MXPA98008830A - Metodo y dispositivo biosensor - Google Patents

Abstract

Un aparato biosensor para detectar un evento de aglutinamiento entre un ligando y un receptor. El aparato incluye un sustrato de electrodo cubierto con una capa monomolecular de cadena de hidrocarburo dieléctrica elevada, y que tiene ligandos unidos a la superficie de la capa monomolecular expuesta. El aglutinamiento de un receptor al ligando aglutinado a la capa monomolecular y la perturbación resultante de la estructura de la capa monomolecular, causan el flujo del electrón mediado por el ión a través de la capa monomolecular. En una modalidad, las capas monomoleculares tienen un heterodímero doblemente arrollado incrustado en las mismas, una subunidad del cual se une al sustrato, y la segunda del cual porta el ligando en la superficie de la capa monomolecular.

Description

MÉTODO Y DISPOSITIVO BIOSENSOR Campo De La Invención La presente invención se refiere, a biosensores, en particular, a un biosensor para medir un evento de aglutinamiento entre un ligando y un receptor que aglutina al ligando, y a métodos que emplean tal biosensor. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Substancialmente, los instrumentos de diagnóstico utilizados para detectar o cuantificar los analitos biológicos se basan en el aglutinamiento del ligando específico entre un ligando y un receptor. Los pares de aglutinamiento ligando-receptor utilizados comúnmente en el diagnóstico incluyen, an ígeno-anticuerpo, hormona-receptor, medicamento-receptor, antígeno de superficie celular-lectina, biotina-avidina, y filamentos de ácido / nucleico complementarios, en donde dicho ligando típicamente es el más pequeño de los dos miembros del par de aglutinamiento. El analito a detectarse puede ser cualquiera de los miembros del par de aglutinamiento; alternativamente, el analito puede ser un análogo del ligando que compite con el ligando para aglutinar al receptor complemento. Se han desarrollado una variedad de métodos para detectar las interacciones del ligando/receptor. El más simple de estos es un formato de fase sólida que emplea un ligando marcado-revelador cuyo aglutinamiento o liberación de una superficie sólida se activa por la presencia del receptor o ligando del analito. En un análisis tipo intercalado de fase sólida típico, por ejemplo, el analito a medirse es un ligando con dos o más sitios de aglutinamiento, que permite al ligando aglutinarse tanto a un receptor, por ejemplo, anticuerpo, portado en una superficie sólida, como a un segundo receptor marcado-revelador. La presencia del analito se detecta (o cuantifica) por la presencia (o cantidad) del revelador aglutinado a la superficie sólida. En un análisis de aglutinamiento competitivo de fase sólida típico, un ligando del analito (o receptor) compite con un análogo del analito marcado-revélador para aglutinarse a un receptor (o ligando) portado sobre un soporte sólido. La cantidad de señal del revelador asociada con el soporte sólido es inversamente proporcional a la cantidad de muestra de analito a detectarse o determinarse . El marcador revelador utilizado en ambos formatos de fase sólida es típicamente una partícula visiblemente perceptible o una enzima capaz de convertir a un substrato en un producto fácilmente perceptible. Los dispositivos espectrofotométricos simples, permiten la cuantificación de la cantidad de marcador revelador, para cuantificar la cantidad de analito. La detección o cuantificación de los eventos de aglutinación del ligando específico también es importante en métodos de rendimiento elevado que se desarrollan para la selección del conjunto combinatorio. En un método típico, se sintetiza un gran conjunto de posibles moléculas determinantes (ligandos) . Los miembros del conjunto se seleccionan entonces para la actividad determinante por sú habilidad para aglutinarse a un receptor seleccionado. El planteamiento tiene el potencial de identificar, por ejemplo, antígenos de oligopép ido nuevos capaces de aglutinarse con especificidad elevada a anticuerpos relacionados con la enfermedad, o compuestos de moléculas pequeñas capaces de interactuar con un objetivo farmacológico seleccionado, tal como un receptor de membrana aglutinado o una enzima celular. Los métodos de selección de rendimiento elevado típicamente emplean análisis de desplazamiento del ligando simple para detectar y cuantificar el ligando que se aglutina a un receptor. Los análisis de desplazamiento tienen la ventaja de sensibilidad elevada, por ejemplo, en donde el ligando desplazado se radiomarca, y también permite la determinación de la afinidad de aglutinamiento ligando-receptor, en base al desplazamiento competitivo de un agente aglutinante cuya afinidad de aglutinamiento al receptor objetivo se conoce. En ambos diagnósticos y selección de rendimiento elevado, existe un interés creciente en desarrollar biosensores electroquímicos capaces de detectar y cuantificar los eventos de aglutinamiento ligando-receptor. Tales biosensores se diseñan para producir señales eléctricas en respuesta a un evento específico-analito seleccionado, tal como un evento de aglutinamiento ligando-receptor. El interés en los biosensores se estimula por un número de ventajas potenciales sobre formatos de análisis estrictamente bioquímicos, tal como aquellos descritos arriba . Primero, los biosensores pueden producirse, utilizando tecnología de microcircuito convencional, en forma miniaturizada y elevadamente reproducible, con la capacidad de colocar un gran número de elementos biosensores en un solo substrato. En segundo lugar, debido a que las señales electroquímicas pequeñas puede amplificarse fácilmente (y someterse a diversos tipos de procesamiento de señal, si se desea) los biosensores tienen el potencial para medir cantidades muy pequeñas del analito, y cambios proporcionalmente pequeños en los niveles del analito. Una consecuencia de la característica anterior es que un gran número de analitos diferentes puede detectarse o cuantificarse al aplicar un volumen pequeño de la muestra, por ejemplo, 10-50 µl a un solo circuito multisensor . Hasta ahora, los biosensores electroquímicos se han aplicado de manera más exitosa para detectar los analitos que son por si mismos especies electroquímicas, o pueden participar en reacciones catalíticas que generan especies electroquímicas, que para detectar los eventos de aglutinamiento ligando-receptor. Esto no es sorprendente, dado el reto más difícil de convertir un evento de aglutinamiento bioquímico en una señal electroquímica. Un propuesta para este problema es proporcionar dos elementos de reacción separados en el biosensor; un primer elemento contiene un receptor y un ligando enlazado a la enzima aglutinada y al segundo elemento, componentes para generar enzimáticamente y luego medir unas especies electroquímicas. En operación, el ligando del analito desplaza el conjugando de la enzima-ligando del primer elemento, liberando la enzima en la región del segundo elemento, generando así unas especies electroquímicas que se miden en el segundo elemento. Los biosensores de dos elementos de este tipos son relativamente complicados de producir, particularmente mediante métodos de disco de silicio convencionales, ya que una o más capas biológicas y capas permselectivas pueden depositarse como parte del proceso de elaboración. Además, las enzimas o receptores en el biosensor pueden desnaturalizarse en el almacenamiento, y el dispositivo puede tener periodos de "humedecimiento" variables después de que se aplica una muestra. Se han propuesto biosensores que intentan acoplar la actividad electroquímica directamente a un evento de aglutinamiento ligando-receptor, por medio de electrodos de membranas de activación periódica. Por ejemplo, las Patentes de E.U. Nos. 5,204,239 y 5,368,712 describen electrodos de membrana de activación periódica formados de una membrana de dos capas lípidas que contienen un receptor de canal-ion, que se encuentra ya sea abierto o cerrado por el aglutinamiento del ligando al receptor. Los electrodos de este tipo son difíciles de almacenar y elaborar, y se limitan en el presente a un grupo preferentemente pequeño de proteínas receptoras . Alternativamente, el aglutinamiento ligando/receptor directo puede medirse eléctricamente al incrustar el receptor en una película de polímero delgada, y medir los cambios en las propiedades eléctricas de la película, por ejemplo, impedancia, debido al aglutinamiento del ligando a los receptores. La Patente de E.U. No. 5,192,507 es ej emplificativa. Ya que el aglutinamiento del ligando al receptor tendrá un efecto preferentemente menor en las propiedades de la película, y ya que ningún efecto de amplificación se logra, se espera que la propuesta tenga sensibilidad limitada. De esta manera sería deseable proporcionar un biosensor capaz de detectar y cuantificar los eventos de aglutinamiento de ligandos y caracterizado por: (i) la conversión electroquímica directa del evento de aglutinamiento a señal eléctrica; (ii) un flujo elevado del electrón "de cambio" desde cada evento de aglutinamiento; (iii) adaptable a substancialmente cualquier ligando y (iv) buenas características de almacenamiento y humedecimiento rápido con la aplicación de la muestra. Además, el dispositivo deberá producirse fácilmente, y preferentemente susceptible de elaborarse utilizando tecnologías de microcircuito estándar. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es un aparato biosensor para detectar un evento de aglutinamiento entre un ligando y el receptor que aglutina al ligando. Un electrodo en el aparato incluye un substrato de electrodo con una superficie de detección cubierta por una capa monomolecular de cadenas de hidrocarburo. Las cadenas se aseguran en sus extremos próximos a la superficie de detección, y se ordenan y empacan de manera suficientemente compacta para formar una barrea efectiva para el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediada por unas especies de ion de redox en una solución acuosa en contacto con la capa monomolecular. El ligando cuyo aglutinamiento a un receptor es para detectarse, se une a los extremos distantes de una porción de las cadenas de capa monomolecular, del tal manera que el aglutinamiento de un ligando a un receptor que se une al ligando perturba suficientemente a la capa monomolecular suficientemente para incrementar mesurablemente el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediado por tales especies de ion redox. La solución acuosa de la especie redox en contacto con la capa monomolecular se mantiene en una cámara que también se diseña para recibir al receptor de la muestra, para poner al receptor en contacto con el ligando en la capa monomolecular. El flujo del electrón mediado por el ion a través de dicha capa monomolecular, en respuesta a los eventos de aglutinamiento que ocurren entre dicho receptor y ligando se mide en un circuito eléctrico en el aparato. En una modalidad preferida, la capa monomolecular se compone de cadenas de 8-22 átomos de carbono unidas en sus extremos próximos a la superficie de detección, por ejemplo, una superficie de oro, mediante un enlace de tiolato. Las cadenas tienen una densidad molecular preferida de aproximadamente 3 a 5 cadenas/nm2. La constante dieléctrica de la capa monomolecular en la presencia de la solución de la especie redox, pero en la ausencia del receptor de aglutinamiento, es preferentemente menor a 2, con un cambio en la constante dieléctrica del 10% o más, por el aglutinamiento del receptor al ligando, siendo fácilmente perceptible. Los pares de ligando-receptor ejemplificativos incluyen, antígeno-anticuerpo, hormona-receptor, medicamento-receptor, antígeno de superficie celular-lectina, biotina-avidina, substrato/anticuerpo y filamentos de ácido nucleico complementarios, en donde el ligando de estos pares, típicamente es el que se nombra primero. En donde se utiliza el aparato para detectar un ligando o análogo del ligando, el aparato puede incluir además un receptor que compite con el análogo o ligando del analito para aglutinarse al ligando en la capa monomolecular. Un ligando ejemplificativo es un ligando de oligosacárido, y un receptor ejemplificativo, el receptor de Verotoxin, también conocido como "Shiga-similar a toxina" . El electrodo empleado en el biosensor puede prepararse, de acuerdo con otro aspecto de la invención al, (i) someter la superficie metálica conductiva del substrato del electrodo a condiciones de ligera oxidación, (ii) agregar al substrato, una solución de cadenas de hidrocarburo que tienen longitudes de entre 8-22 átomos de carbono y derivar a un extremo de la cadena con un grupo de tiol y (iii) aplicar un potencial positivo al electrodo. El potencial colocado en el electrodo, preferentemente es de al menos 250 mV vs NHE (electrodo de hidrógeno normal) , en una solución que contiene el tiol de alquilo a depositarse, y los electrolitos que incluyen ion de litio y aniones de perclorato. Una porción seleccionada de las cadenas de hidrocarburo se deriva en sus extremos opuestos el grupo de tiol, con el ligando de interés. Las condiciones oxidativas aplicadas a la superficie del electrodo son tales como para producir la deposición de una capa monomolecular de cadenas orientadas, empacadas de manera compacta en el substrato, como se prueba por la habilidad del electrodo para formar una barrera efectiva para el flujo de ion de electrón a través de la capa monomolecular mediada por unas especies de ion redox en una solución acuosa en contacto con la capa monomolecular. En otra modalidad general del aparato biosensor, las moléculas del ligando se unen a las cadenas de hidrocarburo formando la capa monomolecular en el electrodo a través de un complejo de la subunidad del heterodímero compuesto de los péptidos, primero y segundo, que juntos forman un heterodímero doblemente arrollado a-helicoidal, en donde: (i) el primer péptido se aglutina covalentemente a la superficie del electrodo a través de un separador, tal como una cadena de hidrocarburo u oligopéptido; (ii) el ligando se une covalentemente al segundo péptido; (iii) el aglutinamiento del segundo péptido al primer péptido, para formar tal complejo, es efectivo para reducir mesurablemente el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediado por tales especies de ion redox, relativo al flujo del electrón observado en la presencia del primer péptido solo; y (iv) el aglutinamiento del ligando al receptor que aglutina al ligando, de tal manera que la parte de formación de dicho complejo, es efectiva para incrementar mesurablemente el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediada por tal especie redox. También se contempla un electrodo para utilizarse en un aparato biosensor de este tipo, compuesto de un substrato que tiene una superficie de detección y moléculas de ligando unidas a la superficie a través de un heterodímero doblemente arrollado a-helicoidal del tipo arriba detallado. El electrodo ya descrito puede producirse, de acuerdo con otro aspecto de la invención, al contactar juntos: (a) una superficie de detección que tiene unida a la misma, un primer heterodímero-péptido de subunidad y (b) una segunda subunidad del heterodímero capaz de aglutinarse a la primer subunidad para formar un heterodímero a-helicoidal, y que tiene un ligando covalentemente unido capaz de aglutinarse específicamente a tal receptor del ligando específico. Estos y otros objetos y características de la invención serán aparentes de manera más completa cuando la siguiente descripción detallada de la invención se lea en conjunto con los dibujos acompañantes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una vista parcialmente esquemática, simplificada de un aparato biosensor construido de acuerdo con la invención; La figura 2 es una vista ampliada de una región del electrodo en el biosensor mostrado en la figura 1; La figuras 3A-3C ilustran tres métodos para formar un electrodo del biosensor que tienen una capa monomolecular lípida y moléculas de ligandos unidas, de acuerdo con la invención; La figura 4 es una gráfica del grosor de la capa monomolecular como una función de voltaje aplicado en una capa monomolecular del electrodo, formado de acuerdo con el método ilustrado en la figura. 3B; La figura 5 ilustra la activación de conductancia por la interacción receptor-ligando en un electrodo del biosensor, de acuerdo con la invención; Las figuras 6A y 6B ilustran la perturbación de la estructura de la capa monomolecular lípida con el aglutinamiento del péptido PAK a ligandos disacáridos en una capa monomolecular; La figura 7 muestra gráficas de cambios en la oxidación (círculos sólidos) y la corriente de reducción (cuadrados abiertos) de Fe (CN) 63"/4" como una función de tiempo después de la adición de un péptido de PAK a la capa monomolecular ilustrada en las figuras. 6A y 6B; Las figuras 8A-8C ilustran la perturbación de la estructura de la capa monomolecular lípida con el aglutinamiento de Verotoxina a los ligandos trisacáridos en una capa monomolecular; La figura 9 muestra gráficas de cambios en la oxidación (círculos sólidos) y la corriente de reducción (cuadrados abiertos) de Fe (CN) 63~/4~ como una función de tiempo después de la adición de Verotoxina a la capa monomolecular ilustrada en las figuras. 8A y 8B; La figura 10 es una gráfica de la corriente de electrodo de Fe (CN) 63"/4" como una función de temperatura en una capa monomolecular del electrodo construido de acuerdo con la invención; Las figuras HA y 11B demuestran los efectos de activación periódica del ion con un ligando cargado negativamente en una capa monomolecular del electrodo; Las figuras 12A y 12B demuestran los efectos de activación periódica del ion con un ligando cargado positivamente en una capa monomolecular del electrodo; Las figuras 13A y 13B ilustran la estructura de una capa monomolecular del electrodo que tiene una subunidad del péptido arrollado K incrustada (13A) , y un arrollamiento K incrustado/arrollamiento E heterodoble; La figura 14 muestra el cambio en la oxidación (círculos sólidos) y la corriente de reducción (cuadrados abiertos) como una función de tiempo después de la adición de una subunidad del péptido de arrollamiento E a un electrodo del tipo ilustrado en la figura 13A que contiene una subunidad del péptido de arrollamiento K incrustado^ La figura 15 muestra los cambios en la oxidación de Fe (CN) 63"/4" (círculos abiertos) y la reducción (cuadrados abiertos) como una función de tiempo después de la adición de un péptido PAK a un electrodo que contiene los ligandos disacáridos en una capa monomolecular lípida de arrollamiento E/arrollamiento K; La figura 16 muestra los cambios en la oxidación de Fe (CN) 63"/4" (círculos abiertos) y la reducción (cuadrados abiertos) como una función de tiempo después de la adición de un péptido de Verotoxina a un electrodo que contiene los ligandos trisacáridos en una capa monomolecular lípida de arrollamiento E/arrollamiento K; Las figuras 17A-17E muestran una vía sintética utilizada para producir un conjugado trisacárido-hidrocarburo empleado en la capa monomolecular ilustrada en las figuras 8A-8C; y La figura 18 muestra una vía sintética utilizada en la producción de un conjugado disacárido-hidrocarburo empleado en la capa monomolecular mostrada en las figuras 6A-6B. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Aparato Biosensor La figura 1 es una vista esquemática simplificada de un aparato biosensor 20 para detectar un evento de aglutinamiento entre un ligando y un agente o receptor que aglutina al ligando, de acuerdo con la invención. El aparato incluye un electrodo de funcionamiento 22 que tiene una superficie de detección conductiva 24 y una capa monomolecular de cadena de hidrocarburos 26 formada en la superficie de detección. En la modalidad mostrada, la superficie de detección es la superficie superior de una película conductiva 28 colocada en un substrato de electrodo 30, el cual puede ser un material no conductivo. Los detalles de la capa monomolecular formada en la superficie de detección y el método para formar la capa monomolecular en la superficie, se describen abajo. Una cubierta 32 en el aparato tiene una pared superior 34 y paredes laterales, tales como la pared 34, las cuales se unen a las regiones límite del substrato del electrodo para formar una cámara cerrada 38 con las mismas. La cámara sirve para mantener una solución de electrolito acuosa requerida para la operación del biosensor, como se describirá. El líquido puede introducirse en o extraerse de la cámara a través de una entrada de válvula 39, como se muestra. Aunque no se muestra, la cámara puede incluir una segunda abertura o ventilación para facilitar el flujo del líquido a través de la abertura. Un electrodo de referencia 40 y un electrodo contador 42 en el aparato, se portan en la superficie de revestimiento de la cámara de la pared 34, como se muestra, y de esta manera ambas se encuentran en contacto conductivo con el electrodo 22 cuando la cámara se llena con la solución de electrolito. El electrodo de referencia, el cual se mantiene en tierra, sirve como la referencia del potencial de voltaje del electrodo de funcionamiento, cuando un potencial seleccionado se coloca en el electrodo de funcionamiento mediante una fuente de voltaje 44. Este potencial se mide mediante un dispositivo que expresa el voltaje 46, el cual puede incluir adicionalmente circuitería convencional para mantener el potencial a un voltaje seleccionado, típicamente entre aproximadamente -500 a +800 mV.

