EP1194780A2 - Screening von target-ligand-wechselwirkungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen unter Verwendung einer chemischen Bibliothek von Liganden, die chemische Bibliothek von Liganden als solche, ein Verfahren zur Herstellung der chemischen Bibliothek sowie die Verwendung der chemischen Bibliothek für die Wirkstoffentwicklung und die Entwicklung molekularer Sensoren. Das Screening-Verfahren umfasst die Schritte: (a) Messung zumindest einer Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek von Liganden, wobei an jeden Liganden ein molekularer Fluoreszenzsensor gebunden ist, (b) Zugabe des Targets, und (c) Messung der gleichen Fluoreszenzeigenschaft(en) der chemischen Bibliothek wie in Schritt (a). Die an einer Festphase immobilisierte, ortsadressierbare chemische Bibliothek von Liganden ist dadurch gekennzeichnet, dass jeder Ligand an einen molekularen Fluoreszenzsensor gebunden ist, vorzugsweise derart, dass der molekulare Fluoreszenzsensor zwischen dem Liganden und der Festphase und/oder an dem der Festphase gegenüberliegenden Ende des Liganden gebunden ist.

Description

Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen unter Verwendung einer chemischen Bibliothek von Liganden, die chemische Bibliothek von Liganden als solche, ein Verfahren zur Herstellung der chemischen Bibliothek sowie die Verwendung der chemischen

Bibliothek für die Wirkstoffentwicklung und die Entwicklung molekularer Sensoren.

Die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe ist ein komplexes Verfahren. Nachdem in einem ersten Schritt die physiologischen und klinischen Aspekte der jeweiligen Krankheit untersucht werden, folgt in der Regel die Identifizierung relevanter Gene und biologischer Zielstrukturen, sog. Targets, für die Therapie. Nicht zuletzt die Fortschritte in der Molekularbiologie und den

Sequenzierverfahren von DNS und RNS haben neue Möglichkeiten bei dieser Identifizierung und somit für die Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe bereitgestellt.

Mit dem Fortschritt bei der Bereitstellung der biologischen Targets geht ein Fortschritt bei der Synthese von Liganden für diese Targets, d.h. Molekülstrukturen, die mit den Targets wechselwirken, durch jüngste Entwicklungen in der kombinatorischen Chemie einher. Unter kombinatorischer Chemie versteht man die parallele Synthese einer grossen Anzahl von

Verbindungen durch Umsetzung bekannter Edukte in bekannten Reaktionen nach kombinatorischen Prinzipien in automatisierten Reaktionsvorschriften, wodurch eine grosse strukturelle Vielfalt an Verbindungen, sog. chemische Bibliotheken, hergestellt werden kann. Es sind zwei grundlegende kombinatorische Prinzipien bekannt . Chemische Bibliotheken können beispielsweise durch das sog. "Split-Mix" -Verfahren hergestellt werden, bei denen Mikrokugeln, sog. Beads, auf verschiedene Reaktionsgefäße aufgeteilt werden, nach dem ersten Syntheseschritt, z.B. dem Anfügen des ersten Substituenten bzw. Synthesebausteins, wieder vereinigt und für den zweiten variablen Substituenten wieder aufgeteilt werden. Durch Wiederholen dieses Vorgangs ist es so auf technisch einfache Weise möglich, Tausende oder Millionen verschiedener Moleküle zu erzeugen, wobei sich auf jeder Mikrokugel nur eine bestimmte Molekülspezies befindet. Zur Herstellung einer ausreichenden Substanzmenge wie auch für eine leichte Handhabe der Festphase werden hierbei in der Regel poröse Mikrokugeln als Trägermaterial verwendet.

Ein anderes kombinatorisches Prinzip stellen die sog.

