JP2009518284A - リガンド結合用新規捕捉剤 - Google Patents

リガンド結合用新規捕捉剤 Download PDF

Info

Publication number
JP2009518284A
JP2009518284A JP2008528688A JP2008528688A JP2009518284A JP 2009518284 A JP2009518284 A JP 2009518284A JP 2008528688 A JP2008528688 A JP 2008528688A JP 2008528688 A JP2008528688 A JP 2008528688A JP 2009518284 A JP2009518284 A JP 2009518284A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
capture agent
group
amino acid
hydrophobic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2008528688A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4846803B2 (ja
Inventor
エー．リーヴ ミハエル
アンダーソン サリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sharp Corp
Original Assignee
Sharp Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sharp Corp filed Critical Sharp Corp
Publication of JP2009518284A publication Critical patent/JP2009518284A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4846803B2 publication Critical patent/JP4846803B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、少なくとも第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含む、リガンド結合用多量体型捕捉剤であって、上記第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖はそれぞれ、２〜５０アミノ酸の鎖を含んでおり、上記アミノ酸のそれぞれは実質的に鏡像異性的に単一であり、かつ上記少なくとも第１ペプチド鎖と第２ペプチド鎖とが共有結合している、ことを特徴とするリガンド結合用多量体型捕捉剤に関する。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、リガンド結合用新規捕捉剤およびその製造方法に関し、同様に、目的とする特定リガンドに結合する捕捉剤を同定する方法に関する。
〔背景技術〕
抗体ライブラリーの製造のような、伝統的な捕捉剤ライブラリーの製造方法は、煩雑かつ高価である。それゆえに、様々な種類のリガンドに結合する捕捉剤として機能し得るペプチドライブラリーを、合成的に製造するために、多くの試みが行われている。
空間的にアドレス可能なライブラリー、および一ビーズ一構造ライブラリーを、スクリーニング方法において利用することが、近年報告されている。これらは、特定のレセプターに対するリガンドライブラリー、または特定のリガンドに対するレセプターライブラリーのいずれかであり得る（Combinatorial Chemistry and high throughput screening, 1, 113, 1998）。
Pro. SPIE, 4205, 75 (2001)には、エポキシドで誘導した結晶表面に結合する、または直接金の表面に結合する、シクロヘキサペプチドの使用が記載されている。この文献においては、他の全てのアミノ酸を変化させたペプチドが記載されている。このペプチドは、リシン残基またはシステイン残基により、表面に付着されている。そして、表面結合ペプチドに対するアミノ酸の結合が分析されている。
酵素阻害剤の同定に用いられる環状ペンタペプチドライブラリーもまた、以前に報告されている。環状および線状ペプチドのライブラリーが作製され、酵素阻害剤生成のために、反復合成およびスクリーニングが用いられた（Molecular Diversity, 1, 223, 1995）。
WO2005/047502にもまた、ランダムなアミノ酸配列を有するタンパク質からなるタンパク質ライブラリーが記載されている。このアミノ酸配列には４〜１２種類のアミノ酸が存在し、これらのアミノ酸にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、並びにＧｌｕまたはＡｓｐが含まれる。また、WO2005/047502には、このライブラリーから、特定の構造または機能を有するタンパク質をスクリーニングする方法が記載されている。
これらの従来のライブラリーは、伝統的な抗体ライブラリーよりも迅速に作製することが可能であるが、作製するのが高価であるという問題を依然として有している。さらに、効果的なライブラリーを作製するために十分な配列の多様性を提供するために、多数の単体ペプチドが合成されることが要求されている。
〔発明の開示〕
したがって、本発明の目的は、配列の多様性が増大した合成捕捉剤を提供することにある。
本発明の第１の態様によれば、少なくとも第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含む、リガンド結合用多量体型捕捉剤であって、上記第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖は、それぞれ、２〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸鎖を含んでおり、上記アミノ酸のそれぞれは、実質的に鏡像異性的に単一であり、かつ上記少なくとも第１ペプチド鎖と第２ペプチド鎖とが共有結合している、ことを特徴とする多量体型捕捉剤が提供される。
各ペプチドは、好ましくは、２〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸鎖を含んでおり、より好ましくは、２〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸鎖を含んでおり、最も好ましくは、５〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸鎖を含んでいる。
各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群から選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群から選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群から選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群から選択される。
実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸単量体としては、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物（amino acid mimetic）、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体であり得ることが理解される。実質的に鏡像異性的に単一であるアミノ酸としては、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかであることが好ましい。
第１ペプチドおよび第２ペプチドは、固相上で合成されることが好ましく、第１の態様においては、使用する前に固相からペプチドが切り離されることがより好ましい。
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、当該技術分野において十分に確立されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（たとえば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。たとえば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、同じかまたは異なる一次アミノ酸配列であり得ることは、一見して明白である。
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成され得ること、ならびに、各アミノ酸群は、同じであってもよくまたは異なるものであってもよいことは、さらに明白である。
各ペプチドは反応基をさらに含んでいることが好ましい。好ましい実施形態において、
ペプチド上にある反応基は、多量体型捕捉剤を形成するように反応する。
好ましい実施形態において、上記反応基は、ペプチド合成の間は保護されており、第１の態様における捕捉剤の生成に使用する前に、保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、たとえば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリを用いることができる。この技術によれば、側鎖が保護されているとともに、アミノ末端がフリーである樹脂結合ペプチドを産出できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準的なペプチド合成条件下において、共役可能なカルボン酸／反応基共役の任意のものと反応する。たとえば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を有するシステインが、組み込まれ得る。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが、溶液中に生じる。
上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、（ニトロ）チオピリジル活性化チオールおよび当該技術分野において周知である他の化合物から選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。上記反応基としては、チオール基がより好ましい。
ペプチド多量体を形成するために、任意の適した反応を用いることができることは理解されており、たとえば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（たとえば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガー（Staudinger）ライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。
好ましい実施形態においては、二量体が形成されており、第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、リガンド結合部位のＮ末端側もしくはリガンド結合部位のＣ末端側にあるペプチド配列中に、または二分されたリガンド結合部位に挟まれた内側に、チオール基（活性化されていても、活性化されていなくてもよい）を保持している。これらの実施形態のいずれにおいても、チオール基部分はリガンド結合残基と同じ配向性または反対の配向性を有していること、および、第１ペプチドおよび第２ペプチド内の各チオール基の位置は独立していることは、明らかである。
ペプチド内にあるアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有するようになることは明白である。たとえば、側鎖はリガンド結合のための正電荷を提供し得る。正電荷は、好ましくは、リシン残基（ペプチド鎖と正電荷との間に四つのＣＨ２基）、オルニチン残基（ペプチド鎖と正電荷との間に三つのＣＨ２基）によってもたらされ、最も好ましくは、ジアミノブチリル残基（ペプチド鎖と正電荷との間に二つのＣＨ２基を有する）によってもたらされる。
アミノ酸は、あるいは、リガンド結合のための水素結合供与体および／または受容体としての役割を果たすことができる水酸基を提供し得る。水酸基は、好ましくは、セリン残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間に一つのＣＨ２基）によってもたらされ、より好ましくは、ホモセリン残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間に二つのＣＨ２を有する）によってもたらされる。
アミノ酸は、リガンド結合のための疎水性部分を提供し得る。好ましくは、アラニン残基（ペプチド鎖とメチル基との間に一つもＣＨ２基がない）が疎水性部分をもたらし、より好ましくは、アミノブチリル残基（ペプチド鎖とメチル基との間に一つのＣＨ２基を有する）が疎水性部分をもたらす。
また、アミノ酸は、リガンド結合のための負電荷を提供し得る。負電荷は、好ましくは、グルタミン酸残基（ペプチド鎖とカルボキシレート基（carboxylate group）との間に二つのＣＨ２基）によってもたらされ、より好ましくは、アスパラギン酸残基（ペプチド鎖とカルボキシレート基との間に一つのＣＨ２基）によってもたらされる。
ペプチド鎖内にあるアミノ酸の数および配列によって、各ペプチド鎖が異なる特性を有するようになることは、当業者にとって明白である。好ましくは、当業者において周知のように、ペプチドは、コンビナトリアル方式（combinatorial manner）によりアミノ酸の群（set）から生成され、それにより、群内にあるアミノ酸の可能な組み合わせの全てを生成することができる。たとえば、群内にＮ種のアミノ酸があり、ペプチドの長さがＬである場合には、完全な群は、ＮＬ種類のペプチドを含むことになる。
好ましい実施形態においては、リガンド結合に有利になる場所に側鎖が位置するように、ペプチドが生成される。これは、例えば図１に示すように、Ｌ型アミノ酸とＤ型アミノ酸とを交互に有するペプチドを合成することによって実現する。
また、図２に示すように、ベータアミノ酸を含む群を用いてペプチドを合成してもよく、または、ペプチドの繰り返し単位あたり偶数個の原子を有する他のキラルアミノ酸単量体を用いて合成してもよい。
好ましい実施形態においては、図３に示すように、アミノ酸が一アミノ酸おきにのみ異なるようにペプチドを合成する。
この実施形態は、リガンド結合にとって最も自然で有利な間隔にて側鎖が配置されている点において有利である。
各ペプチドは、上述したタイプのアミノ酸の一つ以上を含み得ること、および、用いられる特定の組み合わせが、様々なペプチド鎖を含む捕捉剤の特性に影響を与えることは、当業者にとって明らかである。
捕捉剤が多量体であるということにより、多様性が増大していることは明らかである。たとえば、多量体型捕捉剤が二量体の場合には、二つのペプチド鎖があることにより、任意の所定のペプチド長において可能な多様性は二乗した数になる。
好ましい実施形態では、任意の所定のアミノ酸群から生成され得る可能なコンビナトリアルペプチドの、副群（subset）を用いることができる。副群は、ペプチド合成において特定のルールを含めて決定することができ、たとえば、群内における各アミノ酸の最大レベルおよび最小レベルを与えることができる。
好ましい実施形態においては、コンビナトリアルに生成された多量体型捕捉剤は、担体に結合される。
好ましくは、捕捉剤は、付着部分によって担体に結合される。
付着部分は、任意の適した部分であってよいことは理解される。付着は、たとえば、共有結合相互作用、イオン相互作用、疎水性相互作用、極性相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、アビジン−ビオチン相互作用、または他の高アフィニティな非共有結合相互作用によるものであることが理解される。好ましい実施形態においては、付着部分は疎水性部分である。別の好ましい実施形態においては、付着部分は、直接的または間接的に共有結合を形成することができる。ここで間接的とは、介在物を介していることを意味するか、または付着部分を化学修飾した後におこなうことを意味している。
好ましくは、多量体型捕捉剤は、アレイを形成するように担体に結合している。アレイが任意の使いやすい形態をとり得ることは理解される。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、“高密度”アレイの全てのタイプに適用できる。
特に好ましい実施形態において、多量体型捕捉剤は、担体上にてアセンブルされる。
アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の各部位は、異なる捕捉剤を含んでおり、より好ましくは、各部位は、捕捉剤の多数のコピーを含んでいる。
分子（たとえばペプチド）の担体への固定化に関して、用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書において交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な共有結合または非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態においては、共有結合が好ましい。しかしながら、たとえばリガンド結合を必要とする用途などに、支持体の使用を意図している条件下において、分子（たとえばペプチド）が、担体に固定化されている状態または付着している状態に通常とどまりさえすればよい。
