WO2019101250A1 - Verfahren zur quantifizierung von proteinaggregaten einer proteinfehlfaltungserkrankung in einer probe - Google Patents

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WO2019101250A1
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protein
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protein misfolding
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Christian ZAFIU
Dieter Willbold
Bettina Kass
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Definitions

  • the invention relates to a method for quantifying protein aggregates of a protein misfolding disease in a sample.
  • Chromatographic separation methods such as size exclusion chromatography and separation methods based on ultracentrifugation methods are known from the prior art for separating proteins in a mixture from one another.
  • a sample may be fractionated with amyloid beta so that different amyloid beta species are present in different fractions. These can then be analyzed by ELISA, Western Blot, UV-VIS, mass spectroscopy or SDS-PAGE, such. From Funke et al. is known (S.A. Funke, T. van Groen, I. Kadish, D. Bartnik, L.
  • the object of the invention is to provide a highly sensitive method and a device for the quantification of individual protein aggregates in a complex sample or a sample mixture and to specify further applications of the method.
  • the invention relates to a method for quantifying protein aggregates of a protein misfolding disease in a sample, characterized by the steps: a) a catcher molecule A is placed on a substrate against the protein of the protein misfolding disease;
  • the material of the substrate is selected from the group consisting of or consisting of plastic, silicon and silicon dioxide.
  • glass is used as the substrate.
  • a microtiter plate with its many reaction chambers is used as the substrate. These are advantageous readable, z. B. microscopic.
  • the catcher molecule A is preferably arranged on the surface of the reaction chambers.
  • a substrate which has a hydrophilic surface.
  • this is achieved by applying a hydrophilic layer, before step a), to the substrate. Consequently, the molecules of the catcher molecule A, in particular covalently bind to the substrate or to the hydrophilic layer with which the substrate is loaded.
  • the hydrophilic layer is a biomolecule-repellent layer, so that the unspecific binding of biomolecules to the substrate is advantageously minimized.
  • the molecules of the catcher molecule A preferably covalently, are preferably immobilized on this layer. These are affinitive to a trait in the protein aggregate.
  • the hydrophilic layer is selected from the group consisting of or consisting of polyethylene glycol, poly-lysine, preferably poly-D-lysine, and dextran or derivatives thereof, preferably carboxymethyl-dextran (CMD).
  • CMD carboxymethyl-dextran
  • the surface of the substrate is first hydroxylated before application of the hydrophilic layer and then activated with amino groups.
  • This activation with amino groups takes place in an alternative by contacting the substrate with APTES (3-aminopropyltrietoxysilane) or with ethanolamine.
  • the contacting of the substrate with APTES occurs in the gas phase; the optionally pretreated substrate is thus evaporated with APTES.
  • the substrate may be treated with an aqueous solution of CMD at a concentration of 10 mg / ml or 20 mg / ml and optionally N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) car - Bodiimid (EDC), (200 mM) and N-hydroxysuccinimide (NHS), (50 mM) are incubated and then washed.
  • CMD carboxymethyl-dextran
  • the carboxymethyl-dextran is covalently bonded to the glass surface, which was first hydroxylated and then functionalized with amino groups.
  • the substrate used may be microtiter plates, preferably with a glass bottom. Because when using polystyrene frames the use of concentrated
  • the capture molecule A is covalently bound to the substrate.
  • a hydrophilic layer is immobilized, preferably covalently, the capture molecule A, which are affine towards a feature of the protein aggregate to be detected. This feature can be an epitope or a partial sequence of a protein aggregate.
  • catcher molecule A preferably an antibody, optionally after activation of a CMD-coated carrier by a mixture of EDC / NHS (200 or 50 mM), is immobilized on the substrate.
  • Residual carboxylate end groups to which no molecules of catcher molecule A have been bound can be deactivated.
  • Residual carboxylate end groups to which no molecules of catcher molecule A have been bound can be deactivated.
  • To deactivate these carboxylate End groups on the CMD spacer ethanolamine is used.
  • the substrates or carriers are optionally rinsed with buffer.
  • a monoclonal antibody directed against the monomer of the protein misfolding disease can be used.
  • the monoclonal antibody Nab228 can be used and placed on the substrate.
  • the capture molecule A has, unlike the capture molecule B described below, in the method according to the invention no detection molecule or parts of the molecule which are suitable for detection.
  • the term "arrangement" in the main claim does in particular not include exclusively covalent bonds. In the case of the antibodies, these are specific.
  • the method comprises step b). b) A complex sample comprising the aggregate of protein misfolding disease is provided, the aggregate having epitopes of the monomer at the surface of the aggregate;
  • a complex sample is meant, in particular, the choice of an already provided sample, which originates from a diseased animal and / or a diseased human having the protein misfolding disease or to check whether the corresponding aggregates are present or Not.
  • a sample from an animal is selected, in particular a transgenic mouse suffering from Alzheimer's dementia.
  • the sample can be obtained after the death of the animal by processing at least one half of the brain.
  • the treatment is meant in particular a homogenization of the brain tissue.
  • a sample obtained from a diseased animal is selected and examined for the presence of a protein misfolding disease.
  • the sample can also be a cell culture, or an organ taken from an animal or a human, or a sample from a biopsy.
  • the sample contains or will be screened for endogenous peptide or protein aggregates of the protein misfolding disease.
  • the method relates in particular and particularly advantageously and surprisingly to the highly selective detection of a specific aggregate of a protein misfolding disease from a mixture of proteins and / or protein fragments in the same sample.
  • the selected sample it is advantageously possible to detect highly specifically a mixture of more than one protein or protein fragment that has been specifically detected, a specific aggregate of a protein misfolding disease to be detected.
  • the sample may be more than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or even more than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or even more than 100, 200 , 300, 400, 500, 600, 700,
  • the sample can contain thousands of proteins and / or protein fragments. It is called a complex sample in this sense.
  • complex sample encompasses the complete homogenate with the complete soluble protein deposit, in particular the brain of a deceased animal or human.
  • the complex sample obtained is, in particular, the brain homogenate of an animal, in particular a transgenic mouse suffering from Alzheimer's dementia. This also includes thousands of different proteins and / or protein fragments.
  • a complex sample containing the amyloid beta aggregate of Alzheimer's dementia can be selected. Since the small, soluble A ⁇ aggregates (A ⁇ oligomers) have been held responsible for the development and progress of Alzheimer's dementia as the main causative agent for several years, the task of reducing drug candidates to efficiency for the reduction of toxic aggregates is hereby solved. highly sensitive even down to the femtomolar area or even a complete elimination. When an agent is tested for its ability to eliminate the aggregates, detection of these aggregates down to the femtomolar range is possible. If oligomer aggregates are no longer detected, the cure of Alzheimer's dementia or at least improvement of the course of the disease with the method has been proven.
  • Step c) envisages removing the insoluble constituents from the selected sample. Step c) therefore requires z. As a filtration or ultracentrifugation to remove the soluble components from the sample. Other methods are conceivable which the skilled person can also apply according to his existing expertise.
  • a density gradient centrifugation is preferred for this purpose.
  • a density gradient centrifugation is advantageously carried out, with which the sample can be analyzed in up to 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, better in up to 10, and particularly advantageously 11, 12, 13, 14 and most particularly advantageously in up to 15 Fractions are fractionated.
  • a certain fraction can be provided and used further, which differs markedly in terms of its s value from other constituents of the other fractions.
  • a selection of certain fractions such.
  • protofibrils or other precursors, such as oligomers can be selected and studied below.
  • the particles formed from the amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins are thus separated from each other.
  • the particles are contained in amyloid and / or agregating peptides and / or proteins, each having a specific aggregate size and shape.
  • This separation of the particles can advantageously be carried out by means of the density gradient centrifugation according to the s value.
  • the fractionation of the amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins in the sample solution takes place by means of a density gradient centrifugation using z.
  • a density gradient centrifugation using z.
  • Optiprep Percoll, sucrose or an analogous density gradient material.
  • the aggregates are separated according to the size and optionally the form (sedimentation).
  • This method is particularly advantageous with aggregating A ⁇ (1-42) aggregates and Tau aggregates.
  • size exclusion chromatography can also be used which separates according to the hydrodynamic radius.
  • the fractionation is carried out by asymmetric flow field flow fractionation, or by capillary electrophoresis. These methods are also suitable for calibration.
  • the fractions can also be used as the basis of the fractionation to be carried out, for. B. the hydrodynamic radius of the particles.
  • the fractions are spatially separated from each other, z. B. by pipetting.
  • One is therefore not limited to a density gradient centrifugation.
  • density gradient centrifugation has the advantage of providing all the aggregates of the amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins originally present in the sample for further quantitative analysis.
  • the density gradient centrifugation itself is calibrated so that the fractions are exactly determined with respect to their s-value.
  • the term "precisely determined” therefore includes a calibration step by fractionation of molecules of known type and behavior. After fractionation, there is only one particular (ie known) type of conformer in each fraction, eg. G., Oligomers or fibrils and so forth that occur in protein misfolding disease.
  • sample can pass through different processing steps known to the person skilled in the art in step c).
  • a pretreatment of the sample takes place after one or more of the following method steps before the sample is arranged on the catcher molecule A:
  • enzymes for example proteases, nucleases, lipases,
  • the method requires step d).
  • step d) The sample after step c), comprising the aggregate of protein misfolding, is contacted on a part of the substrate with the capture molecule A after step a) and the monomer contained therein and / or the aggregate of the protein misfolding disease at the capture molecule A arranged;
  • the arrangement is specific to catcher molecule A.
  • the arrangement is preferably carried out specifically on a monoclonal antibody as catcher molecule A, as described. This advantageously has the effect that a very specific bond is formed between the aggregate of the sample and its epitopes formed from monomer at the surface of the aggregate and the capture molecule A. This is advantageous causes z. B. other proteins, in particular aggregates of other protein misfolding diseases with a comparable s-value are excluded. Thus, only one specific aggregate is detected by catcher molecule A.
  • the sample to be measured is thus brought into contact with the thus prepared substrate and optionally incubated.
  • the body's own fluids or tissues can be used as the sample to be examined.
  • the sample is selected from brain homogenate, CSF, blood, plasma and urine. It may also be samples of an organ (biopsy) or the homogenate of the entire organ, z. The brain, act.
  • the arrangement of the sample or the aggregate takes place directly on the catcher molecule A.
  • Unspecific bound substances can be removed by at least one washing step.
  • step e) A calibration standard is brought into contact and arranged on another part of the substrate on the seed molecule A after step a), wherein a defined number of monomers of the protein misfolding disorder to be detected are arranged on the surface of the calibration standard;
  • the calibration standard used are particles which advantageously have about the size of the aggregate of the protein misfolding disease. The size will be apparent to the skilled person without effort from the literature.
  • the calibration standard used is a particle which has a defined number of monomers at the surface which corresponds to the number of monomer repitopes of the unit to be detected.
  • the calibration standard should be a particle with a diameter of about 20 nm, since an amyloid beta aggregate can assume this size.
  • the calibration standard On the surface of the calibration standard then about 20-30 amyloid beta monomers should be arranged, for. B. be covalently arranged.
  • the calibration standard used is preferably a silica nanoparticle about 20 nm in size and about 30 amyloid beta monomers on the surface. This corresponds to the size of the amyloid beta aggregates and the number of accessible monomer epitopes in the oligomer or in the aggregate.
  • the calibration standard can be synthesized for the purposes indicated as follows, these methods being non-limiting:
  • step C1) activation of the free carboxyl groups from step C1) z. B through the formation of NHS ester to the carboxyl group, and
  • step D2) binding of monomers of the protein aggregate to the maleimido-spacer carboxylic acids from step C2) via a sulfhydryl group at the free end of the monomers.
  • step f) of the method according to the invention is carried out.
  • a capture molecule B against the monomer of the protein misfolding disease is combined with both the aggregate of the sample on the substrate and contacted with the calibration standard and placed on the monomer of the protein misfolding disease, wherein the capture molecule B can emit a detectable signal;
  • the catcher molecule B thus represents a probe.
  • the term "catcher molecule B" and “probe” are used synonymously.
  • the aggregate of the protein misfolding disease from the sample to be detected is already arranged on catcher molecule A and thus immobilized on the substrate.
  • the catcher molecule A and the catcher molecule or molecules B can in one embodiment of the invention have identical affine molecules or moieties.
  • different affine molecules or molecular moieties may be combined with different detection molecules or moieties, or alternatively, different affine molecules or moieties may be combined with identical detection moieties or moieties. Mixtures of different capture molecules B can also be used.
  • capture molecules B which are coupled to different detection molecules or moieties, on the one hand increases the specificity of the signal (correlation signal), on the other hand allows the identification of protein aggregates that differ in one or more features. This allows selective quantification and characterization of the protein aggregates.
  • the capture molecule A and the capture molecule (s) B bind to the same epitope or to the same overlapping portion of an epitope of the monomer.
  • the immobilized on catcher molecule A Proteinag gregate with one or more useful for further detection probes, the capture molecule B, marked.
  • the individual steps can also be carried out in a different order according to the invention. It is advantageous to choose one or more capture molecules B, which bind to monomers of the protein aggregates, whereby the capture molecules B are also capable, after binding to the aggregate, of emitting a specific signal.
  • the "quantitative determination" initially means the determination of the concentration of the protein aggregates, and therefore also the determination of their presence and / or absence.
  • these excess capture molecules B are not removed. This eliminates a washing step and there is no equilibrium shift in the direction of dissociation of the protein aggregate-probe complexes or compounds. Due to the spatially resolved detection, the excess probes are not detected during the evaluation.
  • the binding sites of the protein aggregate are epitopes and the capture molecules are antibodies and / or antibody moieties and / or fragments thereof.
  • the catcher molecule A and the catcher molecule or molecules B differ.