Mehrfachparallelsynthesen dar, bei denen pro Reaktionsgefäß bzw. fester Reaktionsfläche eine bestimmte Spezies synthetisiert wird. Solche chemischen Bibliotheken werden auch als ortsadressierbare ("spatially addressable") Bibliotheken bezeichnet. Obwohl die Anzahl der synthetisierbaren Spezies gegenüber der Split-Mix-Technik geringer ist, weist dieses Verfahren den Vorteil auf, daß die Identität des Syntheseproduktes aufgrund der festen Position bekannt bzw. stets nachprüfbar ist und eine größere Menge synthetisiert werden kann.

Als beschränkend bei der Bereitstellung von Liganden für die biologischen Targets hat sich jedoch nicht die Synthese der Liganden, sondern deren Evaluierung herausgestellt, und es besteht ein grosser Bedarf an verbesserten Analysemethoden zur Evaluierung bzw. zum Screening von chemischen Bibliotheken (Burbaum und Sigal, Current Opinion in Chemical Biology, 1997, 1:72-78). Für die Analyse der Target-Ligand- Wechselwirkungen werden bislang insbesondere das sog. FACS (Fluorescence Assisted Cell Sorting) -Verfahren im Falle von Bibliotheken gemäß dem "Split-Mix" -Verfahren und klassische Assays wie z.B. Immunoassays in 96er Mikrotiterplatten im Falle von ortsadressierbaren Bibliotheken verwendet. Bei diesen Analyseverfahren wird in der Regel ein an einen Liganden bindendes Target durch einen für das Target spezifischen Fluoreszenzmarker detektiert . Ein solches Analyseverfahren erfordert jedoch Spülschritte vor und nach der Zugabe des Fluoreszenzmarkers sowie eine relativ starke Wechselwirkung zwischen Target und Ligand.

Vor diesem Hintergrund ist es die erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zum Screening von Target-Ligand- Wechselwirkungen in chemischen Bibliotheken von Liganden bereitzustellen, das eine einfachere, schnellere und damit kostengünstigere Analyse bzw. Evaluierung von Liganden- Bibliotheken und die zudem auch die Evaluierung schwächerer Target-Ligand-Wechselwirkungen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen, umfassend die Schritte:

(a) Messung zumindest einer Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek von Liganden, wobei jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor enthält,

(b) Zugabe des Targets, und

(c) Messung der gleichen Fluoreszenzeigenschaft (en) der chemischen Bibliothek wie in Schritt (a) .

Figur 1 zeigt verschiedene Möglichkeiten, wie der molekulare Fluoreszenzsensor in dem Liganden enthalten sein kann.

Die Figuren 2 und 3 zeigen die Schemata der den Beispielen 1 und 2 zugrundeliegenden Reaktionen.

Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff "Target" molekulare Zielstrukturen verstanden, für die mit dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren ein Molekül gefunden werden soll, welches mit dieser Zielstruktur wechselwirkt.

Der Begriff "Target" ist dem Fachmann insbesondere bei der Suche nach neuen Wirkstoffen geläufig, er ist jedoch erfindungsgemäß nicht hierauf beschränkt. Bei der Wirkstoffsuche sind die Targets in der Regel als ursächlich für eine Krankheit identifiziert worden. Diesbezüglich herkömmliche Targets sind Enzyme, Zeiloberflächenrezeptoren, Kernrezeptoren, Ionenkanäle und Signalübertragungsproteine oder Teile hiervon oder auch Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotide .

Erfindungsgemäß umfaßt der Begriff "Target" jedoch auch solche Zielstrukturen, für die Moleküle gefunden werden sollen, die mit dem Target in einer Weise wechselwirken, daß diese Wechselwirkung für eine Analyse des Targets genutzt werden kann. Solche Moleküle sind beispielsweise Moleküle, deren Fluoreszenzeigenschaften sich aufgrund der Wechselwirkung mit dem Target verändern. Von besonderem analytischen Interesse sind hierbei Targets, die bei Analysen im medizinischen, Umwelt- und Militärbereich von Bedeutung sind, wie Glucose, 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure und Trinitrotoluol, aber auch grössere Strukturen wie Proteine und Mikroorganismen.

