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Hintergrund
der Erfindung
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Die
hierin beschriebenen Erfindungen betreffen die Affinitätstrennung
und den Nachweis von Analyten in einer Probe. Insbesondere betreffen
Sie Bindungsversuche ohne Reagenzien, die eine gleichzeitige (Echtzeit-) Überwachung
der Analytkonzentration, einen Analyt-Nachweis bei sehr niedrigen
Konzentrationen erlauben, und die leicht allgemein für den Nachweis
und die quantitative Bestimmung einer Unmenge verschiedener Analyten
angewendet werden können.
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1. Technisches
Gebiet
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Die
Analysen der Erfindung verwenden einzigartige modulare Affinitätssysteme
als Affinitätsmateries zur
Affinitätstrennung,
zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung eines Analyten. Das
System beinhaltet mindestens eine Sensoreinheit, wobei jede mindestens
einen Anti-Analyt-Rezeptor (Affinitätsmodul) und mindestens eine
signalkompetente Indikatorsonde (Indikatormodul), die (das) auf
Ereignisse, die mit der Analyt-Rezeptor-Komplexbildung in Verbindung
stehen, anspricht, aufweist. Während
die Sensoreinheiten hierin beispielhaft als optische Sensoreinheiten,
die lumineszierende Indikatorsonden (Lumineszenzstrahler) aufweisen,
dargestellt werden, wird die Verwendung von bindungsempfindlichen
Indikatorsonden, die nicht-optische Signale wie Elektronenübertragungssignale
wie Elektronenübertragung
und Radioaktivität
weitergeben, in den modularen Systemen der Erfindung ebenfalls ins
Auge gefasst.
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Die
Erfindungen sind insbesondere brauchbar für den Nachweis sehr verdünnter Konzentrationen
an Analyt (im ng/ml – pg/ml-Bereich
und niedriger) und zum kontinuierlichen Anzeigen sich verändernder
Konzentrationen an Analyt in "Echtzeit" (d. h. gleichzeitig
mit der Konzentrationsveränderung),
ohne weitere Manipulation. Ablesungen des weitergeleiteten Signals
können
leicht an von der Analysestelle entfernten Orten getätigt werden,
was beispielsweise eine dauernde Überwachung von Umgebungsluft
und Wasser hinsichtlich Schadstoffen aus weiter Ferne erlaubt.
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Andere
Anwendungen für
die Analysen der Erfindung umfassen den klinischen Nachweis und
die Echtzeit-Überwachung
von Spuren-Biochemikalien in Körpergeweben
und-flüssigkeiten,
so dass sie beispielsweise die Diagnose und Überwachung biochemischer Krankheitsanzeiger;
den Nachweis von Spurenmengen gefährlicher (Bio)Chemikalien in
der Umgebung wie denjenigen von medizinischem, radioaktivem oder
industriellem Abfall; den Nachweis von Pathogenen (z. B. Mikroorganismen
und Viren oder ihrer Toxine) in winzigen Mengen in der Atmosphäre (einschließlich geschlossener
Umgebungen wie Gesundheitsfürsorge-Einrichtungen)
oder in einem Wasservorrat; den Nachweis explosiver Materialien;
und den Nachweis verbotener Substanzen wie bekämpfter Drogen erlauben.
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2. Diskussion
des Stands der Technik
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Zahlreiche
Analysen auf der Basis von Affinitätschromatographie sind wohl
bekannt für
den Nachweis eines Analyten in einer Probe. Derartige Analysen beinhalten
typischerweise das Immobilisieren eines Analyt-spezifischen markierten
Liganden an einem Träger,
um eine Affinitätsmatrix
zu bilden; das Kontaktieren des immobilisierten Liganden mit einer
Fluidprobe, die möglicherweise
den Analyten enthält;
und das Nachweisen und/oder quantitativ Bestimmen von gebundenem
Analyten. Kompetitive Bindungsanalysen, bei denen es auf ein Konkurrieren
zwischen dem Analyten und einem markierten Analyt-Analogen um Liganden-Bindungsstellen
ankommt, sind komplizierter, wobei sie zusätzlich markierte Analyt-Analoge
zur anfänglichen
Sättigung
von Matrix gebundenen Liganden erfordern. Bindungsanalysen vom Sandwich-Typ
erfordern ebenfalls zusätzlich markierte
sekundäre
Liganden zum sandwichartig Umfassen von Analyt, der an den immobilisierten
primären Liganden
gebunden ist.
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Diese
klassischen Analysen haben mehrere Nachteile, die sie zur Erreichung
der Ziele der vorliegenden Erfindung ungeeignet machen. Bei beiden
Analysen spiegelt das Gleichgewicht, das sich schließlich zwischen
dem Analyten und dem immobilisierten Liganden einstellt, eine statische
Analyt-Konzentration der Probe wieder, aber Schwankungen in der
Konzentration können
nicht ohne weiteren Zusatz von Reagenzien, d. h. markiertem Analogen
oder markiertem sekundären
Liganden, nachgewiesen werden. Außerdem ist die Analyse nicht
reversibel ohne zeitaufwendige Regenerierung der Matrix, und selbst
das ist nicht immer möglich.
Die vorliegende Erfindung erübrigt
den Bedarf an sekundären
Markierungsschritten, die Zeit zum Mischen, zur Reaktion und zum
Wegspülen
von überschüssigem Reagens
vor dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung des Analyten erfordern,
und erlaubt eine kontinuierliche Echtzeit-Überwachung
der Analyt-Konzentration ohne Matrix-Regenerierung.
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Die
Entwicklung reagenzienloser, auf Fluoreszenz basierender Sensoren
war auf diesem Gebiet lange ein Ziel. Mehrere reagenzienlose Techniken,
die nahezu eine Echtzeit-Überwachung
von Chemikalien erlauben, wurden entwickelt, aber alle waren auf
einen engen Bereich von Analyten und Rezeptoren begrenzt. Bei vielen
dieser Techniken ist der Rezeptor selbst ein fluoreszierendes Molekül (z. B.
ein Metallionen-Chelator), dessen fluoreszierende Eigenschaften
(z. B.Emissionsintensität,
Emissions-Wellenlänge
oder -Lebensdauer) sich bei Analyt-Bindung verändern. Dementsprechend wurde
auf die Entwicklung von Fluophoren, die auch Analyt-Erkennungseigenschaften
haben, große
Mühe aufgewendet.
