JPH0954094A - ストレプトアビジンとビオチンを基材とする光学的固相バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物分子（受容体）によって溶解された分子
（被検体）を特異的に認識し検出するための光学的バイ
オセンサーの提供。 【解決手段】 ａ）透明支持体、ｂ）最上層としてビオ
チン化ポリリジン臭化水素を含有する、ポリアニオンと
ポリカチオンの隣接した多重層、ｃ）イオン性の最上層
の、ビオチン化層に結合しているストレプトアビジンに
よるカバー、ｄ）受容体としてのさらなるビオチン化生
物分子、を含んでなり、蛍光染料Ｆ１がストレプトアビ
ジンに結合するか、または他の生物分子に結合すること
が可能である、蛍光染料Ｆ１とＦ２の間のフェルスター
・エネルギー移動に基づく、例えば試験ストリップの形
態の新規な光学的固相バイオセンサーが提供される。被
検体は染料Ｆ２が取り付けられるか、またはＦ２を取り
付けられた被検体と競合してバイオセンサーに結合す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光染料で標識す
ることができる、そして生物分子（以下、受容体と呼
ぶ）がその存在を特異的に認識する溶解された分子（以
下、被検体と呼ぶ）を検出するための光学的バイオセン
サーに関する。この場合に関係するものは、第二の蛍光
染料で標識された検出すべき分子へのエネルギー移動過
程によって、その分子の存在と量の測定が可能となる、
蛍光染料を持つ固相センサーである。置換またはサンド
イッチ反応によれば、未標識被検体の測定も可能とな
る。

【０００２】

【発明の背景】生物学的起源の液体試料中のホルモン、
酵素、他のタンパク質、炭水化物、核酸、薬理学的活性
化合物、毒素などのような被検体を検出するには種々の
方法がある。既知の方法の中には、免疫学的検定法およ
びそれに関連する方法が、有機物質の極少量を測定する
ための高感度検出法として傑出している。免疫学的検定
法は一般的に、受容体分子例えば抗体が、リガンド分子
の構造と分子的構成を特異的に認識し、それが非極性お
よび／または極性相互反応によると規定されていても、
かかる方法でこの分子に極めて特異的に結合する能力に
基づく。

【０００３】免疫学的検定法は種々の方法を使用して行
われる。これらの方法には種々の標識技術が含まれ、そ
れらは放射性、酵素結合および蛍光標識の方法によって
被検体を定量することを目的としていることが多い
（Ｅ．Ｆ．Ｕｌｍａｎ，Ｐ．Ｌ．Ｋｈａｎｎａ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ，７４（１９８
１）２８−６０）。放射線のない蛍光エネルギー移動
（フェルスター・エネルギー移動または共鳴エネルギー
移動、ＲＥＴ）は最後に記載した方法の特別の事例と考
えられ、これを使用して、２種の蛍光染料の相対的な幾
何学的位置を、相互の距離が多くとも数ｎｍである場合
でも、測定することができる。従って、受容体／リガン
ド対の即時相互作用を直接的に検出することができる
（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７（１９７８）８
１９−８４６）。この原理については免疫学的検定法と
バイオセンサーシステムの技術中で繰り返し記述されて
いる（Ｓ．Ｍ．Ｂａｒｎａｒｄ，Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５１，９２７（１９９１）、欧州特許
第１５０９０５号明細書、西独特許第３９３８５９８号
明細書）。

【０００４】さらに、本発明は、検出原理としてフェル
スター・エネルギー移動を用いる光学的バイオセンサー
に特に適する、分子的に薄く整った層構造中への生物分
子の固定化に関する。固相上での受容体の固定化はバイ
オセンサーにとって決定的に重要である。現在の技術に
よれば、タンパク質は通常、イオン性もしくは疎水性相
互作用によって吸着的に表面に結合するか、または補助
剤を使用して共有結合によって結合する。上記の後者の
方法の模範的な例として、３−アミノプロピルトリエト
キシシランによりガラスを活性化し、引き続いてグルタ
ルアルデヒドによりタンパク質を結合させ、得られたシ
ッフ塩基を水素化ホウ酸ナトリウムによって還元する方
法が挙げられる。免疫学的検定法で使用される方法の総
説が、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ著「酵素免疫学的検
定法の実際と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅ
ｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｓ）」、第２９７−３２８頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍ
ｓｔｅｒｄａｍ １９８７）にある。さらに、生物工学
的方法としては、透過性重合体または膜中に酵素を封入
する方法が通例である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】吸着によって行われる
方法では、タンパク質固定化の安定性が不足するという
欠点があるが、結合剤または活性化剤を用いる共有結合
では、比較的多数の工程段階、高純度のある場合には不
安定な試薬の使用、または必ずしもすべてのタンパク質
が安定ではない反応条件の使用が必要となることが多
い。最も通常の固定化技術は、受容体が部位特異的に結
合しないので、高いパーセントの受容体において、次の
反応に重要である本体が立体的に遮断されているという
共通の問題点を持っている。タンパク質の変性のため
か、またはタンパク質による表面のコーティングがあま
りに薄いために、タンパク質固定化の効率が不足するこ
とが多い。さらに、いくつかの活性化剤は架橋すること
があるので、得られる表面の鮮鋭さを劣化する。従っ
て、固定化は再現性が極めて乏しい。フェルスター・エ
ネルギー移動による被検体濃度の定量の場合、エネルギ
ー供与体と受容体との間の距離が局部的表面の組成によ
って不規則に変化し、このことは一般的にこのシステム
関連の測定の精度の低下を伴うことは不都合であること
が判明している。