本発明の特定の実施形態では、“官能化された”不活性な担体またはマトリクス（たとえばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている固体支持体を使用している。この官能化は、たとえば、ペプチドなどの生体分子への共有結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。そのような支持体の例としては、ガラスなどの不活性担体上に支持されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これに限定されるものではない。そのような実施形態においては、生体分子（たとえばペプチド）は介在物質（たとえばヒドロゲル）に直接共有結合をしているが、介在物質そのものは担体またはマトリクス（たとえばガラス担体）に非共有結合で結合していてもよい。用語「担体に共有結合」には、適宜、このタイプの処理を包含していると解釈すべきである。
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチド多量体が多コピー含まれている。
ペプチド分子のマルチペプチドアレイは、当業者において一般的に知られている技術を用いて製造できる。
本発明の第２の態様によれば、捕捉剤が少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含んでおり、上記第１ペプチドは、第１反応基をさらに含んでおり、上記第２ペプチドは、第２反応基をさらに含んでいる、リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法であって、上記反応基は、互いのペプチドにおいて同じか、または異なっており、上記ペプチドにある上記反応基が反応して共有結合している二量体を形成するように第１ペプチドと第２ペプチドとが反応する工程を含んでいることを特徴とする多量体型捕捉剤の製造方法が提供される。
より高次な多量体型捕捉剤を形成するために、さらなる反応基を有するさらなるペプチドが、第１ペプチドおよび／または第２ペプチドと反応し得ることは理解される。複数の他のペプチドと反応して多量体型捕捉剤を形成するように、各ペプチドは一つ以上の反応基を含み得ることもまた理解される。
第１ペプチドおよび第２ペプチドは固相上にて合成されることが好ましく、第２の態様の方法においては、使用する前に、ペプチドが固相から切り離されることがより好ましい。
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、当該技術分野において十分に確立されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（たとえば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。たとえば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、同じ一次アミノ酸配列または異なる一次アミノ酸配列であり得ることは、一見して明白である。
第１ペプチドおよび第２ペプチドは第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成でき、また、各アミノ酸群は同じでも異なるものでもよいことは明白である。
上記ペプチドは、２〜１００アミノ酸の長さであることが好ましく、２〜５０アミノ酸の長さであることがより好ましく、５〜２５アミノ酸の長さであることが最も好ましい。
各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群から選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群から選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群から選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群から選択される。
上記群内の各アミノ酸は、各単量体が実質的に鏡像異性的に単一であるという条件で、以下の単量体のいかなるものも含み得ることは理解される。すなわち、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物（amino acid mimetic）、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体である。実質的に鏡像異性的に単一であるアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかであることが好ましい。
好ましい実施形態においては、上記反応基は、ペプチド合成の間は保護されており、第２の態様の方法に使用する前に保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、たとえば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリが挙げられる。この技術によれば、側鎖が保護されており、アミノ末端がフリーである、樹脂結合ペプチドを生成できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準ペプチド合成条件において、共役できるカルボン酸／反応基共役の任意のものと反応する。たとえば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を有するシステインを、組み込むことができる。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが溶液中に生じる。
上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、（ニトロ）チオピリジル活性化チオールおよび当該技術分野において周知である他の化合物から選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。反応基としては、チオール基がより好ましい。
ペプチド多量体を形成するために、任意の適した反応を用いることができることは理解され、たとえば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（たとえば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガーライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。
図４に概略を示した反応スキームでは、様々な反応基を含むペプチドを産出するための経路を示している。
好ましい実施形態においては、二量体が構成され得、第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、リガンド結合部位のＮ末端側もしくはリガンド結合部位のＣ末端側にあるペプチド配列の一部位に、または二分されたリガンド結合部位に挟まれた内側に、チオール基（活性化されていても、活性化されていなくてもよい）を保持している。これらの実施形態のいずれにおいても、チオール基部分はリガンド結合残基と同じ配向性または反対の配向性を有していること、および、第１ペプチドおよび第２ペプチド内の各チオール基の位置は独立であることは、明らかである。
第１の態様に関して説明したように、ペプチド内にあるアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有するようになることは明白である。
第２の態様の方法によって生成される捕捉剤は、担体に付着していることが好ましい。より好ましくは、第２の態様の方法によって生成される捕捉剤は、アレイを形成するように担体に付着している。アレイが任意の使いやすい形態をとり得ることは理解される。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、“高密度”アレイの全てのタイプに適用できる。
特に好ましい実施形態において、多量体型捕捉剤は、担体上にてアセンブル（assembled）される。
アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の全ては、同じ対のペプチドを含んで構成されている。より好ましくは、アレイ上の各所定の部位には、異なる捕捉剤が含まれている。
分子（たとえばペプチド）の担体への固定化に関して、用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書において、交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な共有結合または非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態においては、共有結合が好ましい。しかしながら、たとえばリガンド結合を必要とする用途など、支持体の使用を意図している条件下において、分子（たとえばペプチド）が、担体に固定化されている状態または付着している状態に通常とどまりさえすればよい。
本発明の特定の実施形態では、“官能化された”不活性担体またはマトリクス（たとえばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている固体支持体を使用している。この官能化は、たとえば、ペプチドなどの生体分子への共有結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。そのような支持体の例としては、ガラスなどの不活性担体上に支持されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これに限定されるものではない。そのような実施形態においては、生体分子（たとえばペプチド）は、介在物質（たとえばヒドロゲル）に直接共有結合され得るが、介在物質そのものは担体またはマトリクス（たとえばガラス担体）に非共有結合にて結合していてもよい。用語「担体に共有結合」には、適宜、このタイプの処理を包含していると解釈すべきである。
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には、複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチド二量体が多コピー含まれている。
ペプチド分子のマルチペプチドアレイは、当業者において一般的に知られている技術を用いて製造できる。
本発明の第３の態様によれば、捕捉剤が少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含んでおり、上記第１ペプチドは第１反応基および付着部位をさらに含んでおり、上記第２ペプチドは第２反応基をさらに含んでいる、リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法であって、上記反応基は、互いのペプチドにおいて同じか、または異なっており、（ａ）上記ペプチドにある上記反応基が反応して多量体型構造を形成するように、第１ペプチドと第２ペプチドとが反応する工程と、（ｂ）上記付着部位を介して上記第１ペプチドを担体に付着させる工程と、を含んでおり、工程（ａ）は、工程（ｂ）の前に、または工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後に行うことができることを特徴とする多量体型捕捉剤の製造方法が提供される。
好ましくは、第１ペプチドおよび第２ペプチドは固相上に合成され、また第１ペプチドおよび第２ペプチドは同じものか、または異なるものであることができ、より好ましくは、第３の態様の方法において使用する前に、ペプチドは固相から切り離される。
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、当該技術分野において十分に確立されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（たとえば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。たとえば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
図２９は、第３の態様における捕捉剤の製造方法を概略的に表す図である。
単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。所望であれば、合成の間はＸを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでおり、上記反応基Ｙは合成の間は保護され、その後、使用する前に保護がはずされるものであってもよい。所望であれば、合成の間Ｚも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
群（Ａ）の単量体ユニットのそれぞれを固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。
群（Ｂ）の単量体ユニットのそれぞれを固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｄ）を得る。
次いで、群Ｄの単量体ユニットのそれぞれを、アレイの空間符号化部位において、固体支持体（Ｅ）表面に接触させ、このときに上記表面への付着にＺが用いられるようにする。
次いで、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｇ）を形成するように、群Ｄ由来の表面結合単量体ユニット（Ｆ）を、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）と反応させる。
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
図３０は、第３の態様における捕捉剤の第２の製造方法を概略的に表す図である。
この実施形態においては、単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。上記反応基Ｘは、合成の間は保護され、その後、使用する前に保護がはずされるものであってもよい。
また、単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでいる。上記反応基Ｙは、合成の間は保護され、その後、使用する前に保護をはずすものであってもよい。所望であれば、合成の間Ｚも保護し、その後、使用する前に保護がはずされてもよい。
単量体ユニット（Ｂ）のそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。次いで、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｄ）を形成するように、群（Ａ）由来の所定の固相結合単量体ユニットを、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）と反応させる。
次いで、固相に結合している各二量体構造（Ｄ）を固体支持体から切り離し、溶液中に二量体構造（Ｅ）を得る。
二量体構造が部分Ｚを用いて固体表面（Ｆ）に付着するように、各液相二量体構造（Ｅ）を、最終的に、アレイ内の空間符号化部位において、固体表面（Ｆ）と接触させる。
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用され得る。
図に示したＸ、ＹおよびＺの位置は説明のための単なる例示であり、本発明をこれに限定してみるべきではない。
図３１は、第３の態様における捕捉剤のさらなる製造方法を概略的に表す図である。
単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。所望であれば、合成の間はＸを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでいる。上記反応基Ｙは、合成の間は保護され、その後、使用する前に保護をはずすものであってもよい。所望であれば、合成の間Ｚも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
群（Ａ）の単量体ユニットのそれぞれを固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。
群（Ｂ）の単量体ユニットのそれぞれを固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｄ）を得る。
次いで、二量体構造がＺを用いて固体表面（Ｆ）に付着するように、また、残基Ｘが残基Ｙと反応して固相に結合している二量体構造（Ｇ）を形成するように、群Ｄの単量体ユニットを、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）に接触させ、アレイの空間符号化部位において、固体支持体（Ｅ）の表面に接触させる。
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用され得る。
本発明の最も重要な利点は、アレイ表面における単量体ユニットの対（またはさらに大きい数）のコンビナトリアルな結合によって、配列の多様性が“二乗化”（またはさらに高い次数のべき乗化）されることである。
