DE102014005993A1

DE102014005993A1 - Verfahren zur Anreicherung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe

Info

Publication number: DE102014005993A1
Application number: DE102014005993.6A
Authority: DE
Inventors: Sven Goethel; Viorel Rusu; Eric Reuijters; Tim Welten
Original assignee: MagnaMedics GmbH
Current assignee: MAGTIVIO B.V., NL
Priority date: 2014-04-28
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2015-10-29
Also published as: EP3137185A1; WO2015165434A1; US20170138940A1

Abstract

Verfahren zur Probenvorbereitung für die Anreicherung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe durch Abreicherung von Verbindungen (1) und Abtrennung von Verbindungen (2) umfassend folgende Schritte: a) Lyse der Zellen und/oder b) Abreicherung von Verbindungen (1) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger und/oder c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger, wobei die Bindung auf dem mobilen Festphasenträger unter b) und c) selektiv und/oder reversible erfolgen kann.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Screening-Kit zur Probenvorbereitung für die Anreicherung von Spurenkomponenten in einer flüssigen biologischen Probe durch Abreicherung hochmolekularer Verbindungen (1) und Abtrennung niedermolekularer Verbindungen (2).
Flüssigen biologischen Materialien wie Vollblut, Serum oder Plasmaproben und andere klinisch relevante Flüssigkeiten werden typischerweise mittels ELISA-Assays auf den quantitativen Inhalt von niedermolekularen, organischen Verbindungen hin untersucht, um einen Krankheitsverlauf aufzuzeichnen, eine Krankheit überhaupt erst zu diagnostizieren oder den Medikamentenspiegel zu bestimmen. Bei den Spurenkomponenten die es zu analysieren gilt kann es sich um natürlich vorkommende Verbindungen handeln (z. B. Vitamine oder Stoffwechselmetaboliten), aber auch um exogen verabreichte Substanzen wie Medikamente oder Drogen.
In den letzten Jahren beginnt sich die LC-MS (bzw. LC-MS/MS) als alternative zu ELISA-Assays zu etablieren. Typischerweise wird hierzu die klinische Probe mittels Präzipitation und anschließender Zentrifugation von Plasmaproteinen abgetrennt und anschließend die niedermolekularen Verbindungen in einer reversed Phase LC aufgetrennt, quantifiziert (Fläche des LC Diagramms) und die Molmasse per Massenspektrometrie (MS) analysiert.
Obwohl mit der Massenspektrometrie sehr sensitive und genaue Messergebnisse erzielt werden können, gibt es zahlreiche Substanzen, die sich negativ auf das Messergebnis auswirken. Da diese Substanzen aus einer Matrix wie z. B. Vollblut, Serum aber auch Pflanzenextrakt oder Nahrungsmitteln stammen können, spricht man auch von sogenannten negativen Matrixeffekten. Bei den zu nennenden Substanzen ist zwischen hochmolekularen-Verbindungen wie z. B. Proteine und niedermolekularen-Verbindungen wie z. B. Phospholipiden zu unterscheiden, da eine Abreicherung bzw. Abtrennung beider Substanzklassen mit einer einzigen physikalisch/chemischen Methode nicht möglich ist.
Es ist bekannt, dass abhängig von der Art der Probe und dem Untersuchungsziel, der qualitative und quantitative Anteil einer Zielverbindung bzw. einer Spurenkomponente wie beispielsweise eines Biomarker Targets aus einer biologischen Probe auf unterschiedlichen instrumentellen Plattformen und für unterschiedliche Endanwendungen wie klinische Kontrollen, Dopinguntersuchungen, Forensisch-Toxikologische Gutachten oder Nahrungsmittelkontrollen durchgeführt werden können. Dabei sind unabhängig von der durchzuführenden Untersuchungsmethode wie beispielsweise ELISA oder Massenspektroskopie Vorbehandlungen der Probe notwendig, um Störkomponenten wie beispielsweise Matrixeffekte zu minimieren.
Der analytische Prozess von der Probenentnahme bis zum Endergebnis ist im Wesentlichen in fünf Schritte unterteilt:

1. Probenentnahme
2. Probenvorbereitung
3. Probenfraktionierung
4. Analytdetektion
5. Datenauswertung

Biologische Proben, wie sie zum Beispiel in der Forensik und in der pharmazeutischen Industrie beispielsweise als Rohstoffe und Endprodukte vorliegen, sind aber Mehrkomponentensysteme mit sehr komplexer Zusammensetzung, die oft Proteine, Salze, Lipide, Säuren, Basen und organische Verbindungen als Bestandteile enthalten. Einige dieser Verbindungen sind als Bestandteile von Proben als quasi Matrix anzusehen und weisen ähnliche Eigenschaften wie die Spurenkomponenten auf.
Zudem liegen die Spurenkomponenten bei anstehenden Analysen in der meisten Zeit in einer niedrigen Konzentration in den Proben vor. Daher soll es ermöglicht werden je nach der Herkunft der Proben und der analytischen Ziele, die biologischen Proben aber auch Drogenanalysen in verschiedene Bestandteile zu trennen und spezifische Komponenten wie beispielsweise Spurenkomponenten anzureichern.
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren für ein Screening mit (positiver Selektion von Spurenkomponenten bei negativer Selektion von abundanten Verbindung einer Probe unter Verwendung von magnetischen Teilchen bzw. magnetischen Partikeln zur Probenvorbereitungen bereit zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren und ein Screening-Kit gelöst, wobei folgende Merkmale beinhaltet sind:

a) Lyse der Zellen und/oder
b) Abreicherung von Verbindungen (1) aus einer flüssigen biologischen Probe durch Bindung auf einem Festphasenträger und/oder
c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilem Festphasenträger,