【０００６】上記のシステム関連の問題点を解決する一
つの可能性は、支持体を分子的に整ったフィルムでコー
ティングすることである。このことは、例えば、西独特
許第４３１９０３７号明細書に記載のように、構造形成
単位の外に、固定化すべきタンパク質を共有結合させる
ことができる、側鎖中に反応性基を有するコモノマーを
含有する薄いフィルム形成性共重合体で、支持体をコー
ティングすることによって行うことができる。この方法
の欠点は、一般的に、重合体中の反応性単量体の比率が
制限されることによって、反応性基の数が制限されるこ
とである。結果として、表面上の受容体のコーティング
の厚みがあまりにも薄くなることが多い。

【０００７】バイオセンサーの概念におけるさらなる欠
点は、タンパク質と固相表面との間にしばしば起こる非
特異的な相互作用である。このことによって、望ましく
ない疎水性またはイオン性相互作用による吸着が起こ
り、再現性のない結果が生じ、また測定精度の減少とな
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ａ）透明支持
体、 ｂ）交互にポリアニオンとポリカチオンからなり、そし
て最上層としてビオチン化ポリカチオンを含有し、ビオ
チン化度がカチオン性基の等価数に基づいて２０〜８０
モル％、好適には３０〜７０モル％、特に好適には４０
〜６０モル％である隣接した多重層、 ｃ）ビオチン化されたカチオン性の最上層の、このビオ
チン化層に結合しているストレプトアビジンによるカバ
ー、 ｄ）蛍光染料Ｆ２で標識された被検体に結合することが
でき、蛍光染料Ｆ１がポリイオン性基材層に、ストレプ
トアビジンに、またはさらなる抗体を結合している生物
分子もしくは抗体に結合されることが可能である、受容
体としてのさらなるビオチン化生物分子、好適には抗体
を含んでなる、２種の蛍光染料Ｆ１とＦ２との間のフェ
ルスター・エネルギー移動を使用して被検体を特異的に
認識するための、受容体として生物分子を持つ光学的固
相バイオセンサーに関する。

【０００９】好適な態様では、ｃ）に記載の層に、ビオ
チン化受容体が結合し、それは特異的な認識反応によっ
て該受容体部分に抗体を固定化することができる。

【００１０】従って、本発明は、生物分子、特に受容体
または抗体、の固相上への固定化に関し、その固定化は
永続的で直接的な性質のものであり、受容体をもつ表面
の大きいコーティング厚みが達成されている。被検体の
結合はフェルスター・エネルギ移動によって検出され、
そしてエネルギー供与体と受容体との分子的に整った相
互配列のために、再現性があり、その濃度依存性におい
て規則性がある。表面はタンパク質の非特異的吸着に対
して同時に不活性化される。本発明では、有機的かつ生
物学的成分を、天然のビオチン／ストレプトアビジン系
を使用して、分子的に整った層に固定化することによっ
て、これらの要件が追及され、そして上記の課題が解決
される。ストレプトアビジンはビオチン（ビタンミン
Ｈ）に対して４つの結合部位を有するタンパク質であ
る。それ故、それはビオチン化生物分子の結合のための
マトリックスとして使用することができる。ストレプト
アビジンに対するビオチン結合定数は〜１０¹⁵Ｍ^-1であ
るから、ストレプトアビジンに対するビオチン結合は殆
ど非可逆的である。