La fuente del voltaje 44 se conecta al electrodo contador 42 a través de un dispositivo que mide la corriente 48 como se muestra, para medir el flujo de corriente entre los dos electrodos durante la operación del biosensor. Los electrodos de referencia y contador son, Pt, Ag, Ag/AgCl u otros electrodos adecuados. Los electrodos de referencia y de funcionamiento, y la circuitería que los conecta al electrodo de funcionamiento, también se refieren en la presente, colectivamente, como medios para medir el flujo del electrón mediado por el ion a través de la capa monomolecular del electrodo de funcionamiento, en respuesta a los eventos de aglutinamiento ligando-receptor que ocurren en la superficie de la capa monomolecular. La figura 2 es una vista ampliada de una porción del electrodo de funcionamiento, incluyendo la capa monomolecular del electrodo, que muestra cadenas de hidrocarburos individuales, tales como las cadenas 50, que forman la capa monomolecular, y las moléculas del ligando, tales como las moléculas 52, unidas covalentemente a los extremos distantes de las cadenas de hidrocarburo. El ligando empleado en el biosensor es un patrón de aglutinamiento seleccionado en un par de aglutinamiento ligando/receptor, en donde el analito a detectarse se relaciona a uno de los dos patrones de aglutinamiento. Los pares de aglutinamiento ligando-receptor utilizados comúnmente en el diagnóstico, incluyen antígeno-anticuerpo, hormona-receptor, medicamento-receptor, antígeno de superficie celular-lectina, biotina-avidina, y filamentos de ácido nucleico complementarios, en donde el ligando es típicamente el más pequeño de los dos miembros del par de aglutinamiento. El analito a detectarse puede ser cualquier miembro del par de aglutinamiento, o alternativamente, un análogo del ligando que compite con el ligando para aglutinarse al receptor complemento. Las moléculas de ligando se unen a los extremos distantes de las cadenas a través de reacciones de derivación convencionales, por ejemplo, éster, éter, amida o enlaces de sulfidrilo, de acuerdo a los métodos estándar. El número de cadenas en la capa monomolecular que portan los ligando en los extremos distantes es preferentemente de aproximadamente 1 a 10 por ciento de mol de las cadenas totales, pero puede variar de 0.01 a 100%. Las cadenas que forman la capa monomolecular son típicamente cadenas de hidrocarburo saturadas, de 8-22 carbonos, aunque pueden emplearse cadenas más grandes, cadenas con algo de saturación, cadenas con átomos de cadena sin carbono, tales como esteres de lípido, y/o cadenas con ramificación menor, tal como los grupos de metilo sin cadenas, con la restricción de que las cadenas, en una densidad de empacado suficiente, forman una capa monomolecular ordenada y de empacamiento suficientemente compacto para ser efectivas como una barrera para el flujo del electrón, bajo las condiciones de operación del biosensor, como se describe abajo. Esta densidad se calcula sea de entre 3-5 cadenas/nm2. Como un ejemplo de la variación en la composición de la cadena permitida, la modalidad de la invención mostrada en la figura 13B tiene una capa monomolecular de cadena de hidrocarburo que incluye heterodímeros de péptido doblemente arrollado incrustado en la matriz de cadena plana, mientras que retiene todavía una barrera dieléctrica baja para el flujo del ion a través de la capa monomolecular. En la modalidad mostrada, las cadenas se acoplan a la superficie de detección del electrodo a través de enlaces de sulfihrilo, aunque pueden emplearse otros grupos de acoplamiento adecuados. Ahora se describirán los métodos para producir capas monomoleculares que tienen densidades adecuadas de la cadena de hidrocarburo. B. Producción de la Capa Monomolecular del Electrodo Las figuras 3A-3C ilustran los tres métodos para formar capas monomoleculares de cadena de hidrocarburos adecuadas para utilizarse en los electrodos del biosensor. Un propuesta, ilustrado en la figura 3A, incorpora la difusión pasiva de las cadenas, tales como las cadenas de hidrocarburo 54 y las cadenas derivadas del ligando, tales como las cadenas 56, en la superficie de un electrodo 58, bajo condiciones efectivas para acoplar las cadenas difundidas a la superficie de detección del electrodo. El método de difusión ilustrado en la 3A es un proceso de dos etapas. En la primer etapa, se permite que las cadenas de hidrocarburo solas (en la ausencia de cadenas derivadas del ligando) reaccionen con la superficie detectada por un periodo extendido, por ejemplo, 24-48 horas, hasta que se logre una densidad de empacamiento seleccionada menor a la densidad de empacamiento completa. La reacción de difusión se lleva a cabo bajo condiciones adecuadas para acoplar las cadenas derivadas a la superficie de detección. En donde las cadenas tienen grupos de acoplamiento de tiol, y la superficie del electrodo es oro, la superficie se somete a condiciones leves electroquímicamente oxidantes, con una sal de perclorato presente en la solución, entonces se reaccionan con las cadenas bajo condiciones suavemente oxidantes. Puede monitorearse el grado de empacamiento, por ejemplo, mediante mediciones de elipsometría para determinar el grosor de la capa en la superficie de detección. En la densidad máxima, es decir, saturación, una longitud de cadena dada producirá un grosor dado de la capa monomolecular. Como una guía, las cadenas con C22 producen un grosor de la capa monomolecular máximo de aproximadamente 30Á, y cadenas de longitud más corta, capas monomoleculares proporcionalmente más delgadas . De esta manera, en el caso de una capa monomolecular formada de cadenas de C22, la formación pasiva de la capa monomolecular puede detenerse cuando se observe un grosor de la capa monomolecular de 25Á. La segunda etapa de difusión incorpora la difusión pasiva de las cadenas de tiol derivadas del ligando 56 en la capa monomolecular parcialmente formada, indicada en 60, de nuevo bajo condiciones de acoplamiento de tiolato adecuadas, hasta que se logre una capa monomolecular de densidad elevada 62, como se evidencia, por ejemplo, por el grosor medido de la capa monomolecular y/o una electrodeposición de grosor/curva de tiempo. Aunque este planteamiento se ha aplicado exitosamente a la producción de la capa monomolecular en la invención, padece de dos limitaciones. Primero, se requieren preferentemente periodos de difusión largos, en el orden de uno a varios días, para alcanzar una densidad de empacamiento máxima. Segundo, las cadenas del porcentaje que contienen ligandos unidos son difíciles de controlar de manera reproducible, de tal manera que las capas monomoleculares finales tendrán porcentajes de ligandos de mol variables, y de esta manera, diferentes características de desempeño. Estas limitaciones se superan substancialmente en el método ilustrado en la figura 3B, de acuerdo con otro aspecto novedoso de la invención. En este planteamiento, una mezcla de cadenas de hidrocarburo que portan el ligando y libres, tales como las cadenas 66, 68 respectivamente, a una proporción de mol deseado, se conducen activamente a la superficie al aplicar un potencial de voltaje positivo al substrato, indicado en la presente en 64. En la práctica, la mezcla de la cadena de hidrocarburos (aproximadamente cadenas de hidrocarburo de lmM) en una solución etanólica de perclorato de Li de 100 mM, pH neutro, se agrega colocado sobre el electrodo, y se aplica un potencial seleccionado al electrodo. La formación de la capa monomolecular puede monitorearse mediante el incremento en el grosor de la capa, como anteriormente. Sin embargo, preferentemente, la formación de la capa monomolecular se monitorea al medir el flujo del electrón a través de la capa monomolecular, por ejemplo, empleando la configuración del circuito mostrado en la figura 1. En este caso, la formación de la capa monomolecular, indicada en 70, se caracterizará por una caída estable en la corriente del electrodo, hasta que se alcance un flujo de corriente baja estable, a la cual se ha logrado un punto máximo de empacamiento de la cadena. El tiempo requerido para logra la densidad de empacamiento de saturación variará con el voltaje aplicado, y puede ser tan corto como 10 segundos, es decir, aproximadamente 4 ordenes de magnitud más rápido que la formación de la capa monomolecular por difusión. La figura 4 es una gráfica del grosor de la capa monomolecular formada utilizando una cadena de hidrocarburo C22 del grupo tiol bajo condiciones de acoplamiento similares a aquellas de arriba, después de 10 minutos en el voltaje del electrodo indicado. Como se observa, la formación de la capa monomolecular completa o casi completa (grosor de 30 Á) ocurre dentro de los 10 minutos a aproximadamente el potencial de IV (vs . NHE) y el anterior. En voltajes positivos inferiores, se requiere de un tiempo de reacción adicional. Preferentemente, el voltaje aplicado al electrodo es al menos un voltaje entre +250 mV en relación a un electrodo de hidrógeno normal (+250 vs . NHE) y 1.2V (vs. NHE) . No solo se lograron tiempos más rápidos de formación de la capa monomolecular, sino los porcentajes de las cadenas de ligandos y no ligandos presentes en la mezcla de reacción se representan de manera precisa en las capas monomoleculares, dando características del electrodo altamente reproducibles .