  • z. B different antibodies and / or antibody parts and / or fragments as catcher molecules B are used.
  • a capture molecule A and one or more capture molecules B are used, which are identical to one another except for the possible (dye) label.
  • at least two capture molecules B are used, the z. B. contain different antibodies and optionally also carry different dye label.
  • the capture molecules B are characterized in that they preferably emit an optically detectable signal selected from the group consisting of fluorescence, bioluminescence and chemiluminescence emission and absorption.
  • the capture molecules B as probes are thus labeled with fluorescent dyes.
  • fluorescent dye the dyes known to those skilled in the art can be used.
  • GFP Green Fluorescence Protein
  • conjugates and / or fusion proteins thereof, as well as quantum dots can be used.
  • the catcher molecule A has no probe function as the catcher molecule B. Only for quality control of the surface, for example, to demonstrate the uniformity of the coating with catcher molecule A, the catcher molecule A can be used with a fluorescent dye. For this purpose, a dye is preferably used which does not interfere with the detection of the fluorescent dye of the probe on the protein aggregate. As a result, a subsequent control of the structure of the substrate is possible as well as a normalization of the measurement results.
  • the capture molecule (s) B may be selected and used such that the presence of individual protein aggregate features does not affect the measurement result.
  • a fluorescent monoclonal antibody as catcher molecule B can be brought into contact with and placed against the monomer of the protein misfolding disease with the bound aggregate and the calibration standard.
  • catcher molecule A and as catcher molecule (s) B it is thus possible in particular to select monoclonal antibodies. This advantageously has the effect that a sufficient sensitivity and strength of the arrangement to the unit and / or calibration standard is predetermined. It may be a catcher molecule B, a mixture of monoclonal antibodies, such. MAb labeled with CF-633 and Nab228 labeled with CF-488.
  • molecules should be selected which bind to the same target region of the protein of the protein misfolding disease. This has the particularly advantageous effect that monomers in the sample can no longer be bound by catcher molecule (s) B, since the target region is already occupied by catcher molecule A.
  • catcher molecule A after step a) and capture molecule B / antibody after step f) may both bind to amino acids 3-8 (as viewed from the N 'end). Is z. B. a sample with amyloid beta
  • the process advantageously discriminates monomers which are no longer detected.
  • Step g) of the method can be carried out as follows: g) The signal of the catcher molecules B on the sample aggregate is compared with the signal of the catcher molecules B arranged on the calibration standard for the quantification of the sample aggregate. Step g) then requires the detection of the signal, in particular a fluorescence signal, which is emitted by the example, fluorescent monoclonal antibody as catcher molecule B. For this purpose, z. For example, a TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) system may be used.
  • a spatially resolved determination of the probe signal ie a spatially resolved detection of the signal emitted by the probe, is performed. Accordingly, in this embodiment of the invention, methods based on a non-spatially resolved signal, such as ELISA or sandwich ELISA, are excluded.
  • the spatially resolved determination of the probe signal based on total internal reflection fluorescence microscopy (tirfm) and the study of a small volume element compared to the volume of the sample, in the range of a few Femtolitern to below a femtoliter, or a volume range above the contact surface of the capture molecules with a height of 500 nm, preferably 300 nm, more preferably 250 nm, in particular 200 nm.
  • the detection of the immobilized and labeled protein aggregates takes place by means of imaging of the surface, for. B. with laser scanning microscopy.
  • the highest possible spatial resolution determines a high number of pixels, as a result of which the sensitivity and the selectivity of the method can be further increased since structural features can also be imaged and analyzed.
  • the specific signal increases before the background signal of z. B. nonspecifically bound probes.
  • the detection is carried out, for example, preferably with spatially resolving fluorescence microscopy by means of a TIRF microscope, and the corresponding super-resolution variants thereof, such as, for example, STORM and / or dSTORM.
  • a laser focus as z.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy System
  • these methods produce as many read-out values as there are spatially resolved events (eg, pixels). Depending on the number of different probes, this information is advantageously multiplied. This multiplication applies to each detection event and leads to an information gain, as it provides further properties, eg. B. a second feature, disclosed about protein aggregates. Such a structure can increase the speed of the signal for each event.
  • the spatially resolved information z. As the fluorescence intensity, all used and detected probes used to z. B. to determine the number of protein aggregates, their size and their characteristics.
  • This z. B. algorithms of background minimization and / or intensity thresholds for further evaluation and pattern recognition can be applied.
  • image analysis options include z.
  • the search for local intensity maxima in order to obtain from the image information the number of detected protein aggregates and also to be able to determine the particle sizes.
  • step sequence a) to g) in patent claim 1, as described, serves merely to clarify and not a chronologically successive sequence at steps represents.
  • step b) and c) z. B. before step a) take place gene.
  • the protein aggregates are thus brought into contact with the catcher molecules B and arranged before the aggregates are brought into contact with the catcher molecules A, thus immobilizing probe-labeled protein aggregates on the substrate.
  • a method of quantifying protein aggregates of a protein misfolding disease in a complex sample characterized by the steps of: a) placing on a substrate a capture molecule A against the protein of the protein misfolding disease; b) A complex sample comprising the aggregate of protein misfolding disease is selected, the aggregate having epitopes of the monomer at the surface of the aggregate; c) the insoluble matter is removed from the sample; d) A calibration standard is brought into contact and arranged on a part of the substrate with the capture molecule A after step a), wherein on the surface of the calibration standard a defined number of monomers or parts of the monomers is present, which contains the epitope of the to-be-detected gregates of the protein misfolding disease; e) At least one catcher molecule B against the monomer of the protein misfolding disease is contacted with the aggregate of the sample and placed on the monomer of the protein misfolding disease, wherein the or the catcher molecules B can emit a detectable signal; f) The capture molecule
  • the catcher molecule or molecules B can be bound to the aggregate before it is brought into contact with catcher molecule A and immobilized on the substrate.
  • step b), c) and e) may be performed before any other steps.
  • the sample is chemically fixed, eg. B. by formaldehyde.
  • the method has a very high sensitivity in the detection of aggregates in complex samples such as mouse brain homogenate and is completely in-sensitive to endogenously present monomers.
  • the method detects aggregates of the respective protein misfolding disease in the femtomolar region, in particular up to a range of 1000-500 fM, particularly advantageously 100-500 fM, in particular 50-100 fM and of 5-10 fM. Since it is not a Elisa bound method, the proof of this method is improved by a factor of up to 10,000.
  • the comparison over the defined number of epitopes on the calibration standard advantageously allows an exact quantification of the epitopes in the aggregate of the protein misfolding disease.
  • a monoclonal antibody as catcher molecule A in step a) and as catcher molecule (s) B in step f) can be used, the z. B. amyloid beta 3-8 as identical target region of the monomer.
  • the method is therefore particularly suitable for the detection of aggregates of protein misfolding diseases, since no monomer of the protein misfolding disease can be detected.
  • the invention surprisingly also achieves the object in a complex matrix, such as brain homogenate with thousands of different proteins and protein fragments.
  • the method detects even the smallest amounts of protein aggregates even in the presence of its monomer, since this can not be bound by capture molecule (s) B.
  • Another problem that is solved is that even heterogeneous protein aggregates consisting of more than one type of protein can be clearly identified as an aggregate.
  • an apparatus for quantifying protein aggregates of a protein misfolding disease in a complex sample comprises a substrate on which a capture molecule A for a protein of a protein misfolder Disease is present.
  • the calibration standard is a particle with a defined number of monomer of the protein misfolding disease, which corresponds to the number of epitopes in the aggregate to be detected.
  • Another part of the capture molecule A on another part of the substrate provides the binding sites for monomers of the aggregate of protein misfolding disease from the complex sample.
  • the device comprises the calibration standard with which it is advantageously possible to quantify the aggregates up to the femtomolar range.
  • the device is preferably characterized in that a particle with the size of the unit to be detected is arranged as the calibration standard.
  • the device is characterized in particular by a silica nanoparticle as calibration standard.
  • the device is particularly advantageously a microtiter plate, wherein the microtiter plate has at least one reaction chamber as part of the substrate, on the bottom of which a calibration standard arranged on catcher molecule A is arranged and has at least one further reaction chamber as part of the substrate, on the bottom catcher molecule A for the detected aggregate of protein misfolding disease is located.
  • kit for quantifying aggregate of a protein misfolding disease comprising:
  • a substrate on which a catcher molecule A is arranged for a monomer of a protein misfolding disorder and a calibration standard with a defined number of monomers of the protein misfolding disorder is arranged on a part of catcher molecule A;
  • a capture molecule B on the substrate for the protein of the protein misfolding disease wherein the capture molecule A and the Catcher molecule B bind to the same target region of the protein of the protein misfolding disease.
  • Mixing dishes and buffers for catcher molecule B are optional.
  • the present invention also provides a kit comprising one or more of the following components:
  • Substrate optionally with a hydrophilic surface
  • At least one catcher molecule A At least one catcher molecule A
  • substrate with catcher molecule A and / or calibration standard
  • the compounds and / or components of the kit of the present invention may be packaged in containers, optionally with / in buffers and / or solution. Alternatively, some components may be packaged in the same container. In addition to or alternatively, one or more of the components could already be attached to the substrate as to a solid support, such as a solid support. A glass plate, a chip or a nylon membrane, or to the well of a microtiter plate. Then, the substrate comprises such a microtiter plate. Further, the kit may include instructions for using the kit for any of the embodiments. In a further variant of the kit, the above-described catcher molecules are already immobilized on the substrate. In addition, the kit may contain solutions and / or buffers. To protect the coating and / or the catcher molecules immobilized thereon, they may be overcoated with a solution or a buffer.
  • Another object of the present invention is a method for the detection of protein aggregates in any sample for the quantification and thus titer determination of protein aggregates.
  • the use of a device or kit, as well as the extension of the method, are for the quantitative detection of the aggregate concentration of a protein misfolding disease.
  • the use of the device or kit in this way makes it possible to carry out a method which is sufficiently sensitive to detect an aggregate of a proteinine deficient disease in complex samples such as, for example, a homogenized brain, at the end of an (animal) experiment can.
  • density gradient centrifugation can be used to examine any desired fraction for changes in concentration with or without an addition of active ingredient.
  • the method provides a method step that allows more than one fraction from density gradient centrifugation to be analyzed for changes in concentration, or changes in aggregate size or other parameters.
  • the density gradient centrifugation preferably gives rise to more than 3, 4 or more than 5 fractions, which can be analyzed both quantitatively and qualitatively and not only with regard to changes in concentration.
  • the term "desired fraction" in the sense of the method encompasses in particular but not exclusively those fractions which also contained aggregating or aggregated peptides and / or protein building blocks prior to the separation, in particular toxic oligomers.
  • the method is not causally directed thereto, although of course an active ingredient may be added to the sample comprising the amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins of different aggregate size and shape. Or it is an organ taken at the end of an animal study (eg the brain) that serves as a sample.
  • the samples of a placebo-treated animal can be compared with those of active-substance treated animals.
  • An active substance or the treatment with the active substance alters the distribution and thus the concentration of certain aggregates in the organ and thus in the homogenized sample.
  • This change in concentration is then determined quantitatively.
  • the change is a measure of the reduction or even complete elimination of certain toxic species with detectable aggregate or particle size. That is, the method detects the increase or decrease in the concentration of certain amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins via the change in aggregate size distribution in the sample.
  • composition of amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins with different aggregate size and shape is thus changed during the treatment under the influence of the active ingredient.
  • Other particle sizes increase or remain constant under the influence of the active ingredient.
  • the change in the shape distribution of the peptides and / or proteins under the influence of an active ingredient is also preferably investigated by fluorescence microscopy methods.
  • the detection of a molecular active substance activity in the animal model is possible.
  • the rapid and reliable study at the end of an animal study which shows the reduction of aggregated A ⁇ (A-Beta) quantitatively to the femtomolar range, depending on the treatment with an active substance.
  • an agent is used in an animal study and tested for its dose-dependent influence on the particle size distribution of the sample in vivo, depending on a control.
  • the method is suitable for the screening of potential agents against Alzheimer's disease (AD) based on the modulation of the toxic amyloid ⁇ (A ⁇ ) oligomers under the influence of the active ingredient. It is particularly advantageous if these studies are accompanied by behavioral studies of the animals.
  • the method according to the invention provides a comprehensive, quantitative result with regard to the changing particle or aggregate size distribution of amyloid and / or aggregating peptides and / or proteins under the influence of the active ingredient. This will be promising agents, eg. For example, for a therapy of Alzheimer's dementia, the concentration of soluble toxic Ingredients such.
  • the Aß oligomers is to be examined for their effect in the animal model.
  • the method is not limited to this.
  • this also allows the determination of whether the active ingredient leads to an increase of other potentially toxic or desired species in the animal model.
  • the method is used in the determination of active ingredients which, according to current knowledge, do not lead to an increase in other toxic constituents.
  • it is particularly advantageous to investigate a plurality of the fractions obtained in accordance with the invention for changing the concentration of the building blocks. A comparison of the control with the sample containing a drug or a natural ligand allows a reproducible and rapid determination of drug effectiveness with respect to the elimination and reduction of certain species such. As oligomers and thus an estimate of its effect in an animal model and later in the clinical test phases.
  • a method of detecting protein aggregates of a protein misfolding disease in a sample comprising the steps of: a) selecting a complex sample comprising the aggregate of protein misfolding disease, the aggregate having epitopes of the monomer or detectable portions thereof on the surface of the aggregate; b) The sample after step a) comprising the aggregate of the protein deficiency disease is brought into contact with the substrate and the monomer contained therein is placed on the substrate; c) At least one catcher molecule B is used as a probe for detecting against the monomer of the protein misfolding disease with the aggregate of the sample in
  • a capture molecule A is arranged on the substrate against the monomer of the protein misfolding disease prior to step a) and in step b) the monomer of the aggregate is arranged on catcher molecule A.
