WO2000075657A2 - Screening von target-ligand-wechselwirkungen - Google Patents

Screening von target-ligand-wechselwirkungen Download PDF

Info

Publication number
WO2000075657A2
WO2000075657A2 PCT/EP2000/004948 EP0004948W WO0075657A2 WO 2000075657 A2 WO2000075657 A2 WO 2000075657A2 EP 0004948 W EP0004948 W EP 0004948W WO 0075657 A2 WO0075657 A2 WO 0075657A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescence
ligand
chemical library
fluorophore
target
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/004948
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2000075657A3 (de
Inventor
Richard Ansell
Stefan Seeger
Original Assignee
Molecular Machines & Industries Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Machines & Industries Gmbh filed Critical Molecular Machines & Industries Gmbh
Priority to EP00931274A priority Critical patent/EP1194780A2/de
Priority to JP2001501881A priority patent/JP2003501660A/ja
Publication of WO2000075657A2 publication Critical patent/WO2000075657A2/de
Publication of WO2000075657A3 publication Critical patent/WO2000075657A3/de
Priority to US09/996,571 priority patent/US20020106692A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the invention relates to a method for screening target-ligand interactions using a chemical library of ligands, the chemical library of ligands as such, a method for producing the chemical library and the use of the chemical library
  • Chemical libraries can be produced, for example, by the so-called "split-mix” method, in which microspheres, so-called beads, are divided into different reaction vessels, combined again after the first synthesis step, for example adding the first substituent or synthesis building block, and be divided again for the second variable substituent. By repeating this process, it is technically simple to generate thousands or millions of different molecules, with only one specific molecular species on each microsphere. Porous microspheres are generally used as the carrier material in order to produce a sufficient amount of substance as well as for easy handling of the solid phase.
  • a target that binds to a ligand is usually detected by a fluorescence marker specific for the target.
  • a fluorescence marker specific for the target is usually detected by a fluorescence marker specific for the target.
  • such an analysis method requires rinsing steps before and after the addition of the fluorescent marker and a relatively strong interaction between target and ligand.
  • the object of the invention is to provide a method for screening target-ligand interactions in chemical libraries of ligands, which is a simpler, faster and therefore more cost-effective analysis or evaluation of ligand libraries and also the evaluation of weaker targets -Ligand interactions enabled.
  • step (c) Measuring the same fluorescent property (s) of the chemical library as in step (a).
  • FIG. 1 shows various possibilities of how the molecular fluorescence sensor can be contained in the ligand.
  • Figures 2 and 3 show the schemes of the reactions on which Examples 1 and 2 are based.
  • target is understood to mean molecular target structures for those with the invention Screening method to find a molecule that interacts with this target structure.
  • targets are familiar to the person skilled in the art, particularly when searching for new active ingredients, but it is not restricted to this according to the invention. When searching for active substances, the targets were generally identified as the cause of an illness.
  • conventional targets are enzymes, cell surface receptors, core receptors, ion channels and signal transmission proteins or parts thereof or also nucleic acids or oligonucleotides.
  • target also includes those target structures for which molecules are to be found which interact with the target in such a way that this interaction can be used for an analysis of the target.
  • molecules are, for example, molecules whose fluorescence properties change due to the interaction with the target.
  • targets that are important in analyzes in the medical, environmental and military fields, such as glucose, 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid and trinitrotoluene, but also larger structures such as proteins and microorganisms.
  • ligand refers to compounds that have been synthesized for the purpose of interacting with these targets. The term is therefore not restricted to compounds which necessarily interact with the target, but rather only have a binding potential. These ligands are not chemically restricted, provided that they can be prepared by combinatorial chemistry methods, that is to say by converting known educts into known reactions in automated reaction instructions, as a rule on a solid phase surface. In particular, come according to the invention Polypeptides are considered as ligands, and Fmoc or tBoc-protected amino acids are frequently used for their synthesis.
  • the libraries according to the invention can also be non-linear libraries which are derived from a multifunctional nucleus such as triazine, the various functional groups of which are used for the further construction of the ligand.
  • a chemical library of ligands is an ensemble of ligands produced by parallel synthesis, the production steps of the respective ligands differing in at least one starting material.
  • the location-addressable chemical library according to the invention is produced by a multiple parallel process, each ligand being in a space that can be defined by the location, i.e. for example on a defined area of a solid phase surface.
  • the chemical libraries according to the invention are bound to a solid phase surface which generally corresponds to the surface on which the ligand was synthesized.
  • polymer-grafted polyethylene pegs (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei.
  • location-addressable libraries which have been produced in microtiter plates with 96, 384 or 1536 wells are preferred, in particular when the microtiter plates can also be used for the subsequent fluorescence measurement method, that is to say the preparation of the library and its evaluation can be carried out in one vessel.
  • the microtiter plates preferably have an optically transparent base plate, which is preferably made of glass consists.
  • the base plate also preferably has a coating which carries functional groups suitable for the covalent immobilization of molecules, for example silane films, Langmuir-Blodgett films or hydrogel films such as dextran films.
  • the functional ones for example silane films, Langmuir-Blodgett films or hydrogel films such as dextran films.
  • the base plate is preferably coated with a Langmuir-Blodgett film, in particular a two- or three-dimensionally cross-linkable Langmuir-Blodgett film, particularly preferably a Langmuir-Blodgett film based on cellulose.
  • a Langmuir-Blodgett film in particular a two- or three-dimensionally cross-linkable Langmuir-Blodgett film, particularly preferably a Langmuir-Blodgett film based on cellulose.
  • Such Langmuir-Blodgett films based on cellulose have the advantage that they have a very low non-specific adsorption, which can increase the sensitivity of detection of target-ligand interactions on this surface.
  • the molecular fluorescence sensor used in the method according to the invention is a fluorophore which, when the
  • Targets on the ligand one or more
  • Fluorescence properties such as the fluorescence intensity, or fluorescence life, changes, thereby binding the
  • Targets can be detected on the ligands.
  • Molecular fluorescence sensors used according to the invention can in particular be:
  • Donor for photo-induced electron transfer or (5) is a donor fluorophore-acceptor fluorophore electron energy transfer pair.
  • ICT fluorophores Show a fluorophore with an excited, intramolecular charge transfer state, so-called ICT fluorophores
  • Fluorescence properties that depend on the polarity of the solution environment.
  • a ligand-ICT-fluorophore conjugate interacts with a target, a shift in the emission maximum or the fluorescence lifetime can be observed.
  • 5- (dimethylamino) naphthalene-1-sulfonyl (dansyl) chloride can be mentioned, which was used coupled to an antibody against human serum albumin Fab fragments for the detection of human serum albumin (Bright et al, Anal. Chem., 1990 , 62: 1065-1069).
  • fluorophores can also be used as molecular fluorescence sensors used according to the invention, the fluorescence intensity and / or fluorescence lifetime of which depends on the mobility of the fluorophore.
  • Biscyanine dyes for example, may be mentioned for this purpose, which lose their mobility, for example, when complexing sugars and thereby show a higher fluorescence intensity (Takeuchi et al, Tetrahedron 52, 1996, 1195-1204).
  • Pairs of a fluorophore and a donor for photo-induced electron transfer can also be used as molecular fluorescence sensors.
  • Two effects can be detected with fluorophore-PET donor pairs: firstly, the fluorescence properties such as fluorescence intensity and / or fluorescence lifetime of such a molecular fluorescence sensor generally depend on the distance between the PET donor and the fluorophore, the fluorescence intensity usually increases with increasing distance.
  • a change in the fluorescence intensity or fluorescence lifetime can also be caused by a change in the microenvironment of the ligand when the target is bound.
  • pairs of donor fluorophores and acceptor fluorophores can be used as molecular fluorescence sensors in the method according to the invention.
  • the acceptor / donor emission ratio increases. Examples of such a donor / acceptor pair include lissamin / fluorescein (Godwin and Burg, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118: 6514-6515).
  • molecular fluorescence sensors whose fluorescence is quenched by the target, as a result of which the fluorescence intensity and / or fluorescence lifetime is reduced.
