EP1070144A2 - Mittel und verfahren zum nachweis chemischer substanzen - Google Patents

Mittel und verfahren zum nachweis chemischer substanzen

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Publication number
EP1070144A2
EP1070144A2 EP99917762A EP99917762A EP1070144A2 EP 1070144 A2 EP1070144 A2 EP 1070144A2 EP 99917762 A EP99917762 A EP 99917762A EP 99917762 A EP99917762 A EP 99917762A EP 1070144 A2 EP1070144 A2 EP 1070144A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
fluorophoric
polynucleotide
peptide sequence
attached
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99917762A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolf Bertling
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Original Assignee
November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin filed Critical November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Publication of EP1070144A2 publication Critical patent/EP1070144A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the invention relates to an agent and a method for the detection of chemical substances and physical properties.
  • the object of the present invention is to provide a means and a method which are universally suitable for the detection of chemical substances and physical properties.
  • a second polynucleotide or peptide sequence having a second fluorophoric group the second end of which has a group that can be bound or attached to the chemical substance to be detected or a group that is sensitive to the physical substance to be detected
  • first polynucleotide or peptide sequence can be attached to the second polynucleotide or peptide sequence in such a way that a spatial relationship which enables an interaction between the first and the second fluorophoric molecule can be established
  • the agent is universally suitable for the detection of chemical substances and physical properties.
  • the agent In order to check whether a certain chemical substance is contained in a solution, the agent is brought into contact with the solution. If the chemical substance is contained in the solution, it attaches to the group.
  • a external force directed away from the solid phase for example a centrifugal force, changes the spatial relationship between the first and the second fluorophoric group.
  • a fluorescence reaction can be observed. This can be the deletion of a fluorescence formed when the spatial relationship is present.
  • the fluorescence reactions are essentially based on the so-called Forster effect.
  • a second polynucleotide or peptide sequence having a second fluorophoric group the second end of which has a group that can be bound or attached to the chemical substance to be detected or a group that is recommended for the physical property to be detected
  • first polynucleotide or peptide sequence is attached to the second polynucleotide or peptide sequence in such a way that a spatial relationship which enables an interaction between the first and the second fluorophoric molecule is formed
  • the method is universally suitable for the detection of chemical substances and physical properties, such as the presence of a magnetic field.
  • a magnetic chemical substance can be coupled to the group or a magnetic group can be provided.
  • a magnetic field is applied that pulls the chemical substance or group away from the solid phase, the spatial relationship between the first and the second fluorophoric molecule is eliminated.
  • a fluorescence reaction can be observed, which indicates the presence of a magnetic field.
  • the method according to the invention is also faster than conventional methods for the detection of chemical substances, such as the ELISA method, because a time-consuming conversion of a coloring substrate is not necessary for the detection and because the washing steps for removing unbound antibodies are omitted.
  • the first and the second polynucleotide or peptide sequence are linked to form a molecule.
  • the spatial relationship can take the form of a secondary structure, in particular as a hairpin loop, helix or leaflet structure.
  • the first fluorophoric molecule is bound to a first loop section and the second fluorophoric molecule opposite to a second loop section of the hairpin loop at a distance that enables interaction.
  • the solid phase can be a plastic, preferably an electrically conductive one. This expediently contains a polycarbonate, t ⁇ methylthiophene, thiophene, t ⁇ ammobenzene and / or a polycarbene.
  • the polynucleotide sequence can be a deoxyribin nucleic acid (DNA), a phosphothionate nucleic acid (PTO) or a peptide nucleic acid (PNA). Instead, a peptide or a protein can also be used.
  • the fluorescence reaction can be the generation or quenching of fluorescence.
  • FIG. 2 is a schematic view of FIG. 1, with an antigen and attached
  • FIG. 3 shows a schematic view according to FIG. 2, the secondary structure being lifted up
  • FIG. 5 is a schematic representation of FIG. 4, wherein the second means is in the second state
  • Fig. ⁇ is a schematic representation of a third agent in the first state
  • Fig. 7 is a schematic representation of Fig. 6, wherein the third means is in the second state.
  • the means is shown schematically.
  • a DNA 1 has a hairpin loop 2 with a first 2a and a corresponding second opposite loop section 2b.
  • a first flourophore group 3 is bound to the first loop section 2a and a quencher 4 is bound to the second loop section 2b.
  • a second fluorophoric group can also be provided. This can be a donor group.
  • the first fluorophore group consists of an acceptor group. Suitable donor / acceptor compounds are shown in the table below:
  • a first end E1 of DNA 1 is attached to a solid phase 5, e.g. a polycarbonate, bound.
  • a solid phase 5 e.g. a polycarbonate
  • an antibody 6 e.g. a CD4 antibody.
  • FIG. 2 shows the agent shown in FIG. 1, an antigen 7 to be detected, for example a CD4-, on the antibody 6.
  • a substance 8 is formed from a further group 9, for example a CD4 antibody, which is attachable or bindable to the antigen 7 and a superparamagnetic particle 10.