【００１１】本発明は特に、多重層の構築のためにポリ
カチオンとポリアニオンを使用することを特徴とする。

【００１２】本発明は、一般的に、フロートガラスまた
は石英ガラスまたは例えばポリエステル、ポリカーボネ
ートもしくはポリエチレンテレフタレートのような有機
重合体または他の透明で非蛍光固体を、アニオン性とカ
チオン性重合体の連続的物理吸着による自己集成（Ｓ
Ａ）技術により、多重層でコーティングすることによっ
て実現する。この方法は欧州特許第４７２９９０号明細
書に詳細に記載されている。本発明では、物理的吸着さ
れる多重層の最後の層は、アミノ基上でビオチン化され
たポリカチオンである。ポリカチオンは、欧州特許第０
４７２９９０号明細書に記載の方法に従って、ビオチン
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは他の反
応性エステルを用いて、カチオン性基の等価数に対して
２０〜８０モル％、好適には３０〜７０モル％、特に好
適には４０〜６０モル％までビオチン化される。本発明
に適するポリカチオンは、例えば、ポリリジン、ポリア
リルアミン、ポリビニルアミン、ポリ−（４−ビニルピ
リジン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミ
ド、ポリアルギニン、ポリアスパラギン、ポリグルタミ
ン、ポリエチレンイミンおよびそれらの基本的な単量体
の共重合体であり、好適にはポリリジンとポリアリルア
ミンである。例えば窒素原子が２または３個の水素原子
を有するアンモニウム基として存在するこれらのポリカ
チオンは、例えば、対イオンとして、塩化物または臭化
物のようなハロゲン化物、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、
亜硝酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、水素リン酸
塩、およびギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩または
トリクロロ酢酸塩のような脂肪族カルボン酸アニオンを
有することができる。本発明に従うビオチン化可能ポリ
カチオンは、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタ
ミン、ポリアスパラギン、ポリアクリルアミド、ポリメ
タクリルアミド、ポリアリルアミンおよびそれらの基本
的な単量体の共重合体であり、好適にはポリリジンとポ
リアリルアミンである。ポリアリルアミンは、例えば、
ポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）、ポリアクリル
酸、ポリメタクリル酸、ポリ−（２−アクリル−アミノ
−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリビニル
スルホン酸、ポリビニルスルフェート、デキストランス
ルフェート、セルローススルフェートおよびそれらの基
本的な単量体の共重合体であり、好適にはポリスチレン
スルホネートである。ポリアニオン中の対カチオンは、
例えば、Ｈ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺およびＮＨ₄ ⁺であり、好適に
はＮａ⁺またはＫ⁺である。ビオチン化カチオンの等価量
は所望の要求量の化学量論によって調節することができ
る。ストレプトアビジンとのインキュベーションの結果
として、ストレプトアビジンはビオチン化重合体層に結
合する。次に、蛍光実験が示すように、表面はストレプ
トアビジンで殆ど完全に、中断なくコーティングされ
る。かかるシステムはバイオセンサーについて上記で要
求された要件および利点を示す。一方では、バイオセン
サー表面は、出来る限り厚いタンパク質ストレプトアビ
ジンによるコーティングによって、非特異的相互作用が
遮断され、他方では、バイオセンサーとして使用される
固体界面の機能化のために、万能結合マトリックスを利
用可能にする。当業者に十分周知である、蛍光染料Ｆ１
（例えば、蛍光イソチオシアネート）によるタンパク質
ストレプトアビジンの標識化のために、供与体染料はフ
ェルスター・エネルギー移動のために利用できるように
なる。

【００１３】ビオチン化重合体表面上にストレプトアビ
ジンを固定化した後、まだコーティングされていない結
合部位を持つストレプトアビジンは、受容体としてさら
なるビオチン化生物分子が結合するための、特に抗体が
結合するためのマトリックスとして役立つ。抗体の結合
のための複数の好適な変法が可能である。従って、本発
明の一つの態様は、ビオチン化プロテインＡまたはビオ
チン化プロテインＧをストレプトアビジンマトリックス
に結合させる方法である。プロテインＡをＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドによってまたは他の反応性エステルを
経てビオチン化することは当業者には容易に可能であり
かつよく知られている。プロテインＡは細菌スタヒロコ
ッカス・アウレウスの細胞壁から得られるタンパク質で
ある。ＩｇＧ型の免疫グロブリンをそれらのＦ_c部分上
に特異的に結合することができる。この方法はさらに抗
体を部位特異的に固定化する利点を有する。抗体のＦ_ab
部分は遊離である。抗原結合部位の遮断のために、免疫
学的活性の減少が起こる。Ｆ１のストレプトアビジンへ
の結合の外に、Ｆ１はまた上記の他の生物分子に結合す
ることができる。しかし、ストレプトアビジンへの結合
が好適である。