Der Begriff "Ligand" bezieht sich erfindungsgemäß auf Verbindungen, die für den Zweck synthetisiert worden sind, daß sie mit diesen Targets wechselwirken. Der Begriff ist also nicht auf Verbindungen beschränkt, die notwendigerweise mit dem Target wechselwirken, sondern sie weisen lediglich ein Bindungspotential auf. Diese Liganden sind chemisch nicht beschränkt, sofern sie sich durch Methoden der kombinatorischen Chemie herstellen lassen, d.h. durch Umsetzung bekannter Edukte in bekannten Reaktionen in automatisierten Reaktionsvorschriften in der Regel an einer Festphasenoberfläche. Insbesondere kommen erfindungsgemäß Polypeptide als Liganden in Betracht, wobei zu deren Synthese häufig Fmoc- oder tBoc-geschützte Aminosäuren verwendet werden. Zudem können die erfindungsgemäßen Bibliotheken auch nicht-linerare Bibliotheken sein, die sich von einem mehrfunktionellen Kern wie z.B. Triazin ableiten, dessen verschiedene funktionelle Gruppen zum weiteren Aufbau des Liganden verwendet werden.

Eine chemische Bibliothek von Liganden ist ein durch parallele Synthese hergestelltes Ensemble von Liganden, wobei sich die Herstellungsschritte der jeweiligen Liganden in zumindest einem Edukt unterscheiden. Die erfindungsgemäße ortsadressierbare chemische Bibliothek wird durch ein Mehrfachparallelverfahren hergestellt, wobei sich jeder Ligand in einem durch den Ort definierbaren Raum befindet, d.h. beispielsweise auf einem definierten Bereich einer Festphasenoberfläche. Die erfindungsgemäßen chemischen Bibliotheken sind hierbei an einer Festphasenoberfläche gebunden, die in der Regel der Oberfläche entspricht, an der die Synthese der Liganden erfolgte. Zur Herstellung von ortsadressierbaren Bibliotheken werden insbesondere Polymergepfropfte Polyethylen-Pegs (Geysen et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 1984, 81:3998-4002), Cellulosemembranen (Krchnak et al, Anal. Biochem. , 1990, 189:80-83) oder funktionalisierte Glas-Objektträger verwendet (Fodor et al, Science, 1991, 251:767-773) .

Erfindungsgemäß bevorzugt sind ortsadressierbare Bibliotheken, die in Mikrotiterplatten mit 96, 384 oder 1536 Vertiefungen hergestellt worden sind, insbesondere dann, wenn die Mikrotiterplatten auch für das nachfolgende Fluoreszenzmessverfahren verwendet werden können, also die Herstellung der Bibliothek und deren Evaluierung in einem Gefäss durchführbar ist .

Vorzugsweise weisen die Mikrotiterplatten eine optisch transparente Bodenplatte auf, die vorzugsweise aus Glas besteht. Die Bodenplatte weist zudem vorzugsweise eine Beschichtung auf, die zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeignete funktionelle Gruppen trägt, beispielsweise Silanfilme, Langmuir-Blodgett -Filme oder Hydrogelfilme wie z.B. Dextranfilme . Die funktioneilen

Gruppen an diesem Film sind nicht beschränkt und schließen beispielsweise Hydroxy- , Amino- , Aldehyd- und Carboxygruppen ein. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt ist die Bodenplatte mit einem Langmuir-Blodgett- Film, insbesondere einem zwei- oder dreidimensional vernetzbaren Langmuir-Blodgett-Film, besonders bevorzugt einem Langmuir-Blodgett-Film auf Cellulosebasis beschichtet. Solche Langmuir-Blodgett-Filme auf Cellulosebasis weisen den Vorteil auf, daß sie eine sehr geringe unspezifische Adsorption aufweisen, wodurch die Empfindlichkeit einer Detektion von Target-Ligand-Wechselwirkungen an dieser Oberfläche erhöht werden kann.