  • a sample is selected for this purpose, from which the insoluble constituents were removed in advance.
  • a calibration standard is arranged on another part of the substrate or on another part of the capture molecule A, wherein an exactly defined number of monomers of the protein misfolding disease to be detected are arranged on the surface of the calibration standard.
  • the signal of the catcher molecules B arranged on the sample aggregate is compared with the signal of the catcher molecules B arranged on the calibration standard for the quantification of the sample aggregate.
  • the invention is the detection of an aggregate of a protein misfolding disease on a substrate with a corresponding probe, the capture molecule B.
  • Step A Preparation of the inorganic nanoparticle.
  • 200 ml of ethanol, 3.8 ml of 30% ammonium hydroxide, 3.5 ml of deionized water and 4.4 ml of tetraethoxysilane are constantly stirred for 2 days.
  • the reaction product is silica nanoparticles with a diameter of about 20 nm.
  • the size is determined by means of transmission electron microscopy and corresponds to the size of the amyloid beta aggregate.
  • the yield is determined by evaporating the solvent and weighing.
  • Step B Surface modification with primary amines to form free amino groups.
  • reaction solution from step A 45 ml of the reaction solution from step A are mixed with 10 ⁇ l of glacial acetic acid and 165 ⁇ l of 3-aminopropyltriethoxysilane and stirred for four hours. Subsequently, the particles are cleaned by repeated centrifugation and resumption in ethanol. The yield is determined by evaporation of the solvent and weighing.
  • Step C1 Surface modification with carboxyl functionalities.
  • step B 50 ml of the purified particles from step B are centrifuged, taken up in 50 ml of dimethylformamide and transferred to a round bottom flask. After 5 mmol Bers- tic acid anhydride were added to the solution, the solution is stirred under argon atmosphere for one hour at 90 ° C and heated. After the time has elapsed, the solution is stirred for a further 24 hours.
  • the carboxylated particles are purified by centrifugation and reuptake in deionized water and the yield is determined by evaporation of the solvent and weighing.
  • Step C2 Surface modification with maleimido functionalities.
  • 200 pmol particles from step B are taken up in 1 ml of 100 mM 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer at pH 6 with 10% by volume dimethylformamide and with 40 pmol 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 10 pmol N Hydroxysuccinimide, 40 pM 6-maleimido-hexanoic acid and mixed for one hour.
  • the particles are cleaned by repeated centrifugation and resumption in the abovementioned buffer.
  • D1 Bioconjugation of amyloid beta (1-42) to carboxy silica nanoparticles.
  • carboxylated particles 100 pmol of carboxylated particles are taken up in 1 ml of deionized water and combined with 20 pmol of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 5 pmol of N-hydroxy-succinimide and mixed for one hour.
  • the activated particles are purified by repeated centrifugation and reuptake in deionized water.
  • the particle pellet is taken up in phosphate buffer, added to 0.3 mg of recombinant amyloid beta 1-42 peptide and shaken overnight.
  • the bioconjugated particles are purified by centrifugation, reuptake in hexafluoropropanol and incubation for one hour.
  • the solvent is then cleaned by repeated centrifugation and reuptake in deionized water.
  • the amyloid beta (1-42) particles are purified by centrifugation and reuptake in deionized water and the yield is determined by evaporating the solvent and weighing.
  • the epitope number is determined via a commercially available bicinchoninic acid test and related to the particle concentration.
  • D2 Bioconjugation of amyloid beta (here 1-15) peptides with C-terminal sulfhydryl modification.
  • 1 ml of the particles from step C2 are centrifuged and taken up in a ml of 100 mM 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer at pH 6 with 10% by volume dimethylformamide and 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid with 15 nmol of the peptide (sequence: DAEFRHDSGYEVHHQC, amyloid beta 1-15 with an additional cysteine modification) and shaken for 10 minutes.
  • FIG. 2 Silver staining of the proteins in the individual fractions of the brain homogenate of an APP SW e / PS1AE9 transgenic mouse.
  • FIG. 3 Western blot of amyloid beta proteins in the individual fractions of the
  • FIG. 1 shows the aggregate assay. Result of two fractionally homogenized mouse brain samples (whole hemisphere) by fractional gradient centrifuge (DGZ). Both mice were 24 months old at the time of organ harvesting.
  • the mouse designated a transgenic animal, was an APP SWe / PS1AE9 double mutation expressing strong human amyloid beta. Wild type animals do not express human amyloid beta and are therefore not recognized in the assay by the use of antibodies directed against human amyloid beta.
  • the measurement was successful, despite the strong background of the complex sample, as easily shown in Figure 2 by innumerable bands.
  • the method according to the invention without further separation (on the gel) directly allows the detection of specific amyloid beta aggregates and with the aid of the calibration standard these are advantageously also absolutely quantifiable.
  • the glass bottom of the plate was silanized by APTES (99%; (3-aminopropyl) triethoxysilane; Sigma-Aldrich, Germany) by vapor deposition.
  • APTES 99%; (3-aminopropyl) triethoxysilane; Sigma-Aldrich, Germany
  • the plate was stored in a desiccator over 5 ml of a solution consisting of 5% APTES in toluene (99% Sigma-Aldrich, Germany) in an argon atmosphere for 1 h. After that was remove the APTES solution and dry the plate under vacuum for 2 h.
  • a 2 mM succinimidyl carbonate-poly- (ethylene glycol) -carboxymethyl (MW 3400, Laysan Bio, Arab, USA) in dd H 2 O was added to the reaction chambers (RK) of the plate and incubated for 4 h. At the end of the time, the reaction chamber was washed 3 times with water. The coating was then activated with 200 mM N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (98%, Sigma-Aldrich, Germany) and 50 mM N-hydroxysuccinimide (98%, Sigma-Aldrich, Germany) and incubated for 30 minutes.
  • capture antibody capture molecule A directed against the N-terminus of amyloid beta (Nab228 monoclonal antibody, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in PBS was added to the reaction chamber and incubated for 1 h.
  • TBS + 0.2% Tween (TBST) and TBS the RKs were blocked with Smartblock solution overnight (Candor Bioscience, Germany). The next day, the plate was washed three times with TBS and samples and standards were triplicate plated and incubated for 1 h.
  • Brain homogenate samples were diluted tenfold in TBS before being applied to the plate.
  • Calibration standards for amyloid beta oligomers were A ⁇ 1-42 SiNaPs (silica nanoparticles) with a diameter of 20 nm and about 30 epitopes (A ⁇ 1-42), which were synthesized as described.
  • probe antibodies were used as catcher molecules B Ge 1.25 pg / ml) mAb IC16 labeled with CF-633 (Sigma-Aldrich, Germany) and Nab228 (epitope A ⁇ 1-10) labeled with CF-488 (both Sigma-Aldrich, Germany) used.
  • the probes were mixed on the plate prior to addition and ultracentrifuged (100,000 g, 1 h, 4 ° C) and incubated for 1 h.
  • the reaction chamber was washed three times with TBS and the plate sealed.
  • the measurement was carried out in a Leica multi-color TIRF (total internal reflection fluorescence) system (AM TIRF MC, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
  • the TIRF system was equipped with an automated xyz stage and a 100 x oil immersion objective (1.47 oil CORR TIRF Leica).
  • the TIRF penetration depth was set to 200 nm.
  • the microscope took 5 x 5 images per RK in each channel.
  • Each image consists of 1000 x 1000 pixels with a lateral resolution of 116 nm and a 14-bit intensity resolution. Intensity limits were evaluated on the basis of the negative control in each channel. This limit was then applied to all images and counted only those pixels which were at the same position in both channels (colocalized) above the intensity limits. By evaluating the A ⁇ 1-42 SiNaP standard, the number of colocalized pixels above the thresholds can be converted into oligomer concentrations.
  • Figure 2 shows the silver staining of total proteins in the individual fractions of the brain homogenate of the APP swe / PS1AE9 transgenic mouse.
  • the gel was then incubated in 4.7 mM Na 2 CO 3 , 4.6 mM K 3 Fe (CN) 6 , and 19 mM sodium thiosulfate Na 2 S 2 O 3 for 60 s and washed three times with dd H 2 O for 20 s. Subsequently, the gel was treated for 20 min in 12 mM AgNO 3 and again washed three times for 20 s with dd H 2 O. The staining was developed in 280 mM Na 2 C0 3 with 0.05% formalin (37% formaldehyde solution) until the desired intensity was reached. The further development of the gel was stopped by treatment with 1% acetic acid for 5 min. The image was taken using a ChemiDoc MP system (Bio-Rad, California, USA).
  • FIG. 3 shows the Western blot of amyloid beta proteins in the individual fractions of the brain homogenate of the APP swe / PS1AE9 transgenic mouse.
  • 12 ml of each fraction (1 to 14) of density gradient centrifugation was subjected to SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) in a 16.5% Tris-Tricin gel at constant current of 45 mA per gel for 110 min a Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, California, USA).
  • the proteins were transferred to a PVDF membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m (Roti-PVDF 0.2, Carl Roth, Germany) at 25 V and 1 A for 30 min.
  • a Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad, California, USA
  • the membranes were boiled in PBS for 5 min after transfer. After cooling, the membranes were incubated in PBS and TBS + Tween20 (TBST) for 5 min.
  • the membranes were blocked with 10% skimmed milk powder / TBST (1 h, room temperature) and incubated with anti-A ⁇ antibody mAb IC16 (1: 1000 in TBST overnight,
  • the invention is the detection of an aggregate of a protein misfolding disease on a substrate with a corresponding probe, the capture molecule B, without the corresponding quantification step.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer komplexen Probe. Eine Vorrichtung, ein Kit sowie eine Verwendung der Vorrichtung und des Kit sind offenbart.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggrega- ten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe.
Stand der Technik
Aus dem Stand der Technik sind chromatographische Trennverfahren wie Größen- ausschlusschromatographie und Trennverfahren basierend auf Ultrazentrifugations- methoden bekannt, um Proteine in einem Gemisch voneinander zu trennen.
Mit Hilfe unterschiedlicher Zentrifugationstechniken kann z. B. eine Probe mit Amyloid beta fraktioniert werden, so dass in unterschiedlichen Fraktionen unterschiedli- che Amyloid beta-Spezies vorliegen. Diese kann man anschließend mittels ELISA, Western Blot, UV-VIS, Massenspektroskopie oder SDS-PAGE analysieren, wie z. B. aus Funke et al. bekannt ist (S. A. Funke, T. van Groen, I. Kadish, D. Bartnik, L.
Nagel-Steger, O. Brener, T. Sehl, R. Batra-Safferling, C. Moriscot, G. Schoehn, A. H. C. Horn, A. Muller-Schiffmann, C. Korth, H. Sticht, D. Willbold. Oral Treatment with the D-Enantiomeric Peptide D3 Improves the Pathology and Behavior of Alzheimer’s Disease Transgenic Mice. ACS Chem. Neurosci. (2010), 1 , 639-648). Aus Sehlin et al. (Dag Sehlin , Hillevi Englund, Barbro Simu, Mikael Karlsson, Martin Ingelsson, Fredrik Nikolajeff, Lars Lannfelt, Frida Ekholm Pettersson. 2012. Large Aggregates Are the Major Soluble Aß Species in AD Brain Fractionated with Density Gradient Ultracentrifugation. Plos one, Vol. 7, e32014) ist bekannt, dass große Aggregate die wesentliche Quelle an Amyloid beta Spezies durch Dichtegradienten- Zentrifugation fraktionierten Alzheimersche Demenz Gehirnen sind. Zur Quantifizierung wird ein Elisa-Verfahren angegeben. Aus Ward et al. (Robin V. Ward, Kevin H. Jennings, Robert Jepras, William Neville, Davina E. Owen, Julie Hawkins, Gary Christie, John B. Davis, Ashley George, Eric H. Karran and David R. Howlett. 2000. Fractionation and characterization of oligomeric, protofibrillar and fibrillär forms of ß-amyloid peptide. Biochem. J. 348, 137-144) ist bekannt, dass nach einer Dichtegradientenzentrifugation ein Immunoassay mit dem monoklonalen Antikörper mAb158 angewendet wurde um Amyloid beta Aggregate zu quantifizieren.
Nachteilig ist mit den offenbarten Antikörpern im verwendeten Elisa-Verfahren eine hochsenstive Quantifizierung von Amyloid beta aus komplexen Proben und Gemi- sehen nicht möglich. Die genannten Druckschriften geben hierzu lediglich einen Nachweis an Amyloid beta bis im mikromolaren Bereich an. Diese Verfahren sind daher nicht sensitiv. Selbst die sensitivsten Elisa-Verfahren weisen Proteine lediglich bis zu einer Konzentration von etwa 100 picomolar nach. Dies scheint aus der heuti- gen Sicht nicht genug zu sein, um auch geringe Auswirkungen eines potentiellen Wirkstoffs zur Therapie der Alzheimerschen Demenz auf seine Wirksamkeit hin zu überprüfen.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es ein hochsensitives Verfahren und eine Vorrichtung zur Quantifizierung von einzelnen Proteinaggregaten in einer komplexen Probe oder einem Probengemisch bereit zu stellen und weitere Anwendungen des Verfahrens anzugeben.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst nach dem Verfahren gemäß Hauptanspruch sowie nach den Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen. Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte: a) Auf einem Substrat wird ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Pro- teinfehlfaltungserkrankung angeordnet;
Als Proteinfehlfaltungserkrankung kommen insbesondere die Proteinfehlfaltungserkrankungen von Menschen und Tieren in Betracht.
Tabelle 1 : Protein und zugehörige Proteinfehlfaltungserkrankung
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
In einer Ausführung wird das Material des Substrats ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Kunststoff, Silizium und Siliziumdioxid. In einer be- vorzugten Alternative wird als Substrat Glas eingesetzt.