【００１４】この種類の光学的固相バイオセンサーは例
えば試験ストリップの形態で使用することができる。

【００１５】イムノセンサーの他の態様はストレプトア
ビジンマトリックスへのビオチン化抗体の結合を含んで
なる。この文脈では、本発明による二つの態様が考えら
れる。一方では、抗体はビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドによってまたは他の反応性エステルを経てビ
オチン化されることができる。抗体のビオチン化のかか
る形態は、当業者に良く知られていて、ビオチン化が部
位特異的には起こらないという欠点を有する。ＩｇＧ分
子の一部も抗原結合部位またはその近辺でビオチン化さ
れ、その結果後者の立体遮断が起こり、そして抗体の免
疫学的活性およびセンサーの感度が減少する。本発明に
よる他の態様では、酸化された抗体と反応するヒドラジ
ド反応性基を有するビオチン誘導体が使用される。抗体
の酸化中、ＩｇＧのＦ_c部分上に位置する炭水化物は、
当業者に既知である反応（グリコール開裂）で開裂し
て、アルデヒドを生成する。これらはビオチン誘導体の
ヒドラジド基と反応してヒドラゾンを生成する。ビオチ
ン基は抗体のＦ_c部分に部位特異的に結合する。ビオチ
ン化抗体はストレプトアビジンマトリックスに結合し
て、イムノセンサーの試験ストリップの表面を完成し、
ビオチン化プロテインＡを経る結合は必要としない。

【００１６】次に、試験ストリップは、適切な受容体染
料Ｆ２（例えば、ローダミンイソチオシアネート）を備
えた被検体を、受容体、特に抗体と被検体との相互作用
の結果として、認識および定量することができる。被検
体は、コーティングされた支持体を、被検体としての分
子が存在することが疑われる溶液（試料溶液）と単純に
接触させ、続いて蛍光測定を行うことによって検出され
る。供与体染料（Ｆ１）および受容体染料（Ｆ２）の蛍
光が測定される。受容体染料Ｆ２で標識された被検体が
試験液体（試料溶液）中にある場合、固定化抗体に特異
的に結合した後、フェルスター・エネルギー移動の結果
として、非結合状態と比較して受容体蛍光の強度は増加
し、供与体の強度は減少する。別法として、非標識被検
体が置換反応によって測定されなければならない場合、
試験ストリップは最初に関係被検体の受容体標識類似体
と平衡させる。この状態では、Ｆ２の受容体蛍光はＦ１
の供与体蛍光に勝る。試験液体からの未標識被検体が、
平衡させられた試験ストリップと接触する場合、置換反
応の後、フェルスター・エネルギー移動が中断され、そ
の結果Ｆ１の供与体蛍光の増加およびＦ２の受容体蛍光
の減少によって未標識被検体の結合が示される。両方の
場合、受容体蛍光および供与体蛍光の変化は明らかに被
検体の濃度と関連している。フェルスター・エネルギー
移動は慣用の蛍光分光計で測定することができるが、エ
ネルギー移動のイムノセンサーのために特別に設計され
た装置で測定することもできる。次いで、適切な検量曲
線によって、分析液体中の被検体の濃度を決定すること
ができる。さらなる態様では、検出すべき被検体の存在
下で、これとセンサーの最上層への結合について競合す
る、蛍光染料Ｆ２で標識された特異的に結合する分子
が、検出すべき被検体の存在が考えられる分析液体中に
既知量で添加される。次いで、検出すべき被検体の濃度
は、Ｆ１もしくはＦ２の蛍光強度または２つの強度の比
率の依存性によって測定される。

【００１７】イムノセンサーの本発明による他の態様
は、供与体染料Ｆ１が受容体、好適には抗体に、好適に
は上記の形態の酸化された抗体のヒドラジド反応性基に
よって結合することを含んでなる。この態様では、フェ
ルスター・エネルギー移動の効率は、供与体染料（Ｆ
１）と受容体染料（Ｆ２）との間の平均距離の減少だけ
増加し、このことは試験方法の感度を増加させるのに使
用することができる。

【００１８】次の図面によって本発明を詳細に説明す
る。

【００１９】図１はフェルスター・エネルギー移動のイ
ムノセンサーのための試験ストリップの多重層の構造
（上図）および検出原理（下図）を図式的にそして大体
の尺度で示す。

【００２０】図１：イムノセンサーの図式構造と機能。
分子的成分は大体の尺度で描かれている。支持体Ｉは記
載よりもっと厚い。

【００２１】上図では：透明支持体Ｉ（例えば、ガラ
ス）、高分子電解質の多重層ＩＩ（図を単純化するため
に、最後のビオチン化層のみが示される）、Ｆ１で蛍光
標識されたストレプトアビジン層ＩＩＩ、ビオチン化タ
ンパク質Ａ層ＩＶおよびその上に固定化された抗体Ｖ。