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Beispielsweise
ist im Handel eine Vielfalt Kationen-spezifischer fluoreszierender
Farbstoffe, die bei Ionenbindung eine Intensitätssteigerung oder eine Verschiebung
bei ihren Fluoreszenz-Emissionsspektren zeigen, erhältlich.
Zusätzlich
zu pH-empfindlichen Farbstoffen sind zur Verwendung beim Nachweis relevanter Chemikalien
mehrere Fluoreszenz-Sonden bekannt, die spezifisch Chelate bilden
mit Ionen wie Mg+2 (z. B. Furaptra), Zn+2 (TSQ), Na+ (SBFI),
K+ (PBFI) und Ca+2 (EGTA-AM)
(Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes und Research Chemicals,
Molecular Probes, 1996). Diese Farbstoffe haben eine breite Anwendung sowohl
bei Umweltmeßanwendungen
als auch bei biochemischen Studien gefunden. Die zum Nachweisen
eines Analyten mit diesen Farbstoffen verwendeten Verfahren haben
jedoch den Nachteil, dass sie einen spezifischen Rezeptor für den Analyten,
der ebenfalls fluoresziert und dessen Fluoreszenzeigenschaften sich
bei Analyt-Bindung verändern,
erfordern. Daher können
sie nicht allgemein für
beliebige Analyten angewendet werden. Ähnliche Einschränkungen
gelten auch für
andere optische Sensoreinheiten, die zum Nachweisen von Fluorophoren
oder phosphoreszierenden Stoffen im angeregten Zustand verwendet
werden (Meier, B.; Werner T.; Klimant, I.; Wolfbeis, O.S., "Novel Oxygen Sensor
Material Based on a Ruthenium Bipyridyl Complex Encapsulated in
Zeolite-Y: Dramatic Differences in the Efficiency of Luminescence
Quenching by Oxygen on Going, From Surface-Adsorbed to Zeolite-Encapsulated
Fluorphores," Sensors & actuators B 29:
240, 1995).
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Ein
verwandter reagenzionloser Ansatz ist die Verwendung von umgebungsempfindlichen
Farbstoffen mit Proteinen, Polymeren und in molekularen Systemen
(Lundgren, J.S.; Bright, F.V., "Biosensor
for the Nonspecific Determination of Ionic Sufactants," Anal. Chem. 68:
3377, 1996). Farbstoffe wie 6-Propionyl-2-dimethylamino-naphthalin
(Prodan) und 6-Dodecanoyl-2-dimethylamino-naphthalin (Laurodan)
wurden zur Bindung eines breiten Bereichs von Analyten verwendet.
Diese Farbstoffe enthalten sowohl Elektronendonor- als auch Elektronenakzeptor-Baueinheiten,
die zu einem großen
Dipolmoment im angeregten Zustand führen (Haugland, R.P., Handbook
of. Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes,
1996). Folglich sind die Emissionsspektren dieser Farbstoffe äußerst empfindlich
für die
Polarität
ihrer Umgebung. Beispielsweise variiert das Emissionsmaximum für Prodan
von etwa 380 nm, wenn der Farbstoff in einer unpolaren Umgebung
(z. B. Cycohexan) ist, bis etwa 520 nm, wenn der Farbstoff in einer
polaren Umgebung (z. B. Wasser) ist (Haugland, R.P., Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 1996).
Bei typischen Meßprotokollen
werden diese Farbstoffe in Polymere eingebaut, die in Anwesenheit
bestimmter Arten von Analyten mit niedrigem Molekulargewicht quellen
(Barnard, S.M.; Walt, D.R. A Fibre-Optic Chemical Sensor with Discrete
Sensing Sites," Nature
353: 338-340, 1991). Das Ausmaß der
Quellung des Polymers ist direkt proportional zur Menge an Analyt,
die von dem Polymer aufgenommen wurde, und die sich ergebende Veränderung
der Polarität
der Umgebung des Farbstoffs beeinflußt seine Fluoreszenz-Emissionseigenschaften,
die dann zur Analyt-Konzentration in Beziehung gesetzt werden können. Ähnliche
Techniken wurden zum Studium der Dynamik von Zellmembranen verwendet.
Beispielsweise wurden die Wirkungen von Arzneimitteln, Anästhetika,
extrazellulären
Proteinen und Metallionen auf die Membran-Dynamik und -Struktur durch
den Einbau von Fluoreszenzsonden wie Diphenylhexatrien in die Membranstruktur überwacht
(Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,
Molecular Probes, 1996). Obwohl diese allgemeinen Verfahren zur
Weiterleitung auf der Basis von Fluoreszenz eine reagenzienlose Überwachung
einer Vielfalt von Arten von Analyten erlauben, ist sie nicht in
breitem Umfang allgemein anwendbar, und es fehlt ihr auch Analyt-Spezifität, da viele
Hintergrundsubstanzen Veränderungen
in der Umgebung des Fluoreszenzmoleküls bewirken können, die
zu verwirrenden spektralen Daten führen.
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Ein
Typ einer reagenzienlosen fluoreszierenden Sensoreinheit mit einem
hohen Grad an Spezifizität weist
ein spezifisches Bindungsrezeptorprotein auf, das durch kovalenten
Einbau von Indikator-Fluophoren modifiziert ist. Diese Sensoreinheiten
sind so konstruiert, dass die Emissionseigenschaften des Fluophors
bei Analyt-Rezeptor-Bindung verändert
werden. Als ein Beispiel, es wurden drei allgemeine Weitergabemechanismen,
bei denen die Bindung eines Analyten an den modifizierten Rezeptor
zu einer Störung
der Fluoreszenzemission führt,
identifiziert (siehe Case et al und Sohanpal, K.; Watsuji, T.; Zhou,
L.Q.; Cass, A.E.G., "Reagentless
Fluorescence Sensors Based Upon Specific Binding Proteins", Sensors & Actuators B 11:
547, 1993). Diese sind (1) Störung
des Fluophors entweder durch direkte Wechselwirkung mit dem Analyten
bei Bindung oder durch indirekte Wechselwirkung über den Rezeptor bei Bindung;
(2) durch Konformationsänderungen
in dem Rezeptorprotein bei Analyt-Bindung, die zu einer Veränderung
der lokalen chemischen Umgebung des Fluo phors führt, verursachte Störung des
Fluophors; und (3) durch eine Veränderung des Aggregationszustands des
Rezeptorproteins bei Analyt-Bindung verursachte Störung des
Fluophors. Diese Weitergabemechanismen sind zwar reagenzienlos,
reversibel und spezifisch, aber sie sind zu spezifisch, um allgemein
anwendbar zu sein, da das Fluophor vorher an jedem Proteinrezeptor
an einer Stelle angefügt
werden muß,
die typischerweise in Abhängigkeit
von dem gewählten
Proteinrezeptor unterschiedlich ist.
