JP4318859B2 - 複合アッセイ方法 - Google Patents
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Description
本発明は複合アッセイ方法に関係し、薬物探索について高スループットのスクリーニングの達成ならびに大規模の平行処理および数千もの個々の生物学的アッセイの結果の分析を提供する方法に特に関係する。
【0002】
高スループットスクリーニング(HTS)の方法は、新規薬物の発見、開発、そして販売を含む医薬産業界の目標の中心である(Lutz et al., (1996) Drug Discovery Today, 1(7), 277-86)。HTS方法では、薬物候補を、生物学システムにおいて有効である可能性についてスクリーニングする。各スクリーニングにおいて多数の化合物を試験する動機は、ますます高くなり、100,000またはそれ以上の化合物を試験するスクリーニングアッセイが典型的なものとなっている。これは、効率的なレベルのスループットを達成する高度に精巧な自動装置制御および機器を必要とする。通常、近年のスクリーニング技術は、マルチウェルプレート技術を利用し、数千ものアッセイをその種々ステージ間で移送し得る。そのプレートには、96と1536の間またはそれ以上の個々のウェルが含まれ得、その場合、各ウェルには、スクリーニングにおける他の全ウェルと同じ試薬を含む。ただし、試験中のそれぞれの化合物は1つのウェル中にだけ存在する。マルチウェルプレートの標準的な形式およびレイアウトにより、自動装置を速く操作し得、液体分配装置を使用しスループットを最大にし得る。
【0003】
多くのHTSの適用では、アッセイ分析において、アッセイに使用する標識のシグナルを検出および測定する段階で速度が制限される段階が生ずる。この段階は連続的なプロセスであり、各ウェルのマルチウェルプレートを次々に測定する。その測定は、実施に典型的に1から数秒かかり、マルチウェルプレートの分析にかかる時間は相当なものとなり得る結果となる。
【0004】
フローサイトメトリー(Parks, D.R. and Herzenberg. L.A. 1984, Methods in Enzymology 108, 197-241)は、細胞または粒子をその大きさおよび蛍光によって分析する技術である。細胞または粒子は、細く速い液体の流れにより運ばれ、その液体を、1つもしくはそれ以上のレーザーまたは他の光源による光線が横切る。光線を横切る細胞または粒子から生ずる光散乱および蛍光を光検出器が記録し、それによって生じた電子的シグナルを処理して、分析データとする。マルチウェルプレートリーダーによる長いデータ収集時間とは対照的に、フローサイトメトリーの機器ならば、数千または数百万の細胞または他の粒子を高速の液体の流れで非常に速く分析し得、非常に短時間の測定時間、例えば1μsec/eventのオーダーで分類化する。
【0005】
フローサイトメトリーには、他の特徴があり、HTSの分析に有利なものである。第1に、必要とされる分析容積は非常に小さくてもよく、スループットを増大する手段として規模を小さくしつつある最近の傾向に適する。第2に、フローサイトメトリーは、本来、均質測定系(homogeneous measurement system)であり、即ち、特定の状態における特異的蛍光色素標識リガンドの画分の測定が、すべての型から蛍光色素の型を物理的に分離する必要性もなく、行えることである。HTSの適用では、これは望ましい性質である。測定前に望ましい型の標識を単離する洗浄または分離の段階の必要性がなくなるからである。フローサイトメトリーは診断アッセイとして広く使用され、広い範囲で血液および他の体液中の測定対象物を測定し得、例えば、免疫型化およびHIV感染に付随する細胞表面抗原の測定である(Patterson, B.K. et al., J. Virology, (1995) 69(7) 4316-4322)。しかし、その固有の利点にも拘わらず、フローサイトメトリーは、段階的処理の結果、スループット速度が遅くなる点が不利となる。読み取り時間が非常に速く、単一のアッセイにおいて秒あたり何千もの事象が分析され得る一方、サンプル間では相当の遅れがあり、現状では全体的にスループットが時間あたり100種未満の分析に制限される。
【0006】
