DE69830854T2

DE69830854T2 - Mehrfaches testverfahren

Info

Publication number: DE69830854T2
Application number: DE69830854T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Cardiff THOMAS
Original assignee: Amersham Biosciences UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 1997-12-04
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2018-12-04
Also published as: EP1036332A1; JP2002517759A; CA2313047A1; JP4318859B2; WO1999064867A1; US6913935B1; EP1036332B1; DE69830854D1; WO1999064867A8

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein multiples Assayverfahren, das zum Ausführen eines High-Throughput-Screenings für Drug Discovery geeignet ist, und speziell auf eine Prozedur, die für ein/eine parallele(s) Verarbeiten und Analyse von Ergebnissen von vielen Tausenden getrennter biologischer Assays in großem Maßstab sorgt.
Der Prozess des High-Throughput-Screenings (HTS) ist für die Ziele der pharmazeutischen Industrie zentral, d.h. neue Arzneimittel zu entdecken, zu entwickeln und zu vermarkten (Lutz et al., (1996) Drug Discovery Today, 1(7), 277–86). Im HTS-Prozess werden in Frage kommende Arzneimittel auf mögliche Effekte in biologischen Systemen gescreent. Zunehmend gibt es einen Antrieb, größere Zahlen von Verbindungen in jedem Screen zu testen, und Screening-Assays, die hunderttausend Verbindungen oder mehr untersuchen, sind typisch. Dies erfordert eine hoch anspruchsvolle Roboter-Automatisierung und Messgeräteausrüstung, um effiziente Niveaus des Durchsatzes zu erreichen. Im allgemeinen nutzen moderne Screening-Techniken Multiwell-Platten-Technologien, um den Transfer der vielen Tausend von Assays zwischen den verschiedenen Stufen in der Prozedur zu ermöglichen. Derartige Platten können zwischen 96 und 1536 oder mehr individuelle Wells enthalten, wobei jedes Well dieselben Reagenzien wie alle anderen Wells im Screen enthält, mit Ausnahme der individuellen Verbindungen, die getestet werden und jeweils in nur einem Well vorhanden sind. Das Standardformat und -layout der Multiwell-Platten ermöglicht eine schnelle Roboterhandhabung und dass flüssigkeitsabgebende Vorrichtungen verwendet werden können, um den Durchsatz zu maximieren.
In vielen HTS-Anwendungen erfolgt der die Geschwindigkeit begrenzende Schritt in der Assay-Analyse auf der Stufe des Detektierens und Messens des Signals von dem in dem Assay verwendeten Marker. Dieser Schritt ist ein serieller Prozess, wobei jedes Well der Multiwell-Platte der Reihe nach gemessen wird. Derartige Messungen erfordern typischerweise eine bis mehrere Sekunden, um sie auszuführen, mit der Konsequenz, dass die zum Analysieren einer Multiwell-Platte gebrauchte Zeit beträchtlich sein kann.
Durchflusszytometrie (Parks, D. R. und Herzenberg, L. A., 1984, Methods in Enzymology 108, 197–241) ist eine Technik zum Analysieren von Zellen oder Teilchen gemäß ihrer Größe und Fluoreszenz. Die Zellen oder Teilchen werden durch einen dünnen, sich schnell bewegenden Flüssigkeitsstrom getragen, der von Lichtstrahl(en) von einem oder mehreren Lasern oder anderen Lichtquellen geradlinig abgetastet wird. Fotodetektoren registrieren Lichtstreuung und Fluoreszenz, die aus einer Zelle oder einem Teilchen, das durch einen Lichtstrahl läuft, austritt, und die resultierenden elektronischen Signale werden verarbeitet, um analytische Daten zu ergeben. Im Gegensatz zu der geringen Datenakquisitionszeit von Multiwell-Platten-Lesegeräten ermöglicht die Messgeräteausrüstung für Durchflusszytometrie eine sehr schnelle Analyse vieler Tausender oder Millionen von Zellen oder anderen Teilchen in einem Flüssigkeitsstrom einer hohen Geschwindigkeit und ist durch sehr schnelle Messzeiten gekennzeichnet, z.B. von der Größenordnung 1 μsek/Ereignis.
Durchflusszytometrie besitzt andere Eigenschaften, die es günstig für die Analyse in HTS machen. Erstens sind die erforderlichen sehr kleinen Analysevolumina mit dem gegenwärtigen Trend kompatibel, Assays als ein Mittel des steigendes Durchsatzes zu verkleinern. Zweitens ist die Durchflusszytometrie inhärent ein homogenes Messsystem, d.h. die Messung des Anteils eines spezifischen, mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Liganden in einem besonderen Zustand kann durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit, diesen Typ von Fluoreszenzfarbstoff von dem gesamten Typ physikalisch zu trennen. In HTS-Anwendungen ist dies eine erwünschte Eigenschaft, da sie die Notwendigkeit zum Waschen oder Trennen von Stufen zum Isolieren des erwünschten Typs von Marker vor der Messung ausschließt. Durchflusszytometrie wurde weit verbreitet für diagnostische Assays verwendet, um einen weiten Bereich von Analyten in Blut und anderen biologischen Fluids zu messen, z.B. in Immunotyping und in der Messung von Zelloberflächenantigenen, die mit HIV-Infektion in Verbindung stehen (Patterson, B. K. et al J. Virology, (1995) 69(7) 4316–4322). Trotz ihrer inhärenten Vorteile ist die Durchflusszytometrie jedoch benachteiligt durch geringe Durchsatzgeschwindigkeiten, die eine Folge des seriellen Verarbeitens sind. Während die Lesezeiten sehr schnell sind, was ermöglicht, dass viele Tausende von Ereignissen pro Sekunde innerhalb eines einzelnen Assays analysiert werden, gibt es eine beträchtliche Verzögerung zwischen Proben, die gegenwärtig den Gesamtdurchsatz auf < 100 getrennte Analyse pro Stunden begrenzt.