  • Magnetic beads such as those offered by the companies MILTENY or DYNATECH can be used as superpara agnetic particles. Such magnetic beads can be coupled to a CD4 antibody to form substance 8 by means of Biotm. Instead of the superparamagnetic particle
  • FIG. 3 shows the agent shown in FIG. 2 with attached antigen 7 and a substance 8 coupled to it.
  • the hairpin loop 2 is removed here.
  • the acceptor group 3 and the quencher 4 are so far apart that there is no longer any interaction between them.
  • the substance 8 is added to a sample containing the antigen 7 to be detected.
  • the further group 9 of substance 8 binds to the antigen 7.
  • the agent according to FIG. 1 is brought into contact with the sample.
  • the antigen 7 now binds (with substance 8 coupled to it) to the group 6.
  • the magnet 11 is then brought into the vicinity of the sample.
  • the magnetic field is designed such that the superparamagnetic particles 10 are moved away from the solid phase 1.
  • the force acting on the DNA 1 thereby removes the hairpin loop 2.
  • DNA 1 forms an elongated molecule.
  • the interaction between the previously opposite first fluorophore group 3 and quencher 4 are eliminated. Fluorescence can now be observed when the first fluorophore group 3 is excited.
  • the fluorescence reaction serves to detect the antigen 7.
  • a donor / acceptor pair can also be used for the detection, in which an increased fluorescence occurs when the interaction exists and a weakened fluorescence when the interaction is canceled.
  • the agent can now be removed from the sample.
  • the detected antigen 7 is thus removed from the sample.
  • the agent can be automatically removed by a robot of the sample and transferred to a device provided for this purpose in order to carry out further method steps.
  • a DNA or PNA 1 has a hairpin loop 2 with a first loop section 2a and a second loop section 2b complementary thereto.
  • a first fluorophoric group 3 is bound to the first loop section 2a and a second fluorophoric group 4 is bound to the second loop section 2b.
  • the fluorophoric groups 3, 4 are spaced apart by space, which, with appropriate excitation, allows fluorescence energy transfer.
  • the fluorophoric groups 3, 4 can be a donor / acceptor pair or a donor / quencher pair. Both the first fluorophoric group 3 and the second fluorophoric group 4 can have the donor or acceptor function.
  • the hairpin loop 2 is held together with a first force F1.
  • the DNA 1 is bound to the solid phase 5 at one end E1. It can be polystyrene or polycarbonate. It can be provided at one end of the DNA 1 biotin which reacts with a streptavid coating provided there for binding to the solid phase.
  • a group 12 is bound to the second end E2 of DNA 1. This can be an antibody, an antigen, a receptor or a ligand. If the physical properties are to be verified, the group can also be a magnetic 12 or an electrically charged group.
  • FIG. 5 shows the agent according to FIG. 4 in the second state.
  • a second force F2 acts on the magnetic group 12. It is a magnetic force.
  • the second force F2 is greater than the first force Fl.
  • the DNA 1 When the second force F2 is applied, the DNA 1 is stretched. The hairpin bow 2 is destroyed. The spatial relationship between the first 3 and the second fluorophoric group 4 is canceled. Fluorescence energy transfer is no longer possible. The fluorophore properties of the first 3 and the second fluorophore group 4 change. Due to the change in the fluorophoric properties, it is possible to detect the presence of a magnetic field.
  • a first DNA la which carries the first fluoropnore group 3 is bound to the solid phase 5.
  • the first DNA la is complementary in sections to a second DNA lb, at the second end of which the magnetic group 12 is bound.
  • the second DNA lb carries a quencher 4.
  • the first DNA la and the second DNA lb are designed in such a way that when their complementary sequence sections are deposited together, the first fluorophoric group 3 and the quencher 4 can enter into a spatial relationship which enables fluorescence energy transfer.
  • Two 40 base oligonucleotides are synthesized.
  • the sequences of the oligonucleotides are complementary to one another.
  • the melting point of the oligonucleotides is approx. 70 ° C.
  • a first oligonucleotide carries an amino linker at the 3 'end and a fluorescent group at the 5' end.
  • a two- The oligonucleotide carries a dabcyl group at the 3 'end and a biotm molecule at the 5' end.
  • the oligonucleotides supplied by the manufacturer (TibMol Biol, Berlin) in the freeze-dried state are dissolved in a concentration of 100 mM in sterile water.
  • 100 ⁇ l of the synthesized DNA hybrids are added to each well of a malemic anhydride-activated microtiter plate (Pierce, KMF, Berg. -Gladbach).
  • the DNA is incubated with the surface overnight under rubble at 4 ° C.
  • the solution is then removed from the surface and washed 3 times with 150 ⁇ l of sterile water.
  • the surface is washed 3 times with 150 ⁇ l sterile 10 mM TrisCl, ImM EDTA 5 M. incubated at room temperature.
  • the surface is stored in sterile 100 ⁇ l mM TrisCl, 1 mM EDTA ph 8 at 4 ° C.
  • Particles are removed by gently pushing the microtiter plate spread over the surface.
  • the suspension becomes 15 mm. incubated at room temperature.
  • the fluorescence of the microtiter plate is observed in the microtiter plate reader and in the fluorescence microscope.
