CN114594253A - 一种用于筛选糖结合蛋白竞争性抑制剂的糖芯片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于筛选糖结合蛋白竞争性抑制剂的糖芯片方法。本发明在糖芯片技术用于筛选蛋白受体的基础上，通过加入抑制剂，引起已知结合蛋白荧光强度的改变，实现对已知蛋白的抑制剂的筛选及其竞争力的比较。本发明突破了糖芯片技术原有的筛选功能，拓展了糖芯片技术的应用。该方法可以对不同的糖结合蛋白进行亲和力初步比较，筛选竞争力较强的抑制剂，操作简便迅速，蛋白用量小，可行性高。此外，本发明还可以拓展应用于其他生物芯片，如蛋白质芯片、基因芯片等。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种用于筛选糖结合蛋白抑制剂的糖芯片方法。用于糖结合蛋白抑制剂的筛选、结合糖竞争力比较及其结合糖位点的初步判断。
技术背景
生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生物分子，如寡核苷酸、DNA、RNA、蛋白质、多肽、多糖、寡糖等，固定于基质上形成的生物分子点阵。再与待测物质(本身荧光标记或与荧光标记的抗体特异性结合)进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和结合配体的信息。其中，糖芯片技术因具有高通量、高灵敏度、样品消耗量少等特点，近年来被广泛应用于糖类化合物与生物大分子之间的相互作用研究。其原理是将多种具有明确结构的糖或糖复合物固定于特定载体(例如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等)的不同位置上，检测样品与糖芯片结合的信号，分析糖介导的特异性结合作用等。自2002年Wang等人首次报道将糖分子探针固定在硝酸纤维素包被的玻璃板上制备出糖芯片后的十几年来，糖芯片载体的研发、糖分子探针的合成、探针的固定方式以及糖芯片的检测逐渐成为热门的研究课题。
目前，糖芯片的主要功能是用于筛选糖结合蛋白的受体，即获得结合某一特定糖结合蛋白可以结合的糖结构及结合偏向性。而在分子间相互作用的研究中，尤其是在抑制剂开发研究过程中，评价抑制剂与已知分子的结合竞争力是一项不可或缺的指标。糖芯片能否有效够评价这种结合竞争力尚未被开发。
发明内容
针对上述背景，本发明在常规的芯片结合体系中加入了抑制剂，可以根据抑制剂对已知蛋白结合信号的干扰程度，判断该抑制剂的竞争力强弱。而且，本发明根据目前市售主流荧光抗体的发射波长不同、抗原表位不同，配合芯片扫描仪的检测波长，设计了一种在相同芯片上同时结合两种不同标签蛋白，比较这两种蛋白结合竞争力的方法。具体操作为：
1、芯片前处理：根据不同类型的芯片说明进行前处理，使芯片预湿。
2、芯片的封闭：将芯片小心安放在芯片架上，使每组微阵列分隔成独立的方孔空间。向对照组方孔和实验方孔内小心滴加含有1％至5％(g/mL)BSA(牛血清白蛋白)的缓冲液使芯片封闭1h。缓冲液可根据具体蛋白的性质确定(例如磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等)。
3、将用含有1％至5％(g/mL)BSA缓冲液稀释的已知与芯片结合的带有融合标签的蛋白(0.1至500μg/mL)滴加至对照方孔1中，作为对照组1；将用1％至5％(g/mL)BSA缓冲液稀释的抑制剂(0.00001至10mg/mL)滴加至对照方孔2中，作为对照组2；将至少一组已知蛋白和抑制剂的混合溶液(混合摩尔比例可以为多种比例)滴加至实验方孔中作为实验组，使之共同与芯片孵育。孵育时间(0.5至4h)和孵育温度(室温或37℃)需要根据具体蛋白和所需来确定。孵育结束后，用含有1％至5％(g/mL)BSA缓冲液对芯片进行洗涤。
4、向对照组和实验组中分别滴加已知蛋白融合标签对应的荧光抗体1(浓度为0.1至100μg/mL)，于室温或37℃孵育0.5至4h。孵育结束后，用含有1％至5％(g/mL)BSA缓冲液对芯片进行洗涤。
5、若抑制剂为另一种带有融合标签的蛋白，且融合标签与已知结合蛋白的融合标签不同，则可用于筛选。向对照组和实验组中分别滴加抑制剂融合标签对应的荧光抗体2(发射波长不同于荧光抗体1)于室温或37℃孵育0.5至4h。孵育结束后，用含有1％至5％(g/mL)BSA缓冲液对芯片进行洗涤。先用缓冲液洗涤2次，再用蒸馏水洗涤1次。将芯片离心沥干后用于扫描。
