DE10023517A1 - Anordnung zur Erkennung molekularer Bindung mit UV FRET und Verfahren zum Hochdurchsatzscreening - Google Patents
Anordnung zur Erkennung molekularer Bindung mit UV FRET und Verfahren zum HochdurchsatzscreeningInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist eine Anordnung zur Erkennung der Bindung zwischen einem Protein und einem weiteren Molekül, wobei die Moleküle mit einer UV Lichtquelle bestrahlt werden, das Protein (Donor) Licht absorbiert und im Falle der Bindung der beiden Moleküle die Energie auf das andere Molekül (Akzeptor) transferiert wird. Die Lichtemission der Moleküle wird registriert und anhand von Veränderungen (Anstieg der Akzeptorfluoreszenz oder Verchwinden der Donorfluoreszenz) die Bindung erkannt.
Description
Gegenstand dieser Erfindung ist eine Anordnung, mit der festgestellt werden kann, ob ein
Protein und ein weiteres Molekül, die sich in der Regel in einer Lösung befinden, aneinander
binden. Anhand von zwei Beispielen soll die Bedeutung des Problems, der Stand der Technik
und die Vorteile einer erfindungsgemäßen Anordnung aufgezeigt werden.
Die Untersuchung molekularer Bindungen ist von großem Interesse in der Molekularbiologie,
wo es z. B. darum gehen kann, die Wechselwirkung eines Proteins mit einem Liganden zu
registrieren.
Die Zahl der isolierten Proteine nimmt gegenwärtig rapide zu. Die Funktion der neu entdeckten
Proteine ist aber sehr häufig unklar, weil nicht bekannt ist, mit welchen anderen Proteinen oder
Zellbestandteilen die Proteine wechselwirken. Ein einfaches und schnelles Verfahren, mit dem
die Bindung eines Proteins an andere Moleküle untersucht werden kann, würde die
Entschlüsselung der Funktion der neu entdeckten Proteine beschleunigen.
Eine zweite wichtige Anwendung für ein solches Verfahren ist die Suche nach neuen,
maßgeschneiderten Arzneistoffen.
Es sind Krankheiten bekannt, die auf Funktionsstörungen oder Mutationen einzelner Proteine
zurückgeführt werden können. Ein Ansatz der Pharmaindustrie, diese Krankheiten zu
bekämpfen, ist es, Moleküle zu suchen, die hoch spezifisch an genau die Zielproteine binden.
Diese Arzneistoffe würden die Ursache der Erkrankung ausschalten, ohne starke
Nebenwirkungen zu verursachen.
Um ein Molekül zu finden, daß sich als Arznei eignet, wird in der Regel eine große Anzahl
verschiedener Moleküle in einzelnen Tests daraufhin untersucht, ob es an das Zielprotein
bindet. Die Testmoleküle können dabei Naturstoffbibliotheken entstammen oder durch
kombinatorische Chemie synthetisiert werden.
Ein spezielles Beispiel für solche synthetisierten Bibliotheken sind Oligonukleotide - kurze
einzelsträngige DNA-Moleküle, die relativ einfach in beliebiger Sequenz erzeugt werden
können. Schon mit nur 20 Basen können 204 = 1012 verschiedene Moleküle gebildet werden.
Im folgenden werden die Verfahren, die gegenwärtig zur Untersuchung der Bindung von
Molekülen an Proteine eingesetzt werden, dargestellt. Dabei wird das Molekül, das an das
Protein bindet, mit Ligand bezeichnet. Der Ligand kann ein weiteres Protein, ein Peptid,
Nucleotid oder eine andere chemische Verbindung sein.
Das Protein wird zu Beginn an einer Oberfläche immobilisiert. Der Ligand wird zugegeben,
und wenn er an das Protein bindet, über die Bindung ebenfalls immobilisiert. Ein Antikörper
gegen den Liganden wird zugegeben. Ein zweiter Antikörper, der ein Enzym trägt, wird
zugegeben. Dieser Antikörper bindet an den ersten Antikörper. Eine weitere Substanz wird
zugegeben, die eine Farbreaktion auslöst, wenn sie mit dem Enzym in Kontakt kommt.
