JP2001503849A

JP2001503849A - バイオセンサのデバイスおよび方法

Info

Publication number: JP2001503849A
Application number: JP53842197A
Authority: JP
Inventors: レンノックス，アール．ブルセ; エス．ホッジス，ロバート; ティー．アービン，ランダール
Original assignee: ペンス，インコーポレイテッド; マクギルユニバーシティ
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2001-03-21
Also published as: EP0895592A1; AU2563897A; MXPA98008826A; PT895592E; IL126582A0; DK0895592T3; ATE234461T1; EP0895592B1; AU711956B2; WO1997041424A1; US6461490B1; DE69719742T2; IL126582A; DE69719742D1; US6478939B1; US6165335A; ES2194193T3

Abstract

(57)【要約】リガンドおよびレセプター間の結合事象を検出するためのバイオセンサ装置。該装置は、バイオセンサ表面および表面に結合された、好ましくは反対に荷電された、共にα−ヘリカルコイルドコイルヘテロダイマーを形成する第１および第２のペプチドの２サブユニットヘテロダイマー複合体を含む。第１のペプチドは該バイオセンサ表面に結合されており、そして第２のペプチドはリガンド結合剤による結合にアクセス可能なリガンドを有している。抗リガンド結合剤の表面結合リガンドへの結合は、適切な検出器によって検出される。リガンド特異的バイオセンサ表面は、第１の荷電ペプチドを含む汎用のテンプレートから、第２のペプチドに結合された選択されたリガンドの付加によって容易に調製され得る。

Description

【発明の詳細な説明】バイオセンサのデバイスおよび方法発明の分野本発明は、バイオセンサに関連し、特に、リガンドとリガンド結合レセプターとの間の結合事象を測定するためのバイオセンサ、およびこのようなバイオセンサを提供するための方法に関する。発明の背景生物学的分析物を検出または定量するために使用される診断的ツールは、代表的に、リガンドとレセプターとの間のリガンド特異的結合に依存する。診断において通常使用されるリガンド／レセプター結合対としては、抗原-抗体、ホルモン-レセプター、薬物-レセプター、細胞表面抗原-レクチン、ビオチン-アビジン、基質／酵素、および相補的な核酸鎖が挙げられる。検出されるべき分析物は、結合対のいずれかのメンバーであり得るか；あるいは、分析物は、相補的レセプターへの結合についてリガンドと競合するリガンドアナログであり得る。リガンド／レセプター相互作用を検出するための種々のデバイスが公知である。これらの最も基本的なのは、分析物の存在または量が、検出可能な反応産物（例えば、金免疫粒子(immunoparticle)）を測定または定量することにより検出される、単なる化学／酵素的アッセイである。リガンド／レセプター相互作用はまた、放射性標識アッセイにより検出されそして定量され得る。このタイプの定量的結合アッセイは、２つの別の構成を含む：反応基質（例えば、固相テストストリップ）および別の読み取り器または検出器デバイス（例えば、シンチレーションカウンターまたは分光光度計）。この基質は、一般的に、少量の体液サンプルからの複数分析物アッセイの取扱いに関する複数のアッセイ、または小型化に不適当である。バイオセンサ診断デバイスにおいては、対照的に、アッセイ基質および検出器表面は、単一のデバイスに組み込まれる。１つの一般的なタイプのバイオセンサは、リガンド-レセプター結合事象の存在に応答する電流またはインピーダンスの変化を検出するための電流またはインピーダンス測定要素と組み合わせられた電極表面を使用する。このタイプのバイオセンサは、例えば、米国特許第5,567, 301号に開示される。重量測定用バイオセンサは、その周波数、波長、および／または共鳴状態が結晶表面の表面質量(surfacemass)に敏感な表面音波を生成する圧電結晶(piezoele ctric crystal)を使用する。それ故、音波特性のシフトは、（例えば、リガンド -レセプター結合事象に起因する）表面質量の変化を示す。米国特許第5,478,756 号および同第4,789,804号は、このタイプの重量測定用バイオセンサを記載する。表面プラズモン共鳴(SPR)効果に基づくバイオセンサがまた、例えば、米国特許第5,485,277号および同第5,492,840号において提唱されている。これらのデバイスは、STR界面での摂動(perturbation)（例えば、結合事象）で生じるSPR表面反射角度のシフトを活用する。最後に、バイオセンサ表面での光学特性の変化を利用する種々のバイオセンサは公知である（例えば、米国特許第5,268,305号）。バイオセンサは、別の反応基質および読み取り器デバイスを有する結合アッセイシステムを超える多数の可能性のある利点を有する。１つの重要な利点は、例えば、米国特許第5,200,051号および同第5,212,050号に記載されるような、マイクロチップ製造方法を使用して小規模であるが高度に再生産可能なバイオセンサユニットを製造するような性能である。別の利点は、単一のバイオセンサユニットに組み込まれ得る、潜在的に多数の異なる分析物検出領域であり、これは、非常に少量の体液サンプルでのいくつかの分析物の敏感な検出を可能にする。これらの利点の両方は、１テストあたりの実質的なコスト節約を導き得る。バイオセンサ（特に、複数アッセイバイオセンサ）の製造における重要な要素は、バイオセンサ表面上の所望の位置での分析物特異的結合分子または酵素の配置である。理想的には、厳密なマイクロチップ製造条件下で汎用のバイオセンサ表面を構築することが望ましいが、種々の異なる表面領域フォーマットがより制限されない製造条件下で達成されることを可能にし、最終的に(at one extreme) 、末端のユーザーが汎用のチップを独特の複数分析物フォーマットに合わせることを可能にすることが望ましい。発明の要旨１つの局面において、本発明は、リガンドとリガンド結合剤との間の結合事象を検出するためのバイオセンサ装置を含む。この装置は、バイオセンサ表面および表面上に保有される２サブユニットヘテロ二量体複合体を有する。この複合体は、αヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を共に形成する第一および第二の（好ましくは、正反対に荷電した）ペプチドから構成される。第一のペプチドは、バイオセンサ表面に結合され、そしてリガンドは、リガンド結合剤による結合のための接近を可能にする第二のペプチドに共有結合される。リガンドへの抗リガンド剤の結合は、装置中の適切な検出器により検出される。第一ペプチドサブユニットは、（例えば、オリゴペプチドスペーサーまたは炭化水素鎖スペーサーを介して）バイオセンサ表面に共有結合され得るか、または安定な非共有結合（例えば、ビオチン／アビジン結合対）を介してバイオセンサ表面に結合され得る。バイオセンサ表面は、複数の領域（各々が、第二サブユニットペプチドに結合される異なる選択されたリガンドを有する）を含み得る。１つの一般的な実施態様において、バイオセンサ表面は、バイオセンサ表面の近位端に固着された炭化水素鎖から構成される単層を含み、そして曝される単層表面を規定する遊離の遠位端を有する。この実施態様におけるヘテロ二量体複合体は、好ましくは、単層中に包埋され、そしてリガンドは単層表面上またはその付近に配置される。単層は、金属（例えば、金膜）上で形成され得、そしてチオール結合によりバイオセンサ表面に近位端において結合された８〜22の炭素原子鎖から構成され得る。この鎖は、約３〜５鎖／nm²の好ましい分子密度を有し、単層の誘電率は、このような溶液の存在下であるがこのような結合レセプターの非存在下において、好ましくは約２未満である。