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Anreicherung von Spurenkomponenten in biologischen Proben, wobei eine Abreicherung bzw. Abtrennung von verschiedenen Arten von Verbindungen (1) und (2) erfolgen kann. Verbindungen (1) können beispielsweise abundante Proteine umfassen. Weiterhin sind auch Anwendungen, die im Bereich der Probenvorbereitung im Kit- basierten Format erfolgen, möglich. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung eine selektive Anreicherung von Spurenkomponenten in Gegenwart von einer proteinreichen Matrix (beispielsweise von Hormonen, Vitaminen, insbesondere Vitamin D, Immunsupressiva, Mykotoxinen etc.) unter der Verwendung von kontrollierter Depletion von Proteinen in Gegenwart von magnetischen Teilchen zu steuern.
Die Erfindung ist gerichtet an das Gebiet der Probenvorbereitung für die HPLC, LC/MS, LC/MS/, MS, Immunoassays inkl. ELISA und andere Tests, die auf die Probenvorbereitungsverfahren für den Nachweis von Spurenkomponenten und/oder niedermolekularen Verbindungen für Analysen in komplexen klinischen und nicht-klinischen Proben. Klinische Proben sind gerichtet auf homogenisiertes Gewebe, Vollblut, Zellkultur, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Tränen, Rückenmarksflüssigkeit, Gewebeflüssigkeit, Fruchtwasser, Follikelflüssigkeit und hämolysiertes Blut. Nicht klinische Proben sind gerichtet auf Nahrungsmittel, Getränke, Wasserproben, flüssige Umweltproben, Fermentationsmedien und Wasserproben.
Zur geeigneten Diagnose von Krankheiten bedarf es einer geeigneten Therapie, wobei eine schnelle Diagnose erfolgen soll, um aussichtreiche klinische Entscheidungen treffen zu können. So ist erfindungsgemäß neben der Möglichkeit der Aufarbeitung einer biologischen Probe hinsichtlich der darin enthaltenen Spurenkomponenten durch ein Verfahren zu isolieren und nachfolgend zu analysieren. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich überraschenderweise Verbindungen (1) und Verbindungen (2) aus den biologischen Flüssigkeiten leicht und schnell abreichern bzw. abtrennen, ohne dass die Zusammensetzungen oder die Mengen der Spurenkomponenten verändert werden. Dies trifft zumindest für den Fall zu, dass die Spurenkomponenten nicht in einem Abschließenden clean-up Schritt aufkonzentriert werden.
Verbindungen (1) und (2), die im Rahmen der vorliegenden Erfindung abgreichert und/oder abgetrennt werden können, können beispielsweise Serumalbumine, Immunglobuline, Fibrinogen, Regulator Proteine sein.
Weiterhin können als Verbindungen (2) auch Zucker, Lipide, Phospholipide und anorganische Salze mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert bzw. abgetrennt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nach Analyse der entsprechenden Zielverbindungen wie beispielsweise von Spurenkomponenten in Form von Medikamenten oder Biomarker Targets klinische Entscheidungen zu treffen, die zu einem schnellen Therapieerfolg führen können. Solche klinische Entscheidungen umfassen dann gegebenenfalls weiterführende Behandlungen mittels Arzneimitteln zur Therapie von Krankheiten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann dem zu untersuchenden Patienten Gewebeproben (Biopsie) oder Körperflüssigkeit (Blut, Plasma) entnommen werden, und die Diagnose erfolgt in vitro/ex vivo, d. h. außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers. Aufgrund der Bestimmung der erfindungsgemäßen Spurenkomponenten wird eine hohe Signifikanz für vorhandene Mengen oder deren Erhöhung/Erniedrigung dieser erreicht. Abreicherung einer Verbindung bedeutet im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Verringerung von hochmolekularen Verbindungen (1) aus einer biologischen Probe. Dies kann durch Bindung wie beispielsweise Adsorption an einen mobilen Festphasenträger der beispielsweise aus magnetischem Silikagel bevorzugt aus mesopörsem Silica aber auch Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Latex und Polyvinylalkohol bestehen kann. Unter Abtrennung ist erfindungsgemäß die Bindung von Verbindungen (2) an mobile Festphasenträger zu verstehen. Die mobilen Festphasenträger können dabei verschiedene Ausgestaltungen aufweisen, d. h. sie können alle die gleichen Abmessungen, Oberflächen und Kernbestandteile enthalten oder auch unterschiedlichen Ausgestaltungen aufweisen. Die Ausgestaltung der mobilen Festphasenträger richtet sich nach der Art, Größe und Menge der in der Probe vorhandenen Verbindungen (1) und (2).
Die weitere Reinigung von biologischen Proben neben den Verbindungen (1) und (2) beinhaltet die Anreicherung von Spurenkomponenten durch selektive und reversible Bindung an mobile Festphasenträger beispielsweise in Form von Kieselgelpartikell, die eine oberflachen-modifizierte Struktur aufweisen können und eine einzelne oder mehrere Arten von Oberflächenstrukturen beinhalten, wobei die Bindung der Spurenkomponenten an die mobilen Festphasenträger durch ionische-, hydrophobe-, π-π Wechselwirkungen, sowie Metall-Ion-Wechselwirkungen erfolgen und eine reversible Bindung begründen kann.
In einer besonderen Ausgestaltung weisen die mobilen Festphasenträger magnetische Teilchen beispielsweise im Kern auf und weisen an der Oberfläche eine Mischung verschiedenen Molekülketten auf, die zwei Hauptfunktionen haben: Einerseits als mobiler Festphasenträger für die abgereicherten bzw. abgetrennten Verbindungen (1) und (2) zu fungieren und andererseits als mobiler Festphasenträger für die Anreicherung von Spurenkomponenten zur Verfügung zu stehen, wobei die jeweilige Bindung der mobilen Festphasenträger in Bezug auf die Verbindungen (1) und (2) und den Spurenkomponenten von spezifischen Wechselwirkungen abhängt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Verbindungen (1) und/oder (2) an einem mobilen Festphasenträger wie beispielsweise einem Adsorbens aus Kieselgel Partikeln mit einem magnetischen Kern und mit einer Porengröße im Bereich von 2 bis 50 nm, bevorzugt 5 bis 30 nm und einer inneren Oberfläche im Bereich von 0,1 bis 400 m²/g, bevorzugt 10 bis 200 m²/g, gebunden.
Die Partikel haben im Allgemeinen einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 500 μm, bevorzugt von 50 nm bis 100 μm, insbesondere bevorzugt von 100 nm bis 10 μm.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden zur Bindung und/oder Eluierung protische und aprotische polare organische Lösungsmittel verwendet. Diese haben im Allgemeinen ein Dipolmoment im Bereich von 1.6 bis 4.0 Debye, bevorzugt von 1.69 bis 3.96 Debye.
Als geeignete polare, organische Lösungsmittel seien beispielsweise aber nicht abschließend genannt: Acetonitril, Ethanol, Methanol, Propanol, iso-Propanol, n-Propanol, Isobutanol und n-Butanol, sowie Aceton, Dimethylsulfoxid und Polyethylenglykol-(PEG).
Die polaren, organischen Lösungsmittel können einzeln oder im Gemisch verwendet werden. Die Mischungen werden beispielsweise so eingestellt, dass Alkohole wie Ethanol und iso-Propanol in verschiedenen Gewichtsanteilen oder Acetonitril zusammen mit einem Alkohol wie z. B. iso-Propanol oder Ethanol oder Kombinationen aus Alkoholen wie Ethanol und iso-Propanol mit verschieden Gewichtsanteilen mit z. B. Acetonitril kombiniert werden.
Zur weiteren Reinigung bzw. weiteren Konzentrierung der Spurenkomponenten können diese in einem weiteren Schritt in nicht-polaren, aprotischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Hexan durch flüssig-flüssig Extraktion aufgenommen werden und nach anschließender Verdampfung des Lösungsmittels, kann der Rückstand in einem geeigneten polaren Lösungsmittel wie beispielweise Methanol oder Actonitril wieder aufgenommen werden.
Als Spurenkomponenten bzw. Biomarker Targets im Sinne der Erfindung sind beispielhaft aber nicht abschließend folgende Substanzen oder Substanzklassen zu zählen:
