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Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Bestimmen der Zellaktivierung einer Zielzelle durch einen Aktivator.
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Hintergrund der Erfindung
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Derartige Verfahren und Vorrichtungen werden beispielsweise in der biomedizinischen Forschung, der Wirkstoffforschung, der Biomaterialforschung oder der Toxikologie genutzt, um die Aktivierung einer Zielzelle durch einen Aktivator zu untersuchen. Hierbei betreffen entsprechende Untersuchungen die Frage, ob überhaupt eine Aktivierung im konkreten Fall feststellbar ist, und wahlweise auch den Aspekt von näheren Eigenschaften der Aktivierung, wenn eine solche festgestellt werden kann.
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Viele Vorgänge im Körper von Organismen werden ausgelöst, indem eine Zelle, die auch als Zielzelle bezeichnet wird, mit einem Partikel, einem ausgedehnten Festkörper oder einer anderen Zelle in Kontakt kommt. Die Zelle wird durch den Kontakt aktiviert. Das heißt, dass der Kontakt der Zelle mit dem Partikel, dem Festkörper oder der anderen Zelle zellinterne Signale auslöst, die dann zum Beispiel zu einem veränderten Gen-Expressionsmuster der Zelle führt. Die Zelle wird dadurch in einen neuen Zustand überfährt und nimmt neue Aufgaben war.
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Ein Beispiel für eine Zellaktivierung ist die Wirkung eines oder mehrerer Adjuvanten auf die Zielzelle. Als Adjuvant wird häufig ein Hilfsstoff bezeichnet, der die Wirkung von spezifisch wirkenden Substanzen auf die Zielzelle verstärkt. In der Immunologie wird ein Adjuvant zum Beispiel benötigt, um eine ausreichende Immunantwort zu erhalten. Es kann auch sein, dass verschiedene Adjuvants die Immunantwort in anderer Weise verbessern. Bei einer Impfung wird zum Beispiel zusätzlich ein Adjuvant gegeben, um einen ausreichenden Impfschutz zu gewährleisten.
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Die exakte Wirkweise der Adjuvants ist häufig noch unbekannt, und ihre Wirkung wird empirisch ermittelt. Derzeit gibt es in Europa nur eine sehr geringe Anzahl von für eine Impfung zugelassenen Adjuvants. Zur Erforschung eines verbesserten oder neuen Adjuvants muss derzeit zum Beispiel in der Immunologie zumindest teilweise die Immunantwort untersucht werden. Eine Möglichkeit, die Immunantwort zu untersuchen, besteht darin, u. a. den Aktivierungszustand von Immunzellen zu untersuchen, zum Beispiel von dendritischen Zellen. Hierfür wird üblicherweise ein passender Antikörper benötigt, der noch mit einem Fluorophor auszustatten ist. Es ist ferner eine Inkubationszeit abzuwarten, die durchaus mehrere Stunden betragen kann. Um eine ausreichende Statistik zu haben, wird ferner eine genügende Anzahl von Zellen benötigt. Vielfach wird auch ein Tierversuch nicht zu vermeiden sein, um die Wirkung des Adjuvants zu beurteilen.
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Es ist bekannt, dass beispielsweise Adjuvants für eine Aktivierung oder zumindest für eine verstärkte Aktivierung von Immunzellen sorgen. Es gibt noch zahlreiche weitere Beispiele in der Immunologie, bei denen ganz allgemein ein Aktivator die Aktivierung einer Zielzelle durchführt, die dann der Aktivierung gemäß zumindest in Teilen ein anderes Verhalten zeigt als vor der Aktivierung. So werden zum Beispiel T-Zellen erst durch dendritische Zellen aktiviert und schütten beispielsweise Zytokine aus. B-Zellen werden durch Antigene aktiviert und sezernieren entsprechende Antikörper. Eine verallgemeinerte Bedeutung der Partikel-basierten Zellaktivierung wird durch die Wirkungsweise eines Wirkstoffpartikels deutlich. Ein Wirkstoffpartikel kommt nur dann zur Wirkung, wenn es bei Kontakt eine Zielzelle aktiviert.
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Ein weiteres Beispiel einer Partikel-basierten Zellaktivierung ist die Wirkung eines toxischen Partikels. Es ist bekannt, das Partikel zum Beispiel durch Einatmen in die Lunge eine gesundheitsschädliche Wirkung entfalten können. Die gesundheitsschädliche Wirkung kommt nur dann zu Stande, wenn das Partikel bei Kontakt eine Zelle aktiviert, zum Beispiel eine Lungenepithelzelle.
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Ein Beispiel einer Festkörper basierten Zellaktivierung findet sich in der Transplantat-Technik. Führt zum Beispiel ein Material eines Transplantats bei Kontakt mit Zellen eines Gewebes zu deren Aktivierung, kann dies zu einer Entzündung des Gewebes führen, und das Transplantat wird abgestoßen. Generell muss in der Biomaterialforschung darauf geachtet werden, dass die gewünschte Zellaktivierung zustande kommt und eine unerwünschte Zellaktivierung ausgeschlossen wird.
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Zellaktivierung durch Kontakt mit anderen Zellen finden sich zum Beispiel in der T-Zell-Selektion und Aktivierung (Alberts et. al., Molekularbiologie der Zelle, VCH-Verlag, Weinheim, 1995), der Migration von Neutrophilen (Wagner et al., Neutrophil Migration Mechanisms, with an Empasis an the Pulmonary Vasculature, Pharmacological Reviews, Vol. 52, Issue 3, 349–374, 2000), generell in der Organogenese oder bei Vorgängen im Zusammenhang mit der Bildung eines Krebsgeschwürs oder der Bildung von Krebsmetastasen.
