DE102017010842A1

DE102017010842A1 - Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe

Info

Publication number: DE102017010842A1
Application number: DE102017010842.0A
Authority: DE
Inventors: Christian Zafiu; Dieter Willbold; Bettina Kass
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2019-05-23
Also published as: WO2019101250A1; EP3714274A1; US20200319208A1; JP2021504675A; CN111527409A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer komplexen Probe.Eine Vorrichtung, ein Kit sowie eine Verwendung der Vorrichtung und des Kit sind offenbart.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe.
Stand der Technik
Aus dem Stand der Technik sind chromatographische Trennverfahren wie Größenausschlusschromatographie und Trennverfahren basierend auf Ultrazentrifugationsmethoden bekannt, um Proteine in einem Gemisch voneinander zu trennen.
Mit Hilfe unterschiedlicher Zentrifugationstechniken kann z. B. eine Probe mit Amyloid beta fraktioniert werden, so dass in unterschiedlichen Fraktionen unterschiedliche Amyloid beta-Spezies vorliegen. Diese kann man anschließend mittels ELISA, Western Blot, UV-VIS, Massenspektroskopie oder SDS-PAGE analysieren, wie z. B. aus Funke et al. bekannt ist (S. A. Funke, T. van Groen, I. Kadish, D. Bartnik, L. Nagel-Steger, O. Brener, T. Sehl, R. Batra-Safferling, C. Moriscot, G. Schoehn, A. H. C. Horn, A. Muller-Schiffmann, C. Korth, H. Sticht, D. Willbold. Oral Treatment with the D-Enantiomeric Peptide D3 Improves the Pathology and Behavior of Alzheimer's Disease Transgenic Mice. ACS Chem. Neurosci. (2010), 1, 639-648).
Aus Sehlin et al. (Dag Sehlin , Hillevi Englund, Barbro Simu, Mikael Karlsson, Martin Ingelsson, Fredrik Nikolajeff, Lars Lannfelt, Frida Ekholm Pettersson. 2012. Large Aggregates Are the Major Soluble Aß Species in AD Brain Fractionated with Density Gradient Ultracentrifugation. Plos one, Vol. 7, e32014) ist bekannt, dass große Aggregate die wesentliche Quelle an Amyloid beta Spezies durch Dichtegradientenzentrifugation fraktionierten Alzheimersche Demenz Gehirnen sind. Zur Quantifizierung wird ein Elisa-Verfahren angegeben.
Aus Ward et al. (Robin V. Ward, Kevin H. Jennings, Robert Jepras, William Neville, Davina E. Owen, Julie Hawkins, Gary Christie, John B. Davis, Ashley George, Eric H. Karran and David R. Howlett. 2000. Fractionation and characterization of oligomeric, protofibrillar and fibrillar forms of β-amyloid peptide. Biochem. J. 348, 137-144) ist bekannt, dass nach einer Dichtegradientenzentrifugation ein Immunoassay mit dem monoklonalen Antikörper mAb158 angewendet wurde um Amyloid beta Aggregate zu quantifizieren.
Nachteilig ist mit den offenbarten Antikörpern im verwendeten Elisa-Verfahren eine hochsenstive Quantifizierung von Amyloid beta aus komplexen Proben und Gemischen nicht möglich. Die genannten Druckschriften geben hierzu lediglich einen Nachweis an Amyloid beta bis im mikromolaren Bereich an. Diese Verfahren sind daher nicht sensitiv. Selbst die sensitivsten Elisa-Verfahren weisen Proteine lediglich bis zu einer Konzentration von etwa 100 picomolar nach. Dies scheint aus der heutigen Sicht nicht genug zu sein, um auch geringe Auswirkungen eines potentiellen Wirkstoffs zur Therapie der Alzheimerschen Demenz auf seine Wirksamkeit hin zu überprüfen.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es ein hochsensitives Verfahren und eine Vorrichtung zur Quantifizierung von einzelnen Proteinaggregaten in einer komplexen Probe oder einem Probengemisch bereit zu stellen und weitere Anwendungen des Verfahrens anzugeben.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst nach dem Verfahren gemäß Hauptanspruch sowie nach den Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Auf einem Substrat wird ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet;

Als Proteinfehlfaltungserkrankung kommen insbesondere die Proteinfehlfaltungserkrankungen von Menschen und Tieren in Betracht. Tabelle 1: Protein und zugehörige Proteinfehlfaltungserkrankung

Protein-Monomer, bzw. Epitop	Proteinfehlfaltungserkrankung
Amyloid-Beta	Alzheimersche Demenz
Prion Protein	Prion-Krankheiten
Serum-Amyloid-A-Protein	AA-Amyloidose
IgG-light-chain	AL-Amyloidose
AApoAI	AApoAl-Amyloidose
AApoAII	AApoAII-Amyloidose
ATTR	ATTR-Amyloidose
DISC1	DISC1opathien
FUS	FUS-Proteinopathien
IAPP	Diabetes Mellitus Typ 2
IAPP	Diabetes Mellitus Typ 2
SOD1	Amyotrophe Lateralsklerose
α-Synuclein	Synucleinopathien
Tau	Tauopathien
TDP-43	TDP-43-Proteinopathien
Huntingtin	Huntington-Krankheit
Lysozym	Familiäre viszerale Amyloidose

In einer Ausführung wird das Material des Substrats ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Kunststoff, Silizium und Siliziumdioxid. In einer bevorzugten Alternative wird als Substrat Glas eingesetzt.
Als Substrat wird insbesondere aber nicht ausschließlich eine Mikrotiterplatte mit seinen vielen Reaktionskammern verwendet. Vorteilhaft sind diese auslesbar, z. B. mikroskopisch. Auf der Oberfläche der Reaktionskammern ist vorzugsweise das Fängermolekül A angeordnet.
Hierzu wird in einer Alternative ein Substrat eingesetzt, das eine hydrophile Oberfläche aufweist. In einer Alternative wird dies durch das Auftragen einer hydrophilen Schicht, noch vor Schritt a), auf das Substrat erreicht. Mithin binden die Moleküle des Fängermolekül A, insbesondere kovalent an das Substrat bzw. an die hydrophile Schicht, mit welcher das Substrat beladen ist.
Die hydrophile Schicht ist eine Biomoleküle abweisende Schicht, so dass die unspezifische Bindung von Biomolekülen an das Substrat vorteilhaft minimiert wird. Auf diese Schicht werden vorzugsweise die Moleküle des Fängermolekül A, bevorzugt kovalent, immobilisiert. Diese sind affin gegenüber einem Merkmal im Proteinaggregat.
In einer Ausführung wird die hydrophile Schicht ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Polyethylenglykol, Poly-Lysin, bevorzugt Poly-D-Lysin, und Dextran oder Derivate davon, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD). Derivate im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die sich in einigen Substituenten von den Stammverbindungen unterscheiden, wobei die Substituenten gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren inert sind.
In einer Ausführung der Erfindung wird die Oberfläche des Substrats vor Auftrag der hydrophilen Schicht zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen aktiviert. Diese Aktivierung mit Aminogruppen erfolgt in einer Alternative durch in Kontaktbringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) oder mit Ethanolamin.
Zur Vorbereitung des Substrats auf die Beschichtung können einer oder mehrere der nachfolgenden Schritte durchgeführt werden:

• Waschen eines Substrats aus Glas bzw. eines Glasträgers im Ultraschallbad oder Plasma-cleaner, alternativ dazu in 5 M NaOH mindestens 3 Stunden inkubieren,
• Spülen mit Wasser und anschließendem Trocknen unter Stickstoff,
• Eintauchen in eine Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 für die Aktivierung der Hydroxylgruppen,
• Spülen mit Wasser bis zu einem neutralen pH, anschließend mit Ethanol und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre,
• Eintauchen in eine Lösung mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) (1 - 7 %), bevorzugt in trockenem Toluol, oder einer Lösung von Ethanolamin,
• Spülen mit Aceton oder DMSO und Wasser und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre.