Als Substrat wird insbesondere aber nicht ausschließlich eine Mikrotiterplatte mit seinen vielen Reaktionskammern verwendet. Vorteilhaft sind diese auslesbar, z. B. mikroskopisch. Auf der Oberfläche der Reaktionskammern ist vorzugsweise das Fängermolekül A angeordnet.
Hierzu wird in einer Alternative ein Substrat eingesetzt, das eine hydrophile Oberflä- che aufweist. In einer Alternative wird dies durch das Aufträgen einer hydrophilen Schicht, noch vor Schritt a), auf das Substrat erreicht. Mithin binden die Moleküle des Fängermolekül A, insbesondere kovalent an das Substrat bzw. an die hydrophile Schicht, mit welcher das Substrat beladen ist.
Die hydrophile Schicht ist eine Biomoleküle abweisende Schicht, so dass die unspe- zifische Bindung von Biomolekülen an das Substrat vorteilhaft minimiert wird. Auf diese Schicht werden vorzugsweise die Moleküle des Fängermolekül A, bevorzugt kovalent, immobilisiert. Diese sind affin gegenüber einem Merkmal im Proteinaggre- gat. In einer Ausführung wird die hydrophile Schicht ausgewählt aus der Gruppe enthal- tend oder bestehend aus Polyethylenglykol, Poly-Lysin, bevorzugt Poly-D-Lysin, und Dextran oder Derivate davon, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD). Derivate im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die sich in einigen Substituenten von den Stammverbindungen unterscheiden, wobei die Substituenten gegenüber dem erfin- dungsgemäßen Verfahren inert sind.
In einer Ausführung der Erfindung wird die Oberfläche des Substrats vor Auftrag der hydrophilen Schicht zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen aktiviert. Diese Aktivierung mit Aminogruppen erfolgt in einer Alternative durch in Kon- taktbringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) oder mit Etha- nolamin.
Zur Vorbereitung des Substrats auf die Beschichtung können einer oder mehrere der nachfolgenden Schritte durchgeführt werden:
• Waschen eines Substrats aus Glas bzw. eines Glasträgers im Ultraschallbad oder Plasma-cleaner, alternativ dazu in 5 M NaOH mindestens 3 Stunden inkubieren,
• Spülen mit Wasser und anschließendem Trocknen unter Stickstoff,
• Eintauchen in eine Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und
Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 für die Aktivierung der Hydroxylgruppen,
• Spülen mit Wasser bis zu einem neutralen pH, anschließend mit Ethanol und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre,
• Eintauchen in eine Lösung mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) (1 - 7 %), bevorzugt in trockenem Toluol, oder einer Lösung von Ethanolamin,
• Spülen mit Aceton oder DMSO und Wasser und Trocknen unter
Stickstoffatmosphäre.
In einer Alternative erfolgt das in Kontaktbringen des Substrats mit APTES in der Gasphase; das gegebenenfalls vorbehandelte Substrat wird mithin mit APTES be- dampft. Für die Beschichtung mit Dextran, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD), kann das Substrat mit einer wässrigen Lösung von CMD in einer Konzentration von 10 mg/ml oder 20 mg/ml und gegebenenfalls N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminpropyl) Car- bodiimid (EDC), (200 mM) und N-Hydroxysuccinimid (NHS), (50 mM) inkubiert und anschließend gewaschen werden.
Das Carboxymethyl-Dextran ist in einer Variante kovalent an die Glasoberfläche gebunden, die zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen funktiona- lisiert wurde.
Als Substrat können Mikrotiterplatten, bevorzugt mit Glasboden, eingesetzt werden. Da bei der Verwendung von Polystryrolrahmen der Einsatz von konzentrierter
Schwefelsäure nicht möglich ist, erfolgt die Aktivierung der Glasoberfläche in einer Ausführungsvariante der Erfindung analog.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung ist das Fängermolekül A kovalent an das Substrat gebunden. An beispielweise eine hydrophile Schicht wird, bevorzugt kovalent, das Fängermole- kül A immobilisiert, welches affin gegenüber einem Merkmal des zu detektierenden Proteinaggregats sind. Dieses Merkmal kann ein Epitop bzw. eine Teilsequenz eines Proteinaggregats sein.
Es wird nur eine Sorte Fängermolekül A verwendet. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine Sorte Aggregat einer einzigen Proteinfehlfaltungserkrankung sensitiv quantitativ nachgewiesen werden kann.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird Fängermolekül A, bevorzugt ein Antikörper, gegebenenfalls nach einer Aktivierung eines mit CMD beschichteten Trägers durch eine Mischung aus EDC/NHS (200 bzw. 50 mM), auf dem Substrat immobilisiert.
Verbleibende Carboxylat-Endgruppen, an die keine Moleküle des Fängermolekül A gebunden wurden, können deaktiviert werden. Zur Deaktivierung dieser Carboxylat- Endgruppen auf dem CMD-Spacer wird Ethanolamin verwendet. Vor dem Auftrag der Proben werden die Substrate bzw. Träger gegebenenfalls mit Puffer gespült.
Als Fängermolekül A kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, ein monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung verwen- det. Im Falle der Alzheimerschen Demenz kann beispielweise der monoklonale Anti- körper Nab228 verwendet werden und auf dem Substrat angeordnet werden.
Das Fängermolekül A weist, anders als das unten beschriebene Fängermolekül B, im erfindungsgemäßen Verfahren kein Detektionsmolekül bzw. Molekülteile auf, die zur Detektion geeignet sind. Mit dem Begriff„Anordnung“ im Hauptanspruch sind insbesondere aber nicht aus- schließlich kovalente Bindungen umfasst. Im Falle der Antikörper sind diese spezi- fisch.
Das Verfahren umfasst Schritt b). b) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungser- krankung, wird bereit gestellt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist;
Mit Bereitstellen einer komplexen Probe ist insbesondere die Wahl einer bereits bereit gestellten Probe gemeint, die aus einem erkrankten Tier und/oder eines er- krankten Menschen entstammt, welche die Proteinfehlfaltungserkrankung aufweisen bzw. bei denen überprüft werden soll, ob die entsprechenden Aggregate vorhanden sind oder nicht.
Es wird hierzu z. B. eine Probe aus einem Tier gewählt, insbesondere einer an Alz- heimerschen Demenz erkrankten transgenen Maus. Die Probe kann nach dem Tod des Tieres durch eine Aufbereitung von mindestens einer Gehirnhälfte erhalten wer- den. Mit der Aufbereitung ist insbesondere eine Homogenisierung des Hirngewebes gemeint. Es wird auf diese Weise eine Probe, erhalten aus einem erkrankten Tier, gewählt und auf das Vorhandensein einer Proteinfehlfaltungserkrankung untersucht.
Es kann sich bei der Probe aber auch um eine Zellkultur, oder um ein einem Tier oder einem Menschen entnommenes Organ oder um eine Probe aus einer Biopsie handeln. Die Probe enthält endogen gebildetes Peptid- oder Proteinaggregate der Proteinfehlfaltungserkrankung oder wird darauf hin untersucht.
Das Verfahren bezieht sich insbesondere und besonders vorteilhaft und überra- schend auf den hochselektiven Nachweis eines bestimmten Aggregats einer Protein- fehlfaltungserkrankung aus einem Gemisch an Proteinen und/oder Protein- Bruchstücken in derselben Probe. In der ausgewählten Probe kann vorteilhaft aus einem Gemisch mit mehr als einem Protein oder Proteinbruchstück ein spezifisch nachzuweisendes Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung hochsensitiv nach- gewiesen werden.
Die Probe kann insbesondere mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, oder sogar mehr als 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder sogar mehr als 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700,
800, 900 oder sogar mehr als 1000 verschiedene Proteine oder Proteinbruchstücke enthalten. Die Probe kann tausende an Proteinen und/oder Proteinbruchstücke ent- halten. Sie wird in diesem Sinne als komplexe Probe bezeichnet.
Mit dem Begriff„komplexe Probe“ ist insbesondere das vollständige Homogenat mit dem vollständigen löslichen Proteinbesatz, insbesondere des Gehirns eines verstor- benen Tiers oder Menschen, umfasst.
In Schritt b) wird als komplexe Probe insbesondere das Hirnhomogenat eines Tieres, insbesondere einer transgenen Maus, das an der Alzheimerschen Demenz litt, be- reitgestellt. Dieses umfasst ebenfalls tausende an verschiedene Proteine und/oder Proteinbruchstücke.
In Schritt b) kann somit eine komplexe Probe, enthaltend das Amyloid beta Aggregat der Alzheimerschen Demenz gewählt werden. Da seit einigen Jahren besonders die kleinen, löslichen Aß-Aggregate (Aß- Oligomere) als hauptsächlicher Verursacher für die Entstehung und den Fortschritt der Alzheimerschen Demenz verantwortlich gemacht werden, wird hiermit die Aufga- be gelöst, Wirkstoffkandidaten auf Effizienz zur Reduzierung an toxischen Aggrega- ten hochsensitiv auch bis in den femtomolaren Bereich hinab oder sogar eine voll- ständige Eliminierung nachzuweisen. Wenn ein Wirkstoff auf seine Fähigkeit zur Eliminierung der Aggregate untersucht wird, so ist ein Nachweis dieser Aggregate bis in den femtomolaren Bereich hinab möglich. Werden keine Oligomer Aggregate mehr nachgewiesen, so ist die Heilung der Alzheimerschen Demenz oder zumindest Ver- besserung des Krankheitsverlaufs mit dem Verfahren nachgewiesen.
Als Aggregat werden auch die höhermolekularen Strukturen, wie z. B. die bei der Alzheimerschen Demenz auftretenden Fibrillen nachweisbar.
Dasselbe gilt für den Fall, dass ein Aggregat einer anderen Proteinfehlfaltungser- krankung nachgewiesen werden soll. Der Begriff„quantifizierbar“ im Anspruch 1 kann im einfachsten Fall auch qualitativ ausgelegt werden, indem in einer ja/nein-Antwort das Aggregat der Proteinfehlfal- tungserkrankung nachgewiesen wird. c) Schritt c) sieht vor, aus der ausgewählten Probe die unlöslichen Bestandtei- le zu entfernen. Schritt c) erfordert daher z. B. eine Filtration oder eine Ultrazentrifugation, um die löslichen Bestandteile aus der Probe zu entfernen. Andere Verfahren sind denkbar, die der Fachmann nach seinem vorhandenen Fachwissen ebenfalls anwenden kann.
Insbesondere eine Dichtegradientenzentrifugation ist hierzu bevorzugt. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Probe nach Schritt c) fraktioniert wird. Vorteilhaft wird eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt, mit der die Probe in bis zu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, besser in bis zu 10 und besonders vorteilhaft 11 , 12, 13, 14 und ganz besonders vorteilhaft in bis zu 15 Fraktionen fraktioniert wird. Hiermit kann vorteilhaft eine bestimmte Fraktion bereitgestellt und im Weiteren ver- wendet werden, die sich deutlich hinsichtlich ihres s-Wertes von anderen Bestandtei- len der übrigen Fraktionen unterscheidet. Somit ist eine Auswahl bestimmter Fraktio- nen wie z. B. Protofibrillen oder andere Vorstufen, wie Oligomere, selektierbar und Im Weiteren zu untersuchen.
Die Partikel, die aus den amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen gebildet sind, werden somit voneinander getrennt.
Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass aus der Probe eine Mehrzahl an Frak- tionen erhalten wird. In den Fraktionen sind die Partikel an amyloiden und/oder ag- gregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit jeweils einer bestimmten Aggregat- große und -Form enthalten. Diese Trennung der Partikel kann vorteilhaft mittels der Dichtegradientenzentrifugation nach dem s-Wert vorgenommen werden.
Besonders vorteilhaft erfolgt die Fraktionierung der in der Probenlösung befindlichen amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine mittels einer Dichte- gradientenzentrifugation unter Verwendung von z. B. Optiprep, Percoll, Saccharose oder einem analogen Dichtegradientenmaterial. Die Aggregate werden dabei nach der Größe und gegebenenfalls der Form (Sedimentationskoeffizient) voneinander getrennt. Dieses Verfahren ist besonders bei aggregierenden Aß(1-42) Aggregaten und Tau-Aggregaten vorteilhaft. Alternativ kann auch eine Größenausschlusschromatographie angewendet werden, bei der nach dem hydrodynamischen Radius getrennt wird. Alternativ erfolgt die Fraktionierung durch Asymmetrische-Fluss-Feldflussfraktionierung, oder mittels Ka- pillarelektrophorese. Auch diese Verfahren sind vorteilhaft zur Kalibration geeignet.
Andere physikalische Parameter der Aggregate können ebenfalls als Grundlage der vorzunehmenden Fraktionierung herangezogen werden, z. B. der hydrodynamische Radius der Partikel. Die Fraktionen werden räumlich voneinander getrennt, z. B. durch Abpipettieren. Man ist also nicht auf eine Dichtegradientenzentrifugation eingeschränkt. Die Dichte- gradientenzentrifugation hat aber den Vorteil alle ursprünglich in der Probe vorhan- denen Aggregate der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine für eine weitere quantitative Analyse bereit zu stellen. Die Dichtegradientenzentrifugation selbst wird kalibriert, so dass die Fraktionen hin- sichtlich ihres s-Werts exakt bestimmt sind. Der Begriff„exakt bestimmt“ umfasst daher einen Kalibrierungsschritt, durch eine Fraktionierung von Molekülen bekannter Art und Verhaltens. Nach der Fraktionierung liegt in jeder Fraktion nur eine bestimm- te (das heißt bekannte) Art an Konformer vor, z. B. Oligomere oder Fibrillen und so weiter, die bei der Proteinfehlfaltungserkrankung auftreten.