  • the excitation energy measured is the wavelength for excitation of the fluorescence at 491 nm and the emission at 515 nm. Defined distances from the bottom of the microtiter plate and permanent magnet are introduced into the solution and removed again after 20 seconds. The increase in fluorescence indicates the presence of a magnetic field.
  • a microtiter plate serves as a control, which carries a fixed DNA hybrid that was treated identically but does not carry a biotm.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Nachweis chemischer Substanzen oder physikalischer Eigenschaften, mit einer eine erste (3) fluorophore Gruppe aufweisenden ersten Polynukleotid- (1) oder Peptidsequenz, deren erstes Ende (E1) an eine feste Phase (5) gebunden ist und einer eine zweite (4) fluorophore Gruppe aufweisenden zweiten Polynukleotid- (1a) oder Peptidsequenz, deren zweites Ende (E2) eine an die nachzuweisende chemische Substanz (7) bind- bzw. anlagerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Eigenschaft empfindliche Gruppe (6) aufweist, wobei die erste Polynukleotid- (1) oder Peptidsequenz an die zweite Polynukleotid- (1a) oder Peptidsequenz so anlagerbar ist, dass eine eine Wechselwirkung zwischen der ersten (3) und der zweiten fluorophoren Gruppe (4) ermöglichende räumliche Beziehung herstellbar ist, und wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz (7) an die Gruppe (6) und/oder Einwirkung einer äusseren Kraft auf die Gruppe (6, 12) die räumliche Beziehung aufheb- und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar ist.

Description

Mittel und Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen
Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zum Nach- weis chemischer Substanzen und physikalischer Eigenschaften.
Aus der US 5,607,834 ist es bekannt, zum Nachweis einer Nu- kleotidsequenz einen Primer mit einer Haarnadelschleife zu verwenden. Dabei sind an den gegenüberliegenden Schleifenab- schnitten der Haarnadelschleife ein erstes und ein zweites fluoropnores Molekül vorgesehen. Die fluorophoren Moleküle sind hier so ausgebildet, daß durch den strahlungslosen Ener- gieubergang die Fluoreszenz geloscht wird. Wenn der Primer allerdings mit einem komplementären Gegenstrang hybridisiert, wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die eine Fluoreszenz loschende raumliche Beziehung zwischen dem ersten und dem zweiten fluorophoren Molekül wird geändert. Damit ist eine Fluoreszenz beobachtbar. - Dieses Verfahren eignet sich nur zum Nachweis von Nukleotidsequenzen.
Aus David J. Holme und Hazel Peck: Analytical biochemistry, Longnamm, London und New York, 1983, Seiten 243-244 ist es allgemein bekannt, zum Nachweis von Antigenen Fluro- Immonoassays zu verwenden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel und ein Verfahren anzugeben, die s ch universell zum Nachweis chemischer Substanzen und physikalischen Eigenschaften eignen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 13 gelost. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 12 und 14 bis 32. Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Mittel zum Nachweis chemischer Substanzen oder pysikalischer Eigenschaften vorgesehen, mit
einer eine erste fiuorophore Gruppe aufweisenden ersten Polynukleotid- oder Peptidsequenz, deren erstes Ende an eine feste Phase gebunden ist und
einer eine zweite fiuorophore Gruppe aufweisenden zweiten Polynukleotid- oder Peptiαsequenz, deren zweites Ende eine an die nachzuweisende chemische Substanz bind- bzw. anlagerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Substanz empfindliche Gruppe aufweist,
wobei die erste Polynukleotid- oder Peptidsequenz an die zweite Polynukleotid- oder Peptidsequenz so anlagerbar ist, dass eine eine Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten fluorophoren Molekül ermöglichende räumliche Bezie- hung herstellbar ist,
und wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz an d e Gruppe und/oder Einwirkung einer äußeren Kraft auf die Gruppe die räumliche Beziehung aufheb- und damit eine Fluoreszenzre- aktion erzeugbar ist.
Das Mittel ist universell zum Nachweis chemischer Substanzen und physikalischer Eigenschaften geeignet. Zur Prüfung der Frage, ob eine bestimmte chemische Substanz in einer Losung enthalten ist, wird das Mittel mit der Losung in Kontakt gebracht. Wenn die chemische Substanz in der Losung enthalten ist, lagert sie sich an die Gruppe an. Durch Einwirkung einer von der festen Phase weg gerichteten äußern Kraft, z.B. einer Zentrifugalkraft, wird die räumliche Beziehung zwischen der ersten und der zweiten fluorophoren Gruppe geändert. Es ist eine Fluoreszenzreaktion beobachtbar. Dabei kann es sich um die Loschung einer bei Vorliegen der räumlichen Beziehung gebildeten Fluoreszenz handeln. Die Fluoreszenzreaktionen beruhen hier im wesentlichen auf dem sogennnten Forster-Effekt.