Zwischen den einzelnen Schritten wird das Reaktionsgefäß gewaschen, so daß nur die an der
Oberfläche immobilisierten Moleküle im Gefäß bleiben. D. h. nur wenn der Ligand bindet,
können die Antikörper binden und es zur Farbreaktion kommen. Anhand der Farbreaktion
kann daher festgestellt werden, ob der Ligand gebunden hat.
Dieses Verfahren ist mit einigen Schwierigkeiten verbunden:
Zum einen muß das Protein an eine Oberfläche gebunden werden. Für jedes Protein muß ein Verfahren entwickelt werden, mit dem dies gelingt. Außerdem kann das Protein schon durch die Bindung an die Oberfläche so verändert werden, daß es seine Funktion verliert. Es muß also auch für jedes Protein nachgewiesen werden, daß es nach der Immobilisierung noch funktional ist.
Zum einen muß das Protein an eine Oberfläche gebunden werden. Für jedes Protein muß ein Verfahren entwickelt werden, mit dem dies gelingt. Außerdem kann das Protein schon durch die Bindung an die Oberfläche so verändert werden, daß es seine Funktion verliert. Es muß also auch für jedes Protein nachgewiesen werden, daß es nach der Immobilisierung noch funktional ist.
Die Beschaffung der Antikörper (z. B. aus Kaninchen) ist aufwendig und langwierig. Die
Waschschritte machen das Verfahren langsam. Außerdem müssen die Bedingungen, unter
denen gewaschen wird, genau gewählt werden, weil einerseits die immobilisierten Moleküle
nicht mit abgewaschen werden sollen, aber andererseits nur die spezifisch gebundenen
Moleküle im Reaktionsgefäß verbleiben sollen.
Es gibt weitere Verfahren, bei denen einer der Bindungspartner immobilisiert wird. Diese
Verfahren haben dieselben grundsätzlichen Nachteile, die durch die Immobilisierung und das
Waschen der Proben entstehen.
Bei diesem Verfahren wird der Ligand fluoreszenzmarkiert und in eine Lösung mit dem Protein
gegeben. In einem konfokalen Aufbau wird die Diffusionsgeschwindigkeit des Liganden über
die Verweildauer im Laserfokus gemessen. Bindet der Ligand an das Protein, ändert sich die
Masse des Komplexes und damit auch die Diffusionsgeschwindigkeit.
Dieses Verfahren kommt ohne Immobilisierung aus, funktioniert aber erst bei einem relativ
großen Massenverhältnis zwischen Protein und Ligand (< 8 : 1). Außerdem muß die Lösung
stark verdünnt sein, weil die Diffusionszeit nur dann gut bestimmt werden kann, wenn sich
wenige (< 50) fluoreszenzmarkierte Moleküle gleichzeitig im Laserfokus befinden. Die geringe
Konzentration führt zu langen Meßzeiten. Es kann kein Gemisch von Liganden, von denen
nicht alle binden, untersucht werden. Außerdem läßt sich das Verfahren nur schwer
parallelisieren, was den Durchsatz klein macht.
Das Protein und der Ligand werden fluoreszenzmarkiert und in eine Lösung gegeben. Die
Fluoreszenzmarkierungen sind dabei so gewählt, daß sich das Emissionsspektrum der
Proteinmarkierung gut mit dem Absorptionsspektrum der Ligandmarkierung überlappt.
Dann wird der Farbstoff, der ans Protein gebunden ist, mit einer Lichtquelle angeregt. Bindet
der Ligand an das Protein, kann die Anregungsenergie strahlungslos auf die
Fluoreszenzmarkierung des Liganden übertragen werden (FRET, Förster-Resonanz-
Energietransfer). Die Markierung des Liganden emittiert dann Fluoreszenz, die von einem
Photodetektor nachgewiesen wird.