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Das
US-Patent Nr. 5 156 972 betrifft chemische und biochemische Sensoren,
die ein molekulares Erkennungssystem und einen geeigneten Vermittler
enthalten. Eine Sensoroberfläche
ist mit reversiblen kompetitiven Erkennungseinheiten (reversible
competitive recognition units, RCRUs) beschichtet, von denen jede
als aufbauende Bestandteile mindestens einen Rezeptor und mindestens
einen Liganden enthält,
wobei einer der Bestandteile ein Analyt-Analog ist. Der Rezeptor
und der Ligand in den RCRUs sind in einer solchen Konfiguration
direkt oder indirekt miteinander verbunden, dass ein Analog-Ligand
in relativ enger Nähe
zu dem Rezeptor festgehalten wird, wenn der Analyt-Analog-Ligand
durch einen Analyt-Liganden von dem Rezeptor verdrängt wird.
Die relativen Positionen des Rezeptors und des Liganden in der RCRU
sind so, dass sie, wenn keine Analyten vorhanden sind oder wenn
die Analyt-Konzentration ein niedriges Niveau hat, durch eine spezifische
Affinitätswechselwirkung
affinitätskonjungiert
sind.
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Das
US-Patent Nr. 5 434 088 betrifft ein Immunoassay-Verfahren zum Nachweis
von Pathogenen und Krankheitsanzeigern in klinischen Untersuchungen
und zum industriellen immunologischen Nachweis verschwindend kleiner
Mengen an Zielsubstanzen. Das Verfahren umfaßt das Binden einer fluoreszierenden
Substanz und eines Antikörpers,
der spezifisch mit einer nachzuweisenden Zielsubstanz reagiert,
an ein erstes feines Teilchen, das Binden eines Löschers und
eines Antikörpers,
der spezifisch mit der nachzuweisenden Zielsubstanz reagiert, über eine
unterschiedliche Antigen-Determinante an ein zweites feines Teilchen,
das in Berührung
Bringen der feinen Teilchen mit der in einer Probe enthaltenen Zielsubstanz,
um ein Immunreaktionsprodukt zu bilden, in dem die Zielsubstanz
sandwichartig zwischen dem Antikörper
an dem ersten feinen Teilchen und dem Antikörper an dem zweiten feinen
Teilchen angeordnet ist. Ein Löschen
der Fluoreszenz, das wegen des Löschers
auftritt, wird nachgewiesen, um die Zielsubstanz in der Probe zu
messen.
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Der
Artikel "Molecular
Recognition in Membrane Mimics: A Fluorescent Probe", K. Motesharei und D.C.
Myles, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 7413-7414 (die Literaturstelle
D4) beschreibt ein System zum Untersuchen molekularer Erkennungsereignisse
an organischen Grenzflächen
unter Verwendung fluoreszierender Rezeptoren, die in gemischte eigenständig zusammengefügte monomolekulare
Schichten von Alkanthiolaten auf Gold eingebaut sind. Der Artikel
beschreibt außerdem
die Wechselwirkung von Barbitursäure-Derivaten
mit gemischten monomolekularen Schichten von Octanthiol und dem
Bis(2,6-diaminopyridin)amid von Isophthalsäure-funktionalisiertem Decanthiol
auf dünnen
Goldfilmen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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1:
Abhängigkeit
der relativen Fluoreszenz-Lebensdauer von der Trennungsstrecke zwischen
einem Fluorophor und einer Metalloberfläche, wie bestimmt mittels Kuhn's Näherungstheorie.
Die Figur ist übertragen
aus Chen, H.C.; Frank, C.W., "Fluorescence
Probe Studies of Self-Assembled Monolayer Films," Langmuir 7: 1791, 1991).
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2:
Abschwächung
der Fluoreszenz-Emissionsintensität eines Rhodamin enthaltenden
modularen Systems, erzeugt bei Analyt (Cs+)-Bindung.
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In
diesem Beispiel ist das molekulare System eine eingenständig zusammengefügte monomolekulare Schicht
(self-assembled monolayer, SAM), gebildet durch die Reaktion von HS(CH2)10C(O)NH(CH2)2O)2(CH2)2NHC(S)NH-Rh, worin
Rh = Rhodamin, mit der Oberfläche
eines dünnen Goldfilms.
Der Cäsium-Analyt bindet an
die Oligo(ethylen-glycol)-Baueinheit NH(CH2CH2O)2CH2CH2NH in dem System, was zu einer Veränderung
in der Struktur des molekularen Systems führt, die das Rhodamin wieder
in eine weniger lumineszierende Konformation überführt.
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3: Weitergabe in modularen Systemen
A)
R ist ein Rezeptormodul und L1 und L2 sind lumineszierende oder
andere Indikatormodule. Beispiel 1: L1 und L2 sind Excimer-Paare;
Bindung des Analyten führt
zu einer Excimer-Emission. Beispiel 2: L1 ist ein Luminophor und
L2 ist ein effektiver Löscher
(durch Elektronenübertragungs-Systeme
oder durch Resonanzenergieübertragungs-Systeme).
Bindung des Analyten führt
zu einer verringerten Emission. Beispiel 3: L1 und L2 sind zur photoinduzierten
Ladungsübertragung
in der Lage. Bindung des Analyten kann, abhängig von der Identität von L1
und L2, entweder zu erhöhter
oder verringerter Emission führen.
B)
Bindung des Analyten führt
zu einer Verschiebung eines Effektormoduls (R) weg von dem Luminophor,
was die Emission erhöht.
R ist beispielsweise ein Löscher
oder ist mit einem Löscher
verbunden.
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4: Reagenzienlose Weitergabe der spezifischen
Bindung eines Modell-Analyten
(Streptavidin) an ein modulares System auf einem metallischen Substrat.
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In
dieser Darstellung ist Biotin der Modell-Rezeptor für Streptavidin.