Vitamine, Steroide, Hormone, Tumormarker, Immunsuppressiva, Benzodiazipine, Antidepressiva, Antibiotika, Phsychopharmaka, Cardiovaskuläre Medikamente, Drogen, Insektizide, Pesticide, Fungizide, Antikörper, Vasopressin, Oxytocin, Somatostatin, Enzephalin, beta-Endorphin, Thyroxin, Triiodthyronin, Thyroglobulin, Calcitonin, Catecholamin, Dopamin, Serotonin, Parathormon, Aldesteron, Renin, Angiotensin, Cortisol, Cortison, Desoxycortisol, Desoxycorticosteron, Corticosteron, Androsteron, Progesteron, Pregnenolon, Östrogen, Östron, Östradiol, Östriol, Testosteron, FSH, Gonadotropin, Cyclosporin A, Tacrolimus, Everolimus, Sirolimus, MPA, Insulin, Anti-Insulin-Antikörper, Glucagon, Gastrin, Sekretin, AMP, GMP, MMP 20, ZAP 1, ZAP 2, ZAP 3, Prostaglandine, Thromboxan, Erythropoetin, Histamin, Phenobarbital, Phenytoin, Carbamazepin, Primidon, Ethosuximid, Valproinsäure, Acetazolamid, Sultiam, Glutethimid, Clonazepam, Nitrazepam, Diazepam, Pentobarbital, Secobarbital, Bupivacain, Mepivacain, Lidocain, Procainamid, Chinidin, Digoxin, Digitoxin, Theophyllin, Amitriptylin, Imipramin, Amikacin, Gentamicin, Tobramycin, Cefalexin, Sulfamethoxazol, Methotrexat, Cyclosporin, Methylprednisolon, Salicylsäure, Acetaminophen, Indomethacin, Allopurinol, Vitamin A, Carotin, Vitamin B1;, Vitamin B2;, Vitamin B6; Folsäure, Vitamin C, Vitamin D, 25-OH Vitamin D, Vitamin E, Angiotensin I und II, Hämopexin, Transferrin, Kortisol, Insulin, Fibrinogen, Antithrombin, Plasminogen, Antiplasmin, etc.
Die mobilen Festphasenträger können Kieselgel Partikel bzw. Kieselgel Teilchen, die mit einem magnetischen Kern ausgestaltet sein können, aufweisen. Durch Beschichten des mit Eisenoxid dotierten Kerns umfassen die Partikel bzw. Teilchen, die beispielsweise mit Kieselgel beaufschlagt werden können funktionelle Gruppen wie beispielsweise OH, -COOH, NH₂, R-SO₂–OH, -NH₂; -RNH, -R₂N, _CH₃, -C₂H₅, -C₄H₉, -C₈H₉, -C₆H₅, -ZrO₂, TiO₂, C₆H₉NO₆, Phenylhexyl, Biphenyl, Hydroxyapatit, Boronsäure.
Durch die voranstehend genannten funktionellen Gruppen werden Wechselwirkungen erzielt, die eine gegebenenfalls reversible Bindung der Verbindungen (1) und (2) und/oder Spurenkomponenten auf der Oberfläche der mobilen Festphasenträger gewährleisten. Dazu zählen ionische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, π-π Wechselwirkungen, sowie Metall-Ion-Wechselwirkungen. Die voran genannten Wechselwirkungen ermöglichen insbesondere bei der Verwendung polarer Lösungsmittel eine induzierte Anhaftung der Verbindungen (1) und (2) und/oder der Spurenkomponenten auf der Oberfläche der mobilen Festphasenträger.
Die Beschichtung von Eisenoxid enthaltende Partikel mit Kieselgel ist an sich bekannt (J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62 bis 69; Langmuir 2005, 21, 10763 bis 10769; J. Colloid Interface Sci 2005, 283, 392 bis 396).
Die Beschichtung von Eisenoxid enthaltende Partikel mit Kieselgel für das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Eine Suspension von Eisenoxid enthaltende Partikel in einem Alkohol (z. B. Isopropanol) wir unter starkem Rühren in Gegenwart von Ammoniak zur Beschichtung mit Tetraethylorthosilicat (TEOS) versetzt. Die Dicke der Beschichtung kann durch die Menge des zugegeben Tetraethylorthosilicat gesteuert werden.
Die beschichteten Eisenoxid enthaltende Partikel werden mit einem Alkohol (z. B Methanol) gewaschen und in Wasser gelagert.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden insbesondere Kieselgel Partikel als mobile Festphasenträger bevorzugt, die aus einer mesoporösen Schicht bestehen, die auf den magnetischen Kern aufgetragen ist und eine Schichtdicke im Bereich von 10 bis 100 nm aufweist.
Magnetische Kerne für die erfindungsgemäßen mobilen Festphasenträger Kieselgel Partikel können an sich bekannte Partikel aus Eisenoxid (Fe₂O₃ oder Fe₃O₄) umfassen und eine umgebende Schicht beispielsweise aus Siliciumdioxid aber auch Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Latex und Polyvinylalkohol aufweisen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden bevorzugt Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung eingesetzt, wie sie beispielsweise in Gegenwart von Polyethylenglykol als porogenes Mittel entsteht.
Im Besonderen bevorzugt werden Kieselgel Partikel, die aus einer mesoporösen Schicht bestehen, die auf den magnetischen Kern aufgetragen ist und eine Schichtdicke im Bereich von 10 bis 100 nm aufweist, wobei die magnetischen Kerne Maghemit und/oder Magnetit im Bereich von 30 bis 95 Gew% enthalten und einen mittleren Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 500 μm, bevorzugt von 200 nm bis 10 μm, insbesondere bevorzugt von 300 nm bis 5 μm aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Form durchgeführt werden, dass eine selektive und/oder reversible Bindung der Verbindungen (1) und (2) an die mobilen Festphasenträger erfolgt d. h. eine Bindung von Verbindungen (1) und (2) an ein mobile Festphasenträger zur Abreicherung der Verbindungen (1) und Abtrennung der Verbindungen (2) bei simultaner Anreicherung der Spurenkomponenten erfolgt, wobei die Spurenkomponenten in Lösung verbleiben. Dies hat den Vorteil, dass man je nach Aufgabenstellung eine schnelle und selektive Anreicherung von Spurenkomponenten durch parallele Bindung von Verbindungen (1) und (2) an die mobilen Festphasenträger vornehmen kann ohne mehrstufige Fraktionen zu erhalten. Die erhaltenen Spurenkomponenten können dann einer nachfolgenden Analyse unterzogen werden.
Es ist jedoch auch möglich, dass zunächst die Verbindungen (1) und (2) an mobile Festphasenträger gebunden werden und anschließend die in der Lösung verbliebenen Spurenkomponenten an mobile Festphasenträger gebunden werden. Die mobilen Festphasenträger können sich nach Größe und der Art der funktionellen Gruppen unterscheiden, so dass sich nur bestimmte Verbindungen (1) und (2) oder Spurenkomponenten an die unterschiedlich ausgestalteten mobilen Festphasenträger binden. Die so erhaltenen Spurenkomponenten können dann nach einem optionalen Elutionsschritt einer nachfolgenden Analyse unterzogen werden.
Ferner ist in einer weiteren Ausgestaltung des Erfindungsgegenstandes vorgesehen, dass zunächst nur Verbindungen (2) abgetrennt werden, in einer nachfolgenden Abreicherung die Verbindungen (1) aus der Probe entfernt werden und nachfolgend die Spurenkomponenten, die in der Lösung verblieben sind, einer Analyse unterzogen werden. Alternativ können die Spurenkomponenten auch an mobile Festphasenträger mit bestimmter Ausgestaltung der Oberfläche, beispielsweise durch die geeignete Wahl der funktionellen Gruppen gebunden werden. Die gebundenen Spurenkomponenten können dann nach einem optionalen Elutionsschritt einer nachfolgenden Analyse unterzogen werden.
Auch ist es vorgesehen, zunächst eine Bindung der Spurenkomponenten an geeignete mobile Festphasenträger zu generieren und nachfolgend eine Abreicherung von Verbindungen (2) und Abtrennung von Verbindungen (1) aus der Probe vorzunehmen. Die Spurenkomponenten können dann nach einem Elutionsschritt einer Analyse unterzogen werden.
Die Abreicherung von Verbindungen (1) und Abtrennung von Verbindungen (2) können insofern mit der Anreicherung der Spurenkomponenten in der Probe zeitlich versetzt oder simultan erfolgen, wobei die Verfahrensschritte je nach Art der Aufgabenstellung variabel gestaltbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei der Lyse der Zellen in einem ersten Verfahrensschritt a) eine Pufferlösung mit niedriger Ionenstärke verwendet, wobei der Volumenanteil der biologischen Probe zur Pufferlösung 1:2 bis 1:10 beträgt und die Pufferlösung einen molaren Salzanteil von 0 bis 0,5 mol aufweist. In einem weiteren Verfahrensschritt b) wird zu einem Volumenteil der biologischen Probe 0,5 bis 2,5 Volumenteile einer Pufferlösung mit niedriger Ionenstärke zugesetzt die ein zweiwertiges Salz mit einer molaren Konzentration von bis zu einem mol/l enthält, wobei das zweiwertige Salz insbesondere Zinksulfat ist.
Die Abtrennung der Kieselgel Partikeln mit einem magnetischen Kern kann mit Hilfe eines magnetischen Separators erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie in den folgenden Schritten durchgeführt werden:

