのカルボキシル末端のNHS エステルをさらに６−ブロモアセトアミドヘキシルアミン[BrCH₂ CONH(CH₂)，NH₂;₆ BAHA]と反応させて求電子性のブロモアセトアミド基を組み込んでもよく、これによって、適切なポリペプチドのスルフヒドリル基に結合できる活性化デンドリマー末端が形成される。活性化末端としてまたは活性化末端に変換するのに適した他のデンドリマー末端官能基としては、マレイミジル、クロロアセチル、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、アリル、ビニル、ハロ、オキシラニル、アジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、イソシアナトおよびイソチオシアナトがある。活性化デンドリマー末端に結合させるのに適しているポリペプチドの反応性部分としては、制限はないが、スルフヒドリル、アミノ、エポキシ、ヨードアセチル、アルデヒドおよびフェニルヨードアセトアミドの基がある。反応性部分は、元のポリペチド中に存在している固有の官能基、例えばリシル残基のε- アミノ基またはシステイニル残基のスルフヒドリル基を含有していてもよい。反応性部分として適している固有の基の例証的な実施態様は、Fab'抗体フラグメントのヒンジ領域内のシステイン残基のスルフヒドリル基、および子ウシの腸アルカリホスファターゼ内のリシン残基のε- アミノ基である。また反応性部分は別個の反応でポリペプチドに導入してもよい。例えば、スルフヒドリル基は、ポリペプチドを、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ-LC-SPDP）と反応させてジスルフィド結合を導入し次にジスルフィド結合をジチオエリスリトール（DT E）で還元することによって導入することができる。１分子ポリペプチド当たり導入される反応性部分の平均数は、反応物質の比率、インキュベーション時間、 pH、温度などを適当に選択することによって制御することができる。ポリペプチドに導入された反応性部分の実数は当該技術分野で公知の滴定法で容易に測定することができる。比較的緩和な反応条件下すなわち生理的に容認できる範囲の温度（４〜40℃）、pH(6.0〜8.5)、イオン強度（0.1 〜0.2M）などの条件下で活性化末端を反応性部分に結合させることができるように、相容性の活性化デンドリマー末端基とポリペプチド反応性部分を選択することが好ましい。反応性部分として、一つ以上のスルフヒドリル基を有するポリペプチドに対して適切な活性化デンドリマー末端としては、エポキシ、ヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミドの基のような求電子性基がある。NHS-活性化カルボキシルエステルのデンドリマー末端に結合させるのに用いる適当なポリペプチドの反応性部分は、そのポリペプチド連鎖中のリシン残基のε- アミノ基のようなアミノ基である。特定の求電子性基、例えばスルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホSIAS）はデンドリマーの活性化末端基として好ましくない。なんとなれば、末端のほとんどすべてを緩和な条件下、スルホSIABで官能基化することは困難だからである。ポリペプチドをデンドリマーに連続的に結合させるのに特定の対の基は好ましくない。例えば、デンドリマーの-COOH 末端基とポリペプチドの-NH2基の水性結合を、中性もしくは酸性の媒体中、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDC)の存在下で実施することがある。しかしこのEDC 試薬は、この方法において活性化カルボキシル末端と求核反応性部分が反応する際に通常存在しているので、ポリペプチドのNH2 基と、ポリペプチドおよびデンドリマーの両者のCOOH基との間に分子間および分子内の結合を生成することがある。またその反応生成物は望ましくない架橋タンパク質の種を含有していることがある。架橋したタンパク質の種は、元のタンパク質の生物活性に比べて、タンパク質１モル当りの生物活性が小さいかまたは全く存在しないことが多い。上記のように、ポリペプチド：デンドリマー複合体中のポリペプチドは特定の生物活性を示す。ポリペプチドをデンドリマーに結合させるステップは、このような特定の生物活性を、得られる生成物中に保持する条件下で実施される。しかし、ポリペプチドの他の生物活性の増大、減少または消失が起こることがあることが分かっている。このような増大、減少または消失は、特定の生物活性が保持されている限り、本発明の範囲内にある。実際に、他の生物活性の増大、減少または消失が最終のポリペプチド：デンドリマー組生物にとって望ましいことがある。結合反応によって得られる第一ポリペプチド対デンドリマーの比率は、これら二つの反応物質の量、ポリペプチドの反応性部分の数、デンドリマーの活性化末端の数および反応条件（時間、温度など）を調節することによって容易に制御可能である。反応生成物である第一ポリペプチド：デンドリマー複合体は一般に、上記反応が完了したときゲル濾過法上記反応生成物は第二ポリペプチドを結合させるのに有効である。第二ポリペプチドの有効な結合は、上記二つの結合の化学反応によって決まる方法によって容易に達成される。第一と第二のポリペプチドを、類似の化学反応（第一と第二のポリペプチド両者の同じかまたは類似の反応性部分およびデンドリマーの同じかまたは類似の活性化末端の化学反応）でデンドリマーに結合させることになっているこれらの場合、第一ポリペプチドを結合させるとき、一般に、活性化状態のデンドリマー活性化末端の基をいくつか残し、すなわち活性化末端基がすべて第一ポリペプチドに対する結合に関与しているわけではなく、第二ポリペプチドに対する結合に利用できる。第一ポリペプチドに対する結合に関与しているこれらデンドリマーの末端は勿論、もはや活性化されない。この場合、第一結合反応による反応生成物は、次に、第二ポリペプチドを、第一ポリペプチド：デンドリマー複合体に、所望の比率で、制御可能に結合させるのに有効な条件下で、第二ポリペプチドとともにインキュベートされる。一方、第一ポリペプチドの結合に関与する化学反応が、第二ポリペプチドの結合に関与する化学反応と異なっている場合、第一結合反応の反応生成物は、次に、第一ポリペプチドに対する結合に関与していない少なくとも一つのデンドリマー末端が、第二ポリペプチドをデンドリマー：第一ポリペプチド複合体に結合させるのに適した第二活性化基で活性化される。第二ポリペプチドを結合させる反応条件は所望の平均数の第二ポリペプチド分子がデンドリマー分子に結合されるように、第一結合反応について先に述べたのと類似の方法で制御される。デンドリマー一分子当りのポリペプチド分子の平均数は、ある程度、選択されるデンドリマーの世代によって決まる。というのは、世代が高いデンドリマーはより多数のポリペプチドの結合を支持するからである。一般的なポリペプチド／デンドリマー比は、デンドリマー１分子当り約0.1 〜約２分子である。特定のポリペプチド：デンドリマー複合体の最終用途は、２−ポリペプチド：デンドリマー複合体の所望の比率に影響する。例えば、複合体が標識ポリペプチドと特定の結合ポリペプチドを含有し、特異的結合アッセイで、指示薬または特異的競合試薬として使用することになっている場合、複合体は、デンドリマー１分子当りの特定結合ポリペプチドの数に比べて、デンドリマー１分子当りのラベルポリペプチドの数が多いことが望ましい。ポリペプチド：デンドリマー複合体は、ポリペプチドの結合に関与していない残留デンドリマー末端を有していることがあり、このような場合が多い。このような末端は、最終製品において望ましくない特性と示すことがあり、例えば生理的pHF で帯電する場合がある。所望により、このような末結合の末端基は、一層望ましい末端基例えば帯電していない基に変換するかまたはこのような基で置換することができ、このような変換または置換は”封鎖”と呼ばれている。この封鎖は多くの最終用途にとって必要ではなく、未結合の末端基が存在することが、いくつかの最終用途にとって望ましい場合もある。本発明のポリペプチド：デンドリマー複合体は、いくつもの明確な利点を提供する。第一に、デンドリマーは、適確な高分子化学反応によって製造され、かつ的確な分子の大きさ、分子量および表面組成を生成する適確な世代数を有するよう設計することができる。均一でかつ明確に特徴づけられた化学反応であるから、上記パラメータは、異なる製造ロットにわたって均一である。デンドリマーの特性が均一なことが、直接に結合されたポリペプチド−ポリペプチド接合体と比べて、ポリペプチド：デンドリマーの組成が均一なことに役立っている。第二に、適当な内部組成と表面組成を有するデンドリマーが、水溶性であるように製造することができ、その結果、デンドリマー：ポリペプチド複合体は、溶液状態を保持しかつ時間が経過しても溶液の均一性を維持することができる。第三に、２種の異なるポリペプチドをデンドリマーに順に結合させると、これらポリペプチドをデンドリマーに同時に結合させる場合の変動と制限が回避されることが発見された。本発明の組成物中に組み込まれたポリペプチドは、驚くべきことには、組み込まれていない元のポリペプチドに存在する特定の生物活性を保持している。第二ポリペプチドを有する組成物は、２種の結合化学反応が類似しているかまたは類似していないにかかわらず、第一と第二のポリペプチドの両者の特定の生物活性を示す。本発明は理論にとらわれないが、立体障害およびポリペプチド残基の活性部位に対する望ましくない結合のような要図が、予想に反して起こるとは考えられない。