Zur Losung der Aufgabe ist des weiteren ein Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen oder pysikalischer Eigenschaften vorgesehen, mit
einer eine erste fiuorophore Gruppe aufweisenden ersten Polynukleotid- oder Peptidsequenz, deren erstes Ende an eine feste Phase gebunden ist und
einer eine zweite fiuorophore Gruppe aufweisenden zweiten Polynukleotid- oder Peptidsequenz, deren zweites Ende eine an die nachzuweisende chemische Substanz bind- bzw. anla- gerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Eigenschaft empfmαlicne Gruppe aufweist,
wobei die erste Polynukleotid- oder Peptidsequenz an die zweite Polynukleotid- oder Peptidsequenz so angelagert wird, dass eine eine Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten fluorophoren Molekül ermöglichende räumliche Beziehung gebildet wird,
und wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz an die Gruppe und/oder Einwirkung einer äußeren Kraft auf die Gruppe die räumliche Beziehung aufgehoben und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugt wird. Das Verfahren eignet sich universell zum Nachweis chemischer Substanzen und physikalischer Eigenschaften, wie z.B. das Vorhandensein eines Magnetfelds. Dazu kann z.B. eine magneti- sehe chemische Substanz an die Gruppe gekoppelt werden oder eine magnetische Gruppe vorgesehen sein. Bei Anlegen eines Magnetfelds, welches die chemische Substanz bzw. Gruppe weg von der festen Phase zieht, wird die räumliche Beziehung zwischen dem ersten und dem zweiten fluorophoren Molekül aufge- hoben. Es ist eine Fluoreszenzreaktion beobachtbar, welche das Vornanαensein eines Magentfelds anzeigt. Das erfindungs- gemaße Verfahren ist außerdem schneller als herkömmliche Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen, wie das ELISA- Verfahren, weil zum Nachweis ein zeitaufwendiger Umsatz eines farbgebenden Substrats nicht erforderlich ist und weil die Waschschritte zur Entfernung ungebundener Antikörper entfallen.
Nach einer Ausgestaltung sind die erste und die zweite Po- lynukleotid- oder Peptidsequenz zu einem Molekül verbunden. In diesem Fall kann die räumliche Beziehung m Form einer Se- kundarstruktur, insbesondere als Haarnadelschleife, Helix oder Faltblattstruktur, ausgebildet sein. Vorteilhafterwelse sind das erste fiuorophore Molekül an einem ersten Schleifen- abschnitt und das zweite fiuorophore Molekül gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenabschnitt der Haarnadelschleife in einem eine Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden.
Bei der festen Phase kann es sich um einen, vorzugsweise elektrisch leitfahigen, Kunststoff handeln. Dieser enthalt zweckmaßigerweise ein Polycarbonat , Tπmethylthiophen, Thio- phen, Tπammobenzol und/oder ein Polycarben. Die Polynukleotidsequenz kann eine Desoxyribinuklemsaure (DNA) , eine Phospothionatnuklemsaure (PTO) oder eine Peptid- Nuklemsaure (PNA) sein. Statt dessen können aber auch ein Peptid oder ein Protein verwendet werden. Bei der Fluoreszenzreaktion kann es sich um die Erzeugung oder das Loschen von Fluoreszenz handeln.
Nachfolgend werden Ausfu rungsbeispiele des Mittels und Ver- fahrens anhand der Zeichnung naher erläutert. Hierin zeigen
Fig. 1 eine schematiscne Darstellung des Mittels,
Fig. 2 eine schematische Ansicht nach Fig. 1, mit einem daran gebundenen Antigen und
Fig. 3 eine schematische Ansicht nach Fig. 2, wobei die Sekundarstruktur aufgenoben ist,
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines zweiten Mittels im ersten Zustand,
Fig. 5 eine scnematische Darstellung nach Fig. 4, wobei das zweite Mittel im zweiten Zustand ist,
Fig. β eine schematische Darstellung eines dritten Mittels im ersten Zustand und
Fig. 7 eine schematische Darstellung nach Fig. 6, wobei das dritte Mittel im zweiten Zustand ist. In Fig. 1 ist das Mittel schematisch dargestellt. Eine DNA 1 weist eine Haarnadelschleife 2 mit einem ersten 2a und einem korrespondierenden zweiten gegenüberliegenden Schleifenabschnitt 2b auf. Am ersten Schleifenabschnitt 2a ist eine erste flourophore Gruppe 3 und am zweiten Schleifenabschnitt 2b ein Quencher 4 gebunden. Zwischen der ersten fluorophoren Gruppe 3 und dem Quencher 4 besteht eine Wechselwirkung, welche Fluoreszenz löscht oder die Wellenlänge des emittierten Lichts spezifisch verändert. Statt des Quenchers 4 kann auch eine zweite fiuorophore Gruppe vorgesehen sein. Dabei kann es sich um eine Donorgruppe handeln. In diesem Fall besteht die erste fiuorophore Gruppe aus einer Akzeptorgruppe. In der nachfolgenden Tabelle sind geeignete Donor-/Akzeptor- verbindungen wiedergegeben:
Ein erstes Ende El der DNA 1 ist an eine feste Phase 5, z.B. ein Polycarbonat, gebunden. An einem zweiten Ende E2 der DNA 1 ist ein Antikörper 6, z.B. ein CD4-Antikörper, gebunden.