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete molekulare Fluoreszenzsensor ist ein Fluorophor, welcher bei Bindung des

Targets an den Liganden eine oder mehrere

Fluoreszenzeigenschaften, wie z.B. die Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer, ändert, wodurch eine Bindung des

Targets an den Liganden detektiert werden kann.

Erfindungsgemäß verwendete molekulare Fluoreszenzsensoren können insbesondere sein:

(1) ein Fluorophor mit einem angeregten, intramolekularen Charge-Transfer-Zustand;

(2) ein Fluorophor, dessen Fluoreszenzintensität von seiner Beweglichkeit abhängt;

(3) ein Fluorophor, dessen Fluoreszenz durch das Target gelöscht wird; (4) ein Paar bestehend aus einem Fluorophor und einem

Donor für photoinduzierten Elektronentransfer ; oder (5) ein Donorfluorophor-Akzeptorfluorophor-Elektronen- Energietransfer-Paar ist.

Ein Fluorophor mit einem angeregten, intramolekularen Charge- Transfer-Zustand, sog. ICT-Fluorophore, weisen

Fluoreszenzeigenschaften auf, die von der Polarität der Lösungsumgebung abhängig sind. So kann bei Wechselwirkung eines Ligand- ICT-Fluorophor-Konjugats mit einem Target eine Verschiebung des Emissionsmaximums oder der Fluoreszenzlebensdauer beobachtet werden. Beispielhaft kann hierfür 5- (Dimethylamino) naphthalin-1-sulfonyl (dansyl) chlorid erwähnt werden, welches gekoppelt an einen Antikörper gegen humanes Serumalbumin-Fab-Fragmente zur Detektion von humanem Serumalbumin verwendet wurde (Bright et al, Anal. Chem. , 1990, 62:1065-1069). Bei Binden des humanen Serumalbumins an die Fab-Fragmente wird eine starke Erhöhung der Fluoreszenz aufgrund der Veränderung der Wasserkoordination an dem Fluorophor beobachtet .

Weiterhin können auch Fluorophore als erfindungsgemäß verwendete molekulare Fluoreszenzsensoren verwendet werden, deren Fluoreszenzintensität und/oder Fluoreszenzlebensdauer von der Beweglichkeit des Fluorophors abhängt. Hierfür seien beispielsweise Biscyaninfarbstoffe erwähnt, die beispielsweise bei der Komplexierung von Zuckern ihre Beweglichkeit verlieren und dadurch eine höhere Fluoreszenzintensität zeigen (Takeuchi et al, Tetrahedron 52, 1996, 1195-1204) .

Als molekulare Fluoreszenzsensoren können weiterhin Paare eines Fluorophors und einem Donor für photoinduzierten Elektronentransfer (PET-Donor) verwendet werden. Zwei Effekte können bei Fluorophor-PET-Donor-Paaren detektiert werden: Zum einen hängen die Fluoreszenzeigenschaften wie Fluoreszenzintensität und/oder Fluoreszenzlebensdauer eines solchen molekularen Fluoreszenzsensors in der Regel von der Entfernung zwischen dem PET-Donor und dem Fluorophor ab, wobei die Fluoreszenzintensität in der Regel bei zunehmendem Abstand steigt. Andererseits kann auch eine Veränderung der Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer durch eine Veränderung der Mikroumgebung des Liganden bei Bindung des Targets hervorgerufen werden.

Weiterhin können als molekulare Fluoreszenzsensoren in dem erfindungsgemäßen Verfahren Paare von Donor-Fluorophoren und Akzeptor-Fluorophoren verwendet werden, zwischen denen ein Elektronenenergietransfer stattfinden kann. Wenn der Donor und der Akzeptor sich annähern, steigt das Akzeptor/Donor- Emissionsverhältnis . Beispielhaft kann für ein solches Donor/Akzeptorpaar Lissamin/Fluorescein genannt werden (Godwin and Burg, J. Am. Chem. Soc . 1996, 118:6514-6515).

Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Verwendung von molekularen Fluoreszenzsensoren, deren Fluoreszenz durch das Target gelöscht wird, wodurch die Fluoreszenzintensität und/oder Fluoreszenzlebensdauer verringert wird. Geeignete Fluoreszenzsensoren können durch einfache Vorversuche ermittelt werden, wobei man das Fluorophor mit dem Target in Kontakt bringt und die Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer beobachtet. Je größer die Veränderung eines dieser Parameter, desto geeigneter ist in der Regel das Fluorophor als erfindungsgemäß zu verwendender molekularer Fluoreszenzsensor .

Die erfindungsgemäß verwendeten molekularen Fluoreszenzsensoren weisen vorzugsweise maximale Emissionswellenlänge in dem Bereich über 600 nm auf, da diese Fluorophore normalerweise mit Diodenlasern angeregt werden können.

Der Einbau des molekularen Fluoreszenzsensors in den Liganden ist in Figur 1 näher dargestellt. Die Figuren la bis le zeigen Beispiele, in denen ein einzelner Fluorophor in dem Liganden eingebaut ist. Die Figuren lf bis li zeigen Beispiele, in denen ein Fluorophor und ein Donor für photoinduzierten Elektronentransfer oder ein Donorfluorophor- Akzeptorfluorophor-Elektronenenergietransferpaar eingebaut sind. In den Figuren la, lb, lf und lg ist der Ligand ausgehend von einem mehrfunktionalen Kern aufgebaut, in den Figuren lc, ld, le, lh und li ist der Ligand geradkettig. Die Fluorophore können in dem Liganden in dem ersten (la, lc) oder dem letzten (lb, le) Schritt bei der Ligandensynthese eingebaut werden, oder in einem Zwischenschritt (ld) . Ein Fluorophor und Donor für photoinduzierten Elektronentransfer oder ein Donorfluorophor-Akzeptorfluorophor-

Elektronenenergietransferpaar können in jedweder Kombination im ersten, letzten oder in einem Zwischenschritt eingebaut werden (lf bis li) .

Die zu messende (n) Fluoreszenzeigenschaft (en) hängt (hängen) von der Wahl des molekularen Fluoreszenzsensors ab. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Messung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie erlaubt, abhängig von dem verwendeten

Detektor, die Bestimmung der Fluoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und sogar u.U. der Anzahl der bindenden Liganden, insbesondere bei sehr großen Änderungen der jeweiligen Fluoreszenzeigenschaft, sehr empfindlich zu detektieren. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie eignet sich insbesondere, wenn die Liganden an einer planaren, transparenten Festphase gebunden sind, wie z.B. einem Objektträger. Bei der Bestimmung der Fluoreszenzintensität können auch die Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Emissionswellenlängen und einer festen Anregungswellenlänge verglichen werden. Da die Veränderungen der jeweiligen Fluoreszenzeigenschaft u.U. nur gering sind, ist es bevorzugt, einen möglichst empfindlichen Detektor zu verwenden. Bevorzugt ist die Verwendung einer Photodiode, insbesondere einer Einzelphotonenzähl -Avalanche- Photodiode .

Alternativ kann auch ein Photomultiplier oder eine verstärkte CCD-Kamera verwendet werden. Für Messungen der Fluoreszenzlebensdauer wird vorzugsweise ein Detektor verwendet, der im Time-Correlated-Single-Photon-Counting (TCSPC) -Modus arbeitet.

Die Verwendung von an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek bei dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren von Target-Ligand- Wechselwirkungen ist insbesondere deshalb vorteilhaft, weil sie die Anwendung hochempfindlicher Analyseverfahren dadurch ermöglicht, daß die mögliche Wechselwirkung zwischen Ligand und Target nur in einer dünnen Schicht an der Oberfläche der Festphase stattfinden kann. Weiterhin ermöglicht sie, die Liganden direkt nach der Synthese einem Screening zu unterwerfen, ohne daß eine Abspaltung von der Oberfläche, die Zugabe von Sekundärantikörpern oder weitere Waschschritte notwendig sind.