La figura 3C muestra una modificación del método de la figura 3B, en donde la mezcla de cadena de hidrocarburos reaccionada con el electrodo (indicado en 71) incluye cadenas sin ligandos, tales como las cadenas 72 y conjugados de la subunidad del péptido, tales como las indicadas en 74, que contienen una subunidad del péptido 76 que es capaz de formar un alfa-heterodímero de péptido helicoidal, estabilizado con una subunidad complementaria cargada de manera opuesta. Tales subunidades del heterodímero se describen en la solicitud de patente de PCT WO CA 95/00293, para "Método y Composición del Portador del Inmunogen del Polipéptido de Heterodímero" ("Heterodimer Polypeptide Immunogen Carrier Composition and Method"), fecha de publicación 23 de Noviembre de 1995, la cual se incorpora en la presente para referencia. Las subunidades ejemplificativas se refieren en la presente como arrollamientos K, que se refieren a subunidades cargadas positivamente cuya carga se proporciona dominantemente mediante residuos de lisina; y arrollamientos E, que se refieren a subunidades cargadas negativamente cuya carga se proporciona dominantemente mediante residuos de ácido glutámico. En la modalidad mostrada, la subunidad 76 se une al extremo distante de una cadena de hidrocarburo 78 (extremo opuesto del grupo tiol de la cadena) mediante la conjugación adecuada de lípido a péptido, por ejemplo, mediante el enlace del éster a un ácido graso de hidrocarburo. Alternativamente, y como se describe abajo, la subunidad del péptido puede unirse a la superficie del electrodo a través de un espaciador de péptido, por ejemplo, el espaciador de tripéptido que se extiende de un extremo de la subunidad e incluye cisteina como un residuo terminal, para la unión del sulfhidrilo a la superficie del electrodo. En ambos casos, el conjugado de la subunidad del péptido se mezcla con las cadenas de hidrocarburo, en una proporción molar seleccionada, después se conducen hacia una formación de la capa monomolecular al aplicar un voltaje positivo al electrodo, como anteriormente, hasta que se forme una capa densamente empacada 80. Un ligando adecuado se une entonces a la capa monomolecular al contactar la capa monomolecular con un conjugado ligando-arrollamiento 82 compuesto del complemento cargado de manera opuesta del arrollamiento de la capa monomolecular, indicado en 84, acoplado a un ligando seleccionado 86. Las dos subunidades cargadas de manera opuesta se ensamblan por si mismas de manera espontánea en los heterodímeros, acoplando efectivamente el ligando a las capas monomoleculares con la constante de elevada afinidad de los dos heterodímeros . El método proporciona, además de las ventajas arriba mencionadas con respecto a la figura 3B, un substrato biosensor "universal" que puede modificarse para incluir uno de un gran número de diferentes ligandos en la capa monomolecular del substrato, simplemente al contactar el substrato universal con un conjugado de la subunidad del péptido cargada de manera opuesta y el ligando seleccionado. En el ejemplo mostrado en la figura 3C, una capa monomolecular del substrato universal 80 se convierte en una capa monomolecular del ligando específico 88 mediante la adición del conjugado del ligando específico 82. C. Características del Biosensor: Ligando Directamente Unido Esta sección examina las propiedades dieléctricas de los biosensores de la invención, como se comprueba por las propiedades de conductancia de las membranas de la capa monomolecular del biosensor en la presencia y ausencia del aglutinamiento ligando-receptor. La presente sección considera a las membranas teniendo ligandos directamente unidos del tipo descrito con respecto a las figuras 3A y 3B. La siguiente sección examina las propiedades eléctricas similares en las membranas del biosensor, en las cuales el ligando se une a través de las subunidades del péptido del heterodímero, como se describe con respecto a la figura 3C.

Las características operacionales básicas del biosensor, se ilustran en la figura 5. La figura muestra un electrodo del biosensor 90 en un aparato biosensor del tipo descrito en la figura 1, en donde se forma una capa monomolecular del electrodo 92, como anteriormente, de un arreglo densamente ordenado de cadenas de hidrocarburo que contiene moléculas de ligando, tal como la molécula 94, unida a los extremos distantes de algunas de las cadenas. El electrodo se encuentra en contacto con una solución de la especie iónicas, indicada en 98, capaz de experimentar una reacción redox, es decir, perder o ganar un electrón, en un electrodo cargado de manera adecuada. La especie redox ejemplificativas son Fe (CN) 63"/4~. como las especie cargada de manera negativa, y Ru (NH3) 62+ 3+ como la especie cargadas de manera positiva. Otras pruebas que pueden utilizarse incluyen Mo(CN)63"(E0 = +800 mV) , W(CN)63" (E0 = +580 mV) , Fe(CN)4" (E0 = +580 mV) , Ce+ 3+, (E0 = +1.4 V) y Fe+32+, (E0 = +666 mV) . Las concentraciones de ion redox típicas son de entre 0.01 y 10 mM. La solución redox se contiene en una cámara, como la cámara 38 en la figura 1, y se encuentra en contacto con los electrodos, de referencia y contador. El potencial de voltaje colocado en el electrodo, es decir, entre el electrodo y el electrodo de referencia, es típicamente de al menos 90 mV arriba del valor potencial electroquímico (e0) , de la especie redox para la oxidación y al menos 90 mV por debajo del potencial electroquímico para la reducción de las especies. Considerando, por ejemplo, Fe (CN) 63~/4A con un E0 de 450 mV (vs . NHE). Un potencial del electrodo por arriba de aproximadamente 550 mV, cualquier especie de Fe2+ se oxidiza a Fe3+ , y en un potencial del electrodo por debajo de aproximadamente 350 mV, y Fe+3 se reduce a Fe+2. Del mismo modo, Ru(NH3) 2+/3+ tiene un E0 de +50 mV (vs . NHE), por lo que se logra la oxidación a un potencial del electrodo por arriba de aproximadamente +150 mV, y la reducción, por debajo de aproximadamente -50 mV. En la ausencia del receptor que se aglutina al ligando, la capa monomolecular retiene' su empacamiento ordenado denso, formando una barrera efectiva para el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediada por la especie de ion redox, cuando se coloca un potencial de oxidación o reducción adecuado a través de la capa monomolecular. Esto se refleja por una corriente medida en cero o baja, a través de la membrana. La constante dieléctrica de la capa monomolecular en esta condición típicamente es de aproximadamente 1-2. Con el aglutinamiento de un receptor 96 al ligando, en una capa monomolecular, como se muestra a la derecha de la figura, la estructura ordenada de la capa monomolecular se perturba suficientemente para permitir el movimiento de la especie redox a través de la capa monomolecular, que produce el flujo del electrón a través del electrodo. Las mediciones realizadas en apoyo de la invención indican que un caso de activación conduce de 102 a 10s casos de transferencia de electrón y iónico por segundo, y de esta manera es elevadamente multiplicativo. El biosensor registra este caso de aglutinamiento como un incremento en la corriente a través del electrodo, es decir, entre los electrodos, de funcionamiento y contador. Mediante la analogía a un transistor, la solución de redox sirve como la "fuente", la capa monomolecular como la "entrada" y el electrodo subyacente como la "descarga" . El flujo de la corriente en un transistor se inicia mediante la aplicación de un voltaje de umbral a la entrada. En el biosensor de la invención, el flujo de la corriente se inicia por un estímulo, en este caso, un caso de aglutinamiento ligando-receptor, a la "entrada" de la capa monomolecular. Un electrodo del biosensor 100 se construye de acuerdo con la invención, y teniendo un ligando disacárido indicado en 102, se muestra antes y después del aglutinamiento del receptor en las figuras 6A y 6B, respectivamente. La síntesis de la cadena de hidrocarburo disacárido utilizada en la membrana se describe en los ejemplos ID y 1E . El electrodo se preparo como se describe con referencia a la figura 3B, empleando una proporción de cadenas de ligandos a sin ligandos de aproximadamente 4 a 1. El disacárido es específicamente reactivo con un péptido de PAK de Pseudomonas, indicado en 104, formando un par ligando-receptor con el péptido. El incremento en la corriente del electrodo del biosensor, cuando se agrega el receptor del péptido de PAK a la cámara del biosensor, se observa en la figura 7 tanto para la oxidación (círculos sólidos) como para la corriente de reducción (cuadrados abiertos) de Fe(CN) El incremento extra refleja presumiblemente las cinéticas del aglutinamiento, demostrando que el biosensor también es útil en medir la proporción de casos de aglutinamiento ligando-receptor. La figura 6B ilustra la perturbación de la estructura de la cadena de hidrocarburo con el aglutinamiento del receptor. Como otro ejemplo, el electrodo del biosensor ilustrado en las figuras 8A-8C (electrodo 22 de la figura 2) , tiene un ligando trisacárido 52 que se muestra antes y después del aglutinamiento del receptor en la figura 6A y figuras 6B y 6C, respectivamente. La síntesis de la cadena de hidrocarburo-trisacárido utilizada en la membrana se describe en los Ejemplos IB y ÍC. El electrodo se preparo como se describe con referencia a la figura 3B, empleando una proporción de cadenas ligando a sin ligando de aproximadamente 4 a 1. El disacárido es específicamente reactivo con una Verotoxina, indicada en 106, formando un par ligando-receptor. La Verotoxina se preparo como se describe en el Ejemplo 2. Las figuras 8B y 8C ilustran dos configuraciones de aglutinamiento posibles . La configuración en la figura 8B tiene poco efecto en la estructura de la capa monomolecular, y por lo tanto en la corriente del biosensor, debido