(i) Bereitstellen einer flüssigen biologischen Probe, die eine oder mehrere Spurenkomponenten, sowie Verbindungen (1) und/oder Verbindungen (2) enthalten,
(ii) Kontaktieren der flüssigen biologischen Probe mit Kieselgel Partikeln mit einem magnetischen Kern,
(iii) Zugabe von organischen Lösungsmitteln in vordefinierten Verhältnis
(iv) Verwirbeln und Intubieren des Gemisches, wobei die Verbindungen (1) und/oder Verbindungen (2) auf der Oberfläche der Partikel adsorbiert werden,
(v) Abtrennen der magnetischen Partikel durch Anlegen eines magnetischen Feldes, und
(vi) Abnahme des Überstands mit einer oder mehreren Spurenkomponenten in Lösung bzw. Suspension. Alternativ Extraktion einer oder mehrere Verbindungen (1) und (2) und/oder von Spurenkomponenten aus der Probe mit anschließender Eluierung.
(vii) Austrocknen des Überstands oder der Elutionslösung bzw. -flüssigkeit durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels Mischung bei erhöhter Temperatur (50–85°C) oder im Gasstrom und
(viii) Analysieren der einen oder mehrerer Verbindungen (1) und (2) und/oder Spurenkomponenten unter Verwendung von Gelelektrophorese, HPLC, UPLC, LC/MS, LC-MS/MS, UVNis, Immunoassay Detektion und/oder Durchflusszytometrie.

