DE19808884A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen - Google Patents

Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Nachweis chemischer Substanzen, mit einer im Bereich einer Sekundärstruktur 2 eine erste 3 und eine damit in Wechselwirkung stehende zweite fluorophore Gruppe 4 aufweisenden Polynukleotidsequenz 1, deren erstes Ende E1 an eine feste Phase 5 gebunden und deren zweites Ende E2 ein an die nachzuweisende chemische Substanz bind- oder anlagerbare Gruppe 6 aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz 7 an das zweite Ende E2 die Sekundärstruktur 2 aufheb- oder so änderbar ist, daß die Wechselwirkung eliminierbar und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen.
Aus der US 5,607,834 ist es bekannt, zum Nachweis einer Nu­ kleotidsequenz einen Primer mit einer Haarnadelschleife zu verwenden. Dabei sind an den gegenüberliegenden Schleifenab­ schnitten der Haarnadelschleife ein erstes und ein zweites fluorophores Molekül vorgesehen. Die fluorophoren Moleküle sind hier so ausgebildet, daß durch den strahlungslosen Ener­ gieübergang die Fluoreszenz gelöscht wird. Wenn der Primer allerdings mit einem komplementären Gegenstrang hybridisiert, wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die eine Fluoreszenz lö­ schende räumliche Beziehung zwischen dem ersten und dem zwei­ ten fluorophoren Molekül wird geändert. Damit ist eine Fluo­ reszenz beobachtbar. - Dieses Verfahren eignet sich nur zum Nachweis von Nukleotidsequenzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, die sich universell zum Nachweis chemischer Substanzen eignen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 12 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 11 und 13 bis 28.
Nach Maßgabe der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Nachweis chemischer Substanzen vorgesehen, mit einer im Bereich einer Sekundärstruktur eine erste und eine damit in Wechselwirkung stehende zweite fluorophore Gruppe aufweisenden Polynukleo­ tid- oder Peptidsequenz, deren erstes Ende an eine feste Pha­ se gebunden und deren zweites Ende eine an die nachzuweisende chemische Substanz bind- oder anlagerbare Gruppe aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz an das zweite Ende die Sekundärstruktur aufheb- oder so änderbar ist, daß die Wechselwirkung eliminierbar und damit ein Fluoreszenzre­ aktion erzeugbar ist. - Die Vorrichtung ist universell zum Nachweis chemischer Substanzen geeignet. Es muß lediglich ei­ ne für die chemischen Substanzen spezifische Gruppe am zwei­ ten Ende der Polynukleotid- oder Peptidsequenz vorgesehen sein.
Zur Lösung der Aufgabe ist des weiteren ein Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen vorgesehen, mit einer im Be­ reich einer Sekundärstruktur eine erste und eine damit in Wechselwirkung stehende zweite fluorophore Gruppe aufweisen­ den Polynukleotid- oder Peptidsequenz, deren erstes Ende an eine feste Phase und deren zweites Ende eine an die nachzu­ weisende chemische Substanz bind- oder anlagerbare Gruppe aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz an das zweite Ende die Sekundärstruktur aufgehoben- oder so geändert wird, daß die Wechselwirkung eliminiert und damit eine Fluo­ reszenzreaktion erzeugt wird. - Das Verfahren eignet sich universell zum Nachweis chemischer Substanzen. Es ist außer­ dem schneller als herkömmliche Verfahren, wie das ELISA- Verfahren, weil zum Nachweis ein zeitaufwendiger Umsatz eines farbgebenden Substrats nicht erforderlich ist und die Wasch­ schritte zur Entfernung ungebundener Antikörper entfallen.