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Die Sondenmikroskopie (PM – „Probe Microscopy”) ist eine Mess- und Analysetechnik, bei der in einer prominenten Ausführung eine Messsonde über eine Probe eines zu untersuchenden Messmediums gerastert wird und bei der über eine abstandsabhängige Wechselwirkung zwischen der Messsonde und der Probe eine Topographie der Probe ermittelt wird. Es können aber auch Materialkonstanten oder andere Probeninformationen gewonnen werden. Aufgrund des oft benutzten Rastervorgangs wird anstatt PM auch oft der Begriff Rastersondenmikroskopie (SPM – „Scanning Probe Microscopy”) verwendet. Es gibt verschiedene Ausführungen der Sonde. Die prominentesten Vertreter der PM sind das Rasterkraftmikroskop (AFM – „Atomic Force Microscope”) und das Rastertunnelmikroskop (STM – „Scanning Tunneling Microscope”). Weitere Vertreter dieser Technologie sind insbesondere das Rasternahfeldmikroskop (SNOM – „Scanning Near Field Microscope”), das Rasterphotonenmikroskop (SPhM – „Scanning Photone Force Microscope”) und das Photonenmikroskop („Photonic Force Microscope”). Eine weitere wichtige der Sondenmikroskopie zugeordnete Untersuchungsmethode ist auch die Abstandsspektroskopie, bei der die Messsonde zu Messzwecken meistens nur entlang einer vertikalen Richtung relativ zur untersuchten Probe verlagert wird. In diesem Fall kann sowohl das Gerät als auch die dazugehörige Software hierauf reduziert sein.
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Zum Messen der abstandsabhängigen Wechselwirkung zwischen Messsonde und Probe wird bei der Abstandsspektroskopie die Messsonde relativ zur Oberfläche der Probe verlagert, beispielsweise in einer zur Probenoberfläche vertikalen Richtung, und die Wechselwirkung zwischen Messsonde und Probe wird gemessen. Alternativ kann auch die Probe bewegt werden. Es kann auch eine Relativbewegung zwischen Messsonde und Probe vorgesehen sein, bei der sowohl die Messsonde als auch die Probe bewegt werden. Bei der Sondenmikroskopie wird diese Abstandsspektroskopie zum Messen der Wechselwirkung zwischen Messsonde und Probe beispielsweise dazu genutzt, Kräfte zwischen Molekülen zu messen, indem ein Molekül an die Messsonde bindet und ein weiteres Molekül an die Probe. Es kann dann die Wechselwirkung zwischen den beiden gebundenen Molekülen gemessen werden. Es können aber auch intramolekulare Kräfte gemessen werden, indem beispielsweise die Messsonde auf die Probe abgesenkt und hierbei auf eine Bindung gewartet wird. Danach kann die Messsonde wieder von der Probe entfernt werden, wobei hierbei auf die Messsonde wirkende Kräfte aufgezeichnet werden. Darüber hinaus sind weitere Messungen möglich, bei denen eine Wechselwirkung gemessen wird, die mit einem zugeordneten Abstand zu zwei oder mehreren Orten korreliert.
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Als Messsonde wird bei der Rasterkraftmikroskopie üblicherweise ein Bauteil verwendet, welches auch als Cantilever bezeichnet wird. Mit diesem können Kräfte gemessen werden, indem die Verbiegung der Messsonde erfasst wird. Zur Minimierung des Wechselwirkungsvolumens und damit zur Verbesserung der lateralen Auflösung ist in vielen Fällen eine Messspitze am freien Ende des Cantilevers angebracht. Im Fall der Abstandsspektroskopie wird jedoch auch anstatt der Spitze eine spezifische Belegung des Cantilevers zum Beispiel mit einer Zelle durchgeführt; oft wird dann die Spitze sogar weggelassen. Ohne Einschränkung der Allgemeinheit wird in den nachfolgenden Erläuterungen auf einen Cantilever Bezug genommen. Die Ausführungen gelten entsprechend für andere Formen von Messsonden in der Sondenmikroskopie. Die Cantilever sind in der Regel an einer Basis befestigt, insbesondere um eine sinnvolle Handhabung zu gewährleisten.
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Es ist bekannt, für die Abstandsspektroskopie als Messsonden sowohl unbehandelte als auch vorbehandelte Cantilever zu verwenden. Im Fall eines unbehandelten Cantilevers ist eine Bindung der Probe bei der Messung unspezifisch. Beispielsweise geht es hierbei darum, Moleküle mittels Bindung an den Cantilever aus ihrem Umgebungsmedium zu ziehen, um die Wechselwirkung der Moleküle mit dem Umgebungsmedium zu messen. Hierbei können aber auch die Moleküle genauer charakterisiert werden, an denen gezogen wird. So zeigen zum Beispiel DNA-Moleküle eine spezifische Spektroskopiekurve aufgrund einer internen Konformationsumwandlung.
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Mit einem vorbehandelten Cantilever können insbesondere spezifische Bindungen untersucht werden. Eine solche Untersuchung kann vorteilhaft sein, wenn das Ausbilden von ungewünschten Bindungen, die danach unter Umstanden kaum noch voneinander getrennt werden können, bei der Messung verhindert werden soll. So ist es gängige Praxis, ein oder mehrere Moleküle an die als Cantilever ausgeführte Messsonde zu binden, welche dann mit dem oder den gebundenen Molekül(en) ein Rezeptor-Ligand-System bildet. Es ist auch bekannt, ganze Zellen an eine als Cantilever gebildete Messsonde zu binden und dieses System in Wechselwirkung mit einer Probe, beispielsweise einem Biomaterial, oder mit anderen Zellen zu bringen. In diesem Fall kann es zum Beispiel, wie oben schon erwähnt, günstig sein, einen Cantilever ohne Spitze zu verwenden. Vorbehandlungen von Messsonden, insbesondere von Cantilever, sind in verschiedenen Ausführungsformen bekannt, beispielsweise in Form des Hydrophobisierens der Messsonde.