Die Erfindung betrifft zudem die an einer Festphase immobilisierte, ortsadressierbare chemische Bibliothek von Liganden als solche, die dadurch gekennzeichnet ist, daß jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor, wie oben definiert, enthält. Vorzugsweise liegt der molekulare Fluoreszenzsensor zwischen dem Liganden und der Festphase und/oder an dem der Festphase gegenüberliegenden Ende des Liganden und/oder in der Mitte des Liganden vor. Weiterhin ist der Einbau des Fluoreszenzsensores in der Mitte des Liganden insbesondere dann bevorzugt, wenn das Fluorophor einen angeregten, intramolekularen Charge-Transfer-Zustand aufweist oder wenn dessen Fluoreszenz von seiner Beweglichkeit abhängt. Besonders bevorzugt ist eine chemische

Bibliothek, deren Festphase durch den Boden einer Mikrotiterplatte bereitgestellt wird.

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete molekulare Fluoreszenzsensor kann in jedem Reaktionsschritt beim Aufbau der chemischen Bibliothek hinzugefügt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Einbau des Fluoreszenzsensors vor der ersten Ankopplung eines Synthesebausteins und/oder nach der Ankopplung des letzten Synthesebausteins. Im ersten Fall muß der molekulare Fluoreszenzsensor bifunktionell sein, im zweiten Fall ist eine Monofunktionalität ausreichend. Bei der Verwendung von Donor-Akzeptor- bzw. Fluorophor-Donor-Paaren ist es bevorzugt, das Paar derart an den Liganden zu binden, daß deren Abstand maximal wird. Bei Herstellung einer erfindungsgemäß bevorzugten chemischen Bibliothek, deren Festphase durch den Boden einer Mikrotiterplatte bereitgestellt wird, wird zunächst der Boden der Vertiefungen der Mikrotiterplatte für die kovalente Ankopplung der für die Synthese der Liganden erforderlichen Edukte derivatisiert . Dann folgt der Aufbau der chemischen Bibliothek in der Mikrotiterplatte, wobei in einem Reaktionsschritt ein molekularer Fluoreszenzsensor wie oben beschrieben an den aufzubauenden Liganden gekoppelt wird.

Zudem stellt die Erfindung die Verwendung einer solchen chemischen Bibliothek für die Wirkstoffentwicklung wie auch für die Entwicklung molekularer Sensoren bereit. Während für die Wirkstoffentwicklung die Struktur des Liganden, der mit dem Target wechselwirkt, ohne Berücksichtigung des molekularen Fluoreszenzsensors relevant ist, ist für die Entwicklung molekularer Sensoren das Konjugat aus Ligand und molekularem Fluoreszenzsensor von Bedeutung, d.h. dieses

Konjugat kann direkt für Verfahren zur Analyse des Targets verwendet werden.

Beispiel 1 (siehe Figur 2)

Eine Glasoberfläche wird mit 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichtet. Alternativ kann das Glassubstrat mit einer Monolage von derivatisierter Cellulose unter Verwendung der Langmuir-Blodgett-Technik beschichtet werden. Die Glasoberflache wird dann physikalisch mit einer inerten