a que el aglutinamiento se encuentra "remoto" de la superficie de la membrana; la configuración ilustrada en la figura 8C, por el contrario, produce perturbación significativa de la estructura de la capa monomolecular, y de esta manera se esperaría que aumentara significativamente la corriente del biosensor. Los gráficas de las corrientes de, oxidación y reducción, mostradas en la figura 9 demuestran que la Verotoxina que se aglutina a la membrana, de hecho produce un cambio mayor en la estructura de la capa monomolecular. Como se observa, tanto la corriente de oxidación como de reducción se incrementan desde niveles de casi cero, en la ausencia de Verotoxina, hasta un nivel en el rango de µAmp una hora después de que se introduce la Verotoxina en el biosensor. En los ejemplos anteriores, la estimulación de la corriente del biosensor mediante el aglutinamiento del receptor puede ser el resultado de (i) perturbación estérica de las cadenas de la capa monomolecular, como se indica en las figuras 6B y 8C; (ii) efectos de carga en la superficie de la capa monomolecular debido a grupos cargados en el receptor, o (iii) una combinación de ambos efectos . Los estudios conducidos en apoyo de la invención indican que ambos efectos pueden ser operativos. El efecto de disrupción de la cadena de hidrocarburo en la capa monomolecular del biosensor, se examino al graficar la corriente del biosensor como una función de temperatura del electrodo. Si la disrupción de la cadena lípida conduce a un mayor flujo del electrón en el biosensor, aumentando la temperatura de la capa monomolecular, y de esta manera el movimiento de las cadenas lípidas, deberá incrementar el flujo del electrón mediado medido por los portadores redox. De hecho, esto se observó, como se observa en la figura 10. La gráfica de corriente/temperatura tiene un valor máximo que corresponde a la temperatura de transición de fase de las cadenas de la capa monomolecular (aproximadamente 55°C), consistente con la idea de que la disrupción máxima del líquido ocurre en el punto de la extensión máxima de los límites de fase en las cadenas de hidrocarburo . El efecto en la conductancia de la carga en la superficie de la capa monomolecular puede observarse a partir de las figuras 11 y 12. En el estudio representado en la figura HA, un ligando cargado de manera negativa se une a los extremos distantes de una porción de las cadenas que forman la capa monomolecular. En la figura, el electrodo se indica en 108, la capa monomolecular en 110, las cadenas que forman la capa monomolecular en 112 y los ligandos unidos de la cadena en 114. La corriente del electrodo se midió por la especie redox cargada de manera negativa Fe (CN) 63" 4", e independientemente, con la especie cargada de manera positiva Ru (NH3) s2+ 3+, en los potenciales de oxidación indicados arriba. Como se observa en la figura 11B, la corriente de oxidación para la especia cargada de manera positiva muestra la conducta dependiente del ion esperada para la migración del ion a través de la capa monomolecular, indicando que la capa monomolecular es conductiva para la especie redox cargada de manera positiva. En esta figura, el electrodo se indica en 116, la capa monomolecular en 118, las cadenas que forman la capa monomolecular en 120 y los ligandos unidos a la cadena en 122. De manera contraria, no se observó flujo significativo del electrón con la especie redox cargado de manera negativa. Los resultados similares se obtuvieron con una capa monomolecular diseñada para contener un ligando de la superficie cargado de manera positiva, como se ilustra en la figura 12A. En este caso, se observó la corriente dependiente del ion para la oxidación de la especie redox de ion cargado de manera negativa, pero no para la especie de rutenio cargada de manera positiva. D. Características del Biosensor: Licrando Unido al Heterodímero En otra modalidad, el ligando en el biosensor se fija a la superficie del biosensor, es decir, se incrusta dentro de la capa monomolecular de cadena de hidrocarburos, mediante un complejo de heterodímeros doblemente arrollados formado de dos péptidos de la subunidad. Los péptidos de la subunidad de heterodímero empleados en la invención del biosensor, son dos no idénticos, preferentemente cadenas de polipéptidos cargadas de manera opuesta, típicamente cada una de aproximadamente 21 a aproximadamente 70 residuos de longitud, teniendo una secuencia de aminoácido compatible con su formación en dobles arrollamientos heterodiméricos a-helicoidales, de dos filamentos. En la presente se designan como HSP1 (péptido 1 de la subunidad de heterodímero) y HPS2 (péptido 2 de la subunidad de heterodímero) . En la descripción de abajo, el HSP1 se referirá al péptido unido a la superficie del biosensor en el biosensor, y HSP2 al péptido que tiene un ligando unido. Se entenderá que estas designaciones se refieren al papel funcional ejecutado por el péptido de la subunidad, no a la secuencia real del péptido. En medio acuoso, los péptidos de la subunidad del heterodímero aislados son típicamente arrollamientos aleatorios. Cuando HSP1 y HSP2 se mezclan juntos bajo condiciones que favorecen la formación de heterodímeros doblemente arrollado a-helicoidales, estos interactúan para formar un complejo heterodimérico doblemente arrollado a-helicoidal de dos subunidades. Los péptidos en una conformación doblemente arrollado a-helicoidal interactúan uno con otro de una manera característica que se determina por la secuencia primaria de cada péptido: la estructura terciaria de un a-helicoidal es de tal manera que 7 residuos de aminoácido en la secuencia primaria corresponden a aproximadamente 2 vueltas del a-helicoidal. De acuerdo con lo anterior, una secuencia de aminoácido primaria que ocasiona una conformación a-helicoidal puede descomponerse en unidades de 7 residuos cada una, llamadas heptadas . Los péptidos de la subunidad de heterodímero se componen de una serie de heptadas en tanden. Cuando la secuencia de una heptada se repite en un péptido de la subunidad del heterodímero particular, la heptada puede referirse como una "repetición de heptada", o simplemente "repetición". Los tipos específicos de residuos de aminoácido en posiciones definidas en cada heptada actúan para estabilizar la estructura o complejo heterodimérico doblemente arrollado a-helicoidal de dos filamentos. Los péptidos del heterodímero también puede contener residuos que pueden reaccionarse (ya sea intra- o inter-helicoidalmente) para estabilizar la naturaleza a-helicoidal o doblemente arrollado de los polipéptidos. Un ejemplo de una modificación de estabilización es la incorporación de puentes de lactama en las repeticiones, primera y última (terminal) de los péptidos de la subunidad del heterodímero, como se describe en la solicitud del PCT WO CA95/00293 para "Método y Composición del Portador Inmunogeno del Polipéptido del Heterodímero" ("Heterodimer Polypeptide Immunogen Carrier Composition and Method"), fecha de publicación 23 de Noviembre de 1995, la cual se incorpora en la presente para referencia. La dimerización de HSP1 y HSP2 se debe a la presencia de un motivo de la heptada repetida de residuos de aminoácidos conservados en cada secuencia de aminoácidos primaria del péptido. Los motivos de la heptada de repetición que tienen secuencias de aminoácido apropiadas se dirigen a los polipéptidos HSP1 y HSP2 para instalarlos en una estructura doblemente arrollado a-helicoidal heterodimérica bajo condiciones permisibles. Los péptidos a-helicoidales individuales hacen contacto uno con otro a lo largo de sus faces hidrofóbicas respectivas. El HSP1 y HSP2 pueden instalarse en un heterodímero de hélice doblemente arrollada (heterodímero doblemente arrollado) en configuraciones ya sea paralelas o antiparalelas. En una configuración paralela, las dos hélices del péptido de la subunidad del heterodímero se alienan de tal manear que tienen la misma orientación (amino-terminal a carboxilo-terminal) . En una configuración antiparalela, las hélices se instalan de tan manera que el extremo amino terminal de una hélice se alinea con el extremo carboxilo-terminal de la otra hélice, y viceversa. Los péptidos de la subunidad de heterodímero diseñados de acuerdo con la guía presentada en la solicitud del PCT anterior, típicamente muestran una preferencia a instalarse en una orientación paralela vs . una orientación antiparalela. Por ejemplo, los péptidos ejemplificativos identificados por la SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO: 2 en la solicitud de patente PCT CA95/00293 anterior, forman heterodímeros de configuración paralela, como lo hacen otras secuencias de péptido descritas en la solicitud de PCT. Cuando se une un ligando al HSP2 , generalmente es deseable unir el ligando en o cerca del extremo del péptido que formará el extremo distante del heterodímero. En particular, en donde el heterodímero forma una configuración paralela, el péptido HSP1 se fija preferentemente a la superficie del biosensor en su término C, y el ligando unido al péptido HSP2 en su término N. Como se anotó, uno de los dos péptidos de la subunidad (HSP1) en el heterodímero se une a la superficie del biosensor, y el segundo péptido (HSP2) contiene un ligando propuesto para participar en una reacción de aglutinamiento ligando/anti-ligando dependiente del analito. En ambos casos, el péptido se sintetiza, o deriva después de la síntesis, para proporcionar el requisito de función de unión y ligando, respectivamente. Considerando la modificación del HSP1, el péptido puede sintetizarse, en ya sea su término N o C, para portar los péptidos terminales adicionales que pueden funcionar como un espaciador entre la superficie del biosensor y la parte de formación helicoidal del péptido. Alternativamente, el péptido HSP1 puede unirse a la