単層リガンドへのリガンド結合剤の結合の電流測定的検出のために設計されたバイオセンサ装置において、バイオセンサ表面は電極であり、そして単層（単層に包埋されたヘテロ二量体複合体を含む）は、単層と接触する水溶液中の酸化還元イオン種により媒介される単層を横切る電流に対して有効なバリアを形成するために十分にぎっしり詰められ(close-pack)、整理される(order)。単層表面上でのリガンドへのリガンド結合剤の結合は、このような酸化還元種により媒介される、単層を横切る電流を増加するのに有効である。装置中のチャンバは、単層に接触する酸化還元種の水溶液を含むように適合化され、そして検出器は、レセプターとリガンドとの間に生じる結合事象に反応する、単層を横切るイオン媒介電流を測定するための回路を含む。表面結合リガンドへのリガンド結合剤の結合の重量測定的な検出のために設計されたバイオセンサ装置において、バイオセンサ表面は、圧電結晶である。検出器は、(i)結晶において表面音波を生成し、そして(ii)リガンドへのリガンド結合剤の結合により生成される表面音波の周波数、速度、または共鳴周波数のシフトを検出するために機能する。表面結合リガンドへのリガンド結合剤の結合の、光学的な表面プラズモン共鳴 (SPR)検出のために設計されたバイオセンサにおいて、バイオセンサ表面は、薄い金属層でコートされた透明の誘電性基質である。この金属層の上で単層が形成され、ここで基質および金属層は、プラズモン共鳴界面を形成する。検出器は、金属膜および結合された単層の光学特性に依存するプラズモン共鳴角度での表面プラズモンを励起し、そしてリガンドへのリガンド結合剤の結合により生成されるプラズモン共鳴角度におけるシフトを検出するように機能する。表面結合リガンドへのリガンド結合剤の結合の光学的検出のために設計されたバイオセンサにおいて、検出器は、光線でバイオセンサ表面を照射し、そしてリガンドへのリガンド結合剤の結合により生成される、表面層（例えば、包埋されたヘテロ二量体を有する単層）の光学特性における変化を検出するように機能する。別の局面において、本発明は、リガンドとリガンド結合レセプターとの間での結合事象を検出し得るバイオセンサ装置における使用のためのリガンド特異的バイオセンサを提供する方法を含む。この方法は、(a)バイオセンサ表面およびバイオセンサ表面に結合された第一のヘテロ二量体サブユニットペプチドを有する、バイオセンサ電極、および(b)２サブユニットαヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を形成するために第一のペプチドに結合し得る、好ましくは正反対に荷電した第二のペプチドを、一緒に接触させる工程を包含する。第二のペプチドは、リガンド特異的薬剤に特異的に結合し得る結合されたリガンドを有する。接触工程は、バイオセンサ表面にリガンドを結合させるのに有効である。バイオセンサ表面は、第一および第二の個別の領域を含み得、ここで各領域における第二のヘテロ二量体サブユニットペプチドは、異なる結合されたリガンドを有する。方法の１つの一般的な実施態様において、バイオセンサ表面は、(i)バイオセンサ表面の近位端に固着され、そして(ii)曝される単層表面を規定する遊離の遠位端を有する、炭化水素鎖から構成される単層を有する。第一のペプチドは単層中に包埋され、そして表面に結合した第一のペプチドへの第二のペプチドの結合は、好ましくは単層表面上またはその付近でリガンドを配置するために有効である。より一般的には、本発明は、アッセイ支持体表面上の異なる選択された領域に結合した、異なる選択された生物学的試薬の配列(array)を構築する方法を提供する。この方法は、支持体表面へ、第一のヘテロ二量体サブユニットペプチドの分子を（第一のペプチド分子で、表面上の異なる領域をカバーするために有効に）結合させる工程を包含する。サブユニットペプチドは、光が放出された(photo -release)場合に、ペプチドが、好ましくは正反対に荷電した第二のヘテロ二量体サブユニットペプチドと相互作用して、２サブユニットαヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を形成することを可能にする保護基を有する。照射された領域のみにおいて第一のペプチドが脱保護され、次いでアッセイ試薬を保有する第二のサブユニットペプチドと接触するのに有効な条件下で、表面は、選択された領域における表面で照射される。この接触工程は、曝された表面の領域のみに、選択された試薬を結合させることに有効である。上記工程は、異なる選択された領域およびアッセイ試薬のために、アッセイ支持体表面上の異なる選択された領域において配置された異なる選択された生物学的試薬の所望の配列が生成されるまで繰り返される。１つの実施態様において、第一のサブユニットペプチドは、１つ以上の保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基（例えば、ニトロフェノラート保護基を有するグルタミン酸基）を含む。本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて読む場合に、より完全に明らかになる。図面の簡単な説明図１ＡおよびＩＢは、本発明に関するバイオセンサ装置の部材を示し、装置中でリガンド結合剤をバイオセンサ表面に結合する前（１Ａ）および結合後（１Ｂ）の装置を図示する；図２Ａ〜２Ｃは、（２Ａ）平行α-ヘリカルヘテロ二量体コンフィギュレーションをとっている２つの例示的なヘテロ二量体サブユニットペプチドの末端ヘプタドのヘリカルホイール図（helical wheel representation）；（２Ｂ）非平行 α-ヘリカルヘテロ二量体コンフィギュレーションをとっている２つの例示的なヘテロ二量体サブユニットペプチドの末端ヘプタドのヘリカルホイール図；および（２Ｃ）α-ヘリカルヘテロ二量体コンフィギュレーションをとっている特定のペプチドのヘリカルホイール図を示す；図３Ａ〜３Ｅは、ホモ二量体対ヘテロ二量体のｅ位置およびｇ位置における荷電した残基の安定化/不安定化効果を比較した、平行コンフィギュレーションをとっている２つのヘテロ二量体サブユニットペプチドの隣接するヘプタドを概略的に示したものである；図４Ａおよび４Ｂは、HSP1サブユニットペプチドをバイオセンサ中のバイオセンサ表面にカップリングさせるための別の方法を図示する；図５Ａおよび５Ｂは、単層中に包埋された単独のK-コイルペプチド（５Ａ）および単層中に包埋されたK-コイル/E-コイルヘテロ二量体（５Ｂ）を有するバイオセンサ中のバイオセンサ表面上に形成された炭化水素鎖単層を図示する；図６は、本発明の１つの実施態様に従って構成された、電流測定バイオセンサの部材を示す；図７は、包埋されたK-コイルペプチドサブユニットを含有する図５Ａに図示されたタイプの電極に、E-コイルペプチドサブユニットを添加した後の、時間の関数としての酸化電流（黒丸）および還元電流（白正方形）における変化を示す；図８は、K-コイル/E-コイル脂質単層上に二糖リガンドを含む電極にPAKペプチドを添加した後の、時間の関数としてのFe(CN)₆ ^3-/4-の酸化（白丸）および還元（白正方形）の変化を示す；図９は、K-コイル/E-コイル脂質単層上に三糖リガンドを含む電極にベロ毒素ペプチドを添加した後の、時間の関数としてのFe(CN)₆ ^3-/4-の酸化（白丸）および還元（白正方形）の変化を示す；図10は、本発明の１つの実施態様に従って構成された、重量測定バイオセンサの部材を示す；図11は、本発明の１つの実施態様に従って構成された、表面プラズモン共鳴バイオセンサ（surface plasmon resonance biosensor）の部材を示す；図12は、本発明の１つの実施態様に従って構成された、光学バイオセンサの部材を示す；図13Ａ〜13Ｃは、本発明の１つの実施態様に従って構成されたバイオセンサ表面の照射領域へのアッセイ試薬の付加における工程を図示する；図14は、本発明の１つの実施態様に従って構成された多試験電流測定バイオセンサの一部の断面図である。