これらの適応におけるより高いスループットの必要性より、1以上の測定対象物を同時にフローサイトメトリーで測定し得る複合的な方法が開発された。複合化は、アッセイ基質としてプラスチックまたはラテックスのビーズを用いる固体相連結アッセイを実施することにより行われる。互いのビーズと個々に区別し得る多数の個々のビーズ型を用い、その各ビーズ型が1つのアッセイの試薬を含んでおり、標準的フローサイトメトリー機器を、ビーズ型の識別および各ビーズに伴うアッセイシグナルの測定の両方に使用し得、それにより、単一のサンプルで平行に数種の試験を行える。例えば、ヒト血清中で複数の測定対象物の存在を測定し得る(McHugh T.M., 1994, Methods in Cell Biology 42, 575-595)。ビーズ型の区別は、大きさ(Frengen J. et al., 1995, Journal of Immunological Methods, Volume 178, p141)、色もしくは蛍光(Fulwyler M.J. 英国特許1,561,042)、または電子的手段(Mandecki W. 米国特許5,641,634)により行い得る。
【0007】
フローサイトメトリーアッセイの複合化により、それまで段階処理であった方法に平行処理の要素が組込まれ、そのため、サンプル間の遅延は以前と同じであるにもかからず、各サンプルから得られる情報量は数倍に増大し、データ収集速度を速くする。これは、単一サンプル内の複数対象物の測定に理想的である。即ち、'1サンプル、多試験'である。しかし、高スループットスクリーニング、即ち'1試験、多サンプル'の要件は逆である。HTSアッセイでは、スクリーニングする個々の化合物の有効性が決定できるようにアッセイを常に分離しなければならないという必要がある。その結果として、フローサイトメトリーによる複合診断分析について以前から記載されている方法は、HTSアッセイに適用できない。
【0008】
WO-A-93/02360は、複数のサブポピュレーションの薬物を既知の割合含む組成物と共にサンプルを合せて含むサンプル中の目的の複数の測定対象物と接触して検出する方法およびキットであって、測定対象物と特異的に結合し、粒子支持体、例えばミクロスフェアと結合し、そしてフローサイトメトリーで検出する方法およびキットを開示する。
WO-A-97/14028には、酵素、DNA断片、抗体などの複合化した診断および遺伝的分析のための方法およびキットを開示する。本発明は、ビーズサブセットのプール、即ち、何れか他のサブセットのビーズと識別される少なくとも1つの特徴を異とする1つのサブセットのビーズを用いる。
本発明は、それぞれが試験される化合物を含むN個のサンプルのアッセイ方法であって、
a)N群の担体ビーズを提供すること、その場合、それぞれの群の担体ビーズがすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、
b)N群の標識担体ビーズのそれぞれを、N個の反応容器の1つに分配すること、
c)N個のサンプルそれぞれを、当該複数反応容器の1つに分配すること、
d)当該N個の各反応容器中にアッセイを行うための試薬を加え、それによって、シグナル成分が、反応容器中の担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配され、
e)すべての反応容器の内容物を合わせ、混合物とし、そして
f)その混合物を、フローサイトメトリーにより分析し、各段階の個々のビーズに伴うシグナル成分をアッセイする、
段階[ここで、Nは2より大きいか、または2である]を含む方法を提供する。
【0009】
本発明は、そのアッセイ方法を行うキットをも提供し、そのキットにはN群の担体ビーズが含まれ、その場合、各群の担体ビーズはすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、すべてのビーズが、アッセイを行うための試薬と同じ試薬で、実質的に同じ表面濃度で事前に被覆されており、アッセイを行うために試薬と共に供給される[ここで、Nは少なくとも2である]。
【0010】
適当なのは、Nは2より大きいか、または2であり、好ましくは、2から100,000の範囲であり、より好ましくは80から4000の範囲である。
【0011】
適当なのは、担体ビーズは試薬で被覆され、そのビーズと結合する試薬は、所望によりシグナル成分を有している。
【0012】
適当なアッセイ形は、担体ビーズに結合するシグナル成分を有する試薬を用い、化学的作用かまたは酵素学的作用の何れかによるビーズ由来のシグナル成分の放出が含まれる場合を含む。他の形では、シグナル成分を有する試薬は、適当な媒体である溶液に加えられ、ビーズに固定化された試薬に共有結合的または非共有結合的の何れかで結合されたシグナル成分をアッセイすることを含む。