Ein Wunsch, einen höheren Durchsatz in diesen Anwendungen zu besitzen, hat zur Entwicklung von Multiplex-Verfahren geführt, die es ermöglichen, dass mehr als ein Analyt simultan durch Durchflusszytometrie gemessen wird. Multiplexing wird durch Ausführen von mit fester Phase verknüpften Assays unter Verwenden von Plastik- oder Latex-Kügelchen als Assaysubstrate erreicht. Durch Verwenden einer Anzahl diskreter Kügelchentypen, die individuell voneinander unterscheidbar sind, wobei jeder Kügelchentyp Reagenzien für einen Assay trägt, kann eine Messausrüstung eines Standard-Durchflusszytometers verwendet werden, um sowohl den Kügelchentyp zu identifizieren als auch das Assaysignal, das mit jedem Kügelchen verbunden ist, zu messen, und deshalb um mehrere Tests parallel auf einer einzelnen Probe auszuführen, z.B. um das Vorhandensein von multiplen Analyten in menschlichen Seren zu messen (McHugh T. M., 1994, Methods in Cell Biology 42, 575–595). Unterscheidung zwischen Kügelchentypen kann durch die Größe (Frengen J. et al., 1995, Journal of Immunological Methods, Band 178, S. 141), durch die Farbe der Fluoreszenz (Fulwyler M. J. UK Patent 1,561,042) oder durch elektronische Mittel (Mandecki W. US-Patent 5,641,634) erreicht werden.
Multiplexen von Durchflusszytometrie-Assays führt ein Element des parallelen Verarbeitens in einen anderenfalls seriellen Prozess ein, so dass, während die Verzögerung zwischen Proben wie zuvor bleibt, die Menge der Information, die von jeder Probe gesammelt wird, mehrfach vergrößert wird, was einen resultierenden Anstieg in den Datenakquisitionsgeschwindigkeiten ergibt. Dies ist ideal für die Messung von multiplen Analyten in einer einzelnen Probe, d.h. „eine Probe, viele Tests". Jedoch sind die Erfordernisse eines High-Throughput-Screenings, d.h. „ein Test, viele Pro ben", das Umgekehrte. In HTS-Assays ist es eine Notwendigkeit, dass es immer eine Trennung von Assays geben muss, um zu ermöglichen, dass die Effekte individueller Verbindungen innerhalb des Screens bestimmt werden. Demzufolge sind Verfahren, die zuvor für Multiplex-Diagnoseanalysen durch Durchflusszytometrie beschrieben wurden, nicht auf HTS-Assays anwendbar.
WO-A-93/02360 offenbart ein Verfahren und ein Kit zum angrenzenden Detektieren multipler Analyten von Interesse in einer Probe, umfassend Kombinieren einer Probe mit einer Zusammensetzung, die bekannte Anteile multipler Untergesamtheiten von Reagenzien umfasst, die spezifisch an Analyten binden, die an teilchenförmigen Trägern, z.B. Mikrokügelchen, gebunden sind und die durch Durchflusszytometrie detektiert werden können.
WO-A-97/14028 beschreibt ein Verfahren und ein Kit für die Multiplex-Diagnose und Gen-Analyse von Enzymen, DNA-Fragmenten, Antikörpern etc. Die Erfindung setzt einen Pool von Kügelchen-Untersätzen ein, wobei die Kügelchen eines Untersatzes in mindestens einer sich unterscheidenden Eigenschaft von Kügelchen eines anderen Untersatzes verschieden sind.
Diese Erfindung stellt ein Assay-Verfahren für N Proben, von denen jede eine zu testende Verbindung enthält, bereit, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:

a) Bereitstellen von N Grundgesamtheiten von Trägerkügelchen, wobei die Trägerkügelchen jeder Grundgesamtheit von den Trägerkügelchen jeder anderen Grundgesamtheit unterscheidbar sind;
b) Abgeben jeder der N Grundgesamtheiten der markierten Trägerkügelchen in eines von N verschiedenen Reaktionsgefäßen;
c) Abgeben jeder der N Proben in eines der verschiedenen Reaktionsgefäße;
d) Bereitstellen von Reagenzien zum Ausführen eines Assays in jedem der N verschiedenen Reaktionsgefäße, wodurch eine Signaleinheit veranlasst wird, sich in einer Verbindungs-bezogenen Weise zwischen den Trägerkügelchen in jenem Reaktionsgefäß und einem überstehenden Fluid zu verteilen;
e) Kombinieren der Inhalte aller Reaktionsgefäße zu einer Mischung; und
f) Analysieren der Mischung durch Durchflusszytometrie, um die Signaleinheit, die mit einer jeden Sequenz von individuellen Kügelchen assoziiert ist, einem Assay zu unterziehen;

Geeigneterweise ist N größer als oder gleich 2, bevorzugt im Bereich von 2 bis 100.000, bevorzugter im Bereich von 80 bis 4000.