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Bekannte Möglichkeiten zur Vorbehandlung des Cantilevers führen allgemein zu einer Beschichtung der Messsonde, zumindest in Teilbereichen. So beschichtet eine an dem Cantilever angebrachte Zelle einen Teilbereich der Oberfläche des Cantilevers. Es kann hierbei vorgesehen sein, den Cantilever im Rahmen der Vorbehandlung zunächst mit einer Beschichtung zu versehen, insbesondere einer haftvermittelnden Beschichtung, auf der dann eine zu messende Substanz aufgebracht wird. Allgemein wird im folgenden das im Rahmen der Vorbehandlung auf die Messsonde, insbesondere den Cantilever, aufgebrachte Material als Sondensubstanz bezeichnet, sei es ein einzelnes Material oder eine Kombination von mehreren Materialien, die beispielsweise eine haftvermittelnde Basis und eine hierauf angeordnete und zu untersuchende Substanz umfasst. Eine im Rahmen der Vorbehandlung aufgebrachte und von der Sondensubstanz umfasste (Basis-)Beschichtung wird auch als Sondenbeschichtung bezeichnet.
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Im Dokument A. Taubenberger et al., Molecular Biology of the Cell, Band 18, Seiten 1634–1644 (Mai 2007) ist ein Verfahren zum Bestimmen des zeitlichen Verlaufs der Bindung zwischen einer Zelle und einem Collagen beschrieben. Hierzu wird die Zelle mittels eines Cantilevers eines Rasterkraftmikroskop auf das Collagen aufgebracht. Anschließend wird der Cantilever von der Zelle von dem Collagen entfernt und der zeitliche Verlauf einer Kraft gemessen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen der Zellaktivierung einer Zielzelle durch einen Aktivator zu schaffen, bei denen der Aufwand, sei es in zeitlicher und/oder materieller Hinsicht, für die Untersuchung der Zellaktivierung vermindert ist.
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Dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren der Zellaktivierung einer Zielzelle durch einen Aktivator nach dem unabhängigen Anspruch 1 gelöst. Weiterhin ist eine Vorrichtung zum Bestimmen der Zellaktivierung einer Zielzelle durch einen Akivator nach dem unabhängigen Anspruch 13 vorgesehen. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.
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Mit der Erfindung ist die Möglichkeit geschaffen, auf einfache Art und Weise zeitsparend eine Aktivierung der Zielzelle durch den Aktivator zu prüfen. Insbesondere kann mittels der vorgeschlagenen Technologien festgestellt werden, ob der Aktivator überhaupt zu einer Aktivierung der Zielzelle führt oder nicht, was anhand der Wechselwirkung in Form der Bindung oder der Nichtbindung zwischen Zielzelle und Aktivator untersucht wird. Die Bindung bildet insoweit einen Indikator für die Zellaktivierung.
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Die Zielzelle selbst kann von einer Gruppe von Zellen umfasst sein. Auch kann in einer möglichen Ausgestaltung vorgesehen sein, dass auf der Messsonde mehrere Aktivatoren angeordnet sind. Umgekehrt können an der Messsonde auch mehrere Zielzellen angeordnet sein. Bei der Messsonde kann es sich beispielsweise um einen so genannten Cantilever handeln. Das Maß für die Zellaktivierung kann aus einer oder mehreren für die Bindung der Zielzelle erfassten Messgrößen abgeleitet werden.
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Eine Bindung im hier verstandenen Sinne sind alle starken und schwachen Bindungen oder alle Kontakte zwischen Zielzelle und dem Aktivator im Allgemeinen, die eine Potentialmulde hervorrufen und somit eine anziehende Kraft zwischen den Bindungspartnern hervorrufen. Zu en starken Bindungen gehören insbesondere die kovalente Bindung und die ionische Bindung. Die schwachen Bindungen umfassen insbesondere die Wasserstoffbrückenbindung, die vander-Waals Bindung und die Dipol-Dipol- und die Dipol-Ion-Wechselwirkungen. Weitere Bindungsarten umfassen insbesondere Kräfte, die aufgrund der Oberflächenspannung entstehen, zum Beispiel zwei hydrophobe Körper, die in einer wässrigen Umgebung in Kontakt gebracht werden. Auch sind entropische Kräfte Bindungen, die entstehen, wenn Konfigurationsmöglichkeiten eingeschränkt werden.
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Die vorgeschlagenen Technologien entfalten ihre Vorteile insbesondere bei der Überprüfung einer Vielzahl von Aktivatoren und/oder Zielzellen, da im Vergleich zu Methoden des Standes der Technik der Zeitaufwand für die Bestimmung einer Zellaktivierung wesentlich vermindert ist. Auch der Materialeinsatz ist deutlich reduziert, insbesondere hinsichtlich der Notwendigkeit des Vorsehen umfangreichen Zellmaterials oder auch von Tierversuchen.
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In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wurde festgestellt, dass Zellen durch den Kontakt mit einem Partikel, Festkörper oder einer anderen Zelle aktiviert werden können. Eine Zellaktivierung erfolgt über einen spezifischen oder unspezifischen Rezeptor oder aufgrund der Wechselwirkung der Lipide oder anderer Komponenten der Plasmamembran mit einem Partikel, einem Festkörper oder einer anderen Zelle.
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Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass aus den erfassten Messwerten weiterhin ein Aktivierungsmaß für einen zellaktivierten Zustand der Zielzelle bestimmt wird.