  • Suitable fluorescence sensors can be determined by simple preliminary tests, the fluorophore being brought into contact with the target and the fluorescence intensity or fluorescence lifetime being observed. The greater the change in one of these parameters, the more suitable, as a rule, the fluorophore is the molecular fluorescence sensor to be used according to the invention.
  • the molecular fluorescence sensors used according to the invention preferably have maximum emission wavelengths in the range above 600 nm, since these fluorophores can normally be excited with diode lasers.
  • FIG. 1 The incorporation of the molecular fluorescence sensor in the ligands is shown in more detail in FIG. 1.
  • Figures la to le show examples in which a single fluorophore is incorporated in the ligand.
  • Figures lf to li show Examples in which a fluorophore and a donor for photo-induced electron transfer or a donor fluorophore-acceptor fluorophore electron energy transfer pair are incorporated.
  • the ligand is built up from a multifunctional core
  • lc, ld, le, lh and li the ligand is straight-chain.
  • the fluorophores can be incorporated into the ligand in the first (la, lc) or the last (lb, le) step in ligand synthesis, or in an intermediate step (ld).
  • Electron energy transfer pairs can be installed in any combination in the first, last or in an intermediate step (lf to li).
  • the fluorescence property (s) to be measured depends on the choice of the molecular fluorescence sensor. Measurement with a confocal fluorescence microscope is preferred according to the invention. Confocal fluorescence microscopy allows, depending on the one used
  • Detector the determination of fluorescence intensity, fluorescence life and even possibly the number of binding ligands, especially in the case of very large changes in the respective fluorescence properties, to be detected very sensitively.
  • Confocal fluorescence microscopy is particularly suitable if the ligands are bound to a planar, transparent solid phase, e.g. a slide.
  • the fluorescence intensities at different emission wavelengths and a fixed excitation wavelength can also be compared. Since the changes in the respective fluorescence properties may are only small, it is preferred to use a detector that is as sensitive as possible.
  • the use of a photodiode, in particular a single photon count -valanche photodiode, is preferred.
  • a photomultiplier or a reinforced CCD camera can also be used.
  • a photomultiplier or a reinforced CCD camera can also be used.
  • a detector that works in time-correlated single photon counting (TCSPC) mode.
  • a location-addressable chemical library immobilized on a solid phase in the screening method of target-ligand interactions according to the invention is particularly advantageous because it enables the use of highly sensitive analysis methods in that the possible interaction between ligand and target only in a thin layer can take place on the surface of the solid phase. Furthermore, it enables the ligands to be screened immediately after synthesis, without the need for cleavage from the surface, the addition of secondary antibodies or further washing steps.
  • the invention also relates to the location-addressable chemical library of ligands immobilized on a solid phase as such, which is characterized in that each ligand contains a molecular fluorescence sensor as defined above.
  • the molecular fluorescence sensor is preferably present between the ligand and the solid phase and / or at the end of the ligand opposite the solid phase and / or in the middle of the ligand.
  • the incorporation of the fluorescence sensor in the middle of the ligand is particularly preferred when the fluorophore has an excited, intramolecular charge transfer state or when its fluorescence depends on its mobility.
  • a chemical is particularly preferred
  • the molecular fluorescence sensor used in the method according to the invention can be added in each reaction step when building the chemical library. According to the invention, it is preferred to install the fluorescence sensor before first coupling of a synthesis module and / or after coupling the last synthesis module. In the first case the molecular fluorescence sensor has to be bifunctional, in the second case a monofunctionality is sufficient. When using donor-acceptor or fluorophore-donor pairs, it is preferred to bind the pair to the ligand in such a way that their distance becomes maximum.
  • the solid phase of which is provided by the bottom of a microtiter plate
  • the bottom of the wells of the microtiter plate is first derivatized for the covalent coupling of the starting materials required for the synthesis of the ligands.
  • the chemical library is then built up in the microtiter plate, a molecular fluorescence sensor being coupled to the ligand to be built up in a reaction step, as described above.
  • the invention provides the use of such a chemical library for drug development as well as for the development of molecular sensors. While the structure of the ligand, which interacts with the target, is relevant for drug development without taking the molecular fluorescence sensor into account, the conjugate of ligand and molecular fluorescence sensor is important for the development of molecular sensors, i.e. this
  • Conjugate can be used directly for target analysis procedures.
  • a glass surface is coated with 3-aminopropyltriethoxysilane.
  • the glass substrate can be coated with a monolayer of derivatized cellulose using the Langmuir-Blodgett technique. The glass surface is then physically covered with an inert one
  • a solution of the fluorophore derivative Fmoc-lys-A53, dissolved in DMF, and the coupling agents HOBt / PyBOP and diisopropylethylamine are then added.
  • the dye binds to the surface and the wells are washed thoroughly with DMF to remove non-specifically adsorbed, only physically bound dye. Unreacted amine groups on the surface are then blocked by reaction with acetic anhydride.
  • the Fmoc group is then cleaved from the fluorophore by a solution of piperidine in DMF.
  • a standard library of combinatorial chemistry is then used to create a peptide library using Fmoc-protected amino acids.
  • an Fmoc-amino acid and a coupling reagent such as PYBOP are incubated with diisopropylethylamine in each well in DMF for several hours using a different amino acid in each well.
  • the wells are then washed thoroughly with DMF, after which a solution of piperidine in DMF is added to cleave the Fmoc groups.
  • the wells are again thoroughly washed with DMF and the cycle is repeated with Fmoc amino acids until peptides of the desired length have been synthesized, again using different amino acids in each well.
  • the protective group of the last amino acid is removed with piperidine, the wells are washed thoroughly with DMF and the PET electron donor 4-dimethylaminophenyl-acetic acid in DMF solution is coupled with diisopropylethylamine using PYBOP. Finally, the wells are washed again with DMF and a solution of trifluoroacetic acid in DMF is added to make up the
  • the fluorescence intensity of the ligand in each well of the microtiter plate is determined using a confocal fluorescence microscope with a 635 nm diode laser, which is based on a surface of 1 ⁇ m 2 is focused, and a single photon avalanche detector is measured. The target is then added and the measurement is repeated. If the fluorescence intensity in a well changes significantly, the ligand binds to the target.
  • a composite microtiter plate comprising a glass base coated with a Langmuir-Blodgett film made from amino-functionalized cellulose and a polypropylene mask adhering to it is produced as in exemplary embodiment 1.
  • a solution of an Fmoc amino acid (different amino acids in the respective wells) and the coupling agents HOBt, PyBOP and DIPEA in DMF are then added to each well (step 1 in scheme 3). After coupling, the wells are washed thoroughly with DMF and methanol. Unreacted amine groups on the surface are then blocked by reaction with acetic anhydride (step 2).
  • the Fmoc group is then cleaved from the fluorophore by a solution of piperidine in DMF (step 3). Steps 1 and 3 are repeated until there is a peptide of length m amino acid residues in each well.
  • a solution of the fluorophore derivative Cy5 (phthal) (COOSu) in is then added to each well.
  • the fluorescence intensity of the ligand in each well of the microtiter plate is measured using a confocal fluorescence microscope with a 635 nm diode laser, which is focused on a surface of 1 ⁇ m 2 on the glass surface, and a single-photon avalanche detector. The target is then added and the measurement is repeated. If the fluorescence intensity in a well changes significantly, the ligand binds to the target.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen unter Verwendung einer chemischen Bibliothek von Liganden, die chemische Bibliothek von Liganden als solche, ein Verfahren zur Herstellung der chemischen Bibliothek sowie die Verwendung der chemischen Bibliothek für die Wirkstoffentwicklung und die Entwicklung molekularer Sensoren. Das Screening-Verfahren umfasst die Schritte: (a) Messung zumindest einer Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek von Liganden, wobei an jeden Liganden ein molekularer Fluoreszenzsensor gebunden ist, (b) Zugabe des Targets, und (c) Messung der gleichen Fluoreszenzeigenschaft(en) der chemischen Bibliothek wie in Schritt (a). Die an einer Festphase immobilisierte, ortsadressierbare chemische Bibliothek von Liganden ist dadurch gekennzeichnet, dass jeder Ligand an einen molekularen Fluoreszenzsensor gebunden ist, vorzugsweise derart, dass der molekulare Fluoreszenzsensor zwischen dem Liganden und der Festphase und/oder an dem der Festphase gegenüberliegenden Ende des Liganden gebunden ist.