superficie del biosensor a través de una reacción de aglutinamiento de afinidad elevada, tal como entre un residuo de biotina portada en el péptido y una molécula de avidina unida covalentemente a la superficie. En donde el heterodímero se incrusta en una capa monomolecular de cadena de hidrocarburo, como se describe abajo, el espaciador que fija el péptido de HSP1 a la superficie del biosensor puede ser una cadena de hidrocarburo . La cadena es preferentemente una longitud fraccional de las cadenas que integran la bicapa, de tal manera que los extremos distantes de los péptidos del heterodímero en la capa monomolecular instalada, se encuentran en o cerca de la superficie expuesta de la capa monomolecular. De esta manera, por ejemplo, si la capa monomolecular se integra de cadenas de 18 carbonos, el espaciador es preferentemente de 2-10 carbonos en longitud, dependiendo de la longitud del heterodímero instalado. El espaciador de cadena de hidrocarburo, en la forma de un ácido graso omega-tio, puede acoplarse a un acoplamiento amina o hidroxilo terminal durante la síntesis de fase sólida, como se describe arriba. El péptido derivado, a su vez, puede unirse a una superficie metálica mediante el acoplamiento de tiolato estándar (Dakkouri, y cois, Lanqmuir (1996) 12 : 2849-2852) . supra) . Considerando la unión ligando a HSP2, el ligando seleccionado se determinará por el analito a probarse. Los pares de aglutinamiento ligando-receptor, es decir, pares ligando/agente de aglutinamiento-ligando utilizados comúnmente en el diagnóstico incluyen, antígeno-anticuerpo, hormona-receptor, medicamento-receptor, antígeno de superficie celular-lectina, biotina-avidina, substrato/enzima y filamentos de ácido nucleico complementarios. El ligando es típicamente el más pequeño de los dos miembros del par de aglutinamiento, particularmente en donde el ligando se une a una capa monomolecular de cadena de hidrocarburo, como se describe abajo. Sin embargo, la unión de cualquier par de aglutinamiento se contempla en la presente. En donde el ligando es un polipéptido, por ejemplo un antígeno de péptido, el antígeno puede sintetizarse por cualquiera de los métodos resombinantes o de estado sólido, para incluir el antígeno de péptido en el extremo del péptido HSP2 que se orientará distantemente en el heterodímero instalado. Cuando el ligando es un residuo no péptido, por ejemplo, ácido nucleico, medicamento u hormona no péptida, el péptido HSP2 puede sintetizarse para incluir uno o más residuos que pueden derivarse específicamente con el ligando. El ligando preferentemente se une covalentemente a los residuos de aminoácido de N-terminal, o a uno o los residuos que revisten el lado expuesto del heterodímero . Los grupos de acoplamiento preferidos son grupos de tiol de residuos de cisteina, los cuales se modifican fácilmente mediante métodos estándar. Otros grupos de acoplamiento útiles incluyen el tioéster de metionina, el grupo de imidazolilo de histidina, el grupo de guanidinilo de arginina, el grupo fenólico de tirosina y el grupo de indolilo de triptofano. Estos grupos de acoplamiento pueden derivarse utilizando las condiciones de reacción conocidas por aquellos expertos en la materia. Para unir el péptido de HSP2 derivado del ligando al péptido de HSP1 inmovilizado de la superficie, los dos péptidos hacen contacto bajo condiciones que favorecen la formación del heterodímero. Un medio que favorece la formación del heterodímero doblemente arrollado es una solución acuosa fisiológicamente compatible, que tiene típicamente un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8 y una concentración de sal de entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 500 mM. Preferentemente, la concentración de sal se encuentre entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 200 mM. Un medio benigno ejemplificativo tiene la siguiente composición: 50 mM de fosfato de potasio, 100 mM de KCl, pH 7. El medio igualmente efectivo puede elaborarse al substituir, por ejemplo, el fosfato de sodio por fosfato de potasio y/o el NaCl por KCl. Los heterodímeros pueden formarse bajo condiciones fuera del medio, de pH y rango de sal anteriores, pero algunas de las interacciones moleculares y estabilidad relativa de los heterodímeros vs . homodímeros puede diferir de las características arriba detalladas. Por ejemplo, las interacciones iónicas entre los grupos iónicos que tienden a estabilizar los heterodímeros pueden descomponerse en valores de pH bajos o elevados debido a la protonación de, por ejemplo, cadenas de lado Glu en pH acídico, o la desprotonación de, por ejemplo, cadenas del lado Lys en pH básico. Sin embargo, tales efectos de los valores de pH bajos y elevados en la formación del heterodímero doblemente arrollado, pueden superarse, al incrementar la concentración de sal . El incremento de la concentración de sal puede neutralizar las atracciones iónicas de estabilización o suprimir las repulsiones iónicas de desestabilización. Ciertas sales tienen mayor eficacia en neutralizar las interacciones iónicas. Por ejemplo, en el caso del péptido de arrollamiento K en la figura 2A, se requiere una concentración de 1 mM o mayor de aniones C104"" para inducir la estructura a-helicoidal máxima, mientras que se requiere una concentración de 3M o mayor de iones Cl" para el mismo efecto. Los efectos de la sal elevada en la formación del doble arrollamiento en pH bajo y elevado, también muestra que las atracciones iónicas interhelicoidales no son esenciales para la formación de la hélice, pero preferentemente, controlan si un doble arrollamiento tiende a formarse como un heterodímero vs . un homodímero. La figura 13A muestra un electrodo del biosensor 124, en el cual la capa monomolecular de la cadena de hidrocarburo indicada, incluye una subunidad del péptido de arrollamiento K, tal como la subunidad 128, como se describe arriba. En la modalidad mostrada, cada subunidad de péptido se acopla a la superficie del electrodo a través de un espaciador de tripéptido, tal como el espaciador 130 en la subunidad 128, el cual por si mismo se une a la superficie del electrodo a través de un enlace de sulfidrilo, como se muestra. El péptido, que incluye el espaciador de péptido, se forma convencionalmente, por ejemplo, mediante síntesis de fase sólida. La cantidad de subunidad de péptido en la capa monomolecular es de aproximadamente 20 por ciento molar. La capa monomolecular se formo de acuerdo al método descrito arriba con respecto a la figura 3C. Como se indica arriba, la subunidad de péptido puede acoplarse alternativamente a los extremos distantes de una porción de las cadenas de hidrocarburo en la capa monomolecular, colocando la subunidad más sobre la superficie de la capa monomolecular. Un conjugado de la cadena de hidrocarburo-péptido adecuado para esta aplicación puede elaborarse, por ejemplo, al unir una cadena de hidrocarburo de extremo activado al aminoácido terminal del péptido, como la etapa terminal en la síntesis de fase sólida. Presumiblemente, debido a la carga positiva impartida a la capa monomolecular por las subunidades de arrollamiento K, la capa monomolecular muestra conductancia relativamente elevada para la especie redox cargada de manera negativa, tal como Fe(CN)s3", como se prueba por una corriente de reducción u oxidación relativamente elevada con la especie redox. La figura 13B muestra la misma capa monomolecular, pero después de la adición de subunidades de arrollamiento E cargadas de manera negativa, complementarias, tal como se indica en 130. Como se muestra, las subunidades cargadas de manera opuesta se emparejan para formar heterodímeros de carga neutral en la capa monomolecular. Este emparejamiento es efectivo para reducir substancialmente la conductancia de la capa monomolecular, como se prueba por el descenso dependiente del tiempo en la corriente de reducción u oxidación medida en la presencia de iones de Fe(CN)s3" (figural4) . Como se muestra en la figura 3C, la segunda subunidad de péptido, por ejemplo, la subunidad de arrollamiento E, agregada a la capa monomolecular puede derivarse con un ligando, produciendo una capa monomolecular que tiene heterodímeros de carga neutral incrustados en la misma (o unidos a la superficie de la capa monomolecular) , y un ligando expuesto en la superficie de la capa monomolecular. El electrodo resultante es efectivo para medir los casos de aglutinamiento ligando-receptor específico en un biosensor operado de acuerdo con la invención. Las características de operación de tal biosensor se ilustran en la figura 15. El electrodo en este biosensor incluye (i) una capa monomolecular con arrollamientos K incrustados unidos covalentemente a la superficie del electrodo, (ii) arrollamientos E complementarios que forman heterodímeros con los arrollamientos K en la capa monomolecular y (iii) ligandos de disacárido de la superficie del tipo mostrado en la figura 6 unidos covalentemente a los arrollamientos E y colocados por lo tanto en la superficie de la capa -monomolecular. Como se observa en la figura 15, la adición de un receptor de proteína PAK (ver figura 6B) produce un incremento tanto en las corrientes de reducción como de oxidación, con el tiempo extra de incremento la corriente que refleja presumiblemente los casos de aglutinamiento adicionales después de la adición del receptor al electrodo del biosensor. Un biosensor similar que tiene un trisacárido, en lugar de disacárido, probo el ligando unido a la subunidad de arrollamiento E en la capa monomolecular del electrodo con el receptor de Verotoxina descrito arriba con respecto a la figuras 8A-8C, con los resultados observados en la figura 16. Las líneas sólidas en la figura muestran el incremento en la corriente de oxidación y reducción observada, como una función de tiempo, después de la adición de Verotoxina.

Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar, pero de ninguna manera para limitar la invención. Ejemplo 1 Síntesis de los Receptores en una Forma Adecuada para la Inmovilización en un Electrodo de Oro La tosilación selectiva de 1, 16-dihidroxihexano proporcionó el alcohol 1 monotosilatado en 42% de la producción. El trisacárido 2, obtenido como se describe en la literatura (Janson y cois, J. Org. Chem. 53 : 5629 (1988) ) , se convirtió en una mezcla anomérica de tricloroacetamidatos 3. La glicosilación del alcohol 1 con el donador de glicosil 3 en CH2C12 en la presencia de una cantidad catalítica de triflurometanosulfonato de trimetilsililo dio glicósido de trisacárido ?-tosilato 4, el cual se utilizo en la siguiente etapa sin purificación. El grupo tosiloxi del compuesto 4 se substituyo por tiocianato para proporcionar el glicósido de trisacárido 5, terminado en el extremo de reducción por el brazo espaciador que contiene la función de tiol cubierto. La reducción del tiocianato mediante la acción del borohidrido de sodio (Olsen, R.K. y Snyder, H.R. J. Org. Chem. 30:184 (1965) .) seguida por la saponificación de los grupos de acetato dada el receptor del trisacárido 6. El imidato de disacárido 7 se hizo reaccionar con alcohol 1 de una manera similar a aquella descrita para el trisacárido 4. La síntesis del donador del glicosido de disacárido 7 no se describe en la presente, pero sigue los métodos establecidos que se consideran una técnica general . La substitución nucleofílica del grupo tosiloxi por tiocianato se llevo a cabo como se describe para la preparación de 5 para dar el compuesto 8. La reducción del tiocianato se conduce por la deacetilación proporcionada por el receptor de disacárido sintético 9. A. 16- (p-toluensulfoniloxi) hexadecanol (Estructura 1) A una solución de 1.1 g de 1,16-dihidroxihexadecano en 10 ml de piridina en seco, se agregaron 0.8 g de cloruro de tosilo. Después de 2 hrs. la mezcla se concentro diluida con 20 ml de acetona, se agregaron 5 g de Si02 y la acetona se retiro al vacío. El sólido se aplico en Si02 y se eluyó con pentano-acetato de etilo (2:1) para producir 748 mg (42%) de C-101. B. 2,3,4, 6-tetra-O-acetil-D-cralactopiranasil (al-»4) -6-0-acetil-2 , 3 -di-O-benzoil-D-galactopiranosi1 (ßl—>4) -2,3, 6-tri-O-benzoil-D-glucopiranosil (ßl?O) - (16-tiociano) hexadecanol (Estructura 5) Una mezcla de 277 mg de imidato, 100 mg de C-101 y 0.5 g de mol cribas (4A) se agito por lhora. Después se agregaron 8 µl de TMSOTf . Después de 2 horas se agrego 1 ml de EA, el sólido se retiro mediante filtración. El filtrado se concentró y seco al vacío. Una solución del residuo y 200 mg de KSCN en 6 ml de DMF se agito a 80 °C por 2 horas. La mezcla se concentró, disolvió en 30 ml de CH2C12, se lavó con agua y se concentro de nuevo. La cromatografía del residuo en Si02 con pentano-etil acetato (3:2) dio 225 ml (73%) de C-105. C. D-Galactopiranosil (al-»4) D-galactopiranosi1 (ßl—>4) -D-glucopiranosil (ßl—>0) - (16-tio) hexadecanol (Estructura 6) A una solución de 60 mg de C-105 en 4 ml de MeOH seco ~ 40 mg de NaBH4, se agregó Ar. Después de la agitación por 2 horas a 45 °C, la mezcla se concentro y disolvió bajo reflujo moderado en una solución de 50 mg de NaOH en 10 ml de agua. Después de la agitación durante la noche a 45 °C, la mezcla se neutralizó con cationita (H+-forma) y se aplico en "Seppak" (C-18) . El cartucho se enjuago con 20, 40, 50, 80 y 100% de la solución de MeOH en agua. Las fracciones del 100% de MeOH se concentraron para dar 24.4 mg (81%) de C-106. D. (16-tiociano) hexadecanil 4-Q- (2-acetamido-3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2 -D-galactopiranosil) -2,3, 6-O-acetil-ß-D-galactopiranosida C-108 (Estructura 8) La mezcla de 100 mg de imidato 7, 68 mg de C-101 y 100 mg de cribas de mol (4A) en 5 ml de CH2C12, se agitó por 1 hora. Después se agregaron 5 µl de TMSOTf . Después de 2 horas, se agrego 1 ml de EA, el sólido se retiro mediante filtración. El filtrado se concentro y seco al vacío. Una solución del residuo y 70 mg de KSCN en 3 ml de DMF se agito a 80 °C por 2 horas. La mezcla se concentro, se disolvió en 30 ml de CH2C12, se enjuagó con agua y se concentró de nuevo. La cromatografía del residuo en Si02 con pentano-etil acetato (2:1) dio 82 mg (70%) de C-108. E. (16-tiohidroxi) hexadecanil 4-Q- (2-acetamido-2-deoxi-ß-D-galactopiranosil) -ß-D-galactopiranosida (Estructura 9) Una solución de 54.2 mg de 8 (C-108) y 40 mg de NaBH4 en 3 ml de MeOH seco se refluyo por 2 hrs, después se neutralizo con Dowex (H+) , se concentro y cromatografió en C-18 en H20 (50:50) :100) para producir 19.7 mg (52%) de C-lll. Ejemplo 2 Aislamiento del Receptor de Verotoxina Shiga, como la toxina I (Vero) (SLT-I) se purifico a partir de Escherichia coli JM101 (pJB128) en un procedimiento de una sola etapa, utilizando CHROMOSORB-P que contiene análogos sintéticos covalentemente acoplados de los receptores celulares huéspedes (SYNSORB-Pl) de las toxinas aGal (1 , 4) ßGal (digalactosida) . Las bacterias se desarrollaron en los frascos de Fernbach con deflector a 37°C en carbenicilina- (50 µg/ml) de caldo de soya tríptico suplementado (TSB) que contiene SYNSORB-Pl (15 g/L) para aglutinar la toxina liberada de las células en desarrollo.

Los cultivos de la última fase log se trataron durante 30 minutos a 37 °C con sulfato de Polimixina B (0.1 mg/ml) para liberar el SLT-1 intracelular y también permitir que este se aglutine al SYNSORB-Pl. Después, el SYNSORB-Pl se recolecto y lavó completamente con 250 mM de NaCl (pH 3.8) para retirar las células y residuos celulares. El SLT-1 se eluyó del SYNSORB-Pl lavado utilizando 50 mM de base Tris (pH 10) que contiene 250 mM de NaCl (TN) y se concentro utilizando una unidad de ultrafiltración de Amicon. El SLT-1 concentrado fue estable por semanas a 4°C y podría enfriarse por períodos de tiempo prolongados sin pérdida apreciable de actividad. En promedio, se recupero 61% (n = 10, SD promedio = 8, rango de 48% a 76%) de la actividad del SLT en los cultivos de TSB tratados con Polimixina original, en la fracción de TN eluida del SYNSORB-Pl . Los análisis electroforéticos del gel SDS-poliacrilamida de la preparación del SLT-1 revelaron dos bandas prominentes teñidas de azul Coomassie. El peso molecular de estas dos bandas se calculo para ser de 35,000 y 7,500, respectivamente. La banda de 7.5 KDz reaccionó en inmunomanchas western con SLT-1 pero no con el anticuerpo monoclonal de subunidad específica SLT-II B. El análisis de microsecuencia de amino terminal de ambas bandas confirmaron su identidad como las subunidades A y B del SLT-I. La producción promedio de SLT-I fue de 0.32 mg/L (n = 8, SD promedio = 0.3, rango de 0.1 a 0.8) del cultivo de TSB y su actividad específica en el análisis de citotoxicidad de Vero fue de 4.4 pg/mL/CD 5,0 • Los resultados demostraron la utilidad del SYNSORB en la fácil y rápida purificación de las lectinas o toxinas de aglutinamiento de carbohidrato. Aunque la invención se ha descrito con respecto a diversos métodos y modalidades específicas, se apreciará que diversas modificaciones y cambios pueden hacerse sin apartarse de la invención.