【0013】
適当なのは、反応容器はマルチウェルプレートのウェルである。
【0014】
方法の段階d)では、アッセイ反応は、シグナル成分が担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配されるようにすることによって実施され得る。種々の例が得られる。ある実施例では、試験すべき特定化合物の各サンプル中における存在または非存在を決定するためにアッセイが行われる;各反応容器では、シグナル成分は、容器中に分配されたサンプル中の化合物の存在または非存在を示すように分配される。他の実施例では、試験すべき特定化合物の各サンプル中での濃度を決定するためにアッセイが実施される;各反応容器では、シグナル成分は、容器中に分配されるサンプル中の化合物の濃度を示すように分配される。他の好ましい実施例では、試験すべき複数の化合物の生物活性を決定するようにアッセイが行われる;異なる化合物を、一般に既知量で、それだけをまたは他の成分と共に含む各サンプルを用い、各反応容器では、シグナル成分は、反応容器中に分配されるサンプル中の化合物の生物活性を示すように分配される。
【0015】
本発明の方法での使用に適当なビーズは、フローサイトメトリーによる処理および分析に適合するものであり、加えて、ビーズに識別手段を組み入れるのが適当である。好ましいビーズ型は、ポリスチレン、ラテックス、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリ塩化ビニリデンおよびポリビニルトルエンを含むプラスチックまたはポリマー物質から形成される。ポリスチレンビーズは本発明の使用に特に好ましい。ビーズはフローサイトメトリーの使用に適当な平均直径を持ち得る。本発明での使用に適当なビーズの大きさは、直径1-50μm、好ましくは直径2-20μmの範囲となり得る。好ましくは、同じ大きさのビーズを、本発明の方法に使用し得る。所望により、平均直径10μmのビーズを本発明の方法に使用する。
【0016】
ビーズの識別に適当であり検出可能な標識は、ビーズ内部または表面へ吸収されまたは組込まれた蛍光分子を含む。ビーズ群の区別および識別の別の手段として、1つの群のビーズが、他の群のビーズと比べ、大きさが異なるようにしてもよい。更に別の手段では、ビーズの識別は、電子的な標識に適当な電子的手段をビーズの核に封入してもよい。上記したような検出可能な標識は、単一かまたは組合せて、識別可能なビーズ群を作成し、特異な識別を行うように使用され得る。
【0017】
好ましくは、蛍光標識を含む標識が、本発明の方法に使用される。本発明での使用に適当な蛍光標識ビーズは、2またはそれ以上の種々の蛍光色素を異なった量でビーズの本体中へ組込むことにより調製され、それの結果、蛍光色素の上記組合せにより、特異的ビーズ型が定義される。複合化できる可能な個々のアッセイの数は、混合物中で区別され得るビーズ型の数によってのみ制限され得る。最近のフローサイトメトリー機器を用いても、その方法の利用において、これ以外の制限が生じることはない。典型的な、近年のフローサイトメトリー機器は、4波長の蛍光を同時に測定できると共に、他のパラメーター、例えば分析中の粒子の大きさを測定する光拡散も測定できる。加えて、蛍光検出の動力学的範囲は高く、蛍光は数桁にわたって正確に測定され得る。そのため、本発明のHTSアッセイ中で担体として役割をする多数の個々の区別可能なビーズ型を生ずる構成を案出し得る。例えば、ビーズは、3種の、スペクトルで区別可能な蛍光色素を含むように調製され得、その場合、各蛍光色素は8つの濃度レベルのうちの1つとなり得る。そのため、83が作成可能であり、即ち、スペクトルで区別可能な512のビーズ型ができる。加えて、3つの大きさのビーズを使用するならば、ビーズ型の合計は、3×512=1536である。この数は、高密度マルチウェルプレート中のウェルの数と同じであり、そのため、HTSアッセイでの使用に適当である。このような組合せによる蛍光色素の使用により、フローサイトメトリーによる分析用の1個のサンプルと高密度プレートを組合せてすべての反応を行うことができる。
【0018】
ビーズ識別に有用である適当な蛍光色素は、フローサイトメトリーにおける個々の識別に適当な区別され得る励起および放射のスペクトルを有する色素である。蛍光色素の正確な化学的性質は本発明に重要ではない。使用し得る蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、シアニン色素、クマリンおよび蛍光色素のBODIPY群が含まれるが、これらに限らない。ビーズの電子的コーディングおよび識別の方法は、米国特許5,641,634で開示されている。