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Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Messwerte als Kraftmesswerte erfasst werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Kraftmessung ist das Erfassen einer Kraftabstandskurve. Hierdurch kann insbesondere die Adhäsion zwischen Aktivator und Zielzelle ermittelt werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass beim Erfassen der Messwerte ein zeitlicher Verlauf einer die Bindung oder die Nichtbindung zwischen der Zielzelle und dem Aktivator anzeigenden Messgröße erfasst wird. Auf eine Aktivierung der Zielzelle durch den Aktivator kann insbesondere dann geschlossen werden, wenn der zeitliche Verlauf eine Zunahme der Bindung zwischen der Zielzelle und dem Aktivator anzeigt.
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Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, dass beim relativen Verlagern der Messsonde und der Probenaufnahme zueinander die Zielzelle und der Aktivator wiederholt in Kontakt gebracht und voneinander gelöst werden.
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Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass als Sondenmessvorrichtung ein Sondenmikroskop bereitgestellt wird und die Messwerte als sondenmikroskopische Messwerte erfasst werden.
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Eine Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, dass als Sondenmikroskop ein Rastersondenmikroskop bereitgestellt wird und die sondenmikroskopischen Messwerte als rastersondenmikroskopische Messwerte erfasst werden.
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Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass als Sondenmikroskop ein Rasterkraftmikroskop bereitgestellt wird und die sondenmikroskopischen Messwerte als rasterkraftmikroskopische Messwerte erfasst werden.
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Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass der Aktivator an die Messsonde oder die Probenaufnahme über einen Aktivatorhaftvermittler gebunden wird. Mit Hilfe des Aktivatorhaftvermittlers kann eine mögliche Wechselwirkung des Aktivators mit der Messsonde oder der Probenaufnahme selbst neutralisiert werden, um hierdurch eventuell verursachte Messverfälschungen zu vermeiden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass die Zielzelle an die Messsonde oder die Probenaufnahme über einen Zellhaftvermittler gebunden wird. Bevorzugt ist der Zellhaftvermittler so gewählt, dass durch ihn selbst eine Aktivierung der Zielzelle nicht stattfindet.
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Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, dass für die Messwerte mehrere Messreihen erfasst werden. Das Erfassen der mehreren Messreihen kann in zeitlichen Abständen durchgeführt werden. Hierbei können beispielsweise gleiche Zeitabstände zwischen unterschiedlichen Messreihen vorgesehen sein. Aber auch eine zufällige Verteilung der zeitlichen Abstände zwischen den Messreihen kann genutzt werden. Das Erfassen mehrere Messreihen ermöglicht insbesondere auch das Erfassen von zeitlichen Veränderungen der Bindung zwischen der Zielzelle und dem Aktivator in Form einer Bindung oder einer Nichtbindung.
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Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass als Aktivator ein Material ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Materialien verwendet wird: Wirkstoffpartikel, Implantatmaterial, Aerosol, Adjuvant und Aktivatorzelle.
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Im Fall des Adjuvant kann ein Verfahren ausgeführt werden, bei dem die Wirkung als Aktivator sehr schnell beurteilt werden kann, so dass eine Vorauswahl von Adjuvants aus einer großen Gruppe von Kandidaten ermöglicht ist. Im Fall eines Implantats kann geprüft werden, ob ein Material eine Entzündungsreaktion hervorruft oder nicht. Im Falle von Aerosolen kann mit dem Verfahren geprüft werden, ob diese in der Lunge toxisch wirken oder durch die Lunge in den Blutstrom gelangen können und im Körper toxisch wirken oder ob sie eine Entzündungsreaktion der Lunge oder im Rest des Körpers hervorrufen. Im Falle eines Wirkstoffpartikels kann untersucht werden, ob das Partikel überhaupt mit Zielzellen wechselwirkt und so potentiell wirksam werden kann. Weiter lassen sich Fragestellungen der Grundlagenforschung der Immunologie, der Krebsforschung oder dergleichen mit dem Verfahren angehen, die direkt eine Aktivierung einer Zielzelle durch die Wechselwirkung mit einem Partikel, einem Festkörper oder einer anderen Zielzelle untersuchen.
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Mittels der Messung der Bindung zwischen einem Aktivator und einer zu aktivierenden Zelle, der Zielzelle, wird eine Auswahl getroffen, welchen Effekt der Aktivator erzielt. Darüber hinaus kann auch anhand der Bindung eine Aussage über den Aktivierungszustand der Zielzelle getroffen werden. Auch kann mittels einer gezielten Herbeiführung einer Bindung mit einer Zielzelle eine gewünschte Aktivierung bewirkt werden.
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Die passende Zielzelle ist für den zu untersuchenden Prozess von Fall zu Fall zu ermitteln und wird aus der Gruppe der Zellen gewählt, die für einen zu untersuchenden Anwendungsfall von Bedeutung sind. Es ist unter Umständen von Vorteil, eine große Zahl von verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Zuständen zu untersuchen. Ist die Zielzelle oder eine Gruppe von Zielzellen gefunden, so können hieran eine Vielzahl von verschiedenen Aktivatoren getestet werden.
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Ein Vorteil gegenüber dem Stand der Technik besteht somit darin, dass nur noch der Aktivator und die Zielzelle benötigt wird. Es muss also nicht indirekt über die Wirkung, beispielsweise die Expremierung neuer Proteine, der Effekt der Aktivierung des Aktivators getestet werden. Dieser ergibt sich unmittelbar aus der Bindung selbst. In anderen Fällen erlaubt die Erfindung unter einer großen Zahl von Zelltypen und/oder Aktivatoren diejenigen auszusuchen, die grundsätzlich miteinander binden und eine Aktivierung zur Folge haben. Weitere Untersuchungen zur exakten Natur der Wechselwirkung in Form der Bindung schränken sich dadurch auf diese Wechselwirkungspartner ein.