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、同じかまたは異なる一次アミノ酸配列であり得ることは、一見して明白である。
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成され得ること、ならびに、各アミノ酸群は、同じであってもよくまたは異なるものであってもよいことは、さらに明白である。
各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群から選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群から選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群から選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群から選択される。
上記群における各アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体であり得ることが理解される。アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかであることが好ましい。
上記群における各アミノ酸は、実質的に鏡像異性的に単一であることが理解される。
好ましい実施形態においては、上記反応基は合成の間保護されており、上述したように、第３の態様における方法を使用する前に保護がはずされる。
上記反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、（ニトロ）チオピリジル活性化チオールおよび当該技術分野において周知である他の化合物からなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、反応基はチオール基である。
ペプチド多量体を形成するために、任意の適した反応を用いることができることは理解され、たとえば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（たとえば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガーライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。
第１の態様に関して説明したように、ペプチド内にあるアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有するようになることは明白である。
好ましい実施形態においては、二量体が構成され、第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、リガンド結合部位のＮ末端側もしくはリガンド結合部位のＣ末端側にあるペプチド配列の一部分に、または二分されたリガンド結合部位に挟まれた内側に、チオール基（活性化されていても、活性化されていなくてもよい）を保持している。これらの実施形態のいずれにおいても、チオール基部分はリガンド結合部位と同じ配向性または反対の配向性を有していること、および、第１ペプチドおよび第２ペプチド内の各チオール基の位置は独立であることは、明らかである。
付着部分は、任意の適した部分であってよいことは理解される。付着は、たとえば、共有結合相互作用、イオン相互作用、疎水性相互作用、極性相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、アビジン−ビオチン相互作用、または他の高アフィニティ非共有結合相互作用によるものであり得ることが理解される。好ましい実施形態において、付着部分は、疎水性部分である。別の好ましい実施形態において、付着部分は、直接的または間接的のいずれかにおいて、共有結合を形成することができる。ここで間接的とは、介在物を介していることを意味するか、または付着部分を化学修飾した後におこなうことを意味している。
特に好ましい実施形態において、多量体型捕捉剤は、担体上にてアセンブルされる。
捕捉剤が担体上に“配列される（arrayed）”と、アレイは任意の使いやすい形態をとることができる。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、“高密度”アレイの全てのタイプに適用できる。
第３の態様における捕捉剤は、アレイ上の個別の空間符号化部位に配置されていることが好ましい。好ましくは、アレイ上の所定の場所にある上記捕捉剤の全ては、ペプチドの同じ対を含んで構成されている。より好ましくは、アレイ上の各部位には互いに異なる捕捉剤が含まれている。
分子（たとえばペプチド）の担体への固定化に関して、用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書において交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な、共有結合または非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態においては、共有結合が好ましい。しかしながら、たとえばリガンド結合を必要とする用途など、支持体の使用を意図している条件下において、分子（たとえばペプチド）が、担体に固定化されている状態または付着している状態に通常とどまりさえすればよい。
本発明の特定の実施形態では、“官能化された”不活性担体またはマトリクス（たとえばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている固体支持体を使用しており、官能化は、たとえば、ペプチドなどの生体分子への共有結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。そのような支持体の例としては、ガラスなどの不活性担体上に支持されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これに限定されるものではない。そのような実施形態においては、生体分子（たとえばペプチド）は介在物質（たとえばヒドロゲル）に直接共有結合をしているが、介在物質そのものは担体またはマトリクス（たとえばガラス担体）に非共有結合で結合していてもよい。用語「担体に共有結合」には、適宜、このタイプの処理を包含していると解釈すべきである。
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチド二量体が多コピー含まれている。
ペプチド分子のマルチペプチドアレイは、当業者において一般的に知られている技術を用いて製造できる。
態様１、２および３における捕捉剤は、任意の適した方法により、任意の適した担体に接触させることができる。好ましい実施形態においては、捕捉剤は、共有結合にて担体に付着している。
捕捉剤を担体に共有結合させるための好ましい反応スキームとしては、スルフヒドリル（sulfhydryls）とマレイミド誘導化表面との間の反応、マレイミド誘導化表面とジエン官能化捕捉剤との間のディールス−アルダー反応、アジドおよびアセチレン３＋２付加環化反応、チアゾリジン環形成、ならびに改変シュタウディンガーライゲーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、捕捉剤の担体への共有結合は、入れ換えた方法、たとえば、チオール誘導化表面とマレイミド置換ペプチドとの間の反応によっても、成立し得る。
特に好ましい実施形態においては、捕捉剤を担体に共有結合させるために、チオエステル誘導化捕捉剤と、アミノ基およびシステインのスルフヒドリル基の両方が存在するシステイン誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションが用いられる。
最も好ましい反応スキームでは、図５に示すように、Ｎ末端システインを有する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションを用いている。
ネイティブケミカルライゲーションでは、ペプチド上のＮ末端システインと表面付着チオエステルとの間のペプチド結合が形成される。本発明のこの実施形態における特に有利な点は、ペプチド側鎖の保護が必要ないという点である。本発明のこの実施形態におけるさらに特に有利な点は、形成される表面付着ペプチドが、ジスルフィド結合形成による二量体レセプターの形成に利用され得る内部システイン、またはチオールとマレイミド官能化ペプチドとの間の反応に利用され得る内部システインを保持する点である。
チオエステル官能化ガラス表面の調製における好ましい反応スキームを図６に示す。
上述の態様において説明したように、担体に共有結合する前に多量体型捕捉剤を形成することが可能であり、または、多量体型捕捉剤を担体そのものの上にてアセンブルさせることも可能である。捕捉剤を担体表面にてアセンブルさせる場合における好ましい反応スキームは、図７に示されている。この実施形態において、第１ペプチドは、チオエステル基とＮ末端システイン残基との間のネイティブケミカルライゲーションの反応を介して、官能化担体に共有結合している。多量体型捕捉剤は、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することによって形成される。
チオエステル表面を調製するためのより好ましい経路としては、アミノ化表面と下記タイプのチオラン２，４−ジオンとの間の反応が挙げられる。
チオエステル表面は、下記タイプのチオエステルシリルクロライド共役を用いた水酸化表面の誘導化によっても形成できる。
本発明の第４の態様によれば、少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含み、上記第１ペプチドは、複数の疎水性アミノ酸残基および複数の非疎水性アミノ酸残基を含んでおり、上記第１ペプチドのアミノ酸は、ペプチド側鎖が疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を形成するように、上記第１ペプチドの一次構造中に配置されており、上記第２ペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および複数の非疎水性アミノ酸残基を含んでおり、上記第２ペプチドのアミノ酸は、アミノ酸側鎖が疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を形成するように、上記第２ペプチドの一次構造中に配置されている、ことを特徴とするリガンド結合用捕捉剤が供給される。
図８に示すように、上記第１ペプチドは疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を含んで構成されていることが好ましい。
疎水性面および実質的な非疎水性面となるような側鎖の配置となる他のペプチド配列を容易に設計できることは、当業者によって理解される。たとえば、疎水性残基の間にある３つの非疎水性アミノ酸残基、または奇数個のアミノ酸の任意の組み合わせが挙げられる。または、ペプチドは、疎水性面および実質的な非疎水性面となるように、たとえば、Ｌ型、Ｄ型およびベータアミノ酸の組み合わせを含んでいてもよい。
第１ペプチドは、好ましくは、４〜４０個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、６〜２５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
リガンド結合面にあるように配置されている各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群より選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群より選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群より選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群から選択される。
各アミノ酸単量体は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体であり得ることが理解される。好ましくは、アミノ酸はＬ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかである。
各アミノ酸は、実質的に鏡像異性的に単一であることが好ましい。
リガンド結合面に配置されているアミノ酸は、たとえばアミノ酪酸残基（aminobutyrate residues）などの疎水性残基を含み得ることが理解される。
第１ペプチドは、好ましくは、疎水性アミノ酸残基を１０％〜９０％含んでおり、より好ましくは、２０％〜８０％含んでおり、さらに好ましくは、３０％〜７０％含んでおり、最も好ましくは、４０％〜６０％含んでいる。
特に好ましい実施形態においては、第１ペプチドは、５０％の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
疎水性面を形成する疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン（norleucine）、バリン、ノルバリン（norvaline）、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンである。
好ましい実施形態においては、実質的に非疎水性であるリガンド結合面がリガンド結合しやすいように、捕捉剤は疎水性担体上に位置している。
好ましくは、担体とペプチドの疎水性面との間の疎水性相互作用によって、捕捉剤は疎水性担体に結合している。
担体としては任意の適した疎水性担体、たとえば、疎水性有機チオール処理によって修飾された金、表面処理により修飾されたガラスまたはプラスチックが使用可能であることが理解される。好ましくは、担体はプラスチックである。
または、実質上水性である溶媒の存在下において、捕捉剤を自身に固定化できる疎水性化合物によって、担体をコートしてもよい。
第１ペプチドを疎水性担体に接触させる前に、または接触と同時に、または接触させた後に、ペプチド二量体を第１ペプチドおよび第２ペプチドからアセンブルできることは明白である。特に好ましい実施形態において、ペプチド二量体は疎水性担体上にてアセンブルされる。
好ましい実施形態において、第２ペプチドは、第１ペプチドよりもアミノ酸の数が少なく、また、ペプチドと疎水性面との間の相互作用が相対的に弱くなるように、疎水性残基の数がより少なくなっている。この実施形態において、第２ペプチドは、第１ペプチドと二量体化したときにのみ、疎水性担体に保持される。
第１ペプチドおよび第２ペプチドの長さならびに担体上に保持されるのに必要な疎水性アミノ酸残基の数は、表面の疎水性ならびに第１ペプチドおよび第２ペプチド内の疎水性アミノ酸次第であり、また結合されるリガンドの性質にもよることは、当業者にとって明白である。
担体に保持されるペプチドの量は、担体が供される洗浄のストリンジェンシー次第であることは、当業者にとって、一見して明白である。ペプチドの固定化の後、担体をたとえば１．０Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により洗浄することが好ましい。
第２ペプチドは、疎水性面に、好ましくは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、２〜５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、２〜４個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれにおいて、実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置しているリガンド結合残基の数は、好ましくは１０以下であり、より好ましくは８以下であり、より好ましくは６以下であり、さらに好ましくは４以下であり、最も好ましくは３以下である。
第４の態様における捕捉剤は、当該技術分野において周知のコンビナトリアル手法によって、アミノ酸の複数の群から生成されることが好ましい。
好ましくは、ペプチドはルールセット（a set of rules）にしたがって生成され、さまざまなリガンド結合特性を有するペプチドになる。
第１ペプチドおよび第２ペプチドは固相上に合成されることが好ましく、第４の態様の方法においては、使用する前に、ペプチドが固相から切り離されることがより好ましい。
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、当該技術分野において十分に確立されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（たとえば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。たとえば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドが、互いに同じ一次アミノ酸配列または異なる一次アミノ酸配列であり得ることは、一見して明白である。
第１ペプチドおよび第２ペプチドは第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成でき、また、各アミノ酸群は互いに同じでも異なるものでもよいことはさらに明白である。