Geeigneterweise sind die Trägerkügelchen mit einem Reagenz, das daran gebunden ist, beschichtet, wobei das Reagenz ggf. eine Signaleinheit trägt.
Geeignete Assayformate, die ein Reagenz einsetzen, das eine Signaleinheit trägt, die an das Trägerkügelchen gebunden ist, umfassen jene, die, entweder durch chemische oder durch enzymatische Wirkung, die Freisetzung einer Signaleinheit von dem Kügelchen beinhalten. In der Alternative wird ein Reagenz, das die Signaleinheit trägt, in Lösung in ein geeignetes Medium gegeben und umfasst Assays, die das Binden der Signaleinheit entweder kovalent oder nicht-kovalent an ein auf dem Kügelchen immobilisiertes Reagenz beinhalten.
Geeigneterweise bilden die Reaktionsgefäße die Wells einer Multiwell-Platte.
In Schritt d) des Verfahrens wird eine Assay-Reaktion ausgeführt, in der eine Signaleinheit veranlasst wird, sich in einer Verbindungs-bezogenen Weise zwischen den Trägerkügelchen und einem überstehenden Fluid zu verteilen. Verschiedene Beispiele können in einem Beispiel gegeben werden, ein Assay wird ausgeführt, um das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein einer besonderen zu testenden Verbindung in jeder Probe zu bestimmen; in jedem Reaktionsgefäß verteilt sich die Signaleinheit in einer Weise, die das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein der Verbindung in der Probe, die in jenes Gefäß abgegeben ist, anzeigt. In einem anderen Beispiel wird ein Assay ausgeführt, um die Konzentration einer besonderen zu testenden Verbindung in jeder Probe zu bestimmen; in jedem Reaktionsgefäß wird die Signaleinheit in einer Weise verteilt, die die Konzentration der Verbindung in der Probe, die in jenes Gefäß abgegeben ist, anzeigt. In einem anderen Beispiel, das bevorzugt ist, wird ein Assay ausgeführt, um die biologischen Aktivitäten einer Mehrzahl verschiedener zu testender Verbindungen zu bestimmen, wobei jede Probe eine unterschiedliche Verbindung aufweist oder daraus besteht, im allgemeinen in einer bekannten Menge; in jedem Reaktionsgefäß verteilt sich die Signaleinheit in einer Weise, die die biologische Aktivität der Verbindung in der Probe, die in jenes Reaktionsgefäß abgegeben wurde, anzeigt.
Kügelchen, die zur Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet sind, sind jene, die mit Verarbeitung und Analyse durch Durchflusszytometrie kompatibel sind, und sind zusätzlich geeignet zum Einbauen von Mitteln der Identifizierung in das Kügelchen. Bevorzugte Kügelchentypen sind aus Plastik oder polymeren Materialien gebildet, einschließlich Polystyrollatex-Arten, Polyacrylate, Polymethylmethacrylat, Polyacrylamide, Polyurethan, Polyvinylidenchlorid und Polyvinyltoluol. Polystyrol-Kügelchen sind besonders für die Verwendung in der Erfindung bevorzugt. Kügelchen können einen mittleren Durchmesser besitzen, der zur Verwendung in Durchflusszytometrie-Anwendungen geeignet ist. Eine Kügelchengröße, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet ist, kann im Bereich von 1 bis 50 μm im Durchmesser, bevorzugt in einem Durchmesser von 2 bis 20 μm liegen. Bevorzugt werden die Kügelchen derselben Größe im Verfahren der Erfindung verwendet. Optimalerweise werden Kügelchen eines mittleren Durchmessers von 10 μm im Verfahren dieser Erfindung verwendet.
Detektierbare Marker, die zur Kügelchenidentifizierung geeignet sind, umfassen fluoreszierende Moleküle, absorbiert oder eingebaut in oder auf der Oberfläche des Kügelchens. Als ein alternatives Mittel des Unterscheidens und Identifizierens von Kügelchen-Grundgesamtheiten können Kügelchen einer Grundgesamtheit von einer unterschiedlichen Größe im Vergleich zu Kügelchen einer anderen Grundgesamtheit sein. In einer weiteren Alternative kann die Kügelchen-Identifizierung durch elektronische Mittel stattfinden, wie z.B. durch den Einschluss einer geeigneten elektronischen Markierung in den Kern des Kügelchens. Detektierbare Marker, wie jene, die oben beschrieben sind, können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden, um Kügelchen-Grundgesamtheiten zu erzeugen, die eindeutig identifizierbar sind.