Optional können auch einige andere chromatographische Techniken innerhalb der analytischen Kette vor der Massenspektroskopie erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Probenanalysen mit einem geringem Gehalt Zielverbindungen und Biomarker Targets, wobei die Verbindungen aus einer Probe durch Änderung der Dielektrizitätskonstante mit Hilfe von polaren, organischen Lösungsmitteln mit einem Dipolmoment im Bereich von 1.6 bis 4.0 Debye an Kieselgel Partikeln mit einem magnetischen Kern adsorbiert werden und die magnetischen Kieselgelpartikel mit den adsorbierten Verbindungen im Magnetfeld abgetrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Proben zusätzliche Spurenkomponenten beispielsweise aus einer der Gruppen

a. der entzündungshemmenden Immunsuppressiva,
b. der Antiarythmika,
c. der Nicht-Protein Biomarker,
d. der Drogen
e. der Dopingmittel
f. der Mycotoxinen
g. der Antidepressiva
h. der Antiepileptika
i. der Antipsychotika
j. der Antibiotika
l. der Vitamine

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch eine selektive und/oder reversible Bindung von Spurenkomponenten wie beispielsweise Biomarker Targets auf einem mobilen Festphasenträger beispielsweise mit magnetischen Silka Teilchen als Adsorbens. Die Bindung oder Anlagerung auf der Oberfläche des Festphasenträgers kann durch verschiedene Mechanismen erfolgen. So ist es möglich, dass die Verbindungen durch verschiedene Wechselwirkungen auf der Oberfläche gebunden werden, so dass im Zuge einer nachfolgenden Probenaufbereitung die durch Adsorption gebundenen Spurenkomponenten ggf. leicht von der Oberfläche wieder gelöst werden können. Zu den Wechselwirkungen, die ggf. eine reversible Bindung der Verbindungen auf der Oberfläche gewährleisten, zählen ionische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, π-π Wechselwirkungen und Metall-Ion Wechselwirkungen. Die voran genannten Wechselwirkungen ermöglichen insbesondere bei der Verwendung polarer Lösungsmittel eine induzierte Anhaftung der Verbindungen auf der Oberfläche des Adsorbens. Durch gezielte Änderung des pH's, der Salzkonzentration, Polarität des Lösungsmittels wird die induzierte Anhaftung irreversibel gestaltet und die Spurenkomponente wird vom Festphasenträger eluiert. Neben einer Reinigung der Probe, kann so auch eine Konzentrierung der Spurenkomponente erzielt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet auch die Kombination der selektiven Anreicherung der Zielkomponente und der Abreicherung und/oder Abtrennung von Verbindungen (1) und (2). Die Kombination wird üblicherweise, aber nicht ausschließlich, in einem Zweischrittverfahren erzielt. Hierbei werden Verbindungen (1) und (2) durch selektive und nicht-selektive Bindungen an den Festphasenträger gebunden und damit aus dem Reaktionsgemisch entfernt. In einem weiteren Schritt werden die Spurenkomponenten selektiv und reversibel an einen weiteren Festphasenträger gebunden und ggf. durch Variation des Solvens (pH, Sakzkonzentration, Polarität des Lösungsmittels) wieder vom Festphasenträger eluiert.
Dabei können die Schritte zeitgleich in einer Reaktionskammer, aber auch zeitlich getrennt und in zwei oder mehreren Kavitäten stattfinden. Insbesondere in der Analytik von Spurenkomponenten neben Proteinen und störenden niedermolekularen Verbindungen als Hauptkomponente eröffnet die vorliegende Erfindung in vorteilhafterweise eine einfache Durchführung der Analytik mit geringen Fehlern, die besonders durch die Komplexität des Systems bedingt sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen einer in-vitro Diagnose mittels parallelen oder simultanen Bestimmungen der erfindungsgemäßen Marker durchgeführt werden, wobei die Bestimmungen an mindestens einer Patientenprobe durchgeführt werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer 2D-Elektrophorese erfolgen, wobei in der ersten Dimension eine isoelektrische Fokussierung, in der zweiten Dimension eine Gelelektrophorese durchgeführt wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren und dessen Bestimmungen mittels einem Schnelltest durchgeführt werden (z. B. lateral-flow Test), sei es in Einzel- oder Multiparameterbestimmung.
Schließlich beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Anwendungspaket bzw. Screening-Kit für klinische Proben, wobei die in dem Screening-Kit verwendeten Bestandteile Lysepuffer, organische Lösungsmittel und magnetische Festphasenträger umfassen. Die im Screening-Kit vorhandenen Bestandteile sollen dabei analog zu dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen Bestandteilen in einem Konzentrationsbereich zwischen 1 bis 15 Volumenprozent verwendet werden. Dadurch sind unterschiedliche klinische Anwendungen für das kit möglich, wobei insbesondere durch die Verwendung variabler Konzentrationsbereiche der vorhandenen Screening-Kit Bestandteile verschiedene Probenarten analysiert werden können.
Nachfolgend sind beispielhaft einige typische Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und Screening-Kits aufgeführt
Beispiel 1:
Probenvorbereitung für die Anreicherung und Analyse Kortisol in humanem Vollblut:
Materialien:

Lysiertes Vollblut mit Kortisol
Kortisollösung: 250 μg/ml in sterilem Wasser
Magnetischer Bead mix (50 mg/ml) in wässriger Zinksulfatlösung (0.4 M)
Organischer Lösungsmittel mix, 100% Acetonitrile
Mikrotiterplatten, UV/Vis kompatibel
Mikrotiterplatten Lesegerät
1. Im Mikrotiterplattenformat wird wässrige Kortisollösung, in unterschiedlichen Konzentrationen, zum Vollblut addiert, gemischt und 1 Min. zwecks Zelllyse inkubiert.
2. Zinksulfathaltiger Beadmix wird zum Reaktionsansatz gegeben, gemischt und eine Minute inkubiert.
3. Durch Addition von Acetonitril zum Reaktionsansatz werden die Proteine an den magnetischen Beadmix präzipitiert.
4. Die zugegebenen, bzw. generierten Feststoffe werden in der Gesamtheit durch einen geeigneten magnetischen Seperator, z. B. MagnaMedics M12 + 12 abgetrennt und die überstehende Lösung wird zur weiteren Analyze abgenommen.
5. Der Überstand wird im Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 240 nm vermessen und die optische Dichte (OD₂₄₀) aufgezeichnet.

Als Ergebnis ist festzustellen, dass lysiertes Vollblut bei 240 nm eine vom zugesetzten Kortisol unabhängige Hintergrundabsorption aufweist. Daher müssen die Absorptionswerte von Kortisolhaltigen Proben vom Blindwert subtrahiert (korrigiert) werden.