これらポリペプチドをデンドリマーに順次結合させると、両方の結合反応に同じ化学反応を利用する場合でさえ、これらポリペプチドの相対反応性には無関係に、生成する複合体を制御することができる。一方、同時の結合を成功させるには、第一と第二のポリペプチドが、デンドリマー／活性化デンドリマーに対し同じかまたは類似の反応性を有していることが必要である。つまり、第一と第二のポリペプチドの反応性が異なっていると、反応性が高い方のポリペプチドが優先的にデンドリマーと反応する。例えば、アルカリホスファターゼ（ALP）と抗体をデンドリマーに同時に結合させようとしたところすべて、ALPだけがデンドリマーに結合された生成物が得られることが見出された。このように、２種のポリペプチドの種を同時に結合させるには、二つの反応性が非常に類似していることが必要であるが、これを達成することは極めて困難である。あるいは２種のポリペプチドの種のうちの一方の反応性を、修飾してから同時に結合させることができるが、生物活性を失うことがある。デンドリマー：２ポリペプチド組性物は、工業用バイオリアクター、生物学的標準、またはアフィニティークロマトグラフィーの媒体として有用である。多数の生物学的システムおよび酵素リアクターでは、異なる酵素によって触媒される反応を順に実施する。これらの反応において、一方の酵素で触媒される反応の生成物は、他方の酵素に対する基質である。このように組み合わされた反応は、商業的化学生産および分析目的を含めていくつものプロセスに広い用途が見出された。いくつかの例は次のとおりである。すなわち、インベルターゼ−グルコースイソメラーでの組合わせによるショ糖のフルクトースへの変換；D-アミノ酸オキシダーゼ−カタラーゼの組合わせによるD-アミノ酸のα−ケト酸への変換；トリプトファトーゼ−乳酸デヒドロゲナーゼの組合せによるトリプトファンの定量；およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼの組合せによるＬ−アスパルテートの微量アッセイである。デンドリマー：２ポリペプチド複合体は、均一溶液中、または反応混合物から中空繊維リアクターで分離されるかもしくは固体表面に固定化されるこれらの種類の用途に特に適している。デンドリマー：２ポリペプチド組成物は、２種以上の化学種をそれらの特性の差で精製する必要があるクロマトグラフィー法に有用である。したがって、二つの種のお互いからまたは複合体混合物からの分離は、各々pH解離曲線が異なる第一と第二の抗体をデンドリマーに結合させることによって実施することができる。この方法では、第一の種は、第一pH例えば6.0 においてその抗原一抗体複合体から解離させることができ、一方第二の種は第二pHにおいて解離させることができる。あるいはこの方法は、デンドリマー：２ポリペプチド複合体を二つの種の混合物に添加し、次に第一抗原−抗体複合体を限外濾過によって分離することによって実施することができる。あるいは、デンドリマー：２ポリペプチド複合体は、適当なサイズの膜を用いて混合溶液から分離することができる。ポリペプチド：デンドリマー複合体の好ましい用途は、特異的結合アッセイすなわち分析対象を識別して定量するのに特異的受容体を利用するアッセイにおける指示薬としての用途である。このアッセイでは、分析対象は試料中に見られる他の成分から区別されなければならず、このことは、その分析対象に対する特異的受容体および標識を含有する指示薬を、分析対象と反応させることによって行われる。存在する指示薬の量を、存在する標識の量を検出し次にこの量を分析対象の濃度に関連させることによって測定する。本発明に関連する”指示薬”という用語には、特異的な受容体ポリペプチドと標識ポリペプチドに結合させたデンドリマーが含まれている。指示薬のポリペプチド受容体、例えば抗体、抗体フラグメントまたは他の特異的結合タンパク質（内因子または葉酸結合タンパク質）は、分析対象またはその分析対象の類似体に対して可逆的な特異的結合親和性を有していることが特徴である。類似体は、本明細書で用いる場合、一般に、直接または間接に検出するのに適したマーカーを保有する分析対象誘導体である。この類似体は、被検対とほぼ同じ特異性と親和性で受容体に結合することができる。指示薬の標識は、存在する指示薬の量を直接または間接的に、好ましくは定量方式で検出するのに適したポリペプチドで構成されている。標識は、例えば、基質と接触した後、蛍光生成物、比色法用生成物、化学発光生成物リン光生成物、放射能測定法用またはハイブリダイズされた生成物を産生する酵素でもよい。酵素標識の例示例としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ウレアーゼ、カタラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グリコンダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがある。デンドリマー：２ポリペプチド複合体は、イムノアッセイ、例えばガラス繊維フィルターを固相として用いるイムノアッセイにおける指示薬として有用である。（Giegelら，Clin．Chem.，28巻、1894〜1898頁、1982年および米国特許第4,5 17,288 号参照。なおこれらは本明細書に援用するものである）。ガラス繊維のような固相に対する指示薬の非特異的結合を最小にすることが望ましい。本発明のデンドリマー：２ポリペプチドの指示薬は、非特異的結合のレベルが非常に低いので有利である。本発明のデンドリマー−ポリペプチド複合体は、各種の特異的結合アッセイの方式に利用できる。例えば、各種の直接結合アッセイがこれらの試薬とともに利用することができる。このようなアッセイでは、抗体または結合タンパク質のような受容体は固相に固定化される。その固定化された受容体複合体を、対象の分析対象を含有する試料と接触させる。分析対象を固定化受容体で結合させた後、その固相を洗浄し、次に、一方のポリペプチドが分析対象に対する親和性を有しかつ他方のポリペプチドが標識として機能するデンドリマー：２ポリペプチド指示薬と接触させる。該固体支持体上に存在する該指示薬の量は、例えば、オランダ、アムステルダム所在のElsevier Science Publishers 社が1985年に発行した、Tijssen，P．著"Laboratory Techniques in Biochemistry and Molec ular Biology，Practice and Theory of Enzyme Imminoassay"の10章173 〜219 頁と14章329 〜384 頁に開示されているようにして、未知分析対象の量と関連づけることができる。また、デンドリマー：２ポリペプチド複合体は、競合アッセイの方式で特異的競合試薬として使用することができる。このような方式では、選択された分析対象に対する特異性を有する固定化受容体または他の分子を含有する固相を、このような分析対象を含有していると思われる試料および特異的競合試薬と接触させる。上記特異的競合試薬は、分析対象のポリペプチド類似体および標識として機能するポリペプチドに結合されたデンドリマーで構成されている。この実施態様では、類似体が、試料の分析対象と競合して、固相に固定化された受容体に結合する。別の実施態様では、分析対象を、固相に結合させ、次いで試料、ならびに分析対象の特異的受容体として機能するポリペプチドおよび標識として機能するポリペプチドに結合されたデンドリマーからなる特異的競合試薬と接触させる。この方式では、試料の分析対象が固相の分析対象と競合して可溶性受容体と結合する。両方の実施態様において、洗浄後に、固相に結合していたポリペプチド標識の量は、試料中の分析対象のレベルを表示する。すなわち、固相に結合した標識の量は試料中の分析対象の量に逆比例する。 Giegelら，Clin．Chem.，28巻、1894〜1898頁、1982年および米国特許第4,517 ,288号に開示されている放射状分配イムノアッセイ（Radial partition immunoa ssay）は、すべてのステップを固相に対し直接行うアッセイである。なおこれらの引用文献は本明細書に援用するものである。抗体または他の受容体試薬はガラス繊維製濾紙の小面積に固定化する。次に、検出される分析対象の既知量を含有する各種の較正標準またはかような分析対象を含有している可能性がある各種の未知試料を、この固定化受容体とともにインキュベートする。指示薬または他の標識化試薬を適当に添加した後、洗浄液を加えることによって、過剰の試薬を該濾紙の中心部から除く。エンザイムイムノアッセイの場合、上記洗浄液が酵素の基質を含有し、洗浄ステップと同時に酵素反応を開始してもよい。該酵素の基質に対する作用によって蛍光のシグナルを生成することが好ましい。このようにして、中央領域の一部の酵素活性が前面蛍光分析法によって定量可能になる。上記アッセイ方式すなわち直接結合アッセイまたは競合アッセイによって、蛍光率は試料中の分析対象の濃度に比例または反比例する。デンドリマー：２ポリペプチド複合体は、放射状分配イムノアッセイの指示薬として使用できる。あるいは、本明細書に開示されているデンドリマー：２ポリペプチド組成物は、米国特許願第08/227,364号に開示されているような“プレミックス（pre-mlx ）”特異的結合アッセイの指示薬として使用できる。なおこの特許願は本明細書に援用するものである。デンドリマー：２ポリペプチドの指示薬または特異的競合試薬および各種の他の結合アッセイの試薬を固相に適用し、その固相を洗浄し、次いでその固相に結合した指示薬または競合試薬の量を読み取るために各種の装置を利用することができる。