好ましくは、上記第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、少なくとも１つの反応基を含んでいる。好ましい実施形態においては、ペプチド上にある反応基は、多量体型捕捉剤を形成するように反応する。
好ましい実施形態においては、上記反応基は、ペプチド合成の間は保護されており、第４の態様における捕捉剤の生成に使用する前に保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、たとえば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリがある。この技術によれば、側鎖が保護されておりアミノ末端がフリーである樹脂結合ペプチドを形成できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準ペプチド合成条件において、共役できるカルボン酸反応基共役の任意のものと反応する。たとえば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を保持するシステインを、組み込むことができる。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが、溶液中に生じる。
ペプチド多量体を形成するために、任意の適した反応を用いることができることは理解され、たとえば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（たとえば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガーライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。好ましい実施形態においては、ペプチド多量体は、ジスルフィド結合形成によって形成される。
反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造における任意の適した場所に配置され得ることは理解され、たとえば、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面で、かつリガンド結合部位のＮ末端側にあるように、反応基が一次ペプチド配列中に配置され得る。
または、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置し、第１ペプチドにおいてはリガンド結合部位のＮ末端側に位置し、第２ペプチドにおいてはリガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置され得る。
さらなる実施形態では、第１ペプチドにおいては、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面であり、リガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、また第２ペプチドにおいては、リガンド結合部位に対して反対側の（疎水性の）面であり、リガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置され得る。
好ましい実施形態において、図９に示すように、第１ペプチドの反応基は、一次アミノ酸構造中において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面であり、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、第２ペプチド中において、疎水性面であり、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置している。
上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールならびに当該技術分野において周知である他の化合物から選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。反応基としては、チオール基がより好ましい。反応基がチオール基である場合には、少なくとも１つのチオール基が活性化チオールであることが好ましい。好ましくは、チオール基は、ニトロチオピリジル基またはチオピリジル基で活性化されている。
第１の態様に関して説明したように、ペプチド内にあるアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有するようになることは明白である。
好ましくは、第４の態様の捕捉剤は、アレイを形成するように担体に結合している。アレイが任意の使いやすい形態をとることができることは理解される。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、“高密度”アレイの全てのタイプに適用できる。
アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の各部位には、異なる捕捉剤が含まれており、より好ましくは、各部位には、捕捉剤の多数のコピーが含まれている。
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、配列番号１に示される構造を有している；
（Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）ｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｐｈｅ−Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
ここでＸ、ＹおよびＺはリガンド結合残基であり、Ｃｙｓは二量体形成に用いられる求核チオールを提供する。
第２ペプチドは、配列番号２に示される好ましい構造を有している；
ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐ−Ｘ’−Ｐｈｅ−Ｙ’−Ｐｈｅ−Ｚ’−Ｐｈｅ
ここで、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はリガンド結合残基であり、ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐは二量体形成に用いられる活性化チオール（最も好ましくは、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基のいずれかで活性化されているチオール）である。
上記の好ましい実施形態は、例示のみを目的としており、限定して解釈すべきではないことは理解すべきである。多くの他の反応基および活性化基を本発明に採用できることは、当業者にとって明白である。
最も好ましい実施形態においては、本発明のいずれの態様における捕捉剤も、組み合わせが多様な二量体の、アドレス可能な空間符号化アレイを形成するために、適した担体上に分注される。好ましくは、ペプチドは、非接触型ディスペンサー（たとえばＰｉｅｚｏｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、パーキンエルマーＬＡＳ）を用いて個々に担体上に分注され、ｉｎ ｓｉｔｕでアセンブルされる。
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１または第４の態様における少なくとも１つの捕捉剤が固定化されている担体を提供する。
本発明のまたさらなる態様によれば、本発明の第２または第３の態様における少なくとも１つの捕捉剤が固定化されている担体を供給する。
本発明によれば、関心のあるリガンドを結合している多量体型捕捉剤の検出方法であって、任意の上述の態様に係るコンビナトリアル捕捉剤のアレイを製造する工程と、上記関心のあるリガンドを上記アレイに接触させる工程と、上記リガンドを結合している捕捉剤を検出する工程と、を含むことを特徴とする検出方法もまた提供される。
捕捉剤へのリガンドの結合を当該技術分野において周知であるさまざまな方法によって同定できることは、当業者にとって明白であり、たとえば、リガンドが結合しているアレイ上の位置を同定できるように、リガンドまたは捕捉剤を標識化してもよい。この標識は、たとえば、放射性標識、または、たとえば蛍光プローブを用いた蛍光標識であり得る。または、関心のあるリガンドの捕捉剤への結合を、当該技術分野において周知の他のさまざまな技術を用いて検出してもよく、たとえば、熱量測定、吸光光度法、ＮＭＲ法、原子間力顕微鏡および走査型トンネル顕微鏡を用いた方法、電気泳動またはクロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴検出、弾性表面波検出ならびにマイクロカンチレバーに基づく多くのアプローチがある。
捕捉剤が結合する特定のリガンドは、捕捉剤を形成しているペプチドの長さおよび配列によって決まるので、本発明に係る多量体型捕捉剤および多量体型捕捉剤のアレイは、選択した任意の検出物質（analyte of choice）の同定に使用できる。好ましい実施形態においては、リガンドとしては、真核細胞、原核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、プリオン、胞子、花粉粒、アレルゲン、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、有機化合物または無機化合物が含まれる。リガンドは、好ましくは、生理代謝産物または薬理代謝産物であり、最も好ましくは、診断または予後医療マーカーとして用いることができる、人もしくは動物の体液中にある生理代謝産物または薬理代謝産物である。
本発明のさらなる目的、特徴および長所は、以下の記述で明らかになる。さらに、本発明の利点は、図面を参照する以下の説明によって明らかになる。
〔発明を実施するための最良の形態〕
ここで使用される用語「スペーサーアミノ酸」は、側鎖がリガンド結合に関与しないアミノ酸であって、アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸類似物またはアミノ酸模倣物を意図する。
ここで使用される用語「捕捉剤」は、リガンドが当該捕捉剤に接触したとき、リガンドに結合するような構造を有するペプチド分子を意図する。
ここで使用される用語「多量体型捕捉剤」は、少なくとも２つの連結されたサブユニットを含む捕捉剤を意図する。
ここで使用される用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸残基を含む鎖を意図し、合成アミノ酸、アミノ酸類似物、アミノ酸模倣物、またはこれらのいずれかの組み合わせを意図する。用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中において交換可能に使用される。
ここで使用される用語「実質的に鏡像異性的に単一」は、残基が実質的に１種類の鏡像異性体を含み、他の種類の鏡像異性体は不純物としてのみ含むことを意図する。
ここで使用される用語「リガンド結合に好ましいように配置する」は、多量体捕捉剤を形成するペプチドの側鎖が、リガンドに接触し相互作用し得るように配置することを意図する。
ここで使用される用語「実質的に非疎水性」は、疎水性残基よりも親水性残基を実質的に含むことを意図する。
〔実施例１〕
有機溶媒層中または疎水性表面上におけるペプチドのセルフアセンブリを実証するために、以下の一連のペプチドを合成した。ペプチドのセルフアセンブリは、上記有機溶媒層または疎水性表面に接触する水溶性溶媒中において、エントロピー効果により引き起こされる。
全てのペプチドのＮ末端を、ローダミン色素ＴＡＭＲＡで標識した。５−ＴＡＭＲＡおよび６−ＴＡＭＲＡの混合物を標識に用いた。
以下では、紙面の前に突き出す残基の側鎖は、組み合わせ多様な「リガンド結合面」に相当する。紙面の後ろへ突き出す残基の側鎖は、「疎水性面（あるいはネガティブコントロール残基）」に相当する。
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−８のペプチド群において、４つの側鎖（アスパラギン酸、アラニン、セリン、およびリシン）の混合物を用いた。２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１６のペプチド群において、４つの親水性（アスパラギン酸）の鎖を用いた。
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−４のペプチド群、および２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１２のペプチド群において、５残基の側鎖を「疎水性面（またはネガティブコントロール残基）」に用いた。２ＤＯＳ−５〜２ＤＯＳ−８のペプチド群、および２ＤＯＳ−１３〜２ＤＯＳ−１６のペプチド群において、３残基の側鎖を「疎水性面（またはネガティブコントロール残基）」に用いた。
２ＤＯＳ−１、２ＤＯＳ−５、２ＤＯＳ−９、および２ＤＯＳ−１３のペプチドにおいては、ノルロイシル残基を「疎水性面」に用いた。２ＤＯＳ−２、２ＤＯＳ−６、２ＤＯＳ−１０、および２ＤＯＳ−１４のペプチドにおいては、フェニルアラニン残基を「疎水性面」に用いた。２ＤＯＳ−３、２ＤＯＳ−７、２ＤＯＳ−１１、および２ＤＯＳ−１５のペプチドにおいては、セリン残基を、「疎水性面」に対する弱いネガティブコントロールとして用いた。２ＤＯＳ−４、２ＤＯＳ−８、２ＤＯＳ−１２、および２ＤＯＳ−１６のペプチドにおいては、アスパラギン酸残基を、「疎水性面」に対する強いネガティブコントロールとして用いた。
標準ＦＭＯＣ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｌｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ペプチドを２μｍｏｌ単位で合成し、５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中に１０μＭになるように溶解した。
疎水性面（ポリプロピレンマイクロタイタープレートのウエル）上における、２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチドの保持を調べた。
５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡの溶媒として用いた。
１０μＭの２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド、および１０μＭのＴＡＭＲＡを、１００μｌずつ等分し、図１０に示すように、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウエルに入れた。
このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さ（scan height）を＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。
ペプチドが乾燥するように、一晩中暗所で乾燥させ、マイクロタイタープレートを再び上述したようにスキャニングした。
次いで、２５０μＬの水でウエルを１０回洗浄した。
残りの表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μｌに再懸濁し、マイクロタイタープレートを、再び、上述したようにスキャニングした。
蛍光画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
３回の実験で得られた、６００Ｖ、５００Ｖ、４００Ｖおよび３００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図１１に示す。
定量化データ（４００Ｖでスキャンしたときのデータを用いた）を表２に示し、グラフを図１２に示した。
この結果から、フェニルアラニン残基は、ノルロイシル残基よりも強い保持を引き起こすことが示された。この結果から、さらに、５つの疎水性「アンカー残基」を有するペプチドの方が、３つの疎水性「アンカー残基」を有する同等ペプチドよりもよく保持されることが示された。リガンド結合残基を、アスパラギン酸、アラニン、セリンおよびリシンから、４つのアスパラギン酸残基が連続したものに変更すると、ポリプロピレン表面における保持の低下が引き起こされる。
さらなる実験を、表３に示すＰ１−１〜Ｐ１−５のペプチド、およびＰ２−１〜Ｐ２−２のペプチドの、ポリプロピレン表面における保持を調べるために行った。
ポリプロピレンシートを、使用前に５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液を用いて拭いた。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＰ１−１〜Ｐ１−５のペプチド １μＭ、Ｐ２−１〜Ｐ２−２のペプチド １μＭ、およびＴＡＭＲＡ １μＭの、８×複製２０ｎｌ量を、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）を用いて、１ｍｍ間隔で、３”×１”×１ ｍｍポリプロピレンシートに分注した。「サイドシュート」オプションを用いて、前もって５００滴分注した。また、チューニングを３０μｓ、７２Ｖに設定した。
このスライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。このとき、６００ＶのＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテン（platen）に設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。蛍光画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
スライドの下半分（テストアレイを含む）を１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む１Ｍ ＮａＣｌ １００ｍｌ中で１分間洗浄し、上述したように再スキャニングした。
同じスライドの半分を、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む１Ｍ ＮａＣｌ １００ｍｌ中で３０分間、２回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
同じスライドの半分を、１００ｍｌの水で３０分間、３回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
様々なアレイの蛍光画像を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。
図１３Ａおよび図１３Ｂに示した、配列した様々なペプチドからの蛍光値を、以下の表４〜６に示す。
一回目の洗浄後のデータを表４ａおよび表４ｂに示す。
二回目の洗浄後のデータを表５ａおよび表５ｂに示す。
三回目の洗浄後のデータを表６ａおよび表６ｂに示す。
これらの結果をグラフ化し、図１４に示す。
この図は、ペプチド鎖長の増加に伴ってペプチドの保持が増加することを明確に示す。明確に示すように、１９アミノ酸の鎖長を有するペプチドＰ１−５が、最も高い保持を有する。
〔実施例２〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着させたペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）のｐＨ耐性を調べた。
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のペプチド２ＤＯＳ−２を、５０μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウエル中で乾燥させた。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥させた。
乾燥したペプチドサンプルの最初の１１ウエルを、表７に示すスキームにしたがって、１００ｍＭ リン酸緩衝液 ２００μｌ中で、室温にて３０分間インキュベートした。
上清を全てピペットで吸い取り、１２ウエルの全てに残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０μｌに再懸濁した。そして、このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ポリプロピレン上に付着した２ＤＯＳ−２のｐＨ耐性を示す蛍光画像を、図１５に示す。
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表８に示し、グラフ化したものを図１６に示す。
この結果は、ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、幅広いｐＨ範囲において安定しており、低ｐＨおよび高ｐＨにおいて最大の保持を示し、おおよそｐＨ６．５で最小の保持を示した。
〔実施例３〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）の時間依存持続性を、水性バッファの存在下で、以下に示すように調べた。
７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、５μＭ ペプチド２ＤＯＳ−２を、１００μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートの上部列のウエルに分注した。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥させた。
ウエル１〜１０内で乾燥させたペプチドサンプルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、１Ｍ ＮａＣｌ ２５０μｌと共に、以下に示す時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、全ての上清を、ピペットにより８回出し入れし、その後取り出して、マイクロタイターの下列のウエルに入れた。
１２ウエル全てに残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌ中に再懸濁し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０ フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中サンプルを圧縮した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２の、水性バッファ存在下における時間依存持続性に対する蛍光データを、図１７に示す。
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表９および図１８に示す。
この結果は、疎水性ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、１Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中への懸濁時間を増加させても、安定であったことを示す。
〔実施例４〕
異なる形状のポリプロピレンウエル上における、２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド（上記参照）の保持を調べた。
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡのための溶媒として用いた。
１０μＭの２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド、１０μＭのおよびＴＡＭＲＡを、１μｌずつ等分し、図１９に示すスキームに従って、ＣｏｓｔａｒＶ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、およびＧｒｅｉｎｅｒ平底ポリプロピレンマイクロタイタープレートにピペットで入れた。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥した。
マイクロタイタープレートの上部２列のペプチドサンプルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１Ｍ ＮａＣｌ ２５０μｌ中で、室温で１５分間インキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウエル中で、洗浄バッファをピペットにて８回出し入れした。
洗浄および非処理のペプチドサンプルを、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌ中に再懸濁した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中サンプルを圧縮した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ＰＭＴ電圧６００Ｖおよび５００Ｖにおいてスキャニングしたプレートの蛍光画像を、図２０に示す。
Ｖ底ウエルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１０および図２１に示す。
平底ウエルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１１および図２２に示す。
この結果は、異なる形状のポリプロピレンウエル上における、２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチドの保持は同等であり、ペプチドの保持は、Ｖ底形状のウエルでの乾燥に依存しないことが示す。
〔実施例５〕
ポリプロピレンおよびポリスチレン表面における２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド（上記参照）の保持を比較した。
７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡのための溶媒として用いた。
５μＭの２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド、および５μＭのＴＡＭＲＡを、２０μｌずつ等分し、ＣｏｓｔａｒＶ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、ＧｒｅｉｎｅｒＶ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、およびＧｒｅｉｎｅｒＶ底ポリスチレンマイクロタイタープレートに、図２３に示すスキームに従って、ピペットで入れた。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥した。
マイクロタイタープレートの上部２列におけるペプチドサンプルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１Ｍ ＮａＣｌ ２５０μｌ中において、１５分間、室温でインキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウエル内にて、ピペットで洗浄バッファを８回出し入れした。
洗浄および非処理のペプチドサンプルを、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌ中に再懸濁した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準解像度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
６００Ｖ、５００Ｖおよび４００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたスライドの蛍光画像を、図２４に示す。
プレートの上側半分のペプチドサンプルを洗浄し、プレートの下側半分のペプチドサンプルを非処理とした。
ＣｏｓｔａｒポリプロピレンＶ底ウエルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１２に示す。
ＧｒｅｉｎｅｒポリプロピレンＶ底ウエルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１３に示す。
ＧｒｅｉｎｅｒポリスチレンＶ底ウエルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１４に示す。
これらのグラフを図２５に示す。
この結果は、３つの全ての表面において、同様のペプチドの挙動が見られることを示し、さらに、保持は、ある特定のプラスチック表面に特有の性質というよりもむしろ、ペプチドの配列特異的な性質であることが明らかになった。
〔実施例６〕
７つのフェニルアラニン基からなる「表面結合面」を有する４つのペプチドを合成した。これらのペプチドはまた、帯電残基および非帯電残基からなる中央領域と、末端から２番目の可変残基とを有している。末端から２番目の可変残基は、アラニン、セリン、システインまたはニトロピリジルチオ活性化システイン基である。
さらに、ＴＡＭＲＡ標識した４つの蛍光ペプチドもまた合成した。これらの蛍光ペプチドは、可変のＣ末端基が取り付けられたグリシン残基に取り付けられたＮ末端ＴＡＭＲＡ蛍光団を含む。上記可変のＣ末端基は、アラニン、セリン、システインまたはニトロピリジルチオ活性化システイン基である。
実施例１に示した５−ＴＡＭＲＡ異性体および６−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物を、標識として用いた。
８つのペプチドの全ての群（set）を、表１５および表１６に示した。
ＳＢ−１〜ＳＢ−４のペプチド、およびＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４のペプチドを二量体形成の調査に用いた。
２つの異なるプロトコールを使用した。「液相」プロトコールでは、ＳＢペプチドをポリプロピレン表面上で乾燥した。次いで、ＴＬＳＰペプチドを水溶液に添加し、ウエルを洗浄して、保持された蛍光材料を分析した。
「共乾燥」プロトコールでは、ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを混合し、これらの両方をポリプロピレン表面上で共に乾燥した後、ウエルを洗浄し、保持された蛍光材料を分析した。
さらに他のプロトコールでは、ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを水溶液中で混合し、ペプチド二量体を生成させるために反応させ、当該二量体をポリプロピレン表面上で乾燥させる。当該プロトコールは、従来公知の方法により容易に行い得る。
「液相」プロトコールでは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのＳＢ−１〜ＳＢ−４のペプチド ５０μｌを、表１７に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ Ｖ底マイクロタイタープレートのウエルに添加した。
サンプルを一晩、暗所にて乾燥した。１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の１００μＭのＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４のペプチド ５０μｌを、表１８に示すスキームに従って、ウエルに添加した。
サンプルを室温で１時間、暗所にてインキュベートした。上清を除去し、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１Ｍ ＮａＣｌ ２００μｌを用いて、ウエルを２回洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌを、最後にウエルに添加した。
マイクロタイタープレートをＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中サンプルを圧縮した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
「共乾燥」プロトコールでは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのＳＢ−１〜ＳＢ−４のペプチド ５０μｌを、表１９に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ Ｖ底マイクロタイタープレートのウエルに添加した。
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４のペプチド ５０μｌを、表２０に示すスキームに従って、ウエルに添加した。
サンプルを一晩、暗所で乾燥した。
ウエルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１Ｍ ＮａＣｌ ２００μｌで２回洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌを、最後にウエルに添加した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを圧縮した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
「液相」プロトコールを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図２６Ａに示す。
「液相」プロトコールにより得られた蛍光データを、表２１に示す。
結果をグラフ化し、図２６Ｂに示す。
「共乾燥」プロトコールを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図２７Ａに示す。
「共乾燥」プロトコールにより得られた蛍光データを表２２に示す。
結果をグラフ化し、図２７Ｂに示す。
ポリプロピレン表面と蛍光標識したペプチドとの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在下で、蛍光標識されたペプチドの保持によって、二量体の収率を分析した。
「液相」プロトコールにおける二量体の収率は、「共乾燥」プロトコールにおける二量体の収率よりも低いが、二量体形成の化学特異性はより良かった。最大二量体形成は、表面ペプチドが遊離チオール基を有するとき、および溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに観察された。表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するとき、表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するとき、および表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するとき、にも二量体形成が観察された。