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Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass es sich um eine Einzelmessung handelt, das heißt es werden im einfachsten Fall nur ein Aktivator und eine Zielzelle benötigt. Der Aktivator kann zu diesem Zweck an der Messsonde gebunden sein und die Zielzelle an der Probenauflage. Aber auch eine umgekehrte Anordnung kann vorgesehen sein. Welche Version gewählt wird, wird im Einzelfall davon abhängig gemacht werden, welche Kombination einfacher zu präparieren ist.
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Eine mögliche Ausführung der Erfindung besteht darin, dass die Zielzelle eine Immunzelle ist, insbesondere eine dendritische Zelle.
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Eine mögliche Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass bei der Präparation der Zielzelle, zum Beispiel bei der Befestigung an den Cantilever oder an der Probenaufnahme, eine Aktivierung verhindert wird. Eine mögliche Methode ist zum Beispiel die Verwendung von Cell-Tac zur Immobilisierung der Zelle (zu Cell-Tac vgl. Waite et al., Polyphenolic Substance of Mytilus edulis: Novel Adhesive Containing L-Dopa and Hydroxyproline. Science 212 (1981): 1038–1040). Im Fall des PFM („Photonic Force Microscope”) kann wahlweise auch auf eine Immobilisierung der Zielzelle und/oder des Aktivators verzichtet werden.
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Eine weitere Fortbildung sieht vor, dass die korrespondierende Substanz und/oder das Adjuvant derart präpariert sind, dass eine Bindung möglich ist. Sollen zum Beispiel kleine Moleküle als Adjuvants getestet werden, so ist es gegebenenfalls besser, diese Moleküle zum Beispiel an einem kleinen Partikel zu befestigen und dieses Partikel dann an den Cantilever anzubringen. Es ist dann gewährleistet, dass nur das Adjuvant an der Wechselwirkung beteiligt ist und nicht zum Beispiel das Silizium eines Cantilevers. Neben dieser Lösung kann das Adjuvant auch über ein längliches Molekül mit dem Cantilever verbunden werden. Diese Methode hat den Vorteil, dass sich die Bindung flexibler und somit dem natürlichen Prozess näher ausbilden kann. Beispielsweise kann das Adjuvant eine Drehung vollziehen, um in der richtigen Konfiguration eine Wechselwirkung zu vollziehen.
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Ferner kann vorgesehen sein, eine einzelne Wechselwirkung nur begrenzt wirken zu lassen und zu messen. Durch wiederholtes Messen in geeigneten Zeitabständen kann ein Trend in der Veränderung der Wechselwirkung aufgezeichnet werden, und hierüber eine Aussage getroffen werden in Bezug auf die Wirksamkeit. Geeignete Zeitabstände sollten so ausgesucht werden, dass eine Wechselwirkung, zum Beispiel die Kraft, im Rahmen der Messmöglichkeiten des Messgerätes liegen. Die Zeitabstände können äquidistant gewählt werden. Es kann aber auch vorgesehen sein, stochastische Zeitabstände zu wählen, um so zum Beispiel den möglicherweise so ablaufenden natürlichen Vorgang zu simulieren.
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Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung
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Die Erfindung wird im Folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf Figuren einer Zeichnung näher erläutert. Hierbei zeigen:
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1 eine schematische Darstellung einer bekannten Methode zum Bestimmen einer Zellaktivierung am Beispiel der Immunologie,
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2a und 2b eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einem Adjuvant und einer Zielzelle,
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3a bis 3c eine schematische Darstellung eine Anordnung mit einer Zielzelle und einem Aktivator an einer Messsonde,
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4a und 4b grafische Darstellungen für Messkurven beim Bestimmen einer Zellaktivierung zwischen einer Zielzelle und einem Aktivator,
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5 einen Cantilever, an dem ein Natriumuratkristall als Aktivator angeordnet ist,
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6 eine Aufnahme einer dendritischen Zelle (DC),
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7 den Cantilever mit dem Natriumuratkristall aus 5 über der dendritischen Zelle aus 6,
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8 eine schematische Darstellung mit einer Messanordnung,
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9 eine grafische Darstellung eines beispielhaften Verlaufs einer gemessenen Kraftabstandskurve,
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10 eine grafische Darstellung des zeitlichen Verlaufs von Werten aus Kraftabstandskurven für dendritische Zellen (DC2.4, THP-1, TMDC),
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11 eine grafische Darstellung des zeitlichen Verlaufs von Werten aus Kraftabstandskurven für eine dentrische Zelle vor und nach dem Entfernen von Oberflächenproteinen,
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12 eine grafische Darstellung des zeitlichen Verlaufs von Werten aus Kraftabstandskurven für verschiedene Kinase-Inhibitoren,
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13 eine grafische Darstellung des zeitlichen Verlaufs von Werten aus Kraftabstandskurven für verschiedene Partikel, deren Wirksamkeit als Aktivator getestet werden soll,
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14 eine schematische Darstellung einer Messanordnung zur Messung der in 13 gezeigten Messwerte.
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15 eine Anordnung mit einem Cantilever, an den eine T-Zelle gebunden ist,
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16 eine schematische Darstellung einer Messanordnung für den Cantilever in 14,
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17 eine grafische Darstellung des zeitlichen Verlaufs von Werten aus Kraftabstandskurven für eine T-Zellline, die durch eine dendritische Zelle kontaktiert wird,
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18 eine grafische Darstellung des zeitlichen Verlaufs von Werten aus Kraftabstandskurven für eine weitere T-Zelllinie in Kontakt mit einer dendritischen Zelle und
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19 eine schematische Darstellung mit einer Messanordnung, wobei eine Messsonde mittels eines Fokus eines Lasers gebildet ist.
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1a bis 1c zeigen eine schematische Darstellung einer bekannten Methode zum Bestimmen einer Zellaktivierung am Beispiel der Immunologie.