Die Probe kann in Schritt c) zudem unterschiedliche, dem Fachmann bekannte, Auf- bereitungsschritte durchlaufen.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Vorbehandlung der Probe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahrensschritte bevor, die Probe am Fängermolekül A angeordnet wird:
• Verdünnen mit Wasser oder Puffer,
• Behandlung mit Enzymen, zum Beispiel Proteasen, Nukleasen, Lipasen,
• Zentrifugieren,
• Präzipitation,
• Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Antikörper zu verdrängen.
Das Verfahren erfordert den Schritt d). d) Die Probe nach Schritt c), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungs erkrankung, wird an einem Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A nach Schritt a) in Kontakt gebracht und das darin enthaltene Monomer und/oder auch das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung am Fänger- molekül A angeordnet;
Die Anordnung erfolgt spezifisch an Fängermolekül A. Die Anordnung erfolgt vorzugsweise spezifisch an einem monoklonalen Antikörper als Fängermolekül A, wie beschrieben. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine sehr spezifische Bindung zwischen dem Aggregat der Probe und seinen aus Mono- mer gebildeten Epitopen an der Oberfläche des Aggregats und dem Fängermolekül A eingegangen wird. So wird vorteilhaft bewirkt, dass z. B. andere Proteine, insbe- sondere Aggregate anderer Proteinfehlfaltungserkrankungen mit vergleichbarem s-Wert ausgeschlossen werden. Es wird also nur ein spezifisches Aggregat durch das Fängermolekül A nachgewiesen.
Die zu vermessende Probe wird also mit dem so präparierten Substrat in Kontakt gebracht und optional inkubiert. Als zu untersuchende Probe können wiederum kör- pereigene Flüssigkeiten oder Gewebe eingesetzt werden. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Probe ausgewählt aus Gehirnhomogenat, Liquor (CSF), Blut, Plasma und Urin. Es kann sich aber auch um Stichproben eines Organs (Biopsie) oder dem Homogenat des gesamten Organs, z. B. des Gehirns, handeln. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung erfolgt die Anordnung der Probe bzw. des Aggregats unmittelbar auf dem Fängermolekül A.
Unspezifisch gebundene Substanzen können durch mindestens einen Waschschritt entfernt werden.
Das Verfahren wird mit dem Schritt e) fortgesetzt. e) Ein Kalibrationsstandard wird an einem anderen Teil des Substrats am Fän- germolekül A nach Schritt a) in Kontakt gebracht und angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind; Als Kalibrationsstandard werden Partikel verwendet, die vorteilhaft etwa die Größe des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung aufweisen. Die Größe ist für den Fachmann ohne Aufwand aus der Literatur zu entnehmen. In Schritt e) wird als Kalibrationsstandard ein Partikel verwendet, der eine definierte Anzahl an Monomeren an der Oberfläche aufweist, die der Anzahl der Monome- repitope des nachzuweisenden Aggregats entspricht.
Dadurch wird vorteilhaft 1. wegen der identischen Größe des Kalibrationsstandards zum Aggregat eine ver- besserte Simulation des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung durch den Kalibrationsstandard auf dem Substrat bewirkt, und
2. eine Kalibration in Hinblick auf eine spätere exakte Quantifizierung des Aggregats hinsichtlich der tatsächlich im Aggregat vorhandenen Monomerepitope an der Ober- fläche des Aggregats möglich, da der Kalibrationsstandard etwa soviele Epitope aufweist wie das Aggregat.
Für den Nachweis von Amyloid beta Aggregat der Alzheimerschen Demenz gilt bei- spielweise, dass als Kalibrationsstandard ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 20 nm angeordnet werden sollte, da ein Amyloid beta Aggregat diese Größe annehmen kann. An der Oberfläche des Kalibrationsstandards sollten dann etwa 20- 30 Amyloid beta Monomere angeordnet vorliegen, z. B. kovalent angeordnet sein.
In Schritt e) wird als Kalibrationsstandard vorzugsweise ein Silica-Nanopartikel mit etwa 20 nm Größe und etwa 30 Amyloid beta Monomeren auf der Oberfläche ver- wendet. Dies entspricht der Größe der Amyloid beta Aggregate und der Anzahl der zugänglichen Monomerepitope im Oligomer bzw. im Aggregat.
Der Kalibrationsstandard kann für die angegebenen Zwecke wie folgt synthetisiert werden, wobei diese Verfahren nicht einschränkend sind:
Verfahren 1 :
A) Bereitstellen eines anorganischen Nanopartikels mit etwa der Größe des Ag- gregats der Proteinfehlfaltungserkrankung, B) Bildung freier Aminogruppen an der Oberfläche des Nanopartikels, zur Funkti- onalisierung der Nanopartikel-Oberfläche zu einem aminfunktionalisiertem Nanopartikel,
C1) Bildung freier Carboxylgruppen an die freien Aminogruppen aus Schritt B) zur Ausbildung freier Carboxylgruppen an der Oberfläche der Nanopartikel,
D1) Aktivierung der freien Carboxylgruppen aus Schritt C1) z. B durch die Bildung von NHS Ester an die Carboxylgruppe, und
E1 ) Bindung von freien Aminen der Monomere oder Teilstücke der Monomere an die NHS Ester aus Schritt D1).
Alternative Verfahren 2:
A) Bereitstellen eines anorganischen Nanopartikels mit etwa der Größe des Ag- gregats der Proteinfehlfaltungserkrankung,
B) Bildung freier Aminogruppen an der Oberfläche des Nanopartikels, zur Funkti- onalisierung der Nanopartikel-Oberfläche zu einem aminfunktionalisiertem Nanopartikel,
C2) Bindung von Maleinimido-Spacer-Carbonsäure an die freien Aminogruppen in Schritt B),
D2) Bindung von Monomeren des Proteinaggregats an die Maleinimido-Spacer- Carbonsäuren aus Schritt C2) über eine Sulfhydrylgruppe am freien Ende der Monomere.
Weitere Verfahren sind denkbar.
Sodann wird der Schritt f) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt. f) Ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkran- kung wird sowohl mit dem Aggregat der Probe auf dem Substrat als auch mit dem Kalibrationsstandard in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussenden kann;
Das Fängermolekül B stellt somit eine Sonde dar. Der Begriff„Fängermolekül B“ und „Sonde“ werden synonym verwendet.
Das nachzuweisende Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung aus der Probe ist andererseits bereits an Fängermolekül A angeordnet und damit auf dem Substrat immobilisiert.
Das Fängermolekül A und das oder die Fängermoleküle B können in einer Ausge- staltung der Erfindung identische affine Moleküle oder Molekülteile aufweisen. In einer weiteren Alternative können unterschiedliche affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein, oder alterna- tiv, unterschiedliche affine Moleküle oder Teile mit identischen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein. Es können auch Mischungen verschiedener Fängermoleküle B eingesetzt werden.
Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Fängermoleküle B, die an unterschiedliche Detektionsmoleküle oder Molekülteile gekoppelt sind, erhöht zum Einen die Spezifität des Signals (Korrelationssignals), zum anderen ermöglicht dies die Identifikation von Proteinaggregaten, die sich in einem oder mehreren Merkmalen unterscheiden. Dies ermöglicht eine selektive Quantifizierung und Charakterisierung der Proteinaggrega- te. Das Fängermolekül A und das oder die Fängermoleküle B binden an das gleiche Epitop oder an das gleiche überlappende Teilstück eines Epitops des Monomers.
In einem weiteren Schritt werden die an Fängermolekül A immobilisierten Proteinag gregate mit einer oder mehreren für die weitere Detektion dienlichen Sonden, dem Fängermolekül B, markiert. Wie oben beschrieben können die einzelnen Schritte auch in einer anderen Reihenfolge erfindungsgemäß durchgeführt werden. Es können vorteilhaft ein oder mehrere Fängermoleküle B gewählt werden, welche an Monomere der Proteinaggregate binden, wobei die Fängermoleküle B auch erst nach der Bindung an das Aggregat in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emit- tieren. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„quantitative Bestimmung“ zu- nächst die Bestimmung der Konzentration der Proteinaggregate, mithin also auch die Bestimmung ihrer An- und oder -Abwesenheit.
Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Fängermoleküle B, die nicht an Proteinaggregate gebunden sind, entfernt. Dadurch kann die Sensitivität durch Reduktion des Hintergrundsignals weiter gesteigert werden.
In einer Alternative des Verfahrens werden diese überschüssigen Fängermoleküle B nicht entfernt. Dadurch entfällt ein Waschschritt und es findet auch keine Gleichge- wichtsverschiebung in Richtung der Dissoziation der Proteinaggregat-Sonden- Komplexe oder -Verbindungen statt. Durch die ortsaufgelöste Detektion werden die überschüssigen Sonden bei der Auswertung nicht erfasst.
In einer Ausführung sind die Bindungsstellen des Proteinaggregats Epitope und die Fängermoleküle sind Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente hier- von.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich das Fängermole- kül A und das oder die Fängermoleküle B.
So können z. B. unterschiedliche Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Frag- mente als Fängermoleküle B eingesetzt werden. In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung werden ein Fängermolekül A und ein oder mehrere Fänger- moleküle B eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind. In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei Fängermoleküle B eingesetzt, die z. B. unterschiedliche Antikörper enthalten und gegebenenfalls auch unterschiedliche Farbstoffmarkierung tragen.
In jedem der oben beschriebenen Fälle wird nur eine Sorte Fängermolekül A ver- wendet.
Zur Detektion sind die Fängermoleküle B so gekennzeichnet, dass sie vorzugsweise ein optisch detektierbares Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Biolumineszenz- und Chemolumineszenz-Emission sowie Absorp- tion. In einer Alternative sind die Fängermoleküle B als Sonden somit mit Fluoreszenz- farbstoffen markiert. Als Fluoreszenzfarbstoff können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können GFP (Green Fluorescence Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie Quantendots verwendet werden.
Das Fängermolekül A hat keine Sondenfunktion wie das Fängermolekül B. Lediglich zur Qualitätskontrolle der Oberfläche, zum Beispiel zum Nachweis der Gleichmäßig- keit der Beschichtung mit Fängermolekül A, kann auch das Fängermolekül A mit einem Fluoreszensfarbstoff eingesetzt werden. Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit dem Nachweis des Fluoreszenzfarbstoffs der Sonde am Proteinaggregat interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus des Substrats möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.
Das oder die Fängermoleküle B können derart ausgewählt und verwendet werden, dass die Anwesenheit von einzelnen Proteinaggregat-Merkmalen, das Messergebnis nicht beeinflussen.
Es kann insbesondere ein fluoreszierender, monoklonaler Antikörper als Fängermo- lekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung mit dem gebundenen Aggregat und dem Kalibrationsstandard in Kontakt gebracht und hieran angeordnet werden. Als Fängermolekül A und als Fängermolekül(e) B können somit insbesondere mono- klonale Antikörper gewählt werden. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine aus- reichende Sensitivität und Stärke der Anordnung an das Aggregat und/oder Kalibra- tionsstandard vorgegeben wird. Es kann als Fängermolekül B ein Gemisch aus monoklonaler Antikörpern, wie z. B. mAb IC16, markiert mit CF-633, und Nab228 markiert mit CF-488, verwendet wer- den.
Als Fängermolekül A nach Schritt a) und als Fängermolekül(e) B nach Schritt f) soll- ten Moleküle gewählt werden, die an dieselbe Zielregion des Monomers der Protein- fehlfaltungserkrankung binden. Dadurch wird besonders vorteilhaft bewirkt, dass Monomere in der Probe nicht mehr von Fängermolekül(en) B gebunden werden kann, da die Zielregion bereits durch Fängermolekül A belegt ist.
Zum Beispiel kann im Falle des Amyloid beta das Fängermolekül A nach Schritt a) und das Fängermolekül B / der Antikörper nach Schritt f) beide an die Aminosäuren 3-8 (vom N‘-Ende aus betrachtet) binden. Liegt z. B. eine Probe mit Amyloid beta
1-42 Aggregat an dem Fängermolekül A des Substrats vor, so kann nach Schritt f) nur dann eine Bindung des Fängermoleküls B an Amyloid beta erfolgen, wenn weite- re Epitope vorliegen, das heißt ein Aggregat mit weiteren Oberflächen-Epitopen gebunden wird. Es versteht sich, dass diese Ausführungen lediglich beispielhaften Charakter haben und nicht einschränkend sein sollen.
Das Verfahren diskriminiert vorteilhaft von sich aus Monomere, die nicht mehr nach gewiesen werden.
Schritt g) des Verfahrens kann wie folgt durchgeführt werden: g) Das Signal der Fängermoleküle B am Probenaggregat wird mit dem Signal der am Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifi- zierung des Probenaggregats verglichen. Schritt g) erfordert dann den Nachweis des Signals, insbesondere eines Fluores- zenzsignals, das vom beispielweise fluorezierenden monoklonalen Antikörper als Fängermolekül B ausgesendet wird. Hierzu kann z. B. ein TIRF (engl. Total Internal Reflection Fluorescence) System verwendet werden. In einer Ausführung erfolgt eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals, also eine ortsaufgelöste Detektion des Signals, welches von der Sonde emittiert wird. Demgemäß sind in dieser Ausführung der Erfindung Verfahren, die auf einem nicht- ortsaufgelösten Signal beruhen, wie ELISA oder Sandwich-ELISA, ausgeschlossen.
Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung sehr vorteilhaft. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Proteinaggregates vor einem Hintergrundsignal, welches z. B. durch gerätespezifisches Rauschen, andere unspezifische Signale oder unspe- zifisch gebundene Sonden verursacht wird, ermöglicht. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Read-out- Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse (Pixel), vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA-Verfahren ohne ortsaufgelöstem Signal dar.