好ましい実施態様 Stratus II Immunoassay SyStem で構成され、このシステムはDade Diagnostics Inc．社から入手できる。この装置はバッチ処理式の卓上型装置であり、放射状分配免疫アッセイの方式でタブを操作するよう構成されている（Giegel 3，Clin ．Chem.，28巻、1894〜1898頁、1982年参照）。上記装置は、試料、接合体(conj ugate)および基質の洗浄液用の流体ディスペンサーを備えている。マイクロプロセッサで制御されるパルスモータが試薬の必要量ずつを吸引し分配する。これらディスペンサーのすべてのタイミングと作動の態様は、分析装置内のプログラムルーチンによって予め決定される。またこの装置は、タブ移送システム、温度監視器付き加熱板、試料および試薬の流体ポンプ、読取り機構、データ処理装置、およびタブを廃棄する手段を備えている。品質管理を行うため、装置のマイクロプロセッサ制御プログラムが、臨界作動条件、例えば、基準電圧、温度および供給の設定、ならびに限界を超えた値に対するフラグを周期的に確認する。本発明のポリペプチド−デンドリマー複合体は、各種の生物物質に対する分析プロトコルに使用することができる。例えば、デンドリマー：ポリペプチド複合体は、治療医薬、天然もしくは合成のステロイド、ホルモン、酵素または抗体の存在に関する血液または尿のイムノアッセイを行うのに有用である。上記プロトコルで定量することができる他の分析対象としては、制限はなく、ジゴキシン、ジランチン、フェノバルビタール、チオフィリン、ゲンタマイシン、キニジンなどがある。上記方法で製造したデンドリマー−ポリペプチド複合体は、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、およびエストリオールのようなステロイド類またはフェリチンのような血清タンパク質を検出するのに用いる指示薬または特異的競合試薬としても使用できる。またホルモンの濃度と、本発明のデンドリマー−ポリペプチドの指示薬または特異的競合試薬を使用して測定することができる。これらのホルモンとしては、制限はなく、テトラヨードおよびトリヨード−チロニンおよび甲状腺刺激ホルモン(TSH)のような甲状腺ホルモン類；インスリン、コルチコトロピン、ガストリン、アンギオテンシンおよびプロアンギオテンシンのようなペプチドホルモン類；ならびにサイロトロピン、レベトトロピン（levetotropin）、ソマトトロピンおよびヒト繊毛性ゴナドトロピンホルモン(HCG)のようなポリペプチドホルモン類がある。本発明の複合体の他の用途としては、代謝に関与している比較的小さな分子例えば葉酸塩のアッセイ；感染症に関連するポリペプチドの抗原と抗体、例えばHI V、肝炎、CMV、梅毒、ライム病の因子および他の多数の感染因子に関連する抗原と抗体のアッセイがある。他の用途としては、心臓検査に関連する化合物、例えばクレアチンキナーゼアイソザイムMB（CKMB）、トロポニン、ミオグロビン、炭酸脱水酵素３およびジゴキシン；ならびに癌診断に関連する化合物、例えば癌胎児性抗原(CEA)、α−フェトプロテイン(AFP)およびヒト繊毛性ゴナドトロピンホルモン(HCG)のアッセイがある。本発明のポリペプチド：デンドリマー組成物は、直接結合させて得られるタンパク質−タンパク質接合体または同時に結合させて得られる２ポリペプチド：デンドリマー複合体より低価格でかつ迅速に製造される。というのは、広範囲にあたる品質管理と標準化を行う必要性が少ないからである。本発明の組成物中の第一ポリペプチド／デンドリマーの比率は容易に制御することができ、第二ポリペプチドを含有する組成物中の第二ポリペプチド／デンドリマーの比率も同様である。他の利点としては、直接結合させて得られるポリペプチド−ポリペプチド接合体に比べて、指示薬の所定の感度を達成するのに必要なタンパク質の量が少ないことである。場合によっては、必要なポリペプチドが25％少ない。特異的生物活性が高いのは、少なくとも一部分は本発明によって達成される制御可能な順に行う結合の結果である。他の利点は、本発明の指示薬と特異的競合試薬を使用して、直接結合させて得られるポリペプチド−ポリペプチド接合体または同時に結合して得られるポリペプチド：デンドリマー複合体では達成できないシグナル増幅を達成できることである。これは、デンドリマー１分子当り比較的多数のポリペプチド標識分子とデンドリマー１分子当り比較的少数の特異的結合ポリペプチド分子を制御可能に結合させることによって実施される。このような制御された結合とシグナル増幅は、他のポリペプチド−ポリペプチドの指示薬で達成することは困難である。本発明は以下の例示実施態様を参照することによってさらに深く理解されるであろう。なおこれら実施態様は、単に代表的なものに過ぎないず、請求の範囲に記載されている本発明の真の範囲を限定すると見なしてはならない。実施例１フェニルヨードアセトアミドーおよびスルフヒドリル−活性化デンドリマー類１〜５世代のエチレンジアミンデンドリマー（E1〜E5）のアミノ末端基にフェニルヨードアセトアミド基を組み込むことによって、これらデンドリマーを活性化する実験を行った。約２重量％のデンドリマーを含有する水溶液（米国ミシガン州ミッドランド所在のMichigan Molecular Imstitute社）に、1/5溶積の0.5M リン酸ナトリウム緩衝液pH7.0 を添加して、限定された数のフェニルヨードアセトアミド基を組み込んだ。該溶液のpHは7.6に調節した。20mg/ml のスルホSIAB （Pierce chemical社）を含有する新たに調製した溶液を、上記デンドリマー溶液に、約10：〜25:1 のモル比（スルホ-SIAB :デンドリマー）で絶えず混合しながら加えた。得られた混合物を、30℃で１時間インキュベートし、次 4.5 ℃溶離した。上記カラムから溶出された第一ピークは、280mm 波長光の吸光度で検出したところ、誘導体化されたデンドリマーを含有していた。そのピークを収集し、使用する前12時間ほど水溶液に貯蔵するかまたは２週間までの期間-1 0℃で凍結して貯蔵した。最大可能数のフェニルヨードアセトアミド基を組み込むため、E2の2.5 ％メタノール溶液（23.4mM）を、SIABのTHF-メタノール溶液（ 234mM; Pierce chemical Co.社）とゆっくり混合した。室温下10分経過後、最初透明であった溶液から白色沈澱が沈澱した。分離したところ、その沈澱は、アルコール、ジメチルスルホキシド（DMSO）またはジメチルホルムアミド(DMF)のようなすべての普通溶媒およびpH2.0 〜11.0の緩衝液に対し溶解しないことが見出された。その物質の懸濁液は、L.U.obi，"Application of the 2,4,6-trinitrob enzene-1-sulfonic acid（TNBS）method for determination of available lysi ne in maize seed"，Agric．Biol．chem.，46巻、15〜20頁、1982年に記載されているのと類似の方法で、室温にてTNBSを用いて試験したところ、アミノ基に関する明確な変色反応を示した。５世代デンドリマー、E5を、スルホ-LC-SPDP（スルホスクシンイミジル６−〔３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド〕ヘキサノエート）（米国イリノイ州ロックフォード所在のPierce chemical company 社由来）と、水性メタノール中、室温下１時間反応させた。この反応には、８：１モル比の活性化試薬：デンドリマーを使用した。約4.0 保護スルフヒドリル／デンドリマーを末端基に組み込んで保護E5-SH を製造した。生成物(E5 -S-S-Py)を、これに残っているアミノ基をヒドロキシル基に変換しようと試みて、グルコノラクトン、ブチロラクトンまたはアセトキシアセチルクロリドと反応させた。反応生成物の分析結果は、SPDPで処理したE5中に残っているアミノ基のヒドロキシル基への完全な変換はかような試薬では達成されなかったこのと示した。 SPDPで処理したE5を無水コハク酸でカルボキシル化してスグシニル化E-S-S-Py を製造した。その反応は、E5-S-S-Py のメタノール溶液を過剰の無水コハク酸TH F 溶液で室温下に処理して実施した。反応が完了したことは、遊離の第一級アミノ基の存在を検出する。TNBSによる変色反応がないことによって監視した。反応生成物の分析結果は、E5-S-S-Py 中に残っていたアミノ基はほとんどカルボキシル基で置換されたことを示した。次に、スクシニル化E5-S-S-Py のスルフヒドリル基の保護部分をジチオエリトリトール(DTE)を用いて除去した。得られた生成物のスクシニル化E5-SHは、-20℃で貯蔵すると不溶性の沈澱を生成することが見出された。実施例２反応性部分のポリペプチドへの結合クレアチンキナーゼアイソザイムMB(CKMB Conan，ATCC受託番号：HB8739，分子量約150,000)に対する抗体を、Affi-Prep プロテインＡカラム（Bio Rad 社）を用い、吸着されたタンパク質を、5mM のEDTAを含有する100mM リン酸緩衝液pH 6.0 で溶離することによって精製した。得られた抗CKMB抗体を、２％ペプシンで、37℃、pH4.2 にて24時間消化して、分子量が100,000のフシグメントF(ab')₂を製造した。