遊離チオールに連結される遊離チオールは、単純な好気性酸化によってジスルフィド結合を形成することに起因し得る。Ｓ−ニトロピリジル活性チオールに結合するＳ−ニトロピリジル活性チオールは、残りのＳ−ニトロピリジル活性チオールと反応し得るいくつかの遊離チオールを残すような不完全なチオール活性化の結果、またはいくつかの他のメカニズムに起因するかもしれない。
「共乾燥」プロトコールの結果は、上述した結果に酷似している。この方法においては、二量体の収率は徐々に高くなるが、非特異性結合もまた高くなった。特に、表面に付けられたヒドロキシル化ペプチドと、遊離チオール基およびＳ−ニトロピリジル活性チオール基の両方を含む溶液ペプチドとの間で、いくつかの反応が観察された。
〔実施例７〕
本実施例では、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）非接触ディスペンサーを用いて、平面プラスチック表面上においてペプチド二量体を形成した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）は、高密度アレイに、ナノリットル量をピペットで移すように厳密に設計されている。液量を、圧電性電動チップにより制御した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムは、ソースプレートホルダー、超音波ウォッシュボウル、コンピュータおよびモニター、ならびにシステム溶液用のボトルを含む。
ポリプロピレンシートをＳＢＡプラスチック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂａ．ｃｏ．ｕｋ／， Ｐｒｏｐｙｌｅｘ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｓｈｅｅｔ ２４４０×１２２０×１ ｍｍ）から得た。このポリプロピレンシートを、使用前に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液によりふき取った。
表２３に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中またはコントロール溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのＳＢ−１〜ＳＢ−３のペプチド ５ｎｌの６つの１０×１０配列を、３”×１”にカットされた１ｍｍポリプロピレンシートに、分配した。
表２４に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中、あるいは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中のいずれかにおける、１００μＭのＴＬＳＰ−４ペプチド ５ｎｌの６つの１０×１０配列を、上記スポット上に分配した。
サンプルを室温で３０分間、暗所においてインキュベートした。スライドを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の５０ｍＭ ＮａＣｌ １００ｍｌで洗浄し、スライド上に水道水を１分間流した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧４００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテン（platen）に設定し、スキャニング中、サンプルを圧縮した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ポリプロピレンスライドの蛍光画像を、図２８に示した。
ポリプロピレン表面および蛍光標識したペプチドの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在下にて、蛍光標識したペプチドの保持によって、二量体収率を分析した。
表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに、二量体形成が観察された。単純なプロトコール（蒸発を防ぐためのグリセロールなしで）により、より高い二量体収率が得られた。
〔実施例８〕
本実施例では、Ｌ１−Ｐ１−１〜Ｌ１−Ｐ１−１６のペプチド、およびＬ１−Ｐ２−１〜Ｌ１−Ｐ２−１６のペプチドを含む二量体の、２０個の２５６成分マイクロアレイ（256-element microarrays）を、平行して形成した。
１ｍｍポリプロピレンシートを、１３６ｍｍ ｘ ８０ｍｍにカットし、グラスペーパーにて軽く研磨し、使用前に５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液でふき取った。
Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）を用いて、表２５に示すように、Ｐ１ペプチドの１８×６ｎｌ等分を、０．７２ｍｍ間隔にて、ポリプロピレンスライドの縦列に配列した。
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）
ＴＣＥＰ＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（tris (2-carboxyethyl) phosphine）
Ｐ１ペプチドの配列:
P1-5 TAMRA-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Phe-Ala-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-1 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-2 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-3 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-4 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-5 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-6 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-7 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-8 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-9 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-10 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-11 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-12 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-13 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-14 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-15 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-16 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥させた後、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）を用いて、表２６に示すように、０．７２ｍｍ間隔にて、９０％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ、１ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＬ１−Ｐ２ペプチドの１８×１２ｎｌ等分を、ポリプロピレンスライドの列に沿って配列した。
Ｐ２ペプチドの配列:
L1-P2-1 CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-2 CysSTP-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-3 CysSTP-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-4 CysSTP-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-5 CysSTP-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-6 CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-7 CysSTP-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-8 CysSTP-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-9 CysSTP-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-10 CysSTP-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-11 CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-12 CysSTP-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-13 CysSTP-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-14 CysSTP-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-15 CysSTP-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-16 CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-17 TAMRA-CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-18 TAMRA-CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-19 TAMRA-CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-20 TAMRA-CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥した後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０ｍｌ中で、スライドを１０分間洗浄した。
スライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
二量体の１つの１８×１８配列の蛍光画像、およびコントロールスポットを、図３２に示す。
配列させて分配した各Ｌ１−Ｐ１ペプチドの縦列の蛍光シグナルを観察した。この結果は、Ｌ１−Ｐ１ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であることを示している。また、配列させて分配したＬ１−Ｐ２ペプチドの横列の蛍光シグナルも観察した。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であることを示している。
Ｌ１−Ｐ１ペプチドのチオール基と競合（compete）する、非標識Ｐ２ペプチドおよびＴＡＭＲＡ標識されたＰ２ペプチドの両方を用いて形成された１６×１６配列の二量体蛍光と比較して、ＴＡＭＲＡ標識したＰ２ペプチドのみを有するサンプルの二量体蛍光がより強かった。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドは全て、首尾よくＴＡＭＲＡ標識されたそのカウンターパートと競合し、それゆえに、１６個の全てのＬ１−Ｐ１ペプチドと、１６個の全てのＬ１−Ｐ２ペプチドとの間で、首尾よくペプチド二量体が形成されることを示している。
上述した本発明は、同様の方法が、多くの方法に変更され得ることは明確である。このような変更は発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者にとって明白なこのような変更のすべてが、本発明の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、配列多様性が向上した合成捕捉剤を提供する。本発明に係る捕捉剤は、例えばガラスまたはシリコンのような様々な表面において機能し得るので、上記表面へのリガンド結合を可能にし、または様々なタイプのアレイを形成する。
Ｌ型アミノ酸とＤ型アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。 ベータアミノ酸を含むペプチドを示す図である。 アミノ酸が、一アミノ酸おきに異なるものであるペプチドを示す図である。 様々な反応基を含むペプチドを形成するための可能な経路を示す図である。 Ｎ末端システインを保持する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションの方法を模式的に示す図である。 チオエステル官能化ガラスを調製するための好ましい反応スキームを示す図である。 担体表面に二量体型捕捉剤を調製するための好ましい反応スキームを示す図である。 疎水性アミノ酸と非疎水性アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。 疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を有する二量体型捕捉剤の一例を示す図である。 ９６ウェルプレート中のさまざまな疎水性ペプチドの場所を示す図である。 ウェル中に様々なペプチドがあることを示している、図１０の９６ウェルプレートの蛍光画像である。 図１１の４００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。 ポリプロピレン表面上に、ポリペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。 ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。 図１３Ａおよび図１３Ｂを定量化した結果を示すグラフである。 ポリプロピレン疎水性表面上に沈着させたペプチド２ＤＯＳ−２のｐＨ抵抗性を示す蛍光画像である。 図１５の３００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。 水性バッファー存在下における、ポリプロピレン疎水性表面上に沈着させたペプチド２ＤＯＳ−２の時間依存持続性を示す蛍光画像である。 図１７の３００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。 平底９６ウェルプレートおよびＶ型底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。 洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図１９のプレートの蛍光画像である。 図２０のＶ型底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。 図２０の平底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。 ポリプロピレンおよびポリスチレンＶ型底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。 洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図２３のプレートの蛍光画像である。 図２３のポリプロピレンプレートおよびポリスチレンプレートにおける、洗浄後のさまざまなペプチドの保持率をパーセント表示したグラフである。 “液相”プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。 表２１に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。 “共乾燥（co-drying）”プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。 表２２に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。 ポリプロピレンシート上における二量体形成を示す蛍光画像である。 本発明に係る捕捉剤の第１の製造方法を模式的に示す図である。 本発明に係る捕捉剤の第２の製造方法を模式的に示す図である。 本発明に係る捕捉剤の第３の製造方法を模式的に示す図である。 ペプチド二量体の２５６成分マイクロアレイの蛍光画像である。