【００２２】下図では：試験液で湿らせた後、観測され
る蛍光の波長は、ストレプトアビジンに結合した蛍光染
料Ｆ１が励起した後、直接発光が存在するかどうか（点
線の矢印）、または標識被検体にエネルギー移動（ＲＥ
Ｔ＝破線の矢印）した後の励起エネルギーが赤方偏移し
て発光されるかどうか（実線の矢印）に依存する。直接
発光の強度に対する赤方偏移の比率は、明らかに面積当
たりの結合被検体分子の数に依存する。

【００２３】図２は、製造の各段階における層構造物の
Ｘ線反射曲線を示す。

【００２４】図２：製造の各段階における層構造物（支
持体物質：ケイ素）のＸ線反射曲線を示す。データの各
セットは各場合、相互に比較して１００のファクター偏
移させた。下から上の順に、曲線は、最初に高分子電解
質の多重層、次いでストレプトアビジンでコーティング
された層、引続いてさらにビオチン化タンパク質Ａでコ
ーティングされた層、および最後にＩｇＧ抗体を備えた
層を示す。パルス移動Ｑ_zはＡ^-1で横軸にプロットさ
れ、Ｘ線強度Ｉは縦軸にプロットされている。

【００２５】本実施例の場合の測定結果から、表面は、
各製造段階で規則正しく成長した有機物質の界面層でコ
ーティングされていて、そして各工程で試料は分子的に
平滑であることが分かる。このことは特に、表面の機能
化の結果が、横向きに不均質な構造を持つ固相界面のコ
ーティングにはならない、即ち、液滴形成はナノメータ
の等分目盛においても起こらないことを意味している。

【００２６】図３は、図１に記載の方法と同様に製造さ
れた、そしてＸ線反射性の測定によって図２中に記録さ
れたセンサー表面上でのＥＬＩＳＡ測定結果を示す。

【００２７】図３：各種センサー表面の抗原による力価
測定。特異的結合がＥＬＩＳＡによって検出された。Ｉ
ｇＧがＰＳＳ層上に静電気的に吸着した試料（白ダイヤ
印）を、本明細書に記載した技術によって製造されたセ
ンサー（黒ダイヤ印）と比較した。抗原濃度ｃ_AG（モル
／ｌ）は横軸に、光学濃度Ａ（λ＝４１４ｎｍ）は縦軸
にとってある。

【００２８】図４は、図３に記載の試料と同様に製造さ
れた試料上でのバイオセンサー測定の結果を示す。

【００２９】図４：センサー表面の抗原による力価測定
（黒ダイヤ印）。特異的な結合がエネルギー移動によっ
て検出された。抗原が約２倍希釈の培養上澄液中に存在
した。対照（白ダイヤ印）：ストレプトアビジン層（タ
ンパク質Ａと受容体層なし）までだけ作成された試験ス
トリップ上での抗原の吸着。横軸は培養上澄液中の濃度
ｃ_AG（モル／ｌ）を示す。縦軸は蛍光染料Ｆ１およびＦ
２の５７７および５３０ｎｍでの蛍光強度の比率を示
す。

【００３０】

【実施例】１．使用した化学品 重合体 ：ポリスチレンスルホネート、ナトリウム塩（Ｐ
ＳＳ）、ＭＷ＝７０，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ社。

【００３１】ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）、ＭＷ
＝５０，０００−６０，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ社。

【００３２】ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＭＷ＝５
０，０００、５０％濃度水溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ社。

【００３３】ポリ−Ｌ−リジン臭酸塩（ＰＬ）、ＭＷ＜
５０，０００、Ｂａｃｈｅｍ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
社。

【００３４】ＰＳＳは水溶液としてＲｏｔｈ社のＶＩＳ
ＫＩＮＧ２７／３２透析チュ−ブ中で２日間極めて純粋
な水に対して透析し、次いで凍結乾燥した。

【００３５】タンパク質：ストレプトアビジン、Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社。

【００３６】プロテインＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社。

【００３７】ウサギＩｇＧ、ポリクロナール、特異性：
抗マウスＩｇＧ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｕｎｉｖ．Ｍａｉｎｚ。

【００３８】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｓｉｇｍ
ａ社。

【００３９】抗体：マウスＩｇＧ、モノクローナル、培
養上澄液、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｕｎ
ｉｖ．Ｍａｉｎｚ。