Weil die Energie vom Protein auf den Ligand übertragen wird, werden die Moleküle auch als
Donor und Akzeptor bezeichnet.
Die Effzienz des Energietransfers hängt stark vom Abstand (r) zwischen Donor und Akzeptor
ab (~r-6). Diese starke Abhängigkeit macht das FRET Signal zu einem guten Merkmal für die
Bindung von Protein und Ligand. Das Verfahren kann in Lösung ohne Waschschritte
durchgeführt werden und läßt sich gut parallelisieren. Nachteil dieses Verfahrens ist, daß
sowohl Protein als auch Ligand fluoreszenzmarkiert werden müssen.
Die gezielte Fluoreszenzmarkierung von Proteinen ist mit großem gentechnischen Aufwand
verbunden. Daher ist dieses Verfahren nicht für Screeninganwendungen geeignet. Außerdem
birgt die Markierung die Gefahr in sich, daß das Protein durch die Markierung in seiner
Funktion gestört wird.
Mit einer erfindungsgemäßen Anordnung läßt sich die Bindung von Protein und Ligand
feststellen, ohne daß das Protein dazu verändert werden muß.
Dabei wird ausgenutzt, daß es drei Aminosäuren (Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin) gibt,
die im UV absorbieren (Wellenlängen < ca. 300 nm). Fast alle Proteine enthalten eine oder
mehrere dieser Aminosäuren, so daß sich diese Proteine mit UV Licht anregen lassen.
Regt man die Proteine mit einer UV Lichtquelle an und markiert den Liganden mit einem
Farbstoff der auf die Emissionswellenlängen der Proteine angepaßt ist, kann FRET bei der
Bindung von Ligand und Protein auftreten. An einer Erhöhung der Ligandfluoreszenz kann die
Bindung erkannt werden.
Der Signalanstieg ist sehr groß, so daß die Bindung sehr empfindlich festgestellt werden kann.
Ein starker Signalanstieg macht es möglich ein ganzes Gemisch von Liganden in einer Messung
darauf zu untersuchen, ob einer unter ihnen an das Protein bindet. Dies würde
Screeninganwendungen entsprechend beschleunigen.
Eine andere Möglichkeit, die Bindung zu erkennen, ist es, den Liganden mit einem Molekül zu
markieren, das die Fluoreszenz des Proteins löscht (quenchen). In diesem Fall würde das
Bindungsereignis an einer Signalreduktion der Eigenfluoreszenz des Proteins festgestellt
werden.
Sind die Liganden Oligonukleotide, kann unter Umständen auch auf die Markierung der
Liganden verzichtet werden, weil z. B. DNA die Tyrosin und Tryptophan Fluoreszenz löscht
und die Oligonukleotide somit als Quencher wirken.
Weitere Möglichkeiten die Bindung mit spektroskopischen Methoden festzustellen sind eine
Veränderung der Fluoreszenzlebensdauer oder -polarisation.
Nachdem die Bindung von Protein und Ligand festgestellt wurde, kann auch durch Zugabe
weiterer Substanzen (z. B. eines kompetitiven Binders) die Bindung wieder gelöst werden. Die
Kinetik der Trennung der Bindung kann auch aufgenommen werden, was mit dem ELISA
Verfahren nicht möglich ist.
Die Untersuchung der Bindung mit UV FRET hat folgende Vorteile gegenüber den bekannten
Verfahren:
- 1. Es kann in Flüssigkeiten durchgeführt werden. D. h. die Proteine können sich in physiologischer Umgehung befinden und liegen in ihrer natürlichen Konformation vor.
- 2. Die Proteine brauchen nicht fluoreszenzmarkiert oder auf andere Art chemisch verändert zu werden.
- 3. Es ist keine Immobilisierung nötig.
- 4. Die Durchführung der Messung ist sehr einfach: Protein und Ligand müssen nur in eine Lösung gegeben werden. Es ist kein Waschen nötig.