Fig. 2 zeigt das in Fig. 1 dargestellte Mittel, wobei an den Antikörper 6 ein nachzuweisendes Antigen 7, z.B. ein CD4- Antigen, gebunden ist. Ein Stoff 8 ist aus einer weiteren an das Antigen 7 anlager- bzw. bindbaren Gruppe 9, z.B. ein CD4- Antikroper, und einem superparamagnetischen Partikel 10 gebildet. Als superpara agnetische Partikel können magnetische beads verwendet werden, wie sie von den Firmen MILTENY oder DYNATECH angeboten werden. Solche magnetischen beads können mittels Biotm an einen CD4-Antιkorper zur Bildung des Stoffs 8 gekoppelt werden. Statt des superparamagnetischen Partikels
10 kann auch eine superparamagnetische Gruppe Verwendung fin- den. Die weitere Gruppe 9 ist ebenfalls an das nachzuweisende
Antigen gebunden.
Fig. 3 zeigt das in Fig. 2 gezeigte Mittel mit angelagertem Antigen 7 und einen daran gekoppelten Stoff 8. Die Haarnadel- schleife 2 ist hier aufgehoben. Die Akzeptorgruppe 3 und der Quencher 4 sind soweit voneinander entfernt, daß keine Wechselwirkung zwischen ihnen mehr besteht. Mit dem Bezugszeichen
11 ist ein Magnet bezeichnet.
Die Funktion des Mittels ist folgende:
Einer das nachzuweisende Antigen 7 enthaltenden Probe wird der Stoff 8 zugesetzt. Die weitere Gruppe 9 des Stoffs 8 bindet an das Antigen 7. Dann wird das Mittel gemäß Fig. 1 mit der Probe in Kontakt gebracht. Das Antigen 7 bindet nun (mit daran gekoppeltem Stoff 8) an die Gruppe 6. Nachfolgend wird der Magnet 11 in die Nahe der Probe gebracht. Das Magnetfeld ist so ausgebildet, daß die superparamagnetischen Partikel 10 von der festen Phase 1 wegbewegt werden. Durch die dadurch auf die DNA 1 wirkende Kraft wird die Haarnadelschleife 2 aufgehoben. Die DNA 1 bildet ein langgestrecktes Molekül. Die Wechselwirkung zwischen der vormals gegenüberliegenden ersten fluorophoren Gruppe 3 und dem Quencher 4 fällt weg. Bei Anregung der ersten fluorophoren Gruppe 3 ist nun eine Fluoreszenz beobachtbar. Die Fluoreszenzreaktion dient zum Nachweis des Antigens 7. - Es kann zum Nachweis auch e n Donor-/ Ak- zeptorpaar verwendet werden, bei dem bei Bestehen der Wechselwirkung eine verstärkte und bei Aufhebung der Wechselwirkung eine abgeschwächte Fluoreszenz bewirkt wird.
Das Mittel kann nun aus der Probe entfernt werden. Gleichzei- t g wird damit das nachgewiesene Antigen 7 der Probe entzogen.
Das Mittel kann infolge des bei Vorliegen des nachzuweisenden Antigens 7 bewirkten Fluoreszenzsignals automatisch durch ei- nen Roboter der Probe entfernt und zur Durchführung weiterer Verfahrensschritte an eine dazu vorgesehene Einrichtung bergeben werden.
In Fig. 4 weist eine DNA oder PNA 1 eine Haarnadelschleife 2 mit einem ersten Schleifenabschnitt 2a und einem dazu komplementären zweiten Schleifenabschnitt 2b auf. Am ersten Schleifenabschnitt 2a ist eine erste fiuorophore Gruppe 3 und am zweiten Schleifenabschnitt 2b eine zweite fiuorophore Gruppe 4 gebunden. Die fluorophoren Gruppen 3, 4 weisen einen raum- liehen Abstand auf, der bei entsprechender Anregung einen Fluoreszenz-Energie-Transfer erlaubt. Bei den fluorophoren Gruppen 3, 4, kann es sich um ein Donor/Akzeptor-Paar oder ein Donor/Quencher-Paar handeln. Dabei kann sowohl der ersten fluorophoren Gruppe 3 als auch der zweiten fluorophoren Grup- pe 4 die Donor- oder Akzeptorfunktion zukommen. Die Haarnadelschleife 2 wird mit einer ersten Kraft Fl zusammengehalten. Die DNA 1 ist mit einem Ende El an die feste Phase 5 gebunden. Dabei kann es sich um Polysterol oder Polycarbonat handeln. Es kann am einen Ende der DNA 1 Biotin vor- gesehen sein, welches zur Bindung an die feste Phase mit einer dort vorgesehenen Streptavidmbeschichtung reagiert.
Am zweiten Ende E2 der DNA 1 ist e ne Gruppe 12 gebunden. Dabei kann es sich um einen Antikörper, ein Antigen, einen Re- zeptor oder einen Liganden handeln. Sofern der Nachweis physikalischer Eigenschaften gefuhrt werden soll, kann es sich bei der Gruppe auch um eine magnetische 12 oder eine elektrisch geladene Gruppe handeln.