【００４０】ワサビダイコン・ペルオキシダーゼ（ＨＰ
Ｏ）結合マウスＩｇＧ、アフィニティー精製、Ｊａｃｋ
ｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉａｎｏｖａ，Ｕ．Ｓ．Ａ.。

【００４１】蛍光体：ローダミンＢイソチオシアネート
（ＲＩＴＣ）、Ｓｉｇｍａ社。

【００４２】フルオレシンイソチオシアネート異性体Ｉ
（ＦＩＴＣ）、Ｓｉｇｍａ社。

【００４３】ストレプトアビジンの標識化はタンパク質
分子当たり平均１．４ＦＩＴＣで行い、マウスＩｇＧの
標識化はタンパク質分子当たり平均３ＲＩＴＣで行っ
た。

【００４４】ビオチン活性エステル：ビオチンアミドカ
プロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｓ
ｉｇｍａ社。

【００４５】プロテインＡをビオチン化するためには、
活性エステルとタンパク質を１２対１の分子比で秤量し
た。

【００４６】洗浄剤：ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）、Ｓｉｇｍａ社。

【００４７】ＰＢＳ緩衝剤：リン酸水素ナトリウム、一
水和物、ｐ．ａ．、Ｍｅｒｃｋ社。

【００４８】リン酸水素二ナトリウム、ｐ．ａ．、Ｍｅ
ｒｃｋ社。

【００４９】塩化ナトリウム、ｐ．ａ．、Ｍｅｒｃｋ
社。

【００５０】クエン酸緩衝剤：リン酸水素二ナトリウ
ム、ｐ．ａ．、Ｍｅｒｃｋ社。

【００５１】クエン酸一水和物、Ｓｉｇｍａ社。

【００５２】塩化カリウム、ｐ．ａ．、Ｍｅｒｃｋ社。

【００５３】塩化マグネシウム、六水和物、ｐ．ａ．、
Ｍｅｒｃｋ社。

【００５４】ＡＢＴＳ：２，２′−アジノ−ビス（３−
エチル−ベンゾチアゾリン）−スルホン酸、Ｓｉｇｍａ
社。

【００５５】ガラス基板：（３８×１２）ｍｍ²および
（１〜１．２）ｍｍ厚みの顕微鏡スライド、Ｇｅｂｒ．
Ｒｅｔｔｂｅｒｇ ＧｍｂＨ社。

【００５６】２．支持体の清浄 支持体は標準操作法（Ｗ．Ｋｅｒｎ，Ｄ．Ａ．Ｐｕｏｔ
ｉｎｅｎ，ＲＣＡ Ｒｅｖｉｅｗ，３１（１９７０），
１８７）にしたがって清浄した。

【００５７】３．支持体の製造 すべての溶液は蒸留水を使用して製造した。水で湿潤さ
せた支持体を、ＰＥＩ溶液（２．２ｍｇ／ｍｌに希釈さ
れた）中に３０分間入れ、次いで１０ｍｌの水で３回毎
回約３０秒間洗浄し、次いで窒素のゆっくりした流れ中
で風乾した。次いで、試料をＰＳＳ溶液（１０ｍｌの２
Ｍ ＮａＣｌ溶液中の２０ｍｇのＰＳＳ）中に約２０分
間入れ、洗浄し、上記の通り乾燥した。支持体をＰＡＨ
溶液（１０ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌ溶液中の２０ｍｇのＰ
ＡＨ）中にさらに２０分間入れ、再び洗浄し、乾燥し
た。上記と同様に、さらなるＰＳＳ層、ＰＡＨ層および
ＰＳＳを順番に支持体上に吸着させた。ビオチンで機能
化するために、支持体を、ビオチン化されたポリリジン
臭酸塩（ＰＬＢ）（０．４Ｍ ＮａＣｌ中の５ｍｇ／１
０ｍｌ）の溶液中に２０分間入れ、次いで洗浄し、再び
乾燥した。コーティング支持体は使用するまで４℃の温
度で貯蔵した。

【００５８】４．タンパク質異種多重層の作成：ＰＬＢ
コーティング支持体をＦＩＴＣ−ストレプトアビジン溶
液中（１０ｍＭＰＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７，．２中の１０
^-7モル／ｌのＦＩＴＣ−ストレプトアビジン、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）に約３０分間入れ、１０ｍｌの水で３回
洗浄し、次いでビオチン化プロテインＡの溶液（５×１
０^-7モル／ｌ、上記のＰＢＳ緩衝液）中にさらに４０分
間入れ、純粋のＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。個々のタ
ンパク質コーティングの間の乾燥工程は省略した。プロ
テインＡでコーティングされた支持体をウサギＩｇＧ溶
液（特異性：抗マウスＩｇＧ、５×１０^-7モル／ｌ、上
記のＰＢＳ緩衝液）中に４０分間入れ、純粋な緩衝液で
３回洗浄した。抗原の結合まで、支持体をＰＢＳ緩衝液
中で貯蔵した。