In einer Alternative erfolgt das in Kontaktbringen des Substrats mit APTES in der Gasphase; das gegebenenfalls vorbehandelte Substrat wird mithin mit APTES bedampft.
Für die Beschichtung mit Dextran, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD), kann das Substrat mit einer wässrigen Lösung von CMD in einer Konzentration von 10 mg/ml oder 20 mg/ml und gegebenenfalls N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminpropyl) Carbodiimid (EDC), (200 mM) und N-Hydroxysuccinimid (NHS), (50 mM) inkubiert und anschließend gewaschen werden.
Das Carboxymethyl-Dextran ist in einer Variante kovalent an die Glasoberfläche gebunden, die zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen funktionalisiert wurde.
Als Substrat können Mikrotiterplatten, bevorzugt mit Glasboden, eingesetzt werden. Da bei der Verwendung von Polystryrolrahmen der Einsatz von konzentrierter Schwefelsäure nicht möglich ist, erfolgt die Aktivierung der Glasoberfläche in einer Ausführungsvariante der Erfindung analog.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung ist das Fängermolekül A kovalent an das Substrat gebunden.
An beispielweise eine hydrophile Schicht wird, bevorzugt kovalent, das Fängermolekül A immobilisiert, welches affin gegenüber einem Merkmal des zu detektierenden Proteinaggregats sind. Dieses Merkmal kann ein Epitop bzw. eine Teilsequenz eines Proteinaggregats sein.
Es wird nur eine Sorte Fängermolekül A verwendet. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine Sorte Aggregat einer einzigen Proteinfehlfaltungserkrankung sensitiv quantitativ nachgewiesen werden kann.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird Fängermolekül A, bevorzugt ein Antikörper, gegebenenfalls nach einer Aktivierung eines mit CMD beschichteten Trägers durch eine Mischung aus EDC/NHS (200 bzw. 50 mM), auf dem Substrat immobilisiert.
Verbleibende Carboxylat-Endgruppen, an die keine Moleküle des Fängermolekül A gebunden wurden, können deaktiviert werden. Zur Deaktivierung dieser Carboxylat-Endgruppen auf dem CMD-Spacer wird Ethanolamin verwendet. Vor dem Auftrag der Proben werden die Substrate bzw. Träger gegebenenfalls mit Puffer gespült.
Als Fängermolekül A kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, ein monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung verwendet. Im Falle der Alzheimerschen Demenz kann beispielweise der monoklonale Antikörper Nab228 verwendet werden und auf dem Substrat angeordnet werden.
Das Fängermolekül A weist, anders als das unten beschriebene Fängermolekül B, im erfindungsgemäßen Verfahren kein Detektionsmolekül bzw. Molekülteile auf, die zur Detektion geeignet sind.
Mit dem Begriff „Anordnung“ im Hauptanspruch sind insbesondere aber nicht ausschließlich kovalente Bindungen umfasst. Im Falle der Antikörper sind diese spezifisch.
Das Verfahren umfasst Schritt b).

b) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird bereit gestellt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist;

Mit Bereitstellen einer komplexen Probe ist insbesondere die Wahl einer bereits bereit gestellten Probe gemeint, die aus einem erkrankten Tier und/oder eines erkrankten Menschen entstammt, welche die Proteinfehlfaltungserkrankung aufweisen bzw. bei denen überprüft werden soll, ob die entsprechenden Aggregate vorhanden sind oder nicht.
Es wird hierzu z. B. eine Probe aus einem Tier gewählt, insbesondere einer an Alzheimerschen Demenz erkrankten transgenen Maus. Die Probe kann nach dem Tod des Tieres durch eine Aufbereitung von mindestens einer Gehirnhälfte erhalten werden. Mit der Aufbereitung ist insbesondere eine Homogenisierung des Hirngewebes gemeint.
Es wird auf diese Weise eine Probe, erhalten aus einem erkrankten Tier, gewählt und auf das Vorhandensein einer Proteinfehlfaltungserkrankung untersucht.
Es kann sich bei der Probe aber auch um eine Zellkultur, oder um ein einem Tier oder einem Menschen entnommenes Organ oder um eine Probe aus einer Biopsie handeln. Die Probe enthält endogen gebildetes Peptid- oder Proteinaggregate der Proteinfehlfaltungserkrankung oder wird darauf hin untersucht.
Das Verfahren bezieht sich insbesondere und besonders vorteilhaft und überraschend auf den hochselektiven Nachweis eines bestimmten Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung aus einem Gemisch an Proteinen und/oder Protein-Bruchstücken in derselben Probe. In der ausgewählten Probe kann vorteilhaft aus einem Gemisch mit mehr als einem Protein oder Proteinbruchstück ein spezifisch nachzuweisendes Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung hochsensitiv nachgewiesen werden.
Die Probe kann insbesondere mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, oder sogar mehr als 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder sogar mehr als 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder sogar mehr als 1000 verschiedene Proteine oder Proteinbruchstücke enthalten. Die Probe kann tausende an Proteinen und/oder Proteinbruchstücke enthalten. Sie wird in diesem Sinne als komplexe Probe bezeichnet.
Mit dem Begriff „komplexe Probe“ ist insbesondere das vollständige Homogenat mit dem vollständigen löslichen Proteinbesatz, insbesondere des Gehirns eines verstorbenen Tiers oder Menschen, umfasst.
In Schritt b) wird als komplexe Probe insbesondere das Hirnhomogenat eines Tieres, insbesondere einer transgenen Maus, das an der Alzheimerschen Demenz litt, bereitgestellt. Dieses umfasst ebenfalls tausende an verschiedene Proteine und/oder Proteinbruchstücke.
In Schritt b) kann somit eine komplexe Probe, enthaltend das Amyloid beta Aggregat der Alzheimerschen Demenz gewählt werden.
Da seit einigen Jahren besonders die kleinen, löslichen Aß-Aggregate (Aß-Oligomere) als hauptsächlicher Verursacher für die Entstehung und den Fortschritt der Alzheimerschen Demenz verantwortlich gemacht werden, wird hiermit die Aufgabe gelöst, Wirkstoffkandidaten auf Effizienz zur Reduzierung an toxischen Aggregaten hochsensitiv auch bis in den femtomolaren Bereich hinab oder sogar eine vollständige Eliminierung nachzuweisen. Wenn ein Wirkstoff auf seine Fähigkeit zur Eliminierung der Aggregate untersucht wird, so ist ein Nachweis dieser Aggregate bis in den femtomolaren Bereich hinab möglich. Werden keine Oligomer Aggregate mehr nachgewiesen, so ist die Heilung der Alzheimerschen Demenz oder zumindest Verbesserung des Krankheitsverlaufs mit dem Verfahren nachgewiesen.
Als Aggregat werden auch die höhermolekularen Strukturen, wie z. B. die bei der Alzheimerschen Demenz auftretenden Fibrillen nachweisbar.
Dasselbe gilt für den Fall, dass ein Aggregat einer anderen Proteinfehlfaltungserkrankung nachgewiesen werden soll.
Der Begriff „quantifizierbar“ im Anspruch 1 kann im einfachsten Fall auch qualitativ ausgelegt werden, indem in einer ja/nein-Antwort das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung nachgewiesen wird.

c) Schritt c) sieht vor, aus der ausgewählten Probe die unlöslichen Bestandteile zu entfernen.

Schritt c) erfordert daher z. B. eine Filtration oder eine Ultrazentrifugation, um die löslichen Bestandteile aus der Probe zu entfernen. Andere Verfahren sind denkbar, die der Fachmann nach seinem vorhandenen Fachwissen ebenfalls anwenden kann.
Insbesondere eine Dichtegradientenzentrifugation ist hierzu bevorzugt. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Probe nach Schritt c) fraktioniert wird.
Vorteilhaft wird eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt, mit der die Probe in bis zu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, besser in bis zu 10 und besonders vorteilhaft 11, 12, 13, 14 und ganz besonders vorteilhaft in bis zu 15 Fraktionen fraktioniert wird.
Hiermit kann vorteilhaft eine bestimmte Fraktion bereitgestellt und im Weiteren verwendet werden, die sich deutlich hinsichtlich ihres s-Wertes von anderen Bestandteilen der übrigen Fraktionen unterscheidet. Somit ist eine Auswahl bestimmter Fraktionen wie z. B. Protofibrillen oder andere Vorstufen, wie Oligomere, selektierbar und Im Weiteren zu untersuchen.
Die Partikel, die aus den amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen gebildet sind, werden somit voneinander getrennt.
Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass aus der Probe eine Mehrzahl an Fraktionen erhalten wird. In den Fraktionen sind die Partikel an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit jeweils einer bestimmten Aggregatgröße und -Form enthalten. Diese Trennung der Partikel kann vorteilhaft mittels der Dichtegradientenzentrifugation nach dem s-Wert vorgenommen werden.
Besonders vorteilhaft erfolgt die Fraktionierung der in der Probenlösung befindlichen amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine mittels einer Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von z. B. Optiprep, Percoll, Saccharose oder einem analogen Dichtegradientenmaterial. Die Aggregate werden dabei nach der Größe und gegebenenfalls der Form (Sedimentationskoeffizient) voneinander getrennt. Dieses Verfahren ist besonders bei aggregierenden Aß(1-42) Aggregaten und Tau-Aggregaten vorteilhaft.
Alternativ kann auch eine Größenausschlusschromatographie angewendet werden, bei der nach dem hydrodynamischen Radius getrennt wird. Alternativ erfolgt die Fraktionierung durch Asymmetrische-Fluss-Feldflussfraktionierung, oder mittels Kapillarelektrophorese. Auch diese Verfahren sind vorteilhaft zur Kalibration geeignet.
Andere physikalische Parameter der Aggregate können ebenfalls als Grundlage der vorzunehmenden Fraktionierung herangezogen werden, z. B. der hydrodynamische Radius der Partikel. Die Fraktionen werden räumlich voneinander getrennt, z. B. durch Abpipettieren.
Man ist also nicht auf eine Dichtegradientenzentrifugation eingeschränkt. Die Dichtegradientenzentrifugation hat aber den Vorteil alle ursprünglich in der Probe vorhandenen Aggregate der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine für eine weitere quantitative Analyse bereit zu stellen.
Die Dichtegradientenzentrifugation selbst wird kalibriert, so dass die Fraktionen hinsichtlich ihres s-Werts exakt bestimmt sind. Der Begriff „exakt bestimmt“ umfasst daher einen Kalibrierungsschritt, durch eine Fraktionierung von Molekülen bekannter Art und Verhaltens. Nach der Fraktionierung liegt in jeder Fraktion nur eine bestimmte (das heißt bekannte) Art an Konformer vor, z. B. Oligomere oder Fibrillen und so weiter, die bei der Proteinfehlfaltungserkrankung auftreten.
Die Probe kann in Schritt c) zudem unterschiedliche, dem Fachmann bekannte, Aufbereitungsschritte durchlaufen.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Vorbehandlung der Probe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahrensschritte bevor, die Probe am Fängermolekül A angeordnet wird:

• Verdünnen mit Wasser oder Puffer,
• Behandlung mit Enzymen, zum Beispiel Proteasen, Nukleasen, Lipasen,
• Zentrifugieren,
• Präzipitation,
• Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Antikörper zu verdrängen.