Claims (68)

  1. 少なくとも第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含む、リガンド結合用多量体型捕捉剤であって、
    上記第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖は、それぞれ、２〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸鎖を含み、
    上記アミノ酸のそれぞれは、実質的に鏡像異性的に単一であり、
    上記少なくとも第１ペプチド鎖と第２ペプチド鎖とは、共有結合していることを特徴とする多量体型捕捉剤。
  2. 上記少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドは、コンビナトリアル合成されることを特徴とする請求項１に記載の多量体型捕捉剤。
  3. 上記実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、２０種未満のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の多量体型捕捉剤。
  4. 上記実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、４種のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤。
  5. 上記実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤。
  6. 上記実質的に鏡像異性的に単一であるアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項５に記載の多量体型捕捉剤。
  7. 上記第１ペプチドと上記第２ペプチドとは、互いに異なるアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤。
  8. 上記ペプチドは、リガンド結合領域において、１アミノ酸おきにのみアミノ酸が異なるように合成されることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤。
  9. 上記第１ペプチドおよび上記第２ペプチドは、さらに第１反応基および第２反応基を含んでいることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤。
  10. 上記反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジン活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の多量体型捕捉剤。
  11. 上記反応基は、チオール基であることを特徴とする請求項９または１０に記載の多量体型捕捉剤。
  12. 少なくとも１つのチオール基が、活性化チオールであることを特徴とする請求項１１に記載の多量体型捕捉剤。
  13. 上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基によって活性化されていることを特徴とする請求項１２に記載の多量体型捕捉剤。
  14. 少なくとも上記第１ペプチドは、捕捉剤を担体に付着させるための付着部分をさらに含んでいることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤。
  15. 上記付着部分は、疎水性部分であることを特徴とする請求項１４に記載の多量体型捕捉剤。
  16. 上記付着部分は、直接的または間接的に共有結合を形成し得ることを特徴とする請求項１４に記載の多量体型捕捉剤。
  17. 請求項１〜１６の何れか１項に記載の多量体型捕捉剤の複数が、担体上に固定されていることを特徴とするアレイ。
  18. 上記アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の実質的に全てが、実質的に同一であることを特徴とする請求項１７に記載のアレイ。
  19. 上記アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれていることを特徴とする請求項１７または１８に記載のアレイ。
  20. 少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含んでおり、
    上記第１ペプチドは、第１反応基をさらに含んでおり、
    上記第２ペプチドは、第２反応基をさらに含んでいる、リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法であって、
    上記反応基は、上記第１ペプチドおよび第２ペプチドにおいて、互いに同じか、または異なっており、
    上記ペプチドにある上記反応基が反応して共有結合している二量体を形成するように、第１ペプチドと第２ペプチドとが反応する工程を含んでいることを特徴とする多量体型捕捉剤の製造方法。
  21. 上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から生成されることを特徴とする請求項２０に記載の製造方法。
  22. 上記第１アミノ酸群と第２アミノ酸群とは、異なるものであることを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
  23. 各アミノ酸は、４種のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０〜２２の何れか１項に記載の製造方法。
  24. 一方または両方の上記反応基は、ペプチド合成の間は保護されており、使用の前に保護がはずされることを特徴とする請求項２０〜２３の何れか１項に記載の製造方法。
  25. 上記第１反応基および第２反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジン活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項２４に記載の製造方法。
  26. 上記第１反応基および第２反応基は、チオール基であることを特徴とする請求項２４または２５に記載の製造方法。
  27. 少なくとも１つのチオール基は、活性化チオールであることを特徴とする請求項２６に記載の製造方法。
  28. 上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基によって活性化されていることを特徴とする請求項２７に記載の製造方法。
  29. 上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、固相上で合成されることを特徴とする請求項２０〜２８の何れか１項に記載の製造方法。
  30. 上記第１ペプチドは、付着部分をさらに含んでおり、
    上記付着部分を介して上記第１ペプチドを担体に付着させる付着工程をさらに含んでおり、
    上記付着工程は、上記ペプチドにある反応基が反応して二量体を形成するように第１ペプチドと第２ペプチドとが反応する工程よりも前に、または該工程と同時に、または該工程の後に行なわれることを特徴とする請求項２０〜２９の何れか１項に記載の製造方法。
  31. 上記捕捉剤は、共有結合によって上記担体に付着していることを特徴とする請求項３０に記載の製造方法。
  32. 上記捕捉剤は、上記担体表面上にてアセンブルされることを特徴とする請求項２０〜３１の何れか１項に記載の製造方法。
  33. 複数の捕捉剤が、アレイを形成するように担体に付着していることを特徴とする請求項２０、３０、３１または３２に記載の製造方法。
  34. 上記捕捉剤は、チオエステル誘導化捕捉剤とシステイン誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションによって、上記担体に付着していることを特徴とする請求項３０または３３に記載の製造方法。
  35. 上記捕捉剤は、Ｎ末端にシステインを有する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションによって、上記担体に付着していることを特徴とする請求項３４に記載の製造方法。
  36. 少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含み、
    上記第１ペプチドは、複数の疎水性アミノ酸残基および複数の非疎水性アミノ酸残基を含んでおり、上記第１ペプチドのアミノ酸は、ペプチド側鎖が疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を形成するように、上記第１ペプチドの一次構造中に配置されており、
    上記第２ペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および複数の非疎水性アミノ酸残基を含んでおり、上記第２ペプチドのアミノ酸は、アミノ酸側鎖が疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を形成するように、上記第２ペプチドの一次構造中に配置されていることを特徴とするリガンド結合用捕捉剤。
  37. 上記第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を有することを特徴とする請求項３６に記載の捕捉剤。
  38. 上記第１ペプチドは、６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項３６または３７に記載の捕捉剤。
  39. 上記リガンド結合面に位置するように配置されている上記第１ペプチドの各アミノ酸は、６種未満のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項３６〜３８の何れか１項に記載の捕捉剤。
  40. 上記第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基を２０％〜８０％含んでいることを特徴とする請求項３６〜３９の何れか１項に記載の捕捉剤。
  41. 上記疎水性面を形成する上記アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の捕捉剤。
  42. 上記疎水性面にある上記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであることを特徴とする請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の捕捉剤。
  43. 上記第２ペプチドは、上記第１ペプチドよりもアミノ酸の数が少ない鎖を含んでいることを特徴とする請求項３６〜４２の何れか１項に記載の捕捉剤。
  44. 上記第２ペプチドは、上記第１ペプチドよりも疎水性残基の数が少ないことを特徴とする請求項３６〜４３の何れか１項に記載の捕捉剤。
  45. 上記第２ペプチドは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項３６〜４４の何れか１項に記載の捕捉剤。
  46. 上記第１ペプチドに含まれる、上記実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置しているリガンド結合残基の数が、１０個以下であることを特徴とする請求項３６〜４５の何れか１項に記載の捕捉剤。
  47. 上記第２ペプチドに含まれる、上記実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置しているリガンド結合残基の数が、１０以下であることを特徴とする請求項３６〜４６の何れか１項に記載の捕捉剤。
  48. 上記実質的に非疎水性であるリガンド結合面がリガンドと結合し得るように、担体に結合することを特徴とする請求項３６〜４７の何れか１項に記載の捕捉剤。
  49. 上記担体は、疎水性担体であることを特徴とする請求項４８に記載の捕捉剤。
  50. 疎水性相互作用によって上記疎水性担体に付着することを特徴とする請求項４９に記載の捕捉剤。
  51. 上記疎水性担体は、疎水性有機チオール処理によって修飾された金、表面処理により修飾されたガラス、またはプラスチックから選択されることを特徴とする請求項４９または５０に記載の捕捉剤。
  52. 上記ペプチドの二量体が、上記担体上にてアセンブルされることを特徴とする請求項４８〜５１の何れか１項に記載の捕捉剤。
  53. 上記第１ペプチドおよび第２ペプチドはそれぞれ、少なくとも１つの反応基を含んでいることを特徴とする請求項４１〜５２の何れか１項に記載の捕捉剤。
  54. 上記第１ペプチドにある上記反応基は、一次アミノ酸構造において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面上であり、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、上記第２ペプチドにある上記反応基は、上記疎水性面内であり、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置していることを特徴とする請求項５３に記載の捕捉剤。
  55. 上記反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項５３または５４に記載の捕捉剤。
  56. 上記反応基は、チオール基であることを特徴とする請求項５５に記載の捕捉剤。
  57. 少なくとも１つのチオール基は、活性化チオールであることを特徴とする請求項５６に記載の捕捉剤。
  58. 上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基によって活性化されていることを特徴とする請求項５７に記載の捕捉剤。
  59. 上記第１ペプチドは、配列番号１に示される配列を有していることを特徴とする請求項３６〜５８の何れか１項に記載の捕捉剤。
  60. 上記第２ペプチドは、配列番号２に示される配列を有していることを特徴とする請求項３６〜５８の何れか１項に記載の捕捉剤。
  61. 請求項３６〜６０の何れか１項に記載の捕捉剤を含んでいることを特徴とするアレイ。
  62. 個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることを特徴とする請求項６１に記載のアレイ。
  63. 上記アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の実質的に全てが、実質的に同一であることを特徴とする請求項６１または６２に記載のアレイ。
  64. 上記アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれていることを特徴とする請求項６３に記載のアレイ。
  65. 請求項１７〜１９、６１〜６４の何れか１項に記載のアレイの製造方法であって、
    請求項１〜１６、３６〜５９の何れか１項に記載の捕捉剤を適した担体上に供給して、アドレス可能な空間符号化アレイを形成する工程を含むことを特徴とする製造方法。
  66. 関心のあるリガンドに結合している多量体型捕捉剤の検出方法であって、
    請求項１〜１６、３６〜６０の何れか１項に記載のコンビナトリアル捕捉剤のアレイを製造する工程と、
    上記関心のあるリガンドを上記アレイに接触させる工程と、
    上記リガンドが結合している捕捉剤を検出する工程と、を含むことを特徴とする検出方法。
  67. 上記リガンドは、真核細胞、原核細胞、ウイルスおよびバクテリオファージ、プリオン、胞子、花粉粒、アレルゲン、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、有機化合物ならびに無機化合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項６６に記載の検出方法。
  68. 上記リガンドは、生理代謝産物または薬理代謝産物であることを特徴とする請求項６６または６７に記載の検出方法。
JP2008528688A 2005-12-20 2006-12-19 リガンド結合用新規捕捉剤 Expired - Fee Related JP4846803B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0525915.5 2005-12-20
GB0525915A GB2433505A (en) 2005-12-20 2005-12-20 Capture agents for binding a ligand
PCT/JP2006/325695 WO2007072973A1 (en) 2005-12-20 2006-12-19 Novel capture agents for binding a ligand