- 5. Es können leicht viele Reaktionen parallel untersucht werden, z. B. eine ganze Mikrotiterplatte simultan.
- 6. Die Messung läßt sich schnell und sehr sensitiv durchführen, d. h. es wird nur eine geringe Substanzmenge benötigt.
- 7. Auch die Kinetik der Protein-Ligand-Bindung kann gemessen werden, wenn der Zeitverlauf der Fluoreszenz aufgenommen wird.
- 8. Das Meßprinzip läßt sich auf praktisch alle Proteine (alle, die mindestens eine der absorbierenden Aminosäuren enthalten) ohne Veränderungen anwenden. D. h. mit einem auf diesem Prinzip basierenden Verfahren kann Hochdurchsatzscreening von Protein-Ligand Wechselwirkungen durchgeführt werden.
- 9. Im Falle von kombinatorisch synthetisierten Oligonukleotidbibliotheken kann die Fluoreszenzmarkierung leicht durchgeführt werden.
Insbesondere Punkt 8 und 9 der Liste sind für Hochdurchsatzscreening-Anwendungen
wesentliche Fortschritte gegenüber dem Stand der Technik.
Claims (9)
1. Anordnung zur Erkennung der Bindung zwischen einem Protein (Donor) und einem
Molekül (Akzeptor) dadurch gekennzeichnet,
daß die Moleküle mit UV-Licht einer Lichtquelle bestrahlt werden
und daß das Protein das Licht absorbiert
und daß die Lichtemission der Moleküle mit einem Photodetektor registriert wird
und daß anhand spektroskopischer Merkmale die Lichtemission des Proteins und des Akzeptors unterschieden wird
und daß die Bindung der beiden Moleküle durch Veränderungen der Akzeptor- oder Donoremission festgestellt wird.
daß die Moleküle mit UV-Licht einer Lichtquelle bestrahlt werden
und daß das Protein das Licht absorbiert
und daß die Lichtemission der Moleküle mit einem Photodetektor registriert wird
und daß anhand spektroskopischer Merkmale die Lichtemission des Proteins und des Akzeptors unterschieden wird
und daß die Bindung der beiden Moleküle durch Veränderungen der Akzeptor- oder Donoremission festgestellt wird.
2. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet,
daß die Unterscheidung zwischen Donor und Akzeptor anhand der Emissionsspektren
geschieht.
3. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet,
daß die Lichtquelle gepulst oder moduliert ist
und daß die Unterscheidung zwischen Donor und Akzeptor anhand der Dauer der
Lichtemission oder der Fluoreszenzlebensdauer geschieht.
4. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet,
daß die Unterscheidung zwischen Donor und Akzeptor anhand der Polarisation der Emission
geschieht.
5. Anordnung nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet,
daß die Dauer der Lichtemission mit Hilfe eines phasensensitiven Detektors registriert wird.
6. Anordnung nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet,
daß die Dauer der Lichtemission mit einem schnell öffnenden Detektor oder Zeit-korrelierter
Einzelphotonen-Zählung registriert wird.
7. Anordnung nach einem der voranstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet,
daß aus einem Gemisch von vielen verschiedenen Molekülen ein an den Donor bindendes
Molekül identifiziert wird.
8. Anordnung nach einem der voranstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet,
daß zur Detektion der Lichtemission ein Mikroskop verwendet wird.
9. Anordnung nach einem der voranstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet,
daß verschiedene Reaktionsgefäße simultan untersucht werden.
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|---|---|---|---|
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Country Status (1)
| Country | Link |
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| DE (1) | DE10023517A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103901012A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-07-02 | 山西大学 | 一种提高纳米粒子荧光成像清晰度的方法及装置 |
-
2000
- 2000-05-13 DE DE2000123517 patent/DE10023517A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103901012A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-07-02 | 山西大学 | 一种提高纳米粒子荧光成像清晰度的方法及装置 |
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