発明の詳細な説明Ｉ．バイオセンサ装置図１Ａおよび１Ｂは、本発明に関する、リガンドとリガンド結合レセプターとの間の結合事象を検出するためのバイオセンサ装置20の単純化された概略図を示す。この装置は、基板24により部分的に規定される反応チャンバ22を含む。このチャンバは、チャンバ内にバイオセンサ表面26を有する。バイオセンサ表面は、そこに結合した２サブユニットヘテロ二量体複合体（例えば、複合体28）を有し、各複合体は、リガンド（例えば、リガンド30）を有し、リガンドは、以下で述べるように、リガンド/抗リガンド薬剤（その結合は、測定可能なバイオセンサ事象の「トリガー」として作用する）の２つの結合対のうちの１つを形成する。図１Ｂは、例えば34において示されるように、バイオセンサ表面上のリガンドの一部へのリガンド-結合剤の結合の後のバイオセンサ表面の状態を示す。本発明の重要な特性によれば、各ヘテロ二量体複合体（例えば、複合体28）は、（例えば、共有結合によって）バイオセンサ表面に結合した第１のペプチドサブユニット（例えば、サブユニット28a）、および、リガンドが結合する、第２の（好ましくは反対に荷電した）サブユニット（例えば、サブユニット28b）を含む。２つのペプチドは、以下で詳細に述べるように、安定な２サブユニットα -ヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体複合体への自己組立（self-assembly）のために構成され、そしてこのように構成された場合、示されるように、バイオセンサ表面上のリガンドを係留（anchor）するように作用する。チャンバは、チャンバ内に溶液または懸濁液を導入するための、少なくとも１つのポートまたは開口部32を含み得る。ここで示されるように、バイオセンサが閉じたチャンバを有する場合、チャンバは必要に応じてベント（vent）または出口ポートを含み得る。チャンバ内に導入される分析物（すなわち、アッセイされるべき化合物または材料）は、抗リガンド結合剤、あるいはリガンド結合剤に結合するための表面結合リガンドと競合し得るリガンドまたはリガンドアナログのいずれかである。分析物（すなわち、リガンド、リガンドアナログ、または抗リガンド剤）は、フリーの分子の形態であり得るか、または複合体（例えば、細胞または高分子の複合体）の一部であり得る。分析物がリガンドまたはリガンドアナログである場合、装置は、さらにリガンド結合剤を含む。リガンド結合剤には分析物が導入され得るか、またはリガンド結合剤はチャンバ内に存在し得る（例えば、チャンバ壁上で不動化されるか、またはチャンバ内において、乾燥した非結合形態で存在する）。バイオセンサ装置はまた、リガンド結合剤の存在および/またはレベル、あるいはリガンド結合剤の表面リガンドへの結合を検出するための検出器または検出手段36を含む。種々の検出器を、以下に記載する。簡便のために、図１における検出器を概略的に示す。この検出器は、図１Ｂに示すように、光線44を発生させるための光線源38、光線検出器40、ならびにリガンド結合剤の表面結合リガンドへの結合に応答する光線の変化（例えば、光線強度）を測定するための光線源および検出器に作動可能に接続された制御ユニット42を備える。Ａ．ヘテロ二量体サブユニットペプチド本発明のバイオセンサにおいて使用されるヘテロ二量体サブユニットペプチドは、２つの非同一の、好ましくは反対に荷電したポリペプチド鎖であり、代表的には、各々は長さあたり約21〜70の残基であり、２鎖（stranded）α-ヘリカル二量体コイルドコイルを形成するのに適合するアミノ酸配列を有する。これらは、本明細書中で、HSP1（ヘテロ二量体サブユニットペプチド１）およびHSP2（ヘテロ二量体サブユニットペプチド２）と命名される。以下の議論において、HSP1 とは、バイオセンサ中のバイオセンサ表面に結合したペプチドをいい、そしてHS P2とは、結合したリガンドを有するペプチドをいう。これらの命名が、実際のポリペプチド配列を示すのではなく、サブユニットペプチドにより果たされる機能的役割を示すことが理解される。水性媒体中では、単離されたヘテロ二量体サブユニットペプチドは、代表的にはランダムコイルである。HSP1およびHSP2が、α-ヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を形成するのに好適な条件下で共に混合される場合、これらは相互作用して、２サブユニットα-ヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体複合体を形成する。 α-ヘリカルコイルドコイルコンフォメーションをとっているペプチドは、各ペプチドの一次配列により決定される特徴的な様式で、互いに相互作用する：α -ヘリックスの第３次構造は、第１次配列の７アミノ酸残基が、α-ヘリックスの約２回転に対応するような構造である。従って、α-ヘリカルコンフォメーションを生じる第１のアミノ酸配列は、７残基のユニットに分解され得、その各々はヘプタドと呼ばれる。ヘテロ二量体サブユニットペプチドは、縦列の一連のヘプタドから構成される。ヘプタドの配列が、特定のヘテロ二量体サブユニットペプチド中で繰り返される場合、ヘプタドは、「ヘプタド繰り返し」または単に「繰り返し」と呼ばれ得る。各ヘプタド中の規定された部分におけるアミノ酸残基の特定の型は、２鎖α- ヘリカルコイルドコイル構造または複合体を安定化するように作用する。ヘテロ二量体ペプチドはまた、反応（ヘリックス内またはヘリックス間で）してポリペプチドのαヘリカルまたはコイルドコイルの性質を安定化し得る残基を含み得る。安定化変性の１つの例は、「ヘテロ二量体ポリペプチド免疫原キャリア組成物および方法」（発行日1995年11月23日）についてのPCT出願WO CA95/00293（本明細書中で参考として援用される）中で詳述されているように、ヘテロ二量体サブユニットペプチドの第１および最後（末端）の繰り返し中にラクタム橋（lactam bridge）を組み入れることである。 HSP1およびHSP2の二量体化は、各ペプチドの第１次アミノ酸配列中の保存されたアミノ酸残基の繰り返しヘプタドモチーフの存在に起因する。図２Ａおよび２Ｂ中で示すように、各ヘプタド中の個々の位置は、HSP1については文字ａ〜ｇで命名され、HSP2については文字ａ’〜ｇ’で命名される。適切なアミノ酸配列を有する繰り返しヘプタドモチーフは、HSP1およびHSP2ポリペプチドを、許容可能な条件下でヘテロ二量体性α-ヘリカルコイルドコイル構造に組み込むように指向する。個々のα-ヘリカルペプチドは、各ヘプタドのａ位置およびｄ位置として定義される、それらの対応する疎水性表面に沿って互いに接触する。 HSP1およびHSP2は、平行または非平行のコンフィギュレーションのいずれかで、ヘテロ二量体コイルドコイルヘリックス（コイルドコイルヘテロ二量体）に組み入れられ得る。平行コンフィギュレーションでは、２つのヘテロ二量体サブユニットペプチドヘリックスは、同じ配向を有するように整列される（アミノ末端〜カルボキシル末端）。非平行コンフィギュレーションでは、ヘリックスは、１つのヘリックスのアミノ末端が他のヘリックスのカルボキシル末端と整列するように、およびその逆に配列される。２つの相互作用しているα-ヘリックスのａ-ｇ位置の相対的配向のダイヤグラムを、図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａは、平行コンフィギュレーションで配列されている２つの代表的なヘテロ二量体サブユニットペプチド（EEおよびKK）の最初の２回転（１ヘプタド）の正面概略図（end-on schematic）を示す。図２Ｂは、非平行コンフィギュレーションで配列される、同じヘテロ二量体サブユニットペプチドの正面概略図を示す。本明細書中で示される指標に従って設計されたヘテロ二量体サブユニットペプチドは、代表的に、平行配向対非平行配向で組み立てるのに有利であることを示す。