JP2002517759A5 - - Google Patents

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】 それぞれが試験される化合物を含むＮ個のサンプルのアッセイ方法であって、
ａ)Ｎ群の担体ビーズを提供すること、その場合、それぞれの群の担体ビーズがすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、
ｂ)Ｎ群の標識担体ビーズのそれぞれを、Ｎ個の反応容器の１つに分配すること、
ｃ)Ｎ個のサンプルそれぞれを、当該複数反応容器の１つに分配すること、
ｄ)当該Ｎ個の各反応容器中にアッセイを行うための試薬を加え、それによって、シグナル成分が、反応容器中の担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配され、
ｅ)すべての反応容器の内容物を合わせ、混合物とし、そして
ｆ)その混合物を、フローサイトメトリーにより分析し、各段階の個々のビーズに伴うシグナル成分をアッセイする、
段階[ここで、Ｎは２より大きいか、または２である]を含む方法。
【請求項２】 段階ａ)において、Ｎ群の担体ビーズが提供され、その１つの群の担体ビーズが、他の群の担体ビーズの検出可能な標識により区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】 Ｎが８０-１００，０００である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】 段階ｆ)において、混合物をフローサイトメトリーにより分析し、シグナル成分および各段階の個々のビーズに伴う標識をアッセイし、それによって、シグナル成分が試験すべき化合物の生物活性を示し、標識が当該化合物を含むサンプルを示す、請求項２および３に記載の方法。
【請求項５】 Ｎが８０〜４０００である、請求項１〜４の何れか１つに記載の方法。
【請求項６】 ビーズがアッセイを行うための試薬で事前に被覆されている、請求項１〜４の何れか１つに記載の方法。
【請求項７】 ある群のビーズが少なくとも１つの蛍光色素によって検出できるように標識されている、請求項１〜６の何れか１つに記載の方法。
【請求項８】 ある群のビーズが電子的に標識されている、請求項１〜６の何れか１つに記載の方法。
【請求項９】 シグナル成分が蛍光色素である、請求項１〜８の何れか１つに記載の方法。
【請求項１０】 段階ｄ)において、同じアッセイを行うための同じ試薬をＮ個の反応容器にそれぞれ提供する、請求項１〜９の何れか１つに記載の方法。
【請求項１１】 試験すべき１つまたはそれ以上の化合物をそれぞれ含むＮサンプルのアッセイ用キットであって、各群の担体ビーズはすべての他の群の担体ビーズから区別可能であり、すべてのビーズが、アッセイを行うための試薬と同じ試薬で、実質的に同じ表面濃度で事前に被覆されており、アッセイを行うために試薬と共に供給される、Ｎ群の担体ビーズ[ここで、Ｎは少なくとも２である]を含むキット。

方法の段階ｄ)では、アッセイ反応は、シグナル成分が担体ビーズと上清液体との間で化合物に対応して分配されるようにすることによって実施され得る。種々の例が得られる。ある実施例では、試験すべき特定化合物の各サンプル中における存在または非存在を決定するためにアッセイが行われる；各反応容器では、シグナル成分は、容器中に分配されたサンプル中の化合物の存在または非存在を示すように分配される。他の実施例では、試験すべき特定化合物の各サンプル中での濃度を決定するためにアッセイが実施される；各反応容器では、シグナル成分は、容器中に分配されるサンプル中の化合物の濃度を示すように分配される。他の好ましい実施例では、試験すべき複数の化合物の生物活性を決定するようにアッセイが行われる；異なる化合物を、一般に既知量で、それだけをまたは他の成分と共に含む各サンプルを用い、各反応容器では、シグナル成分は、反応容器中に分配されるサンプル中の化合物の生物活性を示すように分配される。

好ましくは、蛍光標識を含む標識が、本発明の方法に使用される。本発明での使用に適当な蛍光標識ビーズは、２またはそれ以上の種々の蛍光色素を異なった量でビーズの本体中へ組込むことにより調製され、それの結果、蛍光色素の上記組合せにより、特異的ビーズ型が定義される。複合化できる可能な個々のアッセイの数は、混合物中で区別され得るビーズ型の数によってのみ制限され得る。最近のフローサイトメトリー機器を用いても、その方法の利用において、これ以外の制限が生じることはない。典型的な、近年のフローサイトメトリー機器は、４波長の蛍光を同時に測定できると共に、他のパラメーター、例えば分析中の粒子の大きさを測定する光拡散も測定できる。加えて、蛍光検出の動力学的範囲は高く、蛍光は数桁にわたって正確に測定され得る。そのため、本発明のＨＴＳアッセイ中で担体として役割をする多数の個々の区別可能なビーズ型を生ずる構成を案出し得る。例えば、ビーズは、３種の、スペクトルで区別可能な蛍光色素を含むように調製され得、その場合、各蛍光色素は８つの濃度レベルのうちの１つとなり得る。そのため、８^３が作成可能であり、即ち、スペクトルで区別可能な５１２のビーズ型ができる。加えて、３つの大きさのビーズを使用するならば、ビーズ型の合計は、３×５１２＝１５３６である。この数は、高密度マルチウェルプレート中のウェルの数と同じであり、そのため、ＨＴＳアッセイでの使用に適当である。このような組合せによる蛍光色素の使用により、フローサイトメトリーによる分析用の１個のサンプルと高密度プレートを組合せてすべての反応を行うことができる。