Das Verfahren erfordert den Schritt d).

d) Die Probe nach Schritt c), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird an einem Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A nach Schritt a) in Kontakt gebracht und das darin enthaltene Monomer und/oder auch das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung am Fängermolekül A angeordnet;

Die Anordnung erfolgt spezifisch an Fängermolekül A.
Die Anordnung erfolgt vorzugsweise spezifisch an einem monoklonalen Antikörper als Fängermolekül A, wie beschrieben. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine sehr spezifische Bindung zwischen dem Aggregat der Probe und seinen aus Monomer gebildeten Epitopen an der Oberfläche des Aggregats und dem Fängermolekül A eingegangen wird. So wird vorteilhaft bewirkt, dass z. B. andere Proteine, insbesondere Aggregate anderer Proteinfehlfaltungserkrankungen mit vergleichbarem s-Wert ausgeschlossen werden. Es wird also nur ein spezifisches Aggregat durch das Fängermolekül A nachgewiesen.
Die zu vermessende Probe wird also mit dem so präparierten Substrat in Kontakt gebracht und optional inkubiert. Als zu untersuchende Probe können wiederum körpereigene Flüssigkeiten oder Gewebe eingesetzt werden. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Probe ausgewählt aus Gehirnhomogenat, Liquor (CSF), Blut, Plasma und Urin. Es kann sich aber auch um Stichproben eines Organs (Biopsie) oder dem Homogenat des gesamten Organs, z. B. des Gehirns, handeln.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung erfolgt die Anordnung der Probe bzw. des Aggregats unmittelbar auf dem Fängermolekül A.
Unspezifisch gebundene Substanzen können durch mindestens einen Waschschritt entfernt werden.
Das Verfahren wird mit dem Schritt e) fortgesetzt.

e) Ein Kalibrationsstandard wird an einem anderen Teil des Substrats am Fängermolekül A nach Schritt a) in Kontakt gebracht und angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind;

Als Kalibrationsstandard werden Partikel verwendet, die vorteilhaft etwa die Größe des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung aufweisen. Die Größe ist für den Fachmann ohne Aufwand aus der Literatur zu entnehmen.
In Schritt e) wird als Kalibrationsstandard ein Partikel verwendet, der eine definierte Anzahl an Monomeren an der Oberfläche aufweist, die der Anzahl der Monomerepitope des nachzuweisenden Aggregats entspricht.
Dadurch wird vorteilhaft

1. wegen der identischen Größe des Kalibrationsstandards zum Aggregat eine verbesserte Simulation des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung durch den Kalibrationsstandard auf dem Substrat bewirkt, und
2. eine Kalibration in Hinblick auf eine spätere exakte Quantifizierung des Aggregats hinsichtlich der tatsächlich im Aggregat vorhandenen Monomerepitope an der Oberfläche des Aggregats möglich, da der Kalibrationsstandard etwa soviele Epitope aufweist wie das Aggregat.

Für den Nachweis von Amyloid beta Aggregat der Alzheimerschen Demenz gilt beispielweise, dass als Kalibrationsstandard ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 20 nm angeordnet werden sollte, da ein Amyloid beta Aggregat diese Größe annehmen kann. An der Oberfläche des Kalibrationsstandards sollten dann etwa 20-30 Amyloid beta Monomere angeordnet vorliegen, z. B. kovalent angeordnet sein.
In Schritt e) wird als Kalibrationsstandard vorzugsweise ein Silica-Nanopartikel mit etwa 20 nm Größe und etwa 30 Amyloid beta Monomeren auf der Oberfläche verwendet. Dies entspricht der Größe der Amyloid beta Aggregate und der Anzahl der zugänglichen Monomerepitope im Oligomer bzw. im Aggregat.
Der Kalibrationsstandard kann für die angegebenen Zwecke wie folgt synthetisiert werden, wobei diese Verfahren nicht einschränkend sind:

Verfahren 1:
- A) Bereitstellen eines anorganischen Nanopartikels mit etwa der Größe des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung,
- B) Bildung freier Aminogruppen an der Oberfläche des Nanopartikels, zur Funktionalisierung der Nanopartikel-Oberfläche zu einem aminfunktionalisiertem Nanopartikel,
- C1) Bildung freier Carboxylgruppen an die freien Aminogruppen aus Schritt B) zur Ausbildung freier Carboxylgruppen an der Oberfläche der Nanopartikel,
- D1) Aktivierung der freien Carboxylgruppen aus Schritt C1) z. B durch die Bildung von NHS Ester an die Carboxylgruppe, und
- E1) Bindung von freien Aminen der Monomere oder Teilstücke der Monomere an die NHS Ester aus Schritt D1).
Alternative Verfahren 2:
- A) Bereitstellen eines anorganischen Nanopartikels mit etwa der Größe des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung,
- B) Bildung freier Aminogruppen an der Oberfläche des Nanopartikels, zur Funktionalisierung der Nanopartikel-Oberfläche zu einem aminfunktionalisiertem Nanopartikel,
- C2) Bindung von Maleinimido-Spacer-Carbonsäure an die freien Aminogruppen in Schritt B),
- D2) Bindung von Monomeren des Proteinaggregats an die Maleinimido-Spacer-Carbonsäuren aus Schritt C2) über eine Sulfhydrylgruppe am freien Ende der Monomere.

Weitere Verfahren sind denkbar.
Sodann wird der Schritt f) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt.

f) Ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung wird sowohl mit dem Aggregat der Probe auf dem Substrat als auch mit dem Kalibrationsstandard in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussenden kann;