例えば、上記のPCT特許出願CA95/00293において配列番号１および配列番号２で同定される例示のペプチドは、該PCT出願中で議論される他のペプチド配列と同様に、平行コンフィギュレーションヘテロ二量体を形成する。HSP2にリガンドが結合する場合、一般に、ヘテロ二量体の遠位端を形成するペプチドの末端または付近でリガンドを結合（attach）することが望ましい。特に、ヘテロ二量体が平行コンフィギュレーションを形成する場合、HSP1ペプチドは、好ましくはそのＣ末端にてバイオセンサ表面に係留され、リガンドは、そのＮ末端にてHSP2ペプチドに結合している。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃにおいて、アミノ酸は円を描き、そして１文字コードで表されている。連続するアミノ酸位置は番号付けされ、そしてＮ末端からＣ末端への方向を指示する矢印の頭を有する線で結ばれている。２つのヘリックスの間の相互作用は、矢印によって示される。２つのヘリックス間で交差している幅広い矢印は、隣接するヘリックスのａ位置とｄ位置との間の疎水性相互作用を示す。隣接するヘリックスのｅ位置とｇ位置との間のイオン性相互作用は、ヘリックスの連鎖（nexus）の上および下の曲がっている矢印で示される通りである。図２Ａおよび２Ｂにおいて、ペプチドEEの位置ｅは、第１および最後のヘプタド中のGln、および内部ヘプタド中のGlnである。この位置とのイオン性相互作用を示す、（下側の）曲がっている矢印は、点線で描かれており、ヘリックスの内部ヘプタド間にはイオン性相互作用が存在するが、第１および最後（または末端）のヘプタドにはイオン性相互作用が存在しないことを示す。図２Ａおよび２Ｂ中のラクタム橋は、各ヘリカル内のｆ位置とｂ位置との間の直角な線として示される。ヘリックス間の疎水性相互作用は、ヘテロ二量体サブユニットペプチドのａ位置およびｄ位置の疎水性残基に起因する。ヘリックスを接触させて維持するのに有用な、これらの位置における残基には、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アラニン、および上記のいずれかの誘導体が挙げられる。アラニン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびグルタミンを含む他の残基もまた、他が疎水性残基で占められていないかぎり、いくつかのヘプタド中でａ位置またはｄ位置を占め得る。ａ位置およびｄ位置を占める特定の残基の適切な選択は、重要である。例えば、一方の位置にIleを含み、かつ他方の位置にLeuを含むヘリックス間で、疎水性相互作用が強い場合、ヘリックスの有意なフラクションは、同様に荷電した残基がｅ位置およびｇ位置に存在してホモ二量体形成を減少させる場合でさえも、pH ７においてホモ単量体を形成する。一方、ａ位置およびｄ位置における残基が、疎水性相互作用が非常に弱くなるように選択される場合（例えば、両方の位置におけるAla）、ヘリックスは、コイルドコイル二量体を全く形成し得ない。好ましくは、残基対は、pH７において95％以上のヘテロ二量体の形成を行う疎水性相互作用を促進するように選択される。pH７において95％以上のヘテロ二量体の形成をもたらす、ａ位置およびｄ位置における例示的な対には、一方の位置にLeu を含み、かつ他方の位置にValを含むものが挙げられる。これらの残基は、例示的なヘテロ二量体サブユニットペプチドのａ位置およびｄ位置に存在する。 α-ヘリックスの二量体コイルドコイルのコンフォメーションは、好ましくはまた、図３Ａおよび３Ｄに例示されるように、隣接するヘリックスのｅ位置およびｇ位置の残基間のイオン性相互作用により安定化される。二量体の各ヘリックスが１つの位置（例えば、ｅ）で正に荷電した残基および他の位置（例えば、ｇ）で負に荷電した残基を有する場合、ホモ二量体形成が好ましい（図３Ａ；図３Ｂ中のヘテロ二量体と比較のこと）。しかし、各ヘリックスが、両方の位置に同様に荷電した残基を有する場合、２つの反対に荷電したヘリックスは、ホモ二量体（図３Ｃ、３Ｅ）の形成とは反対に、会合してヘテロ二量体（図３Ｄ）になる傾向を有する。例示的なヘテロ二量体配列および合成方法については、上記のWO 95/31480を参照のこと。Ｂ．バイオセンサ表面へのリガンド結合上記のように、ヘテロ二量体中の２つのサブユニットペプチド（HSP1）のうちの一方は、バイオセンサ表面に結合しており、そして第２のペプチド（HSP2）は、分析物に依存するリガンド/抗リガンド結合反応に関与することが意図されるリガンドを含む。両方の場合において、ペプチドは合成されるか、または合成後に誘導体化されて、必要とされる結合機能およびリガンドをそれぞれ提供する。 HSP1の修飾を考慮すると、ペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて合成されて、バイオセンサ表面とペプチドのヘリックス形成部分との間のスペーサーとして機能し得るさらなる末端ペプチドを有し得る。図４Ａは、システイン残基またはメチオニン残基（これは、標準条件下でチオレート結合を介して、表面に共有結合を提供する(例えば、Dakkouri，A.S.ら、Langmuir(1996)12: 2849-2852)）で終結しているポリペプチドスペーサー48を介する金属（例えば、金）表面46に結合したHSP1ペプチドを示す。 HSP1のガラスまたはポリマー表面へのカップリングのために、Ｃ末端またはＮ末端残基は、選択されたアミン、酸、アルコール、または表面上のアルデヒド基へのペプチド末端の直接カップリングを可能にする適切な活性化官能基で誘導体化され得る。これらの基は、標準的方法に従う固相合成の間に、適切な保護基で保護されたペプチド中の他の反応性側鎖と共に導入され得る。あるいは、HSP1ペプチドは、高親和性結合反応（例えば、ペプチド上に担持されたビオチン部分と、表面に共有結合したアビジン分子との間の反応）を介してバイオセンサ表面に結合され得る。ヘテロ二量体が炭化水素鎖単層中に包埋される場合、以下に記載するように、 HSP1ペプチドをバイオセンサ表面に係留しているスペーサーは、図４Ｂにおいて、HSP1をバイオセンサ表面50に係留しているスペーサー鎖52のような炭化水素鎖であり得る。鎖は、好ましくは、二重層を構成している鎖の部分的長さを有し、その結果、組み立てられた単層中のヘテロ二量体ペプチドの遠位端が、単層の曝露された表面に存在するかまたは曝露された表面の近傍に存在する。従って、例えば、単層が18個の炭素鎖から作製される場合、スペーサーは、好ましくは、組み立てられたヘテロ二量体の長さに依存して、２〜10個の炭素の長さを有する。 ω-チオ脂肪酸の形態である炭化水素鎖スペーサーは、上記で概説したように、固相合成の間にカップリングして、末端ヒドロキシルまたはアミンのカップリングになり得る。続いて、誘導体化ペプチドは、標準的なチオレートカップリング（Dakkouri、上述）により、金属表面に結合し得る。 HSP2に対するリガンドの結合を考慮して、選択されるリガンドは試験される分析物によって決定される。リガンド-レセプター結合対(すなわち、診断において一般に使用されるリガンド/リガンド結合剤の対)は、抗原-抗体、ホルモン-レセプター、薬剤-レセプター、細胞表面抗原-レクチン、ビオチン-アビジン、基質/ 酵素、および相補核酸ストランドを含む。以下に記載のように特にリガンドが、炭化水素鎖単層に結合される場合、リガンドは、代表的には２つの結合対のメンバーのより小さい方である。しかし、結合対の両方の結合が本発明に含まれる。リガンドがポリペプチド(例えば、ペプチド抗原)である場合、抗原は固体状態または組換え法によって合成され得、構築されたヘテロ二量体の遠い方を向く、 HSP2ペプチドの末端にペプチド抗原を含む。リガンドが非ペプチド部分(例えば、非ペプチドホルモン、薬物、または核酸)である場合、HSP2ペプチドは、特異的にリガンドに誘導され得る１つ以上の残基を含有するように合成され得る。好ましくは、リガンドはHSP2の１つ以上のヘプタドのb、cおよび/またはf位でアミノ酸結合残基に共有結合している(図２A)。