- -O-:
- Fluoreszenzspektrum
des Indikators Rhodamin von dem System, das nicht Streptavidin ausgesetzt wurde;
- -♢-:
- Fluoreszenzspektrum
des Indikators Rhodamin nach Streptavidin-Exposition;
- :
- Fluoreszenzspektrum
des Rhodamins, nachdem es einem Rezeptor ausgesetzt wurde, der nicht
an Biotin bindet.
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5. Reagenzienlose Weitergabe der reversiblen
Bindung eines Modell-Analyten
(Antibiotin) an ein modulares System auf einem metallischen Substrat.
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Hier
ist Biotin der Modell-Rezeptor für
Antibiotin.
- -O-:
- Fluoreszenzspektrum
des Indikators Rhodamin von dem System, dasnicht Antibiotin ausgesetzt wurde;
- -♢-:
- Fluoreszenzspektrum
des Indikators Rhodamin nach Antibiotin-Exposition;
- :
- Fluoreszenzspektrum
des Indikators Rhodamin, nach Elution von Antibiotin von der Systemoberfläche, indem
es einem Überschuß an Biotin
ausgesetzt wurde.
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Zusammenfassung
der Offenbarung
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Die
Erfindung stellt ein modulares System zur Affinitätstrennung
eines Analyten von einer Probe bereit, das die in Anspruch 1 beanspruchten
Merkmale hat.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
sind in dem abhängigen
Ansprüchen
beansprucht. Die Erfindung stellt außerdem einen Analysekit, wie
er in Anspruch 23 beansprucht ist, und ein Verfahren zum Nachweisen
eines Analyten in einer Probe, wie es in Anspruch 24 beansprucht
ist, bereit. Insbesondere stellt die Erfindung einen Analysekit
zur reagenzienlosen Bindung für
einen Analyten (Ligat) in einer Probe bereit, der eine Sensoreinheit mit
einem Rezeptor oder einem anderen Liganden, der für den Analyten
Bindungsaffinität
hat (Affinitäts modul), der
wirksam in Verbindung steht mit einer Indikatorsonde (Indikatormodul),
die auf Veränderungen
in der Sensoreinheit, die durch ein Analyt-Rezeptor-Komplexbildung
herbeigeführt
werden, durch Weitergabe eines charakteristischen nachweisbaren
Signals anspricht, aufweist.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein modulares Affinitätsmatrixsystem mit mindestens
einer derartigen Sensoreinheit, immobilisiert auf einem festen Affinitätsträger, bereit.
Die Module des Systems werden durch das System physisch eingeengt
(geordnet), so dass die Bildung gebundener Analyt-Rezeptor-Komplexe
die Geordnetheit des Systems stört
und physikalische, elektrische und/oder klinische Veränderungen
verursacht, die von dem Indikatormodul direkt oder indirekt mitteilbar
sind. Lumineszierende Indikatoren (Lumineszenzstrahler), die für Veränderungen
in der Geordnetheit des molekularen Systems, die durch die Bildung
von Rezeptor/Antirezeptor-Komplexen verursacht werden, empfindlich
sind, sind insbesondere brauchbar in Analysen, die eine hohe Empfindlichkeit
für gebundenen
Analyten erfordern, da diese erfindungsgemäß verwendeten Indikatoren in
der Lage sind, die Anwesenheit von lediglich einem einzigen gebundenen Analyten
nachweisbar zu signalisieren.
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Die
Erfindung stellt außerdem
Analysen bereit, die das modulare System der Erfindung verwenden.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Die
modularen Systeme der vorliegenden Erfindung sind Affinitätsmatrizes,
die als Minimum eine Sensoreinheit, die einen Rezeptor (Affinitätsmodul)
und eine Indikatorsonde (Indikatormodul), immobilisiert auf einem
Affinitätsträger, aufweist,
enthalten. Das Affinitätsmodul
weist irgendeinen in der Technik bekannten Affinitätsliganden
auf, der in der Lage ist, mit einem Zielanalyten einen gebundenen
Komplex zu bilden. Für
viele Anwendungen wird es wünschenswert
sein, dass der Rezeptor für
den Zielanalyten eine hohe Spezifität und Affinität hat; jedoch
mögen für andere
Anwendungen Rezeptoren mit breiterer Affinität, wie diejenigen, die mit verwandten
Bakterienspezies kreuzreaktiv sind, er wünscht sein. Die in Frage kommenden
Analyten sind zahllos, und sie erfordern nur einen komplementären Liganden,
um ein geeignetes Ziel für
eine erfindungsgemäße Analyse
zu sein. Bestimmte Analyten umfassen Makromoleküle wie Proteine, ganze Zellen,
immunogene Peptide und Schwermetalle.
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Das
Indikatormodul weist irgendeine bekannte Signal-kompetente Komponente
auf, die in der Lage ist, als Reaktion auf stereochemische Ereignise,
die die Bildung eines gebundenen Rezeptor/Analyt-Komplexes begleiten,
ein nachweisbares charakteristisches Signal weiterzugeben. Zu diesen
Ereignissen gehören
Indikator-Störung
bei Bindung von Analyt, verursacht durch direkte oder indirekte
Wechselwirkung mit dem Analyten; Konformationsveränderungen
bei dem Rezeptor; Veränderungen
im Aggregationszustand des Rezeptors; Veränderungen in der chemischen
oder dielektrischen Umgebung des Indikatormoduls; und Verschiebung
des Indikatormoduls relativ zu einem in das System eingebauten Effektormodul.
Wie oben angegeben, weisen besonders bevorzugte Indikatormodule
optische Indikatoren auf, zu denen Luminophore und Chromophore gehören. Diese
Module haben Emissionseigenschaften, die als Reaktion auf eine Analyt/Rezeptor-Komplexbildung
modulierbar sind, wie Intensität,
Farbe und Lebensdauer der Strahlung; Wellenlängen-Abstand und -Frequenz,
spektrale Verschiebungen und Veränderungen
der Polarisierung. Eine Komplexbildung wird durch eine Veränderung
bei derartigen Emissionseigenschaften leicht mittels bekannter Techniken
nachgewiesen und quantitativ bestimmt. Andere Indikatoren weisen
Elektronenübertragungssysteme
auf Enzym- oder Redox-Basis auf, die in der Technik für ihre Fähigkeit,
nachweisbare Signale zu transportieren, bekannt sind.
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Die
Indikatormodule reagieren auf eine Komplexbildung typischerweise
mit einer Schwankung des Signals; die Module können jedoch auch einen Ein/Aus-Schalter haben, wobei
sie durch Anschalten eines vorher nicht nachweisbaren Signals oder
durch Abschalten eines nachweisbaren Signals reagieren.