100mM リン酸緩衝液pH7.0 中3.2mg/ml抗CKMB F（ab'）₂を、25倍の過剰モルのスルホSIAB（水中）と混合し、30℃で１時間イシキュし、0.6 反応性フェニルヨードアセトアミド部分／ポリプペチドを含有していることが確認された。子ウシ腸アルカリホスファターゼ（本明細書ではALP と呼ぶ）（100mM リン酸緩衝液pH7.6 中2.6mg/ml）を、上記F(ab')₂の場合とほとんど同じ方法で、20倍の過剰モルのスルホSIABと反応させた。精製後、スルホSIAB活性化ALP が、4.6 反応性フェニルヨードアセトアミド部分／ポリプペチドを含有していることが見出された。実施例３ SIAB- ポリプペチドをSH- デンドリマーに対して順次行う結合実施例１由来のスクシニル化E5-SH を、実施例２由来のSIAB活性化F(ab')₂と、5mMEDTA 緩衝液を含有する100mM リン酸緩衝液中、pH6.0、４℃にて20時間反応させた。生成物をセファデックスG-25を用いるゲル濾過法で精製した。精製されたF（ab'）-succE5-SHを、実施例２のSLAB活性化ALP と、pH7.60，４℃にて94 時間反応させた。得られた生成物を、AcA-34を用いるゲル濾過法で精製してALP- succE5-F(ab')₂を得た。この生成物の分子量を計算したところ706,860 であった。生成物のこの分子量は、SIABを用いて直接接合させることによって製造したAL P-Fab'指示薬(ALP-SIAB-Fab')の分子量の２倍を超えた値である。 ALP-succE5-F(ab')₂の生成物を、米国特許願第08/021,928号に記載されているようなCKMBアッセイの指示薬として使用した。なお上記特許願は本明細書に援用するものである。上記アッセイは、選択された較正標準約60μl を吸引してガラス繊維タブ中に送り込む 167ng タンパク質/ml）を各タブに送り込んだ。次いで装置に約70μl の基質洗浄液（1.0mM の４−メチルウンベリフェリルホスフェート(MUP)、アルカリホスファターゼ阻害剤、安定剤、青色染料、界面活性剤および0.1 ％のアジ化ナトリウムを含有するpH9.0 のジエタノールアミン緩衝液）を吸引させ、各タブに20μ l と50μl を順に救出した。第二の基質洗浄液を送り込んで直ちに初期蛍光率を測定し、該装置のメモリに記録した。 MUP 基質に対するALP の作用によって発生した蛍光の量を該装置で検出し、単位時間当りの電圧で表した”率”に変換した。この率は表と図にはmv/minで示す。率は蛍光強度の尺度であり、一方、タブの反応性部分に結合したポリペプチド：デンドリマー複合体の量の尺度でもある。未知の試料が装置の作動中に測定されているとき、個々の較正標準の蛍光率が測定され、その測定値は、マイクロプロセッサ中の記憶場所に送られる。全較正標準が測定された後、プログラムが、下記方程式：Ｒ＝｛（Ａ−Ｄ／［１＋Ｂ（Ｘ／Ｃ）］＋Ｄ｝（式中、Ｒは蛍光率であり、そして×は対応する濃度である）に示す形態の測定データ点に数学的関係を含ませるマルチパス線形回帰ルーチンを用いて”ロッドバード（Rodbard）”パラメータＡ、Ｂ、ＣおよびＤを計算する。上記方程式は、各種のイムノアッセイシステムに対して優れた適合を示すと報告されている一般化Ｓ字状曲線である。メモリに記憶させた、得られたＡ、Ｂ、ＣおよびＤのパラメータに基づいて、該装置は、アッセイされた試料の濃度の読出し値を提供する。この実験の場合、較正標準Ａ、ＢおよびＦは、BSA、安定剤および保存剤としての0.1％のアジ化ナトリウムを含有するトリス−緩衝溶液(pH7.5)中で製造した。較正標準溶液Ａ、ＢおよびＦはそれぞれ、1ml当り0.0、3.9 および131.6ng の濃度のCKMBを含有している。実験の結果を表１に示す。二つの追加の試験でも類似の結果が得られた。実施例４エポキシド- およびSIAB- デンドリマー E5を108 倍の過剰のブロモ酢酸のメタノール溶液で37℃にて処理することによって、カルボキシメチル化-E5 デンドリマー（CME5）を製造した。最終反応ステップでエチレンジアミン／エタノールアミン混合物を用いることによって部分的に（77％）ヒドロキシル化させたE5（77％E5）を製造して５世代末端が形成された（米国ミシガン州ミッドランド所在のMichigan Molecular Institute社）。デンドリマーのE5、E2、77％E5およびスクシニル化E5を、トリエチルアミンまたは懸濁個体の炭酸ナトリウムのような塩基の存在下、50％エタノール中で、室温において16時間、エピブロモヒドリンと反応させた。デンドリマー反応生成物は、エピブロモヒドリンの反応物質由来のエポキシド基を有する末端を含有していた。エポキシド活性化デンドリマー誘導体は50％アルコールに完全に可溶性であった。上記ブンドリマー反応生成物中に組み込まれたエポキシ基の数は、Ngo，T．編集”Nonisotopic immunoassay”Plenum Press社、ニューヨーク、1988年年発行、37頁に記載されているのと類似の滴定法によって定量した。滴定は、既知容積 (0.9mL)の活性化デンドリマー溶液を、0.1mL の0.5mM DTE とともにpH6.0、37℃ で2.5 時間インキュベートすることによって実施した。反応混合物中に残った過剰DTE の量を、ジチオジピリジン（Aldrich Chemical Co.社）の５mM水性アルコール溶液40μL を添加し、次いで324nm にて吸光度を測定することによって定量した。この反応中に消費されるDTE の量は、活性化デンドリマーに存在する活性基の濃度に等しい。その滴定結果は、各デンドリマーの末端アミノ基の95〜99％が、エピブロモヒドリンで処理した後、エポキシ反応性基に結合されたことを示した。カルボキシメチル化E5と77％ヒドロキシル化E5を、それぞれ12：１と８：１のデンドリマー：スルホSIABのモル比で、pH7.4 にてスルホSIABで処理した。これらのチャレンジ比によって、各デンドリマー誘導体に遊離アミノ基を少数保持することができる。実施例５ SH- およびCHO-ポリペプチドをエポキシ−およびSIAB- デンドリマーに対して順に行う結合抗CKMB抗体のFab'フラグメント（分子量：約46,000、本明細書ではFab'と呼称する）を、F(ab')₂（実験例２）を100mM リン酸緩衝液中、pH6.0、37℃にて１時間、DTE で処理することによって製造した。得られたFab'のヒンジ領域のスルフヒドリル部分を、反応性部分として利用して、そのポリペプチドをデンドリマーに結合させた。 ALP を過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、ALP のカルボハイドレート基は反応性アルデヒド部分を導入してALP-CHO を製造した。この反応は、Biocomj．chem. ，５巻、482 〜490 頁、1994年に記載の方法に類似の方法で実施した。また、ALP のスルホ-SIAB による活性化について記載した（実施例２）のと同じ方法で、ALP をスルホ-LC-SPDPで処理した。９量部の反応生物に１量部の100m M DTE pH7.6 を添加し、次いで30分間インキュベートすることによって、反応生成物を室温下で還元した。得られたポリペプチド生成物（ALP-SH）は、ALP のリシル残基の反応性アミノ期に結合した約4.5個のスルフヒドリル反応性部分を含有していた。次に、Fab'とALP 誘導体を順にE5の誘導体に結合させる三つの別個の反応を実施した。反応１では、12mgのFab'と10mgの活性化E5を100mM リン酸緩衝液pH6.5 中に含有する反応混合物を濃縮し、そのインキュベーション混合物のタンパク質濃度と約5.0mg/mLにして、Fab'をエポキシ活性化E5（実施例４）と反応させた。４℃で23時間インキュベートした後、反応混合物のpHを7.67に調節し、インキュベーションを４℃にてさらに17時間続けた。得られた第一ポリペプチド：デンドリマー複合体を、AcA-44カラムによるゲル濾過によって精製したところ、約3.1 個の未結合のエポキシド活性化末端を含有していることが見出された。精製させたFab'-E5-エポキシド(3.9mg)をALP-SH(3.0mg)の溶液に添加した。反応混合物を、100mM リン酸緩衝液pH7.6 中、タンパク質の全濃度が約5.0mg/mLになるまで濃縮し、次いで４℃ で63時間インキュベートした、反応混合物１mL当りN-エチルマレイミド（DMF 中 10mg/mL）10uLを添加することによって、過剰の遊離スルフヒドリル基をクエンチした。反応２では、100mM リン酸緩衝液pH6.0 中で、Fab’(3.2mg)を、SIAB- 活性化カルボキシメチル化E5（CME5-SIAB と命名、14mg；実施例４）と反応させた。４ ℃で24時間インキュベートした後、得られた第一ポリペプチド−デンドリマー複合体を、セファデックスG-25カラムによるゲル濾過で精製し、約16個の未結合SI AB- 活性化末端を含有していることが見出された。精製されたFab'-E5（CH₂COOH ）-NHCOPh NHCO CH₂1 複合体(2.2mg)をALP-SH（3.1mg）の溶液に添加し、次いで反応１で先に述べたようにpH7.6 でインキュベーションを行った。反応３では、２種のポリペプチドをデンドリマーに結合させる順序を逆にした。100mM リン酸緩衝液pH7.6 中に8.1mg のALP-CHO と15.9mgのSIAB活性化CME5を含有する溶液を濃縮することによって、ALP-CHO を結合させた。得られた反応混合物（1.2mL、約5.0mg/mLのタンパク質を含有する）を４℃で16時間インキュベートした。