6、利用芯片扫描仪，选择荧光抗体1对应的波长对芯片进行分别扫描。若对照组2为另一融合标签蛋白，再选择荧光抗体2对应的波长对芯片进行扫描。实验组的荧光强度除以对照组的荧光强度，得到比值。若比值等于1，则抑制剂无竞争作用，若比值小于1，则说明抑制剂具有竞争结合的能力，且比值越小，抑制剂的竞争越强。
本发明在糖芯片技术用于筛选蛋白受体的基础上，通过加入抑制剂，引起已知结合蛋白荧光强度的改变，实现对已知蛋白的抑制剂的筛选及其竞争力的比较。本发明突破了糖芯片技术原有的筛选功能，拓展了糖芯片技术的应用。该方法可以对不同的糖结合蛋白进行亲和力初步比较，筛选竞争力较强的抑制剂，操作简便迅速，蛋白用量小，可行性高。此外，本发明还可以拓展应用于其他生物芯片，如蛋白质芯片、基因芯片等。
附图说明
图1.实施例1中新冠病毒S1蛋白与抗凝血酶AT在肝素芯片上的结合信号(4组平行实验中的一组结果)。A，实验组(新冠病毒S1蛋白与抗凝血酶AT同时孵育)的488nm扫描结果和635nm扫描结果。B，新冠病毒S1蛋白对照组在488nm扫描结果。C，抗凝血酶AT对照组在635nm扫描结果。
图2.实施例2中新冠病毒S1蛋白与肝素辅助因子II在肝素芯片上的结合信号(4组平行实验中的一组结果)。A，实验组(新冠病毒S1蛋白与肝素辅助因子II同时孵育)的488nm扫描结果和635nm扫描结果。B，新冠病毒S1蛋白对照组在488nm扫描结果。C，肝素辅助因子II对照组在635nm扫描结果。
具体实施方式
实施例1
新型冠状病毒S蛋白与抗凝血酶AT结合肝素竞争力的比较
1、肝素芯片前处理：
将固定有肝素的芯片(肝素的固定量为0.5ng，点的直径约为150-200μm)放入超纯水中，浸润约30秒后取出。离心沥干后，将芯片小心安装至芯片架上。芯片架会将芯片上的糖微阵列分隔成独立的方孔空间，容积约150μL。
2、封闭：
向每个芯片架的方孔空间中加入100μL含有质量体积浓度(g/ml)为1％BSA(牛血清白蛋白)的TBST(Tris-盐酸-Tween)缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH＝7.4，0.05％Tween-20)，于室温封闭1h。将BSA溶液吸出后，加入100μL TBST洗涤，共3次。
3、用含有质量体积浓度(g/ml)1％BSA的TBST缓冲液分别将带有mFc标签的新冠病毒S1蛋白(北京百普赛斯，Cat:SIN-C5257)与带有His标签的抗凝血酶AT(北京义翘神州，Cat:10142-H08H)稀释，并将4μg/mL新冠病毒S1蛋白与2μg/mL抗凝血酶AT等体积混合(蛋白摩尔比为1:1)，取100μL加至实验孔中与芯片室温孵育1.5h。再分别取100μL 2μg/mL新冠病毒S1蛋白与100μL 1μg/mL抗凝血酶AT，分别加至两个对照孔中室温孵育1.5h。共做4次平行重复实验。孵育结束后，将蛋白溶液吸出后，加入100μL TBST洗涤3次。
4、向实验孔和对照孔中分别加入100μL用1％BSA的TBST缓冲液稀释的AlexaFluor488标记的羊抗鼠IgG荧光抗体(Cell Signaling，#4408，稀释比例为1:1000)，于室温孵育1h。孵育结束后，将抗体吸出，用缓冲液洗涤3次。
5、再分别向实验孔和对照孔中加入100μL用1％BSA的TBST缓冲液稀释的AlexaFluor 647标记的兔抗His标签荧光抗体(Cell Signaling，#14931，稀释比例为1:1000)，于室温孵育1h。孵育结束后，将抗体吸出，用缓冲液洗涤3次，再用蒸馏水洗涤1次。将芯片卸下，并离心沥干。
6、利用芯片扫描仪，选择488nm和635nm波长分别对芯片进行扫描，记录结果。实验组的两组波长结果分别与对应对照组结果进行比值。实验组AT的荧光强度(635nm下结果)与对照组AT的荧光强度4组比值为96.4％±23.1％，说明新冠病毒S1的存在并没有明显影响AT与芯片上肝素的结合，即AT结合肝素的亲和力强于S1结合肝素的亲和力。实验组S1的荧光强度(488nm下结果)与对照组S1的荧光强度比值为62.0％±12.5％，说明了AT的存在明显影响了S1与肝素的结合，即AT结合肝素的亲和力强于S1结合肝素的亲和力。
实施例2
肝素辅助因子II与新型冠状病毒S蛋白结合肝素的竞争力比较
1、肝素芯片前处理：
将固定有肝素的芯片(肝素的固定量为0.5ng，点的直径约为150-200μm)放入超纯水中，浸润约30秒后取出。离心沥干后，将芯片小心安装至芯片架上。芯片架会将芯片上的糖微阵列分隔成独立的方孔空间，容积约150μL。
2、封闭：