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Gewünschtenfalls
werden in die modularen Systeme Effektormodule eingebaut zur Vermittlung
der Signalantwort des Indikatormoduls auf eine Affinitätskomplex-Bildung.
Zu beispielhaften Effektormodulen gehören beispielsweise Ex cimer-Paare,
Stoßlöscher und
Resonanzenergieübertragungs-Donoren
oder -Akzeptoren, die durch eine Rezeptor/Analyt-Komplexbildung
direkt beeinflußt
werden und wiederum entsprechende Signalveränderungen im Luminophor oder
anderen Indikatoren bewirken. Andere Effektormodule umfassen Bestandteile
wie metallische Teilchen oder Filme mit dielektrischen Eigenschaften,
die die Lumineszenzeigenschaften von Luminophor-Indikatoren bei
Verschiebung der Luminophore relativ zu dem dielektrischen Material
bei Komplexbildung verändern.
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Daher
kann die nachweisbare Signalantwort 1) eine Signal-Auslösung und
-Weitergabe (Erzeugung), 2) eine Signal-Auslöschung, oder 3) eine Signal-Schwankung sein.
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Die
Modul-Bestandteile des Systems sind auf dem Affinitätsträger in wirksamer
Beziehung angeordnet, so dass physikalische, elektrische oder chemische
Ereignisse, die eine Komplexbildung begleiten, dem Indikatormodul
entweder direkt oder über
ein Effektormodul übermittelt
werden und zu einem nachweisbaren Signal der Komplexbildung führen. Das
Affinitätsmodul
ist, während
es mit den anderen Modulen der Erfindung in dem System in Verbindung
steht, entweder an dem Träger
befestigt, so dass es von dem Indikatormodul beabstandet ist, oder
der Indikator und das Affinitätsmodul
sind verbunden. Jede der Sensoreinheiten des Systems weist mindestens
ein Rezeptormodul und ein Indikatormodul auf, die auf dem Träger immobilisiert
sind; die Module können
dieselben oder verschieden sein. Die Rezeptormodule können sich
von Einheit zu Einheit unterscheiden, aber mit demselben Indikatormodul
in Verbindung stehen, und umgekehrt; jede Einheit kann dieselben
Indikatoren und Rezeptoren haben; oder es können sich sowohl die Indikatormodule
als auch die Rezeptormodule von Einheit zu Einheit unterscheiden.
Beispielsweise kann eine erste Sensoreinheit einen Antikörper gegen
Virus A als Rezeptor mit einem zugehörigen Fluophor-Indikator enthalten,
während
eine zweite Sensoreinheit einen Antikörper gegen Virus B als Rezeptor
mit einem zugehörigen
phosphoreszierenden Indikator enthalten kann. Ein derartiges modulares
System ist insbesondere geeignet zum Prüfen einer Umgebung auf eine
Vielfalt möglicher
Analyten durch Herbeiführen
verschiedener Signale für
verschiedene gebun dene Analyten. Die erhaltenen Signale können dann
ausgelesen und für
spezifische Analyten quantitativ bestimmt werden. Mögliche Untereinheit-Konstrukte
umfassen:
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Der
Träger
ist ein Metall, d. h. ein festes, steifes Substrat, das aus Materialien
ausgewählt
wird, die in der Technik für
Affinitäts-Ligandenimmobilisierung
bekannt sind. Kriterien für
derartige Träger
sind bekannt; beispielsweise sollte der Träger frei sein von Fremdionen-Austauschstellen,
keine unspezifische Bindung fördern,
für die
ins Auge gefaßte
Anwendung mechanisch fest genug sein, biologisch und chemisch inert
sein und für
Ligandenimmobilisierung geeignet sein. Der Träger sollte auch unter Reaktionsbedingungen
(z. B. für
Ligandenimmobilisierung) und in seiner beabsichtigten Gebrauchsumgebung
stabil sein. Brauchbare Träger
zur Modulimmobilisierung weisen allgemein organische Polymere, Metalle,
Halbleiter und Keramiken auf. Der Träger kann ein Gemisch aus diesen
Materialien aufweisen, wie eine Schicht aus organischem Polymer,
die an eine anorganische Schicht gebunden ist, um Anlagerungsstellen
für bestimmte
Affinitätsmodule
zu schaffen, oder eine Schicht aus nichtleitendem Oxid auf einem
metallischen oder einem anderen Substrat. Für die meisten Anwendungen wird
der Affinitätsträger einen
relativ dünnen
Film oder Verbundmaterialfilm aufweisen, wie weiter unten beschrieben.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung besteht der Affinitätsträger aus
einem Metall.
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Das
modulare Konstruieren von reagenzienlosen Analyt-Sensoreinheiten
gemäß der Erfindung
umfaßt
die Herstellung einer Minimalkombination von zwei Modulen mit den
getrennten Funktionen von (a) Analyt-Bindungsaffinität (Affinitätsmodul)
und (b) auf Erkennung ansprechender Signalgebung (Indikator modul). Die
Sensoreinheiten sind in das System eingebaut, so dass das Bindungsereignis
zwischen dem Rezeptor und dem Analyten die Signalgebungseigenschaften
des Indikatormoduls ausreichend beeinflußt, um einen Nachweis des Ereignisses
zu erlauben. Das modulare Designkonzept ist attraktiv, weil es bei
einer Vielfalt von Rezeptoren und ihren Zielanalyten brauchbar ist.
Bisher wurde es jedoch nur verwendet, um Indikatoren für die Bindung
von Schwermetallionen in Lösung
zu erzeugen.
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Modulare Systeme.
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Die
modularen Systeme der Erfindung werden durch kovalente oder nicht-kovalente
Anlagerung von Bestandteilmodulen an einen festen Affinitätsträger oder
ein festes Affinitätssubstrat,
bestehend aus einem Metall, hergestellt. Sie sind Systeme im festen
Zustand, worin sie sich von anderen Affinitätsmatrizes unterscheiden, die
Affinitätsträger haben,
die Fluide, freistehende Membranen wie Lipid-Doppelschichten, Vesikel und
Langmuir-Filme aufweisen.
Die Festkörper-Systeme
der Erfindung sind für
eine ausreichende strukturelle Stabilität konstruiert, so dass eine
direkte oder indirekte Störung
des Indikatormoduls, um Signalveränderungen zu bewirken, verläßlich eine
Komplexbildung anstatt Fremdereignisse widerspiegelt. Die Träger weisen bekannte
Materialien auf, die in der Technik für die Immobilisierung von Affinitätsliganden
verwendet werden. Der Träger
besteht aus einem Metall. In der Technik bekannt sind auch Materialien,
zu denen eigenständig
zusammengefügte
monomolekulare Schichten (self-assembled monolayers, SAMs); polymere
Bürsten
und gepfropfte Polymere gehören.
Materialien, die geordnete Systeme sind (z. B. SAMs von Alkylthiolen
auf Edelmetallen und manchen Halbleitern, von Silanen auf Oxiden,
oder von Carbonsäuren
auf basischen Oxiden, Polymerbürsten
und bestimmte gepfropfte Polymere), unterscheiden sich hierin von
denjenigen, die normalerweise relativ ungeordnet sind, wie Polymergele
und an einer Oberfläche
absorbierte unlösliche
Polymere. Es gab nur einige wenige Berichte über die Verwendung derartiger
Systeme für
reagenzienloses chemisches Abfühlen (Motesharei,
K.; Myles, D.C., "Molecular
Recognition in Membrane Mimics: A Fluorescence Probe", J. Am. Chem. Soc.
116: 7413, 1994), und keine Berichte über Weitergabemechanismen auf
der Basis von Veränderungen
in der Geordnetheit von molekularen Systemen bei Analyt-Bindung
und -Nachweis.
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Auf Lumineszenz basierende
Sensoreinheiten.
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Eine
Anzahl von Vorzügen
macht die Messung von Veränderungen
der Lumineszenzeigenschaften (z. B. Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-Eigenschaften)
zu einem wünschenswerten
Verfahren der Weitergabe in Sensoreinheiten auf Affinitätsbasis.
Unter geeigneten Bedingungen kann Lumineszenz-Spektroskopie zur
Untersuchung extrem niedriger Konzentrationen an Analyt verwendet
werden; Veränderungen
in den Fluoreszenz-Spektren und -Lebensdauern können selbst von einem einzigen
Molekül
nachgewiesen werden (Ambrose, W.P.; Goodwin, P.M.; Martin, J.C.;
Keller, R.A. "Alterations
of Single Molecule Fluorescence Lifetimes in Near-Field Optical
microscopy", Science
265: 364, 1994). Die Lumineszenz kann im wesentlichen als ein Verstärkungsmechanismus
wirken, da ein einziger Luminophor vielfachen Anregungs- und Emissions-Zyklen
unterzogen werden kann, von denen jeder den Bindungszustand eines
Rezeptors, mit dem der Luminophor in Verbindung steht, widerspiegelt.
Zu anderen nützlichen
Eigenschaften der Lumineszenz gehört die Tatsache, dass die Intensität der Extinktion
und Emission bei verschiedenen Wellenlängen, die Lumineszenzpolarisation
und die Lebensdauer des angeregten Zustands alles Eigenschaften
des Luminophors sind, die im allgemeinen empfindlich für die chemische
und elektrische Umgebung des Luminophors sind. Daher können diese
Eigenschaften alle vorteilhaft in einer Vielfach-Meßanalyse
des Bindungszustands eines Rezeptors, mit dem der Luminophor in
Verbindung steht, zur Echtzeitüberwachung
eines Analyten verwendet werden. Kürzliche Fortschritte bei der
Messung der Lebensdauer angeregter Zustände sind beispielsweise besonders
relevant für das
Abfühlen
von Affinitätskomplexen,
da sie zu der Entwicklung einer kompakten Geräteausrüstung zur Messung der Phosphoreszenz-
und Fluoreszenz-Lebensdauern
in Anordnungen geführt
haben, die gegen Beeinflussungen von Außen wie störende Lichtquellen und Photobleicheffekte
relativ unempfindlich sind (Meier, B.; Werner, T.; Klimant, I.;
Wolfbeis, O.S, "Novel
Oxygen Sensor Material Based on a Ruthenium Bipyridyl Complex Encapsulated
in Zeolite-Y: Dramatic Differences in the Efficiency of Luminescence
Quenching by Oxygen on Going, From Surface-Adsorbed to Zeolite-Encapsulated
Fluorophores", Sensors & actuators B 29:
240, 1995).
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Wie
oben beschrieben, basieren die vorliegenden Erfindungen auf modularen
Systemen, die Affinitäts- und
Indikator-Module beinhalten, die ausgewählt und auf dem Träger angeordnet
sind, so dass eine Bindung des Analyten an das Rezeptor(Affinitäts)-Modul
zu einer oder mehreren Veränderungen
in der Architektur (Ordnung) des molekularen Systems, für die die
Lumineszenzeigenschaften oder andere Eigenschaften des Indikatormoduls
empfindlich sind„ führt. Beispiele
für derartige
Veränderungen
sind: (1) eine Veränderung
in der Struktur des modularen Systems, die zu einer Veränderung
des durchschnittlichen Abstands zwischen den Lumineszenzzentren
eines Luminophormoduls und eines festen Substrats mit geeigneten
dielektrischen Eigenschaften (z. B. n und k) führt, so dass die ursprünglichen
Lumineszenzeigenschaften des Luminophors bei Analytbindung verändert werden;
(1) (b) eine Veränderung
in der Struktur des Systems, die zu einer Veränderung des durchschnittlichen
Abstands zwischen einer elektroaktiven Indikatorsonde, z. B. einem
Redox-Indikator wie Viologen oder einem Redox-Enzym wie Meerrettichperoxidase,
führt;
(2) eine Veränderung
in der Struktur des modularen Systems, so dass die Transporteigenschaften
von Löschern
wie Sauerstoff bei Analytbindung modifiziert werden; (3) eine Veränderung
der Struktur von modularen Systemen, so dass die Lumineszenzeigenschaften
eines Luminophor-Indikators indirekt durch Effektormodule, die in
das modulare System eingebaut sind, wie Excimer-Paare, Stoß-Löscher und
Resonanzenergieübertragungs-Donoren
oder -Akzeptoren, beeinflußt
werden; (4) eine Veränderung
der Struktur von modularen Systemen, so dass die Lumineszenzeigenschaften
von Luminophor-Indikatormodulen
wie Fluophoren und phosphoreszierenden Stoffen direkt durch den
Analyten beeinflußt
werden, beispielsweise durch Löschen
durch Stoß,
durch photoinduzierte Elektronenübertragung
oder durch Resonanzenergieübertragung.
Es sind mehrere Beispiele für
kovalent verknüpfte
Rezeptor- und Weitergabe-Module auf der Basis von photoinduzierter
Elektronenübertragung
(photoinduced electron transfer, PET) bekannt (siehe z. B. Prasanna
de Silva, A.; Gunnlaugsson, T.; Rice, T.E., "Recent Evolution of Luminescent Photoinduced
Electron Transfer Sensors",
Analyst 121: 1759, 1996; Fabbrizzi, L.; Licchelli, M.; Pallavicini,
P.; Sacchi, D.; Taglietti, A. "Sensing
of Transition Metals Through Fluorescence Quenching or enhancement:
A Review", Analyst 121:
1763, 1996, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden). Derartige
Mechanismen erlauben die Verallgemeinerung der vorliegenden Affinitätsmatrizes,
um den einfachen Nachweis einer Unmenge von Analyten zu erlauben.
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Ein
besonders signifikanter Aspekt der Erfindung ist die Ermöglichung
einer Funktionsmodularität
binärer
oder höherer
Ordnung, die durch das modulare Konzept der Erfindung geschaffen
wird. Zusätzlich
zu den Affinitäts
(Rezeptor)- und
Indikator (z. B. Luminophor)-Modulen in den Systemen können auch
Module eingebaut werden, die zusätzliche
Funktionen erfüllen.
Beispielsweise kann zum Messen in biologischen Fluiden ein Fäulnis verhinderndes
Modul eingebaut werden, das beispielsweise Polyethylenglycol oder
ein hochgradig hydratisiertes Polysaccharid aufweist, um einen Biobewuchs
der Affinitätsmatrix
auszuschließen.
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Beispiele
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Weitergabe durch Veränderung
des Abstands zwischen Indikatoren und Ihrem Träger bei Analytbindung
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Es
ist bekannt, dass innerhalb eines Abstands, der näherungsweise
der Dicke der hier ins Auge gefaßten modularen Systeme entspricht
(typischerweise etwa 10Å – 1 μm), die Strahlungsemission
von fluoreszierenden und phosphoreszierenden Stoffen sehr empfindlich
für ihren
Abstand von Metallen und anderen Materialien ist (Pockrand, I.;
Brillante, A.; Mobius, D., "Nonradiative
Decay of Excited Molecules Near a Metal surface", Chemical Physics Letters 69: 499-504, 1980). 1 beispielsweise
veranschaulicht die Abhängigkeit der
Fluoreszenz-Lebensdauer von der Abstandsstrecke von einer metallischen
Oberfläche,
wie mittels Näherungstheorie
von Kuhn bestimmt. Für
Rhodamin (λ der
Emission = 600 nm), und n, = 1,45 (der Näherungswert für dicht
gepackte Kohlenwasserstoff-Systeme) entspricht ein Wert von 1,0
auf der X-Achse eines Abstandsstrecke von 65 mm. Dieser Abstand
liegt im mittleren Bereich der Dicken für die hier ins Auge gefaßten molekularen
Dünnfilm-Systeme.
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In
einer ersten Näherung
können
die Komponenten des komplexen Brechungsindex (n und k) des Substrats,
zusammen mit der Abstandsstrecke und der Ausrichtung des Fluophors
oder des phosphoreszierenden Stoffs relativ zu der Substratoberfläche und
der Rauheit der Substratoberfläche
verwendet werden, um zu bestimmen, wie stark die Oberfläche die
Lebensdauer und die Emissionsintensität des Indikators beeinflußt (Chen,
H.C.; Frank, C.W., "Fluorescence
Probe Studies of Self-Assembled Monolayer Films", Langmuir 7: 1791, 1991). Unten werden
mehrere neue Arten synthetischer Molekularsysteme beschrieben, die
aus diesen Phänomenen
bei der Weitergabe einer Bindung eines Analyten an ein modulares
System Vorteile ziehen können.
In den folgenden Beispielen wird ein synthetisches (bio)organisches
System entweder direkt auf einer metallischen Oberfläche (z.
B. Gold, Silber), auf einem nicht leitenden Oxid auf einer metallischen
Oberfläche
oder auf irgendeinem anderen festen Träger (z. B. Halbleiter, Oxid,
organisches Polymer, wobei der Träger der Erfindung ein Metall
ist), der entweder als ein Abstandhalter von der metallischen Oberfläche oder,
wenn er mit den passenden dielektrischen Eigenschaften, wie sie
in der Technik bekannt sind, ausgestattet ist, auch als das Modul,
das die Signalgebungseigenschaften des Indikatormoduls stört, wirken
kann, gebildet. Die folgenden Beispiele zeigen die Weitergabe durch
direkte Messung der Fluoreszenz-Lebensdauer oder durch Messung der
Fluoreszenz-Intensität
und/oder -Polarisation, die mit der Fluoreszenz-Lebensdauer korrelieren
kann. Sehr dünne
Filme aus Metallen oder anderen Materialien, die für Anregungslicht
und emittiertes Licht transparent sind, können auf Trägern für kompakte Meßplattformen,
die beispielsweise auf einer Anregung mit evaneszenter Welle basieren,
gebildet werden.
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Zusätzlich zu
Lumineszenzindikatoren können
andere Indikatoren verwendet werden, die für Veränderungen in ihrem Abstand
von einem metallischen oder einem anderen Träger empfindlich sind. Dazu
gehören
Redox-Indikatoren wie elektroaktive chemische und biochemische Verbindungen,
z. B. Ferrocen, Viologen und Enzyme, die Redox-Reaktionen katalysieren.
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Beispiel I
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IA. Konformationsveränderungen
in dem Rezeptor nahe einem metallischen oder einem anderen beeinflussenden
Substrat.