そのpHを6.30に調節し、混合物を200 μL のシアノホウ水素化ナトリウム（水中30mg/mL）と混合した。室温下で１時間経過後、ALP：デンドリマー複合体を含有する反応混合物を、100mM リン酸緩衝液pH7.6 中で、セファデックス G-25によるゲル濾過で精製した。精製されたALP-E5（CH₂COOH）-NHCOPh NHCO CH₂ １複合体(4.7mg)をFab'(2.3mg)の溶液に添加し、反応１で先に述べたようにして24時間インキュベートした。上記３種のデンドリマー：ポリペプチド反応生成物を各々、AcA-34を通過させて、関連する画分のA280を測定した。そのカラムプロフィールは、分子量が約30 0,000の種が存在していることを示したが、これは、上記三つの反応のすべてにA LP-E5-Aab'複合体が生成したことを示している。示薬として使用した。その生成物は、較正標準ＡとＦそれぞれに対する蛍光率が 4364mV/minと4899mV/minであった。残りの二つの反応の生成物についても類似の試験結果が得られた。実施例６ ALP と、SIAB- 、エポキシ−およびヨードアセチル−デンドリマーとの結合約15.3個のSIAB活性化未結合末端を含有するALP-77％E5-NHCOPhNHCO CH₂Iを、 ALP-CHO とSIAB活性化77％Ｅ５を反応３に記載の条件（実験例５）を用いて結合させることによって製造し、次にセファデックスG-25によるゲル濾過で精製した。生成物約20μl を、実施例３に記載したようにしてStratus CKMBアッセイの指示薬（0.94ngタンパク質/ μl 指示薬）として使用した。蛍光応答は、較正標準または試料を含有していない紙タブ（ブランクの紙タブ）上で2028mV/minであった。デンドリマーE2を、実施例４に記載されているようにしてエピブロモヒドリンで活性化した。E2も N-ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート（NIA）（米国イリノイ州ロスコー所在のBio Affinity Systems社）で活性化した。NIA のアルコール-THF（１：１）溶液を、１％W/V のE2デンドリマーを含有するE2の50％アルコール溶液に徐々に添加し、次に室温下で１時間インキュベートした。この反応では、該デンドリマーを20倍過剰のモル濃度のNIA で活性化した。得られた溶液を減圧下で蒸発させることにより、生成したヨードアセチル活性化デンドリマーを黄色樹脂状物として得た。その生成物を、アルコールと100mM リン酸緩衝液pH7.2 の１：１混合物に溶解して直ちに使用した。これらの手順において、ほとんどすべてのデンドリマー末端が活性化された。求電子性のエポキシ末端またはヨードアセトアミド末端を含有する上記２種の活性化E2誘導体を各々、実施例５に記載されているようにしてALP-SH（ポリペプチド１分子当り2.6個の遊離スルフヒドリル基を含有している）に結合させた。各ALP-デンドリマー複合体を、先に述べたように、ブランクの紙タブを用いる Stratus CKMBアッセイで指定薬として使用した。ALP-E2-COCH₂ Iを用いた場合の蛍光応答は、100ng タンパク質/ml指示薬で、約1058mV/minであった。ALP-E2- エポキシドの蛍光応答を計算したところ、100ng タンパク質/ml 指示薬で約50,1 30mV/minであった。 ALP-E2-COCH₂I 複合体を、100mM リン酸緩衝液pH7.2 中100mMアミノエタンチオール（1/5 容積）とともに16時間インキュベートした。アミノエタンチオールは、デンドリマー−ポリペプチド複合体中に存在する反応性ヨードアセチル基と反応して、各ヨードアセチル基の代わりにアミノ基を導入する。次にこのアミノエタンチオールで処理した複合体を、上記のノエタンチオールで処理した複合体を指示薬として用いた場合の蛍光応答は、未処理の複合体を用いた場合の応答の約４倍であった。実施例７ ALP-SHのヨードアセチル−デンドリマーとの結合 pH7.0 で10倍過剰のスルホ-LC-SPDPを用いたことを除いて実施例５に記載したのと同様にして、スルフヒドリル反応性部分をALP に結合させた。ALP-SH生成物はタンパク質１mole当り１moleの遊離スルフヒドリル基を含有していた。 NIA を用いて、ヨードアセチル基で、各種デンドリマーE1〜E5のアミノ末端を活性化した。デンドリマーの50％アルコール溶液（１〜３％、w/v）に、10〜25 ％過剰の活性化試薬NIA を含有するTHF 溶液を滴下して加えた。したがって、例えば、それぞれ８個と32個の末端基を有するE1とE3を、それぞれ10: １と35: １のモル比のNIA :デンドリマーと反応させた。室温下１時間反応させた後、大部分の揮発性試薬を、25℃未満の浴温にしロータリーエバポレーターで除去した。残った水溶液／水性懸濁液を等容積のアルコールで希釈した。NIA活性化デンドリマーのわずかに濁った水性アルコール溶液を、通常、調製後４時間以内に使用するまで４℃で貯蔵した。 NIA 活性化デンドリマーをフルオレスカミンで滴定したところ（Lai，C.Y.，M ethods Exzymol．47巻、236 〜243 頁、1977年）、最初存在していた第一級アミノ基は検出できなかった。この観察結果は、第一級アミノ末端全部の99％以上がこの反応によってNHS 活性化末端に変換されたことを示唆した。E1（IAE1）中の NIA 活性化活性化末端の数は、その基が不安定であるため測定しなかった。 1.0 ±0.1mg/mlの上記ALP-SH生成物（12.0ml、85μM; 100mMリン酸緩衝液、pH 7.0）を、約0.1 倍容積のIAEIの50％アルコール溶液(1.5ml; 20mM)とともにインキュベートすることによって、ALP-SHをNIA 活性化E1に結合させた。得られた混合物を４℃で16時間ゆるやかに攪拝した。反応生成物のALP-SCH₂COHN-E1-NHCOCH₂ I をAcA-44カラムのゲル濾過で精製し、その精製物はDTE 滴定を行ったところ、タンパク質１mole当り約1.3mole のヨードアセチル基を含有していることを示した。上記反応生成物（ALP-E1と呼称する）をCKMBアッセイにてブランク紙タブで指示薬（指示薬１mL当り500ng のタンパク質）として使用したところ、146mV/ min の蛍光率が観察された。ALP-SHポリペプチドがALP 分子一分子当り約2.6 個のスルフヒドリル基を含有していたときのALP-SCH₂COHN-E2-NHCOCM₂I 製剤を用い、同じ条件下で、9713mV/minの蛍光率が観察された。特に断らない限り、実施例８〜11の実験では、ポリペプチド１分子当り平均１個のスルフヒドリル基を含有するALP 製剤を使用した。ヨードアセチル−活性化アミノ末端を有する他のデンドリマーについて類似の実験を行った。いくつかのヨードアセチル活性化デンドリマー:ALP 複合体についてブランクタブで得られた蛍光応答を表２に示す。上記ALP :デンドリマー複合体中に存在するヨードアセチル基の数は、その各デンドリマー中に存在するアミノ基の数に基づいて予想される数より一般に小さい。デンドリマーの活性化されていない未結合のアミノ基末端が近傍のヨードアセチル基と反応して非反応性の環式構造体を生成した可能性がある。このような反応は比較的ゆっくりしていると考えられるが、デンドリマーのアミノ基末端は一層反応性である。その上、デンドリマー中に組み込まれたヨードアセチル基は、他の種類の分子に組み込まれたヨードアセチル基より反応性が高い。 p-ニトロフェノールホスフェートを用いて、上記デンドリマー−ポリペプチド複合体について、酵素化活性を試験した。この活性（単位/mg タンパク質で表す）は、試験を行った全誘導体についてほとんど同一であることが見出された。この試験結果は、ALP を結合させたデンドリマーの世代が、ALP の酵素治性に有害な影響を与えなかったことを示す。実施例８ Fab'のALP-ヨードアセチル- デンドリマーへの結合 100mM のリン酸塩-1.0mM MgCL₂pH7.6の緩衝液中に約5mg/mLの全タンパク質を含有する反応混合物をインキュベートすることによって、Fab'を実施例７の各AL P :デンドリマー複合体に結合させた。この混合物は、ALP :デンドリマー複合体１mg当り1.5 〜1.9mg のFab'を含有していた。この比率は、ALP :デンドリマー複合体の量に対し５倍を超える過剰のモルのFab'を示す。4℃で24〜60時間インキュベートした後、実施例５に記載されているようにしてN-エチルマレイミド(NEM)を添加することによってすべての遊離スルフヒドリル基をクエンチした。実施例９に記載されているようにして生成物を精製した後、これらデンドリマー：２ポリペプチド複合体を、実施例３に記載したのと同様にしてCKMBアッセイの指示薬として使用した。試験結果を表３に示す。上記試験結果は、デンドリマーに順に結合させた２種のポリペプチドを含有する指示薬組成物を使う場合の蛍光率は、特異的結合アッセイで指示薬として現在使用されている直接結合させてなるALP-Fab'接合体の率を類似していることを示している。さらに試験結果は、１〜５世代のエチレンジアミンコアデンドリマーが、２種の異なるポリペプチドを順に結合させて、各ポリペプチドの固有の生物活性が未接合ポリペプチドの活性とほぼ同じままで残っている２ポリペプチド：デンドリマー複合体を製造するのに有効に使用できることを示している。