Bevorzugt werden Kügelchen, einschließlich Fluoreszenzmarker, in dem Verfahren der Erfindung verwendet. Fluoreszenzmarkierte Kügelchen, die zur Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, werden durch den Einbau verschiedener Mengen zweier oder mehrerer verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in den Körper des Kügelchens derart hergestellt, dass jede Kombination derartiger Fluoreszenzfarbstoffe einen eindeutigen Kügelchentyp definiert. Die Anzahl möglicher diskreter Assays, die als Multiplex ausgeführt werden können, wird nur durch die Anzahl von Kügelchen-Typen begrenzt, mit der es möglich ist, in einer Mischung zu unterscheiden. Mit einer gegenwärtigen Durchflusszytometrie-Messausrüstung stellt dies keine Begrenzung auf die Nutzbarkeit der Prozedur dar. Typischweise sind moderne Durchflusszytometrie-Instrumente fähig, simultan Fluoreszenz bei vier Wellenlängen zu messen, zusammen mit anderen Parametern, z.B. Lichtstreuung, die ein Maß für die Größe der analysierten Teilchen ist. Zusätzlich ist der dynamische Bereich der Fluoreszenzdetektion groß und die Fluoreszenz kann genau über mehrere Größenordnungen gemessen werden. Es ist deshalb möglich, Schemata zu entwerfen, die eine große Anzahl individuell unterscheidbarer Kügelchentypen ergeben, die als Träger in einem HTS-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung dienen. Zum Beispiel können Kügelchen hergestellt werden, die drei getrennte, spektral unterscheidbare Fluores zenzfarbstoffe enthalten, wobei jeder Fluoreszenzfarbstoff in einem von acht Konzentrations-Niveaus vorhanden sein kann. So ist es möglich, 8³, d.h. 512 spektral unterscheidbare Kügelchentypen zu erzeugen. Falls, zusätzlich, drei Größen von Kügelchen verwendet werden, beträgt die Gesamtzahl von Kügelchentypen 3 × 512 = 1.536. Diese Zahl ist äquivalent mit der Zahl von Wells in einer Hochdichte-Multiwell-Platte, welche zur Verwendung in HTS-Assays geeignet sind. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen in derartigen Kombinationen wird ermöglichen, dass alle Reaktionen in einer Hochdichte-Platte in einer einzelnen Probe für die Analyse durch Durchflusszytometrie kombiniert werden.
Geeignete Fluoreszenzfarbstoffe, die für die Kügelchen-Identifizierung nützlich sind, sind Farbstoffe, die diskrete Anregung und Emissionsspektren besitzen, die zur individuellen Identifizierung in einem Durchflusszytometer geeignet sind. Die genaue chemische Natur der Fluoreszenzfarbstoffe ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Fluoreszenzfarbstoffe, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Fluoresceine, Rhodamine, Cyaninfarbstoffe, Coumarine und die BODIPY-Gruppen von Fluoreszenzfarbstoffen. Verfahren zum elektronischen Kodieren und Identifizieren von Kügelchen sind in US-Patent 5,641,634 offenbart.
Die oben beschriebenen Kügelchen-Typen können auf Assays angewandt werden, die allgemein in HTS-Anwendungen verwendet werden. Derartige Assays sind günstigerweise als einer von zwei Typen kategorisiert.

i) Die erste Kategorie umfasst Gleichgewichtsbindungsassays, in denen ein Element eines Bindungspaares (der Reaktant) an die Oberfläche des Kügelchens gebunden ist, und Proben, die zu screenende Verbindungen enthalten, auf ihren Effekt bei der Bindung (entweder antagonistisch oder agonistisch) an ein zweites Element des Bindungspaars (der Ligand) getestet werden, wobei der Ligand eine Signaleinheit trägt, bevorzugt einen Fluoreszenzmarker. Auf diese Weise kann der Effekt der Testprobe auf die Bindungsreaktion durch Messung der Menge von markiertem Ligand, der an das Kügelchen gebunden wird, durch seine Wechselwirkung mit seinem Bindungspartner bestimmt werden. Beispiele derartiger Gleichgewichtsbindungs-Wechselwirkungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen, Protein-Protein-Bindungs-Wechselwirkungen und Protein-DNA-Wechselwirkungen. Ungeachtet der Identität der Komponenten der Wechselwirkung sind alle derartigen Assays auf ähnliche Weise dadurch gekennzeichnet, dass sie zwei Komponenten besitzen, wobei eine Komponente an das Kügelchen gebunden ist und die zweite Komponente eine Signaleinheit trägt, die an das Kügelchen über die Wechselwirkung der zwei Komponenten gebunden wird.
ii) In der zweiten Kategorie kann der Assay eine Detektion und eine Messung einer chemischen oder enzymatischen Änderung im Zustand einer Assay-Komponente umfassen, die an das Kügelchen gebunden ist und in der die Proben, die zu screenende Verbindungen enthalten, auf ihre Inhibitor-Effekte, Potenzierungs-Effekte, agonistischen oder antagonistischen Effekte auf die Reaktion, die untersucht wird, getestet werden. Beispielhaft für derartige Reaktionen sind jene, die die Entfernung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Einheit von einem Substrat umfassen, das direkt oder indirekt an das Kügelchen über eine kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkung gekoppelt ist, oder alternativ die kovalente oder nicht-kovalente Addition einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Einheit von einem Substrat in Lösung im Assaymedium an ein Molekül, das direkt oder indirekt an das Kügelchen mittels einer kovalenten oder nicht-kovalenten Wechselwirkung gekoppelt ist. Beispiele derartiger Assays umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Spaltung eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Peptids oder Proteins durch eine Protease, die Spaltung eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA- oder RNA-Moleküls durch eine Nuklease, das Verbinden eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA- oder RNA-Moleküls mit anderen Nukleinsäuremolekülen durch Ligasen, die Addition eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Nukleotids an ein DNA- oder RNA-Molekül durch eine Polymerase und den Transfer einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten chemischen Einheit von einem Molekül zu einem anderen durch eine Transferase, wie Acetyltransferase.