【0019】
上記ビーズ型は、HTSの適用に通常使用されるアッセイに適用され得る。そのアッセイは、2つの型のうちの1つとして都合よくは類別される。
【0020】
i)第1のカテゴリーは平衡結合アッセイを含み、結合対(反応物)の一方がビーズの表面に結合しており、スクリーニングすべき化合物を含むサンプルは、シグナル成分、好ましくは蛍光標識を担持しているリガンドである結合対の他方に対する結合(アンタゴニストかアゴニストかの何れか)への影響について試験される。このようにして、結合反応に対する試験サンプルの効果は、その結合相手との相互作用を通じてビーズに結合する標識リガンドの量の測定により、決定され得る。その平衡結合相互作用の例には、レセプター-リガンド相互作用、タンパク質-タンパク質結合相互作用およびタンパク質-DNA相互作用が含まれるが、これらに制限されない。相互作用成分の種類に関係なく、アッセイは一方の成分がビーズに結合し、他方の成分はシグナル成分を担持し、2成分の相互作用を通じてビーズに結合するという2成分を有する点で同じように特徴づけられる。
【0021】
ii)第2のカテゴリーでは、アッセイは、ビーズに結合するアッセイ成分の状態としての、化学的または酵素学的変化の検出および測定を含み、そこでは、スクリーニングすべき化合物を含むサンプルが、試験すべき反応における、阻害効果、増強効果、アゴニストまたはアンタゴニスト効果について試験される。その反応の実例は、共有結合的または非共有結合的相互作用でビーズに直接的または間接的に結合する基質由来の蛍光色素標識成分を除去する場合、または、他に、アッセイ媒体中に溶解している基質の蛍光色素標識成分を、共有結合的または非共有結合的相互作用によりビーズに直接的または間接的に結合する分子に、共有結合的または非共有結合的に付加するものである。そのアッセイの例には、プロテアーゼによる蛍光色素標識ペプチドまたはタンパク質の切断、ヌクレアーゼによる蛍光色素標識DNAまたはRNA分子の切断、リガーゼによる蛍光色素標識DNAまたはRNA分子の他の核酸分子への結合、ポリメラーゼによる蛍光色素標識核酸のDNAまたはRNA分子への付加、およびアセチルトランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼによる蛍光色素標識化学的部分のある分子から他の分子への転位が含まれるが、これらに制限されない。
【0022】
リガンドまたは基質を標識とするのに適当な蛍光標識は、a)スペクトルが明瞭であり、ビーズ識別に使用される如何なる蛍光色素とも区別でき、b)フローサイトメーターにより検出でき、c)共有結合または非共有結合によりアッセイのリガンドまたは基質成分と結合できるものである。本発明の方法によるリガンドおよび基質の標識の使用に適当な蛍光色素は、通常のカテゴリーである上記蛍光色素から選択され得る。好ましくは、生物学的標的分子において相当する官能または反応基への結合に適当な反応または官能基を有する蛍光色素の誘導体が使用され得る。その反応性蛍光色素の例は、上記米国特許番号4268486(Waggoner et al)に記載のスルホ-シアニン色素NHSエステル誘導体である。標的分子の標識に適当な他の蛍光試薬は、当業者に既知である。
【0023】
他に、リガンドまたは基質への結合に有用な標識は、蛍光エネルギー転位標識(fluorescence energy transfer label)であり得る。そのエネルギー転位蛍光色素の例は、英国特許番号2301833(Waggoner et al)に見られ、それは、標的に共有結合する反応性または官能基を含む蛍光エネルギー転位複合体に関係する。他の蛍光エネルギー転位標識は、リガンドまたは基質部分に非共有結合的に、例えば、色素のdsDNA分子との相互作用により結合し得る。その色素の例は、米国特許番号5401847(Glazer et al)に開示されている。
【0024】
明瞭にするために、本発明の方法の一般的原理および特定の実施態様(即ち、混合/複合HTS)を以下の図を引用することにより解説する。
図1:混合/複合HTS方法の原理をフローチャートで示している。
図2:蛍光ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