実施例９ポリペプチド−デンドリマー複合体のカラムプロフィール実施例８に記載のALP-EX-Fab’誘導体を、10mMのトリス、100mM のNaCl、1.0m M のMgCl₂、0.1mM のZnSO₄および0.1 ％のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液（ pH7.00）を用いてAcA-34カラム（1.6cm 直径×100cm）を通過させた。分子量が高い方の種がこれらの条件下で早い方の画分に溶出する。画分（2ml ずつ）を集めて、各画分の280 ナノメートル波長の吸光度（A₂₈₀）を測定した。図１〜５は、１世代〜５世代のエチレンジアミンデンドリマーを使用して製造したそれぞれの複合体のカラムプロフィールを示す。各図の矢印は、実施例８に記載されているようにStratus アッセイで試験するためプールされた溶出物質の画分を示す。１世代または２世代のデンドリマーを用いたポリペプチド−デンドリマー複合体は、他のデンドリマー複合体より均質のようである（図１と２）。ALP-E3-Fab ’のカラムプロフィール（図３）は、SIABの化学作用が直接接合させて得たALP- Fab'複合体のカラムプロフィール（図示せず）とほとんど同一であった。両方の場合、ほぼ32番の画分における高分子量のショルダー部がほぼ43番の画分における主接合体のピークより先行している。 E4とE5のポリペプチド−デンドリマー複合体は、E1〜E3複合体より分子量が高い種を生成した。ほとんど同じタンパク質濃度で、ALP-E4-Fab’のプロフィル中の第一ピークの画分（図４の画分23〜29）は、Stratus CKMB検査法の活性が、主ピークの画分（図４の画分33〜40）と比べて約1/2 であることを示した。表３に示す試験結果は、主ピーク画分由来のプールの活性を示す。表３で使用されたAL P-E5-Fab’複合体は画分20〜28（図５）から集めた。そしてこの複合体は、Stra tus アッセイで蛍光応答読取り値を得るために、他の複合体が必要とするタンパク質の量に比べてはるかに多量のタンパク質を必要とした（表３）。またALP-E3-Fab’複合体は、オクチルセファロースカラム（0.8 ×６cm）による疎水性相互作用クロマトグラフィーで精製した。疎水性相互作用クロマトグラフィーでは、反応生成物中の一層疎水性が高いポリペプチド／デンドリマーの種が、n-プロパノール／トリエタノールアミン緩衝液で溶離される。このカラム由来の画分の有効タンパク質濃度を表４に示す。直接結合させて得られた接合体の疎水性が高い種は、疎水性が低い種に比べて、ほとんど1/2 のタンパク質濃度で有効である。これらの試験結果は、ALPとFab 'のポリペプチドの成分の比率が、ALP-E3-Fab’と比べてALP-SIAB-Fab’では異なっていることを示唆している。差が比較的小さいことは、その複合体の二つのタンパク質成分の比率が類似していることを示唆している。実施例10 ALP-SHのFab'−デンドリマーへの結合 Fab'の溶液（pH6.0 の緩衝液中2.6ng/ml）を結合に用いたことを除いて、実施例４に記載されているのと類似の方法によってFab'をNIA-活性化E2に結合させた。反応生成物はFab'-SCH2 COHN-E2-NHCO2I(Fab'-E2)であった。Fab'-E2は、タンパク質１mole当り2.5mole の反応性ヨードアセチル基を含有していた。次にALP-SH(2.8mg)とFab'-E2（6.6mg）の1.1ml 混合物を、実施例７に記載したのと同様にしてインキュベートすることによって、ALP-SHをFab'-E2 に結合させた。反応生成物（Fab'-E2-ALP と呼ぶ）をAcA-34によるゲル濾過で精製した。 Fab'-E2-ALP 生成物を、実施例９に記載されているようにしてAcA-34カラムで精製した。2mlずつの画分を集め、各画分のA280を測定した。そのA280のデータによると、比較的ブロードなカラムプロフィールであった。異なるカラムの画分を二つのグループに集め、各プールのポリペプチド−デンドリマー複合体を、実施例３に記載したようにして、Stratus CKMBアッセイの指示薬として使用した。これらの各複合体の蛍光応答を表５に示す。実施例11 ポリペプチド−デンドリマー複合体におけるALP/Fab'の比率 SIAB基によって直接結合させて製造した接合体およびデンドリマーに順に結合せることによって製造した複合体におけるALP とFab'の相対比率を測定した。この目的のため、フルオレセインとBODIPY（米国オレゴン州ユージーン所在のMole cular Propes社）すなわち異なるスペクトル特性を有する二つの蛍光標識を用いて、当該技術分野で公知の緩和な反応条件下で、ALP とF(ab')2 をそれぞれ標識化した。フルオロセインを含有する種は495nm の波長光を吸収して520nm の波長光を発し、一方BODIPYを含有する種は580nm の波長光を吸収して590nm の波長光を発する。Fab'の免疫活性とALP の酵素活性はこの処理によって影響を受けなかった。次に上記標識化タンパク質を用いて、実施例８に記載されているようにしてALP-E2-Fab’を製造し、および直接結合させて接合体のALP-SIAB-Fab’を製造した。各反応の生成物をAcA-34カラムにかけてトリス緩衝液で溶離した（実施例９）。ポリペプチド−デンドリマー複合体または直接結合させて得た接合体を含有するカラム画分集めてプールした。次に各プールを、実施例３に記載されているようにしてCKMB検査法の指示薬として使用した。指示薬として有効であったこれらプールされたALP-SIAB-Fab’の画分は、約180,000 ダルトン〜約600,000 ダルトンというポリペプチド−デンドリマーの分子量の範囲を示し、一方、指示薬として有効であったこれらプールされたALP-E2-Fab’の画分は約160,000 ダルトン〜約440,000 ダルトンの分子量の範囲を示した。各プールにおけるALP とFab'から発せられる蛍光を、励起て枚出を行うため適当な波長を設定して蛍光計で測定した。これらの測定値は、ALP-SIAB-Fab’複合体が１：６のALP:Fab’比を有し、一方ALP-E2-Fab’複合体は１：３のALP:Fab' 比を有していることを示唆した。ALP-E2-Fab’中のFab'に対するALP の量が高いので、ALP-SIAB-Fab’に比較して蛍光シグナルが増幅される。実施例12 1/2 世代のデンドリマーに対して順に行うポリペプチドの結合この実施例は、1/2 の世代のカルボキシル末端デンドリマーを、２種のポリペプチドに順に結合させることができることを教示する。 1/2 世代エチレンジアミンコアデンドリマー(G1 1/2-COOH)すなわち遊離酵(34 mg; 16μM)を0.5mL の80％水性DMF に溶解して得た溶液を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸(390mg; 2mM; EDC)およびＮ −ヒドロキシスクシンイミド（230mg; 2mM）と混合した。室温下５時間または４ ℃にて16時間撹拝した後、その反応混合物を酢酸エチル５mLと混合した。析出した半固体物質を、イソプロバノール（３×５ml）を用いて離解させた。最後のイソプロパノール洗浄液を遠心分離した後（1000rpm、５分間）、白色の綿毛状の個体が得られた。その残留物を0.5mL の水に溶解し、次に、100mM リン酸緩衝液 pH7.0 で希釈した上記生成物の少量部分にエチレンジアミン１％溶液を添加して A260の変化を測定することによって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの濃度を測定した。反応生成物は、実質的にすべてのデンドリマー末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を含有する活性化1/2 世代デンドリマーであった。6 1/2 世代エチレンジアミンデンドリマー溶液[G(5 1/2)-COOH]を、先に述べたのと同じ条件下でNHS およびEDC とともにインキュベートした。活性エステルの水溶液を調製した後１時間以内に、各活性化エステルデンドリマーの水溶液（200 〜500 倍過剰モル）を、ALP(3.4mg/ml)と、冷蔵庫内でpH7.0 にて16時間反応させて、ポリペプチド−デンドリマー複合体のALP-G（1 1/2）とALP-G（5 1/2）を製造した。ALP のリシン残基のε−アミノ基はこれらの条件下で反応性部分として働く。各反応の結合効率は、ALP/活性化デンドリマー混合物の一部を、過剰のエチレンジアミンとともに４℃で16時間インキュベートすることによって推定した。その上、ALP/G（1 1/2）-COOH 活性デンドリマー混合物を、２−アミノエタンチオールとともにpH8.0 でインキュベートした。ALP-G（1 1/2）またはALP-G（5 1/2 ）に組み込まれたアミノ基またはチオール基（それぞれエチレンジアミンまたは２−アミノエタンチオール由来）の数は、フルオレスカミンまたはジチオジピリジン（実施例４）で滴定して測定した。アミノ化およびチオール化されたALP/デンドリマー複合体を、実施例６に記載されているようにしてブランクの紙タブの指示薬として使用した。これらの試験結果を表６に示す。高レベルの非特異的結合（蛍光応答のデータによって示される）は、ALP-デンドリマー複合体中に多数の未結合デンドリマー末端が残っていたことを示す。 ALP3（実施例５のようにして過ヨウ素酸塩で修飾されたALP）を、NHS-活性化G （1 1/2）-COOH デンドリマーを20：１、100 ：１および500 ：１のデンドリマー：ALP3のモル比で用いて、先に述べたようにして30分間インキュベートした。 