Das Fängermolekül B stellt somit eine Sonde dar. Der Begriff „Fängermolekül B“ und „Sonde“ werden synonym verwendet.
Das nachzuweisende Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung aus der Probe ist andererseits bereits an Fängermolekül A angeordnet und damit auf dem Substrat immobilisiert.
Das Fängermolekül A und das oder die Fängermoleküle B können in einer Ausgestaltung der Erfindung identische affine Moleküle oder Molekülteile aufweisen. In einer weiteren Alternative können unterschiedliche affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein, oder alternativ, unterschiedliche affine Moleküle oder Teile mit identischen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein.
Es können auch Mischungen verschiedener Fängermoleküle B eingesetzt werden.
Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Fängermoleküle B, die an unterschiedliche Detektionsmoleküle oder Molekülteile gekoppelt sind, erhöht zum Einen die Spezifität des Signals (Korrelationssignals), zum anderen ermöglicht dies die Identifikation von Proteinaggregaten, die sich in einem oder mehreren Merkmalen unterscheiden. Dies ermöglicht eine selektive Quantifizierung und Charakterisierung der Proteinaggregate. Das Fängermolekül A und das oder die Fängermoleküle B binden an das gleiche Epitop oder an das gleiche überlappende Teilstück eines Epitops des Monomers.
In einem weiteren Schritt werden die an Fängermolekül A immobilisierten Proteinaggregate mit einer oder mehreren für die weitere Detektion dienlichen Sonden, dem Fängermolekül B, markiert. Wie oben beschrieben können die einzelnen Schritte auch in einer anderen Reihenfolge erfindungsgemäß durchgeführt werden.
Es können vorteilhaft ein oder mehrere Fängermoleküle B gewählt werden, welche an Monomere der Proteinaggregate binden, wobei die Fängermoleküle B auch erst nach der Bindung an das Aggregat in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die „quantitative Bestimmung“ zunächst die Bestimmung der Konzentration der Proteinaggregate, mithin also auch die Bestimmung ihrer An- und oder -Abwesenheit.
Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Fängermoleküle B, die nicht an Proteinaggregate gebunden sind, entfernt. Dadurch kann die Sensitivität durch Reduktion des Hintergrundsignals weiter gesteigert werden.
In einer Alternative des Verfahrens werden diese überschüssigen Fängermoleküle B nicht entfernt. Dadurch entfällt ein Waschschritt und es findet auch keine Gleichgewichtsverschiebung in Richtung der Dissoziation der Proteinaggregat-Sonden-Komplexe oder -Verbindungen statt. Durch die ortsaufgelöste Detektion werden die überschüssigen Sonden bei der Auswertung nicht erfasst.
In einer Ausführung sind die Bindungsstellen des Proteinaggregats Epitope und die Fängermoleküle sind Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente hiervon.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich das Fängermolekül A und das oder die Fängermoleküle B.
So können z. B. unterschiedliche Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente als Fängermoleküle B eingesetzt werden. In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung werden ein Fängermolekül A und ein oder mehrere Fängermoleküle B eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind.
In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei Fängermoleküle B eingesetzt, die z. B. unterschiedliche Antikörper enthalten und gegebenenfalls auch unterschiedliche Farbstoffmarkierung tragen.
In jedem der oben beschriebenen Fälle wird nur eine Sorte Fängermolekül A verwendet.
Zur Detektion sind die Fängermoleküle B so gekennzeichnet, dass sie vorzugsweise ein optisch detektierbares Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Biolumineszenz- und Chemolumineszenz-Emission sowie Absorption.
In einer Alternative sind die Fängermoleküle B als Sonden somit mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Als Fluoreszenzfarbstoff können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können GFP (Green Fluorescence Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie Quantendots verwendet werden.
Das Fängermolekül A hat keine Sondenfunktion wie das Fängermolekül B. Lediglich zur Qualitätskontrolle der Oberfläche, zum Beispiel zum Nachweis der Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit Fängermolekül A, kann auch das Fängermolekül A mit einem Fluoreszensfarbstoff eingesetzt werden. Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit dem Nachweis des Fluoreszenzfarbstoffs der Sonde am Proteinaggregat interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus des Substrats möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.
Das oder die Fängermoleküle B können derart ausgewählt und verwendet werden, dass die Anwesenheit von einzelnen Proteinaggregat-Merkmalen, das Messergebnis nicht beeinflussen.
Es kann insbesondere ein fluoreszierender, monoklonaler Antikörper als Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung mit dem gebundenen Aggregat und dem Kalibrationsstandard in Kontakt gebracht und hieran angeordnet werden.
Als Fängermolekül A und als Fängermolekül(e) B können somit insbesondere monoklonale Antikörper gewählt werden. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass eine ausreichende Sensitivität und Stärke der Anordnung an das Aggregat und/oder Kalibrationsstandard vorgegeben wird.
Es kann als Fängermolekül B ein Gemisch aus monoklonaler Antikörpern, wie z. B. mAb IC16, markiert mit CF-633, und Nab228 markiert mit CF-488, verwendet werden.
Als Fängermolekül A nach Schritt a) und als Fängermolekül(e) B nach Schritt f) sollten Moleküle gewählt werden, die an dieselbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfaltungserkrankung binden. Dadurch wird besonders vorteilhaft bewirkt, dass Monomere in der Probe nicht mehr von Fängermolekül(en) B gebunden werden kann, da die Zielregion bereits durch Fängermolekül A belegt ist.
Zum Beispiel kann im Falle des Amyloid beta das Fängermolekül A nach Schritt a) und das Fängermolekül B / der Antikörper nach Schritt f) beide an die Aminosäuren 3-8 (vom N'-Ende aus betrachtet) binden. Liegt z. B. eine Probe mit Amyloid beta 1-42 Aggregat an dem Fängermolekül A des Substrats vor, so kann nach Schritt f) nur dann eine Bindung des Fängermoleküls B an Amyloid beta erfolgen, wenn weitere Epitope vorliegen, das heißt ein Aggregat mit weiteren Oberflächen-Epitopen gebunden wird.
Es versteht sich, dass diese Ausführungen lediglich beispielhaften Charakter haben und nicht einschränkend sein sollen.
Das Verfahren diskriminiert vorteilhaft von sich aus Monomere, die nicht mehr nachgewiesen werden.
Schritt g) des Verfahrens kann wie folgt durchgeführt werden:

g) Das Signal der Fängermoleküle B am Probenaggregat wird mit dem Signal der am Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen.

Schritt g) erfordert dann den Nachweis des Signals, insbesondere eines Fluoreszenzsignals, das vom beispielweise fluorezierenden monoklonalen Antikörper als Fängermolekül B ausgesendet wird. Hierzu kann z. B. ein TIRF (engl. Total Internal Reflection Fluorescence) System verwendet werden.
In einer Ausführung erfolgt eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals, also eine ortsaufgelöste Detektion des Signals, welches von der Sonde emittiert wird. Demgemäß sind in dieser Ausführung der Erfindung Verfahren, die auf einem nichtortsaufgelösten Signal beruhen, wie ELISA oder Sandwich-ELISA, ausgeschlossen.
Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung sehr vorteilhaft. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Proteinaggregates vor einem Hintergrundsignal, welches z. B. durch gerätespezifisches Rauschen, andere unspezifische Signale oder unspezifisch gebundene Sonden verursacht wird, ermöglicht. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Read-out-Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse (Pixel), vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA-Verfahren ohne ortsaufgelöstem Signal dar.
In einer Ausführung beruht die ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals auf total intern reflection fluorescence microscopy (tirfm) und der Untersuchung eines kleinen Volumenelements im Vergleich zum Volumen der Probe, im Bereich von wenigen Femtolitern bis unterhalb eines Femtoliters, oder eines Volumenbereichs oberhalb der Kontaktoberfläche der Fängermoleküle mit einer Höhe von 500 nm, bevorzugt 300 nm, besonders bevorzugt 250 nm, insbesondere 200 nm.
Die Detektion der immobilisierten und markierten Proteinaggregate erfolgt mittels Abbildung der Oberfläche, z. B. mit Laser Scanning Mikroskopie. Eine möglichst hohe Ortsauflösung ermittelt eine hohe Anzahl an Bildpunkten, wodurch die Sensitivität sowie die Selektivität des Verfahrens weiter erhöht werden können, da strukturelle Merkmale mit abgebildet und analysiert werden können. Somit erhöht sich das spezifische Signal vor dem Hintergrundsignal von z. B. unspezifisch gebundenen Sonden.
Die Detektion erfolgt beispielweise bevorzugt mit ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie durch ein TIRF-Mikroskop, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten davon, wie zum Beispiel STORM und/oder dSTORM.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z. B. in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird, oder ein FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy System) dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie zum Beispiel STED, PALM oder SIM.
Wiederum im Unterschied zu ELISA entstehen durch diese Verfahren so viele Read-out-Werte, wie ortsaufgelöste Ereignisse (z. B. Pixel) vorhanden sind. Abhängig von der Anzahl an unterschiedlichen Sonden wird diese Information vorteilhaft vervielfacht. Diese Vervielfachung gilt für jedes Detektionsereignis und führt zu einem Informationsgewinn, da sie weitere Eigenschaften, z. B. ein zweites Merkmal, über Proteinaggregate offenbart. Durch so einen Aufbau kann für jedes Ereignis die Spezifität des Signales erhöht werden.
Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen, z. B. die Fluoreszenz-Intensität, aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um z. B. die Anzahl der Proteinaggregate, deren Größe und deren Merkmale zu bestimmen.
Dabei können z. B. auch Algorithmen der Hintergrundminimierung und/oder auch Intensitäts-Schwellenwerte für die weitere Auswertung sowie der Mustererkennung angewandt werden.
Weitere Bildanalyse-Optionen beinhalten z. B. die Suche nach lokalen Intensitätsmaxima, um aus der Bildinformation die Zahl an detektierten Proteinaggregaten zu erhalten und auch die Partikelgrößen bestimmen zu können.
Es können Waschschritte nach den Schritten a), d), e) und f) durchgeführt werden.
Es versteht sich, dass die Schrittabfolge a) bis g) in Patentanspruch 1 wie beschrieben lediglich der Verdeutlichung dient und keine zeitlich aufeinanderfolgende Abfolge an Schritten darstellt. Ohne weiteres kann Schritt b) und c) z. B. vor Schritt a) erfolgen.
Beispielhaft werden daher in einer anderen Variante des Verfahrens, die Proteinaggregate mit den Fängermolekülen B in Kontakt gebracht und angeordnet, bevor die Aggregate mit den Fängermolekülen A in Kontakt gebracht werden, wodurch somit eine Immobilisierung von mit Sonden markierten Proteinaggregate auf dem Substrat erfolgt.
Dann ist das Verfahren z. B. wie folgt durchzuführen:

Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer komplexen Probe, gekennzeichnet durch die Schritte:
1. a) Auf einem Substrat wird ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet;
2. b) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist;
3. c) Aus der Probe werden die unlöslichen Bestandteile entfernt;
4. d) Ein Kalibrationsstandard wird an einem Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A nach Schritt a) in Kontakt gebracht und angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren oder Teile der Monomere vorliegt, die das Epitop der nachzuweisenden Aggregate der Proteinfehlfaltungserkrankung aufweisen;
5. e) Mindestens ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung wird mit dem Aggregat der Probe in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das oder die Fängermoleküle B ein detektierbares Signal aussenden kann bzw. können;
6. f) Das oder die Fängermoleküle B am Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung wird mit dem Fängermolekül A an einem Teil des Substrats und dem Kalibrationsstandard an einem anderen Teil des Substrats in Kontakt gebracht, und das Aggregat an das Fängermolekül A und an den Kalibrationsstandard angeordnet.
7. g) Das Signal der Fängermoleküle B am Probenaggregat wird mit dem Signal der am Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen.