Claims (20)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. 1. Un aparato biosensor para detectar un caso de aglutinamiento entre un ligando y un receptor que aglutina al ligando, que comprende: un electrodo que tiene (i) una superficie de detección, (ii) formada en dicha superficie de detección, una capa monomolecular compuesta de cadenas de hidrocarburo fijas en sus extremos próximos a la superficie de detección, y teniendo extremos distantes libres que definen una superficie de la capa monomolecular expuesta, siendo dichas cadenas suficientemente ordenadas y empacadas compactas para formar una barrera efectiva para el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediado por una especie de ion redox en una solución acuosa en contacto con la capa monomolecular, y (iii) el ligando unido a la capa monomolecular, en la superficie de la misma, de tal manera que el aglutinamiento del ligando al receptor que aglutina al ligando, perturba suficientemente a la capa monomolecular para incrementar mesurablemente el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediado por tal especie de ion redox; una cámara para contener tal solución acuosa de la especie redox en contacto con dicha capa monomolecular, medios para introducir el receptor en dicha cámara, y medios de circuito para medir el flujo del electrón mediado por el ion a través de dicha capa monomolecular, en respuesta a los eventos de aglutinamiento que ocurren entre dicho receptor y el ligando.
2. 2. El aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque la capa monomolecular incluye además un complejo de la subunidad del heterodímero compuesto de péptidos, primero y segundo, que juntos forman un heterodímero doblemente arrollado a-helicoidal, en donde: (i) dicho primer péptido se aglutina covalentemente a la superficie de detección, (ii) el ligando se une covalentemente al segundo péptido; (iii) el aglutinamiento del segundo péptido al primer péptido, para formar tal complejo, es efectivo para reducir mesurablemente el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediado por tal especie de ion redox, con relación al flujo del electrón observado en la presencia del primer péptido solo, y (iv) el aglutinamiento de un ligando al receptor que aglutina al ligando, con tal parte de formación de dicho complejo, es efectivo para incrementar mesurablemente el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediada por tal especie redox.
3. 3. El aparato según la reivindicación 2 , caracterizado porque la primer subunidad de péptido se fija covalentemente a la superficie de detección a través de un espaciador de oligopéptido o un espaciador de cadena de hidrocarburo .
4. 4. El aparato según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el electrodo tiene una superficie de detección de oro y dicha capa monomolecular se compone de cadenas de 8-22 átomos de carbono unidas en sus extremos próximos a la superficie de detección mediante un enlace de tiolato.
5. 5. El aparato según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dichas cadenas tienen una densidad molecular de aproximadamente 3 a 5 cadenas/nm2.
6. 6. El aparato según la reivindicación 4, caracterizado porque la constante dieléctrica de dicha capa monomolecular, en la presencia de tal solución pero en la ausencia de tal receptor de aglutinamiento, es menor a aproximadamente 2.
7. 7. El aparato según la reivindicación 5, caracterizado porque el cambio en la constante dieléctrica de dicha capa monomolecular, en la presencia de tal solución y una cantidad perceptible de tal receptor de aglutinamiento, es al menos de aproximadamente 10%.
8. 8. El aparato según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque, para utilizarse en la detección de la presencia, en una muestra de fluido corporal, de un receptor que se forma con dicho ligando, un par de aglutinamiento ligando-receptor seleccionado del grupo que consiste de antígeno-anticuerpo, hormona-receptor, medicamento-receptor, antígeno de superficie celular-lectina, biotina-avidina, oligosacárido-receptor de aglutinamiento, oligonucleotido-proteína de aglutinamiento de ADN y filamentos de ácido nucleico complementarios, en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste de antígenos, hormonas, medicamentos, antígenos de superficie celular, y oligonucleotidos .
9. 9. El aparato según la reivindicación 8, caracterizado porque el ligando es un oligosacárido.
10. 10. El aparato según la reivindicación 9, caracterizado porque el ligando es un trisacárido y el receptor es un receptor de Verotoxina.
11. 11. El aparato según la reivindicación 10, caracterizado porque el ligando es un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleotido seleccionada, y el receptor es un polinucleotido objetivo que tiene una región de secuencia complementaria a aquella del ligando.
12. 12. El aparato según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque, se utiliza en la detección de la presencia, en una muestra de fluido corporal, de un analito del ligando que se forma con un receptor, un par de aglutinamiento ligando-receptor seleccionado del grupo que consiste de antígeno-anticuerpo, efector-receptor, medicamento-receptor, antígeno de superficie celular-lectina, biotina-avidina, secuencia del oligonucleótido-proteína de aglutinamiento de ADN y filamentos de ácido nucleico complementarios, primero y segundo en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste de antígenos, efectores del receptor, medicamentos, antígenos de superficie celular, y oligonucleotidos, y el aparato incluye además, para la inclusión en tal solución, un receptor cuyo aglutinamiento al analito evita su aglutinamiento al ligando aglutinado a la capa monomolecular .
13. 13. El aparato según la reivindicación 12, para utilizar en detectar un analito del antígeno, caracterizado porque el ligando es un analito o análogo del analito, y el aparato incluye además, para la inclusión en tal solución, un anticuerpo cuyo aglutinamiento al analito evita su aglutinamiento al ligando aglutinado a la capa monomolecular .
14. 14. El aparato según las reivindicaciones 1 o 2, para utilizarse en seleccionar un compuesto efectivo para inhibir el aglutinamiento de un ligando a un receptor, caracterizado porque el ligando y el receptor forman un par de aglutinamiento seleccionado del grupo que consiste de efector-receptor, medicamento-receptor, y secuencia de oligonucleótido-proteína de aglutinamiento de ADN, estando el ligando unido a la capa monomolecular, y el aparato incluye además tal receptor, para su inclusión en tal solución.
15. 15. Un método para formar un electrodo para utilizarse en medir los eventos de aglutinamiento entre un ligando y un receptor, caracterizado porque comprende: someter un substrato de electrodo que tiene una superficie metálica conductiva a leves condiciones de oxidación; agregar al substrato, una solución de cadenas de hidrocarburos que tienen longitudes entre 8-22 átomos de carbono y derivarlas a un extremo de la cadena con un grupo de tiol, en donde una porción seleccionada de dichas cadenas se deriva en sus extremos opuestos al grupo de tiol, con dicho ligando, aplicar un potencial positivo a dicho electrodo, siendo dichas condiciones de oxidación tales como para producir la deposición de una capa monomolecular de cadenas orientadas, de empaquetamiento compacto en dicho substrato, como se prueba mediante la habilidad del electrodo para formar una barrera efectiva para el flujo del ion del electrón a través de la capa monomolecular mediado por una especie de ion redox en una solución acuosa en contacto con la capa monomolecular.
16. 16. El método según la reivindicación 15, caracterizado porgue dicho sometimiento incluye colocar un potencial de al menos 260 mV en dicho electrodo, en una solución que contiene el tiol de alquilo a depositarse, y los electrolitos que incluyen el ion de litio y aniones de perclorato.
17. 17. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque las cadenas de hidrocarburo son cadenas de C8 a C22 que contienen grupos de tiol en un extremo, y una porción de las cadenas contienen un grupo químico funcional en el otro extremo.
18. 18. Un método para producir un biosensor de ligando específico para utilizarse en un aparato biosensor capaz de detectar un evento de aglutinamiento entre un ligando y un receptor que aglutina al ligando, dicho método comprende, contactar juntos: (a) un electrodo del biosensor que tiene (i) una superficie de detección, (ii) formada en dicha superficie de detección, una capa monomolecular compuesta de cadenas de hidrocarburo fijas en sus extremos próximos a la superficie de detección, y (iii) incrustado en la capa monomolecular de cadena de hidrocarburo y unido covalentemente a la superficie de detección, un primer péptido de la subunidad de heterodímero, y (b) una segunda subunidad de heterodímero capaz de aglutinarse a dicha primer subunidad para formar un heterodímero a-helicoidal, teniendo dicho segundo péptido un ligando unido covalentemente capaz de aglutinarse específicamente a tal receptor de ligando específico, y mediante dicho contacto formar tal heterodímero en dicha capa monomolecular; en donde dichas cadenas se ordenan y empacan suficientemente compactas para formar una barrera efectiva para el flujo del electrón a través de la capa monomolecular mediado por una especie de ion redox en una solución acuosa en contacto con la capa monomolecular, en la ausencia de la unión a las cadenas de dicho primer péptido, con (i) la unión del primer péptido a los extremos de la cadena siendo efectiva para incrementar mesurablemente tal flujo del electrón, en relación al flujo del electrón en la ausencia de tal unión, (ii) el aglutinamiento del segundo péptido al primer péptido unido a la cadena para formar tal heterodímero, siendo efectivo para reducir mesurablemente tal flujo del electrón, en relación al flujo del electrón en la presencia del primer péptido unido solo, y (iii) el aglutinamiento de una especie que aglutina al ligando a un ligando unido covalentemente al segundo péptido en tal heterodímero, siendo efectivo para incrementar mesurablemente tal flujo del electrón a través de la capa monomolecular, en relación al flujo del electrón en la presencia del heterodímero solo.
19. 19. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque el electrodo tiene una superficie de detección de oro y dicha capa monomolecular se compone de cadenas de 8-22 átomos de carbono unidas en sus extremos próximos a la superficie de detección mediante un enlace de tiolato .
20. 20. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque dichas cadenas tienen una densidad molecular de aproximadamente 3 a 5 cadenas/nm2.