これらの位置は、コイルドコイルヘテロ二量体の外側面に沿って存在する。例示的な実施態様において、単結合残基はHSP2の末端ヘプタドのf位、または末端残基に設置される。この残基は、公知の方法による固体状態合成中に誘導体化され得、反応されるべき残基の選択的脱保護が可能になる。好ましい結合基はシステイン残基のチオール基であり、これは標準的な方法で容易に修飾される。他の有用な結合基は、メチオニンのチオエステル、ヒスチジンのイミダゾリル基、アルギニンのグアニジニル基、チロシンのフエノール基およびトリプトファンのインドリル基を含む。これらの結合基は当業者に公知の反応条件を用いて誘導体化され得る。リガンド誘導体化HSP2ペプチドを表面固定化HSP1ペプチドに結合させるために、２つのペプチドが好ましいヘテロ二量体形成条件下で接触される。コイルドコイルヘテロ二量体形成に好ましい媒体は、代表的には約６〜約８のpHおよび約50 mM〜500mMの塩濃度を有する生理学的に適合可能な水溶液である。好ましくは、塩濃度は約100mM〜約200mMである。例示的で良好な媒体は以下の組成を有する： 50mMリン酸カリウム、100mM KCl、pH７。同様に効果的な媒体は、置換、例えば、リン酸カリウムをリン酸ナトリウムでおよび/またはKClをNaClで置換することによって、調製され得る。ヘテロ二量体は上記pHおよび塩、媒体の範囲外の条件下で形成され得るが、ホモ二量体に対するヘテロ二量体の分子間相互作用および相対的安定性の内のいくつかは上記の詳細な特性とは異なり得る。例えば、ヘテロ二量体を安定化する傾向にあるe位とg位との間のイオン相互作用は、酸性pHでの、例えばGlu側鎖のプロトン化、あるいは塩基性pHでの例えばLys側鎖の脱プロトン化のために、低または高pH値では破綻し得る。しかし、コイルドコイルヘテロ二量体形成での低および高pH値のこのような影響は、塩濃度の上昇によって克服され得る。塩濃度を上昇させることは、イオン誘引の安定化を中和するか、またはイオン反発の不安定化を抑制し得る。特定の塩は、イオン相互作用を中和することにおいてより大きな効果がある。例えば、図２AのK-コイルペプチドの場合、１M以上の濃度のClO₄ ^-アニオンは、最大限のαヘリカル構造(実施例２に詳細が記載されるように行われるCD測定によって決定されるような)を誘発するために必要であるのに対し、３M以上のの濃度のCl^-イオンが同じ効果のために必要である。低または高pHでのコイルドコイル形成における高塩濃度の影響もまた、ヘリックス内のイオン誘引がヘリックス形成に関して必要と言うわけではなく、むしろコイルドコイルがホモ二量体に対するヘテロ二量体を形成される傾向があるかどうかを制御することを示す。Ｃ．炭化水素鎖単層を有するバイオセンサ表面１つの好ましい実施態様では、以下に記載の種々のバイオセンサの使用に関して、図５Aおよび図５Bに例示されるように、バイオセンサ表面は炭化水素鎖単層を含むように修飾される。この図はバイオセンサ表面48の一部を拡大して見たものであり、基板52上の薄膜電極フィルム50、およびチオエーテル結合を介してフィルムに結合される炭化水素鎖(例えば、鎖56)から形成される単層54を含む。単層に包埋されているのは、分子58(図５A、HSP2ペプチドの付加前)のような上記のように表面に固着しているHSP1ペプチドの分子、および複合体59(図５B、HSP2 ペプチドの付加後)のようなヘテロ二量体複合体である。単層を形成する鎖は、代表的には8-22炭素、飽和炭化水素鎖であり、より長い鎖であっても、いくつかの不飽和を有する鎖、非炭素鎖原子を有する鎖(例えば脂質エーテル)、および/または少数の分岐(例えば、鎖のないメチル基)を有する鎖が使用され得る。電流測定バイオセンサの実施態様において、以下に記載されるように、鎖は十分に緊密に充填されており、そして以下に示すバイオセンサの操作条件下で電子移動流に対する効果的なバリアを形成するように整えられる。この密度は３〜５鎖/nm²であると計算される。図５Aを参照して、HSP1ペプチドは、好ましくは1:100〜1:5のペプチド/炭化水素鎖のモル比で単層に含まれる。図に示されるように、そして以下に記載されるように、図５Aの単層は、イオンキャリアー(例えば、Fe(CN)₆ ^3-)に漏れやすく、そしてその結果、分析物の非存在下での計測可能な検出器電流を提供する。膜の漏れ易さは、示されるように、おそらく単層の荷電ペプチド間の荷電-荷電反発によって単層が破壊されるため、および単層の静電ポテンシャルバリアの減少のためである。図５Bを参照して、荷電キャリアーの存在下で実質的に低減した電流によって証明されるように、膜が低伝導性となる結果を伴って、反対に荷電したHSP2ペプチドの添加は、HSP1ペプチド電荷を中和する。バイオセンサ表面のこの特性は、図７〜９を参照してさらに以下に記載される。単層を形成する好ましい方法において、選択されたモル比において、チオール含有鎖とチオール末端化HSP1ペプチドとの混合物は、基板表面（例えば、金箔）に正電位ポテンシャルを印加することにより表面に活性的に運ばれる。実際には、100mM過塩素酸Li、中性pHのエタノール溶液中の炭化水素鎖混合物(約１mM炭化水素鎖)は、電極上に設置され、そして選択されたポテンシャルが電極に印加される。単層の構築は層の厚さの増加によってモニターされ得る。あるいは、単層形成は、以下に記載のように、単層を横切る電流を測定することによりモニターされる。この場合、単層の形成は、最小電流になるまでの電極電流の一定の低下によって特徴づけられ、このとき最大鎖充填が達成される。飽和充填密度の達成するために必要な時間は、印加された電位とともに変化し、そして10秒程度に短縮され得る−拡散による単層形成より約４桁の規模で速くなり得る。完全な、またはほぼ完全な単層形成(30Å厚)は、約１Ｖポテンシャルおよびそれより大きいときに10分以内で生じる。より低正電位において、さらなる反応時間が必要とされる。好ましくは、電極に印加された電位は、標準水素電極に対して少なくとも約+250mV(+250vs．NHE)から1.2V(vs．NHE)の間である。急速な単層形成時間が達成されるだけでなく、反応混合物中に存在するペプチドおよび炭化水素鎖の割合は、単層中で正確に表され、高い再生可能性を有する電極特性を与える。結合したリガンドを有する単層の形成を完全にするために、上記で詳述したように、リガンド誘導体化HSP2ペプチドは、ヘテロ二量体形成に好ましい条件下で単層と接触され得、ここで好ましくはHSP2ペプチドが過剰に添加される。ヘテロ二量体の形成の後、単層を横切る電流を測定され得る。上記のように、ヘテロ二量体形成が単層を「強固にする」傾向があるので、安定な低電流に到達するまで、ヘテロ二量体形成は測定電極電流の確実な低下を導き、このとき最大のヘテロ二量体形成が生じる。以下のサブセクションは、上記バイオセンサ表面が適切である数種のバイオセンサを例示する。Ｄ．電流測定バイオセンサ簡略化した表示の図６は、本発明の１つの実施態様によって構築された電流測定バイオセンサ60の部品を例示する。この装置は、金箔66から形成されたバイオセンサ表面64を収容する閉鎖チャンバー62を有し、これはバイオセンサの表面電極を形成する。この電極表面は、曝露された単層表面68を規定する炭化水素鎖の単層66によって覆われる。この単層は、70に示されるようなリガンド支持ヘテロ二量体を含み、リガンド結合剤との反応に到達可能であるように、単層またはその近傍に付与されたリガンドとともにこの中に包埋されている。単層は、上記のように形成される(例えば、金箔に対する単層成分のチオエーテル結合を伴う)。バイオセンサチャンバーは、記載されるように、バイオセンサの操作に必要な水性電解質溶液を保持するのに貢献する。液体は、バルブ付きポート72を通じてチャンバーから導入または排出され得、そしてチャンバーは、ポートを通じた液体流を促進するための第２ポートまたは排気口(示さず)を含み得る。