Ein Pipettierschema ist nachfolgend aufgelistet:

Pipettierschema:	Vollblut [μul]	Wasser [μl]	Kortisollsg. [μl]	Bead- Lösung [μl]	Acetonitril Lösung [μl]	Summe
1	50	250	0	50	700	1050
2	50	250	0	50	700	1050
3	50	210	40	50	700	1050
4	50	210	40	50	700	1050
5	50	170	80	50	700	1050
6	50	170	80	50	700	1050
7	50	130	120	50	700	1050
8	50	130	120	50	700	1050
9	50	90	160	50	700	1050
10	50	90	160	50	700	1050
11	50	50	200	50	700	1050
12	50	50	200	50	700	1050

Auslesung:

	OD₂₄₀	Kortisol im Assay [μg]	⌀. Blindwert [OD₂₄₀]	Korr. OD₂₄₀	Rel. Absorptkoeff. [alpha]	Abweichung alpha in [%]
1	0,3449	0	0,3619	0,0171	n. a
2	0,3790	0	0,3619	0,0171	n. a
3	0,5713	10	0,3620	0,2094	0,1099	96,9
4	0,5972	10	0,3620	0,2353	0,1235	108,9
5	0,8047	120	0,3620	0,4428	0,1162	102,4
6	0,7806	20	0,3620	0,4187	0,11	96,9
7	0,9878	30	0,3620	0,6259	0,1095	96,5
8	1,0328	30	0,3620	0,6709	0,1174	103,5
9 10	1,2283 1,2395	40 40	0,3620 0,3620	0,8664 0,8776	0,1137 0,1151	100,3 101,6
11	1,3627	50	0,3620	1,0008	0,1050	92,6
12	1,4440	50	0,3620	1,0821	0,1136	100,2
				⌀	0,1134

Die Wiederfindungsrate von additiv zugeführtem Kortisol beträgt in obigem Experiment 92%.
Beispiel 2:
Vergleich von Protokollen zur Abreicherung bzw. Abtrennung von Verbindungen (1) und (2) zur Bestimmung von Kortisol in humanem Vollblut mit magnetischen und unmagnetischen mobilen Festphasenträgern:
Materialien:

Lysiertes Vollblut mit Kortisol
Kortisollösung: 250 μg/ml in sterilem Wasser
Magnetischer Bead mix (20 mg/ml)
Organischer Lösungsmittel mix, 100% Acetonitrile
Mikrotiterplatten, UV/Vis kompatibel
Mikrotiterplatten Lesegerät

1) Protokol mit magnetischen mobilen Festphasenträgern:

• Im Mikrotiterplattenformat werden zu 35 μl Vollblut (bzw. 100 μl Serum) 0, 25, 50 oder 75 μl Kortisollösung und 1-fach, 1.5 fach, 2 fach und 4 fach konzentrierte magnetische Bead Mix Lösung, gemäß dem untigem Pipetierschema, gegeben, gründlich gemischt und für 1 Minute inkubiert.
• Durch Addition von Acetonitril (270 μl bei Vollblutproben und 360 μl bei Serumproben) werden die Proteine an die magneticchen Beads präzipitiert.
• Nach 1 minütiger magnetischer Separation wird der Überstand abgenommen, in ein freies Mikrotiterplattenwell transferiert und im Mikrotiterplattenlesegerät bei 240 nm ausgelesen.

2) Protokol ohne magnetischemobile Festphasenträger:

• Im Mikrotiterplattenformat werden zu 35 μl Vollblut (bzw. 100 μl Serum) 0, 25, 50 oder 75 μl Kortisollösung und 75, 50, 25 oder 0 μl Wasser gemäß dem untigen Pipetierschema, gegeben, gründlich gemischt und für 1 Minute inkubiert.
• Durch Addition von Acetonitril (270 μl bei Vollblutproben und 360 μl bei Serumproben) werden die Proteine präzipitiert.
• Der Reaktionsansatz wird vom Mikrotiterplatten-format in Eppendorf-Tube format überführt.
• Die präzipitierten Proteine werden durch 10 minütige Zentrifugation bei
10.000 G kollektiert und der Überstand zurück ins Mikrotiterplattenformat überführt.
• Im Mikrotiterplattenlesegerät wird die Probe bei 240 nm ausgelesen.

Pipettierschema:

	Schritt 1	Schritt 2 addiere	Schritt 3 addiere, mische und inkubiere 1 min.*	Schritt 4 addiere und mische	Schritt 6 Transfer der Probe	Schritt 7 Separation	Schritt 8
1	35 μl Vollblut	0 μl Kortisollösung	100 μl Bead Lsg (1 fach konz.)	270 μl Acetonitril	-	1 Minute magnetische Separation	Überstand abnehmen
2	35 μl Vollblut	25 μl Kortisollösung	75 μl Bead Lsg (1.5 fach konz.)	270 μl Acetonitril	-	1 Minute magnetische Separation	Überstand abnehmen
3	35 μl Vollblut	50 μl Kortisollösung	50 μl Bead Lsg (2 fach konz.)	270 μl Acetonitril	-	1 Minute magnetische Separation	Überstand abnehmen
4	35 μl Vollblut	75 μl Kortisollösung	25 μl Bead Lsg (4 fach konz.)	270 μl Acetonitril	-	1 Minute magnetische Separation	Überstand abnehmen
5	35 μl Vollblut	0 μl Kortisollösung	100 μl Wasser	270 μl Acetonitril	Transfer in Eppendorf tubes	10 min. Zentrifugatio n bei 10.000 G	Überstand abnehmen
6	35 μl Vollblut	25 μl Kortisollösung	75 μl Wasser	270 μl Acetonitril	Transfer in Eppendorf tubes	10 min. Zentrifugatio n bei 10.000 G	Überstand abnehmen
7	35 μl Vollblut	50 μl Kortisollösung	50 μl Wasser	270 μl Acetonitril	Transfer in Eppendorf tubes	10 min. Zentrifugatio n bei 10.000 G	Überstand abnehmen
8	35 μl Vollblut	75 μl Kortisollösung	25 μl Wasser	270 μl Acetonitril	Transfer in Eppendorf tubes	10 min. Zentrifugatio n bei 10.000 G	Überstand abnehmen

* Eine Minute Inkubation zur Lyse der Vollblutzellen ist nur bei Vollblut-Proben notwendig – entfällt für Serum und Wasserproben.

Beispiel 3:
Abtrennung von Verbindungen (2) durch die mobilen magnetischen Festphasenträgert MagSi-TDM^PREP am Beispiel des Phosphatidylinositols:
Materialien:

Phosphatidyllösung (wässrig): 0.5 g/L
Magnetischer Bead mix (50 mg/ml)
Wasser p. a.
Organischer Lösungsmittel mix, 100% Acetonitrile
Mikrotiterplatten, UV/Vis kompatibel
Mikrotiterplatten Lesegerät

Protokol:

• Phosphatidylinositol werden in 0.4 M wässriger Kaliumbicarbonat, pH 9 Lösung bei einer Endkonzentration von 0.5 g/L gelöst.
• 25 μl Phosphatidylinositollösung werden in Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben.
• Zur Lösung werden 40 μl magnetische Partikelmischung gegeben und gemischt. Anschließend wird die Lösung 30 Sek. inkubiert.
• Zur Lösung werden 70 μl Wasser und 90 μl Acetonitrile gegeben.
• Die Magnetpartikel werden für 1 min. im Magnetfeld separiert.
• Der Überstand wird im Mikrotiterplattenlesegerät bei OD₄₀₅ auf Turbidimetrie untersucht.