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In 1a ist eine Zellkultur mit Immunzellen 10 auf einer Probenauflage 20 gezeigt. Die Immunzelle sei hier zum Beispiel eine dendritische Zelle. In der Umgebung der Zellen, die in der Regel aus einem wässrigen Puffer 30 besteht, befinden sich Antigene 40, die vereinzelt von einer Zelle aufgenommen und an ihrer Oberfläche präsentiert sind 41. Diese Präsentation stellt eine mögliche so genannte Aktivierung der Zelle dar. Es kann auch sein, dass kein Antigen präsentiert wird und damit gar keine Aktivierung vorliegt.
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In 1b wird nun in die Umgebung 30 zusätzlich das zu untersuchende Adjuvant 1 gegeben. Nach einer Inkubationszeit ist in 1c eine deutliche Erhöhung der Präsentation von Antigenen 41 an der Oberfläche der Zellen zu erkennen. Die Aktivierung der Zellen ist damit deutlich erhöht. Für das gezeigte Beispiel gilt es nun, die Unterschiede der Antigenpräsentation zwischen 1a und 1c nachzuweisen. Hierfür gibt es zahlreiche Untersuchungsmethoden wie zum Beispiel die Fluoreszenzmethoden, FACS („Fluorescence Activated Cell Sorting”) oder dergleichen.
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Neben der gezeigten Möglichkeit bestehen noch viele weitere Möglichkeiten der Aktivierung, die zum Beispiel in der Ausschüttung von Botenstoffen bestehen können. Auch diese Unterschiede müssen zum Beispiel über biochemische Methoden nachgewiesen werden oder über eine weitere nachfolgende Aktivierung einer weiteren Zelle. In allen Fällen wird immer nur die Wirkung nachgewiesen.
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2a und 2b zeigen eine sehr einfache Anordnung zur Beurteilung eines Adjuvants am Beispiel der Immunologie, bei der in 2a zunächst nur ein Adjuvant 1, der Aktivator, und eine dendritische Zelle 10, der Zielzelle, auf einem Substrat 20 gezeigt sind. Findet nun eine Bindung 2 zwischen dem Adjuvant 1 und der Zelle 10 statt, wie in 2b gezeigt, so kann diese prinzipiell vermessen werden, und diese Bindung wird als Maß für die Wirkung des Adjuvants auf eine verstärkte Aktivierung der Zelle herangezogen. Im Gegensatz zu bekannten Methoden ist hier also eine eigentliche Aktivierung der Zelle eher indirekt Gegenstand der Untersuchung, wodurch die Untersuchung wesentlich vereinfacht wird.
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3a bis 3c zeigen eine schematische Darstellung eine Anordnung mit einer Zielzelle und einem Aktivator an einer Messsonde zur Erläuterung einer Messmethode zur Messung der in 2 erläuterten Bindung.
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Ein Adjuvant 1 wird an einen Cantilever 50 gebunden. Der Cantilever 50 ist ohne Spitze ausgebildet und ist wie üblich an einer Basis 51 befestigt. Diese Basis 51 wird genutzt, um eine Befestigung an dem Rasterkraftmikroskop zu gewährleisten, dessen Bestandteile bekannt und zur Vereinfachung hier nicht gezeigt sind. Mittels der Verbiegung des Cantilevers 50 kann nun zum Beispiel eine Kraft gemessen werden. Wie in den 2a und 2b ist wiederum eine Zelle 10 auf einem Substrat 20 immobilisiert. Im vorliegenden Beispiel wird nun mittels einer relativen vertikalen Bewegung zwischen dem Substrat und der Basis 51 eine Annäherung zwischen Adjuvant und Zelle herbeigeführt, bis sich eine Bindung 2 ausbilden kann. Wird nun versucht, durch eine erneute Bewegung zwischen Substrat und Basis das Adjuvant von der Zelle zu entfernen, wie es in 3c gezeigt ist, so wird der Cantilever 50 verbogen und damit eine Kraft gemessen. Diese Messung ist eine mögliche Charakterisierung der in Verbindung mit den 2a und 2b diskutierten Bindung und erlaubt eine Aussage über die Aktivierungswirksamkeit des Adjuvants 1.
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Es kann auf diese Weise zum Beispiel ein optimales Adjuvant aus einer großen Auswahl von möglichen Adjuvants ermittelt werden. Weitere Parameter, wie zum Beispiel pH-Wert oder auch der Ausgangszustand der Zielzelle können die Auswahl eines passenden Adjuvants für eine spezielle Situation ermöglichen.
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4a und 4b zeigen grafische Darstellungen für Messkurven beim Bestimmen einer Zellaktivierung zwischen einer Zielzelle und einem Aktivator zur Erläuterung einer Ausführungsform eines Messverfahrens, das den Vorteil hat, eine zeitliche Entwicklung darzustellen.
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Zur Einleitung ist in 4a noch einmal eine typische Kraftabstandskurve 60 skizziert. Die x-Achse 61 zeigt die relative Entfernung zwischen Substrat 20 und Basis 51 wie in 3 definiert, die y-Achse 62 zeigt die Verbiegung des Cantilevers, die unter anderem auch als Kraft interpretiert werden kann. Im vereinfachten Fall kann man zunächst davon ausgehen, dass sich die Verbiegung des Cantilevers für die Annäherung und das Entfernen zwischen Substrat und Basis nur in der Nähe des Kontaktes unterscheidet. Die Annäherungskurve verläuft dann im Abschnitt 63; hier wird der Cantilever nicht ausgelenkt sondern erst am Punkt 64, wenn das Adjuvant in Kontakt zur Zelle tritt. Beim Entfernen wird dann oft der Verlauf 65 beobachtet, wenn sich eine Bindung zwischen Adjuvant und Zelle ausgebildet hat.