この装置中の参照電極74および対向電極76は、示されるように上部チャンバー壁に設置され、そしてチャンバーが電解質溶液で満たされた場合、両者が電極64 と伝導性接触する。地面に固定された参照電極は、選択されたポテンシャルが電位源78によって作用電極上に設置される場合、作用電極の電位ポテンシャル参照として役立つ。このポテンシャルは電位計測装置80によって計測され、この装置は選択された電位、代表的には約-500〜+800mVにポテンシャルを保持するための従来の回路網をさらに含み得る。電位源78は、バイオセンサ操作中の２つの電極間の電流を測定するために、示されたような電流測定装置82を介して対向電極76に接続される。参照及び対向電極は、Pt、Ag、Ag/AgCl、または他の適切な電極である。参照電極ならびに作用電極、および作用電極にそれらを接続する回路網はまた、単層表面に生じるリガンドーレセプター結合事象に応答して作用電極単層を横切るイオン媒介電流を測定するための検出器手段として、ひとまとめにして本明細書中に参照される。操作の際に、チャンバーはレドックス反応(すなわち、電子を失うまたは得る) を適切な荷電電極で行うことが可能な分析物およびイオン種を含有する溶液で満たされる。例示的なレドックス種は、負電荷種としてはFe(CN)₆ ^3-/4-であり、そして正電荷種としてはRu(NH₃)₆ ^2+/3+である。使用され得る他のプローブは、Mo( CN)₆ ^3-(E₀=+800mV)、W(CN)₆ ^3-(E₀=+580mV)、Fe(CN)₄ ^-(E₀=+580mV)、Ce^4+/3+(E₀= +1.4V)、およびFe^3+/2+(E₀=+666mV)を含む。代表的なレドックスイオン濃度は、 0.01〜10mMである。レドックス溶液はチャンバーに含まれ、そして参照および対向電極と接触する。電極(すなわち、電極と参照電極間)上に設置された電位ポテンシャルは、代表的には酸化に関してレドックス種の電気化学ポテンシャル(E₀)値の少なくとも90 mV上であり、種の還元に関して電気化学ポテンシャルの少なくとも90mV下である。例えば、450mV(vs．NHE)のE₀を有するFe(CN)₆ ^3-/4-を考慮せよ。約550mV以上の電極ポテンシャルでは、任意のFe2+種がFe3+に酸化されており、そして約350m V未満の電極ポテンシャルでは、Fe3+がFe2+に還元される。同様に、Ru(NH₃)₆ ^2+/ ³⁺ は+50mV(vs．NHE)のE₀を有し、そこで酸化は約+150mV以上の電極ポテンシャルで達成され得、そして還元は約-50mV未満で達成され得る。単層の均一に充填された構造を増強するための単層のヘテロ二量体の形成の能力は、単層伝導性によって明らかなように、図７で例示される。イオン媒介電流によって測定されるように、K-コイルペプチドのみを含む単層への添加後、図は反対に荷電したE-コイルペプチドの伝導性の低下を示す。Fe(CN)₆ ^3-イオンの存在下で測定される酸化または還元電流の時間依存の低下によって明らかなように、単層の電荷-中性ヘテロ二量体を形成するための２つのペプチドの対形成は、実質的に単層伝導性を減少するのに効果的である。１つの例示的なバイオセンサーにおいて、バイオセンサー表面は、(i)電極表面に共有結合的に結合された包埋K-コイルペプチド(HSP1)を有する単層、(ii)単層のK-コイルペプチドを有するヘテロ二量体を形成する、反対に荷電したE-コイルペプチド(HSP2)、および(iii)E-コイルペプチドに誘導体化され、従って単層表面に配置された表面二糖リガンドを含む。図８に見られるように、抗リガンド -レセプター(PAKタンパク質レセプター)の添加は、酸化および還元電流の両方を増加し、この電流は表面リガンドに結合するレセプターの動力学を反映する時間にわたって増加する。電極単層のE-コイルペプチドサブユニットに結合した、二糖ではなく三糖リガンドを有する同様のバイオセンサーは、ベロトキシン(Verot oxin)レセプターを用いて試験され、図９に見られる結果を有する。図の実線は、ベロトキシン添加後に観測される酸化および還元電流の増加を時間の関数として示す。リガンドに結合するレセプターの非存在下において、単層は、その高密度に秩序化(order)された充填を保持し、適切な酸化または還元ポテンシャルが単層を横切って設置される場合、レドックスイオン種によって媒介される単層を横切る電流の効果的なバリアを形成する。これは、膜を横切る低いまたは０の測定電流によって反映される。この条件における単層の誘電率は、代表的に約１〜２である。バイオセンサのきっかけとなる事象は、表面結合リガンドに対するリガンド結合剤の結合である。この結合は、単層の配置された構造を動揺させ、単層を通じたレドックス種の移動を十分可能にし、電極を通じて電流を生成する。本発明の支持において行われる測定は、１つのきっかけとなる事象が１秒当たり10²〜10⁶ のイオンおよび電子移動事象に導き、従って高い増殖性となることを示す。バイオセンサーは、この結合事象を電極を横切る(すなわち、作用および対向電極間の)電流の増加として記録する。トランジスタの類似性によって、レドックス溶液は「供給源」として、単層は「ゲート」として、そして下にある電極は「ドレイン」として役立つ。トランジスタの電流はゲートに閾値電位を印加することによって開始される。本発明のバイオセンサでは、電流が単層「ゲート」への刺激(この場合、リガンド-レセプター結合事象)によって開始される。 E. 重量測定バイオセンサ図10は、本発明の新規のバイオセンサ表面を組み込む重量測定バイオセンサ86 の基本部品を示す。このバイオセンサは、圧電性結晶90を有し、そのバイオセンサ表面92は、その中に包埋されたリガンド支持ヘテロ二量体複合体(例えば、複合体96)を有する単層94を含む。表面音波(surface acoustic waves)(SAW)が発振器96によって結晶中に生じる。公知の圧電性バイオセンサの原理に従って、リガンド結合剤の表面結合リガンドに対する結合から生じるバイオセンサ表面の重量変化がSAWの周波数、共鳴周波数、および波長を変え、そしてこれらの波長特性のうちの少なくとも１つは検出器98によって測定される。発振器および検出器はまとまって、リガンド結合剤のバイオセンサ表面に対する結合を検出するための検出手段を形成する。重量測定バイオセンサの結晶構造および付随する検出手段の詳細は、例えば、米国特許第5,478,756号および4,789,804号ならびにPCT出願W096/02830に記載されている。 F. 表面プラズモン共鳴バイオセンサ図11は、本発明の新規のバイオセンサ表面を組み込む表面プラズモン共鳴(SPR )バイオセンサ100の基本部品を示す。バイオセンサの上部開口チャンバ102は、誘電体フィルム106および誘電体/金属フィルム界面で表面プラズモン波を支持するために構築された薄いエバポレート金属フィルム108から構成されるウェーブガイド104を含む。ウェーブガイド表面は、その中に包埋されたリガンド支持ヘテロ二量体複合体(例えば、複合体112)を有する単層110を有するバイオセンサ表面を形成する。光源114は、発散光ビームをレンズ116を通してバイオセンサー表面上に指向する。バイオセンサー表面の長さに沿ったいくつかの領域で、ビーム角は、表面プラズモンによる減衰波からの吸収が生じる吸収角で表面に当たる。吸収角は界面に近い材料の組成の変化と共にシフトする、すなわち、単層表面上に生じる結合事象に応じてシフトする。バイオセンサー表面に沿った各領域からの反射光の強度は、光センサー118によってモニターされ、その感光グリッドは、特定の検出器表面領域に適合され、そしてこれは分析器120に操作可能に接続される。光源および光センサーも本明細書中でバイオセンサ手段と言われる。操作において、バイオセンサ表面上のSPR吸収角は分析物の添加前および添加後に測定され、角度の測定されたシフトは、リガンド結合剤に対する表面リガンド結合の程度に比例する。Ｇ．光学バイオセンサバイオセンサ表面の光学特性の変化に依存する種々のバイオセンサデバイスは、リガンド/抗リガンド結合事象に応じて提案されている。