ALP-デンドリマー反応生成物を２−アミノエタンチオールとともにインキュベートし次いで先に述べたようにして組み込まれたSH基の数を測定することによって、各反応における結合効率を試験した。各チオール化生成物を、CKMBアッセイのブランク紙タブの指示薬として使用してその蛍光応答を記録した。その試験結果を下記表７に示す。そのデータは、活性化デンドリマー:ALP のCNチャレンジ比が増大するにつれて、非特異的結合のレベルのみならず、組み込まれたSH基の数が増大することを示している。 ALP3を、50：１の活性化デンドリマー：ALP3のチャレンジ比で、NHS 活性化G （1 1/2）-COOH デンドリマーと、上記のようにして反応させた。ALP :デンドリマー生成物を先に述べたようにしてアミノエタンチオールと反応させた。得られた生成物のALP-G（1 1/2）-SH は2.6 個の反応性スルフヒドリル基を含有していた。 1，4- ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDE）（97mM）0.16mlとFab’(0 .9mg/ml,50μM)を、100mM リン酸緩衝液、5.0mM EDTA、pH6.0 中で混合し次いで４℃で24時間インキュベートすることによって、Fab'をホモニ官能架橋剤のBDE で活性化した。反応生成物は、タンパク質１モル当り0.5mole のエポキシド反応性部分を含有していることを示した。エポキシ基がFab'のヒンジ領域のスルフヒドリル基に組み込まれていた。ALP-G（1 1/2）-SH とFab'-エポキシドを実施例７に記載されているようにして24時間かけて結合させた。得られたALP-G(1 1/2) -Fab'ポリペプチド−デンドリマー複合体を、実施例３に記載されているようにしてCKMBアッセイ法の指示薬として使用した。蛍光応答のデータを表８に示す。実施例13 CHO-およびSH- ポリペプチドのCOOH- およびCOCH2Br-末端に対して順に行う結合 1.0mL の水／ジオキサン／DMF(1:2 :2 v/v)に溶解した遊離酸形のG（1 1/2）- COOH(20mg、9.2 μM)を、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(89mg、670 μM、DPA )の存在下、N，N，N'，N'- テトラメチル（スクシンイミド）ウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU)(69ng、230 μM)で活性化した。室温下で１時間経過後、揮発性有機化合物を減圧で除去し、得られた固体残留物を、酢酸エチル(345mL )で洗浄した。酢酸エチルに溶解しない物質を減圧で乾燥し次いで0.5mL の水に溶解した。得られた水溶液中の活性エステルの濃度を、実施例12に記載されているようにしてエチレンジアミンで滴定して測定した。そしてこれらのデータによって、デンドリマー末端のほとんどすべてがＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基によってエステル化されていることが裏付けられた。 ALP3を、実施例12に記載されているようにして、pH7.0 で30分間、水溶中で、 NHS 活性化G（1 1/2）と反応させた。得られた反応混合物を、1.5 倍容積の0.2M ヘキサメチレンジアミン(HMD)とともにpH9.0 で２時間インキュベートしたところ、ALP に結合していなかったデンドリマー末端に反応性アミノ基が組み込まれた。 pH7.0 リン酸緩衝液を用いて超遠心分離を行って生成物を非タンパク質の不純物から分離し次に、アミノ基の数をフルオレスカミンで滴定することによって推定した。その滴定データは約31個のアミノ基が存在することを示した。未反応の ALP3は約55個のアミノ基を有していると予想されそして未反応のNHS 活性化G（1 1/2）は約12個のアミノ基末端を有すると予想される。反応性アミノ基の実測数（31）と等モルのALP-デンドリマーの結合から予測される数（16）の差は、ALP3 分子がG（1 1/2）-COOH デンドリマーのNHS 活性化末端に結合されたことを示唆した。しかし実質的にすべてのNHS 活性化デンドリマー末端ALがALP 分子に結合したわけではないようである。 ALP-デンドリマー複合体中の反応性アミノ基の実測数と予想数の差の大部分はおそらく他の理由が原因であろう。一つの可能性がある説明は、デンドリマー１分子当りのALP3分子の数が約２より大きい(ALP)_n-G(1 1/2)の生成物は、ポリペプチド−デンドリマー複合体のサイズ排除カラムのプロフィールから除外されたことである。ALP-G（1 1/2）の未結合のNHS 活性化カルボキシル末端は分解して HMD と反応しない形態になるがまたはHMDの両方のアミノ基は各々NHS 活性化末端と反応する。滴定の計算結果によればHMD の一方のアミノ基だけが反応性であると推定される。つまり両方のHMD アミノ基が反応性であれば、その計算結果は ALP 分子に結合しないままで残っているNHS 末端の実数より低い数を示す。ヘテロニ官能架橋剤の６−ブロモアセトアミド−ヘキシルアミン[BrCH₂CONH(C H₂)6NH2; BAHA]をトリフルオロ酢酸塩として合成した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルの溶液(3.5g/35mL THF)を、N-Boc-1,6-ジアミノヘキサン塩酸から調製した遊離塩基の溶液（3.5g/20mL メタノール）と混合した。室温下で２時間経過後、上記のメタノール-THF溶液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。得られた白色残留物を、精製することなく、50mLのジクロロメタンと30 mLのトリフルオロ酢酸に溶解した。生成した透明な溶液を室温下２時間撹拝した。得られた反応混合物を30℃の浴を用いてロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。蒸発後得られた白色油状物をイソプロパノールから結晶化して、0.75g の白色結晶生成物（mp121 ℃）(BAHA)を得た。 ALP3 を、NHS で活性化したG（1 1/2）-COOH およびG（1 1/2）-COOH（先に述べたようにTSTVを用いて活性化した）と別個に反応させた。粗反応混合物(1.1mL)を各々、BAHAの溶液（20mg/0.4mLイソプロパノール）と混合し、４℃で16時間インキュベートした。非タンパク質成分は、100mM リン酸、1.0mM Mgcl₂ pH7.0 緩衝液を用いて超遠心分離によって除去した。２−アミノエタンチオールをDTE の代わりに使用したことを除いて実施例４に記載されているようにして、上記生成したALP-G（1 1/2）およびALP-G（2 1/2）の複合体を２−アミノエタンチオールで滴定した。滴定試験の結果は、3.9 個と 4.8 個の反応性ブロモアセトアミド基がそれぞれ、ALP に結合していないデンドリマーの末端に組み込まれていることを示した。Alp がG（1 1/2）-COOHおよびG （2 1/2）-COOH と等モル結合を行うと仮定すると、未結合末端がすべてBAHAと反応した場合に予想されるブロモアセトアミド基の数は、ALP-G（1 1/2）の場合は約11でありかつALP-G（2 1/2）の場合は約23であった。 ALP-G（4 1/2）-COCH2Br（タンパク質1mole 当り５個の２−アミノエタンチオール反応性基を含有している）を、ALP-G（1 1/2）-COCH₂Brの場合に記載したようにして製造した。ALP-G（1 1/2）、ALP-G（2 1/2）およびALP-G（4 1/2）のブランク紙タブの蛍光応答は、これら３種の複合体の蛍光反応応答率が100mV/min 以上であることを示した。対照的に、フル世代のアミノ末端デンドリマー-ALP複合体の非特異的結合は、世代数が増すにつれて増大した（表３）。 ALP-G（1 1/2）-COCH₂BrとALP-G（4 1/2）-COCH₂Brを、ALP-ヨードアエチルデンドリマー複合体に関する実施例８に記載されているようにしてFab'とpH7.6 で 24時間反応させた。生成したポリペプチド−デンドリマー複合体のALP-G（1 1/2 ）-Fab’とALP-G（4 1/2）-Fab’を、実施例３に記載されているようにして特異的結合アッセイの指示薬として評価した。試験結果を表９に示す。特異的結合アッセイの指示薬としてのこれら複合体の性能は、同種のアッセイに現在使用されている直接接合された指示薬（CXMB-139）の性能と類似している。さらに、ALP-G（4 1/2）-Fab’の場合タブに用いられるタンパク質の量は、CX MB-139の場合に必要な量より約25％少なかった。これまでに示していない範囲について、本明細書に記載し例示されている各種具体的実施態様のいずれか一つをさらに改変して他の具体的実施態様に示される特徴を組み込むことができることは、当該技術分野の当業者にとって理解されるであろう。上記詳細な説明は、本発明を一層十分に理解することだけを目的として提供したものであり、したがっていくつかの改変は後記特許請求の範囲の思想と範囲から逸脱することなく行えることは当該技術分野の当事者にとって明らかであるから、上記説明によって不必要な限定がなされると解すべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/543 ５６５Ｇ０１Ｎ 33/543 ５６５Ｅ

