JP2002517759A5 - - Google Patents
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Description
【特許請求の範囲】
【請求項1】 それぞれが試験される化合物を含むN個のサンプルのアッセイ方法であって、
a)N群の担体ビーズを提供すること、その場合、それぞれの群の担体ビーズがすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、
b)N群の標識担体ビーズのそれぞれを、N個の反応容器の1つに分配すること、
c)N個のサンプルそれぞれを、当該複数反応容器の1つに分配すること、
d)当該N個の各反応容器中にアッセイを行うための試薬を加え、それによって、シグナル成分が、反応容器中の担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配され、
e)すべての反応容器の内容物を合わせ、混合物とし、そして
f)その混合物を、フローサイトメトリーにより分析し、各段階の個々のビーズに伴うシグナル成分をアッセイする、
段階[ここで、Nは2より大きいか、または2である]を含む方法。
【請求項2】 段階a)において、N群の担体ビーズが提供され、その1つの群の担体ビーズが、他の群の担体ビーズの検出可能な標識により区別される、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 Nが80-100,000である、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項4】 段階f)において、混合物をフローサイトメトリーにより分析し、シグナル成分および各段階の個々のビーズに伴う標識をアッセイし、それによって、シグナル成分が試験すべき化合物の生物活性を示し、標識が当該化合物を含むサンプルを示す、請求項2および3に記載の方法。
【請求項5】 Nが80〜4000である、請求項1〜4の何れか1つに記載の方法。
【請求項6】 ビーズがアッセイを行うための試薬で事前に被覆されている、請求項1〜4の何れか1つに記載の方法。
【請求項7】 ある群のビーズが少なくとも1つの蛍光色素によって検出できるように標識されている、請求項1〜6の何れか1つに記載の方法。
【請求項8】 ある群のビーズが電子的に標識されている、請求項1〜6の何れか1つに記載の方法。
【請求項9】 シグナル成分が蛍光色素である、請求項1〜8の何れか1つに記載の方法。
【請求項10】 段階d)において、同じアッセイを行うための同じ試薬をN個の反応容器にそれぞれ提供する、請求項1〜9の何れか1つに記載の方法。
【請求項11】 試験すべき1つまたはそれ以上の化合物をそれぞれ含むNサンプルのアッセイ用キットであって、各群の担体ビーズはすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、すべてのビーズが、アッセイを行うための試薬と同じ試薬で、実質的に同じ表面濃度で事前に被覆されており、アッセイを行うために試薬と共に供給される、N群の担体ビーズ[ここで、Nは少なくとも2である]を含むキット。
【請求項1】 それぞれが試験される化合物を含むN個のサンプルのアッセイ方法であって、
a)N群の担体ビーズを提供すること、その場合、それぞれの群の担体ビーズがすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、
b)N群の標識担体ビーズのそれぞれを、N個の反応容器の1つに分配すること、
c)N個のサンプルそれぞれを、当該複数反応容器の1つに分配すること、
d)当該N個の各反応容器中にアッセイを行うための試薬を加え、それによって、シグナル成分が、反応容器中の担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配され、
e)すべての反応容器の内容物を合わせ、混合物とし、そして
f)その混合物を、フローサイトメトリーにより分析し、各段階の個々のビーズに伴うシグナル成分をアッセイする、
段階[ここで、Nは2より大きいか、または2である]を含む方法。
【請求項2】 段階a)において、N群の担体ビーズが提供され、その1つの群の担体ビーズが、他の群の担体ビーズの検出可能な標識により区別される、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 Nが80-100,000である、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項4】 段階f)において、混合物をフローサイトメトリーにより分析し、シグナル成分および各段階の個々のビーズに伴う標識をアッセイし、それによって、シグナル成分が試験すべき化合物の生物活性を示し、標識が当該化合物を含むサンプルを示す、請求項2および3に記載の方法。
【請求項5】 Nが80〜4000である、請求項1〜4の何れか1つに記載の方法。
【請求項6】 ビーズがアッセイを行うための試薬で事前に被覆されている、請求項1〜4の何れか1つに記載の方法。
【請求項7】 ある群のビーズが少なくとも1つの蛍光色素によって検出できるように標識されている、請求項1〜6の何れか1つに記載の方法。
【請求項8】 ある群のビーズが電子的に標識されている、請求項1〜6の何れか1つに記載の方法。
【請求項9】 シグナル成分が蛍光色素である、請求項1〜8の何れか1つに記載の方法。
【請求項10】 段階d)において、同じアッセイを行うための同じ試薬をN個の反応容器にそれぞれ提供する、請求項1〜9の何れか1つに記載の方法。
【請求項11】 試験すべき1つまたはそれ以上の化合物をそれぞれ含むNサンプルのアッセイ用キットであって、各群の担体ビーズはすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、すべてのビーズが、アッセイを行うための試薬と同じ試薬で、実質的に同じ表面濃度で事前に被覆されており、アッセイを行うために試薬と共に供給される、N群の担体ビーズ[ここで、Nは少なくとも2である]を含むキット。