【００５９】図２は、試験ストリップ（支持体物質シリ
コン）の製造中の各吸着工程の間に（乾燥試料につい
て）測定されたＸ線反射曲線を示す。これらの結果か
ら、吸着過程の間、線状分子的目盛で均一であるコヒー
レント層構造が形成されること、各場合の層厚みの増加
は吸収剤の分子的寸法に一致すること、および各吸着工
程後の表面が分子的に平滑であることが確認される。例
外は末端抗体層であり、それは、抗体の長い分子形状お
よびプロテインＡによる部位選択的結合のために、大量
の緩衝水溶液を含有する。この層は測定中の乾燥工程で
崩壊し、その後分子的寸法から期待されるより顕著に薄
くなるようである。図２からの実験データは表１で定量
的に評価される。

【００６０】 表１ イムノセンサーの活性界面層の分子的寸法 コーティング工程 層厚みの増加 表面の荒さ （Ａ） 有機界面／空気（Ａ） ６分子の高分子電解質層 ２０３ ６ （ＰＬＢを含む） 高分子電解質フィルム／ＰＬＢ ５６ １１ 上のストレプトアビジン層 ストレプトアビジン層上の ７ １１ ビオチン化プロテイン プロテインＡ上の １３ １７ ウサギＩｇＧ（抗マウス）５．抗原とのインキュベーション、対照を含む ａ．ＥＬＩＳＡ測定 試料は上記の通りにシリコン上に製造した。１０ｍｇ／
ｍｌのＢＳＡを、０．１％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰ
ＢＳ緩衝液中に溶解させた。このタンパク質溶液を、Ｈ
ＰＯ標識抗体（マウスＩｇＧ−ＨＰＯ）の希釈系列（濃
度が１０^-13〜１０^-17モル／ｌである）の製造のための
ＥＬＩＳＡ測定に使用した。抗原とインキュベートした
後、試料を、３ｇ／ｌのＡＢＴおよび０．００７５％の
Ｈ₂₂Ｏを有するクエン酸緩衝液中に展開し、測定した。
図３には、本明細書に記載の技術により製造された試料
についての代表的な結果が示される。薄い分子層のＰＳ
Ｓでコーティングされたシリコン界面上にＩｇＧのみが
静電気的に吸着させられた試料の滴定が、これと比較さ
れる。新規の技術によって製造された試料の特徴となる
高い感度、良好な直線性および低い非特異的吸着が図中
で明らかに見ることができる。

【００６１】ｂ．蛍光測定 試料はフロートガラス上に上記の通り製造した。１０ｍ
ｇ／ｍｌのＢＳＡをＰＢＳ中に溶解させた。このタンパ
ク質溶液をＲＩＴＣ標識抗原の希釈系列を製造するのに
使用した。この希釈系列では、抗原の濃度は２．５×１
０^-9〜５×１０^-6モル／ｌであった。支持体をある一定
の濃度の溶液中に約４０分間入れ、次いで０．１％ＴＷ
ＥＥＮ２０で処理されたＰＢＳ緩衝液（上記の緩衝剤組
成）中で約１分間５回洗浄した。支持体を窒素の流れ中
で風乾し、測定まで４℃で暗所で貯蔵した。

【００６２】抗原と基板との非特異的な相互反応を定量
するために、支持体を同一の順序でストレプトアビジン
層までコーティングし（しかし、タンパク質ＡとＩｇＧ
層なしで）、各場合に希釈系列の抗原含有溶液中に約４
０分間入れ、上記の通り洗浄し、乾燥した。

【００６３】試料および基準支持体を慣用の蛍光分光計
および乾燥状態で蛍光エネルギー移動を測定するために
特別に設計された装置で測定した。図４は代表的な結果
を示す。

【００６４】なお、本発明の主たる特徴および態様を以
下に記載する。

【００６５】１．ａ）透明支持体、 ｂ）交互にポリアニオンとポリカチオンからなり、そし
て最上層としてビオチン化ポリカチオンを含有し、ビオ
チン化度がカチオン性基の等価数に基づいて２０〜８０
モル％、好適には３０〜７０モル％、特に好適には４０
〜６０モル％である隣接した多重層、 ｃ）ビオチン化されたカチオン性の最上層の、このビオ
チン化層に結合しているストレプトアビジンによるカバ
ー、 ｄ）蛍光染料Ｆ２で標識された被検体に結合することが
でき、蛍光染料Ｆ１をポリイオン性基材層に、ストレプ
トアビジンに、またはさらなる抗体を結合している生物
分子もしくは抗体に結合されることが可能である、受容
体としてのさらなるビオチン化生物分子、好適には抗
体、を含んでなる、２種の蛍光染料Ｆ１とＦ２との間の
フェルスター・エネルギー移動を使用して被検体を特異
的に認識するための、受容体として生物分子を持つ光学
的固相バイオセンサー。