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Als Adhäsionskraft 66 wird in der Regel die Kraft bezeichnet, bei der es zum Abriss und damit zur Trennung von Adjuvant und Zelle kommt. Danach wirkt keinerlei Kraft und der Cantilever ist nicht mehr verbogen. Die Adhäsionskraft 66 kann mm als Maß für eine Beurteilung des Adjuvants herangezogen werden.
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Um eine besonders zuverlässige Aussage zu erhalten, ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel der in 4b gezeigte Ablauf einer Messung vorgesehen. Es wird hierfür die x-Achse 70 beispielsweise als Zeitachse gezeichnet und die y-Achse 71 als Adhäsionskraft. Die runden Punkte 81, ..., 85 zeigen mm einen Verlauf 80 von fünf Messungen der Adhäsionskraft, bei der die Adhäsionskraft sukzessive ansteigt. Das Adjuvant entfaltet eine Bindung und kann somit als wirksam gelten. Die Kreuze 91, ..., 95 zeigen ein Adjuvant, bei dem zwar auch eine Adhäsionskraft vorhanden ist, deren zeitlicher Ablauf 90 aber keine Entwicklung zeigt und somit als unspezifisch eingeordnet werden kann; das Adjuvant wird in diesem Fall als unwirksam oder zumindest unwirksamer eingestuft als das zuvor betrachtete und im Verlauf 80 dargestellte.
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Die einzelnen Punkte können auch eine Mittelung aus mehreren Kraftabstandskurven darstellen, da sonst die unspezifische Streuung den Blick auf die Entwicklung verhindern könnte. Der Grund für diese Messmethode liegt darin begründet, dass bei einer bekannten Methode, bei der zum Beispiel die Verweildauer verlängert wird, die Kräfte rasch zu groß werden, so dass sie nicht mehr gemessen werden können. Eine einzelne Messung selbst wäre aufgrund möglicher auch großer unspezifischer Kräfte nicht sinnvoll. Die vorgeschlagene Messmethode könnte zudem einen Vorteil darin bergen, dass der Ablauf eher dem natürlichen Prozess nah kommt. Auch die vorliegende verbesserte Messmethode kann natürlich durch die Variation verschiedener Parameter wie zum Beispiel Verweildauer, maximale Andruckkraft, pH-Wert, Temperatur oder dergleichen verändert werden, so dass man in der Lage ist, deren Einfluss abzuschätzen.
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5 zeigt einen Cantilever 50, an dem ein Natriumuratkristall (MSU-Kristall: monosodium urate) 100 als Aktivator befestigt ist.
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6 zeigt eine dendritsche Zelle (DC) 10 als Zielzelle. Dendritische Zellen gehören zu einer Gruppe von Immunzellen, die in der Gegenwart von Krankheitserregern oder auch Partikeln das Immunsystem aktivieren. Der MSU-Kristall ruft als ein solches Partikel eine sehr starke Aktivierung hervor. Forschungen zielen dahin, herauszufinden, welcher Mechanismus diesem Prozess zugrunde liegt.
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In 7 ist ein Cantilever 50 mit einem MSU-Kristall, der in dieser Aufnahme jedoch nicht zu erkennen ist, über einer dendritischen Zelle 10 gezeigt, und in 8 ist der Aufbau noch einmal schematisch skizziert, wobei hier neben dem Cantilever 50 und der dendritischen Zelle 10 mit Zellkern 11 auch der MSU-Kristall 100 und die Probenauflage, eine Glasscheibe 20 dargestellt sind.
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9 zeigt eine gemessene Kraftkurve, wie sie nach einer Verlagerung des Cantilevers und der Probenaufnahme zueinander entsteht. Die Annäherung selbst ist hier nicht gezeigt, sondern nur das Wegziehen voneinander. Es ergibt sich ein repulsives Regime, Pfeil 110, das auftritt, wenn der Cantilever in die Zelle drückt. Wird nun der Abstand zwischen Cantilever und Probenaufnahme vergrößert, so kommt man zu dem Punkt, bei dem der Cantilever nicht mehr verbogen ist, das heißt die Kraft beträgt 0 nN. Aufgrund anziehender Kräfte, deren Ursache eine Bindung im hier verstandenen Sinne ist, wird nun aber der Cantilever wieder verbogen und es ergibt sich das attraktive Regime (Pfeil 111). Die hier auftretende Maximalkraft (Pfeil 112) wird nun ausgewertet. Alternativ können beispielsweise auch die berechnete Fläche unter der Kurve oder ein ähnliches Maß herangezogen werden. Werden der Cantilever und die Zelle weit genug voneinander entfernt, so wird der Cantilever nicht mehr ausgelenkt, und es findet keine Interaktion zwischen beiden mehr statt (Pfeil 113).
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Wird nun das oben unter Bezugnahme auf 4a bis 4c vorgestellte Verfahren angewendet, wobei für das vorliegende System jede Sekunde eine Kraftabstandskurve aufgenommen wurde, so werden, wie in 10 gezeigt, immer höhere Bindungskräfte gemessen, wobei verschieden Linien von dendritischen Zellen (DC2.4 (21), THP-1 (12) und BMDC (13) getestet wurden. Dies zeigt eine Aktivierung der dendritischen Zelle an. Für einen Cantilever ohne MSU-Kristall ergibt sich für zwei Messreihen keine nennenswerte Veränderung in der Adhäsionskraft (14).
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11 zeigt, dass der Verlauf der Kraftabstandskurve sich nicht wesentlich ändert, wenn das Experiment mit einer dendritischen Zelle durchgeführt wird, bei der alle Oberflächenproteine entfernt sind, was hier durchgeführt wird, indem eine Behandlung mit Pronase durchgeführt wird. Der Verlauf 15 zeigt eine Messung mit einer unbehandelten Zelle, der Verlauf 16 eine Messung mit einer mit Pronase behandelten Zelle.