向每个芯片架的方孔空间中加入100μL含有质量体积浓度(g/ml)为1％BSA(牛血清白蛋白)的TBST(Tris-盐酸-Tween)缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH＝7.4，0.05％Tween-20)，于室温封闭1h。将BSA溶液吸出后，加入100μL TBST洗涤，共3次。
3、用含有质量体积浓度(g/ml)1％BSA的TBST缓冲液将将带有mFc标签的新冠病毒S1蛋白与带有His标签的肝素辅助因子II(北京义翘神州，Cat:10295-H08H)稀释，并将4μg/mL新冠病毒S1蛋白与2μg/mL肝素辅助因子II等体积混合(摩尔比约1:1)，取100μL加至实验孔中与芯片室温孵育1.5h。再分别取100μL 2μg/mL新冠病毒S1蛋白与100μL 1μg/mL肝素辅助因子II，分别加至两个对照孔中室温孵育1.5h。共做4次平行重复实验。孵育结束后，将蛋白溶液吸出后，加入100μL TBST洗涤3次。
4、向实验孔和对照孔中分别加入100μL用1％BSA的TBST缓冲液稀释的AlexaFluor488标记的羊抗鼠IgG荧光抗体(稀释比例为1:1000)，于室温孵育1h。孵育结束后，将抗体吸出，用缓冲液洗涤3次。
5、再分别向实验孔和对照孔中加入100μL用1％BSA的TBST缓冲液稀释的AlexaFluor 647标记的兔抗His标签荧光抗体(稀释比例为1:1000)，于室温孵育1h。孵育结束后，将抗体吸出，用缓冲液洗涤3次，再用蒸馏水洗涤1次。将芯片卸下，并离心沥干。
6、利用芯片扫描仪，选择488nm和635nm波长分别对芯片进行扫描，记录结果。4组实验组的两种波长结果分别与对应4组对照组结果进行比值。实验组肝素辅助因子II的荧光强度(635nm下结果)与对照组肝素辅助因子II的荧光强度比值为73.3％±15.6％，说明新冠病毒S1的存在并没有明显影响肝素辅助因子II与芯片上肝素的结合，即肝素辅助因子II结合肝素的亲和力强于S1结合肝素的亲和力。实验组S1的荧光强度(488nm下结果)与对照组S1的荧光强度比值为25.8％±0.45％，说明了肝素辅助因子II的存在明显影响了S1与肝素的结合，即肝素辅助因子II结合肝素的亲和力强于S1结合肝素的亲和力。此外，肝素辅助因子II和新冠病毒S1蛋白竞争结合的比例相对互补，也说明两者结合肝素上较为相似的位点。
Claims (10)
1.一种用于筛选糖结合蛋白竞争性抑制剂的糖芯片方法，其特征在于：
1)在固载有3组以上糖微阵列的芯片上，于其中一组糖微阵列上滴加带有荧光检测标签的待检测蛋白A溶液进行孵育，作为对照组1；于另一组糖微阵列上滴加抑制剂溶液进行孵育，作为对照组2；于对照组1和对照组2之外的一组以上糖微阵列上滴加带荧光检测标签的待检测蛋白和抑制剂的混合溶液进行孵育，作为实验组；
2)对对照组1、对照组2、实验组进行洗涤，洗去孵育溶液，于对照组1、对照组2、实验组的糖微阵列分别滴加与待检测蛋白A上标签对应的荧光检测抗体溶液进行孵育；洗去孵育溶液；
3)采用荧光检测抗体对应检测荧光波长，分别对对照组1、对照组2、实验组进行荧光检测，获得荧光信号强度；
若对照组2的荧光信号强度大于0或对照组1的荧光信号强度等于0，则不能可筛选判断；
若对照组2的荧光信号强度为0且对照组1的荧光信号强度大于0，则可进行筛选判断；实验组的荧光信号强度除以对照组1的荧光信号强度得到竞争性值a，若a等于1，则所述抑制剂不是待检测蛋白的竞争性抑制剂，若a小于1，则所述抑制剂是待检测蛋白的竞争性抑制剂，且a值越小表示抑制剂对待检测蛋白的竞争力越大。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述抑制剂为另一种带荧光检测标签的待检测蛋白；具体过程为，
1)在固载有3组以上糖微阵列的芯片上，于其中一组糖微阵列上滴加带有荧光检测标签y的待检测蛋白B溶液进行孵育，作为对照组1；于其中另一组待检测糖位点上滴加带荧光检测标签z的待检测蛋白C溶液进行孵育，作为对照组2；于对照组1和对照组2之外的一组以上待检测糖位点上滴加待检测蛋白B和待检测蛋白C的混合溶液进行孵育，作为实验组；
2)对对照组1、对照组2、实验组进行洗涤，洗去孵育溶液；于对照组1、对照组2、实验组的位点处分别滴加与含待检测蛋白B上的y标签对应的荧光检测抗体Y和待检测蛋白C上的标签z对应的荧光检测抗体Z的溶液进行孵育；洗去孵育溶液；
3)检测蛋白B上的y标签和待检测蛋白C上的z标签不相同，且荧光检测抗体Y和Z对应的检测荧光波长不相同；
分别采用荧光检测抗体Y对应的检测波长对对照组1、实验组进行荧光检测，获得荧光信号强度B1和B3；
分别采用荧光检测抗体Z对应的检测波长对对照组2、实验组进行荧光检测，获得荧光信号强度C2和C3；
B3除以B1得到竞争性值b，若b等于1，则所述待检测蛋白C不是待检测蛋白B的竞争性抑制剂，若b小于1，则所述待检测蛋白C是待检测蛋白B的竞争性抑制剂，且b值越小表示抑制剂对待检测蛋白的竞争力越大；
C3除以C2得到竞争性值c，若c等于1，则所述待检测蛋白B不是待检测蛋白C的竞争性抑制剂，若c小于1，则所述待检测蛋白B是待检测蛋白C的竞争性抑制剂，且c值越小表示抑制剂对待检测蛋白的竞争力越大；
通过两种波长的荧光抗体，分别检测两种糖结合蛋白在芯片上的信号差异，实现两种蛋白结合竞争力比较及其结合糖位点的初步判断。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤1)中在对照组1、实验组上滴加的溶液中带荧光检测标签的待检测蛋白的量过量于糖微阵列上糖结合所需蛋白的量；
步骤1)中在对照组2、实验组上滴加的溶液中抑制剂的量过量于糖微阵列上糖结合所需抑制剂的量；
步骤2)中在对照组1、对照组2、实验组上分别滴加的溶液中待检测蛋白上的标签对应的荧光检测抗体的量过量于位点上荧光检测标签和/或抑制剂与荧光检测抗体反应所需的量。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)的孵育条件为室温或37℃孵育0.5至4h。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
待检测糖为植物多糖(例如人参果胶、柴胡多糖等)、哺乳动物体内的寡糖(例如母乳寡糖等)、哺乳动物体内的多糖(例如N糖链，O糖链等)、细菌表面的多糖(例如加膜多糖等)中的一种或二种以上；
待检测蛋白为糖结合蛋白(例如动植物凝集素、病毒刺突蛋白等)中的一种或二种以上。
6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
抑制剂为糖结合蛋白(例如动植物凝集素、病毒刺突蛋白等)、各类糖(例如植物多糖、母乳寡糖等)、小分子化合物(例如乳糖类似物等)中的一种或二种以上。
7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
荧光检测标签为与蛋白融合表达的标签(例如His(系列组氨酸)标签、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签、GFP(绿色荧光蛋白)标签等)或通过化学反应连接在蛋白上的标签(例如生物素(Biotin)标签)中的一种或二种以上；
荧光检测抗体为发射波长范围在488nm、532nm和647nm的荧光抗体(例如AlexaFluor488标记的羊抗鼠IgG、AlexaFluor 647标记的兔抗His标签，AlexaFluor 532标记的兔抗鼠IgG等)中的一种或二种以上。
8.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
待检测蛋白溶液的浓度为0.1至500μg/mL；
抑制剂溶液的浓度0.00001至10mg/mL；
荧光检测抗体的浓度0.1至100μg/mL。
9.按照权利要求1或8所述的方法，其特征在于：
于对照组1和对照组2之外的2组以上糖微阵列上分别滴加不同浓度带荧光检测标签的待检测蛋白和不同浓度抑制剂溶液进行孵育，作为2个以上实验组；
或，于对照组1和对照组2之外的2组以上糖微阵列上分别滴加相同浓度带荧光检测标签的待检测蛋白和不同浓度抑制剂溶液进行孵育，作为2个以上实验组；
或，于对照组1和对照组2之外的2组以上糖微阵列上分别滴加不同浓度带荧光检测标签的待检测蛋白和相同浓度抑制剂溶液进行孵育，作为2个以上实验组。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的各类糖芯片，以及其他类型的生物芯片，包括蛋白质芯片和基因芯片等中的一种或二种以上。
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-
2020
- 2020-12-03 CN CN202011412492.7A patent/CN114594253A/zh active Pending
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