【００６６】２．供与体染料Ｆ１がストレプトアビジン
に結合している上記１に記載の光学的バイオセンサー。

【００６７】３．受容体、好適には抗体が、それ自体は
抗体ではないビオチン化生物分子によって、特にプロテ
インＡまたはプロテインＧを経て、ストレプトアビジン
層に結合している上記１に記載の光学的バイオセンサ
ー。

【００６８】４．ビオチン化されている受容体、好適に
は抗体が、ストレプトアビジン層に結合している上記１
に記載の光学的バイオセンサー。

【００６９】５．被検体分子が、被検体ではない、最上
層に結合されかつ蛍光染料Ｆ２で標識された他の分子を
最上層から取って代わり、そして最終的に結合した被検
体分子の濃度が、Ｆ２の蛍光強度の減少もしくはＦ１の
蛍光強度の増加または２つの強度の比率の変化の関数と
して測定される上記１に記載の光学的バイオセンサー。

【００７０】６．被検体分子が、被検体ではない、バイ
オセンサーの最上層に結合させるために既知量で分析溶
液中に添加される、蛍光染料Ｆ２で標識された特異的に
結合する分子と競合して、そして被検体の濃度がＦ２も
しくはＦ１の蛍光強度または２つの強度の比率の関数と
して測定される上記１に記載の光学的バイオセンサー。

【００７１】７．使用された支持物質が、フロートガラ
ス、石英ガラス、ポリエステル、ポリエチレンテレフタ
レートもしくはポリカーボネートまたは他の透明な非蛍
光固体である上記１に記載の光学的バイオセンサー。

【図面の簡単な説明】

【図１】イムノセンサーの構造と機能を図式的に示す図
である。

【図２】製造の各段階における層構造体のＸ線反射曲線
を示す図である。

【図３】本明細書に記載の方法で製造された試料（黒ダ
イヤ印）およびＰＳＳ層上にＩｇＧを静電気的に吸着さ
せた試料（白ダイヤ印）について、センサー表面上での
抗原の吸着をＥＬＩＳＡ測定で示した図である。

【図４】本明細書に記載の方法で製造された試料（黒ダ
イヤ印）および支持体を同一の順序でストレプトアビジ
ン層までコーティングした試料（白ダイヤ印）につい
て、センサー表面上での抗原の吸着を蛍光測定で示した
図である。

【符号の説明】 １ 透明支持体 ２ 高分子電解質多重層（ビオチン化層のみ記載） ３ Ｆ１で蛍光標識されたストレプトアビジン層 ４ ビオチン化タンパク質Ａ層 ５ 固定化された抗体

フロントページの続き (72)発明者 ミヒヤエル・フエルカー ドイツ51061ケルン・モルゲングラーベン ２ (72)発明者 ハンス−ウルリヒ・ジークムント ドイツ51149ケルン・カスパー−シユトラ ーセ55 (72)発明者 ルトガー・ハイリガー ドイツ51373レーフエルクーゼン・カール −ルンプフ−シユトラーセ８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）透明支持体、 ｂ）交互にポリアニオンとポリカチオンからなり、そし
   て最上層としてビオチン化ポリカチオンを含有し、ビオ
   チン化度がカチオン性基の等価数に基づいて２０〜８０
   モル％、好適には３０〜７０モル％、特に好適には４０
   〜６０モル％である隣接した多重層、 ｃ）ビオチン化されたカチオン性の最上層の、このビオ
   チン化層に結合するストレプトアビジンによるカバー、 ｄ）蛍光染料Ｆ２で標識された被検体に結合することが
   でき、蛍光染料Ｆ１をポリイオン性基材層に、ストレプ
   トアビジンに、またはさらなる抗体を結合している生物
   分子もしくはそれらの抗体に結合されることが可能であ
   る、受容体としてのさらなるビオチン化生物分子、好適
   には抗体を含んでなる、２種の蛍光染料Ｆ１とＦ２との
   間のフェルスター・エネルギー移動を使用して被検体を
   特異的に認識するための、受容体として生物分子を持つ
   光学的固相バイオセンサー。