Description

Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen unter Verwendung einer chemischen Bibliothek von Liganden, die chemische Bibliothek von Liganden als solche, ein Verfahren zur Herstellung der chemischen Bibliothek sowie die Verwendung der chemischen
Bibliothek für die Wirkstoffentwicklung und die Entwicklung molekularer Sensoren.
Die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe ist ein komplexes Verfahren. Nachdem in einem ersten Schritt die physiologischen und klinischen Aspekte der jeweiligen Krankheit untersucht werden, folgt in der Regel die Identifizierung relevanter Gene und biologischer Zielstrukturen, sog. Targets, für die Therapie. Nicht zuletzt die Fortschritte in der Molekularbiologie und den
Sequenzierverfahren von DNS und RNS haben neue Möglichkeiten bei dieser Identifizierung und somit für die Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe bereitgestellt.
Mit dem Fortschritt bei der Bereitstellung der biologischen Targets geht ein Fortschritt bei der Synthese von Liganden für diese Targets, d.h. Molekülstrukturen, die mit den Targets wechselwirken, durch jüngste Entwicklungen in der kombinatorischen Chemie einher. Unter kombinatorischer Chemie versteht man die parallele Synthese einer grossen Anzahl von
Verbindungen durch Umsetzung bekannter Edukte in bekannten Reaktionen nach kombinatorischen Prinzipien in automatisierten Reaktionsvorschriften, wodurch eine grosse strukturelle Vielfalt an Verbindungen, sog. chemische Bibliotheken, hergestellt werden kann. Es sind zwei grundlegende kombinatorische Prinzipien bekannt . Chemische Bibliotheken können beispielsweise durch das sog. "Split-Mix" -Verfahren hergestellt werden, bei denen Mikrokugeln, sog. Beads, auf verschiedene Reaktionsgefäße aufgeteilt werden, nach dem ersten Syntheseschritt, z.B. dem Anfügen des ersten Substituenten bzw. Synthesebausteins, wieder vereinigt und für den zweiten variablen Substituenten wieder aufgeteilt werden. Durch Wiederholen dieses Vorgangs ist es so auf technisch einfache Weise möglich, Tausende oder Millionen verschiedener Moleküle zu erzeugen, wobei sich auf jeder Mikrokugel nur eine bestimmte Molekülspezies befindet. Zur Herstellung einer ausreichenden Substanzmenge wie auch für eine leichte Handhabe der Festphase werden hierbei in der Regel poröse Mikrokugeln als Trägermaterial verwendet.
Ein anderes kombinatorisches Prinzip stellen die sog.
Mehrfachparallelsynthesen dar, bei denen pro Reaktionsgefäß bzw. fester Reaktionsfläche eine bestimmte Spezies synthetisiert wird. Solche chemischen Bibliotheken werden auch als ortsadressierbare ("spatially addressable") Bibliotheken bezeichnet. Obwohl die Anzahl der synthetisierbaren Spezies gegenüber der Split-Mix-Technik geringer ist, weist dieses Verfahren den Vorteil auf, daß die Identität des Syntheseproduktes aufgrund der festen Position bekannt bzw. stets nachprüfbar ist und eine größere Menge synthetisiert werden kann.
Als beschränkend bei der Bereitstellung von Liganden für die biologischen Targets hat sich jedoch nicht die Synthese der Liganden, sondern deren Evaluierung herausgestellt, und es besteht ein grosser Bedarf an verbesserten Analysemethoden zur Evaluierung bzw. zum Screening von chemischen Bibliotheken (Burbaum und Sigal, Current Opinion in Chemical Biology, 1997, 1:72-78). Für die Analyse der Target-Ligand- Wechselwirkungen werden bislang insbesondere das sog. FACS (Fluorescence Assisted Cell Sorting) -Verfahren im Falle von Bibliotheken gemäß dem "Split-Mix" -Verfahren und klassische Assays wie z.B. Immunoassays in 96er Mikrotiterplatten im Falle von ortsadressierbaren Bibliotheken verwendet. Bei diesen Analyseverfahren wird in der Regel ein an einen Liganden bindendes Target durch einen für das Target spezifischen Fluoreszenzmarker detektiert . Ein solches Analyseverfahren erfordert jedoch Spülschritte vor und nach der Zugabe des Fluoreszenzmarkers sowie eine relativ starke Wechselwirkung zwischen Target und Ligand.
Vor diesem Hintergrund ist es die erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zum Screening von Target-Ligand- Wechselwirkungen in chemischen Bibliotheken von Liganden bereitzustellen, das eine einfachere, schnellere und damit kostengünstigere Analyse bzw. Evaluierung von Liganden- Bibliotheken und die zudem auch die Evaluierung schwächerer Target-Ligand-Wechselwirkungen ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen, umfassend die Schritte:
(a) Messung zumindest einer Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek von Liganden, wobei jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor enthält,
(b) Zugabe des Targets, und
(c) Messung der gleichen Fluoreszenzeigenschaft (en) der chemischen Bibliothek wie in Schritt (a) .
Figur 1 zeigt verschiedene Möglichkeiten, wie der molekulare Fluoreszenzsensor in dem Liganden enthalten sein kann.
Die Figuren 2 und 3 zeigen die Schemata der den Beispielen 1 und 2 zugrundeliegenden Reaktionen.
Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff "Target" molekulare Zielstrukturen verstanden, für die mit dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren ein Molekül gefunden werden soll, welches mit dieser Zielstruktur wechselwirkt.
Der Begriff "Target" ist dem Fachmann insbesondere bei der Suche nach neuen Wirkstoffen geläufig, er ist jedoch erfindungsgemäß nicht hierauf beschränkt. Bei der Wirkstoffsuche sind die Targets in der Regel als ursächlich für eine Krankheit identifiziert worden. Diesbezüglich herkömmliche Targets sind Enzyme, Zeiloberflächenrezeptoren, Kernrezeptoren, Ionenkanäle und Signalübertragungsproteine oder Teile hiervon oder auch Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotide .
Erfindungsgemäß umfaßt der Begriff "Target" jedoch auch solche Zielstrukturen, für die Moleküle gefunden werden sollen, die mit dem Target in einer Weise wechselwirken, daß diese Wechselwirkung für eine Analyse des Targets genutzt werden kann. Solche Moleküle sind beispielsweise Moleküle, deren Fluoreszenzeigenschaften sich aufgrund der Wechselwirkung mit dem Target verändern. Von besonderem analytischen Interesse sind hierbei Targets, die bei Analysen im medizinischen, Umwelt- und Militärbereich von Bedeutung sind, wie Glucose, 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure und Trinitrotoluol, aber auch grössere Strukturen wie Proteine und Mikroorganismen.
Der Begriff "Ligand" bezieht sich erfindungsgemäß auf Verbindungen, die für den Zweck synthetisiert worden sind, daß sie mit diesen Targets wechselwirken. Der Begriff ist also nicht auf Verbindungen beschränkt, die notwendigerweise mit dem Target wechselwirken, sondern sie weisen lediglich ein Bindungspotential auf. Diese Liganden sind chemisch nicht beschränkt, sofern sie sich durch Methoden der kombinatorischen Chemie herstellen lassen, d.h. durch Umsetzung bekannter Edukte in bekannten Reaktionen in automatisierten Reaktionsvorschriften in der Regel an einer Festphasenoberfläche. Insbesondere kommen erfindungsgemäß Polypeptide als Liganden in Betracht, wobei zu deren Synthese häufig Fmoc- oder tBoc-geschützte Aminosäuren verwendet werden. Zudem können die erfindungsgemäßen Bibliotheken auch nicht-linerare Bibliotheken sein, die sich von einem mehrfunktionellen Kern wie z.B. Triazin ableiten, dessen verschiedene funktionelle Gruppen zum weiteren Aufbau des Liganden verwendet werden.
Eine chemische Bibliothek von Liganden ist ein durch parallele Synthese hergestelltes Ensemble von Liganden, wobei sich die Herstellungsschritte der jeweiligen Liganden in zumindest einem Edukt unterscheiden. Die erfindungsgemäße ortsadressierbare chemische Bibliothek wird durch ein Mehrfachparallelverfahren hergestellt, wobei sich jeder Ligand in einem durch den Ort definierbaren Raum befindet, d.h. beispielsweise auf einem definierten Bereich einer Festphasenoberfläche. Die erfindungsgemäßen chemischen Bibliotheken sind hierbei an einer Festphasenoberfläche gebunden, die in der Regel der Oberfläche entspricht, an der die Synthese der Liganden erfolgte. Zur Herstellung von ortsadressierbaren Bibliotheken werden insbesondere Polymergepfropfte Polyethylen-Pegs (Geysen et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 1984, 81:3998-4002), Cellulosemembranen (Krchnak et al, Anal. Biochem. , 1990, 189:80-83) oder funktionalisierte Glas-Objektträger verwendet (Fodor et al, Science, 1991, 251:767-773) .
Erfindungsgemäß bevorzugt sind ortsadressierbare Bibliotheken, die in Mikrotiterplatten mit 96, 384 oder 1536 Vertiefungen hergestellt worden sind, insbesondere dann, wenn die Mikrotiterplatten auch für das nachfolgende Fluoreszenzmessverfahren verwendet werden können, also die Herstellung der Bibliothek und deren Evaluierung in einem Gefäss durchführbar ist .
Vorzugsweise weisen die Mikrotiterplatten eine optisch transparente Bodenplatte auf, die vorzugsweise aus Glas besteht. Die Bodenplatte weist zudem vorzugsweise eine Beschichtung auf, die zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeignete funktionelle Gruppen trägt, beispielsweise Silanfilme, Langmuir-Blodgett -Filme oder Hydrogelfilme wie z.B. Dextranfilme . Die funktioneilen
Gruppen an diesem Film sind nicht beschränkt und schließen beispielsweise Hydroxy- , Amino- , Aldehyd- und Carboxygruppen ein. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt ist die Bodenplatte mit einem Langmuir-Blodgett- Film, insbesondere einem zwei- oder dreidimensional vernetzbaren Langmuir-Blodgett-Film, besonders bevorzugt einem Langmuir-Blodgett-Film auf Cellulosebasis beschichtet. Solche Langmuir-Blodgett-Filme auf Cellulosebasis weisen den Vorteil auf, daß sie eine sehr geringe unspezifische Adsorption aufweisen, wodurch die Empfindlichkeit einer Detektion von Target-Ligand-Wechselwirkungen an dieser Oberfläche erhöht werden kann.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete molekulare Fluoreszenzsensor ist ein Fluorophor, welcher bei Bindung des
Targets an den Liganden eine oder mehrere
Fluoreszenzeigenschaften, wie z.B. die Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer, ändert, wodurch eine Bindung des
Targets an den Liganden detektiert werden kann.
Erfindungsgemäß verwendete molekulare Fluoreszenzsensoren können insbesondere sein:
(1) ein Fluorophor mit einem angeregten, intramolekularen Charge-Transfer-Zustand;
(2) ein Fluorophor, dessen Fluoreszenzintensität von seiner Beweglichkeit abhängt;
(3) ein Fluorophor, dessen Fluoreszenz durch das Target gelöscht wird; (4) ein Paar bestehend aus einem Fluorophor und einem
Donor für photoinduzierten Elektronentransfer ; oder (5) ein Donorfluorophor-Akzeptorfluorophor-Elektronen- Energietransfer-Paar ist.
Ein Fluorophor mit einem angeregten, intramolekularen Charge- Transfer-Zustand, sog. ICT-Fluorophore, weisen
Fluoreszenzeigenschaften auf, die von der Polarität der Lösungsumgebung abhängig sind. So kann bei Wechselwirkung eines Ligand- ICT-Fluorophor-Konjugats mit einem Target eine Verschiebung des Emissionsmaximums oder der Fluoreszenzlebensdauer beobachtet werden. Beispielhaft kann hierfür 5- (Dimethylamino) naphthalin-1-sulfonyl (dansyl) chlorid erwähnt werden, welches gekoppelt an einen Antikörper gegen humanes Serumalbumin-Fab-Fragmente zur Detektion von humanem Serumalbumin verwendet wurde (Bright et al, Anal. Chem. , 1990, 62:1065-1069). Bei Binden des humanen Serumalbumins an die Fab-Fragmente wird eine starke Erhöhung der Fluoreszenz aufgrund der Veränderung der Wasserkoordination an dem Fluorophor beobachtet .