In einer Ausführung beruht die ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals auf total intern reflection fluorescence microscopy (tirfm) und der Untersuchung eines kleinen Volumenelements im Vergleich zum Volumen der Probe, im Bereich von wenigen Femtolitern bis unterhalb eines Femtoliters, oder eines Volumenbereichs oberhalb der Kontaktoberfläche der Fängermoleküle mit einer Höhe von 500 nm, bevorzugt 300 nm, besonders bevorzugt 250 nm, insbesondere 200 nm.
Die Detektion der immobilisierten und markierten Proteinaggregate erfolgt mittels Abbildung der Oberfläche, z. B. mit Laser Scanning Mikroskopie. Eine möglichst hohe Ortsauflösung ermittelt eine hohe Anzahl an Bildpunkten, wodurch die Sensitivi- tät sowie die Selektivität des Verfahrens weiter erhöht werden können, da strukturelle Merkmale mit abgebildet und analysiert werden können. Somit erhöht sich das spezi- fische Signal vor dem Hintergrundsignal von z. B. unspezifisch gebundenen Sonden. Die Detektion erfolgt beispielweise bevorzugt mit ortsauflösender Fluoreszenz- mikroskopie durch ein TIRF-Mikroskop, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten davon, wie zum Beispiel STORM und/oder dSTORM.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z. B. in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird, oder ein FCS (Fluorescence Corre- lation Spectroscopy System) dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflö- senden Varianten wie zum Beispiel STED, PALM oder SIM.
Wiederum im Unterschied zu ELISA entstehen durch diese Verfahren so viele Read- out-Werte, wie ortsaufgelöste Ereignisse (z. B. Pixel) vorhanden sind. Abhängig von der Anzahl an unterschiedlichen Sonden wird diese Information vorteilhaft verviel- facht. Diese Vervielfachung gilt für jedes Detektionsereignis und führt zu einem In- formationsgewinn, da sie weitere Eigenschaften, z. B. ein zweites Merkmal, über Proteinaggregate offenbart. Durch so einen Aufbau kann für jedes Ereignis die Spe zifität des Signales erhöht werden. Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen, z. B. die Fluoreszenz- Intensität, aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um z. B. die Anzahl der Proteinaggregate, deren Größe und deren Merkmale zu bestimmen.
Dabei können z. B. auch Algorithmen der Hintergrundminimierung und/oder auch Intensitäts-Schwellenwerte für die weitere Auswertung sowie der Mustererkennung angewandt werden.
Weitere Bildanalyse-Optionen beinhalten z. B. die Suche nach lokalen Intensitätsma- xima, um aus der Bildinformation die Zahl an detektierten Proteinaggregaten zu erhalten und auch die Partikelgrößen bestimmen zu können.
Es können Waschschritte nach den Schritten a), d), e) und f) durchgeführt werden. Es versteht sich, dass die Schrittabfolge a) bis g) in Patentanspruch 1 wie beschrie- ben lediglich der Verdeutlichung dient und keine zeitlich aufeinanderfolgende Abfolge an Schritten darstellt. Ohne weiteres kann Schritt b) und c) z. B. vor Schritt a) erfol- gen.
Beispielhaft werden daher in einer anderen Variante des Verfahrens, die Proteinag- gregate mit den Fängermolekülen B in Kontakt gebracht und angeordnet, bevor die Aggregate mit den Fängermolekülen A in Kontakt gebracht werden, wodurch somit eine Immobilisierung von mit Sonden markierten Proteinaggregate auf dem Substrat erfolgt.
Dann ist das Verfahren z. B. wie folgt durchzuführen:
Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungser- krankung in einer komplexen Probe, gekennzeichnet durch die Schritte: a) Auf einem Substrat wird ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet; b) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungser- krankung, wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist; c) Aus der Probe werden die unlöslichen Bestandteile entfernt; d) Ein Kalibrationsstandard wird an einem Teil des Substrats mit dem Fänger- molekül A nach Schritt a) in Kontakt gebracht und angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren oder Teile der Monomere vorliegt, die das Epitop der nachzuweisenden Ag- gregate der Proteinfehlfaltungserkrankung aufweisen; e) Mindestens ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung wird mit dem Aggregat der Probe in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das oder die Fängermoleküle B ein detektierbares Signal aussenden kann bzw. können; f) Das oder die Fängermoleküle B am Aggregat der Proteinfehlfaltungserkran- kung wird mit dem Fängermolekül A an einem Teil des Substrats und dem Kalibrationsstandard an einem anderen Teil des Substrats in Kontakt ge- bracht, und das Aggregat an das Fängermolekül A und an den Kalibrations- standard angeordnet. g) Das Signal der Fängermoleküle B am Probenaggregat wird mit dem Signal der am Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifi- zierung des Probenaggregats verglichen.
Mithin können das oder die Fängermoleküle B an das Aggregat gebunden werden bevor dieses mit Fängermolekül A in Kontakt gebracht wird und an das Substrat immobilisiert wird.
Auch hier sind beliebige Abfolgen möglich, z. B. kann Schritt b), c) und e) vor allen anderen Schritten erfolgen.
In einer weiteren Variante des Verfahrens, wird die Probe nach dem in Kontakt brin- gen der Proteinaggregate mit Fängermolekül B chemisch fixiert, z. B. durch Formaldehyd.
Überraschend wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass das Verfahren bei der Detektion von Aggregaten in komplexen Proben wie Mausgehirn-Homogenat eine sehr hohe Sensitivität auswies und vollkommen in-sensitiv gegenüber endogen vor- handenen Monomeren ist.
Besonders überraschend ist zudem, dass trotz der Komplexität der Probe keine störenden Signale zu Proben aus Wildtyp Mäusen ermittelt wurden. Damit ist gezeigt, dass es keine störenden Hintergrundsignale gibt. In Wildtyp Tieren befindet sich kein humanes Abeta 1-42, deshalb reagiert dort der Antikörper nicht. Das Verfahren weist Aggregate der jeweiligen Proteinfehlfaltungserkrankung im femtomolaren Bereich nach, insbesondere bis zu einem Bereich von 1000-500 fM, besonders vorteilhaft 100-500 fM, insbesondere 50-100 fM und von 5-10 fM. Da es sich nicht um ein Elisa gebundenes Verfahren handelt, ist der Nachweis gegenüber diesem Verfahren um den Faktor von bis zu 10.000 verbessert.
Der Vergleich über die definierte Anzahl der Epitope am Kalibrationsstandard erlaubt vorteilhaft eine exakte Quantifizierung der Epitope im Aggregat der Proteinfehlfal- tungserkrankung.
Ein monoklonaler Antikörper als Fängermolekül A in Schritt a) und als Fängermole- kül(e) B in Schritt f) kann verwendet werden, die z. B. Amyloid beta 3-8 als identische Zielregion des Monomers aufweisen. Dadurch wird der oben genannte Zweck erfüllt, keine Monomere der Probe mehr zu binden.
Das Verfahren eignet sich deshalb besonders gut zum Nachweis von Aggregaten der Proteinfehlfaltungserkrankungen, da kein Monomer der Proteinfehlfaltungserkran- kung nachgewiesen werden kann.
Die Erfindung löst die Aufgabe überraschend auch in einer komplexen Matrize, wie Gehirnhomogenat mit tausenden an unterschiedlichen Proteinen und Proteinbruch stücken. Das Verfahren detektiert dabei selbst geringste Mengen von Proteinaggre- gaten sogar in Anwesenheit von dessen Monomer, da dieses nicht von Fängermole- kül(en) B gebunden werden kann.
Eine weitere Aufgabe, die gelöst wird, ist, dass auch heterogene Proteinaggregate, bestehend aus mehr als einer Art von Protein, eindeutig als Aggregat identifiziert werden können.
Die Erfindung erschöpft sich hieran noch nicht. Es wird auch eine Vorrichtung zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Pro- teinfehlfaltungserkrankung in einer komplexen Probe bereitgestellt. Diese umfasst ein Substrat, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Proteinfehlfaltungser- krankung angeordnet vorliegt. An einem Teil des Fängermoleküls A auf dem Substrat ist als Kalibrationsstandard ein Partikel mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, die der Anzahl der Epitope im nachzu- weisenden Aggregat entspricht. Ein anderer Teil des Fängermolekül A an einem anderen Teil des Substrats stellt die Bindungsstellen für Monomere des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung aus der komplexen Probe bereit.
Die Vorrichtung umfasst den Kalibrationsstandard mit dem vorteilhaft eine Quantifi- zierung der Aggregate bis in den femtomolaren Bereich ermöglich ist.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise gekennzeichnet dadurch, dass als Kalibrations- Standard ein Partikel mit der Größe des nachzuweisenden Aggregats angeordnet ist.
Die Vorrichtung ist insbesondere gekennzeichnet durch ein Silica-Nanopartikel als Kalibrationsstandard.
Die Vorrichtung ist besonders vorteilhaft eine Mikrotiterplatte, wobei die Mikrotiter- platte mindestens eine Reaktionskammer als Teil des Substrats aufweist, auf deren Boden ein an Fängermolekül A angeordneter Kalibrationsstandard angeordnet ist und mindestens eine weitere Reaktionskammer als Teil des Substrats aufweist, auf deren Boden Fängermolekül A für das nachzuweisende Aggregat der Proteinfehlfal- tungserkrankung angeordnet ist.
Die Aufgabe wird zudem gelöst durch ein Kit zur Quantifizierung von Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung, umfassend:
- ein Substrat, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Protein- fehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt und an einem Teil von Fän- germolekül A ein Kalibrationsstandard mit einer definierten Anzahl an Mo- nomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist; - Hiervon getrennt ein Fängermolekül B auf dem Substrat für das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung, wobei das Fängermolekül A und das Fängermolekül B an dieselbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfal tungserkrankung binden.
Mischschalen und Puffer für das Fängermolekül B sind optional vorhanden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner auch ein Kit enthaltend eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
- Substrat, optional mit einer hydrophilen Oberfläche,
- Mindestens ein Fängermolekül A,
- Alternativ: Substrat mit Fängermolekül A, und/oder Kalibrationsstandard
- Fängermolekül(e) B, - Lösungen,
- Kalibrationsstandard,
- Puffer.
Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätz- lich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten bereits an das Substrat als an einem festen Träger, wie z. B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Dann umfasst das Substrat eine solche Mikrotiterplatte. Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine beliebige der Ausführungsformen enthalten. In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle bereits immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Beschichtung und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung oder einem Puffer überschichtet vorliegen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Proteinaggregaten in beliebigen Proben zur Quantifizierung und damit Titerbe- stimmung von Proteinaggregaten.
Die Verwendung einer Vorrichtung oder eines Kit sowie die Erweiterung des Verfah- rens sind für den quantitativen Nachweis der Konzentration an Aggregat einer Pro- teinfehlfaltungserkrankung gegeben.
Die Verwendung der Vorrichtung bzw. des Kit ermöglicht auf diese Weise ein Verfah- ren durchzuführen, das ausreichend sensitiv ist, um ein Aggregat einer Protei nfehlfal- tungserkrankung in komplexen Proben wie zum Beispiel homogenisiertem Gehirn, am Ende eines (Tier-)Versuchs nachweisen zu können.
Beispielweise kann durch die Dichtegradientenzentrifugation jede gewünschte Frak- tion auf Konzentrationsänderungen mit oder auch ohne eine Wirkstoffzugabe untersucht werden. Das Verfahren stellt einen Verfahrensschritt bereit, der es erlaubt, mehr als eine Fraktion aus der Dichtegradientenzentrifugation auf Konzentrationsän- derungen hin zu untersuchen oder auch auf Änderungen der Aggregatgröße oder anderer Parameter.
Durch die Dichtegradientenzentrifugation werden vorzugsweise mehr als 3, 4 oder mehr als 5 Fraktionen gewonnen, die sowohl in quantitativer als auch in qualitativer Weise untersucht werden können und nicht nur im Hinblick auf Konzentrationsände- rungen. Der Begriff„gewünschte Fraktion“ im Sinne des Verfahrens umfasst insbe- sondere aber nicht ausschließlich solche Fraktionen, die vor der Auftrennung auch aggregierende bzw. aggregierte Peptide und/oder Proteinbausteine enthielten, ins- besondere toxische Oligomere. Das Verfahren ist nicht ursächlich darauf ausgerichtet, wenngleich selbstverständlich ein Wirkstoff zu der Probe zugegeben werden kann, welche die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine mit unterschiedlicher Aggregatgröße und -Form umfasst. Oder aber es handelt sich um ein am Ende einer Tierstudie ent- nommenes Organ (z. B.: das Gehirn), das als Probe dient. Hierbei können die Pro- ben eines mit Placebo behandelten Tiers mit jenen von mit Wirkstoff behandelten Tieren verglichen werden.
Ein Wirkstoff bzw. die Behandlung mit dem Wirkstoff ändert die Größen Verteilung und damit die Konzentration bestimmter Aggregate im Organ und somit in der homo- genisierten Probe. Diese Konzentrationsänderung wird dann quantitativ festgestellt. Die Änderung ist ein Maß für die Reduktion oder sogar für die vollständige Eliminie- rung bestimmter toxischer Spezies mit nachweisbarer Aggregat- bzw. Partikelgröße. Das heißt, dass das Verfahren die Zunahme oder die Abnahme der Konzentration bestimmter amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine über die Änderung der Aggregatgrößenverteilung in der Probe nachweist.
Die Zusammensetzung an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit unterschiedlicher Aggregatgröße und -Form wird also während der Behandlung unter Einfluss des Wirkstoffs verändert. Andere Partikelgrößen nehmen unter dem Einfluss des Wirkstoffs zu oder bleiben konstant.