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009518284A true JP2009518284A (ja) 2009-05-07
JP4846803B2 JP4846803B2 (ja) 2011-12-28

Family

ID=35840792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008528688A Expired - Fee Related JP4846803B2 (ja) 2005-12-20 2006-12-19 リガンド結合用新規捕捉剤

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20100105567A1 (ja)
EP (2) EP1969369B1 (ja)
JP (1) JP4846803B2 (ja)
CN (1) CN101317093B (ja)
GB (1) GB2433505A (ja)
WO (1) WO2007072973A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014210733A (ja) * 2013-04-19 2014-11-13 株式会社日立製作所 タンパク質固定化担体及びその製造方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent
CN107759799B (zh) * 2017-09-21 2020-10-23 中山大学 一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法
WO2023288108A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-19 The University Of Chicago Biocompatible surface for quantum sensing and methods thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10507778A (ja) * 1995-08-11 1998-07-28 デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド ポリペプチド：デンドリマー複合体
JP2001503849A (ja) * 1996-04-25 2001-03-21 ペンス，インコーポレイテッド バイオセンサのデバイスおよび方法
JP2005524057A (ja) * 2002-04-25 2005-08-11 へリックス バイオファーマ コーポレイション マルチサブユニット複合体のためのタンパク質相互作用系

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5200526A (en) * 1987-04-27 1993-04-06 The Governors Of The University Of Alberta Syntheses of optically pure α-amino acids from 3-amino-2-oxetanone salts
US5120829A (en) * 1989-03-20 1992-06-09 La Jolla Cancer Research Foundation Hydrophobic attachment site for adhesion peptides
CA1337639C (en) * 1989-08-01 1995-11-28 Joseph Eugene Celebuski Dna probe assay using neutrally charged probe strands
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
AU3664693A (en) * 1992-02-13 1993-09-03 Bio-Metric Systems, Inc. Immobilization of chemical species in crosslinked matrices
US5491074A (en) * 1993-04-01 1996-02-13 Affymax Technologies Nv Association peptides
JPH09506629A (ja) * 1993-12-17 1997-06-30 キュビッチョッティ，ロジャー・エス ヌクレオチドに支配された生体分子および多分子薬物の集合並びに装置
ATE177843T1 (de) * 1994-01-19 1999-04-15 Us Health Peptomere mit erhöhter immunogenizität
US5738996A (en) * 1994-06-15 1998-04-14 Pence, Inc. Combinational library composition and method
US5824483A (en) * 1994-05-18 1998-10-20 Pence Inc. Conformationally-restricted combinatiorial library composition and method
US5549748A (en) * 1995-01-12 1996-08-27 University Of Chicago Method for harvesting single crystals from a peritectic melt
US5780221A (en) * 1995-05-03 1998-07-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Identification of enantiomeric ligands
WO1997035194A2 (en) * 1996-03-21 1997-09-25 President And Fellows Of Harvard College Enantiomeric screening process, and compositions therefor
US5955379A (en) * 1996-04-25 1999-09-21 Mcgill University Biosensor device and method
US6130037A (en) * 1996-04-25 2000-10-10 Pence And Mcgill University Biosensor device and method
JP2000510233A (ja) * 1996-04-25 2000-08-08 ペンス，インコーポレイテッド バイオセンサ装置および方法
US6107080A (en) * 1996-04-25 2000-08-22 Mcgill University Biosensor device and method
US6709814B1 (en) * 1998-04-02 2004-03-23 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Peptides causing formation of compact structures
US7115396B2 (en) * 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
CN1262561C (zh) * 1999-02-12 2006-07-05 布克旺制药有限公司 干扰细胞内信号发生的合成多肽
AU2898500A (en) * 1999-03-02 2000-09-21 Helix Biopharma Corporation Biosensor device and method
PL354122A1 (en) * 1999-08-09 2003-12-29 Tripep Abtripep Ab Pharmaceutical compositions containing tripeptides
US6994964B1 (en) * 1999-09-01 2006-02-07 Affymetrix, Inc. Macromolecular arrays on polymeric brushes and methods for preparing the same
US8143195B2 (en) * 2000-01-24 2012-03-27 Yingjian Wang Arrays for bringing two or more reagents in contact with one or more biological targets and methods for making and using the arrays
US7429466B2 (en) * 2000-01-24 2008-09-30 Hypromatrix, Inc Methods and arrays for detecting biological molecules
US6827579B2 (en) * 2000-11-16 2004-12-07 Rutgers, The State University Of Nj Method and apparatus for rehabilitation of neuromotor disorders
AU2002253934A1 (en) * 2001-02-09 2002-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Peptides that inhibit poly-glutamine aggregation
DE60216468T2 (de) * 2001-03-09 2007-09-27 Boston Probes, Inc., Bedford Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen
US20060223114A1 (en) * 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
CA2444854A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20030157561A1 (en) * 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) * 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) * 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050053973A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
CA2458227A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Helix Biopharma Corporation Method and device for integrated protein expression, purification and detection
JP2005504309A (ja) * 2001-10-01 2005-02-10 ワン，インジアン 生体分子を検出する方法およびアレイ
AU2002364207A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Applera Corporation Heteroconfigurational polynucleotide and methods of use
CN1446923A (zh) * 2002-03-22 2003-10-08 阎小君 用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法
JP2003284552A (ja) * 2002-03-28 2003-10-07 Hitachi Software Eng Co Ltd イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法
US20040043508A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-04 Frutos Anthony G. Polymer-coated substrates for binding biological molecules
WO2005047502A1 (ja) 2002-11-22 2005-05-26 Keio University タンパク質ライブラリー及びそれを用いるスクリーニング方法
WO2004058946A2 (en) * 2002-12-22 2004-07-15 The Scripps Research Institute Protein arrays
US20060292438A1 (en) * 2002-12-23 2006-12-28 Applera Corporation; Applied Biosystems Group Heteroconfigurational Polynucleotides and Methods of Use
CN1431321A (zh) * 2003-01-28 2003-07-23 肖鹏峰 组装式化合物阵列芯片及制备方法
US20050164301A1 (en) * 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
US20060008844A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10507778A (ja) * 1995-08-11 1998-07-28 デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド ポリペプチド：デンドリマー複合体
JP2001503849A (ja) * 1996-04-25 2001-03-21 ペンス，インコーポレイテッド バイオセンサのデバイスおよび方法
JP2005524057A (ja) * 2002-04-25 2005-08-11 へリックス バイオファーマ コーポレイション マルチサブユニット複合体のためのタンパク質相互作用系

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010070154, ＤＯＷＥＲ，Ｗ．Ｊ．, "Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．", Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒ．, 1999, Ｖｏｌ．４０， Ｎｏ．１, ｐ．２６７−２６８ *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014210733A (ja) * 2013-04-19 2014-11-13 株式会社日立製作所 タンパク質固定化担体及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1969369A4 (en) 2009-04-29
GB2433505A (en) 2007-06-27
GB0525915D0 (en) 2006-02-01
US20100105567A1 (en) 2010-04-29
EP1969369A1 (en) 2008-09-17
WO2007072973A1 (en) 2007-06-28
CN101317093A (zh) 2008-12-03
EP2447718A1 (en) 2012-05-02
JP4846803B2 (ja) 2011-12-28
EP1969369B1 (en) 2012-08-01
CN101317093B (zh) 2012-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2004215030B2 (en) Method for selecting a candidate drug compound
JP4846803B2 (ja) リガンド結合用新規捕捉剤
KR20120116396A (ko) 교정 시약 및 이의 용도
JP4750187B2 (ja) リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法
WO2005075996A1 (ja) 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法
JP6615895B2 (ja) トランスグルタミナーゼ基質の同定およびそれに関する使用
WO2017093246A1 (en) System and method for identification of protease substrates
Lin et al. Controlling Surface Wettability for Automated In Situ Array Synthesis and Direct Bioscreening
JP4722998B2 (ja) 疎水性担体にリガンド結合性を付与する方法
US20220243360A1 (en) Peptide libraries having enhanced subsequence diversity and methods for use thereof
Kumaresan et al. Screening chemical microarrays: methods and applications
US10641778B2 (en) System and method for analysis of peptide synthesis fidelity
US20230212788A1 (en) New method for automated on-demand biomolecular array synthesis
AU2016251501A1 (en) Specific peptide binders to proteins identified via systemic discovery, maturation and extension process
Dong et al. Facile construction of fluorescent peptide microarrays: One-step fluorescent derivatization of sub-microscale peptide aldehydes for selective terminal immobilization
Schutkowski et al. Peptide arrays on solid supports: a tool for the identification of peptide ligands
Wang Exploring the Nature of Protein-Peptide Interactions on Surfaces

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101207

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110203

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110712

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110906

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20111011

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20111012

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141021

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees