DE102018209516A1

DE102018209516A1 - Verfahren zur Bestimmung von Analyten mittels kompetitiver Bindungsreaktion

Info

Publication number: DE102018209516A1
Application number: DE102018209516.7A
Authority: DE
Inventors: Frank Biedermann; Stephan Sinn
Original assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2019-12-19
Also published as: WO2019238805A1; EP3807641A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten durch Messung der kompetitiven Bindungsreaktion der Analyten und mindestens eines Indikators um die Bindung an ein Trägermaterial.

Description

Einleitung:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in einer Probe durch Messung der kompetitiven Bindungsreaktion der Analyten und mindestens eines Indikators um die Bindung an ein Trägermaterial.
Hintergrund:
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit analytischen Fragen und stellt ein neues Verfahren zum Nachweis von Analyten mit molekularen, biologisch- und stoffbasierten Rezeptoren und Chemosensoren (Trägern, Trägermaterialien) bereit.
Typischerweise bewirken relevante Analyten und geeignete Hostmaterialien (Rezeptoren), an die die zu untersuchenden Analyten binden können, keine inhärenten spektroskopischen Reaktionen (z. B. Fluoreszenz, Phosphoreszenz, UV-Aktivität etc.). Analyseverfahren unter Ausnutzung kompetitiver Bindungsreaktionen (Konkurrenzreaktionen) können dieses Problem überwinden. In derartigen kompetitiven Bindungsreaktionen wird üblicherweise ein Rezeptor-Indikator-Komplex (Trägermaterial-Indikator-Komplex) bereitgestellt, worin der Indikator an ein auch zur Bindung des zu bestimmenden Analyten geeignetes Trägermaterial (Hostmaterial, Rezeptor) gebunden vorliegt. Durch Verdrängung des Indikators aus dem Rezeptor-Indikator-Komplex bei kompetitiver Bindung des Analyten wird der Indikator freigesetzt und erzeugt dadurch eine messbare Signaländerung. Derartige indirekte Sensormethoden sind in der biologischen, pharmazeutischen und supramolekularen Analytik weit verbreitet und darin erfolgt die Bestimmung der Analyten durch Messung der spektroskopischen Antwort des Indikators in gebundenem und ungebundenem Zustand. Derartige indirekte Assays umfassen insbesondere sogenannte Competition-Binding-Assays (CBA) bzw. Indicator-Displacement-Assays (IDA). Diesen CBA- bzw. IDA-Verfahren liegt das Prinzip einer kompetitiven Verdrängungsreaktion des gebundenen Indikators aus dem Rezeptor (Trägermaterial) durch den Analyten zugrunde.
Dabei geben alle Analyten im IDA bzw. CBA die gleiche Art von Antwort, z. B. eine Änderung in der Intensität eines spektroskopischen Signals. Damit sind die untersuchten Analyten jedoch nur durch die unterschiedliche Größe der Signaländerung, die sie verursachen, unterscheidbar. Stärker bindende Analyten verdrängen mehr Indikator und liefern somit stärkere Signale als schwach bindende Analyten, vorausgesetzt alle treten in der gleichen Konzentration auf. Allerdings können auch schwach bindende Analyten eine starke spektroskopische Antwort liefern, nämlich wenn sie in einer höheren Konzentration auftreten. Somit können Analyte in einem herkömmlichen IDA- bzw. CBA-Verfahren in der Praxis nicht qualitativ unterschieden werden, da die Konzentration eines Analyten typischerweise unbekannt ist.
Stand der Technik:
Verfahren zur indirekten Bestimmung von Analyten mittels IDA (Indicator-Displacement-Assay) sind bekannt. Diese werden jedoch ausschließlich in einer thermodynamischen Verfahrensführung durchgeführt, d.h. das durch den Indikator erzeugte Signal wird zu einem festen Zeitpunkt, typischerweise nach Einstellung des Gleichgewichts der Konkurrenzreaktion, gemessen und der Auswertung zugrunde gelegt [z.B.: You, L.; Zha, D.; Anslyn, E. V.: „Recent Advances in Supramolecular Analytical Chemistry Using Optical Sensing", Chem. Rev. 2015, 115, 7840-7892; oder Nguyen, B. T.; Anslyn, E. V.: „Indicator-displacement assays", Coord. Chem. Rev. 2006, 250, 3118-3127]. Durch diese Art der thermodynamischen Messung sind die Möglichkeiten zur qualitativen und quantitativen Bestimmung unbekannter Analyten in unbekannter Menge aus den oben genannten Gründen jedoch stark eingeschränkt.
Die vorliegende Erfindung hingegen ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Analyten unabhängig von deren Konzentration in der Reaktionsmischung, indem eine kontinuierliche Messung der aufgrund der Konkurrenzreaktion erzeugten Signaländerung, und damit eine Aufzeichnung sowohl der kinetischen als auch der thermodynamischen Reaktionsdaten erfolgt.
Die Aufzeichnung kinetischer Daten und Verwendung derselben zur Differenzierung und Identifizierung von Analyten und zu deren Quantifizierung in Assays basierend auf kompetitiven Bindungsreaktionen wurde bisher nicht beschrieben. Zwar werden in einigen Publikationen zeitaufgelöste Messungen beschrieben, diese weichen jedoch von dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ab.
Auch werden kinetische Informationen über Antikörper-Antigen-Bindung häufig mit einem BIAcore-Setup zur Bestimmung von Affinitäten verwendet. Dies kann als kompetitiver Bindungsassay durchgeführt werden. Die BIAcore-Experimente erfordern jedoch eine Oberflächenimmobilisierung und verwenden im Gegensatz zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung keinen Indikator, sondern folgen der direkten Rezeptor-Analyt-Komplexbildung durch Änderungen des Brechungsindex an der Oberfläche, wo die Bindungswechselwirkung stattfindet. Außerdem wird nicht beschrieben, diese kinetischen Bindungsunterschiede zur Identifizierung verschiedener Analyten zu verwenden [Nieba L, Krebber A, Plückthun A.: „Competition BIAcore for Measuring True Affinities: Large Differences from Val-ues Determined from Binding Kinetics", Anal Biochem 1996, 234(2): 155-165].
Kinetische Prozesse wurden auch für Cucurbit[n]uril (CBn)-Komplexe untersucht, jedoch wurde die Identifizierung und Quantifizierung von Analyten hierbei nicht beschrieben. Diese Studien wurden für ein grundlegendes Verständnis des tatsächlichen Bindungsereignisses durchgeführt. Kinetische Parameter wurden durch Stopped-Flow-Techniken auf 1:1-Host: Gast-Wechselwirkungen abgeleitet. Beispiele für derartige Untersuchungen mit CBn sind z.B. beschrieben durch E. Masson, M. Raeisi, K. Kotturi: „Kinetics Inside, Outside and Through Cucurbiturils", Isr. J. Chem., 10.1002/ijch.201700120; Miskolczy Z, Biczok L, Jablonkai I.: „Kinetics of the reversible inclusion of flavopereirine in cucurbit[7]uril", Phys Chem Chem Phys 2017, 19(1): 766-773; Z. Miskolczy, L. Biczok: „Kinetics and thermodynamics of berberine inclusion in cucurbit[7]uril"; J. Phys. Chem. B 2014, 118, 2499-2505; Z. Miskolczy, L. Biczok: „Sequential Inclusion of Two Berberine Cations in Cucurbit[8]uril Cavity: Kinetic and Thermodynamic Studies", Phys. Chem. Chem. Phys. 2014, 16, 20147-20156; Appel EA, Biedermann F, Hoogland D, del Barrio J, Driscoll MD, Hay S, et al.: „Decoupled Associative and Dissociative Processes in Strong yet Highly Dynamic Host-Guest Complexes", J Am Chem Soc 2017, 139(37): 12985-12993; oder Tang H, Fuentealba D, Ko YH, Selvapalam N, Kim K, Bohne C.: „Guest Binding Dynamics with Cucurbit[7]uril in the Presence of Cations", J Am Chem Soc 2011, 133(50): 20623-20633.
In einigen Fällen wurden CBn-IDA basierte Verfahren verwendet, um den Kinetik- / Reaktionsfortschritt von enzymatischen, chemischen und biophysikalischen Prozessen zu überwachen, aber die IDA-Reaktionskinetik wurde dadurch nicht genutzt. Tatsächlich ist es dabei erforderlich, dass die IDA-Kinetik schneller ist als die Bioreaktion oder der biophysikalische Prozess, der überwacht werden soll. Die Identifizierung und Quantifizierung von unbekannten Analyten basierend auf kinetischer IDA-Information wurde nicht beschrieben. Einige Beispiele für Untersuchungen mit CBn IDA Sensing Ensembles sind beschrieben in Ghale G, Nau WM.: „Dynamically Analyte-Responsive Macrocyclic Host-Fluorophore Systems", Acc Chem Res 2014, 47(7): 2150-2159 (und darin zitierte Fundstellen); Biedermann F, Hathazi D, Nau WM.: „Associative chemosensing by fluorescent macrocycle-dye complexes - a versatile enzyme assay platform beyond indicator displacement.“, Chem Commun 2015, 51(24): 4977-4980; oder Biedermann F, Nau WM.: „Noncovalent Chirality Sensing Ensembles for the Detection and Reaction Monitoring of Amino Acids, Peptides, Proteins, and Aromatic Drugs“, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53(22): 5694-5699.
Die Firma HORIBA hat eine gebrauchsfertige Messeinrichtung zum Nachweis der Bindungsaffinitäten von selektiv bindenden Analyten wie Antikörpern oder Affimeren an ihre Zielmoleküle auf der Grundlage der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) etabliert. Die Technik ist durch Immobilisierung der selektiv bindenden Analyten auf einem Goldsubstrat markierungsfrei. Die Bindung kann durch die Variation des SPR-Signals in Zeit und Konzentration verfolgt werden. Kinetische Kurven können detektiert und direkt an ein 1:1 Bindungsmodell angepasst werden. Die kinetischen Kurven dienen hier als Information über den Zeitablauf, der für das Auftreten des Bindungsereignisses benötigt wird, aber nicht zur Identifizierung der Analyten. Deren Identifizierung beruht auf der Bindungsaffinität des Analyten gegenüber seinem Komplement.
Die vorliegende Erfindung basiert im Wesentlichen darauf, dass gegenüber herkömmlichen CBA- bzw. IDA-Methoden eine umgekehrte kompetitive Bindungsreaktion zugrunde gelegt und protokolliert wird. Während in herkömmlichen CBA- bzw. IDA-Methoden, die darüber hinaus ausschließlich im thermodynamischen Modus durchgeführt werden (d.h. in der Regel nach der Gleichgewichtseinstellung des Systems), der Indikator durch einen Analyten aus dem Träger (Rezeptor, Host) verdrängt wird, wird im Verfahren der vorliegenden Erfindung der Analyt durch einen Indikator aus dem Träger (Rezeptor, Host) verdrängt und das dabei entstehende Signal des Indikators im Sinne eines umgekehrten Signalprotokolls aufgezeichnet. Diese Umkehrung der kompetitiven Bindungsreaktion ermöglichte überraschend eine verbesserte Analyt-Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen CBA- und IDA-basierten Verfahren.
Messverfahren unter Verwendung eines Analyt-Träger-Komplexes (ABA; Assoziativer-Bindungs-Assay / Analyt-Bindungs-Assay) wurden für Cucurbituril als Indikator und Zeolithe als Trägermaterialien beschrieben. Dabei handelt es sich bei solchen ABA-Verfahren jedoch nicht um kompetitive Bindungsreaktionen, da hierin ein Indikator zu einem Analyt-Träger-Komplex hinzugegeben wird und der Indikator zusätzlich zum Analyten - neben diesem - an den Träger bindet, ohne jedoch den Analyten aus dem Trägermaterial zu verdrängen und freizusetzen. Auch wurden solche ABA-Verfahren bisher ausschließlich unter thermodynamischer Verfahrensführung, nicht jedoch zur Messung und Auswertung der kinetischen Reaktionsdaten genutzt [Biedermann, F., Septiadi, D., Prasetyanto, E. A., Chen, P., De Cola, L.: „Highly selective artificial neurotransmitter receptors“, 2017 sowie EP20160305378A1 ]. Auch wurde bereits beschrieben, induzierten zirkulären Dichroismus (iCD) zur Identifizierung von chiralen Analyten mittels ABA (Assoziativer-Bindungs-Assay) zu verwenden [Nau, W.; Biedermann, F.: „Method for detecting a chiral analyte“, 2017 sowie EP2899531A1 ].
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschend gefunden, dass mit dem neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung basierend auf einer gegenüber IDA- und CBA-Verfahren umgekehrten kompetitiven Bindungsreaktion sowohl eine kinetische als auch thermodynamische Verfahrensführung möglich ist und damit überraschend nicht nur die Quantifizierung sondern auch eine Identifizierung verschiedener Analyten möglich ist. Es wurde außerdem überraschend gefunden, dass das neue erfindungsgemäße Verfahren auch eine verbesserte Analyt-Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen CBAs und IDAs ermöglicht.
Zusätzlich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch die Bestimmung von Bindungskonstanten (Affinitäten) für wasserunlösliche Substanzen (z.B. Arzneimittel, Toxine) mit wasserlöslichen / dispergierbaren Trägermaterialien (Rezeptoren / Hosts), wie z. B. Cyclodextrinen, BSA- und HSA-Proteinen, ohne die Notwendigkeit, organische Co-Lösungsmittel zu verwenden, wodurch ansonsten auftretende störende spektroskopische Fehlsignale und Bindungsartefakte sowie Biomolekül-Kompatibilitätsprobleme eliminiert werden können.
Aufgabenstellung:
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Verfahren zur Bestimmung von Analyten bereitzustellen, das die Nachteile der beschriebenen Verfahren nicht aufweist. Insbesondere bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein neues Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung unbekannter Analyten bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Verfahren mit verbesserter Analyt-Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen CBAs und IDAs bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Verfahren auf Basis kompetitiver Bindungsreaktionen zur Bestimmung von Bindungskonstanten (Affinitäten) für wasserunlösliche Substanzen mit wasserlöslichen / dispergierbaren Trägermaterialien (Rezeptoren / Hosts) bereitzustellen, ohne die Notwendigkeit, organische Co-Lösungsmittel zu verwenden.
Beschreibung der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend näher beschrieben und umfasst insbesondere die folgenden Ausführungsformen:

[1] Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten umfassend die Schritte
1. a) Bereitstellen eines zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und mindestens eines Indikators geeigneten Trägermaterials,
2. b) Zugabe der zu bestimmenden Analyten zu dem unbeladenen Trägermaterial und Bindung der Analyten an das Trägermaterial,
3. c) Zugabe mindestens eines Indikators und kompetitive Bindung des Indikators an das Trägermaterial,
4. d) Messung des durch den Indikator in der kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial erzeugten Signals.
[2] Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform [1], worin Schritt b) vor Schritt
- c) durchgeführt wird und in Schritt c) der Indikator an das Trägermaterial unter Verdrängung und Freisetzung des Analyten aus dem Trägermaterial bindet.
[3] Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform [1], worin die Schritte b) und c) gleichzeitig durchgeführt werden und die zu bestimmenden Analyten und der mindestens eine Indikator in einer kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial binden.
[4] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin in Schritt d) die Bestimmung der Analyten durch kontinuierliche Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion unter Erhalt eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils der kompetitiven Bindungsreaktion erfolgt.
[5] Verfahren gemäß Ausführungsform [4], worin eine qualitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt.
[6] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion zu einem definierten Zeitpunkt oder nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven Bindungsreaktion und eine quantitative Bestimmung der Analyten aus dem so erhaltenen thermodynamischen Messwert erfolgt.
[7] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin eine qualitative und quantitative Bestimmung der Analyten aus den kinetischen und thermodynamischen Messdaten erfolgt.
[8] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die qualitative Bestimmung der Analyten durch Vergleich des kontinuierlichen (kinetischen) spektroskopischen Profils mit Referenzdaten erfolgt.
[9] Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die quantitative Bestimmung der Analyten durch Vergleich der thermodynamischen Daten zu einem gesetzten Zeitpunkt, insbesondere nach Einstellung des Gleichgewichts, der kompetitiven Bindungsreaktion mit einer definierten Menge eines Referenzstandards erfolgt.
[10] Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die zu bestimmenden Analyten wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen sind, insbesondere Hormone und Steroide wie 19-Nortestosteron, Progesteron, β-Estradiol, Prednisolon; Arzneistoffe bzw. Toxine wie Nicotin, Phenylbutazon, Tetracyclin und Warfarin; Metabolite und Neurotransmitter wie Typtamin, Serotonin, Histamin und Spurenamine wie Spermidin.
[11] Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend wasserlösliche makrozyklische Moleküle, wie insbesondere Cucurbit[n]urilen, Cyclodextrinen, Proteine wie BSA und HSA Proteine, sowie nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, umfassend Zeolithe, Organosilikate, metallorganische Gerüste (MOF) und kovalente organische Gerüstmaterialien (COF), wobei Cucurbit[n]urile und Zeolithe besonders bevorzugt sind.
[12] Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die zu bestimmenden Analyten wasserunlösliche Verbindungen sind und als Trägermaterialien wasserlösliche Moleküle aus der Gruppe bestehend aus Cucurbiturilen, Cyclodextrinen, BSA und HSA Proteinen oder wasser-dispergierbare nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, insbesondere Zeolithe, ausgewählt werden.
[13] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin die kompetitive Bindungsreaktion in einem wässrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird.
[14] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin das wässrige Reaktionsmedium frei von organischen Lösungsmitteln ist bzw. die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird.
[15] Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Indikator ausgewählt ist aus der Gruppe der UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktiven Farbstoffe, elektrochemoaktiven Farbstoffe, elektrochemilumineszenten Farbstoffe und chemolumineszenten Farbstoffe, insbesondere aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe.
[16] Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend in Schritt a) das Dispergieren des Trägermaterials in Wasser; in Schritt b) die Zugabe einer die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probenmatrix unter Bindung der in der Probenmatrix enthaltenen Analyten an das Trägermaterial; und Entfernung der verbleibenden Probenmatrix durch Waschen und/oder Zentrifugation nach Bindung der Analyten an das Trägermaterial.
[17] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, worin das kontinuierlich gemessene Signal ein Absorptionssignal, Fluoreszenzsignal, Phosphoreszenzsignal, Zirkulardichroismussignal (CD), Fluoreszenz-detektiertes Zirkulardichroismussignal (FDCD), zirkular polarisiertes Emissionsignal (CPL), Fluoreszenzanisotropiesignal / -polarisationssignal, Schwingungsspektroskopiesignal (Raman, IR) oder Kernspinresonanzsignal (NMR) ist.
[18] Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, welches Array-basiert durchgeführt wird.
[19] Assay zur Durchführung des gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und eines Indikators geeigneten Trägermaterials sowie mindestens einen Indikator.
[20] Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial in kompetitiven Bindungsassay zur indirekten Bestimmung von Analyten, wie insbesondere zur Verwendung in einem ADA-, SAIBA- oder IDA-Verfahren.
[21] Verwendung gemäß Ausführungsform [20] zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Analyten aus den kinetischen und/oder thermodynamischen Messdaten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten auf Basis einer kompetitiven Bindungsreaktion zwischen den zu bestimmenden Analyten und einem Signal-gebenden Indikator. Dabei unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren von herkömmlichen Verfahren wie z.B. CBA- und IDA-Methoden dadurch, dass die zu untersuchenden Analyten direkt mit dem unbeladenen Trägermaterial in Kontakt gebracht werden. Der gebundene Analyt wird entweder anschließend durch Zugabe eines geeigneten Indikators in einer kompetitiven Bindungsreaktion aus dem Trägermaterial verdrängt und freigesetzt, was als ADA-Verfahren oder ADA-Methode bezeichnet wird (ADA; Analyt-Displacement-Assay), oder Analyt und Indikator konkurrieren bei gleichzeitiger Zugabe zu dem unbeladenen Trägermaterial in der kompetitiven Bindungsreaktion um die freien Bindungsplätze, was als SAIBA-Methode bezeichnet wird (SAIBA; Simultaner Analyt-Indikator-Bindungs-Assay). Beide erfindungsgemäßen Reaktionen (ADA und SAIBA) basieren dabei auf einer kompetitiven Bindungsreaktion.
In den erfindungsgemäßen Verfahren (ADA und SAIBA) wird die Signaländerung, die durch die Bindung des zugesetzten Indikators an das Trägermaterial auftritt, gemessen und aufgezeichnet.
Bevorzugt erfolgt in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine kontinuierliche, d.h. zeitaufgelöste oder kinetische Messung und Aufzeichnung des durch den Indikator verursachten Signals. Diese kontinuierlichen Messdaten werden auch als kinetische Daten bezeichnet und diese ermöglichen eine qualitative Bestimmung und Identifizierung der untersuchten Analyten, was mit den herkömmlichen Messverfahren unter Erhebung der thermodynamischen Daten nicht möglich ist. Erfindungsgemäße Verfahren, worin eine kontinuierliche Messung der kompetitiven Bindungsreaktion gemessen wird und somit die kinetischen Daten dieser Reaktion erhoben werden, werden auch als kinADA bzw. kinSAIBA bezeichnet.
Die kinetische Verfahrensführung der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethoden ermöglicht sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung der untersuchten Analyten. Dabei kann das kinADA- und kinSAIBA-Verfahren so eingestellt werden, dass das zeitaufgelöste spektroskopische Reaktionsprofil (z. B. die Anfangsgeschwindigkeiten) nur von der Identität des Analyten abhängt, aber unabhängig von der Analytkonzentration ist. Dies bedeutet, dass die Identität des Analyten durch Vergleich mit Referenzdaten, die aus kinetischen spektroskopischen Reaktionsprofilen von Vergleichssubstanzen erhalten werden, festgestellt werden kann. Das kinetische spektroskopische Reaktionsprofil einer Verbindung stellt dabei eine Art „kinetischen Fingerabdruck“ dar, der zur Identifizierung der Analyten herangezogen werden kann.
Mit dem oben beschriebenen IDA-Verfahren kann unter kinetischer Verfahrensführung grundsätzlich keine Entkopplung von Identität des Analyten, dargestellt durch seine spezifischen Geschwindigkeitskonstanten für das Eindringen und den Austritt mit dem Trägermaterial, und dessen Konzentration erreicht werden. Darin ist die beobachtbare zeitaufgelöste Signaländerung anfänglich direkt proportional zu der inhärenten Eindring-/Bindungsrate und zu der Konzentration des Analyten (unbekannte Komponente), so dass es nicht möglich ist, im kinetischen IDA-Verfahren beide Parameter zu trennen. Im Gegensatz dazu kann mit der erfindungsgemäßen umgekehrten kompetitiven Bindungsreaktion im kinetischen Verfahrensmodus (kinADA, kinSAIBA) eine Entkopplung erreicht werden, dank der kontrollierbaren Variation einer bekannten Komponente (Trägermaterial, Indikator). Ein weiterer Nachteil der auf den bisherigen kompetitiven Reaktionen beruhenden Verfahren liegt darin, dass z.B. ein im kinetischen Modus geführtes IDA-Verfahren zu einer zu schnellen Reaktionskinetik für viele Träger-Analyt-Systeme führt, so dass jeweils sehr spezifische Messeinrichtungen (z. B. gestoppte Durchflußmessungen) für eine Messung des kinetischen Profils erforderlich wären. Dies ist für Routine-Meßanwendungen jedoch unpraktisch und unpraktikabel.
Neben der Auswertung dieser kinetischen Reaktionsprofile zur Identifizierung der untersuchten Analyten kann an einem bestimmten Reaktionszeitpunkt, z.B. nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven Bindungsreaktion, über die so erhaltenen thermodynamischen Messdaten außerdem die Konzentrationsbestimmung der Analyten erfolgen. Dies ist möglich, da die bekannte Komponente des Reaktionssystems, der Indikator, in ihrer Größenordnung (Konzentration, Überschuss) gesteuert werden kann.
Die Messung und Aufzeichnung der kontinuierlichen (kinetischen) Messdaten kann, muss jedoch nicht bis zur Gleichgewichtseinstellung erfolgen. Insbesondere bei sehr langsam verlaufenden Reaktionen kann die Identifizierung auch bereits aus den vor der Gleichgewichtseinstellung erhaltenen Profilen ermittelt werden und eine Quantifizierung kann auch zu einem gesetzten (definierten) Zeitpunkt vor Gleichgewichtseinstellung erfolgen, was unter praktischen und verfahrensökonomischen Gesichtspunkten vorteilhaft ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren kinADA und kinSAIBA können aufgrund ihrer einzigartigen kinetischen Geschwindigkeitsparameter so gesteuert werden, dass unterschiedliche, jeweils gesteuerte Konzentrationen von Trägermaterial (Host / Rezeptor) und Indikator eingesetzt werden, wodurch die erfindungsgemäßen Verfahren kinADA und kinSAIBA quantitative Informationen über die Analytkonzentration liefern und gleichzeitig zur Identifizierung der Analyten verwendet werden können. Alternativ kann zuerst die Identität des Analyten bestimmt werden, z.B. mittels dem erfindungsgemäßen kinADA- oder kinSAIBA-Verfahren mit einem vorhandenen Überschuss an Indikatorfarbstoff, und die erhaltene Information kann anschließend verwendet werden, um die Durchführung eines zweiten ADA- oder SAIBA-Verfahrens in einem thermodynamischen oder kinetischen Modus anzupassen, um die Konzentration des Analyten zu ermitteln.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wie insbesondere der kinADA- und kinSAIBA-Verfahrensvariante liegt darin, dass auch Mischungen von Analyten analysiert werden können und daraus sowohl die Identität der verschiedenen Analyten als auch deren Konzentrationen bestimmt werden können.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Verfahren auch eingesetzt werden, um über die thermodynamische Verfahrensführung die Bindungskonstanten (Affinitäten) wasserlöslicher und wasserunlöslicher Substanzen (z.B. Arzneistoffe, Hormone, Duftstoffe, Geschmacksstoffe (Aromen) mit wasserlöslichen Trägermaterialien, wie z.B. Cyclodextrinen, BSA- und HSA-Proteinen, zu ermitteln, ohne die Notwendigkeit, organische Co-Lösungsmittel einzusetzen. Die Möglichkeit zum Verzicht auf organische Co-Lösungsmittel ist dabei gegeben, weil in dem erfindungsgemäßen ADA-Verfahren die wasserlöslichen Träger-Analyt-Komplexe mit wasserlöslichen Indikatoren in einem wässrigen Reaktionssystem in Konkurrenz treten. Im Gegensatz dazu muss bei herkömmlichen IDA- und CBA-Verfahren die Analyt-Lösung zu der Lösung des Träger-Indikator-Komplexes titriert werden, was bedeutet, dass für wasserunlösliche Analyten organische Lösungsmittel benötigt werden. Diese Verfahren können selbstverständlich auch im kinetischen Modus zur Identifizierung wasserunlöslicher Analyte eingesetzt werden.
Bevorzugt werden in solchen Systemen zur Bestimmung wasserunlöslicher Analyten als Trägermaterialien wasserlösliche Moleküle aus der Gruppe bestehend aus Cucurbiturilen, Cyclodextrinen, BSA und HSA Proteinen oder wasser-dispergierbare nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, wie insbesondere Zeolithe, ausgewählt.
In derartigen Verfahrensvarianten werden außerdem bevorzugt wasserlösliche Indikatoren eingesetzt.
Die Bestimmung wasserunlöslicher Analyte mit den erfindungsgemäßen Verfahren auf Basis kompetitiver Bindungsreaktionen erfolgt bevorzugt in einem wässrigen Reaktionsmedium. Dabei ist es außerdem bevorzugt, dass das wässrige Reaktionsmedium frei von organischen Lösungsmitteln ist und somit die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „wässriges Reaktionsmedium / wässrige Reaktionsmedien“ sowohl reines Wasser als auch Wasser-basierte Lösungen, die weitere wasserlösliche Komponenten enthalten können. Derartige wässrige Reaktionsmedien oder wässrige Lösungen sind somit bevorzugt hydrophile Reaktionslösungen auf Wasserbasis, die im Wesentlichen frei von unpolaren organischen Lösungsmitteln oder Extraktionsmitteln sind. Wasserlösliche (hydrophile) Komponenten, die in den wässrigen Reaktionsmedien der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, umfassen insbesondere polare Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Propanol (n-Propanol, i-Propanol), Butanol (n-Butanol, i-Butanol, tert-Butanol) etc., sowie Puffersubstanzen, insbesondere solche zur Einstellung biologisch relevanter Puffersysteme, beispielsweise Phosphatpuffer, HEPES, TRIS, MOPS, MES, PIPES etc.. Wässrige Reaktionsmedien im Sinne der vorliegenden Erfindung können außerdem organische Säuren, wie beispielsweise CF₃COOH, CH₃COOH, p-Toluolsulfonsäure etc., oder anorganische Säuren, wie beispielsweise HCl, HBr, HF, H₂SO₄, H₃PO₄ etc., oder anorganische Basen wie beispielsweise LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)₂, Ba(OH)₂, Li₂CO₃, K₂CO₃, Na₂CO₃, NaHCO₃, etc., oder organische Basen, wie beispielsweise Amine wie Triethylamin, Diethylisopropylamin, Bu₄NOH, Piperidin, Morpholin, Alkylpyridine etc., enthalten. Daraus resultierend sind auch komplexe Medien wie etwa PBS oder Urin als wässrige Reaktionsmedien zu betrachten.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Verfahren auch zur Bestimmung von Analyten in einer inhomogenen Matrix angewendet werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es gegenüber herkömmlichen Verfahren wie IDA und CBA möglich, die zu untersuchende Probe direkt einzusetzen und darin enthaltene Matrixbestandteile nach der Bindung der Analyten durch geeignete Reinigungsschritte wie Waschen oder Zentrifugieren zu entfernen, bevor die kompetitive Bindungsreaktion und Signalerfassung erfolgt. Das Entfernen von derartigen Matrixkomponenten ist aus praktischen Gründen bevorzugt, aber bei herkömmlichen IDA- oder CBA-Verfahren nicht möglich, da mit dem Waschen auch die Entfernung des aus dem Trägermaterial verdrängten Indikatorfarbstoffs erfolgt und somit die Signalgebung verfälscht wird.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine derartige Reinigung und Entfernung störender Matrixbestandteile erreicht werden, indem z.B. das Trägermaterial (Host / Rezeptor) in Wasser dispergiert und mit der die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe getränkt oder anderweitig in Kontakt gebracht wird. Die Analyten binden an das Trägermaterial. Die Matrix wird anschließend abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren oder Waschen, wobei das mit Analyt beladene Trägermaterial zurückgehalten wird.
Anschließend wird der Indikator zu dem Analyt-beladenen Trägermaterial (Träger-Analyt-Komplex) hinzugefügt und die Signalmessung durchgeführt. Diese Verfahrensvariante eignet sich besonders für die erfindungsgemäßen ADA- und kinADA-Verfahren.
Allerdings ist diese Art der Analyt-Zugabe grundsätzlich auch für die SAIBA-Verfahrensvariante möglich, worin Analyt (in der Probenmatrix) und Indikator gleichzeitig mit dem Träger in Kontakt gebracht werden. Hierin erfolgt die Abtrennung der Probenmatrix dann nach Bindung von Analyt und Indikator an den Träger.
In der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante, worin die kompetitive Bindungsreaktion durch gleichzeitiges Inkontaktbringen der Analyten und des Indikators mit dem unbeladenen Trägermaterial erfolgt (SAIBA, kinSAIBA), werden entweder Analyt und Indikator gleichzeitig zu dem unbeladenen Trägermaterial hinzugegeben, oder das unbeladene Trägermaterial wird zu einer Mischung des Analyten und des Indikators gegeben. Die kinetische Verfahrensführung dieser Variante wird auch als kinSAIBA bezeichnet. In der kinSAIBA-Verfahrensführung werden indikative kinetische Profile beobachtet, die „Spitzen“ oder „keine Spitzen“ aufweisen, abhängig von den individuellen Eindring- und Austrittsraten des Analyten und des Indikators für das eingesetzte Trägermaterial. Diese Verfahrensführung ermöglicht eine Klassifizierung von Analyten in Bezug auf einen ausgewählten Indikatorfarbstoff. Bei Anwendung dieser Bestimmungsmethode in einer Array-basierten Verfahrensführung (z. B. mit verschiedenen Indikatoren und / oder Trägermaterialien) kann die Analytklassifizierung zusätzlich verbessert werden und die Analytidentifizierung kann durch Erkennung von Mustern binärer Informationen („Spitzen“ oder „keine Spitzen“) erreicht werden. Darüber hinaus bietet kinSAIBA durch die Analyse der kinetischen Profile auch Möglichkeiten zur Identifizierung und Quantifizierung von Analyten, die mit denen von kinADA vergleichbar sind.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ADA, kinADA, SAIBA und kinSAIBA können grundsätzlich in allen Arten von Verfahrensführungen durchgeführt werden, die auch für IDA- bzw. CBA-Verfahren bekannt sind. So ist eine Verfahrensführung in Küvetten, in Mikrotiterplatten, in mikrofluiden Vorrichtungen, auf Oberflächen (Deckgläser, Chips) möglich. Zur qualitativen Identifizierung der zu bestimmenden Analyten ist die Möglichkeit der Messung zeitaufgelöster Signale, also kontinuierlich Messung und Aufzeichnung, die einzige Anforderung für die erfindungsgemäßen kinADA- und kinSAIBA-Verfahren.
Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung können sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche Verbindungen (Analyte) bestimmt werden. Dabei können sowohl natürlich vorkommende als auch künstliche Verbindungen sowie unnatürliche Verunreinigungen bestimmt werden. Beispiele natürlich vorkommender Verbindungen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Hormone, Neurotransmitter, Metabolite, Spurenamine, körpereigene Substanzen, Kohlenhydrate, natürlich vorkommende Kationen und Anionen, natürlich vorkommende medizinisch wirksame Verbindungen (Arzneistoffe, Medikamente), natürlich vorkommende Toxine, sowie (natürliche und künstliche) Duft- und Geschmacksstoffe.
Beispiele für Hormone, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Steroide, Proteine, Aminosäurederivate sowie Peptidhormone, wie z.B. β-Estradiol Progesteron, Testosteron, Prednisolon, Insulin, Adrenalin und Somatostatin.
Beispiele für Neurotransmitter, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Serotonin, Acetylcholin und Histamin.
Beispiele für Metabolite und Spurenamine, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Aminosäurederivate und Aminosäureabbauprodukte, wie z.B. Tryptophanamid, Cadaverin, Spermidin und Tryptamin.
Beispiele für körpereigene Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Aminosäuren, Peptide und Proteine, wie z.B. Phenylalanin, Phe-Ala-Val-Gly, His-Ala, Trp-Gly, und Insulin.
Beispiele für Kohlenhydrate, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Zucker, wie z.B. Mannose.
Beispiele für Kationen und Anionen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Mineralien, Spurenelemente, Schwermetallionen, Phosphate und Carboxylate wie z.B. Na⁺, Ca²⁺, K⁺ etc., Fe²⁺, Fe³⁺, Ce⁺, Cd⁺ etc., Ru²⁺, Pd²⁺, Hg⁺ etc., Pyrophosphate, Aminosäuren etc..
Natürlich vorkommende medizinisch wirksame Verbindungen (Arzneistoffe, Medikamente), die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Antidiabetika, ACE Hemmer, Nichtsteroidale Antirheumatika, Sympathomimetika, und Antibiotika, wie z.B. Metformin, Lisinopril, Naproxen, Amphetamin, Teixobactin, Tetracyclin etc..
Natürlich vorkommende Toxine, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Alkaloid und Nitrosamine, wie z.B. Nikotin, Sanguinarin und (4-Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon.
Beispiele für künstliche Verbindungen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen Anabolika, Pestizide und künstliche Geschlechtshormone, wie z.B. künstliche Steroide, Insektizide und Fungizide, wie beispielsweise 19-Nortestosteron, Pralidoxim, Trifloxystrobin und Ethinylestradiol.
Beispiele für unnatürliche Verunreinigungen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, umfassen fossile Abfälle wie Öl und Kohle, insbesondere polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), wie z.B. Biphenyl, Napthalin und Fluoren.
Beispiele für in den Verfahren der vorliegenden Erfindung einsetzbare Indikatoren umfassen UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktive Farbstoffe, elektrochemoaktive Farbstoffe, elektrochemilumineszente Farbstoffe und chemolumineszente Farbstoffe.
Im Prinzip sind Indikatoren einsetzbar, die ein messbares Signal abgeben und mittels Fluoreszenz-, Absorptions-, Elektrochemilumineszenz-Methoden, mittels Zirkulardichroismus (CD), Fluoreszenz-detektiertem Zirkulardichroismus (FDCD), zirkular polarisierter Emission (CPL), Fluoreszenzanisotropie / -polarisation, Schwingungsspektroskopie (Raman, IR) oder mittels Kernspinresonanz (NMR), Elektronenspinresonanz- oder Potentiometrie-Methoden gemessen werden können.
Beispiele für Fluoreszenz- oder Absorptions-Indikatoren umfassen Aromaten, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), polyzyklische heteroaromatische Kohlenwasserstoffe, Carbazolfarbstoffe, Acridinfarbstoffe, Alkaloidfarbstoffe, Xanthenfarbstoffe, Bodipyfarbstoffe, Diazafarbstoffe, Quinoniminfarbstoffe und Metallkomplexe.
Beispiele umfassen DAPI, 1,8 ANS, AEC, Proflavin, Berberin, Lucigenin, Dapoxyl, MDPP, MDAP, Acridin Orange, Fluorescin, Rhodamin 6G, Pyronin Y, Dansylamid, BD140, Kernechtrot, Rubipy, Irbipy und Methylenblau sowie Xe129, F19, P31, TEMPO, Ferrocen, Methylviologen und Luciferin.
Bevorzugt werden Indikatoren aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe bzw. wasserlösliche Indikatoren eingesetzt.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Trägermaterialien (Hostmaterialien, Rezeptoren) müssen grundsätzlich zur Bindung der zu bestimmenden Analyten sowie mindestens eines Indikators, mit dem die zu bestimmenden Analyten um die Bindungsplätze im Trägermaterial konkurrieren, geeignet sein. Beispiele umfassen organische Trägermaterialien, anorganische poröse Trägermaterialien, insbesondere nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, sowie Protein-Rezeptoren als Trägermaterialien.
Beispiele organischer Trägermaterialien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bindung von Analyt und Indikator eingesetzt werden können, umfassen Makrozyklen, offene Rezeptoren und acyclische Hostmaterialien.
Beispiele für Makrozyklen umfassen Cucurbit[n]urile wie CB5, CB6, CB7 und CB8; Cyclodextrine wie α-Cyclodextrin (aCD), β-Cyclodextrin, (βCD), γ-Cyclodextrin (yCD) und Aminocyclodextrin (AminoCD); Calix[n]arene wie CX4, CX5, CX6, und Sulfonatocalix[n]arene wie SC4, SC5 und SC6; Pillarene wie Pillar[5]arene und DMPillar[5]arene; Cyclophane wie bipyCP (Cyclobis(paraquat-p-phenylene) (CAS: 117271-76-8) und CP66 (1,1,8,8,22,22,29,29-Octamethyl-1,8,22,29-tetraazonia[8.1.8.1]paracyclophan tetrachlorid (CAS: 92901-70-7); Kronenether wie 18Krone6, 15Krone5 und DiAza18Krone6, Lariatether wie CholesterylAza18Krone6 sowie [2.2.2]Kryptanten und [2.2.2]Cyclopeptide. Daraus sind besonders bevorzugte Trägermaterialien Cucurbit[n]urile und Cyclodextrine, insbesondere Cucurbit[n]urile.
Beispiele für offene Rezeptoren umfassen multivalente Rezeptoren, acyclische Hostmaterialien und Metallkomplexe, wie z.B. 2-(Guanidiniocarbonyl)pyrrol, ClipP (Bis(tetrabutylammonium)-6,8,15,17-tetrahydro-6,17:8,15-dimethanoheptacen-7,16-Bis-methylphosphonat), TweezerP (Bis(lithium)-(5R,7R,9R,11R,16R,18R,20R,22R)-5,7,9,11, 16,18,20,-22-octahydro-5,22:7,20:9,18:11,16-tetramethanononacen-8,19bismethyl-phosphonat), acyclische Cucurbiturile oder acyclische Polyglycolurile mit n Glycoluril Einheiten (aCB[n]), wie beispielsweise aCB4 (acyclisches Polyglycoluril mit n=4 Glycoluril Einheiten / acyclisches Cucurbituril mit n=4 Glycoluril Einheiten), Ni-, Zn-Porphyrine und Phthalcyanine, Pd(en)Cl₂, Dichloro(p-cymen)ruthenium(II). Daraus sind besonders bevorzugte Trägermaterialien (bevorzugte offene Rezeptoren) 2-(Guanidiniocarbonyl)pyrrol und TweezerP.
Beispiele für poröse Trägermaterialien, insbesondere nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bindung von Analyt und Indikator eingesetzt werden können, umfassen MOFs (metal organic frameworks) wie ZIF-8, MOF-210, MOF-200,Cu₃(BTC)₂(H₂O)₃, kovalente organische Gerüstmaterialien (COFs), Organosilikate sowie Zeolithe wie ZeoA, Nanozeolith, ZeoL und ZeoY. Daraus sind besonders bevorzugte Trägermaterialien Zeolithe.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschend gefunden, dass insbesondere Zeolithe als Trägermaterialien zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Zeolithe werden üblicherweise als Wasserenthärter bzw. Komplexierungsmittel in der Wasserreinigung und -aufbereitung eingesetzt. Die Bindung und Komplexierung von Mineralien in Zeolithe ist somit bekannt. Die Bindung von Indikator-Farbstoffen in einer kompetitiven Analytbestimmung wurde für Zeolithe als Trägermaterial (Hostmaterial, Rezeptor) bisher noch nicht beschrieben. Dies gilt für die erfindungsgemäßen Verfahren, aber auch für herkömmliche indirekte Messungsverfahren wie die oben beschriebenen IDA bzw. CBA-Verfahren. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial (Hostmaterial oder Rezeptor) in IDA-, CBA-, ADA- (und kinADA-) und SAIBA- (und kinSAIBA-) Verfahren. Der Vorteil von Zeolithen liegt dabei in der Reduzierung der Bindungsreaktionsgeschwindigkeit.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur qualitativen Bestimmung / Identifizierung von Analyten mittels kontinuierlicher (zeitaufgelöster) Messung in einem IDA- (bzw. CBA-), ADA-, kinADA- oder kinSAIBA-Verfahren mit einem Trägermaterial aus der Gruppe der Zeolithe. Dabei erfolgt die Auswertung der kinetischen Daten über Referenzprofile (kinetische Fingerabdrücke) wie oben bereits beschrieben.
Beispiele von Protein-Rezeptoren als Trägermaterialien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bindung von Analyt und Indikator eingesetzt werden können, umfassen Transportproteine, Antikörper und Nucleinsäuren wie z.B. HSA, BSA, Immunoglobulin A, Immunoglobulin D, Immunoglobulin G, DNA und RNA. Daraus sind besonders bevorzugte Protein-Rezeptoren als Trägermaterialien HSA und BSA.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden besonders bevorzugt die folgenden Kombinationen von Trägermaterial, Analyt und Indikator eingesetzt:
Typische Signalerfassungsverfahren umfassen Absorptions-, Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-, Zirculardichroismus (CD), Fluoreszenz-detektierter Zirkulardichroismus (FDCD), zirkularpolarisierte Emission (CPL), Fluoreszenzanisotropie / -polarisation, Vibrationsspektroskopie (Raman, IR) und magnetische Kernresonanz sein (NMR). Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind Fluoreszenz-, Fluoreszenzanisotropie- und Absorptionsspektroskopie.
Analog zu den etablierten IDA-Methoden können die erfindungsgemäßen ADA-, kinADA-, kinSAIBA- und kinABA-Verfahren Array-basiert unter Verwendung von mehreren chemosensitiven Ensembles durchgeführt werden, um die Analyt-Differenzierung und Quantifizierung zu verbessern. Die Bedingungen für eine Array-basierte Verfahrensführung sind grundsätzlich bekannt.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Assays zur Durchführung der hierin beschriebenen ADA, kinADA, SAIBA und kinSAIBA-Verfahren, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und des mindestens einen Indikators geeigneten Trägermaterials sowie mindestens einen Indikator. Bezüglich bevorzugter Trägermaterialien und/oder Indikator-Komponenten solcher erfindungsgemäßer Assays und bevorzugter Kombination derselben wird auf die vorstehenden Ausführungen Bezug genommen.
Figurenliste

1 Prinzip eines (thermodynamischen) ADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung
2 Prinzip eines herkömmlichen (thermodynamischen) IDA-Verfahrens
3 Illustration des Prinzips einer kompetitiven Bindung von zwei Analyten mit einem Indikator-Rezeptor-Paar gemäß einem herkömmlichen IDA-Verfahren. Analyten können ähnliche Affinitäten für den Rezeptor (Trägermaterial) aufweisen, so dass ein ähnlicher Grad an Indikatorverdrängung auftritt, oder ein ähnlicher Grad an Indikatorverdrängung ist auch messbar, wenn eine schwach bindender Analyt in hoher Konzentration mit einem stark bindenden Analyten in niedriger Konzentration verglichen wird. Die Analytendifferenzierung ist dann mittels herkömmlichem IDA-Verfahren im thermodynamischen Modus unmöglich.
4 Illustration des Grundprinzips eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, dargestellt durch einen Fluoreszenzassay basierend auf einem Indikator (z.B. Berberinchlorid), der außerhalb des Rezeptors (z.B. CB7) fast nicht fluoresziert, aber nach dem Verdrängen des Analyten stark emissiv wird.
5 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 1 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung (5a) im Vergleich zu einer herkömmlichen kinetischen IDA-Messung (5b); die kinetischen Profile für 19-Nortestosteron werden angezeigt (obere Kurve IDA, untere Kurve ADA)
6 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 2 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit Zeolith L als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator. Die einzelnen kinetischen Profile von Tryptamin, Nikotin und Spermidin sind dargestellt (obere Kurve Spermidin, untere Kurve Nicotin). Der Einschub zeigt die normalisierten kinetischen Profile (obere Kurve Spermidin, mittlere Kurve Tryptamin, untere Kurve Nicotin).
7 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und einer Analytmischung; die einzelnen kinetischen Profile von 19-Nortestosteron und Testosterone sind dargestellt (obere Kurve Nortestosteron, mittlere Kurve Nortestosteron/Testosteron, untere Kurve Testosteron).
8 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB7 als Trägermaterial und einer Analytmischung; die einzelnen kinetischen Profile von 19-Nortestosteron und β-Estradiol sind dargestellt (obere Kurve β-Estradiol, mittlere Kurve β-Estradiol/ 19-Nortestosteron, untere Kurve 19-Nortestosteron).
9 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 4 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit HSA als Trägermaterial und Dansylamid als Indikator; die einzelnen kinetischen Profile von Phenylbutazon und Tetracyclin sind dargestellt (gemessene Emissionsintensität; obere Kurve Phenylbutazon, untere Kurve Tetracyclin).
10 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 5 eines kinADA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit HSA als Trägermaterial und Dansylamid als Indikator; die einzelnen kinetischen Profile von Phenylbutazon und Tetracyclin sind dargestellt (normalisierte Intensität; Zuordnung der Kurven von oben nach unten auf Höhe von t = 0 s obere Kurve Phenylbutazon, untere Kurve Tetracyclin).
11 Darstellung der kinetischen Profile ausgewählter Analyten (Steroide) bestimmt mittels kinADA-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator (Zuordnung der Kurven von oben nach unten auf Höhe von t = 30 s: 19-Nortestosteron, Progesteron, Testosteron, Prednisolon.
12 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 6: Darstellung der Einstellung der kinetischen Parameter von Testosteron und Progesteron gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB8 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator. Die angezeigten Werte stellen Mittelwerte aus verschiedenen Analytkonzentrationen dar.
13 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 8: Darstellung der Konzentrationsbestimmung. Links: Konzentrationsabhängige kinetische Profile bestimmt mittels kinADA mit limitierender Indikatorkonzentration. Die Konzentration von Trägermaterial (CB7) und Indikator (Berberinchlorid) wurden konstant gehalten und die Analytkonzentration (19-Nortestosteron) wurde variiert. Rechts: Kalibrierkurve für 19-Nortestosteron aus der äquilibrierten Emissionsintensität.
14 Ergebnis von Ausführungsbeispiel 10 eines kinSAIBA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit CB7 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator; das kinetische Profil für 19-Nortestosteron wird angezeigt
15 Gegenüberstellung der erfindungsgemäßen thermodynamischen kompetitiven Bindungsassays der vorliegenden Erfindung ADA (15a) und SAIBA (15b) mit dem herkömmlichen thermodynamischen kompetitiven Bindungsassay IDA (15c) sowie dem Literaturwert (15d) zur Bestimmung der Bindungskonstanten Nandrolon mit CB7 als Trägermaterial und Berberinchlorid als Indikator in Wasser; die angegebenen Werte stellen Mittelwerte einer Dreifachbestimmung bei T=25 °C dar.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher beschrieben, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
Beispiele
Allgemeine Beschreibung eines kinADA-Verfahrens:
Ein geeignetes Trägermaterial wird zusammen mit der Analytlösung (wässrig, gepuffert) gelöst / suspendiert und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird ein Indikator in vorbekannter Konzentration hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird kontinuierlich über die Zeit aufgezeichnet.
Ausführungsbeispiel 1 eines kinADA-Verfahrens:
2 ml einer Mischung von 6,2 µM CB7 (Trägermaterial) und 7,1 µM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,7 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 5a im Vergleich mit einem herkömmlichen IDA-Verfahrens im kinetischen Modus (5b).
Ausführungsbeispiel 2 eines kinADA-Verfahrens:
2 ml einer Mischung aus 238 µg / ml Zeolith L (Trägermaterial) und 9,5 µM L-Nicotin (Analyt, Toxin) oder 9,5 µM Tryptamin (Analyt, Metabolit) oder 9,5 µM Spermidin (Analyt, Spurenamin) in Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,2 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 6.
Ausführungsbeispiel 3 eines kinADA-Verfahrens:
2 ml einer Mischung von 6,2 µM CB8 (Trägermaterial) und 7,0 µM 19-Nortestosteron (Analyt I, Steroid) und 7,2 µM Testosteron (Analyt II, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,4 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 7.
In gleicher Weise wurde ein kinADA-Verfahren mit 3,1 µM CB7 als Trägermaterial, 18,9 µM Berberinchlorid als Indikator sowie 7,0 µM 19-Nortestosteron (Analyt I, Steroid) und 7,0 µM β-Estradiol (Analyt II, Steroid) als Analyt-Mischung in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) durchgeführt.
Das Ergebnis zeigt 8.
Ausführungsbeispiel 4 eines kinADA-Verfahrens:
2 ml einer Mischung von 9,3 µM Humanem Serumalbumin (HSA, Trägermaterial) und 46,5 µM Tetracyclin (Analyt I, Antibiotikum) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PS-Fluoreszenzküvette bei 8 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Dansylamid (Seite I-spezifischer Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 93,0 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 480 nm mit einer Anregungswellenlänge von 350 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 9.
Ausführungsbeispiel 5 eines kinADA-Verfahrens:
2 ml einer Mischung von 9,3 µM Humanem Serumalbumin (HSA, Trägermaterial) und 46,5 µM Phenylbutazon (Analyt I, Antibiotikum) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PS-Fluoreszenzküvette bei 8 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Dansylamid (Seite I-spezifischer Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 93,0 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 480 nm mit einer Anregungswellenlänge von 350 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 10.
Die Unterdrückung beobachtbarer Parameter ist ein Schlüsselmerkmal in der analytischen Chemie. Eine Klassifizierung der Analyten kann durch die Analyse der Anfangsraten erzielt werden. Die Anfangsraten wurden für CB8 / Steroid-Komplexe und für CB7 / Steroid-Komplexe und Mischungen bestimmt. Die in den folgenden Tabelle dargestellten Anfangsraten können verwendet werden, um die Analyten zu identifizieren, und helfen auch bei der Interpretation der erhaltenen Kurven (11).
Die kinetischen Parameter, d.h. die Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation (k₁) und Dissoziation (k_-1), stellen die Basis für die konzentrationsunabhängige Identifizierung von Analyten. Die Anpassung dieser Parameter an bekannte Kinetiken des Indikators kann Software gesteuert erfolgen.
Die Bindungskonstanten der Steroide Testosteron (K_a = 110 × 10⁶ M^-1) und Progesteron (K_a = 93 × 10⁶ M^-1) wurden mittels thermodynamischem IDA-Verfahren bestimmt und erlauben keine Unterscheidung eines Analyten vom anderen, da die K_a-Werte zu dicht beieinander liegen. Die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen kinetischen Konstanten erlauben eine klare Unterscheidung zwischen den Analyten mit dem gleichen Rezeptor, wie die nachfolgende Tabelle zeigt:
Zusammenfassung der kinetischen Konstanten der Bindung von Testosteron und Progesteron an CB8 in Wasser:
Allgemeine Beschreibung der Bestimmung der kinetischen Parameter einer Träger-Analyt-Wechselwirkung mittels kinADA-Verfahren:
Ein Satz Differentialgleichungen wurde verwendet, um die Kinetik der Träger-Analyt-Indikator-Wechselwirkung zu beschreiben und mittels mathematischer Software zu lösen. Das resultierende Modell kann verwendet werden, um das erhaltene Signal anzupassen, um die Geschwindigkeitskonstanten für den zu bestimmenden Bindungspartner (typischerweise die Verbindung von Interesse, wie ein Analyt) zu berechnen. Als Voraussetzung sollten die Konzentrationen von Trägermaterial, Analyt und Indikator sowie die kinetischen Parameter für die Träger-Indikator-Wechselwirkung und die thermodynamischen Parameter der Träger-Indikator-Wechselwirkung und der Träger-Analyt-Wechselwirkung bekannt sein. Diese Parameter können in separaten Versuchen erhalten werden. Die Konzentration des Analyten wird variiert, während die Trägermaterial- und Indikatorkonzentrationen konstant gehalten werden, um eine globale Anpassung zu ermöglichen. Mit dieser Methode konnten erfindungsgemäß nicht nur langsame Träger-Analyt-Wechselwirkung (CB7 / 19-Nortestosteron, k₁ = 8200 M^-1 s^-1), sondern auch schnelle Wechselwirkungen (CB8 / Progesteron, k₁ = 9 × 10⁶ M^-1 s^-1) untersucht werden.
Anmerkung:
Im Gegensatz zu Träger-Analyt-Wechselwirkungen hängt die kompetitive Bindung nicht nur von der Träger-Analyt-Kinetik und deren thermodynamischen Parametern ab, sondern auch von der Kinetik und Thermodynamik der Träger-Indikator-Wechselwirkungen. Die erfindungsgemäßen kompetitiven Bindungsassays kinADA und kinSAIBA (und ebenso die hierin beschriebenen kinIDA-Verfahren) koppeln die Kinetik und Thermodynamik der Träger-Analyt- und der Träger-Indikator-Komplexe inhärent. Daher ermöglicht eine Änderung des Indikators (molekulares Design) die Anpassung des aufgezeichneten Signals im kompetitiven Assay und ermöglicht die Bestimmung schnellerer und langsamerer Kinetiken von zu bestimmenden Analyten. Zusätzlich kann auch die Änderung der Temperatur genutzt werden, um die kinetischen Raten in den bevorzugten experimentellen Bereich zu verschieben.
Ausführungsbeispiel 6 zur Bestimmung kinetischer Parameter:
2 ml einer Mischung von 0,6 µM CB8 (Trägermaterial) und 5,7 (11,4; 17,1) µM Testosteron (bzw. Progesteron in der gleichen Konzentrationsreihe) in deionisiertem Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 18,7 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 12.
Ausführungsbeispiel 7 zur Bestimmung kinetischer Parameter:
2 ml einer Mischung von 3,1 µM CB7 (Trägermaterial) und 0,5 (0,9; 7,0) µM Testosteron (bzw. Progesteron in der gleichen Konzentrationsreihe) in deionisiertem Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 19,0 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Konzentrationsbestimmung mittels kinADA:
Die Konzentrationsbestimmung mittels kinADA kann entweder unter Verwendung einer Signalintensität nach einer definierten Zeit oder nach Einstellung des Reaktionsgleichgewichts erfolgen. Dazu können die kinetischen Profile zur Identifizierung der Analyten und die thermodynamische Angabe (z.B. nach Gleichgewichtseinstellung) für die Konzentrationsbestimmung verwendet werden.
Ausführungsbeispiel 8 zur Konzentrationsbestimmung:
2 ml einer Mischung von 1,1 µM CB8 (Trägermaterial) und 7,2 (14,3; 21,8; 28,4; 35,5) µM Testosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 37,5 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 13.
Ausführungsbeispiel 9 zur Konzentrationsbestimmung:
2 ml einer Mischung von 2,1 µM CB7 (Trägermaterial) und 1,0 (1,6; 3,3; 4,9; 6,6; 8,2) µM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde Berberinchlorid (Indikator) zugegeben, um die Signalfarbstoffkonzentration auf 10,8 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Allgemeine Beschreibung eines kinSAIBA-Verfahrens:
Der zu bestimmende Analyt wird zusammen mit der Indikatorlösung (wässrig, gepuffert) gelöst und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird ein Trägermaterial in vorbekannter Konzentration hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird kontinuierlich über die Zeit aufgezeichnet.
Ausführungsbeispiel 10 eines kinSAIBA-Verfahrens:
2 ml einer Mischung von 19,7 µM Berberinchlorid (Indikator) und 7,1 µM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Natriumphosphatpuffer (1 mM, pH 7,45) wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde CB7 (Trägermaterial) zugegeben, um die Trägermaterialkonzentration auf 6,2 µM zu erhöhen, und die zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals mit der Aufzeichnung der Signalintensität bei 550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 437 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer gestartet.
Das Ergebnis zeigt 14.
Allgemeine Beschreibung eines thermodynamischen SAIBA-Verfahrens (thermSAIBA):
Der Indikator wird zusammen mit dem Analyten (wässrige, gepufferte Lösung) gemischt und zum Ausgleich (einige Minuten unter Rühren) stehen gelassen. Zu dieser Mischung wird das Trägermaterial in vorbekannter Konzentration portionsweise hinzugefügt und die Signaländerung (Zunahme / Abnahme) des Indikators wird nach Zugabe und Ausgleich bei einer definierten Temperatur aufgezeichnet.
Ausführungsbeispiel 11 eines thermodynamischen SAIBA-Verfahrens (thermSAIBA):
2 ml einer Mischung von 4,5 µM Berberinchlorid (Indikator) und 0,17 µM 19-Nortestosteron (Analyt, Steroid) in Wasser wurden in einer PMMA-Fluoreszenzküvette bei 25 °C für 5 min gerührt. Anschließend wurde CB7 (Trägermaterial) schrittweise von 0 bis 16,2 µM zugegeben und die Fluoreszenzintensität bei 529 nm mit einer Anregungswellenlänge von 462 nm mit einem Standardfluoreszenzspektrophotometer nach Injektion eines jeden Aliquots und eine Ausgleichszeit von 30 Sekunden aufgezeichnet.
15 stellt die beiden thermodynamischen kompetitiven Bindungsassays der vorliegenden Erfindung ADA (15a) und SAIBA (15b) dem herkömmlichen thermodynamischen kompetitiven Bindungsassay IDA (15c) sowie dem Literaturwert (15d) gegenüber.
Die nachfolgende Tabelle zeigt eine Auswahl erfolgreich getesteter kinetischer Assays gemäß der vorliegenden Erfindung mit unterschiedlichen Trägermaterialien, Indikatoren und Analyten:
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten umfassend die Schritte a) Bereitstellen eines zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und mindestens eines Indikators geeigneten Trägermaterials, b) Zugabe der zu bestimmenden Analyten zu dem unbeladenen Trägermaterial und Bindung der Analyten an das Trägermaterial, c) Zugabe mindestens eines Indikators und kompetitive Bindung des Indikators an das Trägermaterial, d) Messung des durch den Indikator in der kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial erzeugten Signals; wobei i) Schritt b) vor Schritt c) durchgeführt werden kann und in Schritt c) der Indikator an das Trägermaterial unter Verdrängung und Freisetzung des Analyten aus dem Trägermaterial bindet oder ii) die Schritte b) und c) gleichzeitig durchgeführt werden können und die zu bestimmenden Analyten und der mindestens eine Indikator in einer kompetitiven Bindungsreaktion an das Trägermaterial binden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Schritt d) die Bestimmung der Analyten durch kontinuierliche Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion unter Erhalt eines kontinuierlichen spektroskopischen Profils der kompetitiven Bindungsreaktion erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin eine qualitative Bestimmung der Analyten aus den kontinuierlichen, kinetischen Messdaten erfolgt und/oder worin die Messung des Signals der kompetitiven Bindungsreaktion zu einem definierten Zeitpunkt oder nach Einstellung des Gleichgewichts der kompetitiven Bindungsreaktion und eine quantitative Bestimmung der Analyten aus dem so erhaltenen thermodynamischen Messwert erfolgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die zu bestimmenden Analyten wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen sind, insbesondere Hormone und Steroide wie 19-Nortestosteron, Progesteron, β-Estradiol, Prednisolon; Arzneistoffe bzw. Toxine wie Nicotin, Phenylbutazon, Tetracyclin und Warfarin; Metabolite und Neurotransmitter wie Typtamin, Serotonin, Histamin und Spurenamine wie Spermidin.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend wasserlösliche makrozyklische Moleküle, wie insbesondere Cucurbit[n]urilen, Cyclodextrinen, Proteine wie BSA und HSA Proteine, sowie nanoporöse kristalline dreidimensionale Materialien, umfassend Zeolithe, Organosilikate, metallorganische Gerüste (MOF) und kovalente organische Gerüstmaterialien (COF), wobei Cucurbit[n]urile und Zeolithe besonders bevorzugt sind.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die kompetitive Bindungsreaktion in einem wässrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird, welches frei von organischen Lösungsmitteln ist und somit die kompetitive Bindungsreaktion in Abwesenheit organischer Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Indikator ausgewählt ist aus der Gruppe der UV-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, Phosphoreszenzfarbstoffe, spinaktiven Farbstoffe, elektrochemoaktiven Farbstoffe, elektrochemilumineszenten Farbstoffe und chemolumineszenten Farbstoffe, insbesondere aus der Gruppe der wasserlöslichen Farbstoffe und worin das kontinuierlich gemessene Signal entsprechend ein Absorptionssignal, Fluoreszenzsignal, Phosphoreszenzsignal, Zirkulardichroismussignal (CD), Fluoreszenz-detektiertes Zirkulardichroismussignal (FDCD), zirkular polarisiertes Emissionsignal (CPL), Fluoreszenzanisotropiesignal / -polarisationssignal, Schwingungsspektroskopiesignal (Raman, IR) oder Kernspinresonanzsignal (NMR) ist
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend in Schritt a) das Dispergieren des Trägermaterials in Wasser; in Schritt b) die Zugabe einer die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probenmatrix unter Bindung der in der Probenmatrix enthaltenen Analyten an das Trägermaterial; und Entfernung der verbleibenden Probenmatrix durch Waschen und/oder Zentrifugation nach Bindung der Analyten an das Trägermaterial.
Assay zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen zur Bindung der zu bestimmenden Analyten und eines Indikators geeigneten Trägermaterials sowie mindestens einen Indikator.
Verwendung von Zeolithen als Trägermaterial in kompetitiven Bindungsassay zur indirekten Bestimmung von Analyten, wie insbesondere zur Verwendung in einem ADA-, SAIBA- oder IDA-Verfahren, wobei eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Analyten aus den kinetischen und/oder thermodynamischen Messdaten erfolgen kann.