Dadurch wird vorteilhaft die Konzentrationsänderung an amyloiden und/oder aggre- gierenden Peptiden und/oder Proteinen mit jeweils bestimmter Größe quantitativ mit oder auch ohne den Einfluss eines Wirkstoffs erkennbar. Durch einen Vergleich mit Kontrollen ohne den Wirkstoff kann der Einfluss des Wirkstoffes auf die Verteilung der Aggregate der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine in der jeweiligen Fraktion quantitativ bestimmt werden. Hierdurch erhält man ein Maß unter anderem über die Wirksamkeit des Wirkstoffes hinsichtlich seiner Fähigkeit bestimmte Spezies während der Behandlungsphase zu eliminieren, z. B. toxische Oligomere.
Es ist auch möglich, nur eine einzige Fraktion auf diese Weise zu untersuchen. Man erhält dann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Maß über die Fähigkeit des Wirkstoffs die bestimmten Konformere aus der Fraktion quantitativ zu verändern, z.
B. toxische Oligomere im Tiermodell zu eliminieren.
In einer Ausgestaltung der Erfindung wird auch die Änderung der Formverteilung der Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss eines Wirkstoffes untersucht vorzugs- weise durch Fluoreszenz-Mikroskopische Verfahren.
Damit ist optional auch der Nachweis einer molekularen Wirkstoffaktivität im Tiermo- dell möglich. Von großem Vorteil ist die schnelle und zuverlässige Untersuchung am Ende einer Tierstudie, die die Reduktion von aggregiertem Aß (A-Beta) in Abhängig- keit von der Behandlung mit einem Wirkstoff quantitativ bis in den Femtomolaren Bereich nachweist.
Durch die besonders vorteilhafte Kombination einer auf Dichtegradientenzentrifugati- on basierenden Fraktionierung und der Konzentrationsbestimmung mit Hilfe der Fluoreszensmikroskopie, insbesondere der Laser Scanning Mikroskopie und der TIRF Mikroskopie wurde somit ein Verfahren entwickelt, welches besonders sensitiv den Einfluss potentieller Wirkstoffe auf den Anteil an toxischen Oligomer-Spezies eines Aß(1-42)-Peptids oder anderer Peptide und/oder Proteine quantifiziert, da es die Monomerform nicht misst.
Optional wird ein Wirkstoff in einer Tierstudie eingesetzt und hinsichtlich seiner Dosis abhängigen Einflusses auf die Partikelgrößenverteilung der Probe in vivo getestet in Abhängigkeit einer Kontrolle. Ganz besonders vorteilhaft ist das Verfahren geeignet für das Screening potentieller Wirkstoffe gegen die Alzheimersche Demenz (AD) basierend auf der Modulation der toxischen Amyloid-ß (Aß)-Oligomere unter dem Einfluss des Wirkstoffes. Besonders Vorteilhaft ist es wenn diese Studien von Verhal- tensuntersuchungen der Tiere begleitet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert zudem ein umfassendes, quantitatives Er- gebnis in Hinblick auf die sich ändernde Partikel- bzw. Aggregatgrößenverteilung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss des Wirkstoffes. Damit werden erfolgversprechende Wirkstoffe, z. B. für eine Thera- pie der Alzheimerschen Demenz, welche die Konzentration an löslichen toxischen Bestandteilen wie z. B. den Aß-Oligomeren verringern soll auf ihre Wirkung im Tier- modell untersucht.
Das Verfahren ist hierauf nicht beschränkt. Ohne eine Einschränkung des Verfahrens erlaubt dieses darüber hinaus auch die Feststellung, ob der Wirkstoff zu einer Zu- nähme anderer potentiell toxischer oder erwünschter Spezies im Tiermodell führt. Vorzugsweise wird das Verfahren angewendet bei der Ermittlung von Wirkstoffen die nach heutigem Erkenntnisstand nicht zu einer Zunahme anderer toxischer Bestand- teile führen. Hierzu werden besonders vorteilhaft mehrere der erhaltenen Fraktionen auf Konzentrationsänderung der Bausteine erfindungsgemäß untersucht. Ein Vergleich der Kontrolle mit der einen Wirkstoff oder einen natürlichen Liganden beinhaltenden Probe erlaubt eine reproduzierbare und schnelle Bestimmung der Wirkstoffeffektivität bezüglich der Eliminierung und Reduktion bestimmter Spezies wie z. B. Oligomere und somit eine Abschätzung seiner Wirkung in einem Tiermodel und später in den klinischen Testphasen. Es ist denkbar, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl an poten- tiellen Wirkstoffen hinsichtlich ihres Einflusses auf die Partikelgrößen-Verteilung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe schnell und reproduzierbar quantifiziert werden. Die Probe kann dabei synthetischer Art sein. Es können aber auch natürliche Wirkstoffe oder entnommene Proben auf diese Wei- se untersucht werden.
Die Erfindung ist noch nicht auf die bisherigen Ausführungen eingeschränkt. Vielmehr kann in einer vereinfachten Variante das Verfahren auch wie folgt durchgeführt werden:
Verfahren zum Nachweis von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe mit den Schritten: a) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungser- krankung, wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers oder nachweisbare Teile hiervon an der Oberfläche des Aggregats aufweist; b) Die Probe nach Schritt a), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungs- erkrankung, wird mit dem Substrat in Kontakt gebracht und das darin enthal- tene Monomer auf dem Substrat angeordnet; c) Mindestens ein Fängermolekül B wird als Sonde zum Nachweis gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung mit dem Aggregat der Probe in
Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussen- den kann.
In einer Ausgestaltung dieses Verfahrens wird auf dem Substrat ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung vor dem Schritt a) angeord- net und in Schritt b) das Monomer des Aggregats an Fängermolekül A angeordnet.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird hierzu eine Probe gewählt, aus der die unlöslichen Bestandteile vorab entfernt wurden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Kalibrationsstan- dard an einem anderen Teil des Substrats bzw. an einen anderen Teil des Fängermoleküls A angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine exakt definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungser- krankung angeordnet sind.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung dieser Erfindung wird das Signal der an dem Probenaggregat angeordneten Fängermoleküle B mit dem Signal der an dem Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen.
Es versteht sich, dass sich weitere vorteilhafte Ausführungen bzw. Wirkungen ein- stellen, sofern die oben genannten Merkmale des speziellen Verfahrens mit den Schritten a) bis g) auf das vereinfachte Verfahren nach den Schritten a) bis c) ange- wendet werden. Daher ist die Erfindung im einfachsten Falle der Nachweis eines Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung auf einem Substrat mit einer entsprechenden Sonde, dem Fängermolekül B.
Ausführungsbeispiele Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beige- fügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.
Der Kalibrationsstandard wird im Detail wie folgt bereitgestellt:
Schritt A Erstellung des anorganischen Nanopartikels. In einem Rundkolben werden 200 ml of Ethanol, 3,8 ml 30 % Ammoniumhydroxid, 3,5 ml deionisertes Wasser und 4,4 ml Tetraethoxysilan für 2 Tage konstant gerührt. Das Reaktionsprodukt sind Silica Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 20 nm. Die Größe wird mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie ermittelt und entspricht der Größe des Amyloid beta Aggregats. Die Ausbeute wird durch Ver- dampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt.
Schritt B: Oberflächenmodifikation mit primären Aminen zur Bildung freier Amino- gruppen.
45 ml der Reaktionslösung aus Schritt A werden mit 10 pl Eisessig und 165 pl 3- Aminopropyl-triethoxy-silan gemischt und für vier Stunden gerührt. Im Anschluss werden die Partikel durch mehrmaliges zentrifugieren und Wiederaufnahme in Etha- nol gereinigt. Die Ausbeute wird durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwie- gen ermittelt.
Schritt C1 : Oberflächenmodifikation mit Carboxyl-Funktionalitäten.
50 ml der gereinigten Partikel aus Schritt B werden zentrifugiert, in 50 ml Dimethyl- formamid aufgenommen und in einen Rundkolben überführt. Nachdem 5 mmol Bers- teinsäure Anhydrid der Lösung hinzugefügt wurden, wird die Lösung unter Argon Atmosphäre für eine Stunde auf 90°C gerührt und erhitzt. Nach Ablauf der Zeit wird die Lösung für 24 Stunden weitergerührt. Die carboxylierten Partikel werden durch Zentrifugation und Wiederaufnahme in deionisertem Wasser gereinigt und die Aus- beute durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt.
Schritt C2: Oberflächenmodifikation mit Maleinimido Funktionalitäten.
200 pmol Partikel aus Schritt B werden in 1 ml 100 mM 2-(N- Morpholino)ethansulfonsäure Puffer bei pH 6 mit 10 Volumen % Dimethylformamid aufgenommen und mit 40 pmol 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 10 pmol N-Hydroxysuccinimid, 40 pM 6-Maleimid-hexansäure versetzt und für eine Stunde gemischt. Die Partikel werden durch mehrmaliges Zentrifugieren und Wie- deraufnahme im oben genannten Puffer gereinigt.
D1 : Biokonjugation von Amyloid beta (1-42) an Carboxy Silica Nanopartikel.
100 pmol carboxylierte Partikel werden in 1 ml deioniesiertem Wasser aufgenommen und mit 20 pmol 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 5 pmol N-Hydroxy- succinimid versetzt und für eine Stunde gemischt. Die aktivierten Partikel werden durch mehrmaliges Zentrifugieren und Wiederaufnahme in deionisiertem Wasser gereinigt. Final wird das Partikel Pellet in Phosphat Puffer aufgenommen, zu 0,3 mg rekombinantem Amyloid beta 1-42 Peptid hinzugefügt und über Nacht geschüttelt. Die biokonjugierten Partikel werden durch Zentrifugieren, Wiederaufnahme in Hexaf- luoropropanol und Inkubation für eine Stunde gereinigt. Im Anschluss wird das Lö- sungsmittel durch mehrmaliges Zentrifugieren und Wiederaufnahme in deionisertem Wasser gereinigt. Die Amyloid beta (1-42) Partikel werden durch Zentrifugation und Wiederaufnahme in deionisertem Wasser gereinigt und die Ausbeute durch Ver- dampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt. Die Epitopanzahl wird über einen kommerziellen erhältlichen Bicinchoninsäure Test ermittelt und zu der Partikelkonzentration in Relation gesetzt.
D2: Biokonjuagtion von Amyloid beta (hier 1-15) Peptiden mit C-terminaler Sul- fhydrylmodifikation. 1 ml der Partikel aus Schritt C2 werden werden zentrifugiert und in einem ml 100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure Puffer bei pH 6 mit 10 volumen % Dimethylfor- mamid und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure aufgenommen mit 15 nmol des Pep- tids (Sequenz: DAEFRHDSGYEVHHQC, Amyloid beta 1-15 mit einer zusätzlichen Cystein Modifikation) versetzt und für 10 Minuten geschüttelt. Nach Ablauf der Zeit werden 50 pmol Tris(2-carboxyethyl)phosphin der Lösung hinzugefügt und die Lö- sung über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag werden die Partikel durch Zentrifugie- ren und Wiederaufnahme in deionisiertem Wasser gereinigt und die Ausbeute durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt. Die Epitopanzahl wird über einen kommerziellen erhältlichen Bicinchoninsäure Test ermittelt und der Partikel- konzentration in Relation gesetzt.
Es zeigen:
Figur 1 : Aggregat Assay Ergebnis zweier durch Dichtegradientenzentrifugation
(DGZ) fraktionierter und homogenisierter Maus Gehirn Proben. Figur 2: Silberfärbung der Proteine in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomo- genat einer APPSWe/PS1AE9 transgenen Maus.
Figur 3: Westernblot von Amyloid beta Proteinen in den einzelnen Fraktionen des
Gehirnhomogenat der APPswe/PS1AE9 transgenen Maus.
Figur 1 zeigt das Aggregat Assay Ergebnis zweier in durch Dichtegradientenzentrifu- gation (DGZ) fraktioneller homogenisierter Maus Gehirn Proben (ganze Hemisphe- re). Beide Mäuse waren zum Zeitpunkt der Organentnahme 24 Monate alt. Die als transgenes Tier bezeichnete Maus war eine APPSWe/PS1AE9 doppel Mutation, die stark humanes Amyloid beta exprimiert. Wild Typ Tiere exprimieren kein humanes Amyloid beta und werden daher im Assay durch den Einsatz von Antikörpern, die sich gegen humanes Amyloid beta richten nicht erkannt.
Die Fraktionen sind unterscheidbar und zeigen die gleiche Verteilung wie der Wes- tern blot (Fig. 3) an. Damit ist gemeint, dass die Konzentration dargestellt in der Figur 1 etwa dem Muster im Western Blot (Figur 3) entspricht allerdings mit dem Vorteil einer genauen quantitativen Aussage durch das erfindungsgemäße Verfahren.
Die Messung war erfolgreich, trotz des starken Hintergrunds durch die komplexe Probe wie leicht an der Figur 2 durch unzählige Banden gezeigt werden kann. Im Gegensatz zum Western Blot erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren ohne eine weitere Trennung (am Gel) direkt den Nachweis spezifischer Amyloid beta Aggregate und mit Hilfe des Kalibrationsstandards sind diese vorteilhaft auch absolut quantifizierbar.
Probenvorbereitunq, Homogenisierung und Dichtezentrifuqation Für die Homogenisierung wurden jeweils die rechten Hemispheren verwendet und für
2 x 20 s bei 6500 rpm (Precellys® 24, Bertin Instruments, Montigny-Ie-Bretonneux, France) mit Tris Puffer (pH 8.3, 20 mM Tris, 250 mM NaCI, und Protease und Phos- phatase Inhibitoren (beides Roche, Basel, Schweiz) behandelt.