図3:電子的ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
【0025】
図1に関し、混合/複合HTS方法を行うために、スクリーニングユニット中で実施される区別される個々のアッセイについて1つの担体ビーズ型が使用されるように十分な数の担体ビーズが使用される。即ち、スクリーニングされるべき個々のサンプルに対して1個のビーズ型が使用される。ビーズ表面は、例えば、抗体、プロテインA、ストレプトアビジン、アビジン、麦芽アグルチニンまたはポリ-l-リシンのような結合試薬で被覆されることにより修飾される。他に、ビーズ表面は、化学的修飾により処理され得、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、リガンドおよび炭水化物のような特定のアッセイ成分によるビーズ表面への結合に適当な官能または反応基を提供し得る。適当な官能または反応基には、ヒドロキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシルおよびメルカプト基が含まれる。ビーズ表面への反応物の結合に適当な方法は当業者に既知である。
【0026】
本発明の方法の更なる例示では、2つの可能な、しかし制限的ではない方法が引用される。図2に関して、異なる量の2つの蛍光色素を含むビーズをアッセイの担体ビーズとして使用する。アッセイを設定するため、各型のビーズ(2,3,4)をマルチウェルスクリーニングプレート(1)の個々のウェルに加える。次いで、このように並べた、事前に分配したプレートを、上記のスクリーニング方法のベースとして使用する。スクリーニング方法の反応段階が一旦完了すると、反応が行われた各ウェルの内容物の一部または全部を単一の容器(6)に混合し、フローサイトメトリーにより分析する。フローサイトメトリーでは、2つの利用可能な蛍光測定チャンネルを用い、個々のビーズが属するビーズ型を、ビーズ内に存在する2つの蛍光色素の量を測定することにより識別する。同時に、3番目の蛍光チャンネルを用い、ビーズ表面に結合する蛍光色素標識リガンドまたは基質の量を定量し得る。
【0027】
本発明の方法に従い実施するアッセイでは、1つのマルチウェルプレート中で行うアッセイ反応に典型的に相当するスクリーニングユニットについて説明するのが便利である。その場合、完全なスクリーニングが1から多数のマルチウェルプレートを含む。1-Nの各ビーズ型が、アッセイ試薬を含む相当する1-Nのウェルに、それぞれ加えられ、それは、例えば、レセプターを基にしたスクリーニングアッセイの場合、試薬は、レセプター調製物、アッセイ緩衝液および蛍光標識レセプターリガンドを典型的に含む。スクリーニングすべき1またはそれ以上の化合物を含むサンプルを、調製されたウェルに個々に加える。即ち、1-Nのサンプルを1-Nのウェルに加える。この方法では、スクリーニングにおける各サンプルと、試験される1またはそれ以上の化合物を含む各個々サンプルに接触させた反応物を有するビーズ型との間で固定化された関係が確立される。アッセイの反応段階が一旦完了すると、スクリーニングユニットにおける反応物すべてが該関係を損わないように混合され、分析される。フローサイトメトリーによる分析において、特定のビーズ型およびそれに付随するアッセイシグナルの両方が、分析混合物中任意のビーズに対して容易に決定されるからである。それゆえ、混合サンプルの分析が一旦完了すると、1-Nのビーズ(1-Nの活性)から測定されるアッセイシグナルは、1-Nのウェルに当初加えられた1-Nのサンプルと相関する。
【0028】
x-y-zプロット(7)としてのデータの表示から、xおよびy軸それぞれにおけるビーズ蛍光色素1(8)および2(9)の蛍光の相対強度による各ビーズ型が識別でき、当該スクリーニングにおける各化合物のアッセイシグナルの強度が別途表示される(10)。各ビーズ型の識別はx-y位置から決定され得、それゆえ、その型のZアッセイシグナルは当初のマルチウェルプレート中の1個のウェルに割り当てられる。結果として、1つの混合サンプルのアッセイデータすべてが、マルチウェルプレートのオリジナルレイアウトおよびスクリーニングされた化合物の活性を決定するための試験結果がデータマトリクス(11)として示される。
【0029】