Geeignete Fluoreszenzmarker zum Markieren von Liganden oder Substraten sind jene, die a) spektral eindeutig und unterscheidbar von einem beliebigen Fluoreszenzfarbstoff sind, der für die Kügelchenidentifizierung verwendet wird, b) detektierbar durch ein Durchflusszytometer sind und c) fähig sind, an die Liganden- oder Substratkomponente des Assays durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung gebunden zu werden. Geeignete Fluoreszenzfarbstoffe zur Verwendung beim Markieren von Liganden und Substraten gemäß des Verfahrens der Erfindung können aus den oben aufgelisteten allgemeinen Kategorien von Fluoreszenzfarbstoffen ausgewählt werden. Bevorzugt werden Derivate derartiger Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die reaktive oder funktionelle Gruppen zum Binden an entsprechende funktionelle oder reaktive Gruppen auf biologischen Ziel-Molekülen besitzen. Beispiele derartiger reaktiver Fluoreszenzfarbstoffe sind Sulpho-Cyaninfarbstoff-NHS-Ester-Derivate, wie in US-Patent Nr. 4,268,486 (Waggoner et al.) beschrieben. Andere fluoreszierende Reagenzien, die zum Markieren von Zielmolekülen geeignet sind, werden jenen Fachleuten gut bekannt sein.
Alternativ können Marker, die zum Binden an die Liganden oder Substrate nützlich sind, Fluoreszenzenergietransfer-Marker sein. Beispiele derartiger Energietransfer-Fluoreszenzfarbstoffe werden in GB-Patent Nr. 2 301 833 (Waggoner et al.) gefunden, das sich auf Fluoreszenzenergietransfer-Komplexe bezieht, die reaktive oder funktionelle Gruppen für die kovalente Bindung an ein Ziel enthalten. Andere Fluoreszenzenergietransfer-Marker können nicht-kovalent an eine Liganden- oder Substrateinheit gebunden werden, z.B. durch Interkalation eines Farbstoffs an ein dsDNA-Molekül. Beispiele derartiger Farbstoffe sind in US-Patent Nr. 5,401,847 (Glazer et al.) offenbart.
Um der Klarheit willen werden die allgemeinen Prinzipien und spezifischen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung (bezeichnet Mix/Multiplex-HTS) mit Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben:
1: Flussdiagramm, das das Prinzip des Mix/Multiplex-HTS-Prozesses veranschaulicht.
2: Schematische Darstellung des Mix/Multiplex-HTS-Prozesses unter Verwenden einer Fluoreszenz-Kügelchen-Identifizierung.
3: Schematische Darstellung des Mix/Multiplex-HTS-Prozesses unter Verwenden einer elektronischen Kügelchen-Identifizierung.
Es wird auf 1 Bezug genommen, um den Mix/Multiplex-HTS-Prozess auszuführen, werden ausreichend individuelle Typen von Trägerkügelchen verwendet, um einen Trägerkügelchen-Typ für jeden diskreten auszuführenden Assay in einer Screeningeinheit zu ermöglichen, d.h. ein Kügelchen-Typ für jede zu screenende Probe. Die Oberflächen von Kügelchen werden modifiziert, z.B. durch eine Beschichtung mit einem Bindungsreagenz, wie einem Antikörper, Protein A, Streptavidin, Avidin, Weizenkeim-Agglutinin oder Poly-I-Lysin. Alternativ kann die Kügelchenoberfläche durch chemische Modifizierung behandelt sein, um funktionelle oder reaktive Gruppen bereitzustellen, die für das Binden spezifischer Assay-Komponenten, wie Proteine, Peptide, Oligonukleotide, Liganden und Kohlenhydrate an die Oberfläche des Kügelchens geeignet sind. Geeignete funktionelle oder reaktive Gruppen umfassen Hydroxyl-, Amino-, Carbonyl-, Carboxyl- und Sulphydryl-Gruppen. Verfahren, die zum Koppeln von Reaktanten an die Oberfläche des Kügelchens geeignet sind, sind jenen Fachleuten gut bekannt.