Weiterhin können auch Fluorophore als erfindungsgemäß verwendete molekulare Fluoreszenzsensoren verwendet werden, deren Fluoreszenzintensität und/oder Fluoreszenzlebensdauer von der Beweglichkeit des Fluorophors abhängt. Hierfür seien beispielsweise Biscyaninfarbstoffe erwähnt, die beispielsweise bei der Komplexierung von Zuckern ihre Beweglichkeit verlieren und dadurch eine höhere Fluoreszenzintensität zeigen (Takeuchi et al, Tetrahedron 52, 1996, 1195-1204) .
Als molekulare Fluoreszenzsensoren können weiterhin Paare eines Fluorophors und einem Donor für photoinduzierten Elektronentransfer (PET-Donor) verwendet werden. Zwei Effekte können bei Fluorophor-PET-Donor-Paaren detektiert werden: Zum einen hängen die Fluoreszenzeigenschaften wie Fluoreszenzintensität und/oder Fluoreszenzlebensdauer eines solchen molekularen Fluoreszenzsensors in der Regel von der Entfernung zwischen dem PET-Donor und dem Fluorophor ab, wobei die Fluoreszenzintensität in der Regel bei zunehmendem Abstand steigt. Andererseits kann auch eine Veränderung der Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer durch eine Veränderung der Mikroumgebung des Liganden bei Bindung des Targets hervorgerufen werden.
Weiterhin können als molekulare Fluoreszenzsensoren in dem erfindungsgemäßen Verfahren Paare von Donor-Fluorophoren und Akzeptor-Fluorophoren verwendet werden, zwischen denen ein Elektronenenergietransfer stattfinden kann. Wenn der Donor und der Akzeptor sich annähern, steigt das Akzeptor/Donor- Emissionsverhältnis . Beispielhaft kann für ein solches Donor/Akzeptorpaar Lissamin/Fluorescein genannt werden (Godwin and Burg, J. Am. Chem. Soc . 1996, 118:6514-6515).
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Verwendung von molekularen Fluoreszenzsensoren, deren Fluoreszenz durch das Target gelöscht wird, wodurch die Fluoreszenzintensität und/oder Fluoreszenzlebensdauer verringert wird. Geeignete Fluoreszenzsensoren können durch einfache Vorversuche ermittelt werden, wobei man das Fluorophor mit dem Target in Kontakt bringt und die Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenzlebensdauer beobachtet. Je größer die Veränderung eines dieser Parameter, desto geeigneter ist in der Regel das Fluorophor als erfindungsgemäß zu verwendender molekularer Fluoreszenzsensor .
Die erfindungsgemäß verwendeten molekularen Fluoreszenzsensoren weisen vorzugsweise maximale Emissionswellenlänge in dem Bereich über 600 nm auf, da diese Fluorophore normalerweise mit Diodenlasern angeregt werden können.
Der Einbau des molekularen Fluoreszenzsensors in den Liganden ist in Figur 1 näher dargestellt. Die Figuren la bis le zeigen Beispiele, in denen ein einzelner Fluorophor in dem Liganden eingebaut ist. Die Figuren lf bis li zeigen Beispiele, in denen ein Fluorophor und ein Donor für photoinduzierten Elektronentransfer oder ein Donorfluorophor- Akzeptorfluorophor-Elektronenenergietransferpaar eingebaut sind. In den Figuren la, lb, lf und lg ist der Ligand ausgehend von einem mehrfunktionalen Kern aufgebaut, in den Figuren lc, ld, le, lh und li ist der Ligand geradkettig. Die Fluorophore können in dem Liganden in dem ersten (la, lc) oder dem letzten (lb, le) Schritt bei der Ligandensynthese eingebaut werden, oder in einem Zwischenschritt (ld) . Ein Fluorophor und Donor für photoinduzierten Elektronentransfer oder ein Donorfluorophor-Akzeptorfluorophor-
Elektronenenergietransferpaar können in jedweder Kombination im ersten, letzten oder in einem Zwischenschritt eingebaut werden (lf bis li) .
Die zu messende (n) Fluoreszenzeigenschaft (en) hängt (hängen) von der Wahl des molekularen Fluoreszenzsensors ab. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Messung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie erlaubt, abhängig von dem verwendeten
Detektor, die Bestimmung der Fluoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und sogar u.U. der Anzahl der bindenden Liganden, insbesondere bei sehr großen Änderungen der jeweiligen Fluoreszenzeigenschaft, sehr empfindlich zu detektieren. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie eignet sich insbesondere, wenn die Liganden an einer planaren, transparenten Festphase gebunden sind, wie z.B. einem Objektträger. Bei der Bestimmung der Fluoreszenzintensität können auch die Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Emissionswellenlängen und einer festen Anregungswellenlänge verglichen werden. Da die Veränderungen der jeweiligen Fluoreszenzeigenschaft u.U. nur gering sind, ist es bevorzugt, einen möglichst empfindlichen Detektor zu verwenden. Bevorzugt ist die Verwendung einer Photodiode, insbesondere einer Einzelphotonenzähl -Avalanche- Photodiode .
Alternativ kann auch ein Photomultiplier oder eine verstärkte CCD-Kamera verwendet werden. Für Messungen der Fluoreszenzlebensdauer wird vorzugsweise ein Detektor verwendet, der im Time-Correlated-Single-Photon-Counting (TCSPC) -Modus arbeitet.
Die Verwendung von an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek bei dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren von Target-Ligand- Wechselwirkungen ist insbesondere deshalb vorteilhaft, weil sie die Anwendung hochempfindlicher Analyseverfahren dadurch ermöglicht, daß die mögliche Wechselwirkung zwischen Ligand und Target nur in einer dünnen Schicht an der Oberfläche der Festphase stattfinden kann. Weiterhin ermöglicht sie, die Liganden direkt nach der Synthese einem Screening zu unterwerfen, ohne daß eine Abspaltung von der Oberfläche, die Zugabe von Sekundärantikörpern oder weitere Waschschritte notwendig sind.