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Verschiedene
Rezeptoren, einschließlich
einiger, die auf in der Natur vorkommenden Biomolekülen basieren
(Sohanpal, K.; Watsuji, T.; Zhou, L.Q.; Cass, A.E.G., "Reagentless Fluorescence
Sensors Based Upon Specific Binding Proteins", Sensors & Actuators B 11: 547, 1993), und
einiger, die auf synthetischen Molekülen basieren (Fabbrizzi, L.;
Licchelli, M.; Pallavicini, P.; Sacchi, D.; Taglietti, A. "Sensing of Transition
Metals Through Fluorescence Quenching or enhancement: A Review", Analyst 121: 1763,
1996), zeigen Veränderungen
in der Konformation ihrer Molekülketten
bei Bindung eines Analyten. Bei gemeinsamer örtlicher Festlegung dieser
Rezeptoren mit Luminophoren, Elektrophoren (für Elektronenübertragung
empfindlichen Sonden), oder anderen Indikatoren in einem modularen
System in der Nähe
eines Metallfilms oder eines anderen Films, der die Emissionseigenschaften
des Indikators beeinflußt,
führt die
sich ergebende Veränderung
in der Rezeptor-Konformation zu einer Veränderung z. B, bei dem durchschnittlichen
Abstand zwischen einem Luminophor-Indikator und dem Metall oder
einer anderen Oberfläche,
und daher zu einer Veränderung
bei den nachweisbaren Lumineszenzeigenschaften eines Luminophors.
Irgendeine sich aus der Komplexbildung ergebende Rezeptor-Veränderung,
die den relativen Abstand zwischen dem Luminophor und der Oberfläche beeinflußt oder
sich in anderer Weise auf seine dielektrischen Eigenschaften auswirkt,
ist für
die Weitergabe gemäß der Erfindung
verwendbar. 2 veranschaulicht diesen Weitergabemechanismus.
In dieser Darstellung wird ein kovalent an den Rezeptor gebundener
Fluophor verwendet, um ein Signal als Reaktion auf die Analyt-Bindung
weiterzugeben.
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IB. Veränderung
der Struktur des Systems nahe einer metallischen oder einer anderen
beeinflussenden Oberfläche.
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Mehrere
andere Weitergabemechanismen auf der Basis von Veränderungen
des Systemaufbaus kommen in Frage:
- – Verringerung
des durchschnittlichen Abstands von Luminophoren von einer metallischen
oder einer anderen Oberfläche
(z. B. als ein Ergebnis der Vernetzung oder Entnetzung des Systems
bei Analytbindung). Vernetzungs- und Entnetzungs-Reaktionen können durch
die Anwesenheit von Analyt durch kompetitive Dissoziierung herbeigeführt werden.
Bei diesem Schema ist der Rezeptor in Abwesenheit von Analyt nicht-kovalent
an ein Analyt-Analoges, das in dem molekularen System co-immobilisiert
(z. B. kovalent) ist, gebunden. Das Rezeptor-Analyt-Analog-Paar
wird, wenn es einem Analyten in Lösung ausgesetzt wird, wegen
der Bildung von Rezeptor-Analyt-Komplexen kompetitiv dissoziiert.
In dieser Ausführungsform
ist der Rezeptor mit einer weitergebenden Sonde [z. B. einem Luminophor
oder einer Redoxsonde (Elektrophor)] markiert, deren Weitergabeeigenschaften
stark von dem metallischen oder dem anderen Träger beeinflußt werden.
Bei der kompetitiven Dissoziierung durch Analyt-Exposition (d. h.
Entnetzung) verändert sich
der Abstand zwischen dem markierten Rezeptor und dem Substrat (z.
B. durch Diffusion). Der Sensor wird reversibel gemacht durch (1)
Verbinden des markierten Rezeptors (z. B. kovalent) durch ein flexibles Haltemolekül (z. B.
Polyethylenglycol) mit dem Träger;
oder (2) Begrenzen des Rezeptor-Analyt-Komplexes auf die Nähe der Sensoroberfläche mittels
einer selektiv permeablen Membran, die den Transport des größeren Rezeptormoleküls (z. B.
ein Antikörper)
nicht erlaubt, aber den Transport durch das kleinere Analytmolekül erlaubt.
- – Erhöhung des
durchschnittlichen Abstands von Luminophoren von einer metallischen
oder einer anderen Oberfläche
(z. B. als ein Ergebnis der Quellung des modularen Systems bei Analytbindung).
Eine Quellung wird üblicherweise
verursacht durch das ausgeschlossene Volumen des Analyten oder durch
die Entfernung von Vernetzungen durch den Analyten.
- – Veränderungen
der durchschnittlichen Ausrichtung von Luminophoren bezüglich einer
metallischen oder einer anderen Oberfläche bei Analytbindung.
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Beispiel II
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Weitergabe durch Transportvermittung
von Löschern.
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Weitergabe
ohne Reagenzien kann auch auf der Verwendung von Löschern,
die in der Lage sind, angeregte Zustände eines Luminophors in der
Probe oder dem Meßmedium
(z. B. O2 in Luft oder in Wasser gelöst) zu löschen, basieren.
In diesen Systemen führt
die Bindung des Analyten an einen Rezeptor zu einer Veränderung
in dem modularen System, die den Transport eines molekularen Löschers (z.
B. O2) zu dem Luminophor hemmt. Eine Hemmung
des Transports (z. B. Diffusion) kann unter anderem beeinflußt werden
durch:
- • ein
Abschließen
der Oberfläche
des Systems durch den Analyten (z. B. ein Protein);
- • eine
Verringerung der Porosität
des Systems;
- • eine
Veränderung
in der Festkörper-Diffusionsfähigkeit
in dem modularen System.
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Beispiel III
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Weitergabe in modularen
Systemen durch Excimer-Bildung und -Zerstörung, Resonanzenergieübertragung und
photoinduzierte Elektronenübertragung.
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Mehrere
reagenzienlose Weitergabemechanismen auf der Basis des Konzepts
der modularen Bauweise ansprechender molekularer Systeme sind in 3 gezeigt.
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Beispiel IV
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Weitergabe in modularen
Systemen durch Analyt-Löschung.
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Der
modulare Einbau von Rezeptor- und Luminophor-Modulen wird in enger
Nähe in
dem System veranlaßt,
um bei Bindung des Analyten an den Rezeptor eine Veränderung
in den Photoemissionseigenschaften eines Lumineszenzindikators zu
bewirken. Zu typischen Luminophoreigenschaften, die von dem Analyten
beeinflußt
werden, gehören
photoinduzierte Ladungsübertragung,
Resonanzenergieübertragung
und Veränderungen
in der örtlichen
dielektrischen Umgebung der Lumineszenzsonde.
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Beispiel V
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In
den 4 und 5 sind
Beispiele angegeben, die schematisch andere spezifische und reversible
reagenzienlose Weitergaben in den modularen Systemen der Erfindung
veranschaulichen.