In Fig. 5 ist das Mittel gemäß Fig. 4 im zweiten Zustand gezeigt. Auf die magnetische Gruppe 12 wirkt eine zweite Kraft F2. Dabei handelt es sich um eine Magnetkraft. Die zweite Kraft F2 ist großer als die erste Kraft Fl .
Bei Anlegen der zweiten Kraft F2 wird die DNA 1 gestreckt. Die haarnadelschleife 2 wird zerstört. Die räumliche Beziehung zwischen der ersten 3 und der zweiten fluorophoren Gruppe 4 wird aufgehoben. Es ist kein Fluoreszenz-Energie- Transfer mehr möglich. Die fluorophoren Eigenschaften der er- sten 3 und der zweiten fluorophoren Gruppe 4 andern sich. Auf der Grund der Änderung der fluorophoren Eigenschaften ist ein Nachweis eines Vorliegens eines Magnetfelds möglich.
In den Fig. 6 und 7 ist ein drittes Mittel zum Nachweis che- mischer Substanzen oder physikalischer Eigenschaften gezeigt.
Dabei ist an die feste Phase 5 eine erste DNA la gebunden, welche die erste fluoropnore Gruppe 3 tragt. Die erste DNA la ist abschnittsweise komplementär zu einer zweiten DNA lb, an deren zweites Ende die magnetische Gruppe 12 gebunden ist. Die zweite DNA lb tragt einen Quencher 4.
Die erste DNA la und die zweite DNA lb sind so ausgebildet, dass bei Anemanderlagerung ihrer komplementären Sequenzabschnitte die erste fiuorophore Gruppe 3 und der Quencher 4 eine räumliche Beziehung eingehen können, welche einen Fluoreszenz-Energie-Transfer ermöglicht .
Bei Anlegen eines Magnetfelds wird auf die magnetische Gruppe 12 eine von der festen Phase 5 weggerichtete Kraft F2 ausgeübt. Die zweite Kraft F2 ist großer als die erste Kraft Fl, mit welcher die erste DNA la und die zweite DNA 2a im m Fig. 6 gezeigten ersten Zustand zusammengehalten werden. Unter Einwirkung der zweiten Kraft F2 lost sich die zweite DNA lb von der ersten DNA la ab. Die räumliche Beziehung zwischen der ersten fluorophoren Gruppe 3 und dem Quencher 4 wird aufgehoben. Es ist kein Fluoreszenz-Energie-Transfer mehr mog- lieh. Dadurch wird eine Fluoreszenzreaktion bedingt, die das Vorhandensein eines Magnetfelds anzeigt.
Beispiel: Herstellung eines Magnetfeldsensors
1. Synthese eines DNA-Hybrids einer mit fluoreszenzaktiven Gruppe .
Zwei Oligonukleotide einer Lange von 40 Basen werden synthetisiert. Die Sequenzen der Oliogonukleotide sind zueinander komplementär. Der Schmelzpunkt der Oligonukleotide liegt bei ca. 70°C. Ein erstes Oligonukleotid tragt am 3 'Ende einen Aminolinker und am 5 ' Ende eine Fluoreszem-Gruppe . Ein zwei- tes Oliognukleotid tragt am 3 ' Ende eine Dabcyl-Gruppe und am 5 'Ende ein Biotm-Molekul . Die vom Hersteller (TibMol Biol, Berlin) im gefriergetrockneten Zustand gelieferten Oligonukleotide werden in einer Konzentration von 100 mM in sterilen Wasser gelost. Je 100 μl der Losungen werden in einem 500 μl Reaktionsgefaß zusammengeführt und 5 Min. auf 95°C erhitzt. Danach wird die Probe 15 Min. auf 68°C (2 Hin, unterhalb des Schmelzpunktes der Oligonukleotide) abgekühlt und dann bei 4°C gelagert.
2. Kopplung des DNA-Hybrids an eine Malemsaureanhydrid- aktivierte Kunststoffoberflache
In jeder Kavitat einer Malemsaureanhydπd-aktivierten Mikro- titerplatte (Pierce, KMF, Berg. -Gladbach) wird 100 μl der synthetisierten DNA-Hybrids gegeben. Die DNA wird über Nacht unter Schuttein bei 4°C mit der Oberflache inkubiert. Anschließend wird die Losung von der Oberflache abgezogen und 3 mal mit j e 150 μl sterilen Wasser gewaschen. Zur Absattigung von vorhandenen aktivierten Bmdungsstellen wird die Oberflache 3 mal mit 150 μl sterilen 10 mM TrisCl, ImM EDTA 5 M . bei Raumtemperatur mkubiert. Die Oberflache wird in sterilen 100 μl mM TrisCl, 1 mM EDTA ph 8 bei 4°C gelagert.