Die Erfindung betrifft zudem die an einer Festphase immobilisierte, ortsadressierbare chemische Bibliothek von Liganden als solche, die dadurch gekennzeichnet ist, daß jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor, wie oben definiert, enthält. Vorzugsweise liegt der molekulare Fluoreszenzsensor zwischen dem Liganden und der Festphase und/oder an dem der Festphase gegenüberliegenden Ende des Liganden und/oder in der Mitte des Liganden vor. Weiterhin ist der Einbau des Fluoreszenzsensores in der Mitte des Liganden insbesondere dann bevorzugt, wenn das Fluorophor einen angeregten, intramolekularen Charge-Transfer-Zustand aufweist oder wenn dessen Fluoreszenz von seiner Beweglichkeit abhängt. Besonders bevorzugt ist eine chemische
Bibliothek, deren Festphase durch den Boden einer Mikrotiterplatte bereitgestellt wird.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete molekulare Fluoreszenzsensor kann in jedem Reaktionsschritt beim Aufbau der chemischen Bibliothek hinzugefügt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Einbau des Fluoreszenzsensors vor der ersten Ankopplung eines Synthesebausteins und/oder nach der Ankopplung des letzten Synthesebausteins. Im ersten Fall muß der molekulare Fluoreszenzsensor bifunktionell sein, im zweiten Fall ist eine Monofunktionalität ausreichend. Bei der Verwendung von Donor-Akzeptor- bzw. Fluorophor-Donor-Paaren ist es bevorzugt, das Paar derart an den Liganden zu binden, daß deren Abstand maximal wird. Bei Herstellung einer erfindungsgemäß bevorzugten chemischen Bibliothek, deren Festphase durch den Boden einer Mikrotiterplatte bereitgestellt wird, wird zunächst der Boden der Vertiefungen der Mikrotiterplatte für die kovalente Ankopplung der für die Synthese der Liganden erforderlichen Edukte derivatisiert . Dann folgt der Aufbau der chemischen Bibliothek in der Mikrotiterplatte, wobei in einem Reaktionsschritt ein molekularer Fluoreszenzsensor wie oben beschrieben an den aufzubauenden Liganden gekoppelt wird.
Zudem stellt die Erfindung die Verwendung einer solchen chemischen Bibliothek für die Wirkstoffentwicklung wie auch für die Entwicklung molekularer Sensoren bereit. Während für die Wirkstoffentwicklung die Struktur des Liganden, der mit dem Target wechselwirkt, ohne Berücksichtigung des molekularen Fluoreszenzsensors relevant ist, ist für die Entwicklung molekularer Sensoren das Konjugat aus Ligand und molekularem Fluoreszenzsensor von Bedeutung, d.h. dieses
Konjugat kann direkt für Verfahren zur Analyse des Targets verwendet werden.
Beispiel 1 (siehe Figur 2)
Eine Glasoberfläche wird mit 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichtet. Alternativ kann das Glassubstrat mit einer Monolage von derivatisierter Cellulose unter Verwendung der Langmuir-Blodgett-Technik beschichtet werden. Die Glasoberflache wird dann physikalisch mit einer inerten
Plastik- (Polypropylen) -Maske mit 96 Vertiefungen verbunden (Durchmesser der Vertiefungen: 7.0 mm) . In jede Vertiefung wird dann eine Lösung des Fluorophorderivats Fmoc-lys- A53 , gelöst in DMF, und den Kupplungsmitteln HOBt/PyBOP und Diisopropylethylamin hinzugefügt. Der Farbstoff bindet an die Oberfläche, worauf die Vertiefungen gründlich mit DMF gewaschen werden, um nicht spezifisch adsorbierten, lediglich physikalisch gebundenen Farbstoff zu entfernen. Nicht umgesetzte Amingruppen auf der Oberfläche werden dann durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid abgeblockt . Anschließend wird die Fmoc-Gruppe von dem Fluorophor durch eine Lösung von Piperidin in DMF abgespalten. Mit Standardtechniken der kombinatorischen Chemie wird dann eine Peptidbibliothek unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren hergestellt. In dem ersten Schritt werden eine Fmoc-Aminosäure und ein Kupplungsreagens wie z.B. PYBOP mit Diisopropylethylamin in jeder Vertiefung in DMF mehrere Stunden inkubiert, wobei in jeder Vertiefung eine andere Aminosäure verwendet wird. Die Vertiefungen werden dann gründlich mit DMF gewaschen, worauf eine Lösung von Piperidin in DMF hinzugefügt wird, um die Fmoc-Gruppen abzuspalten. Die Vertiefungen werden nochmal gründlich mit DMF gewaschen, und der Zyklus wird mit Fmoc- Aminosäuren wiederholt, bis Peptide der erwünschten Länge synthetisiert worden sind, wobei wiederum in jeder Vertiefung verschiedene Aminosäuren verwendet werden. Im letzten Schritt wird die Schutzgruppe der letzten Aminosäure mit Piperidin entfernt, die Vertiefungen gründlich mit DMF gewaschen und der PET-Elektronendonor 4-Dimethylaminophenyl-Essigsäure in DMF-Lösung unter Verwendung von PYBOP mit Diisopropylethylamin angekoppelt. Schließlich werden die Vertiefungen nochmals mit DMF gewaschen, und eine Lösung von Trifluoressigsäure in DMF wird hinzugefügt, um die
Schutzgruppen der Seitenketten zu entfernen. Dann werden die Vertiefungen mit DMF, Methanol, Wasser und anschließend Puffer für das Screeningverfahren gewaschen.
Die Fluoreszenzintensität des Liganden in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte wird unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops mit einem 635 nm Diodenlaser, der auf eine Oberfläche von 1 μm2 fokusiert wird, und eines Einzelphotonenavalanchedetektors gemessen. Das Target wird dann hinzugefügt, und die Messung wird wiederholt. Bei signifikanter Veränderung der Fluoreszenzintensität in einer Vertiefung bindet der Ligand an das Target.
Beispiel 2 (siehe Figur 3) :