In einer weiteren Veranschaulichung des Verfahrens dieser Erfindung wird auf zwei mögliche, aber nicht beschränkende Ausführungsformen des Prozesses Bezug genommen. Es wird auf 2 Bezug genommen, Kügelchen, die verschiedene Mengen zweier Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, werden als Trägerkügelchen für den Assay verwendet. Um den Assay einzurichten, wird jeder Typ von Kügelchen (2, 3, 4) zu einem separaten Well einer Multiwell-Screening-Platte (1) gegeben. Vorbeschickte Platten, die auf diese Weise angeordnet sind, werden dann als die Basis für den Screening-Prozess, wie oben allgemein beschrieben, verwendet. Sobald die Reaktionsstufe des Screening-Prozesses abgeschlossen ist, werden ein Teil oder die gesamten Inhalte von jedem der Wells, in denen Reaktionen ausgeführt wurden, zusammen in einen einzelnen Behälter (6) gemischt und durch Durchflusszytometrie analysiert. Im Durchflusszytometer werden zwei der verfügbaren Fluoreszenzmessungs-Kanäle verwendet, um den Kügelchen-Typ zu identifizieren, zu dem jedes individuelle Kügelchen gehört, durch Bestimmen der Mengen der zwei Fluoreszenzfarbstoffe, die innerhalb des Kügelchens vorhanden sind. Gleichzeitig kann ein dritter Fluoreszenzkanal verwendet werden, um die Menge des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Liganden oder Substrats, das an die Oberfläche des Kügelchens gebunden ist, zu quantifizieren.
Beim Ausführen von Assays gemäß des Verfahrens dieser Erfindung ist es günstig, auf eine Screening-Einheit zu verweisen, die typischerweise zu Assayreaktionen passt, die in einer Multiwell-Platte ausgeführt werden, wobei ein kompletter Screen eine bis viele Multiwell-Platten umfasst. Jeder Kügelchen-Typ von 1–N wird individuell zu entsprechenden Wells 1–N, die Assayreagenzien enthalten, gegeben, wobei z.B. im Falle eines auf einem Rezeptor basierenden Screening-Assays Reagenzien typischerweise ein Rezeptorpräparat, einen Assay-Puffer und einen fluoreszenzmarkierten Rezeptorliganden umfassen. Proben, die eine oder mehrere zu screenende Verbindungen enthalten, werden individuell zu den vorbereiteten Wells gegeben, wobei die Proben 1–N zu den Wells 1–N gegeben werden. Auf diese Weise wird ein fester Bezug zwischen jeder Probe im Screen und dem Kügelchen-Typ, der die Reaktanten trägt, die jeder individuellen Probe ausgesetzt werden, die eine oder mehrere getestete Verbindungen enthält, etabliert. Sobald die Reaktionsstufe des Assays abgeschlossen ist, werden alle Reaktionen in einer Screening-Einheit für eine Analyse zusammengemischt, ohne den Bezug zu zerstören, da bei der Analyse durch Durchflusszytometrie sowohl der besondere Kügelchen-Typ als auch das Assay-Signal, das damit in Verbindung steht, auf einfache Weise für ein beliebiges gegebenes Kügelchen in der analysierten Mischung bestimmt werden kann. Demgemäss können, sobald die Analyse der gemischten Proben abgeschlossen ist, Assay-Signale, die von den Kügelchen 1–N (Aktivität 1–N) gemessen werden, mit Proben 1–N korreliert werden, die ursprünglich zu den Wells 1–N gegeben wurden.
Die Anzeige von Daten als ein x-y-z-Plot (7) ermöglicht die Identifizierung individueller Kügelchen-Typen gemäß der relativen Intensitäten der Fluoreszenz von Kügelchen-Fluoreszenzfarbstoffen 1 (8) und 2 (9) auf den x- bzw. y-Achsen und ermöglicht, dass die Intensitäten von Assay-Signalen für jede Verbindung im Screen getrennt angezeigt werden können (10). Die Identität jedes Kügelchen-Typs kann von seiner x-y-Position bestimmt werden und deshalb kann das z-Assay-Signal jenes Typs einem einzelnen Well in der ursprünglichen Multiwell-Platte zugeordnet werden. Demzufolge können alle Assay-Daten von einer gemischten Probe als eine Daten-Matrix (11) angezeigt werden, entsprechend dem ursprünglichen Layout der Multiwell-Platte und den untersuchten Ergebnissen, um die Aktivität der gescreenten Verbindungen zu bestimmen.
In einer zweiten möglichen Ausführungsform des Prozesses der Erfindung wird eine elektronische Kodierung verwendet, um Assay-Trägerkügelchen zu identifizieren. Es wird auf 3 Bezug genommen, in dieser Ausführungsform werden Trägerkügelchen, die Halbleiterspeichervorrichtungen enthalten, wie in US-Patent 5,641,634 beschrieben ist, und die mit Assayreagenzien, die für den ausgeführten Assay-Typ besonders sind, in einer Großmengensuspension (12) wie oben beschrieben verwendet. Die Großmengenkügelchen werden in Multiwell-Platten (13) unter Verwenden einer Abgabedüse (14) abgegeben, die mit einer Radiofrequenz-erzeugenden Spule (16) ausgerüstet ist, die durch eine Kodierungsschaltung (15) gesteuert wird. Diese Vorrichtung ermöglicht, dass Kügelchen, die durch die Abgabevorrichtung durchlaufen, eine eindeutige Identität über die Wirkung des Radiofrequenzfeldes auf den Halbleiter gegeben wird. Durch dieses Mittel ist es möglich, ausgehend von einer Großmengensuspension von identischen Kügelchen und durch Bewegen der Abgabevorrichtung von Well zu Well, eine Multiwell-Platte mit einer eindeutig kodierten Grundgesamtheit von Kügelchen in jedem Well zu erzeugen. Auf dieser Stufe wird der Screening-Prozess wie oben beschrieben fortgesetzt, wobei Assayreagenzien (17) zu den Wells der Multiwell-Platte gegeben werden, gefolgt von Proben (18), die die zu screenenden Verbindungen enthalten.