Mithin können das oder die Fängermoleküle B an das Aggregat gebunden werden bevor dieses mit Fängermolekül A in Kontakt gebracht wird und an das Substrat immobilisiert wird.
Auch hier sind beliebige Abfolgen möglich, z. B. kann Schritt b), c) und e) vor allen anderen Schritten erfolgen.
In einer weiteren Variante des Verfahrens, wird die Probe nach dem in Kontakt bringen der Proteinaggregate mit Fängermolekül B chemisch fixiert, z. B. durch Formaldehyd.
Überraschend wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass das Verfahren bei der Detektion von Aggregaten in komplexen Proben wie Mausgehirn-Homogenat eine sehr hohe Sensitivität auswies und vollkommen in-sensitiv gegenüber endogen vorhandenen Monomeren ist.
Besonders überraschend ist zudem, dass trotz der Komplexität der Probe keine störenden Signale zu Proben aus Wildtyp Mäusen ermittelt wurden. Damit ist gezeigt, dass es keine störenden Hintergrundsignale gibt. In Wildtyp Tieren befindet sich kein humanes Abeta 1-42, deshalb reagiert dort der Antikörper nicht.
Das Verfahren weist Aggregate der jeweiligen Proteinfehlfaltungserkrankung im femtomolaren Bereich nach, insbesondere bis zu einem Bereich von 1000-500 fM, besonders vorteilhaft 100-500 fM, insbesondere 50-100 fM und von 5-10 fM. Da es sich nicht um ein Elisa gebundenes Verfahren handelt, ist der Nachweis gegenüber diesem Verfahren um den Faktor von bis zu 10.000 verbessert.
Der Vergleich über die definierte Anzahl der Epitope am Kalibrationsstandard erlaubt vorteilhaft eine exakte Quantifizierung der Epitope im Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung.
Ein monoklonaler Antikörper als Fängermolekül A in Schritt a) und als Fängermolekül(e) B in Schritt f) kann verwendet werden, die z. B. Amyloid beta 3-8 als identische Zielregion des Monomers aufweisen. Dadurch wird der oben genannte Zweck erfüllt, keine Monomere der Probe mehr zu binden.
Das Verfahren eignet sich deshalb besonders gut zum Nachweis von Aggregaten der Proteinfehlfaltungserkrankungen, da kein Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung nachgewiesen werden kann.
Die Erfindung löst die Aufgabe überraschend auch in einer komplexen Matrize, wie Gehirnhomogenat mit tausenden an unterschiedlichen Proteinen und Proteinbruchstücken. Das Verfahren detektiert dabei selbst geringste Mengen von Proteinaggregaten sogar in Anwesenheit von dessen Monomer, da dieses nicht von Fängermolekül(en) B gebunden werden kann.
Eine weitere Aufgabe, die gelöst wird, ist, dass auch heterogene Proteinaggregate, bestehend aus mehr als einer Art von Protein, eindeutig als Aggregat identifiziert werden können.
Die Erfindung erschöpft sich hieran noch nicht.
Es wird auch eine Vorrichtung zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer komplexen Probe bereitgestellt. Diese umfasst ein Substrat, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt. An einem Teil des Fängermoleküls A auf dem Substrat ist als Kalibrationsstandard ein Partikel mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, die der Anzahl der Epitope im nachzuweisenden Aggregat entspricht. Ein anderer Teil des Fängermolekül A an einem anderen Teil des Substrats stellt die Bindungsstellen für Monomere des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung aus der komplexen Probe bereit.
Die Vorrichtung umfasst den Kalibrationsstandard mit dem vorteilhaft eine Quantifizierung der Aggregate bis in den femtomolaren Bereich ermöglich ist.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise gekennzeichnet dadurch, dass als Kalibrationsstandard ein Partikel mit der Größe des nachzuweisenden Aggregats angeordnet ist.
Die Vorrichtung ist insbesondere gekennzeichnet durch ein Silica-Nanopartikel als Kalibrationsstandard.
Die Vorrichtung ist besonders vorteilhaft eine Mikrotiterplatte, wobei die Mikrotiterplatte mindestens eine Reaktionskammer als Teil des Substrats aufweist, auf deren Boden ein an Fängermolekül A angeordneter Kalibrationsstandard angeordnet ist und mindestens eine weitere Reaktionskammer als Teil des Substrats aufweist, auf deren Boden Fängermolekül A für das nachzuweisende Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist.
Die Aufgabe wird zudem gelöst durch ein Kit zur Quantifizierung von Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung, umfassend:

- ein Substrat, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt und an einem Teil von Fängermolekül A ein Kalibrationsstandard mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist;
- Hiervon getrennt ein Fängermolekül B auf dem Substrat für das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung, wobei das Fängermolekül A und das Fängermolekül B an dieselbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfaltungserkrankung binden.

Mischschalen und Puffer für das Fängermolekül B sind optional vorhanden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner auch ein Kit enthaltend eine oder mehrere der folgenden Komponenten:

- Substrat, optional mit einer hydrophilen Oberfläche,
- Mindestens ein Fängermolekül A,
- Alternativ: Substrat mit Fängermolekül A, und/oder Kalibrationsstandard
- Fängermolekül(e) B,
- Lösungen,
- Kalibrationsstandard,
- Puffer.

Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein.
Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten bereits an das Substrat als an einem festen Träger, wie z. B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Dann umfasst das Substrat eine solche Mikrotiterplatte.
Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine beliebige der Ausführungsformen enthalten.
In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle bereits immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Beschichtung und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung oder einem Puffer überschichtet vorliegen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Proteinaggregaten in beliebigen Proben zur Quantifizierung und damit Titerbestimmung von Proteinaggregaten.
Die Verwendung einer Vorrichtung oder eines Kit sowie die Erweiterung des Verfahrens sind für den quantitativen Nachweis der Konzentration an Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung gegeben.
Die Verwendung der Vorrichtung bzw. des Kit ermöglicht auf diese Weise ein Verfahren durchzuführen, das ausreichend sensitiv ist, um ein Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung in komplexen Proben wie zum Beispiel homogenisiertem Gehirn, am Ende eines (Tier-)Versuchs nachweisen zu können.
Beispielweise kann durch die Dichtegradientenzentrifugation jede gewünschte Fraktion auf Konzentrationsänderungen mit oder auch ohne eine Wirkstoffzugabe untersucht werden. Das Verfahren stellt einen Verfahrensschritt bereit, der es erlaubt, mehr als eine Fraktion aus der Dichtegradientenzentrifugation auf Konzentrationsänderungen hin zu untersuchen oder auch auf Änderungen der Aggregatgröße oder anderer Parameter.
Durch die Dichtegradientenzentrifugation werden vorzugsweise mehr als 3, 4 oder mehr als 5 Fraktionen gewonnen, die sowohl in quantitativer als auch in qualitativer Weise untersucht werden können und nicht nur im Hinblick auf Konzentrationsänderungen. Der Begriff „gewünschte Fraktion“ im Sinne des Verfahrens umfasst insbesondere aber nicht ausschließlich solche Fraktionen, die vor der Auftrennung auch aggregierende bzw. aggregierte Peptide und/oder Proteinbausteine enthielten, insbesondere toxische Oligomere.
Das Verfahren ist nicht ursächlich darauf ausgerichtet, wenngleich selbstverständlich ein Wirkstoff zu der Probe zugegeben werden kann, welche die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine mit unterschiedlicher Aggregatgröße und -Form umfasst. Oder aber es handelt sich um ein am Ende einer Tierstudie entnommenes Organ (z. B.: das Gehirn), das als Probe dient. Hierbei können die Proben eines mit Placebo behandelten Tiers mit jenen von mit Wirkstoff behandelten Tieren verglichen werden.
Ein Wirkstoff bzw. die Behandlung mit dem Wirkstoff ändert die Größenverteilung und damit die Konzentration bestimmter Aggregate im Organ und somit in der homogenisierten Probe. Diese Konzentrationsänderung wird dann quantitativ festgestellt. Die Änderung ist ein Maß für die Reduktion oder sogar für die vollständige Eliminierung bestimmter toxischer Spezies mit nachweisbarer Aggregat- bzw. Partikelgröße. Das heißt, dass das Verfahren die Zunahme oder die Abnahme der Konzentration bestimmter amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine über die Änderung der Aggregatgrößenverteilung in der Probe nachweist.
Die Zusammensetzung an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit unterschiedlicher Aggregatgröße und -Form wird also während der Behandlung unter Einfluss des Wirkstoffs verändert. Andere Partikelgrößen nehmen unter dem Einfluss des Wirkstoffs zu oder bleiben konstant.
Dadurch wird vorteilhaft die Konzentrationsänderung an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit jeweils bestimmter Größe quantitativ mit oder auch ohne den Einfluss eines Wirkstoffs erkennbar. Durch einen Vergleich mit Kontrollen ohne den Wirkstoff kann der Einfluss des Wirkstoffes auf die Verteilung der Aggregate der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine in der jeweiligen Fraktion quantitativ bestimmt werden. Hierdurch erhält man ein Maß unter anderem über die Wirksamkeit des Wirkstoffes hinsichtlich seiner Fähigkeit bestimmte Spezies während der Behandlungsphase zu eliminieren, z. B. toxische Oligomere.
Es ist auch möglich, nur eine einzige Fraktion auf diese Weise zu untersuchen. Man erhält dann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Maß über die Fähigkeit des Wirkstoffs die bestimmten Konformere aus der Fraktion quantitativ zu verändern, z. B. toxische Oligomere im Tiermodell zu eliminieren.
In einer Ausgestaltung der Erfindung wird auch die Änderung der Formverteilung der Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss eines Wirkstoffes untersucht vorzugsweise durch Fluoreszenz-Mikroskopische Verfahren.
Damit ist optional auch der Nachweis einer molekularen Wirkstoffaktivität im Tiermodell möglich. Von großem Vorteil ist die schnelle und zuverlässige Untersuchung am Ende einer Tierstudie, die die Reduktion von aggregiertem Aß (A-Beta) in Abhängigkeit von der Behandlung mit einem Wirkstoff quantitativ bis in den Femtomolaren Bereich nachweist.
Durch die besonders vorteilhafte Kombination einer auf Dichtegradientenzentrifugation basierenden Fraktionierung und der Konzentrationsbestimmung mit Hilfe der Fluoreszensmikroskopie, insbesondere der Laser Scanning Mikroskopie und der TIRF Mikroskopie wurde somit ein Verfahren entwickelt, welches besonders sensitiv den Einfluss potentieller Wirkstoffe auf den Anteil an toxischen Oligomer-Spezies eines Aß(1-42)-Peptids oder anderer Peptide und/oder Proteine quantifiziert, da es die Monomerform nicht misst.
Optional wird ein Wirkstoff in einer Tierstudie eingesetzt und hinsichtlich seiner Dosis abhängigen Einflusses auf die Partikelgrößenverteilung der Probe in vivo getestet in Abhängigkeit einer Kontrolle. Ganz besonders vorteilhaft ist das Verfahren geeignet für das Screening potentieller Wirkstoffe gegen die Alzheimersche Demenz (AD) basierend auf der Modulation der toxischen Amyloid-β (Aß)-Oligomere unter dem Einfluss des Wirkstoffes. Besonders Vorteilhaft ist es wenn diese Studien von Verhaltensuntersuchungen der Tiere begleitet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert zudem ein umfassendes, quantitatives Ergebnis in Hinblick auf die sich ändernde Partikel- bzw. Aggregatgrößenverteilung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss des Wirkstoffes. Damit werden erfolgversprechende Wirkstoffe, z. B. für eine Therapie der Alzheimerschen Demenz, welche die Konzentration an löslichen toxischen Bestandteilen wie z. B. den Aß-Oligomeren verringern soll auf ihre Wirkung im Tiermodell untersucht.
Das Verfahren ist hierauf nicht beschränkt. Ohne eine Einschränkung des Verfahrens erlaubt dieses darüber hinaus auch die Feststellung, ob der Wirkstoff zu einer Zunahme anderer potentiell toxischer oder erwünschter Spezies im Tiermodell führt. Vorzugsweise wird das Verfahren angewendet bei der Ermittlung von Wirkstoffen die nach heutigem Erkenntnisstand nicht zu einer Zunahme anderer toxischer Bestandteile führen. Hierzu werden besonders vorteilhaft mehrere der erhaltenen Fraktionen auf Konzentrationsänderung der Bausteine erfindungsgemäß untersucht.
Ein Vergleich der Kontrolle mit der einen Wirkstoff oder einen natürlichen Liganden beinhaltenden Probe erlaubt eine reproduzierbare und schnelle Bestimmung der Wirkstoffeffektivität bezüglich der Eliminierung und Reduktion bestimmter Spezies wie z. B. Oligomere und somit eine Abschätzung seiner Wirkung in einem Tiermodel und später in den klinischen Testphasen.
Es ist denkbar, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl an potentiellen Wirkstoffen hinsichtlich ihres Einflusses auf die Partikelgrößen-Verteilung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe schnell und reproduzierbar quantifiziert werden. Die Probe kann dabei synthetischer Art sein. Es können aber auch natürliche Wirkstoffe oder entnommene Proben auf diese Weise untersucht werden.
Die Erfindung ist noch nicht auf die bisherigen Ausführungen eingeschränkt. Vielmehr kann in einer vereinfachten Variante das Verfahren auch wie folgt durchgeführt werden:
Verfahren zum Nachweis von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe mit den Schritten:

a) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers oder nachweisbare Teile hiervon an der Oberfläche des Aggregats aufweist;
b) Die Probe nach Schritt a), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird mit dem Substrat in Kontakt gebracht und das darin enthaltene Monomer auf dem Substrat angeordnet;
c) Mindestens ein Fängermolekül B wird als Sonde zum Nachweis gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung mit dem Aggregat der Probe in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussenden kann.

In einer Ausgestaltung dieses Verfahrens wird auf dem Substrat ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung vor dem Schritt a) angeordnet und in Schritt b) das Monomer des Aggregats an Fängermolekül A angeordnet.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird hierzu eine Probe gewählt, aus der die unlöslichen Bestandteile vorab entfernt wurden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Kalibrationsstandard an einem anderen Teil des Substrats bzw. an einen anderen Teil des Fängermoleküls A angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine exakt definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung dieser Erfindung wird das Signal der an dem Probenaggregat angeordneten Fängermoleküle B mit dem Signal der an dem Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen.
Es versteht sich, dass sich weitere vorteilhafte Ausführungen bzw. Wirkungen einstellen, sofern die oben genannten Merkmale des speziellen Verfahrens mit den Schritten a) bis g) auf das vereinfachte Verfahren nach den Schritten a) bis c) angewendet werden.
Daher ist die Erfindung im einfachsten Falle der Nachweis eines Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung auf einem Substrat mit einer entsprechenden Sonde, dem Fängermolekül B.
Ausführungsbeispiele
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.
Der Kalibrationsstandard wird im Detail wie folgt bereitgestellt:
Schritt A Erstellung des anorganischen Nanopartikels.
In einem Rundkolben werden 200 ml of Ethanol, 3,8 ml 30 % Ammoniumhydroxid, 3,5 ml deionisertes Wasser und 4,4 ml Tetraethoxysilan für 2 Tage konstant gerührt. Das Reaktionsprodukt sind Silica Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 20 nm. Die Größe wird mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie ermittelt und entspricht der Größe des Amyloid beta Aggregats. Die Ausbeute wird durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt.
Schritt B: Oberflächenmodifikation mit primären Aminen zur Bildung freier Aminogruppen.
45 ml der Reaktionslösung aus Schritt A werden mit 10 µl Eisessig und 165 µl 3-Aminopropyl-triethoxy-silan gemischt und für vier Stunden gerührt. Im Anschluss werden die Partikel durch mehrmaliges zentrifugieren und Wiederaufnahme in Ethanol gereinigt. Die Ausbeute wird durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt.
Schritt C1: Oberflächenmodifikation mit Carboxyl-Funktionalitäten.
50 ml der gereinigten Partikel aus Schritt B werden zentrifugiert, in 50 ml Dimethylformamid aufgenommen und in einen Rundkolben überführt. Nachdem 5 mmol Bersteinsäure Anhydrid der Lösung hinzugefügt wurden, wird die Lösung unter Argon Atmosphäre für eine Stunde auf 90°C gerührt und erhitzt. Nach Ablauf der Zeit wird die Lösung für 24 Stunden weitergerührt. Die carboxylierten Partikel werden durch Zentrifugation und Wiederaufnahme in deionisertem Wasser gereinigt und die Ausbeute durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt.
Schritt C2: Oberflächenmodifikation mit Maleinimido Funktionalitäten.
200 pmol Partikel aus Schritt B werden in 1 ml 100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure Puffer bei pH 6 mit 10 Volumen % Dimethylformamid aufgenommen und mit 40 µmol 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 10 µmol N-Hydroxysuccinimid, 40 µM 6-Maleimid-hexansäure versetzt und für eine Stunde gemischt. Die Partikel werden durch mehrmaliges Zentrifugieren und Wiederaufnahme im oben genannten Puffer gereinigt.
D1: Biokonjugation von Amyloid beta (1-42) an Carboxy Silica Nanopartikel.
100 pmol carboxylierte Partikel werden in 1 ml deioniesiertem Wasser aufgenommen und mit 20 µmol 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 5 µmol N-Hydroxysuccinimid versetzt und für eine Stunde gemischt. Die aktivierten Partikel werden durch mehrmaliges Zentrifugieren und Wiederaufnahme in deionisiertem Wasser gereinigt. Final wird das Partikel Pellet in Phosphat Puffer aufgenommen, zu 0,3 mg rekombinantem Amyloid beta 1-42 Peptid hinzugefügt und über Nacht geschüttelt. Die biokonjugierten Partikel werden durch Zentrifugieren, Wiederaufnahme in Hexafluoropropanol und Inkubation für eine Stunde gereinigt. Im Anschluss wird das Lösungsmittel durch mehrmaliges Zentrifugieren und Wiederaufnahme in deionisertem Wasser gereinigt. Die Amyloid beta (1-42) Partikel werden durch Zentrifugation und Wiederaufnahme in deionisertem Wasser gereinigt und die Ausbeute durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt. Die Epitopanzahl wird über einen kommerziellen erhältlichen Bicinchoninsäure Test ermittelt und zu der Partikelkonzentration in Relation gesetzt.
D2: Biokonjuagtion von Amyloid beta (hier 1-15) Peptiden mit C-terminaler Sulfhydrylmodifikation.
1 ml der Partikel aus Schritt C2 werden werden zentrifugiert und in einem ml 100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure Puffer bei pH 6 mit 10 volumen % Dimethylformamid und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure aufgenommen mit 15 nmol des Peptids (Sequenz: DAEFRHDSGYEVHHQC, Amyloid beta 1-15 mit einer zusätzlichen Cystein Modifikation) versetzt und für 10 Minuten geschüttelt. Nach Ablauf der Zeit werden 50 µmol Tris(2-carboxyethyl)phosphin der Lösung hinzugefügt und die Lösung über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag werden die Partikel durch Zentrifugieren und Wiederaufnahme in deionisiertem Wasser gereinigt und die Ausbeute durch Verdampfen des Lösungsmittels und Abwiegen ermittelt. Die Epitopanzahl wird über einen kommerziellen erhältlichen Bicinchoninsäure Test ermittelt und der Partikelkonzentration in Relation gesetzt.
Es zeigen:

1: Aggregat Assay Ergebnis zweier durch Dichtegradientenzentrifugation (DGZ) fraktionierter und homogenisierter Maus Gehirn Proben.
2: Silberfärbung der Proteine in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomogenat einer APP_swe/PS1ΔE9 transgenen Maus.
3: Westernblot von Amyloid beta Proteinen in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomogenat der APP_swe/PS1ΔE9 transgenen Maus.