Claims

【特許請求の範囲】１．複数の末端を有するデンドリマーを含んでなるデンドリマー−ポリペプチド複合体であって、前記デンドリマーが、前記末端の少なくとも一つを介して第一ポリペプチドに、そして前記末端の異なる少なくとも一つを通じて第二ポリペプチドに、順に結合されており、前記複合体の前記第一と第二のポリペプチドがそれぞれ第一及び第二の規定された生物学的活性を示すものである、デンドリマー −ポリペプチド複合体。２．前記末端の一部が未結合でありかつ前記未結合の末端の実質的にすべてが封鎖されている、請求項１の組成物。３．前記デンドリマーが、第１、２、３、４および第５世代エチレンジアミン・コア・デンドリマーからなる群から選択されるものである、請求項１の組成物。４．前記デンドリマーが、第１、２、３、４及び第５の半世代エチレンジアミン・コア・デンドリマーからなる群から選択される、請求項１の組成物。５．前記規定された生物学的活性の一つが酵素触媒作用を含むものである、請求項１の組成物。６．前記酵素触媒作用が、基質と接触した後、蛍光性生成物、比色法用生成物、化学発光性生成物、リン光性生成物、放射能測定法用生成物またはハイブリダイズされた生成物を生成する作用を含むものである、請求項５の組成物。７．前記酵素触媒作用を示す前記ポリペプチドが、アルカリホスファターゼ、β −ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼおよびアセチルコリンエステラーゼからなる群から選択される、請求項６の組成物。８．前記規定された生物学的活性の一つが、分析対象または該分析対象の受容体に対する特異的結合性を含むものである、請求の範囲１記載の組成物。９．前記特異的結合性の生物学的活性を示す前記ポリペプチドが、クレアチンキナーゼアアイソザイムMB、炭酸脱水酵素３、トロポニンＩ、ミオグロビン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモンおよびフェリチンに対し結合特異性を有する抗体または抗体フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項８の組成物。 10．前記第一の規定された生物学的活性が酵素触媒作用を含んでなり、そして前記第二の規定された生物学的活性が分析対象または分析対象の受容体に対する特異的結合性を含むものである、請求項１の組成物。 11．第一のポリペプチドに結合したデンドリマーを含んでなるデンドリマーポリペプチド複合体であって、前記複合体の前記ポリペプチドが第一の規定された生物学的活性を示し、前記デンドリマーが、次いで第二の規定された生物学的活性を有する第二のポリペプチドをそれに結合させるのに有効な少なくとも一つの活性化された末端を有し、前記第一と第二のポリペプチドが、前記次の結合の後にそれぞれの前記規定された生物学的活性を示すものである、デンドリマー−ポリペプチド複合体。 12．前記第一の規定された生物学的活性が、酵素触媒作用を含むものである、請求項11の組成物。 13．前記第一の規定された生物学的活性が、基質と接触した後、蛍光性生成物、比色法用生成物、化学発光性生成物、リン光性生成物、放射能測定法用生成物またはハイブリダイズされた生成物を生成する作用を含むものである、請求項12 の組成物。 14．前記第一のポリペプチドが、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼおよびアセチルコリエステラーゼからなる群から選択されるものである、請求項13の組成物。 15．デンドリマー／ポリペプチド複合体の製造方法であって、ａ）複数の活性化末端を含んでなるデンドリマーを準備するステップと；ｂ）少なくとも一つの反応性部分を有し、かつ第一の規定された生物学的活性をもっている第一ポリペプチドを準備するステップと；ｃ）前記第一ポリペプチドを前記反応性部分を通じて前記活性化デンドリマーの末端の一つに結合させて、前記第一の規定された生物学的活性を示すデンドリマー／ポリペプチド複合体を製造するステップとを含み、前記複合体が、第二の規定された生物学的活性を有する第二のポリペプチドを次いで前記デンドリマーに結合させるのに有効であり、前記第一と第二のポリペプチドが、前記次の結合を行った後、前記それぞれの規定された生物学的活性を示すものである；デンドリマー／ポリペプチド複合体の製造方法。 16．前記デンドリマーが、第１、２、３、４および第５世代のエチレンジアミン・コア・デンドリマーからなる群から選択されるものである、請求項15の方法。 17．前記反応性部分がスルフヒドリル基を含みそして前記複数の活性化末端が複数のヨードアセチル基を含むものである、請求項16の方法。 18．前記デンドリマーが、第１、２、３、４及び第５の半世代のエチレンジアミン・コア・デンドリマーからなる群から選択されるものである、請求項15の方法。 19．前記反応性部分がアミノ基を含みそして前記複数の活性基末端が複数のＮ −ヒドロキシスクシンイミジル基を含むものである、請求項18の方法。 20．請求項15の方法であって、さらに、ａ）少なくとも一つの反応性部分を有し、かつ第二の規定された生物学的活性をもっている第二のポリペプチドを準備するステップと；ｂ）前記第二のポリペプチドの反応性部分を前記活性化末端に結合させてデンドリマー：２ポリペプチド複合体を製造するステップと、を含み、前記複合体の前記第一と第二のポリペプチドがそれぞれ前記第一と第二の特性生物活性を示すものである；方法。 21．請求項20の方法であって、前記第一のポリペプチドの反応性部分がスルフヒドリル基を含み、第二のポリペプチドの反応性部分がスルフヒドリル基を含み、そして前記複数の活性化末端が複数のヨードアセチル、ブロモアセチル、クロロアセチル、エポキシおよびマレイミジルの基からなる群から選択されるものである、方法。 22．請求項15の方法であって、前記複合体の前記活性化末端の少なくとも一つが未結合であり、さらにａ）前記デンドリマー／ポリペプチド複合体の前記少なくとも一つの未結合末端を、第二活性化基で活性化して第二の活性化末端を製造するステップと；ｂ）反応性部分を有し、かつ第二の規定された生物学的活性を有する第二ポリペプチドを準備するステップと；そしてｃ）前記第二ポリペプチドの反応性部分を前記第二活性化末端に結合させてデンドリマー：２ポリペプチド複合体を製造するステップと、を含み、前記複合体の前記第一と第二のポリペプチドがそれぞれ前記第一と第二の規定された生物学的活性を示すものである；方法。 23．請求項22の方法であって、前記第一のポリペプチドの反応性部分がアミノ基を含み、前記第二ポリペプチドの反応性部分がスルフヒドリル基を含み、前記複数の活性化末端が複数のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含み、そして前記第二の活性化末端がブロモアセチル、ヨードアセチル、クロロアセチル、エポキシおよびマレイミジルの基からなる群から選択されるものである、方法。 24．試料中の分析対象の濃度または存在を決定するため特異的結合アッセイを実施する方法であって、ａ）前記分析対象または前記分析対象の受容体に対して特異性を有する特異的結合アッセイ用試薬の有効量を固相に固定化するステップと；ｂ）前記試料を結合条件下で前記固相に適用するステップと；ｃ）複数の末端を有するデンドリマーであって、前記末端の少なくとも第一の末端を通じて第一ポリペプチドに結合しかつ前記末端の少なくとも第二の末端を通じて第二ポリペプチドに結合しているものであり、前記ポリペプチドの一方が標識を含み、かつ前記ポリペプチドの他方が前記分析対象また前記分析対象の受容体に対する特異的結合受容体を含んでいるものであるデンドリマーを含んでなる指示薬の選択量を適用するステップと；ｄ）前記固相に結合された前記デンドリマー−ポリペプチド指示薬の量を測定するステップと；次いでｅ）前記指示薬の前記量を、前記試料中の前記分析対象または前記分析対象の受容体の濃度または存在と相関づけるステップと；を含んでなる方法。 25．前記末端の一部が未結合であり、かつ前記未結合末端の実質的にすべてが封鎖されている請求項24の方法。 26．試料中の分析対象の濃度または存在を決定するため特異的結合アッセイを実施するための方法であって、ａ）前記分析対象または前記分析対象の受容体に対し特異性を有する特異的結合アッセイ用試薬の有効量を含んでなる試薬溶液を準備するステップと；ｂ）前記試料を特異的結合条件下に前記試薬溶液に添加してアッセイ溶液をつくるステップと；ｃ）前記アッセイ溶液の有効量を、前記試薬を固相の範囲を定めた領域へ固定化させる条件下に前記固相に添加するステップと；ｄ）前記範囲を定めた領域に、複数の末端を有するデンドリマーであって前記末端の少なくとも第一の末端を通じて第一のポリペプチドが結合されかつ前記末端の少なくとも第二の末端を通じて第二のポリペプチドが結合されており、前記ポリペプチドの一方が標識を含み、かつ前記ポリペプチドの他方が前記分析対象または前記分析対象の特異的結合受容体を含んでいるものである、デンドリマーを含んでなる指示薬を適用するステップと；ｅ）前記固相に結合された前記デンドリマー−ポリペプチド指示薬の量を測定するステップと；次いでｆ）前記指示薬の前記量を、前記試料中の前記分析対象または前記分析対象の受容体の濃度または存在と相関づけるステップと；を含んでなる方法。 27．前記末端の一部が未結合であり、かつ前記未結合の末端の実質的にすべてが封鎖されているものである、請求項26の方法。