Für eine Analyse wird ein modifiziertes Durchflusszytometer (20) verwendet, wobei das Instrument mit einer zweiten Radiofrequenzspule (22) ausgerüstet ist, die eingerichtet ist, um Information, die auf dem Halbleiter innerhalb von Kügelchen kodiert ist, durch eine Dekodierungsschaltung (21) zu lesen. Gemischte Kügelchen (19), die durch das Instrument durchlaufen, werden zuerst durch den Decoder und zweitens durch den herkömmlichen Fluoreszenzdetektionslaser (23) des Instruments und Fotomultiplier(24)-Komponenten gelesen, um ein kontinuierliches Datenauslesen des Kügelchen-Identitätscodes (25) und des Assay-Fluoreszenz-Signals (26) zu ergeben.
Durch die Verwendung des elektronischen Kodierens als ein Mittel der Kügelchen-Identifizierung ist die mögliche Anzahl von Kügelchen-Typen nur durch die Kapazität des Halbleiters begrenzt. Zum Beispiel würde eine 16-Bit-Vorrichtung die Charakterisierung von 32.768 verschiedenen Kügelchen-Typen und deshalb Mix/Multiplexen von 32.768 diskreten Screening-Assay-Reaktionen ermöglichen. Zweitens können die Kügelchen für einen Assay in großer Menge erzeugt und direkt vor der Verwendung kodiert werden, wodurch die Notwendigkeit zum Ausführen individueller Herstellungen für jeden Kügelchen-Typ ausgeschlossen wird. Radiofrequenz-Kodierung und -Lesen schließt das Erfordernis für mehrfache Fluoreszenzkanäle aus, die zur Kügelchen-Identifizierung verwendet werden müssen, was entweder die Vereinfachung der Messgeräteausrüstung oder die Verwendung von Fluoreszenzkanälen zum Messen zusätzlicher Assay-Information ermöglicht.
Die Mix/Multiplex-Prozedur, wie sie oben beschrieben ist, ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz individueller Screening-Assay-Reaktionen durch Analyse durch Durchflusszytometrie in einer Weise, die die Fähigkeiten der Durchflusszytometrie-Messausrüstung ausschöpft, und insbesondere die sehr schnelle Datenakquisition, die erhalten werden kann. Die Prozedur ist kompatibel mit dem weiten Bereich verschieden großer Multiwell-Platten, die herkömmlicherweise in HTS-Programmen verwendet werden. Das Verfahren dieser Erfindung wird bevorzugt in Platten mit einer hohen Well-Dichte, kleinem Well-Volumen, wie 1.536-Well-Platten, bei denen das Assay-Volumen/Well 10 μl oder weniger beträgt, verwendet. Die Mengen von in jedem Well verwendeten Kügelchen können variiert werden, um den Erfordernissen verschiedener Screening-Assays zu genügen, werden aber bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 10% v/v in Bezug auf das Assayvolumen, am meisten bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 10% v/v sein. Bei den am meisten bevorzugten Kügelchen-Konzentrationen und unter Verwenden einer bevorzugten Kügelchengröße von 10 μm würde ein einzelnes Assay-Well, das 10 μl Flüssigkeit enthält, eine Anzahl von Kügelchen im Bereich von 10.000 bis 100.000 Kügelchen/Well enthalten.
Jedes Kügelchen in jedem individuellen Well ist identisch zu jedem anderen Kügelchen im selben Well und ist deshalb eine individuelle Assay-Einheit, die getrennt durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Beim Ausführen biologischer Assays ist es allgemeine Praxis, Wiederholungsmessungen auszuführen, um den physikalischen oder biologischen Variationen, die dem Assay-Prozess inhärent sind, Rechnung zu tragen. Derartige Wiederholungen nehmen typischerweise die Form von Doppel- oder Dreifach-Bestimmungen jedes Assays an, die ausgeführt werden, um Daten zu erhalten, die typischerweise als eine mittlere ±Standardabweichung ausgedrückt werden, wobei die Standardabweichung ein statistisches Maß für die Variation in den Assay-Daten ist, das verwendet wird, um die Präzision und Genauigkeit der in herkömmlichen Screening-Assays erhaltenen Daten zu bewerten. In herkömmlichen Screening-Assays umfasst der Assay das ganze Well oder Röhrchen, in dem der Assay ausgeführt wird, und deshalb beinhaltet eine Wiederholung die Verdopplung des gesamten Assays. Im Gegensatz dazu können in auf Kügelchen basierenden Assays, bei denen jedes Kügelchen eine messbare Einheit ist, Wiederholungs-Messungen auf dem Niveau individueller Kügelchen ausgeführt werden. Deshalb ist es, während ein Assay-Well 10.000 bis 100.000 Kügelchen enthalten kann, nicht nötig, dass in der nachfolgenden Analyse jedes Kügelchen aus jedem Well gemessen wird, sondern nur ausreichend Kügelchen zu messen, um Daten zu sammeln, die vorbestimmte Spezifikationen für die Präzision und Genauigkeit erfüllen.