本発明の方法の2番目の可能な態様では、電子的コード化を用い、アッセイ担体ビーズを識別する。図3に関し、この態様では、米国特許番号5,641,634に記載のような半導体記憶素子を含む担体ビーズおよび実施されるアッセイの型に特有のアッセイ試薬で被覆した担体ビーズが、上記のようなバルクサスペンジョン(12)中で使用される。バルクビーズを、エンコーディング回路(15)により制御される無線周波数発生コイル(16)を装備した分配ノズル(14)を用い、マルチウェルプレート(13)に分配する。この装置により、ビーズは分配装置を通過し、半導体への無線周波数磁界(radio-frequency field)の作用により特異的識別性を付与される。この方法により、同一のビーズのバルクサスペンジョンから始まり得、ウェルからウェルへ分配装置を移動することにより、各ウェルで特異的にコードされた群のビーズを有するマルチウェルプレートを生ずる。この段階で、スクリーニング方法を上記のように継続し、マルチウェルプレートのウェルにアッセイ試薬(17)を添加し、その後、スクリーニングすべき化合物を含むサンプル(18)を添加する。
【0030】
分析のために、改造されたフローサイトメーター(20)を用いる。ここでは、機器には第2の無線周波数コイル(22)を、デコーディング回路(21)でビーズ内の半導体上にコード化された情報を読むために設定する。プールされたビーズ(19)は機器を通過し、最初にデコーダーにより読まれ、次に常用の機器である蛍光検出レーザー(23)およびフォトマルチプライアー(24)部分によりビーズ識別コード(25)およびアッセイ蛍光シグナル(26)のデータを連続的に読み取る。
【0031】
ビーズ識別の手段としての電子的コード化の使用により、可能なビーズ型の数は半導体の性能によってのみ制限される。例えば、16ビット装置により、32768種のビーズ型が特性解析され、そのため、32768種のスクリーニングアッセイ反応が混合/複合化される。また、ビーズはバルクの状態でアッセイ用に調製され、使用前に直接コード化されてもよく、そのことにより、各ビーズ型を個別に調製する必要がなくなる。無線周波数のコード化およびリーディングにより、ビーズ識別に使用する多重蛍光チャンネルの必要性がなくなり、機器の単純化または多重蛍光チャンネルを他のアッセイ情報の測定に使用することが可能となる。
【0032】
上記のような混合/複合化方法によって、フローサイトメトリー機器の性能を利用することによりフローサイトメトリー分析による個々のスクリーニングアッセイ反応の高スループットを実現し、かつ、特に、非常に高速なデータ取得を可能にする。その方法は、HTSプログラムに共通して使用する広い範囲の異なった大きさのマルチウェルプレートに適する。本発明の方法は、高ウェル密度、小ウェル体積で、好ましくは用いられ、即ち、1536ウェルプレートのようなプレートで用いられ、その場合、ウェルあたりのアッセイ体積が10μlまたはそれ未満となる。各ウェル中で使用するビーズ量は、それぞれのスクリーニングアッセイの必要性に合わせて変化し得るが、アッセイ容積に関しては0.01-10%v/vの範囲であり、最も好ましくは0.1-1.0%の範囲となる。最も好ましいビーズ濃度で、好ましいビーズの大きさ10μmを用い、液体10μlを含む単一アッセイウェルには、10,000-100,000ビーズ/ウェルの範囲の数のビーズが含まれる。
【0033】
個々のウェルにおける個々のビーズは、同じウェル中では他のいずれのビーズとも同一であり、そのため、個々のアッセイ単位は、別々にフローサイトメトリーにより測定し得る。生物学的アッセイでは、アッセイ方法に固有の物理学的または生物学的変化を考慮に入れるため、通常反復して測定が実施される。その反復により、各アッセイでは2重、3重の測定が典型的に行われ、平均値±標準偏差として一般に表示されるデータが得られる。ここで、標準偏差は、アッセイデータにおける変化の統計的数値であり、得られたデータの精密性(precision)と正確性(accuracy)の評価に使用する。通常のスクリーニングアッセイでは、アッセイには、アッセイを行うウェルまたはチューブ全体が含まれ、そのため、反復には、アッセイ全体を二重に行うことを含む。これとは対照的に、各ビーズが測定単位である、ビーズに基くアッセイでは、反復測定は、個々のビーズのレベルで実施し得る。そのため、アッセイウェルは10,000-100,000ビーズを含み得るが、その後の分析において、当該ウェル由来のすべてのビーズを測定する必要はなく、正確性と精密性について求められる仕様を満たすデータを集積するのに十分なだけビーズを測定すれば足りる。
【0034】