明瞭にするために、本発明の方法の一般的原理および特定の実施態様(即ち、混合／複合ＨＴＳ)を以下の図を引用することにより解説する。
図１：混合／複合ＨＴＳ方法の原理をフローチャートで示している。
図２：蛍光ビーズ識別を用いる混合／複合ＨＴＳの概要を示している。
図３：電子的ビーズ識別を用いる混合／複合ＨＴＳの概要を示している。

本発明の方法の更なる例示では、２つの可能な、しかし制限的ではない方法が引用される。図２に関して、異なる量の２つの蛍光色素を含むビーズをアッセイの担体ビーズとして使用する。アッセイを設定するため、各型のビーズ(２，３，４)をマルチウェルスクリーニングプレート(１)の個々のウェルに加える。次いで、このように並べた、事前に分配したプレートを、上記のスクリーニング方法のベースとして使用する。スクリーニング方法の反応段階が一旦完了すると、反応が行われた各ウェルの内容物の一部または全部を単一の容器(６)に混合し、フローサイトメトリーにより分析する。フローサイトメトリーでは、２つの利用可能な蛍光測定チャンネルを用い、個々のビーズが属するビーズ型を、ビーズ内に存在する２つの蛍光色素の量を測定することにより識別する。同時に、３番目の蛍光チャンネルを用い、ビーズ表面に結合する蛍光色素標識リガンドまたは基質の量を定量し得る。

本発明の方法に従い実施するアッセイでは、１つのマルチウェルプレート中で行うアッセイ反応に典型的に相当するスクリーニングユニットについて説明するのが便利である。その場合、完全なスクリーニングが１から多数のマルチウェルプレートを含む。１-Ｎの各ビーズ型が、アッセイ試薬を含む相当する１-Ｎのウェルに、それぞれ加えられ、それは、例えば、レセプターを基にしたスクリーニングアッセイの場合、試薬は、レセプター調製物、アッセイ緩衝液および蛍光標識レセプターリガンドを典型的に含む。スクリーニングすべき１またはそれ以上の化合物を含むサンプルを、調製されたウェルに個々に加える。即ち、１-Ｎのサンプルを１-Ｎのウェルに加える。この方法では、スクリーニングにおける各サンプルと、試験される１またはそれ以上の化合物を含む各個々サンプルに接触させた反応物を有するビーズ型との間で固定化された関係が確立される。アッセイの反応段階が一旦完了すると、スクリーニングユニットにおける反応物すべてが該関係を損わないように混合され、分析される。フローサイトメトリーによる分析において、特定のビーズ型およびそれに付随するアッセイシグナルの両方が、分析混合物中任意のビーズに対して容易に決定されるからである。それゆえ、混合サンプルの分析が一旦完了すると、１-Ｎのビーズ(１-Ｎの活性)から測定されるアッセイシグナルは、１-Ｎのウェルに当初加えられた１-Ｎのサンプルと相関する。

本方法により、可能なスループットを、下記実施例により解説する。１５３６ウェルプレートを単一スクリーニング単位として使用し、それを測定し統計学的に有効な分析を得るためにスクリーニングされる各化合物に対し１００ビーズのアッセイ結果を測定する必要があるとすれば、分析すべきビーズの総数は１５３，６００となる。最近のフローサイトメーターは、１０００〜１０，０００粒子／秒で容易に測定し得る；中間的な速度２５００ビーズ／秒での分析を行うとすると、マルチウェルプレートにおいて１５３６種のアッセイを行うための分析時間は１５３，６００／２５００＝６１．４４秒または約１分となる。これは、プレートリーダーによって個々の結果を読むのに２５．６分かかることと、有利に比較される。フローサイトメーターに速さ４０／時間で連続混合サンプルをローディングすると、１５３６×４０＝６１４４０アッセイ／時間のスループットまたは１仕事日あたり約５００，０００アッセイのスループットが得られる。