3. Bindung an superparamagnetische Partikel
Streptavidm-beschichtete superparamagnetische Partikel der
(Dynal, Hamburg) werden 1:1 (v/v) in 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA ph 8 suspendiert. Ca. 5 μl Partikel-Suspension werden jeweils m ein beschichtetes Well der Mikrotiterplatte gegeben. Die
Partikel werden durch leichtes Nachstoßen der Mikrotiterplat- te auf der Oberflache verteilt. Die Suspension wird 15 Mm. bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Nachweis eines Magnetfelds mittels eines FET-basisierten Sensors
Die Fluoreszenz der Mikrotiterplatte wird im Mikrotiterplat- tenreader und im Fluoreszenzmikroskop beooachtet. Dabei wird als Anregungsenergie die Wellenlange zur Anregung des Fluo- reszem bei 491 nm und die Emission bei 515 nm gemessen. In die Losung wird definierten Abstanden vom Boden der Mikrotiterplatte e n Permanentmagnet eingeführt und nach 20 Sek. wieder entfernt. Die Erhöhung der Fluoreszenz zeigt das Vorhandensein eines magnetischen Felds an. Als Kontrolle dient eine Mikrotiterplatte, die ein fixiertes DNA-Hybrid, das identisch behandelt wurde aber kein Biotm tragt.
Bezugszeichenliste
1 DNA la erste DNA lb zweite DNA
2 Haarnadelschleife
2a erster Schleifenabschnitt
2b zweiter Schleifenabschnitt
3 erste fiuorophore Gruppe 4 Quencher
5 feste Phase
6 erster Antikörper
7 Antigen
8 Stoff 9 zweiter Antikörper
10 superparamagnetisches Partikel
11 Permanentmagnet
12 magnetische Gruppe
El erstes Ende
E2 zweites Ende
Fl erste Kraft
F2 zweite Kraft

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zum Nachweis chemischer Substanzen oder pysikali- scher Eigenschaften, mit
einer eine erste (3) fiuorophore Gruppe aufweisenden ersten Polynukleotid- (la) oder Peptidsequenz, deren erstes Ende (El) an eine feste Phase (5) gebunden ist und
einer eine zweite (4) fiuorophore Gruppe aufweisenden zweiten Polynukleotid- (lb) oder Peptidsequenz, deren zweites Ende (E2) eine an die nachzuweisende chemische Substanz (7) bind- bzw. anlagerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Eigenschaft empfindliche Gruppe (6, 12) aufweist,
wobei die erste Polynukleotid- (la) oder Peptidsequenz an die zweite Polynukleotid- (lb) oder Peptidsequenz so anlagerbar ist, dass eine eine Wechselwirkung zwischen dem ersten (3) und dem zweiten fluorophoren Molekül (4) ermöglichende räumliche Beziehung herstellbar ist,
und wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz (7) an das zweite Ende (E2) und/oder Einwirkung einer äußeren Kraft (F2) auf die Gruppe (6 , 12) die räumliche Bezie- nung aufheb- und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar
2. Mittel nach Anspruch 1, wobei die erste (la) und die zweite Polynukleotid- oder Peptidsequenz (lb) zu einem
Molekül (1) verbunden sind.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die räumliche Beziehung in Form einer Sekundärstruktur (2) , insbesondere als Haarnadelschleife, Helix oder Faltblattstruktur, ausgebildet ist.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste fiuorophore Gruppe (3) an einem ersten Schleifenabschnitt (2a) und die zweite fiuorophore Gruppe (4) gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenabschnitt (2b) der Haarna- delschleife (2) in einem eine Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden sind.
5. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase (5) ein, vorzugsweise elektrisch leitfähiger, Kunststoff ist.
6. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trimethylthiophen, Thiophen, Triaminobenzol und/oder ein Polycarben enthält.
7. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste fiuorophore Gruppe (3) eine Akzeptorgruppe und die zweite fiuorophore Gruppe (4) eine Donorgruppe ist.
8. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste fiuorophore Gruppe (3) durch einen Quencher ersetzt ist.
9. Mittel nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Akzeptorgruppe (3) 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Fluoreszein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.
10. Mittel nach Anspruch 7 oder 9, wobei die Donorgruppe 6- Carboxy-Fluorescein, Fluoreszein, IADEANS, EDANS oder Bo- dipy Fl ist.
11. Mittel nach einem der vorhergeheden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz (1, la, lb) DNA, PTO oder PNA ist.
12. Mittel nach einem der vorhergeheden Ansprüche, wobei die Gruppe (6) ein Antikörper, ein Rezeptor, eine DNA-, PTO-, Peptid- oder PNA-Sequenz ist.