1 zeigt das Aggregat Assay Ergebnis zweier in durch Dichtegradientenzentrifugation (DGZ) fraktionerter homogenisierter Maus Gehirn Proben (ganze Hemisphere). Beide Mäuse waren zum Zeitpunkt der Organentnahme 24 Monate alt. Die als transgenes Tier bezeichnete Maus war eine APP_swe/PS1ΔE9 doppel Mutation, die stark humanes Amyloid beta exprimiert. Wild Typ Tiere exprimieren kein humanes Amyloid beta und werden daher im Assay durch den Einsatz von Antikörpern, die sich gegen humanes Amyloid beta richten nicht erkannt.
Die Fraktionen sind unterscheidbar und zeigen die gleiche Verteilung wie der Western blot (3) an. Damit ist gemeint, dass die Konzentration dargestellt in der 1 etwa dem Muster im Western Blot (3) entspricht allerdings mit dem Vorteil einer genauen quantitativen Aussage durch das erfindungsgemäße Verfahren.
Die Messung war erfolgreich, trotz des starken Hintergrunds durch die komplexe Probe wie leicht an der 2 durch unzählige Banden gezeigt werden kann. Im Gegensatz zum Western Blot erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren ohne eine weitere Trennung (am Gel) direkt den Nachweis spezifischer Amyloid beta Aggregate und mit Hilfe des Kalibrationsstandards sind diese vorteilhaft auch absolut quantifizierbar.
Probenvorbereitung, Homogenisierung und Dichtezentrifugation
Für die Homogenisierung wurden jeweils die rechten Hemispheren verwendet und für 2 × 20 s bei 6500 rpm (Precellys® 24, Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France) mit Tris Puffer (pH 8.3, 20 mM Tris, 250 mM NaCI, und Protease und Phosphatase Inhibitoren (beides Roche, Basel, Schweiz) behandelt.
150 µl des Homogenats wurden nochmals bei 1200 g für 10 min zentrifugiert und 100 µl des Überstandes auf einen Dichtegradienten aufgetragen. Der Dichtegradient bestand aus 5 bis 50 % (w/v) lodixanol (OptiPrep, Axis-Shield, Norway). Nach der Zentrifugation (3 h, 259.000 × g, bei 4 °C) (Optima TL-100, Beckman Coulter, USA), 14 Fraktionen (je 140 µl) wurden von oben nach unten hin abgenommen, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Plattenvorbereitung und Messung
Für den Assay wurden zunächst 384 well Mikrotiter-Platten mit 170 µm starkem Glasboden (Sensoplate Plus, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) vorbereitet.
Der Glasboden der Platte wurde mit APTES (99 %; (3-Aminopropyl) triethoxysilane; Sigma-Aldrich, Germany) durch Bedampfung silanisiert. Dafür wurde die Platte in einem Exsikator über 5 ml einer Lösung bestehend aus 5 % APTES in Toluol (99 % Sigma-Aldrich, Germany) in einer Argon Atmosphere für 1 h gelagert. Danach wurde die APTES Lösung entfernt und die Platte für 2 h unter Vakuum getrocknet. In die Reaktionskammern (RK) der Platte wurde eine 2 mM succinimidyl carbonate-poly-(ethylene glycol)-carboxymethyl (MW 3400, Laysan Bio, Arab, USA) in dd H₂O gefüllt und für 4 h inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktionskammer 3 mal mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Beschichtung mit 200 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (98 %; Sigma-Aldrich, Germany) und 50 mM N-hydroxysuccinimide (98 %; Sigma-Aldrich, Germany) aktiviert und für 30 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit dd H₂O wurden 10 µg/ml Fängerantikörper (Fängermolekül A), der sich gegen den N-terminus von Amyloid beta richtet (Nab228 monoclonal antibody, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in PBS den Reaktionskammer hinzugefügt und für 1 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBS + 0,2 %Tween (TBST) und TBS wurden die RK mit Smartblock Lösung über Nacht geblockt (Candor Bioscience, Germany). Am nächsten Tag wurde die Platte dreimal mit TBS gewaschen und Proben und Standards als Triplikat auf die Platte aufgetragen und für 1 h inkubiert.
Gehirnhomogenat Proben wurden zehnfach in TBS verdünnt bevor sie auf die Platte aufgetragen wurden. Als Kalibrationsstandard für Amyloid beta Oligomere dienten Aβ1-42-SiNaPs (Silica Nanopartikel) mit einem Durchmesser von 20 nm und ca. 30 Epitopen (Aβ1-42), welche, wie beschrieben, synthetisiert wurden.
Nach dem dreimaligen Waschen mit TBS wurden zwei verschiedene Sondenantikörper als Fängermoleküle B (je 1.25 µg/ml) mAb IC16, markiert mit CF-633, (Sigma-Aldrich, Germany) und Nab228 (epitope Aβ1-10) markiert mit CF-488 (beides Sigma-Aldrich, Germany), verwendet. Die Sonden wurden vor der Zugabe auf die Platte gemischt und ultrazentrifugiert (100.000 g, 1 h, 4 °C) und 1 h inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Reaktionskammer dreimal mit TBS gewaschen und die Platte versiegelt. Die Messung erfolgte in einem Leica multi-colour TIRF (total internal reflection fluorescence) System (AM TIRF MC, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Das TIRF System war mit einer automatisierten xyz Bühne und einem 100 × Öl Immersion Objective (1.47 oil CORR TIRF Leica) ausgestattet. Die Bilder wurden konsekutiv bei Ex/Em = 633/705 nm und 488/525 nm mit einer Belichtungszeit von 500 ms und einer Verstärkung von 800 für beide Kanäle aufgezeichnet. Die TIRF Eindring-Tiefe wurde auf auf 200 nm gesetzt. Das Mikroskop nahm 5 × 5 Bilder pro RK in jedem Kanal. Jedes Bild besteht aus 1000 × 1000 pixel mit einer lateralen Auflösung von 116 nm und einer 14 bit Intensitätsauflösung.
Intensitätsgrenzwerte wurden auf Basis der Negativkontrolle in jedem Kanal ausgewertet. Dieser Grenzwert wurde dann auf alle Bilder angewendet und nur jene Bildpunkte gezählt, welche an der derselben Position in beiden Kanälen (kolokalisiert) über den Intensitätsgrenzwerte lagen. Durch die Auswertung des Aß1-42-SiNaP Standards, lässt sich die Anzahl an kolokalisierten Bildpunkten über den Schwellenwerten in Oligomer konzentrationen umwandeln.
2 zeigt die Silberfärbung der gesamten Proteine in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomogenat der APP_swe/PS1ΔE9 transgenen Maus.
Für die Silberfärbung wurden 12 µl jeder Fraktion (1 to 14) der DGZ auf ein SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat polyacrylamide gel electrophoresis) in einem 16.5 % Tris-Tricin Gel bei konstanter Stromstärke von 45 mA pro Gel für 110 min in einem Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, California, USA). Nach der Fixierung des Polyacrylamid Gels über Nacht in 50 % Ethanol/10 % Essigsäure wurde das Gel in 10 % Ethanol/5 % Essigsäure zweimalig 5 min lang inkubiert. Das Gel wurde dann in einer 4.7 mM Na₂CO₃, 4.6 mM K₃Fe(CN)₆, und 19 mM sodium thiosulfate Na₂S₂O₃ for 60 s inkubiert und dreimal für 20 s mit dd H₂O gewaschen. Anschließend wurde das Gel für 20 min in 12 mM AgNO₃ behandelt und wieder dreimal für 20 s mit dd H2O gewaschen. Die Färbung wurde in 280 mM Na₂CO₃ mit 0.05% Formalin (37% Formaldehydlösung) entwickelt bis die erwünschte Intensität erreicht wurde. Die weitere Entwicklung des Gels wurde durch Behandlung mit 1 % Essigsäure für 5 min gestoppt. Die Aufnahme wurde mithilfe eines ChemiDoc MP System (Bio-Rad, California, USA) gemacht.
3 zeigt hierzu den Westernblot von Amyloid beta Proteinen in den einzelnen Fraktionen des Gehirnhomogenat der APP_swe/PS1ΔE9 transgenen Maus.
Für die Silberfärbung wurden 12 µl jeder Fraktion (1 bis 14) der Dichtegradientenzentrifugation auf ein SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat polyacrylamide gel electrophoresis) in einem 16.5 % Tris-Tricin Gel bei konstanter Stromstärke von 45 mA pro Gel für 110 min in einem Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, California, USA) getrennt.
Die Proteine wurden auf eine PVDF Membran mit einer Porengröße von 0,2 µm (Roti-PVDF 0.2, Carl Roth, Germany) bei 25 V und 1 A für 30 min transferiert. Dafür wurde ein Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, California, USA) verwendet. Die Membranen wurden in PBS für 5 min nach dem Transfer gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die Membranen in PBS und in TBS + Tween20 (TBST) für 5 min inkubiert. Die Membranen wurden mit 10 % Magermilchpulver/TBST (1 h, Raumtemperatur) geblockt und mit anti-Aß antibody mAb IC16 (1:1000 in TBST über Nacht, 4 °C) inkubiert. Die Membrane wurden anschließend 3mal für 10 min mit TBST gewaschen und mit einem HRP-konjugierten Ziege anti-Maus IgG (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) (1:10000 in TBST) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für je 10 min mit TBST wurden die Proteinbanden in einem ChemiDoc MP System (Bio-Rad, California, USA) durch die Verwendung von ECL Prime Substrat (Amersham, Little Chalfont, United Kingdom) sichtbar gemacht.
Es versteht sich, dass sich ein vereinfachtes Verfahren aus den Ausführungsbeispielen zum Nachweis der Proteinfehlfaltungserkrankung durch Weglassen einzelner Schritte ergibt, wie in den Patentansprüchen 17 bis 21 in abstrakter Weise angegeben.
Daher ist die Erfindung im einfachsten Falle der Nachweis eines Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung auf einem Substrat mit einer entsprechenden Sonde, dem Fängermolekül B, ohne den entsprechenden Quantifizierungsschritt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Funke et al. bekannt ist (S. A. Funke, T. van Groen, I. Kadish, D. Bartnik, L. Nagel-Steger, O. Brener, T. Sehl, R. Batra-Safferling, C. Moriscot, G. Schoehn, A. H. C. Horn, A. Muller-Schiffmann, C. Korth, H. Sticht, D. Willbold. Oral Treatment with the D-Enantiomeric Peptide D3 Improves the Pathology and Behavior of Alzheimer's Disease Transgenic Mice. ACS Chem. Neurosci. (2010), 1, 639-648 [0003]
Sehlin et al. (Dag Sehlin , Hillevi Englund, Barbro Simu, Mikael Karlsson, Martin Ingelsson, Fredrik Nikolajeff, Lars Lannfelt, Frida Ekholm Pettersson. 2012. Large Aggregates Are the Major Soluble Aß Species in AD Brain Fractionated with Density Gradient Ultracentrifugation. Plos one, Vol. 7, e32014) [0004]
Ward et al. (Robin V. Ward, Kevin H. Jennings, Robert Jepras, William Neville, Davina E. Owen, Julie Hawkins, Gary Christie, John B. Davis, Ashley George, Eric H. Karran and David R. Howlett. 2000. Fractionation and characterization of oligomeric, protofibrillar and fibrillar forms of β-amyloid peptide. Biochem. J. 348, 137-144) [0005]