Partikeltyp/Partikelmix	OD₄₀₅ Werte
MagSi-S	0,1590
MagSi-TDM^PREP	0,1541
MagSi-WCX	0,3520
MagSi-proteomics C8	0,1328
Negativkontrolle (ohne magnetische Partikel)	0,3502

Bespiel 4:
Protokol zur Probenvorbereitung von Vollblutproben zwecks IC-MS/MS aber auch Immunoassay; IC oder Elektrophorestischer zur Anreicherung und Analyse von Spurenkomponenten:
Probenmaterial: EDTA-Blut, Heparin Blut, Citrat-Blut

1. Zu 50 μl Vollblut wird Lyselösung (ddWasser) im Bereich von 100 bis 250 μl geben, der Reaktionsansatz wird gemischt und 30 sec.–2 min. bei Raumtemperatur inkubiert.
2. Ggf. wird ein Interner Standard, bevorzugt ein deuterierter interner Standard, in geeigneter Konzentration zum Reaktionsansatz gegeben, typischerweise in Volumina zwischen 10–50 μl. Anschließend wird der Reaktionsansatz gemischt.
3. Optional kann eine Partikelsuspension aus mobilen Festphasenträgern, die ggf. eine spezifische Oberflächenmodifikation aufweisen kann, zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, eine Anionenaustauscherfunktionalität, im Bereich von 1 mg–10 mg Trockengewicht in geeigneter Pufferlösung zum Reaktionsansatz gegeben werden. Im Anschluss wird der Reaktionsansatz für 10 sec. bis 2 min. bei Raumtermparatur inkubiert. Hierdurch werden Verbindungen (2), die einen Matrixeffekt auslösen, abgereichert. Alternativformate zu Partikelsuspension können auch geeignete Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z. B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
4. Im Anschluss wird die Partikelsuspension im Magnetfeld pelettiert und der Überstand wird von den mobilen Festphasenträgern separiert.
5. Zum Überstand aus (4) wird eine weitere Partikelsuspension in Form von erfindungsgemäßer mobiler Festphasenträger, die sich in Zusammensetzung, Konzentration und ggf. Partikeldimensionen von der Partikelsuspension unter (3) unterscheidet, im Bereich von 1–10 mg Trockengewicht in geeigneter Pufferlösung gegeben.
6. Zum Reaktionsansatz aus (5) wird ein organisches Solvens, bevorzugt, aber nicht ausschließlich, Acetontrilil im Bereich von ¾ bis 3 Volumenanteilen des Reaktionsansatzes gegeben und der Reaktionsansatz gründlich durchmischt. Hierbei werden Proteine und weitere Hochmolekulare Substanzen an die vorhandenen partikulären, mobilen Festphasenträger präzipitiert.
7. Die magnetischen Partikel zusammen mit dem Präzipitat wird im Magnetfeld kollektiert und der Überstand wird abgenommen.
8. Optional können die Spurenkomponente, die nach (7) im Überstand verblieben sind, weiter aufgereinigt werden. Hierzu werden die Spurenkomponenten selektiv, zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, über eine Antigen/Antikörper Erkennung, oder aber auch nicht-selektiv, zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, über eine reversed-phase oder ionenaustascher Funktionalität, an eine magnetische Partikelsuspension, im Bereich von 1–10 mg Trockengewicht in geeigneter Pufferlösung, die sich in Zusammensetzuing und Konzentration von der Partikelsuspension unter (5) unterscheidet, gebunden. Nach magnetischer Separation wird der Überstand verworfen und die Partikel werden in geeigneter Waschlösung resuspendiert. Dieser Vorgang wird ggf. wiederholt und abschießend werden die kollektierten Partikel in geeignete Elutionspuffer aufgenommen. Dabei gehen die gebundenen Spurenkomponenten in Lösung. Alternativformate zu Partikelsuspension koennen auch geeignete Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z. B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
9. Optional können im Überstand verbliebene Verbindungen (2), durch Bindung an eine Partikelsuspension in Form von mobilen Festphasenträgern, die sich in Zusammensetzung und Konzentration von der Partikelsuspension unter (5) unterscheidet, die im Bereich von 1–10 mg Trockensubstanz in geeigneter Pufferlösung zugegeben wird, selektiv von den Spurenkomponenten extrahiert werden. Alternativformate zu Partikelsuspension können auch geeignete Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z. B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
10. Optional können Spurenkomponenten ankonzentriert werden. Hierzu wird der Überstand aus (7) mit Wasser oder einem polarem organischem Solvenz in Bereich von 2–10 Volumenanteilen vom Überstand verdünnt und zu dem verdünnten Reaktionsansatz wird eine Partikelsuspension, die sich in Zusammensetzung und Konzentration von der Partikellösung unter (5) abgrenzt, zugegeben und die Spurenkomponenten werden gebunden. Dabei kann die Binding analog zu (8) selektive oder nicht-selektiv erfolgen. Nach magnetischer Separation wird der Überstand verworfen und die Partikel werden in geeigneter Waschlösung resuspendiert. Dieser Vorgang wird ggf. wiederholt und abschießend werden die kollektierten Partikel in geeignetem Elutionspuffer aufgenommen. Dabei gehen die gebundenen Spurenkomponenten in Lösung. Alternativformate zu Partikelsuspension koennen auch geeignete Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z. B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.

Beispiel 5:
Protokol zur bProbenvorbereitung von Serum/Plasma zwecks LC-MS/MS aber auch Immunoassay; LC oder Elektrophorestischer zur Anrfeicherung und Analyse von Spurenkomponenten
Probenmaterial: humanes Serum oder Plasma
Das Protokol zur Probenvorbereitung von Serum/Plasma Proben ist identisch mit dem Protokol unter Beispiel 4 – Vollblutproben – mit dem Unterschied dass auf Schritt (1) verzichtet wird.
Beispiel 6:
Protokol zur Probenvorbereitung von Vollblutproben zwecks LC-MS/MS aber auch Immunoassay; LC oder Elektrophorestischer zur Anreicherung und Analyse von Spurenkomponenten (Hochsalzlyse):

1. Zu 50 μl Vollblut wird 15 μl Lyselösung – wässrige ZnSO4 (p. a.) im Bereich von 0.2 M–1 M zugegeben und 0.5–2 min. bei Raumtemperatur inkubiert.