図12は、開口チャンバ124および包埋されたヘテロ二量体複合体(例えば、130に示される)と共に炭化水素鎖単層128を含むバイオセンサ表面126を有する光学バイオセンサ装置122の基本部品を示す。バイオセンサ表面上での結合事象を検出するための装置の検出手段は、偏光源 132および単層領域を通過したビーム光を指向するためのレンズシステム134含む。バイオセンサ表面の反対側の光検出器136は、偏光フィルター138を通じて所定の偏光角の光の強度を測定するように機能する。リガンド結合事象の検出は、表面結合事象による単層の規則的な秩序の動揺に応じて、単層による透過光の偏光角および強度の変化に基づく。これらの変化は、光センサーに操作可能に接続された分析器140によって記録される。上記のバイオセンサは、単一の分析物の検出での使用のための単一領域のバイオセンサ表面(すなわち、単一のリガンドを含むバイオセンサ表面)を有する。これらの表面は上記のように、選択されたHSP2-リガンド複合体と汎用HSP1バイオセンサ表面とを接触させ、次いでヘテロ二量体形成条件下で所望のHSP2-リガンド複合体を添加することによって容易に構築される。本発明の方法は、複数の分析物を試験するために、複数のセンサー表面を有するバイオセンサ表面を構築するために用いられ得、または単一の表面に数カ所の異なるリガンド領域を区切るために用いられ得ることが認められる。後者の実施態様では、異なるHSP2-リガンド複合体が汎用のセンサー表面上の別に選択された領域と接触する。本発明は、バイオセンサ表面の製造後、結合したリガンドの数およびタイプにより柔軟性を可能にし、特にここで別々のバイオセンサ領域が、異なるHSP2-リガンド複合体と選択的に接触し得る。次のセクションは、複数の試薬を有するバイオセンサ表面を形成するための、特に高密度の異なるリガンドを含有する試験領域を有するバイオセンサ表面を構築する際の使用のための発明による、より一般的な方法を記載する。 II．複数リガンド表面の製造図13A〜図13Cは、本発明に従って、アッセイ支持表面上の異なる選択領域に異なる生物学的試薬のアレイを構築する方法の最初の反復を例示する。図13Aは、アッセイ支持表面142の部分を示す(この場合は電流測定のバイオセンサデバイスにおける使用のためのバイオセンサ表面)。この表面は、例えば従来のフォトリソグラフ法によって構築され、電極領域(例えば、２つの領域144、 146)のアレイを含む。例示された実施態様において、この領域は、基板148上に形成される金属(例えば、金)フィルム領域である。ここに記載はしないが、この表面は上記のように、単層に包埋されたHSP1ペプチド(例えば、150に示されるように)を有する炭化水素鎖単層として調製される。本発明の重要な特徴によれば、HSP1ペプチドは１つ以上の光放出ブロック基(p hoto-releasable blocking group)を有し(例えば、ペプチド150上のブロック基1 50a)、これが選択された条件下でのHSP2ペプチドの存在下でヘテロ二量体の形成を防止する。この場合、HSP1ペプチドはE-コイルペプチドであり、そしてブロック基は、２つ以上のグルタメート側鎖カルボキシル基上のニトロフェノレート保護基である。当業者は種々の光放出ブロック基(例えば、アミノ酸側鎖上の１つ以上の光脱保護可能な基)が、立体障害または電荷相互作用の減少のいずれかによってヘテロ二量体形成をブロックするために用いられ得ることを認識する。ブロック基を有するHSP1ペプチドのアッセイ表面、または表面上の単層の一部への付着に続いて、表面の照射された領域のみのブロック基を放出するように、表面は選択的に照射される。これは、図13Aに示されるように、フォトマスク開口部に対応する表面の領域を選択的に照射するよう、表面を覆って配置されたフォトマスク152を通して表面を照射することによって達成され得る。図13Bは、照射領域144からのブロック基の選択的放出を示す。次いで、示されるように、表面を、選択されたリガンドに結合されたHSP2ペプチド154(図13C)と反応させ、ヘテロ二量体を表面の非ブロック領域に選択的に形成する。必要であれば、ヘテロ二量体形成条件は、例えば、イオン強度で、非ブロックHSP1ペプチドのみとヘテロ二量体を形成するように選択される。従って、放出されたブロック基がイオン基、例えばカルボキシル基を露出する場合、反応媒体のイオン強度を下げ、イオン相互作用効果を増強してヘテロ二量体形成に導くことが有用であり得る。上記の工程は、異なるリガンドの所望のアレーが、表面の異なるアドレス可能な領域に構築されるまで、アッセイ表面に付加される各リガンドに対して繰り返される。図14は、以上の方法に従って構築され、そして上記のタイプの電流測定バイオセンサ装置156に使用される多分析物アッセイ表面の部分を示す。チャンバー157 中のバイオセンサー表面158は、複数の独立したセンサ領域（例えば、領域160、 162）を有し、これらは、各々、例えば、L₁、L₂に示される別々のリガンドを有し、これらは、例えば、ヘテロ二量体（例えばヘテロ二量体166(L₁)および168(L₂ )）を介してそれぞれのセンサ領域に付着している。バイオセンサチャンバーに導入される分析物含有試料中の異なる分析物の検出のために、ヘテロ二量体は、各領域上の単層（例えば単層154)中に埋包されている。各検出領域（例えば、領域160、162）中の電流は、各領域を電圧源174および電流デバイス176を通してチャンバーリザーバーに接続するマルチプレクサ172 によって応答される。以上のように、リガンド結合剤の任意の領域への結合は、領域の単層構造を混乱させ、このような結合が起こった領域に測定される電流の増加を引き起こす。前記から、本発明がいかに多くの目的および利益を供するかが理解され得る。本発明のバイオセンサ表面は、マイクロチップスケールおよびフォトマスクプロセスに一致する制御された製造条件下で形成され得て、高度に均一の、および／または小型化された、および／または高密度の、付着されたHSP1ペプチドを有するアレーセンサーデバイスを製造する。一般的な表面を有するデバイスの製造の後、センサ表面を選択されたリガンドで誘導体化されたHSP2ペプチドと反応させることによって、センサ表面は容易に広範なリガンドに適応させ得る。リガンド付着反応は、比較的単純な製造条件下で行われ得、最終使用者でさえ、達成可能であり、従って、最初の製造段階での製造の精密さ、およびリガンド付加段階でのアッセイのフレキシビリティーの両方を統合し得る。本発明は、電流測定バイオセンサの場合におけるように、最密な単層バイオセンサ表面を使用しまたは必要とするバイオセンサデバイスを製造するのに特に有用である。図7〜9で報告される研究は、炭化水素鎖単層中のヘテロ二量体の形成が、イオンキャリア移動に対する有効な障壁を形成する最密な単層構造と相溶性であり、そして同時に、リガンド結合剤による結合に敏感であり、単層を通じたイオンキャリア移動を増加させることを示す。本発明は、以上で示したような、任意の種々のバイオセンサデバイス容易に適応される。さらに、本発明は、一般のバイオセンサ表面の異なる領域を異なる選択されたHSP2リガンド結合体に選択的に接触させることによって、多リガンドバイオセンサを製造するのに容易に適応され得る。他の局面では、本発明は、複数の異なるリガンド領域を有する高度に再現性のマイクロアレーバイオセンサデバイスを製造可能なフォトマスキング技術によって多リガンドアッセイ表面を製造するのに使用され得る。本発明は、特定のデバイスおよび方法に関して記載されているが、付属の請求範囲によって包含される本発明から離れることなしに種々の改変および修飾がなされ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レンノックス，アール．ブルセカナダ国ケベックエイチ４エイ２エックス３，モントリオール，ハーバードアベニュー 4605 (72)発明者ホッジス，ロバートエス. カナダ国アルバータティー８エイチ１イー２，エドモントン，サスカッチェワンドライブ 9045 (72)発明者アービン，ランダールティー. カナダ国アルバータティー８エイチ１イー２，シャーウッドパーク，チェルシーマノー９