Claims

Verfahren zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte: a) Auf einem Substrat wird ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet; b) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist; c) Aus der Probe werden die unlöslichen Bestandteile entfernt; d) Die Probe nach Schritt c), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird an einem Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A in Kontakt gebracht und das darin enthaltene Monomer am Fängermolekül A angeordnet; e) Ein Kalibrationsstandard wird an einem anderen Teil des Substrats mit dem Fängermolekül A in Kontakt gebracht und daran angeordnet, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind; f) Mindestens ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung wird sowohl mit dem Aggregat der Probe als auch mit dem Kalibrationsstandard in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussenden kann; g) Das Signal des oder der an dem Probenaggregat angeordneten Fängermoleküle B wird mit dem Signal der an dem Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen, wobei die Schritte a) bis g) nicht nacheinander durchgeführt werden müssen.
Verfahren nach vorherigem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Fängermolekül A nach Schritt a) und als Fängermolekül B nach Schritt f) Moleküle gewählt werden, die an dieselbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfaltungserkrankung binden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Fängermolekül A und als Fängermolekül B monoklonale Antikörper gewählt werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fängermolekül B gewählt wird, das mindestens zwei monoklonale Antikörper gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine komplexe Probe enthaltend Amyloid beta Monomer der Alzheimerschen Demenz verwendet wird.
Verfahren nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet dadurch, dass ein monoklonaler Antikörper als Fängermolekül A in Schritt a) und als Fängermolekül B in Schritt f) verwendet wird, die Amyloid beta 3-8 als identische Zielregion des Monomers aufweisen.
Verfahren nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet dadurch, dass in Schritt e) als Kalibrationsstandard ein Partikel mit der Größe des Aggregats der Proteinfehlfaltungserkrankung verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) als Kalibrationsstandard ein Partikel verwendet wird, der eine definierte Anzahl an Monomeren des nachzuweisenden Aggregats an der Oberfläche des Partikels aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) als Kalibrationsstandard ein Silica-Nanopartikel mit etwa 20 nm Größe und etwa 30 Amyloid beta Monomeren auf der Oberfläche verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) als komplexe Probe das Hirnhomogenat eines Tieres, insbesondere einer transgenen Maus mit Alzheimerscher Demenz, gewählt wird.
Vorrichtung zur Quantifizierung von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer komplexen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Substrat umfasst, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt und auf einem Teil des Substrats am Fängermolekül A ein Partikel als Kalibrationsstandard mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist, die der Anzahl der Monomerepitope im nachzuweisenden Aggregat entspricht und an einem anderen Teil des Substrats das Fängermolekül A die Bindungsstellen für Monomere der Proteinfehlfaltungserkrankung aus der komplexen Probe bereit stellt.
Vorrichtung nach vorherigem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Kalibrationsstandard ein Partikel mit der Größe des nachzuweisenden Aggregats angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der vorherigen zwei Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Silica-Nanopartikel als Kalibrationsstandard.
Vorrichtung nach einem der vorherigen drei Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Mikrotiterplatte als Substrat, wobei die Mikrotiterplatte mindestens eine Reaktionskammer aufweist, auf deren Boden ein an einem Fängermolekül A angeordneter Kalibrationsstandard angeordnet ist und die Vorrichtung mindestens eine weitere Reaktionskammer aufweist, auf deren Boden Fängermolekül A für das nachzuweisende Aggregat der Probe angeordnet ist.
Kit zur Quantifizierung von Aggregat einer Proteinfehlfaltungserkrankung, umfassend: - ein Substrat, auf dem ein Fängermolekül A für ein Monomer einer Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet vorliegt und an einem Teil der immobilisierten Fängermoleküle A ein Kalibrationsstandard mit einer definierten Anzahl an Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet ist; - mindestens ein Fängermolekül B für das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung, wobei das Fängermolekül A und das Fängermolekül B an dieselbe Zielregion des Monomers der Proteinfehlfaltungserkrankung binden.
Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 14 oder eines Kit nach Anspruch 15 zum Nachweis des Einflusses eines Wirkstoffs auf die Konzentration eines Aggregats einer Proteinfehlfaltungserkrankung.
Verfahren zum Nachweis von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte: a) Eine komplexe Probe, umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung wird gewählt, wobei das Aggregat Epitope des Monomers an der Oberfläche des Aggregats aufweist; b) Die Probe nach Schritt a), umfassend das Aggregat der Proteinfehlfaltungserkrankung, wird mit dem Substrat in Kontakt gebracht und das darin enthaltene Monomer auf dem Substrat angeordnet; c) Ein Fängermolekül B gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung wird mit dem Aggregat der Probe auf dem Substrat in Kontakt gebracht und an das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet, wobei das Fängermolekül B ein detektierbares Signal aussenden kann.
Verfahren nach vorherigem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Substrat ein Fängermolekül A gegen das Monomer der Proteinfehlfaltungserkrankung vor dem Schritt a) angeordnet wurde und in Schritt b) das Monomer an Fängermolekül A angeordnet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen zwei Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe gewählt wird, aus der die unlöslichen Bestandteile vorab entfernt wurden.
Verfahren nach einem der vorherigen zwei Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an einem Teil des Substrats ein Kalibrationsstandard mit dem Fängermolekül A in Kontakt gebracht und angeordnet wird, wobei an der Oberfläche des Kalibrationsstandards eine definierte Anzahl an Monomeren der nachzuweisenden Proteinfehlfaltungserkrankung angeordnet sind.
Verfahren nach vorherigem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal der an dem Probenaggregat angeordneten Fängermoleküle B mit dem Signal der an dem Kalibrationsstandard angeordneten Fängermoleküle B zur Quantifizierung des Probenaggregats verglichen wird.