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Wird nun alles Cholesterol aus den Zellen entfernt, so ändert sich der Verlauf derart, dass keine Veränderung der Adhäsionskraft über die Zeit mehr auftritt (nicht dargestellt). Es wird daher geschlossen, dass eine Änderung der Anordnung von Cholesterol auf der Membran eine Signalkaskade zur Aktivierung auslöst. Hieran beteiligt ist zum Beispiel SYK („Spleen Tyrosine Tinase”), ein menschliches Protein und Gen. SYK ist zusammen mit Zap-70 ein Mitglied der Syk-Familie der Tyrosin-Kinasen. Diese zytoplasmatischen Tyrosin-Kinasen ohne Rezeptor teilen sich eine charakteristische doppelte SH2 Domäne, die über eine Verbindungsdomäne separiert ist. Obwohl SYK und Zap-70 hauptsächlich in blutbildenden Gewebe expremiert werden, werden sie auch in einer Vielzahl von anderen Geweben expremiert. Sowohl im B- als auch im T-Lymphozyten leiten SYK und Zap-70 Signale von den B- oder T-Zell-Rezeptoren weiter. Die gleiche Rolle spielt SYK bei der Signalübertragung von einer Vielzahl von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich CD74, FC Rezeptor und Integrinen.
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Es ergeben sich nun durch verschiedene Inhibitoren wieder sehr unterschiedliche Verläufe der maximalen Bindungskraft über die Zeit, die in 12 dargestellt sind. Für Piceatannol (120), einem SYK-Inibitor, und für Wortmannin (121) und LV 294002 (122), beides Inhibitoren der Kinase PI3K, ergeben sich Verläufe, die darauf schließen lassen, dass keine Aktivierung stattfindet. Für einen externen Blocker wie FcR g (123) oder einen Kontroll-Inhibitor (124) sowie für eine unbeandelte Probe (125) ergibt sich wieder eine Zunahme der maximalen Bindungskraft über die Zeit, wodurch auf eine Aktivierung zu schließen ist.
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Es wurden auch andere Partikel getestet, so zum Beispiel Latex, BCP und Allopurino. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Zum Vergleich ist der Verlauf eines MSU-Tests zu sehen 101. Latex, für das ebenfalls bekannt ist, dass es eine Aktivierung auslöst, zeigt wieder den Anstieg der Bindungskräfte 102, BCP 103 und Allopurinol 104 (Dreiecke), die nicht aktivieren, zeigen keinen Anstieg. Die Methode ist somit an mehreren Strukturen getestet. Zusammen mit den oben geschilderten Messungen und Erkenntnissen wird der Einsatz der Methode der Kraftmessung, insbesondere auch deren Zeitverlauf, als allgemeiner Indikator für Zellaktivierung vorgeschlagen.
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In der 14 ist noch einmal der Aufbau des Experiments schematisch skizziert. In diesem Fall wurde die dendritische Zelle 10 mit dem Zellkern 11 an einem Cantilever 50 befestigt. Der Aktivator, hier der MSU-Kristall 100 ist hier auf einem Glasträger 20 angeordnet, zum Beispiel als Kristalloberfläche, die aus mehreren Kristallen besteht.
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15 zeigt eine Anordnung mit einem Cantilever 50, an den eine T-Zelle 130 aus der Zellline OT-2 gebunden ist. 16 zeigt schematisch die Messanordnung mit dem Cantilever 50, mit der an ihm über einen Zellhaftvermittler 150 gebundenen T-Zelle 130 und einer dendritischen Zelle 10, die an einer Oberfläche 20 gebunden ist. Wird die Zelle mit gängigen Methode am Cantilever befestigt, so ergibt sich schon vorab eine Aktivierung, die nicht akzeptabel ist. Daher wird hier ein nicht aktivierender Zellhaftvermittler verwendet, zum Beispiel Cell-Tak.
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Enthält die T-Zelle nun Peptide in Form von Antigen-Rezeptoren, so dass eine Aktivierung der T-Zelle ausgelöst werden sollte, so ergibt sich wieder, wie in 17 gezeigt, eine Vergrößerung der Bindungskraft 140. Im Kontrollexperiment ohne Peptide ergibt sich keine signifikante Erhöhung der Bindungskraft 141. In diesem Beispiel mit der T-Zelllinie OT-1 wird also nicht, wie zuvor, die dendritische Zelle aktiviert, sondern die dendritische Zelle selbst ist hier der Aktivator und die T-Zelle ist die Zielzelle. Zur Absicherung wurde das Experiment mit einer T-Zelle aus einer anderen Zelllinie, OT-2, wiederholt und es zeigen sich in 18 ähnliche Ergebnisse, d. h. ein Anstieg der Bindungskraft mit der Zeit für den Fall, dass Antigen-Rezeptoren vorhanden sind 142, und kein Anstieg der Bindungskraft für den Fall, dass keine Rezeptoren vorhanden sind 143.
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Im Fall der Nutzung eines PFMs („photonic force microscope”) kann wahlweise auch auf eine Imobilisierung der Zielzelle und/oder des Aktivators verzichtet werden. Im Beispiel der 19 ist hier das Experiment aus 8 in der Form verändert worden, dass die Sonde nicht mehr ein Cantilever ist, sondern der Fokus eines Lasers, der mittels eines gaußschen Strahlengangs 200 skizziert ist. Ein Partikel 100, zum Beispiel ein MSU-Kristall oder ein anderes geeignetes Partikel, wird im Fokus gehalten. Mittels der Detektion des am Partikel 100 gestreuten Lichtes können gleichzeitig die Kräfte auf das Partikel gemessen werden, die dann unter Umständen sogar kleiner sein dürfen als für den Fall des SFMs.
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Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein.