Alle weiteren Schritte folgen dem Beispiel 4, Schritte 1 bis 10.
Das erfindungsgemäße Verfahren und Screening Kit wird anhand der nachfolgenden 1 nochmals erläutert:
In dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Verfahren zur Anreicherung von Spurenkomponenten anhand des Screening-Kits können einzelne Prozessschritte simultan oder separat, in ein oder mehreren Kavitäten durchgeführt werden. 1 zeigt mögliche Prozessschritte die durch die vorliegende Erfindung abgedeckt werden. Die Abreicherung bzw. Abtrennung von Verbindungen (1) und (2) kann simultan (Fall A und B) oder separat (Fall C und D) erfolgen. Eine Anreicherung einer Spurenkomponente (so erforderlich) erfolgt üblicherweise, aber nicht ausschließlich, als letzter Prozessschritt. Bei Vollblutproben ist die Lyse von roten Blutzellen ein notwendiger Prozessschritt – bei anderen klinischen Proben wie Serum/Plasma oder Saliva kann dieser Prozessschritt entfallen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62 bis 69 [0028]
Langmuir 2005, 21, 10763 bis 10769 [0028]
J. Colloid Interface Sci 2005, 283, 392 bis 396 [0028]

Claims

Verfahren zur Probenvorbereitung für die Anreicherung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe durch Abreicherung von Verbindungen (1) und Abtrennung von Verbindungen (2) umfassend folgende Schritte: a) Lyse der Zellen und/oder b) Abreicherung von Verbindungen (1) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger und/oder c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger, wobei die Bindung auf dem mobilen Festphasenträger unter b) und c) selektiv und/oder reversible erfolgen kann.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach Anspruch 1, wobei die Anreicherung der Spurenkomponenten simultan und/oder zeitlich verzögert zu den Schritten a, b und/oder c durch selektive und/oder reversible Bindung auf einem mobilen Festphasenträger erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindungen (1) Proteine und Verbindungen (2) Peptide, Aminosäuren, Zucker, Lipide, Phospholipide und anorganische Salze umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindungen (1) und (2) durch protische und aprotische Lösungsmittel an den mobilen Festphasenträger gebunden und eluierbar sind, wobei die Elutionsmittel Acetonitril, Methanol, Ethanol, H₂O, Isopropanol, n-Propanol, Isobutanol, n-butanol und DMSO enthalten.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mobilen Festphasenträger für die Abreicherung von Verbindungen (1), Abtrennung von Verbindungen (2) und/oder Anreicherung von Spurenkomponenten beschichtete magnetischen Partikel umfassen, wobei die Beschichtung aus der Gruppe von Verbindungen umfassend Siliciumdioxid, Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Latex, Polyvinylalkohol ausgewählt ist und wobei die Partikel einen Partikeldurchmesser zwischen 100 nm and 100 μm aufweisen und die Oberfläche der Partikel funktionelle Gruppen beinhaltet, die ausgewählt sind aus der Gruppe -OH, -COOH, Diethylaminoethanol, NH₂, R-SO₂-OH, -NH₂; -RNH, -R₂N, -R₃N⁺ _CH₃, -C₂H₅, -C₄H₉, -C₈H₁₇, -C₁₈H₃₇, -C₆H₅, -ZiO₂, TiO₂, C₆H₉NO₆ Phenyl-Hexyl, Bi-Phenyl, Hydroxyapatit und Boronsäure.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt c) simultan und/oder zeitlich versetzt mit Schritt a) und/oder Schritt b) erfolgt.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lyse folgende Schritte beinhaltet: a) zu einem Volumen eines biologischen flüssigen Materials werden 1,5–10 Volumen einer Pufferlösung mit geringer ionischer Stärke mit Salzkonzentrate von 0–0,5 M hinzugefügt oder b) zu einem Volumenteil einer biologischen Flüssigkeit werden 0,05 bis 2,5 Teile des Volumens des Puffers mit hoher Ionenstärke hinzugefügt, welches ein zweiwertiges Salz mit einer Konzentration im Bereich von 0,1 M bis 3 M beinhaltet, wobei das zweiwertige Salz vorzugsweise ZnSO4 ist.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Abreicherung von Verbindungen (1) und/oder Abtrennung von Verbindungen (2) durch einen Wechsel in der dielektrischen Konstante durch Hinzufügen mindestens einer organischen Lösung erfolgt, welche einen Dipolmoment zwischen 1,6 und 4,0 Debye bei einem Volumenanteil in einem Bereich zwischen 1,5 und 4 aufweist.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine selektive, und/oder reversible Bindung der Spurenkomponenten an einen Festphasenträger durch spezifische Wechselwirkung erfolgt, umfassend a) ionische Wechselwirkungen zur Bindung der geladenen Verbindungen, b) Wasserstoffbrückenbindungen zur Bindung der polaren Verbindungen, c) hydrophobe Wechselwirkungen zur Bindung der hydrophoben Verbindungen, d) π-π-Elektronen-Wechselwirkungen zur Bindung von Verbindungen, welche delokalisierte π-Elektronensysteme wie Aromate enthalten, e) Metall-Affinität-Bindungen zur Bindung von ausgewählten Verbindungen wie Phosphatgruppen.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Anprüche, wobei die verbleibenden Spurenkomponenten (1), insbesondere Biomarker Targets durch magnetische Felder und/oder Zentrifugation getrennt und durch Elektrophorese, CE, HPLC, UPLC, LC/MS, LC-MS/MS, UV/Vis, Immunoassay-Detektion oder Durchflusszytometrie analysiert werden.
Screening-Kit für die Anreicherung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe für die klinische Anwendung beinhaltend Lysepuffer, organische Lösungsmittel und magnetischen Festphasenträger in einem Konzentrationsbereich von 0,1–15% (w/v).
Screening Kit zur Anreicherung von Spurenkomponenten nach Anspruch 11, umfassend Suspensionen magnetischer mobiler Festphasenträger in einem Bereich von 10 mg/ml bis 100 mg/ml, wobei die mobilen Festphasenträger beschichtete magnetischen Partikel umfassen, wobei die Beschichtung aus der Gruppe von Verbindungen umfassend Siliciumdioxid, Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Latex, Polyvinylalkohol ausgewählt ist.