Die Polynukleotidsequenz kann eine Desoxyribonukleinsäure (DNA), eine Phospothionatnukleinsäure (PTO) oder eine Peptid- Nukleinsäure (PNA) sein. Statt dessen können aber auch ein Peptid oder ein Protein verwendet werden. Bei der Fluores­ zenzreaktion kann es sich um die Erzeugung oder das Löschen von Fluoreszenz handeln.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung und des Verfahrens anhand der Zeichnung näher erläutert. Hierin zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Vorrichtung,
Fig. 2 eine schematische Ansicht nach Fig. 1, mit einem daran gebundenen Antigen und
Fig. 3 eine schematische Ansicht nach Fig. 2, wobei die Sekundärstruktur aufgehoben ist.
In Fig. 1 ist die Vorrichtung schematisch dargestellt. Eine DNA 1 weist eine Haarnadelschleife 2 mit einem ersten 2a und einem korrespondierenden zweiten gegenüberliegenden Schlei­ fenabschnitt 2b auf. Am ersten Schleifenabschnitt 2a ist eine erste fluorophore Gruppe 3 und am zweiten Schleifenabschnitt 2b ein Quencher 4 gebunden. Zwischen der ersten fluorophoren Gruppe 3 und dem Quencher 4 besteht eine Wechselwirkung, wel­ che Fluoreszenz löscht oder die Wellenlänge des emittierten Lichts spezifisch verändert. Statt des Quenchers 4 kann auch eine zweite fluorophore Gruppe vorgesehen sein. Dabei kann es sich um eine Donorgruppe handeln. In diesem Fall besteht die erste fluorophore Gruppe aus einer Akzeptorgruppe. In der nachfolgenden Tabelle sind geeignete Donor-/Akzeptor­ verbindungen wiedergegeben:
Donor
Akzeptor
Fluorescein Fluorescein
6-Carboxy-Fluorescein 6-Carboxymethyl-Rhodamin
Fluorescein Tetramethylrhodamin
IAEDANS (= 5-((((2-iodoacyl)amino)ethyl)amino)naphthalene-1-sulonsäure Fluorescein
EDANS (= 5-((2-aminomethyl)amino)naphthalen-1-sulfonsäure DABCYL (4-dimethylaminoazobenzen-4'-sulfoylchlorid)
BODIPY FL BODIPY FL
Ein erstes Ende E1 der DNA 1 ist an eine feste Phase 5, z. B. ein Polycarbonat, gebunden. An einem zweiten Ende E2 der DNA 1 ist ein Antikörper 6, z. B. ein CD4-Antikörper, gebunden.
Fig. 2 zeigt die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung, wobei an den Antikörper 6 ein nachzuweisendes Antigen 7, z. B. ein CD4- Antigen, gebunden ist. Ein Stoff 8 ist aus einer weiteren an das Antigen 7 anlager- bzw. bindbaren Gruppe 9, z. B. ein CD4- Antikröper, und einem superparamagnetischen Partikel 10 ge­ bildet. Als superparamagnetische Partikel können magnetische beads verwendet werden, wie sie von den Firmen MILTENY oder DYNATECH angeboten werden. Solche magnetischen beads können mittels Biotin an einen CD4-Antikörper zur Bildung des Stoffs 8 gekoppelt werden. Statt des superparamagnetischen Partikels 10 kann auch eine superparamagnetische Gruppe Verwendung fin­ den. Die weitere Gruppe 9 ist ebenfalls an das nachzuweisende Antigen 7 gebunden.
Fig. 3 zeigt die in Fig. 2 gezeigte Vorrichtung mit angela­ gertem Antigen 7 und einen daran gekoppelten Stoff 8. Die Haarnadelschleife 2 ist hier aufgehoben. Die Akzeptorgruppe 3 und der Quencher 4 sind soweit voneinander entfernt, daß kei­ ne Wechselwirkung zwischen ihnen mehr besteht. Mit dem Be­ zugszeichen 11 ist ein Magnet bezeichnet.