Plastik- (Polypropylen) -Maske mit 96 Vertiefungen verbunden (Durchmesser der Vertiefungen: 7.0 mm) . In jede Vertiefung wird dann eine Lösung des Fluorophorderivats Fmoc-lys- A53 , gelöst in DMF, und den Kupplungsmitteln HOBt/PyBOP und Diisopropylethylamin hinzugefügt. Der Farbstoff bindet an die Oberfläche, worauf die Vertiefungen gründlich mit DMF gewaschen werden, um nicht spezifisch adsorbierten, lediglich physikalisch gebundenen Farbstoff zu entfernen. Nicht umgesetzte Amingruppen auf der Oberfläche werden dann durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid abgeblockt . Anschließend wird die Fmoc-Gruppe von dem Fluorophor durch eine Lösung von Piperidin in DMF abgespalten. Mit Standardtechniken der kombinatorischen Chemie wird dann eine Peptidbibliothek unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren hergestellt. In dem ersten Schritt werden eine Fmoc-Aminosäure und ein Kupplungsreagens wie z.B. PYBOP mit Diisopropylethylamin in jeder Vertiefung in DMF mehrere Stunden inkubiert, wobei in jeder Vertiefung eine andere Aminosäure verwendet wird. Die Vertiefungen werden dann gründlich mit DMF gewaschen, worauf eine Lösung von Piperidin in DMF hinzugefügt wird, um die Fmoc-Gruppen abzuspalten. Die Vertiefungen werden nochmal gründlich mit DMF gewaschen, und der Zyklus wird mit Fmoc- Aminosäuren wiederholt, bis Peptide der erwünschten Länge synthetisiert worden sind, wobei wiederum in jeder Vertiefung verschiedene Aminosäuren verwendet werden. Im letzten Schritt wird die Schutzgruppe der letzten Aminosäure mit Piperidin entfernt, die Vertiefungen gründlich mit DMF gewaschen und der PET-Elektronendonor 4-Dimethylaminophenyl-Essigsäure in DMF-Lösung unter Verwendung von PYBOP mit Diisopropylethylamin angekoppelt. Schließlich werden die Vertiefungen nochmals mit DMF gewaschen, und eine Lösung von Trifluoressigsäure in DMF wird hinzugefügt, um die

Schutzgruppen der Seitenketten zu entfernen. Dann werden die Vertiefungen mit DMF, Methanol, Wasser und anschließend Puffer für das Screeningverfahren gewaschen.

Die Fluoreszenzintensität des Liganden in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte wird unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops mit einem 635 nm Diodenlaser, der auf eine Oberfläche von 1 μm² fokusiert wird, und eines Einzelphotonenavalanchedetektors gemessen. Das Target wird dann hinzugefügt, und die Messung wird wiederholt. Bei signifikanter Veränderung der Fluoreszenzintensität in einer Vertiefung bindet der Ligand an das Target.

Beispiel 2 (siehe Figur 3) :

Eine Verbund-Mikrotiterplatte umfassend einen mit einem Langmuir-Blodgett-Film aus amino-funktionalisierter Cellulose beschichteten Glasboden und eine darauf haftende Polypropylenmaske wird wie in Ausführungsbeispiel 1 hergestellt. In jede Vertiefung wird dann eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (verschiedene Aminosäuren in den jeweiligen Vertiefungen) und den Kupplungsmitteln HOBt, PyBOP und DIPEA in DMF hinzugefügt (Schritt 1 in Schema 3) . Nach dem Ankoppeln werden die Vertiefungen gründlich mit DMF und Methanol gewaschen. Nicht umgesetzte Amingruppen auf der Oberfläche werden dann durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid abgeblockt (Schritt 2) . Anschließend wird die Fmoc-Gruppe von dem Fluorophor durch eine Lösung von Piperidin in DMF abgespalten (Schritt 3) . Die Schritte 1 und 3 werden wiederholt, bis ein Peptid der Länge von m Aminosäureresten in jeder Vertiefung vorliegt. Zu jeder Vertiefung wird dann eine Lösung des Fluorophorderivates Cy5 (phthal) (COOSu) in