13. Verfahren zum Nachweis chemischer Substanzen oder pysika- lischer Eigenschaften, mit
einer eine erste fiuorophore Gruppe (3) aufweisenden ersten Polynukleotid- (la) oder Peptidsequenz, deren erstes Ende (El) an eine feste Phase (5) gebunden ist und
einer eine zweite fiuorophore Gruppe (4) aufweisenden zweiten Polynukleotid- (lb) oder Peptidsequenz, deren zweites Ende (E2) eine an die nachzuweisende chemische Substanz (7) bind- bzw. anlagerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Eigenschaft empfindiche Gruppe (6) aufweist,
wobei die ersten Polynukleotid- (la) oder Peptidsequenz an die zweite Polynukleotid- (lb) oder Peptidsequenz so angelagert wird, dass eine eine Wechselwirkung zwischen dem ersten (3) und dem zweiten fluorophoren Molekül (4) ermöglichende räumliche Beziehung gebildet wird, und wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz (7) an die Gruppe (6) und/oder Einwirkung einer äußeren Kraft auf die Gruppe (6) die räumliche Beziehung aufgehoben und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste (la) und die zweite Polynukleotid- oder Peptidsequenz (lb) zu einem Molekül (1) verbunden sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die räumliche Beziehung m Form einer Sekundarstruktur (2) , insbesondere als Haarnadelschleife, Helix oder Faltblattstruktur, ausgebildet ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die erste fiuorophore Gruppe (3) an einem ersten Schleifenabschnitt (2a) und die zweite fiuorophore Gruppe (4) gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenabschnitt (2b) der Haarnadelschleife (2) in einem eine Wechselwirkung ermog- l chenden Abstand gebunden sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 16, wobei die feste Phase (5) ein, vorzugsweise elektrisch leitfahiger, Kunststoff ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trimethylthiophen, Thiophen, Triammobenzol und/oder ein Polycarben enthalt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei die erste fiuorophore Gruppe (3) eine Akzeptorgruppe und die zweite fiuorophore Gruppe (4) eine Donorgruppe ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei die erste fiuorophore Gruppe (3) durch einen Quencher ersetzt ist .
21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Akzeptorgruppe (3) 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Fluoreszein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.
22. Verfahren nach Anspruch 19 oder 21, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluoreszein, IADEANS, EDANS oder Bodipy Fl ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 22, wobei die Nukleotidsequenz (1, la, lb) DNA, PTO oder PNA ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 24, wobei die Gruppe (7) ein Antikörper, ein Rezeptor, eine DNA-, PTO-, Peptid- oder PNA-Sequenz ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der die chemische Substanz (7) enthaltenden Probe ein Stoff (8) zugegeben wird, der eine weitere zur Anlagerung an die chemische Substanz (7) geeignete Gruppe (9) mit einem daran gebun- denen superparamagnetischen Partikel (10) enthält.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die nachzuweisende chemische Substanz (7) an die Gruppe (6) und an die weitere Gruppe (9) gebunden wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ein Magnetfeld angelegt wird, so daß das superparamagnetische Partikel (10) von der festen Phase (5) wegbewegt und dadurch die Sekundärstruktur (2) aufgehoben oder geändert wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 27, wobei die Fluoreszenz mittels eines mit einer Datenverarbeitungseinrichtung verbundenen Fluorometers erfaßt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei aus der zeitlichen Änderung der Fluoreszenzintensität die Konzentration der nachzuweisenden chemischen Substanz (7) ermittelt wird.
30. Zusammenstellung von Mitteln (Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 13, mit
al) einer einer im Bereich einer Sekundärstruktur (2) eine erste (3) und eine damit in Wechselwirkung stehende zweite fiuorophore Gruppe (4) aufweisenden Polynukleotidsequenz (1) , deren erstes Ende (El) an eine feste Phase (5) gebunden und deren zweites Ende (E2) eine an die nachzuweisende chemische Substanz (7) bind- bzw. anlagerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Eigenschaft empfindliche Gruppe (6) aufweist, wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz die Gruppe (6) und/oder Einwirkung einer äußeren Kraft (F2) auf die Gruppe (6, 12) die räumliche Beziehung aufhebbar und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar ist
oder
a2) einer eine erste (3) fiuorophore Gruppe aufweisenden ersten Polynukleotid- (la) oder Peptidsequenz, deren erstes Ende (El) an eine feste Phase (5) gebunden ist und einer eine zweite fiuorophore Gruppe (4) aufweisenden zweiten Polynukleotid- (la, lb) oder Peptidsequenz, deren zweites Ende (E2) eine an die nachzuweisende chemische Substanz (7) bind- oder anlagerbare oder eine für die nachzuweisende physikalische Eigenschaft empfindliche Gruppe (6, 12) aufweist, wobei die erste Polynukleotid- (la) oder Peptidsequenz an die zweite Polynukleotid- (lb) oder Peptidsequenz so angelagert wird, dass eine eine Wechselwirkung zwischen der ersten (3) und der zweiten fluorophoren Gruppe (4) ermöglichende räumliche Beziehung herstellbar ist, und wobei bei Anlagerung der chemischen Substanz (7) an die Gruppe (6) und/oder Einwirkung einer äußeren Kraft (F2) auf die Gruppe (6, 12) die räumliche Beziehung aufhebbar und damit eine Fluoreszenzreaktion erzeugbar ist.
31. Zusammenstellung von Mitteln nach Anspruch 30 enthaltend einen Stoff (8) , der eine weitere zur Anlagerung an die chemische Substanz (7) geeignete Gruppe (9) mit einem daran gebundenen superparamagnetischen Partikel (10) enthält.
32. Zusammenstellung von Mitteln (Kit) nach Anspruch 31, enthaltend einen Magneten (11) .
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