方法の段階d)では、アッセイ反応は、シグナル成分が担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配されるようにすることによって実施され得る。種々の例が得られる。ある実施例では、試験すべき特定化合物の各サンプル中における存在または非存在を決定するためにアッセイが行われる;各反応容器では、シグナル成分は、容器中に分配されたサンプル中の化合物の存在または非存在を示すように分配される。他の実施例では、試験すべき特定化合物の各サンプル中での濃度を決定するためにアッセイが実施される;各反応容器では、シグナル成分は、容器中に分配されるサンプル中の化合物の濃度を示すように分配される。他の好ましい実施例では、試験すべき複数の化合物の生物活性を決定するようにアッセイが行われる;異なる化合物を、一般に既知量で、それだけをまたは他の成分と共に含む各サンプルを用い、各反応容器では、シグナル成分は、反応容器中に分配されるサンプル中の化合物の生物活性を示すように分配される。
好ましくは、蛍光標識を含む標識が、本発明の方法に使用される。本発明での使用に適当な蛍光標識ビーズは、2またはそれ以上の種々の蛍光色素を異なった量でビーズの本体中へ組込むことにより調製され、それの結果、蛍光色素の上記組合せにより、特異的ビーズ型が定義される。複合化できる可能な個々のアッセイの数は、混合物中で区別され得るビーズ型の数によってのみ制限され得る。最近のフローサイトメトリー機器を用いても、その方法の利用において、これ以外の制限が生じることはない。典型的な、近年のフローサイトメトリー機器は、4波長の蛍光を同時に測定できると共に、他のパラメーター、例えば分析中の粒子の大きさを測定する光拡散も測定できる。加えて、蛍光検出の動力学的範囲は高く、蛍光は数桁にわたって正確に測定され得る。そのため、本発明のHTSアッセイ中で担体として役割をする多数の個々の区別可能なビーズ型を生ずる構成を案出し得る。例えば、ビーズは、3種の、スペクトルで区別可能な蛍光色素を含むように調製され得、その場合、各蛍光色素は8つの濃度レベルのうちの1つとなり得る。そのため、83が作成可能であり、即ち、スペクトルで区別可能な512のビーズ型ができる。加えて、3つの大きさのビーズを使用するならば、ビーズ型の合計は、3×512=1536である。この数は、高密度マルチウェルプレート中のウェルの数と同じであり、そのため、HTSアッセイでの使用に適当である。このような組合せによる蛍光色素の使用により、フローサイトメトリーによる分析用の1個のサンプルと高密度プレートを組合せてすべての反応を行うことができる。
明瞭にするために、本発明の方法の一般的原理および特定の実施態様(即ち、混合/複合HTS)を以下の図を引用することにより解説する。
図1:混合/複合HTS方法の原理をフローチャートで示している。
図2:蛍光ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
図3:電子的ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
図1:混合/複合HTS方法の原理をフローチャートで示している。
図2:蛍光ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
図3:電子的ビーズ識別を用いる混合/複合HTSの概要を示している。
本発明の方法の更なる例示では、2つの可能な、しかし制限的ではない方法が引用される。図2に関して、異なる量の2つの蛍光色素を含むビーズをアッセイの担体ビーズとして使用する。アッセイを設定するため、各型のビーズ(2,3,4)をマルチウェルスクリーニングプレート(1)の個々のウェルに加える。次いで、このように並べた、事前に分配したプレートを、上記のスクリーニング方法のベースとして使用する。スクリーニング方法の反応段階が一旦完了すると、反応が行われた各ウェルの内容物の一部または全部を単一の容器(6)に混合し、フローサイトメトリーにより分析する。フローサイトメトリーでは、2つの利用可能な蛍光測定チャンネルを用い、個々のビーズが属するビーズ型を、ビーズ内に存在する2つの蛍光色素の量を測定することにより識別する。同時に、3番目の蛍光チャンネルを用い、ビーズ表面に結合する蛍光色素標識リガンドまたは基質の量を定量し得る。
本発明の方法に従い実施するアッセイでは、1つのマルチウェルプレート中で行うアッセイ反応に典型的に相当するスクリーニングユニットについて説明するのが便利である。その場合、完全なスクリーニングが1から多数のマルチウェルプレートを含む。1-Nの各ビーズ型が、アッセイ試薬を含む相当する1-Nのウェルに、それぞれ加えられ、それは、例えば、レセプターを基にしたスクリーニングアッセイの場合、試薬は、レセプター調製物、アッセイ緩衝液および蛍光標識レセプターリガンドを典型的に含む。スクリーニングすべき1またはそれ以上の化合物を含むサンプルを、調製されたウェルに個々に加える。即ち、1-Nのサンプルを1-Nのウェルに加える。この方法では、スクリーニングにおける各サンプルと、試験される1またはそれ以上の化合物を含む各個々サンプルに接触させた反応物を有するビーズ型との間で固定化された関係が確立される。アッセイの反応段階が一旦完了すると、スクリーニングユニットにおける反応物すべてが該関係を損わないように混合され、分析される。フローサイトメトリーによる分析において、特定のビーズ型およびそれに付随するアッセイシグナルの両方が、分析混合物中任意のビーズに対して容易に決定されるからである。それゆえ、混合サンプルの分析が一旦完了すると、1-Nのビーズ(1-Nの活性)から測定されるアッセイシグナルは、1-Nのウェルに当初加えられた1-Nのサンプルと相関する。
本方法により、可能なスループットを、下記実施例により解説する。1536ウェルプレートを単一スクリーニング単位として使用し、それを測定し統計学的に有効な分析を得るためにスクリーニングされる各化合物に対し100ビーズのアッセイ結果を測定する必要があるとすれば、分析すべきビーズの総数は153,600となる。最近のフローサイトメーターは、1000〜10,000粒子/秒で容易に測定し得る;中間的な速度2500ビーズ/秒での分析を行うとすると、マルチウェルプレートにおいて1536種のアッセイを行うための分析時間は153,600/2500=61.44秒または約1分となる。これは、プレートリーダーによって個々の結果を読むのに25.6分かかることと、有利に比較される。フローサイトメーターに速さ40/時間で連続混合サンプルをローディングすると、1536×40=61440アッセイ/時間のスループットまたは1仕事日あたり約500,000アッセイのスループットが得られる。
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