本方法により、可能なスループットを、下記実施例により解説する。1536ウェルプレートを単一スクリーニング単位として使用し、それを測定し統計学的に有効な分析を得るためにスクリーニングされる各化合物に対し100ビーズのアッセイ結果を測定する必要があるとすれば、分析すべきビーズの総数は153,600となる。最近のフローサイトメーターは、1000〜10,000粒子/秒で容易に測定し得る;中間的な速度2500ビーズ/秒での分析を行うとすると、マルチウェルプレートにおいて1536種のアッセイを行うための分析時間は153,600/2500=61.44秒または約1分となる。これは、プレートリーダーによって個々の結果を読むのに25.6分かかることと、有利に比較される。フローサイトメーターに速さ40/時間で連続混合サンプルをローディングすると、1536×40=61440アッセイ/時間のスループットまたは1仕事日あたり約500,000アッセイのスループットが得られる。
【0035】
実施例
ストレプトアビジン被覆ビーズ型A(黄色蛍光体)およびビーズ型B(紫蛍光体)を、マイクロタイタープレートの2つの異なるウェルにピペットした。こうして、ウェル1にはビーズAを含み、ウェル2にはビーズBを含ませる。緩衝液をウェル1に添加し、ビオチンを含む緩衝液をウェル2に添加した。混合およびインキュベーション後、緩衝液中のCy-5標識ビオチンの溶液を両方のウェルに添加した。更にインキュベーション後、ウェル1およびウェル2の内容物を合わせ、その混合物をフローサイトメトリーで分析した。各ビーズ型に関係するCy-5蛍光を測定すると、ウェル1では、多量のビーズBの蛍光が見られたことから、多量のCy-5-ビオチンが結合していることが示され、ウェル2では、低量のCy-5-ビオチン結合が見られた。これは、ビーズ表面上のストレプトアビジンに結合する活性拮抗体がウェル2中に存在するからである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 混合/複合HTS方法の原理をフローチャートで示している。
【図2】 蛍光ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
【図3】 電子的ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
Claims (10)
- それぞれが試験される化合物を含むN個のサンプルのアッセイ方法であって、
a)N群の担体ビーズを提供すること、その場合、それぞれの群の担体ビーズがすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、
b)N群の標識担体ビーズのそれぞれを、N個の反応容器の1つに分配すること、
c)N個のサンプルそれぞれを、当該複数反応容器の1つに分配すること、
d)当該N個の各反応容器中にアッセイを行うための試薬を加え、それによって、シグナル成分が、反応容器中の担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配され、
e)すべての反応容器の内容物を合わせ、混合物とし、そして
f)その混合物を、フローサイトメトリーにより分析し、各段階の個々のビーズに伴うシグナル成分をアッセイする、
段階[ここで、Nは2より大きいか、または2である]を含む方法。 - 段階a)において、N群の担体ビーズが提供され、その1つの群の担体ビーズが、他の群の担体ビーズの検出可能な標識により区別される、請求項1に記載の方法。
- Nが80-100,000である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 段階f)において、混合物をフローサイトメトリーにより分析し、シグナル成分および各段階の個々のビーズに伴う標識をアッセイし、それによって、シグナル成分が試験すべき化合物の生物活性を示し、標識が当該化合物を含むサンプルを示す、請求項2および3に記載の方法。
- Nが80〜4000である、請求項1〜4の何れか1つに記載の方法。
- ビーズがアッセイを行うための試薬で事前に被覆されている、請求項1〜4の何れか1つに記載の方法。
- ある群のビーズが少なくとも1つの蛍光色素によって検出できるように標識されている、請求項1〜6の何れか1つに記載の方法。
- ある群のビーズが電子的に標識されている、請求項1〜6の何れか1つに記載の方法。
- シグナル成分が蛍光色素である、請求項1〜8の何れか1つに記載の方法。
- 段階d)において、同じアッセイを行うための同じ試薬をN個の反応容器にそれぞれ提供する、請求項1〜9の何れか1つに記載の方法。
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