Der mögliche Durchsatz des Prozesses wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht. Falls eine 1.536-Well-Platte als eine einzelne Screening-Einheit verwendet wird und bestimmt wird, dass es zum Erhalten einer statistisch wertvollen Analyse nötig ist, Assay-Ergebnisse für 100 Kügelchen für jede gescreente Verbindung zu messen, beträgt die Gesamtzahl von zu analysierenden Kügelchen 153.600. Moderne Durchflusszytometer sind auf einfache Weise fähig, Messungen von zwischen 1.000 und 10.000 Teilchen/Sekunde auszuführen, wobei angenommen wird, dass eine Analyse bei einer Zwischengeschwindigkeit von 2.500 Kügelchen/Sekunde eine Analysezeit von 153.600/2.500 = 61,44 Sekunden oder annähernde eine Minute ergibt, um die 1.536 diskreten Assays in der Multiwell-Platte zu messen. Dies ist ein sehr günstiger Vergleich mit einer Zeit von 25,6 Minuten, um Ergebnisse individuell in einem Platten-Leser bei einer Geschwindigkeit von 1 Sekunde/Well zu lesen. Ermöglicht man ein Laden von aufeinanderfolgenden gemischten Proben auf ein Durchflusszytometer mit einer Geschwindigkeit von 40/Stunde, ergibt dies einen Durchsatz von 1.536 × 40 = 61.440 Assays/Stunde oder ungefähr 500.000 Assays an einem Arbeitstag.
Beispiel
Mit Streptavidin bedeckter Kügelchen-Typ A (gelbe Fluor.) und Kügelchentyp B (violette Fluor.) wurden in zwei getrennte Wells einer Mikrotiter-Platte pipettiert, so dass das Well 1 das Kügelchen A enthielt und das Well 2 das Kügelchen B enthielt. Puffer wurde zu Well 1 gegeben und Puffer, der Biotin enthielt, wurde zu Well 2 gegeben. Nach dem Mischen und der Inkubation wurde eine Lösung von mit Cy-5 markiertem Biotin in Puffer zu beiden Wells gegeben. Nach einer weiteren Inkubation wurden die Inhalte von Well 1 und Well 2 kombiniert und die Mischung durch Durchflusszytometrie analysiert. Die Messung der Cy-5-Fluoreszenz, die mit jedem Kügelchen-Typ in Verbindung stand, zeigte eine hohe Fluoreszenz für das Kügelchen B, was eine hohe Cy-5-Biotin-Bindung in Well 1 und eine niedrige Cy-5-Biotin-Bindung in Well 2 anzeigt, was damit korreliert, dass ein aktiver Wettbewerber in Well 2 zum Binden an das Streptavidin auf der Kügelchenoberfläche vorhanden ist.

Claims

Assay-Verfahren für N Proben, von denen jede eine zu testende Verbindung enthält, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: a) Bereitstellen von N Grundgesamtheiten von Trägerkügelchen, wobei die Trägerkügelchen jeder Grundgesamtheit von den Trägerkügelchen jeder anderen Grundgesamtheit unterscheidbar sind; b) Abgeben jeder der N Grundgesamtheiten der markierten Trägerkügelchen in eines von N verschiedenen Reaktionsgefäßen; c) Abgeben jeder der N Proben in eines der verschiedenen Reaktionsgefäße; d) Bereitstellen von Reagenzien zum Ausführen eines Assays in jedem der N verschiedenen Reaktionsgefäße, wodurch eine Signaleinheit veranlasst wird, sich in einer Verbindungs-bezogenen Weise zwischen den Trägerkügelchen in jenem Reaktionsgefäß und einem überstehenden Fluid zu verteilen; e) Kombinieren der Inhalte aller Reaktionsgefäße zu einer Mischung; und f) Analysieren der Mischung durch Durchflusszytometrie, um die Signaleinheit, die mit einer jeden Sequenz von individuellen Kügelchen assoziiert ist, einem Assay zu unterziehen; wobei N größer als oder gleich 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem in Schritt a) N Grundgesamtheiten von Trägerkügelchen bereitgestellt werden, wobei die Trägerkügelchen einer Grundgesamtheit mittels einer detektierbaren Markierung von den Trägerkügelchen einer anderen Grundgesamtheit unterscheidbar sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem N 80–100.000 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2 und 3, bei dem in Schritt f) die Mischung einer Analyse durch Durchflusszytometrie unterzogen wird, um die Signaleinheit und die Markierung, die mit einer jeden Sequenz von individuellen Kügelchen assoziiert ist, einem Assay zu unterziehen, wodurch die Signaleinheit die biologische Aktivität der zu testenden Verbindung anzeigt und die Markierung die Probe anzeigt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem N 80 bis 4000 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Kügelchen mit einem Reagenz zum Ausführen des Assays vorbeschichtet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem eine Grundgesamtheit von Kügelchen mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff detektierbar markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem eine Grundgesamtheit von Kügelchen elektronisch markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Signaleinheit ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem in Schritt d) dieselben Reagenzien zum Ausführen desselben Assays in jedem der N verschiedenen Reaktionsgefäße bereitgestellt werden.