DIPEA/DMF/Dioxan/Wasser (Schritt 4 in Schema 3) hinzugegeben. Das Fluorophor wird in die Peptidkette eingebaut und anschliessend werden die Vertiefungen gründlich mit DMF, Methanol und Wasser gewaschen, um unspezifisch, physikalisch adsorbierten Farbstoff zu entfernen. Die Phthalimidgruppe wird dann von dem Fluorophor durch Verwendung einer methanolischen Hydrazinlösung abgespalten (Schritt 5) . Hierauf werden die Schritte 1 und 3 für weitere (n-m) Zyklen wiederholt, bis Peptide der erwünschten Gesamtlänge von n Aminosäureresten erhalten wird, wobei jeweils zwischen dem Aminosäurerest m und dem Aminosäurerest m+1 Cy5 eingebaut ist. Schließlich werden die Vertiefungen nochmals gründlich mit DMF gewaschen, und eine Lösung von Trifluoressigsaure in DMF wird hinzugefügt, um die Schutzgruppen an den Seitenketten zu entfernen (Schritt 6) . Dann werden die Vertiefungen gründlich mit DMF, Methanol und Wasser und dann Puffer für das Screening gewaschen.

Die Fluoreszenzintensität des Liganden in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte wird unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops mit einem 635 nm Diodenlaser, der auf eine Oberfläche von 1 μm² auf der Glasoberfläche fokusiert wird, und eines Einzelphotonenavalanchedetektors gemessen. Das Target wird dann hinzugefügt, und die Messung wird wiederholt. Bei signifikanter Veränderung der Fluoreszenzintensität in einer Vertiefung bindet der Ligand an das Target .

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Screening von Target -Ligand- Wechselwirkungen, umfassend die Schritte:

(a) Messung zumindest einer Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek von Liganden, wobei jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor enthält,

(b) Zugabe des Targets, und

(c) Messung der gleichen Fluoreszenzeigenschaft (en) der chemischen Bibliothek wie in Schritt (a) .

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Fluoreszenzsensor ausgewählt wird aus

(1) einem Fluorophor mit einem angeregten, intramolekularen Charge-Transfer- Zustand; (2) einem Fluorophor, dessen Fluoreszenzintensität von seiner Beweglichkeit abhängt;

(3) einem Fluorophor, dessen Fluoreszenz durch das Target ganz oder überwiegend gelöscht wird;

(4) einem Paar bestehend aus einem Fluorophor und einem Donor für photoinduzierten Elektronentransfer; oder

(5) einem Donorfluorophor-Akzeptorfluorophor Elektronen-Energietransfer-Paar .

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Fluoreszenzsensor ein Fluorophor ist, dessen

Fluoreszenz durch das Target ganz oder überwiegend gelöscht wird.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der

Fluoreszenzeigenschaft eine Messung der Fluoreszenzintensität oder der Fluoreszenzlebensdauer ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Fluoreszenzeigenschaft mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop erfolgt.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung in dem Gefäß erfolgt, in dem die ortsadressierbare chemische Bibliothek hergestellt worden ist .

7. Verfahren gemäß gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Fluoreszenzeigenschaft in einer Mikrotiterplatte erfolgt.

8. An einer Festphase immobilisierte, ortsadressierbare chemische Bibliothek von Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor enthält.

9. Chemische Bibliothek von Liganden gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Fluoreszenzsensor zwischen dem Liganden und der Festphase und/oder an dem der Festphase gegenüberliegenden Ende des Liganden und/oder in der Mitte des Liganden eingebaut ist.

10. Chemische Bibliothek gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase der Boden einer Mikrotiterplatte ist.

11. Verfahren zur Herstellung der chemischen Bibliothek gemäß Anspruch 10, umfassend die Schritte:

a) Derivatisieren der Bodenoberflächen der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für die kovalente Immobilisierung; b) Aufbau einer chemischen Bibliothek von Liganden in der Mikrotiterplatte, wobei in einem Reaktionsschritt ein molekularer Fluoreszenzsensor an den aufzubauenden Liganden gekoppelt wird.

12. Verwendung der chemischen Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 für die Wirkstoffentwicklung .

13. Verwendung der chemischen Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 für die Entwicklung molekularer Sensoren.