150 mI des Homogenats wurden nochmals bei 1200 g für 10 min zentrifugiert und 100 pl des Überstandes auf einen Dichtegradienten aufgetragen. Der Dichtegradient bestand aus 5 bis 50 % (w/v) lodixanol (OptiPrep, Axis-Shield, Norway). Nach der Zentrifugation (3 h, 259.000 x g, bei 4 °C) (Optima TL-100, Beckman Coulter, USA), 14 Fraktionen (je 140 mI) wurden von oben nach unten hin abgenommen, in flüssi- gem Stickstoff gefroren und bei -80°C bis zur Analyse aufbewahrt. Plattenvorbereitunq und Messung
Für den Assay wurden zunächst 384 well Mikrotiter-Platten mit 170 pm starkem Glasboden (Sensoplate Plus, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) vorbereitet.
Der Glasboden der Platte wurde mit APTES (99 %; (3-Aminopropyl) triethoxysilane; Sigma-Aldrich, Germany) durch Bedampfung silanisiert. Dafür wurde die Platte in einem Exsikator über 5 ml einer Lösung bestehend aus 5 % APTES in Toluol (99 % Sigma-Aldrich, Germany) in einer Argon Atmosphere für 1 h gelagert. Danach wurde die APTES Lösung entfernt und die Platte für 2 h unter Vakuum getrocknet. In die Reaktionskammem (RK) der Platte wurde eine 2 mM succinimidyl carbonate-poly- (ethylene glycol)-carboxymethyl (MW 3400, Laysan Bio, Arab, USA) in dd H O ge- füllt und für 4 h inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktionskammer 3 mal mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Beschichtung mit 200 mM N-(3- dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (98 %; Sigma-Aldrich, Germany) und 50 mM N-hydroxysuccinimide (98 %; Sigma-Aldrich, Germany) akti- viert und für 30 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit dd H O wurden 10 pg/ml Fängerantikörper (Fängermolekül A), der sich gegen den N-terminus von Amy- loid beta richtet (Nab228 monoclonal antibody, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in PBS den Reaktionskammer hinzugefügt und für 1 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBS + 0,2 %Tween (TBST) und TBS wurden die RK mit Smartblock Lösung über Nacht geblockt (Candor Bioscience, Germany). Am nächsten Tag wurde die Platte dreimal mit TBS gewaschen und Proben und Standards als Triplikat auf die Platte aufgetragen und für 1 h inkubiert.
Gehirnhomogenat Proben wurden zehnfach in TBS verdünnt bevor sie auf die Platte aufgetragen wurden. Als Kalibrationsstandard für Amyloid beta Oligomere dienten Aß1-42-SiNaPs (Silica Nanopartikel) mit einem Durchmesser von 20 nm und ca. 30 Epitopen (Aß1-42), welche, wie beschrieben, synthetisiert wurden.
Nach dem dreimaligen Waschen mit TBS wurden zwei verschiedene Sondenantikör- per als Fängermoleküle B Ge 1.25 pg/ml) mAb IC16, markiert mit CF-633, (Sigma- Aldrich, Germany) und Nab228 (epitope Aß1-10) markiert mit CF-488 (beides Sigma- Aldrich, Germany), verwendet. Die Sonden wurden vor der Zugabe auf die Platte gemischt und ultrazentrifugiert (100.000 g, 1 h, 4 °C) und 1 h inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Reaktionskammer dreimal mit TBS gewaschen und die Platte versiegelt. Die Messung erfolgte in einem Leica multi-colour TIRF (total internal reflection fluorescence) System (AM TIRF MC, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Das TIRF System war mit einer automatisierten xyz Bühne und einem 100 x Öl Immersion Objective (1.47 oil CORR TIRF Leica) ausgestattet. Die Bilder wurden konsekutiv bei Ex/Em = 633/705 nm und 488/525 nm mit einer Belichtungs- zeit von 500 ms und einer Verstärkung von 800 für beide Kanäle aufgezeichnet. Die TIRF Eindring-Tiefe wurde auf auf 200 nm gesetzt. Das Mikroskop nahm 5 x 5 Bilder pro RK in jedem Kanal. Jedes Bild besteht aus 1000 x 1000 pixel mit einer lateralen Auflösung von 116 nm und einer 14 bit Intensitätsauflösung. Intensitätsgrenzwerte wurden auf Basis der Negativkontrolle in jedem Kanal ausge- wertet. Dieser Grenzwert wurde dann auf alle Bilder angewendet und nur jene Bild- punkte gezählt, welche an der derselben Position in beiden Kanälen (kolokalisiert) über den Intensitätsgrenzwerte lagen. Durch die Auswertung des Aß1-42-SiNaP Standards, lässt sich die Anzahl an kolokalisierten Bildpunkten über den Schwellen- werten in Oligomer konzentrationen umwandeln.
Figur 2 zeigt die Silberfärbung der gesamten Proteine in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomogenat der APPswe/PS1AE9 transgenen Maus.
Für die Silberfärbung wurden 12 mI jeder Fraktion (1 to 14) der DGZ auf ein SDS- PAGE (Natriumdodecylsulfat polyacrylamide gel electrophoresis) in einem 16.5 % Tris-Tricin Gel bei konstanter Stromstärke von 45 mA pro Gel für 110 min in einem Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, California, USA). Nach der Fixierung des Poly- acrylamid Gels über Nacht in 50 % Ethanol/10 % Essigsäure wurde das Gel in 10 % Ethanol/5 % Essigsäure zweimalig 5 min lang inkubiert. Das Gel wurde dann in einer 4.7 mM Na2C03, 4.6 mM K3Fe(CN)6, und 19 mM sodium thiosulfate Na2S203 for 60 s inkubiert und dreimal für 20 s mit dd H2O gewaschen. Anschließend wurde das Gel für 20 min in 12 mM AgN03 behandelt und wieder dreimal für 20 s mit dd H20 gewa- schen. Die Färbung wurde in 280 mM Na2C03 mit 0.05% Formalin (37% Formalde- hydlösung) entwickelt bis die erwünschte Intensität erreicht wurde. Die weitere Ent wicklung des Gels wurde durch Behandlung mit 1 % Essigsäure für 5 min gestoppt. Die Aufnahme wurde mithilfe eines ChemiDoc MP System (Bio-Rad, California, USA) gemacht.
Figur 3 zeigt hierzu den Westernblot von Amyloid beta Proteinen in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomogenat der APPswe/PS1AE9 transgenen Maus. Für die Silberfärbung wurden 12 mI jeder Fraktion (1 bis 14) der Dichtegradienten- zentrifugation auf ein SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat polyacrylamide gel electro- phoresis) in einem 16.5 % Tris-Tricin Gel bei konstanter Stromstärke von 45 mA pro Gel für 110 min in einem Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, California, USA) ge- trennt.
Die Proteine wurden auf eine PVDF Membran mit einer Porengröße von 0,2 pm (Roti-PVDF 0.2, Carl Roth, Germany) bei 25 V und 1 A für 30 min transferiert. Dafür wurde ein Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, California, USA) verwendet. Die Membranen wurden in PBS für 5 min nach dem Transfer gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die Membranen in PBS und in TBS + Tween20 (TBST) für 5 min inkubiert. Die Membranen wurden mit 10 % Magermilchpulver/TBST (1 h, Raumtem peratur) geblockt und mit anti-Aß antibody mAb IC16 (1 :1000 in TBST über Nacht,
4 °C) inkubiert. Die Membrane wurden anschließend 3mal für 10 min mit TBST ge- waschen und mit einem HRP-konjugierten Ziege anti-Maus IgG (Thermo Fisher Sci- entific, Massachusetts, USA) (1 :10000 in TBST) inkubiert. Nach dreimaligem Wa- schen für je 10 min mit TBST wurden die Proteinbanden in einem ChemiDoc MP System (Bio-Rad, California, USA) durch die Verwendung von ECL Prime Substrat (Amersham, Little Chalfont, United Kingdom) sichtbar gemacht.
Es versteht sich, dass sich ein vereinfachtes Verfahren aus den Ausführungsbeispie- len zum Nachweis der Proteinfehlfaltungserkrankung durch Weglassen einzelner Schritte ergibt, wie in den Patentansprüchen 17 bis 21 in abstrakter Weise angege- ben.
Daher ist die Erfindung im einfachsten Falle der Nachweis eines Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung auf einem Substrat mit einer entsprechenden Sonde, dem Fängermolekül B, ohne den entsprechenden Quantifizierungsschritt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungs- erkrankung in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte: a) Auf einem Substrat wird ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Pro- teinfehlfaltungserkrankung angeordnet; b) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungser- krankung, wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist; c) Aus der Probe werden die unlöslichen Bestandteile entfernt; d) Die Probe nach Schritt c), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungs- erkrankung, wird an einem Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A in Kontakt gebracht und das darin enthaltene Monomer am Fängermolekül A angeordnet; e) Ein Kalibrationsstandard wird an einem anderen Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A in Kontakt gebracht und daran angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind; f) Mindestens ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfal- tungserkrankung wird sowohl mit dem Aggregat der Probe als auch mit dem Kalibrationsstandard in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detek- tierbares Signal aussenden kann; g) Das Signal des oder der an dem Probenaggregat angeordneten Fängermoleküle B wird mit dem Signal der an dem Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen, wo- bei die Schritte a) bis g) nicht nacheinander durchgeführt werden müssen.
2. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
dad u rch gekennzeichnet, dass
als Fängermolekül A nach Schritt a) und als Fängermolekül B nach Schritt f) Moleküle gewählt werden, die an dieselbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfaltungserkrankung binden.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad urch geken nzeich net, dass
als Fängermolekül A und als Fängermolekül B monoklonale Antikörper gewählt werden.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
ein Fängermolekül B gewählt wird, das mindestens zwei monoklonale Antikörper gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung umfasst.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad urch geken nzeichnet, dass
in Schritt b) eine komplexe Probe enthaltend Amyloid beta Monomer der Alz- heimerschen Demenz verwendet wird.
6. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
gekennzeichnet dadurch, dass
ein monoklonaler Antikörper als Fängermolekül A in Schritt a) und als Fänger- molekül B in Schritt f) verwendet wird, die Amyloid beta 3-8 als identische Zielregion des Monomers aufweisen.
7. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
gekennzeich net dad u rch , dass in Schritt e) als Kalibrationsstandard ein Partikel mit der Größe des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Schritt e) als Kalibrationsstandard ein Partikel verwendet wird, der eine defi- nierte Anzahl an Monomeren des nachzuweisenden Aggregats an der Oberflä- che des Partikels aufweist.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Schritt e) als Kalibrationsstandard ein Silica-Nanopartikel mit etwa 20 nm
Größe und etwa 30 Amyloid beta Monomeren auf der Oberfläche verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Schritt b) als komplexe Probe das Hirnhomogenat eines Tieres, insbesondere einer transgenen Maus mit Alzheimerscher Demenz, gewählt wird.
11. Vorrichtung zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfal- tungserkrankung in einer komplexen Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass
diese ein Substrat umfasst, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer ei- ner Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt und auf einem Teil des Substrats am Fängermolekül A ein Partikel als Kalibrationsstandard mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist, die der Anzahl der Monomerepitope im nachzuweisenden Aggregat ent- spricht und an einem anderen Teil des Substrats das Fängermolekül A die Bin- dungsstellen für Monomere der Proteinfehlfaltungserkrankung aus der komple- xen Probe bereit stellt.
12. Vorrichtung nach vorherigem Anspruch
dadurch gekennzeichnet, dass als Kalibrationsstandard ein Partikel mit der Größe des nachzuweisenden Ag- gregats angeordnet ist.
13. Vorrichtung nach einem der vorherigen zwei Ansprüche,
geken nze ich net d u rch
einen Silica-Nanopartikel als Kalibrationsstandard.
14. Vorrichtung nach einem der vorherigen drei Ansprüche,
gekennze ich net d u rch
eine Mikrotiterplatte als Substrat, wobei die Mikrotiterplatte mindestens eine Reaktionskammer aufweist, auf deren Boden ein an einem Fängermolekül A angeordneter Kalibrationsstandard angeordnet ist und die Vorrichtung mindes- tens eine weitere Reaktionskammer aufweist, auf deren Boden Fängermolekül A für das nachzuweisende Aggregat der Probe angeordnet ist.
15. Kit zur Quantifizierung von Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung, umfassend:
- ein Substrat, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Protein- fehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt und an einem Teil der irnmobi- lisierten Fängermoleküle A ein Kalibrationsstandard mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist;
- mindestens ein Fängermolekül B für das Monomer der Proteinfehlfaltungs- erkrankung, wobei das Fängermolekül A und das Fängermolekül B an die- selbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfaltungserkrankung binden.
16. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 1 bis 14 oder eines Kit nach Anspruch 15 zum Nachweis des Einflusses eines Wirkstoffs auf die Konzentra- tion eines Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung.
17. Verfahren zum Nachweis von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungser- krankung in einer Probe, gekennzeich net d urch die Schritte: a) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungser- krankung wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist; b) Die Probe nach Schritt a), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungs- erkrankung, wird mit dem Substrat in Kontakt gebracht und das darin enthal- tene Monomer auf dem Substrat angeordnet; c) Ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkran- kung wird mit dem Aggregat der Probe auf dem Substrat in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussenden kann.
18. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
dad urch geken nzeich net, dass
auf dem Substrat ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfal- tungserkrankung vor dem Schritt a) angeordnet wurde und in Schritt b) das Mo nomer an Fängermolekül A angeordnet wird.
19. Verfahren nach einem der vorherigen zwei Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
eine Probe gewählt wird, aus der die unlöslichen Bestandteile vorab entfernt wurden.
20. Verfahren nach einem der vorherigen zwei Ansprüche,
dad urch gekennzeichnet, dass
an einem Teil des Substrats ein Kalibrationsstandard mit dem Fängermolekül A in Kontakt gebracht und angeordnet wird, wobei an der Oberfläche des Kalibra- tionsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind.
21. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Signal der an dem Probenaggregat angeordneten Fängermoleküle B mit dem Signal der an dem Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen wird.
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