Eine Verbund-Mikrotiterplatte umfassend einen mit einem Langmuir-Blodgett-Film aus amino-funktionalisierter Cellulose beschichteten Glasboden und eine darauf haftende Polypropylenmaske wird wie in Ausführungsbeispiel 1 hergestellt. In jede Vertiefung wird dann eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (verschiedene Aminosäuren in den jeweiligen Vertiefungen) und den Kupplungsmitteln HOBt, PyBOP und DIPEA in DMF hinzugefügt (Schritt 1 in Schema 3) . Nach dem Ankoppeln werden die Vertiefungen gründlich mit DMF und Methanol gewaschen. Nicht umgesetzte Amingruppen auf der Oberfläche werden dann durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid abgeblockt (Schritt 2) . Anschließend wird die Fmoc-Gruppe von dem Fluorophor durch eine Lösung von Piperidin in DMF abgespalten (Schritt 3) . Die Schritte 1 und 3 werden wiederholt, bis ein Peptid der Länge von m Aminosäureresten in jeder Vertiefung vorliegt. Zu jeder Vertiefung wird dann eine Lösung des Fluorophorderivates Cy5 (phthal) (COOSu) in
DIPEA/DMF/Dioxan/Wasser (Schritt 4 in Schema 3) hinzugegeben. Das Fluorophor wird in die Peptidkette eingebaut und anschliessend werden die Vertiefungen gründlich mit DMF, Methanol und Wasser gewaschen, um unspezifisch, physikalisch adsorbierten Farbstoff zu entfernen. Die Phthalimidgruppe wird dann von dem Fluorophor durch Verwendung einer methanolischen Hydrazinlösung abgespalten (Schritt 5) . Hierauf werden die Schritte 1 und 3 für weitere (n-m) Zyklen wiederholt, bis Peptide der erwünschten Gesamtlänge von n Aminosäureresten erhalten wird, wobei jeweils zwischen dem Aminosäurerest m und dem Aminosäurerest m+1 Cy5 eingebaut ist. Schließlich werden die Vertiefungen nochmals gründlich mit DMF gewaschen, und eine Lösung von Trifluoressigsaure in DMF wird hinzugefügt, um die Schutzgruppen an den Seitenketten zu entfernen (Schritt 6) . Dann werden die Vertiefungen gründlich mit DMF, Methanol und Wasser und dann Puffer für das Screening gewaschen.
Die Fluoreszenzintensität des Liganden in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte wird unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops mit einem 635 nm Diodenlaser, der auf eine Oberfläche von 1 μm2 auf der Glasoberfläche fokusiert wird, und eines Einzelphotonenavalanchedetektors gemessen. Das Target wird dann hinzugefügt, und die Messung wird wiederholt. Bei signifikanter Veränderung der Fluoreszenzintensität in einer Vertiefung bindet der Ligand an das Target .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Screening von Target -Ligand- Wechselwirkungen, umfassend die Schritte:
(a) Messung zumindest einer Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten, ortsadressierbaren chemischen Bibliothek von Liganden, wobei jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor enthält,
(b) Zugabe des Targets, und
(c) Messung der gleichen Fluoreszenzeigenschaft (en) der chemischen Bibliothek wie in Schritt (a) .
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Fluoreszenzsensor ausgewählt wird aus
(1) einem Fluorophor mit einem angeregten, intramolekularen Charge-Transfer- Zustand; (2) einem Fluorophor, dessen Fluoreszenzintensität von seiner Beweglichkeit abhängt;
(3) einem Fluorophor, dessen Fluoreszenz durch das Target ganz oder überwiegend gelöscht wird;
(4) einem Paar bestehend aus einem Fluorophor und einem Donor für photoinduzierten Elektronentransfer; oder
(5) einem Donorfluorophor-Akzeptorfluorophor Elektronen-Energietransfer-Paar .
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Fluoreszenzsensor ein Fluorophor ist, dessen
Fluoreszenz durch das Target ganz oder überwiegend gelöscht wird.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der
Fluoreszenzeigenschaft eine Messung der Fluoreszenzintensität oder der Fluoreszenzlebensdauer ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Fluoreszenzeigenschaft mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop erfolgt.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung in dem Gefäß erfolgt, in dem die ortsadressierbare chemische Bibliothek hergestellt worden ist .
7. Verfahren gemäß gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Fluoreszenzeigenschaft in einer Mikrotiterplatte erfolgt.
8. An einer Festphase immobilisierte, ortsadressierbare chemische Bibliothek von Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Ligand einen molekularen Fluoreszenzsensor enthält.
9. Chemische Bibliothek von Liganden gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Fluoreszenzsensor zwischen dem Liganden und der Festphase und/oder an dem der Festphase gegenüberliegenden Ende des Liganden und/oder in der Mitte des Liganden eingebaut ist.
10. Chemische Bibliothek gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase der Boden einer Mikrotiterplatte ist.
11. Verfahren zur Herstellung der chemischen Bibliothek gemäß Anspruch 10, umfassend die Schritte:
a) Derivatisieren der Bodenoberflächen der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für die kovalente Immobilisierung; b) Aufbau einer chemischen Bibliothek von Liganden in der Mikrotiterplatte, wobei in einem Reaktionsschritt ein molekularer Fluoreszenzsensor an den aufzubauenden Liganden gekoppelt wird.
12. Verwendung der chemischen Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 für die Wirkstoffentwicklung .
13. Verwendung der chemischen Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 für die Entwicklung molekularer Sensoren.
PCT/EP2000/004948 1999-06-02 2000-05-30 Screening von target-ligand-wechselwirkungen WO2000075657A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00931274A EP1194780A2 (de) 1999-06-02 2000-05-30 Screening von target-ligand-wechselwirkungen
JP2001501881A JP2003501660A (ja) 1999-06-02 2000-05-30 ターゲット−リガンド相互作用のスクリーニング
US09/996,571 US20020106692A1 (en) 1999-06-02 2001-11-30 Screening of target-ligand interactions