Claims

【特許請求の範囲】１．リガンドおよびリガンド結合剤間の結合事象を検出するためのバイオセンサ装置であって、以下を含むバイオセンサ装置：バイオセンサ表面を定義する手段であって、該バイオセンサ表面上には、α−ヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を共に形成する第１および第２のペプチドからなる２サブユニットヘテロ二量体複合体を有しており、該第１のペプチドは該バイオセンサ表面に結合されている手段、リガンドであって、２サブユニットヘテロ二量体複合体中の第２のペプチドに共有結合的に付着され、リガンド結合剤による結合にアクセス可能なリガンド、該バイオセンサ表面上に、リガンド結合剤、および該リガンドに結合するリガンド結合剤と競合し得るリガンドまたはリガンドアナログからなる群から選択される分析物を導入する手段であって、分析物がリガンドまたはリガンドアナログである場合、該装置はまたリガンド結合剤を含む手段、リガンド結合剤の該バイオセンサ表面上の該リガンドへの結合を検出するための手段。２．前記バイオセンサ表面が炭化水素鎖からなる単層を含み、該炭化水素鎖はその近位端が該バイオセンサ表面に固着され、そして曝露された単層表面を定義する遊離の遠位端を有し、前記ヘテロ二量体複合体が該単層中に包埋され、そして前記リガンドが該曝露された単層表面の上または近傍に配置されている、請求項１に記載の装置。３．電極が金のバイオセンサ表面を有し、前記単層が近位端で前記バイオセンサ表面にチオール結合により結合された８〜22の炭素原子鎖からなり、該鎖は約３〜５鎖/nm²の分子密度を有する、請求項２に記載の装置。４．前記第１および第２のサブユニットペプチドが反対に荷電されている、請求項１に記載の装置。５．前記第１のペプチドサブユニットがオリゴペプチドスペーサーまたは炭化水素鎖スペーサーを通じて共有結合的に前記バイオセンサ表面に結合されている、請求項２に記載の装置。６．検出器表面が、第２のペプチドに結合された各々異なる選択されたリガンドを有する第１および第２の領域を含む、請求項１に記載の装置。７．リガンド結合剤の単層リガンドへの結合の電流測定的検出のために設計された、請求項２に記載の装置であって、ここで、前記バイオセンサ表面は電極であり、ヘテロ二量体複合体を含む前記単層は、該単層に接触している水溶液中の酸化還元イオン種によって媒介される該単層を横切る電流に対して効果的なバリアを形成するのに十分にぎっしり詰められそして整列しており、そしてリガンド結合剤の該単層表面上の該リガンドへの結合は、該酸化還元種に媒介される該単層を横切る電流を測定可能なように増加させるのに効果的であり、該装置は、該単層に接触している該酸化還元種の水溶液を含むのに適応したチャンバをさらに含み、そして前記検出手段は、前記レセプターおよびリガンド間に起こる結合事象に応答して該単層を横切るイオン媒介電流を測定するための回路手段を含む。８．リガンド結合剤の前記単層リガンドへの結合の重量測定的検出のために設計された請求項２に記載の装置であって、ここで、前記バイオセンサ表面は、圧電結晶であり、そして前記検出手段は、該結晶に表面音波を生成するための手段、およびリガンド結合剤の該リガンドへの結合によって生成される該表面音波の周波数、速度、または共鳴周波数におけるシフトを検出するための手段を含む。９．リガンド結合剤の前記単層リガンドへの結合の光学的表面プラズモン共鳴(S PR)検出のために設計された請求項２に記載の装置であって、前記バイオセンサ表面は、上に該単層が形成される薄い金属層でコートされた透明な誘電体基板、該基板およびプラズモン共鳴界面を形成する金属層であり、そして前記検出手段が、金属フィルムおよび結合された単層の光学特性に依存するプラズモン共鳴角度で表面プラズモンを励起するための手段、およびリガンド結合剤の該リガンドへの結合によって生じたプラズモン共鳴角度のシフトを検出するための手段を含む、装置。１０．リガンド結合剤の前記単層リガンドへの結合の光学的検出のために設計された請求項２に記載の装置であって、ここで該検出手段は、該単層を光ビームで照射するための手段、およびリガンド結合剤の該リガンドへの結合によって生成される該単層の光学特性の変化を検出するための手段を含む。１１．リガンドおよびリガンド結合レセプター間の結合事象を検出することが可能なバイオセンサ装置に使用するためのリガンド特異的バイオセンサを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：以下の(ａ)および(ｂ)を共に接触させる工程：（ａ）バイオセンサ表面を有し、そして該バイオセンサ表面、第１のヘテロ二量体サブユニットペプチドに結合されるバイオセンサ電極、および（ｂ）該第１のペプチドに結合してαヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を形成することが可能な第２のヘテロ二量体サブユニットペプチド、特異的に該リガンド特異的レセプターに結合することが可能な共有結合されたリガンドを有する該第２のペプチド、および該接触によって、リガンドを該バイオセンサ表面に結合させる工程を含む。１２．前記接触工程後、前記バイオセンサ表面が炭化水素鎖からなる単層を含み、該炭化水素鎖はその近位端が該バイオセンサ表面に固着され、そして曝露された単層表面を定義する遊離の遠位端を有し、前記第１のペプチドが該単層中に包埋され、そして前記リガンドが該曝露された単層表面の上または近傍に配置されている、請求項１１に記載の方法。１３．前記バイオセンサ表面が金のバイオセンサ表面を含み、前記単層が近位端で該バイオセンサ表面にチオール結合により結合された８〜22の炭素原子鎖からなり、該鎖は約３〜５鎖/nm²の分子密度を有する、請求項１２に記載の方法。１４．前記第１のペプチドがオリゴペプチドスペーサーまたは炭化水素鎖スペーサーを介して前記バイオセンサ表面に共有結合されている、請求項１１に記載の方法。１５．前記バイオセンサ表面が第１および第２の別個の領域を含み、そして前記接触が、各領域に、前記第１のペプチドヘ結合しαヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を形成することが可能な第２のヘテロ二量体サブユニットペプチドを配置することを含む請求項１１に記載の方法であって、ここで、各領域中の該第２のヘテロ二量体サブユニットペプチドは、異なる結合されたリガンドを有する、方法。１６．アッセイ支持体表面上の異なる選択された領域の、異なる選択された生物学的試薬の配列を構成する方法であって、以下の工程：第１のヘテロ二量体サブユニットペプチドの分子を、該支持体表面に、該表面上の該異なる領域を結合された分子で覆うのに効果的に結合させ、該サブユニットペプチドは、(i)脱保護状態で、第２のヘテロ二量体サブユニットペプチドを有するαヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体を形成可能であり、そして（ii）該ヘテロ二量体形成を防ぐ１つ以上の光脱保護可能な基を有する工程、第１のペプチドを曝露された領域のみで脱保護するのに効果的な照射条件下で、該表面の選択された領域を選択的に照射し、該表面を、そこに結合された選択されたアッセイ試薬を有する該第２のサブユニットペプチドと接触させる工程、該接触により、該選択された試薬を該表面の該曝露された領域に付着させる工程、および該照射、接触、および結合工程を、アッセイ支持体表面上の異なる選択された領域に配置された、異なる選択された生物学的試薬の所望の配列が生成されるまで繰り返す工程を含む。１７．前記第１のサブユニットペプチドが１つ以上の保護カルボキシル基を有するアミノ酸残基を含む、請求項１６に記載の方法。１８．前記第１のサブユニットペプチドが、カルボキシル側鎖の少なくともいくつかがジニトロフェノレート基で保護されているグルタメート残基を含む、請求項１７に記載の方法。