Die Funktion der Vorrichtung ist folgende:
Einer das nachzuweisende Antigen 7 enthaltenden Probe wird der Stoff 8 zugesetzt. Die weitere Gruppe 9 des Stoffs 8 bin­ det an das Antigen 7. Dann wird die Vorrichtung gemäß Fig. 1 mit der Probe in Kontakt gebracht. Das Antigen 7 bindet nun (mit daran gekoppeltem Stoff 8) an die Gruppe 6. Nachfolgend wird der Magnet 11 in die Nähe der Probe gebracht. Das Ma­ gnetfeld ist so ausgebildet, daß die superparamagnetischen Partikel 10 von der festen Phase 1 wegbewegt werden. Durch die dadurch auf die DNA 1 wirkende Kraft wird die Haarnadel­ schleife 2 aufgehoben. Die DNA 1 bildet ein langgestrecktes Molekül. Die Wechselwirkung zwischen der vormals gegenüber­ liegenden ersten fluorophoren Gruppe 3 und dem Quencher 4 fällt weg. Bei Anregung der ersten fluorophoren Gruppe 3 ist nun eine Fluoreszenz beobachtbar. Die Fluoreszenzreaktion dient zum Nachweis des Antigens 7. - Es kann zum Nachweis auch ein Donor-/Akzeptorpaar verwendet werden, bei dem bei Bestehen der Wechselwirkung eine verstärkte und bei Aufhebung der Wechselwirkung eine abgeschwächte Fluoreszenz bewirkt wird.
Die Vorrichtung kann nun aus der Probe entfernt werden. Gleichzeitig wird damit das nachgewiesene Antigen 7 der Probe entzogen.
Die Vorrichtung kann infolge des bei Vorliegen des nachzuwei­ senden Antigens 7 bewirkten Fluoreszenzsignals automatisch durch einen Roboter der Probe entfernt und zur Durchführung weiterer Verfahrensschritte an eine dazu vorgesehene Einrich­ tung übergeben werden.
Bezugszeichenliste
1
DNA
2
Haarnadelschleife
2
a erster Schleifenabschnitt
2
b zweiter Schleifenabschnitt
3
erste fluorophore Gruppe
4
Quencher
5
feste Phase
6
erster Antikörper
7
Antigen
8
Stoff
9
zweiter Antikörper
10
superparamagnetisches Partikel
11
Permanentmagnet
E1 erstes Ende
E2 zweites Ende

Claims (29)

1. Vorrichtung zum Nachweis chemischer Substanzen, mit einer im Bereich einer Sekundärstruktur (2) eine erste (3) und eine damit in Wechselwirkung stehende zweite fluorophore Gruppe (4) aufweisenden Polynukleotid- (1) oder Peptidse­ quenz, deren erstes Ende (E1) an eine feste Phase (5) gebunden und deren zweites Ende (E2) eine an die nachzu­ weisende chemische Substanz (7) bind- oder anlagerbare Gruppe (6) aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz an das zweite Ende (E2) die Sekundärstruktur (2) aufheb- oder so änderbar ist, daß die Wechselwirkung eli­ minierbar und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Sekundärstruktur (2) eine Haarnadelschleife, eine Helix, eine Faltblatt­ struktur oder ein Ring ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei das erste fluorophore Molekül (3) an einem ersten Schleifenabschnitt (2a) und das zweite fluorophore Molekül (4) gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenabschnitt (2b) der Haarnadel­ schleife (2) in einem eine Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden sind.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo­ bei die feste Phase (5) ein, vorzugsweise elektrisch leitfähiger, Kunststoff ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo­ bei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trimethylthiophen, Thiophen, Triaminobenzol und/oder ein Polycarben enthält.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo­ bei das erste fluorophore Molekül (3) eine Akzeptorgruppe und das zweite fluorophore Molekül (4) eine Donorgruppe ist.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo­ bei das erste fluorophore Molekül (3) durch einen Quen­ cher ersetzt ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Akzeptor­ gruppe (3) 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetrame­ thylrhodamin, Fluoreszein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 8, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluoreszein, IADEANS, EDANS oder Bodipy Fl ist.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergeheden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz (1) DNA, PTO oder PNA ist.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergeheden Ansprüche, wobei die Gruppe ein Antikörper (6), ein Rezeptor, eine DNA-, PTO-, Peptid- oder PNA-Sequenz ist.
12. Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen, mit einer im Bereich einer Sekundärstruktur (2) eine erste (3) und eine damit in Wechselwirkung stehende zweite fluorophore Gruppe (4) aufweisenden Polynukleotid- (1) oder Peptidse­ quenz, deren erstes Ende (E1) an eine feste Phase (5) ge­ bunden und deren zweites Ende (E2) eine an die nachzuwei­ sende chemische Substanz (7) bind- oder anlagerbare Grup­ pe (6) aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Sub­ stanz (7) an das zweite Ende (E2) die Sekundärstruktur (2) aufgehoben- oder so geändert wird, daß die Wechsel­ wirkung eliminiert und damit eine Fluoreszenzreaktion er­ zeugt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Sekundärstruktur (2) eine Haarnadelschleife, eine Helix, Faltblattstruktur oder ein Ring ist.
14. Verfahren nach nach Anspruch 13, wobei das erste fluoro­ phore Molekül (3) an einem ersten Schleifenabschnitt (2a) und das zweite fluorophore Molekül (4) gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenabschnitt (2b) der Haarnadel­ schleife (2) in einem eine Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden sind.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die feste Phase (5) ein, vorzugsweise elektrisch leitfähiger, Kunststoff ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trimethylthiophen, Thiophen, Triaminobenzol und/oder ein Polycarben enthält.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das erste fluorophore Molekül (3) eine Akzeptorgruppe und das zweite fluorophore Molekül (4) eine Donorgruppe ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei das das erste fluorophore Molekül (3) durch einen Quencher ersetzt ist.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Akzeptorgruppe (3) 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Fluoreszein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17 oder 19, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluoreszein, IADEANS, EDANS oder Bodipy Fl ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die Nukleotidsequenz (1) DNA, PTO oder PNA ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei die Gruppe (7) ein Antikörper, ein Rezeptor, eine DNA-, PTO-, Peptid- oder PNA-Sequenz ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der die chemische Sub­ stanz (7) enthaltenden Probe ein Stoff (8) zugegeben wird, der eine weitere zur Anlagerung an die chemische Substanz (7) geeignete Gruppe (9) mit einem daran gebun­ denen superparamagnetischen Partikel (10) enthält.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die nachzuweisende che­ mische Substanz (7) an die Gruppe (6) und an die weitere Gruppe (9) gebunden wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei ein Magnetfeld angelegt wird, so daß das superparamagnetische Partikel (10) von der festen Phase (5) wegbewegt und dadurch die Sekundär­ struktur (2) aufgehoben oder geändert wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 25, wobei die Fluoreszenz mittels eines mit einer Datenverarbeitungs­ einrichtung verbundenen Fluorometers erfaßt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei aus der zeitlichen Än­ derung der Fluoreszenzintensität die Konzentration der nachzuweisenden chemischen Substanz (7) ermittelt wird.
28. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12, mit
  • a) einer einer im Bereich einer Sekundärstruktur (2) eine erste (3) und eine damit in Wechselwirkung stehende zwei­ te fluorophore Gruppe (4) aufweisenden Polynukleotidse­ quenz (1), deren erstes Ende (E1) an eine feste Phase (5) gebunden und deren zweites Ende (E2) eine an die nachzu­ weisende chemische Substanz (7) bind- oder anlagerbare Gruppe (6) aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz an das zweite Ende (E2) die Sekundärstruktur (2) aufheb- oder so änderbar ist, daß die Wechselwirkung eli­ minierbar und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar ist, und
  • b) einem Stoff (8), der eine weitere zur Anlagerung an die chemische Substanz (7) geeignete Gruppe (9) mit einem daran gebundenen superparamagnetischen Partikel (10) ent­ hält.
29. Kit nach Anspruch 28, desweiteren enthaltend einen Magne­ ten (11).
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