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19925402A DE19925402C2 (de) 1999-06-02 1999-06-02 Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen
DE19925402.8 1999-06-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/996,571 Continuation US20020106692A1 (en) 1999-06-02 2001-11-30 Screening of target-ligand interactions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2000075657A2 true WO2000075657A2 (de) 2000-12-14
WO2000075657A3 WO2000075657A3 (de) 2001-09-27

Family

ID=7910105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/004948 WO2000075657A2 (de) 1999-06-02 2000-05-30 Screening von target-ligand-wechselwirkungen

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20020106692A1 (de)
EP (1) EP1194780A2 (de)
JP (1) JP2003501660A (de)
DE (1) DE19925402C2 (de)
WO (1) WO2000075657A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6019441A (en) * 1997-10-09 2000-02-01 General Motors Corporation Current control method for a solenoid operated fluid control valve of an antilock braking system

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10109777A1 (de) * 2001-03-01 2002-09-19 Infineon Technologies Ag Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren
DE10109779A1 (de) * 2001-03-01 2002-09-19 Infineon Technologies Ag Vorrichtung und Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren
DE10314579A1 (de) * 2003-03-31 2004-10-14 Carl Zeiss Jena Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren
JP2007509317A (ja) * 2003-10-18 2007-04-12 バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト 生物学的試験システムにおける、蛍光寿命の測定による分子修飾の直接的観察
DE102004050032A1 (de) * 2004-10-13 2006-04-27 Micronas Gmbh Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden
CN100483112C (zh) * 2006-05-19 2009-04-29 湖南大学 一种检测有机溶剂中水含量的荧光化学传感器及其应用
JP5219144B2 (ja) * 2007-12-28 2013-06-26 公益財団法人新産業創造研究機構 新規アフィニティーラベル化方法及びラベル化方法を用いたスクリーニング方法
KR101847264B1 (ko) * 2016-03-29 2018-04-10 국립암센터 항원 반응형 항체-형광염료 결합체 및 이를 이용한 표적 세포의 형광영상 검출방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040065A2 (en) * 1996-04-24 1997-10-30 Peptide Therapeutics Limited Substrates and inhibitors of proteolytic enzymes
US5786219A (en) * 1996-10-28 1998-07-28 Molecular Probes, Inc. Microspheres with fluorescent spherical zones
WO1998053093A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-26 Bioarray Solutions Llc Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
WO1999011655A1 (en) * 1997-09-04 1999-03-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9215641D0 (en) * 1992-07-23 1992-09-09 Sharma Ashutosh Nadh detection
US5837475A (en) * 1997-01-30 1998-11-17 Hewlett-Packard Co. Apparatus and method for scanning a chemical array

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040065A2 (en) * 1996-04-24 1997-10-30 Peptide Therapeutics Limited Substrates and inhibitors of proteolytic enzymes
US5786219A (en) * 1996-10-28 1998-07-28 Molecular Probes, Inc. Microspheres with fluorescent spherical zones
WO1998053093A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-26 Bioarray Solutions Llc Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
WO1999011655A1 (en) * 1997-09-04 1999-03-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GORDON E M ET AL: "APPLICATIONS OF COMBINATORIAL TECHNOLOGIES TO DRUG DISCOVERY. 2. COMBINATORIAL ORGANIC SYNTHESIS, LIBRARY SCREENING STRATEGIES, AND FUTURE DIRECTIONS" JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY,AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. WASHINGTON,US, Bd. 37, Nr. 10, 13. Mai 1994 (1994-05-13), Seiten 1384-1401, XP000195953 ISSN: 0022-2623 *
RANO ET AL: "A combinatorial approach for determining protease specificities: application to intereukin-1beta converting enzyme (ICE)" CHEM. BIOL., Bd. 4, 1997, Seiten 149-55, XP000995163 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6019441A (en) * 1997-10-09 2000-02-01 General Motors Corporation Current control method for a solenoid operated fluid control valve of an antilock braking system

Also Published As

Publication number Publication date
EP1194780A2 (de) 2002-04-10
DE19925402C2 (de) 2001-12-20
JP2003501660A (ja) 2003-01-14
DE19925402A1 (de) 2000-12-14
WO2000075657A3 (de) 2001-09-27
US20020106692A1 (en) 2002-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69531667T2 (de) Festphasen, spezifisch für biologische reaktionen, ihre herstellung und anwendung
DE69838067T2 (de) Farbkodierung und in situ abfrage von matrix-gekoppelten chemischen verbindungen
EP1556695B1 (de) Analytische plattform und nachweisverfahren mit gegebenenfalls nach fraktionierung in einer probe nachzuweisenden analyten als immobilisierten spezifischen bindungspartnern
WO1994016313A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur bewertung der fitness von biopolymeren
DE102005020384A1 (de) Spektroskopisches Verfahren zum Nachweis von Analyten
EP2269724A1 (de) Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in komplex zusammengesetzten Proben biologischen Ursprungs und dessen Verwendung
EP1018007B1 (de) Adressierbares modulares erkennungssystem, seine herstellung und verwendung
DE19925402C2 (de) Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen
EP1332365B1 (de) Verfahren und testkit zum nachweis von analyten in einer probe
EP1561109A1 (de) Analytische plattform und nachweisverfahren mit den in einer probe nachzuweisenden analyten als immobilisierten spezifischen bindungspartnern
DE19903576C2 (de) Quantitative Bestimmung von Analyten in einem heterogenen System
EP1745063B1 (de) Verfahren zur herstellung von chemischen mikroarrays
DE4301005A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bewertung der Fitness von Biopolymeren
DE19703718A1 (de) Affinitätssensoren und -assays
DE60304262T2 (de) Verfahren zum Kalkulieren von Assoziations- und Dissoziationskonstanten mit einem Polymerchip zum Auffinden von ionischen Polymeren
DE10045808C2 (de) Verfahren zur Detektion der Aktivität von Wirkstoffen
DE60209273T2 (de) Chip aus biologischen Materialien
EP1521964B1 (de) Verfahren zur bestimmung der zahl von rezeptoren auf einem träger
EP1651959B1 (de) Molekulare sonde und material zum nachweis eines analyts und deren verwendung
DE10128093A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Substanzen und Artikel zur Durchführung dieser Verfahren
EP2225560A1 (de) Affinitätsstrukturen zur spezifischen bindung von substanzen durch nicht-kovalente interaktionsformen
DE10023517A1 (de) Anordnung zur Erkennung molekularer Bindung mit UV FRET und Verfahren zum Hochdurchsatzscreening

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09996571

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 501881

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000931274

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000931274

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000931274

Country of ref document: EP